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Was sind iPSC-Zellen und was sind ihre Anwendungen?

Was sind iPSC-Zellen und was sind ihre Anwendungen?


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Ich habe es auch im Internet durchsucht und weiß im Grunde genommen, dass es mit den Stammzellen zusammenhängt, aber es gibt zu viele Ressourcen. Kann mir jemand helfen, mehr über sie herauszufinden, z. B. über ihre Anwendungen? Sie interessieren mich wirklich.


Aus diesem Artikel: iPSCs oder induzierte pluripotente Stammzellen sind somatische Zellen, die dazu gebracht wurden, einen induzierten pluripotenten Zellzustand zu erlangen. Somatische Zellen können jede Zelle des Körpers sein, außer Samenzellen, Eizellen und undifferenzierte Stammzellen. Forscher können diese Zellen dazu bringen, in einen stammzellähnlichen Zustand zurückzukehren, indem sie die Expression wichtiger Transkriptionsfaktoren erzwingen und durch genomweite Remodellierung epigenetischer Markierungen.

Es gibt ein ganzes Spektrum an verschiedenen iPSCs, die generiert werden können, aber vieles ist noch nicht bekannt. Zukünftige Anwendungen umfassen ihre Verwendung für die regenerative Medizin, die Wirkstoffforschung usw.

Kürzlich wurden mehrere Artikel in der Natur veröffentlicht:

unter anderem. Sie können auch http://www.stemformatics.org/ besuchen, um weitere Informationen über Stammzellen und die durchgeführte Forschung zu erhalten.


IPSC-Plattform


Die Technologie induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) hat das Potenzial, die nächste Grenze in der Entwicklung von Zelltherapien zu eröffnen. Das Aufkommen von iPSCs mit ihrer Fähigkeit, gentechnisch verändert und in Kultur unbegrenzt vermehrt zu werden, hat dazu gedient, eine potenziell unbegrenzte Zellquelle für die Differenzierung in spezialisierte Zelltypen und die Entwicklung von „Standard“-Zelltherapien zu schaffen.

Wir haben Pionierarbeit bei der hocheffizienten Ableitung und Erweiterung menschlicher iPSCs geleistet. Seit unserer Gründung haben wir unsere Expertise in der induzierten pluripotenten Stammzellbiologie genutzt, um eine proprietäre, durch kleine Moleküle verbesserte iPSC-Plattform zu entwickeln. Unsere patentgeschützte iPSC-Plattform ermöglicht uns die Gentechnik, die Einzelzellisolierung und die Selektion von iPSCs für die klonale Expansion als Master-iPSC-Linien. Unsere iPSC-Plattform wird durch ein Portfolio an geistigem Eigentum von über 300 erteilten Patenten und 150 anhängigen Patentanmeldungen unterstützt, die wir besitzen oder lizenzieren.

Master-iPSC-Linien sind eine ideale Quelle für die Entwicklung von Zelltherapie-Produktkandidaten, die gut definiert sind, eine einheitliche Zusammensetzung aufweisen, ein konsistentes und dosisabhängiges pharmakologisches Profil aufweisen und für die Behandlung einer großen Anzahl von Patienten ab Lager geliefert werden können. Wir lenken das Schicksal von Master-iPSC-Linien auf die Bildung von Zellen des Immunsystems, einschließlich NK-Zellen, T-Zellen und CD34+-Zellen, und entwickeln eine Pipeline von handelsüblichen zellulären Immuntherapien, die aus Master-iPSC-Linien abgeleitet werden.


Anwendungen induzierter pluripotenter Stammzellen bei der Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen

Neurodegeneration ist der Oberbegriff für den fortschreitenden Verlust der Struktur oder Funktion von Neuronen. Unheilbare neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD) und die Parkinson-Krankheit (PD) zeigen insbesondere in den fortgeschrittenen Altersgruppen dramatisch steigende Tendenzen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt und es gibt bisher keine Biomarker zur Früherkennung oder wirksamen Behandlung der zugrunde liegenden Ursachen dieser Erkrankungen. Darüber hinaus konzentriert sich aufgrund von Artenvariationen und Unterschieden zwischen Tiermodellen (z. B. transgene Maus- und Knockout-Modelle) von neurodegenerativen Erkrankungen eine wesentliche Debatte darauf, ob Tier- und Zellkultur-Krankheitsmodelle den Zustand bei menschlichen Patienten korrekt modellieren können. 2006 demonstrierte Yamanaka von der Universität Kyoto erstmals einen neuartigen Ansatz zur Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die ein ähnliches Pluripotenzpotenzial wie embryonale Stammzellen (ESCs) aufwiesen. Derzeit durchdringen iPSC-Studien viele Bereiche der Krankheitsforschung. Aus Patientenproben gewonnene iPSCs können verwendet werden, um patientenspezifische Krankheitsmodelle zu konstruieren, um die pathogenen Mechanismen der Krankheitsentwicklung aufzuklären und neue therapeutische Strategien zu testen. Dementsprechend konzentriert sich die vorliegende Übersicht auf die jüngsten Fortschritte in der iPSC-Forschung bei der Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen und bei der Entwicklung neuer Therapieoptionen.

1. Einleitung

Humane embryonale Stammzellen (ESCs) sind undifferenzierte Zellen, die aus der inneren Zellmasse der Blastozyste stammen. ESCs zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur unbegrenzten Vermehrung ohne Differenzierung und durch ihre Fähigkeit zur Differenzierung in alle embryonalen Zelllinien aus [1]. ESCs werden häufig für viele Zwecke wie Gen-Targeting, Zelltherapie, Gewebereparatur und Organregeneration eingesetzt [2]. Der Einsatz von ESCs wird jedoch durch erhebliche Barrieren wie Immunabstoßung, inkorrekte Geweberegeneration, Tumorbildung und ethische Bedenken in Bezug auf die Zerstörung menschlicher Embryonen behindert [3, 4]. Kürzlich demonstrierten Takahashi und Yamanaka einen neuartigen Ansatz zur Herstellung von iPSCs, deren Pluripotenzpotential dem von ESCs sehr ähnlich ist, durch die Reprogrammierung von Mausfibroblasten zurück in einen unreifen, pluripotenten Zustand durch retroviral vermittelte Einführung und Überexpression der pluripotenten Transkriptionsfaktoren ( TF) [5]. Anschließend haben Takahashi et al. unabhängig reprogrammierte humane somatische Zellen in humane iPSCs, die in Morphologie, Proliferation, Oberflächenantigenen, Genexpression, epigenetischem Status pluripotenter zellspezifischer Gene und Telomeraseaktivität den humanen ESCs ähnlich waren [6, 7].

Der Einsatz von iPSCs durchdringt mittlerweile viele Bereiche der Krankheitsforschung. Aus Patientenproben gewonnene iPSCs können verwendet werden, um patientenspezifische Krankheitsmodelle zu konstruieren, um bisher unbekannte pathogene Mechanismen der Krankheitsentwicklung aufzuklären und neue therapeutische Strategien zu testen [8–15].

Neurodegeneration ist der Überbegriff für den fortschreitenden Verlust der Struktur oder Funktion von Neuronen, einschließlich des Absterbens von Neuronen. Unheilbare neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer (AD), Frontotemporale Demenz (FTD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Morbus Parkinson (PD), Morbus Huntington (HD) und Multiple Sklerose (MS) haben eine erschreckende Prävalenz erreicht [16] . Trotz großer Fortschritte beim Verständnis der Ätiologie der Erkrankungen sind die zugrunde liegenden Mechanismen noch unklar. Darüber hinaus wurden keine Mittel zur Behandlung der zugrunde liegenden Ursache entwickelt. Obwohl transgene und Knockout-Modelle neurodegenerativer Erkrankungen umfassend eingesetzt werden und wichtige Einblicke in einige molekulare Mechanismen der Krankheitsentstehung geliefert haben, bieten die Modelle keine Möglichkeit, Mechanismen der Neurodegeneration in gefährdeten menschlichen Neuronen zu untersuchen. Daher ist es oft schwierig oder sogar unmöglich, die Humanpathogenese mit diesem Ansatz zu replizieren [17]. Das Feld wird durch den Mangel an krankheitsspezifischen Modellen für den Menschen zur Entwicklung neuer Medikamente zur Kontrolle dieser Krankheiten behindert. Seit einem Jahrzehnt interessieren sich Forscher für Stammzellen und die Aussicht, sie zum Verständnis der Pathogenese von Krankheiten zu verwenden und die Entwicklung neuer Therapeutika zu erleichtern [18–20]. Die Verwendung von krankheitsspezifischen iPSCs aus Patienten ermöglicht die Herstellung von Neuronen, die die genetische Information des einzelnen Patienten enthalten. Dementsprechend konzentriert sich die vorliegende Übersicht auf die jüngsten Fortschritte der iPSC-Forschung bei der Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen und bei der Entwicklung neuer Therapieoptionen.

2. Traditionelle Methoden zur Etablierung von Stammzellen

Stammzellen werden grob in ESCs, mesenchymale Stammzellen (MSCs) und iPSCs eingeteilt [21]. Die Reprogrammierungstechnologie wandelt differenzierte Körperzellen (z. B. Hautfibroblasten und Blutlymphozyten) durch epigenetische Modifikation in Stammzellen um [5, 6, 22–25]. Bis vor kurzem wurde das Zurücksetzen des Epigenoms einer somatischen Zelle in einen pluripotenten Zustand durch somatischen Zellkerntransfer (SCNT) [22], Zell-Zell-Fusion [23], Behandlung mit Extrakten pluripotenter Zellen [24] und ektopische Expression von erreicht definierte Faktoren [5, 6] (Tabelle 1).

Die ersten erfolgreichen Klonierungsexperimente bei Säugetieren durch Einbringen von Kernen adulter somatischer Zellen in Eizellen (SCNT-Technologie), die lebensfähige Nachkommen hervorbrachten, zeigten eindeutig, dass das Zytoplasma von Eizellen ausreichende genetische Informationen enthalten muss, um die Kerne zumindest einiger Zelltypen umzuprogrammieren [26 ]. Der Einsatz von SCNT für die Forschung oder für potenzielle stammzellbasierte Therapien, die auf menschliche Patienten zugeschnitten sind, wird jedoch durch die geringe Klonierungseffizienz und die Beobachtung von Entwicklungsanomalien bei Versuchstieren in verschiedenen Entwicklungsstadien eingeschränkt [26, 27]. Darüber hinaus haben ethische Probleme im Zusammenhang mit der Gewinnung und Bearbeitung einer großen Zahl menschlicher Eizellen die Anwendung der SCNT in der Klinik weiter eingeschränkt [26]. Die Schaffung von Zellhybriden durch Fusion von somatischen Zellen mit pluripotenten Zellen unterschiedlicher Herkunft hat erfolgreich somatische Zellen aus Mäusen oder Menschen umprogrammiert und pluripotente Zellen erzeugt [28, 29]. Der Nutzen dieser Methode wird jedoch dadurch behindert, dass die resultierenden Zellhybride tetraploid sind [23, 29], was die Anwendung dieser Methode für klinische Anwendungen einschränken kann. Darüber hinaus erfordern sowohl SCNT als auch Zellfusion komplexe Mischungen bekannter und undefinierter Faktoren aus Eizellen oder pluripotenten Zellen, um eine Reprogrammierung auszulösen, was mechanistische Studien besonders schwierig macht [26–28].

Inkubation reversibel permeabilisierter Zellen mit den zellfreien Extrakten pluripotenter Zellen, wie ESCs [24], embryonalen Keimzellen [30] oder Xenopus Eizellen [31], induziert ebenfalls eine teilweise Neuprogrammierung des Zellkerns. Die reprogrammierten Zellen reexprimieren Pluripotenzmarker und redifferenzieren in mehrere Linien [24, 30, 31]. Im Vergleich zu SCNT oder Zellfusion führt dieses Verfahren keine ESC-Chromosomen in somatische Zellen ein. Allerdings ist die Methode bei der Anwendung auf primäre Zellen eingeschränkt, da die reprogrammierten Zellen nur einige pluripotente Zelleigenschaften wiedererlangen [26]. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass in einigen Fällen die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden kann, dass die berichtete Reexpression von Pluripotenz-assoziierten Genen auf Material aus den pluripotenten Spenderzellen zurückzuführen ist [26].

3. iPSC-Technologie

Eine neue Strategie wurde von Takahashi et al. Dadurch wurden alle oben genannten Probleme vermieden, bei denen somatische Zellen von Säugetieren durch ektopische Expression der pluripotenten TFs zu iPSCs umprogrammiert wurden Okt4 (auch bekannt als Pou5f1), Sox2, Klf4, und c-Myc (bekannt als OSKM) [5, 54]. Im Jahr 2007 wurden erstmals humane iPSCs von derselben Gruppe erzeugt, indem adulte humane dermale Fibroblasten mit viralen Vektoren, die dieselben TFs tragen, unter Verwendung eines retroviralen Systems transduziert wurden [6]. Die auf diese Weise erzeugten iPSCs teilen die Haupteigenschaften von Präimplantationsembryonen abgeleiteten ESCs, die eine unbegrenzte Selbsterneuerung und das Potenzial zur Differenzierung in Zellen der drei Keimblätter umfassen [5, 6]. Im selben Jahr haben Yu et al. erzeugten auch humane iPSCs, bei denen die Faktoren Okt4, Sox2, Nanog, und LIN28 und ein lentivirales System wurden verwendet, um menschliche Körperzellen in pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren, die die wesentlichen Eigenschaften von ECS aufweisen [7]. Takahashi und Yamanaka identifizierten 24 Gene als Kandidatenfaktoren für die Aufrechterhaltung der ESC-Identität, die anschließend retroviral in Fbx15-Rezeptor-Fibroblasten transduziert wurden, wobei ein Assay-System verwendet wurde, bei dem die Induktion des pluripotenten Zustands durch Resistenz gegen G418 nachgewiesen werden konnte [ 5]. Die Zahl der 24 Kandidatenfaktoren wurde durch schrittweisen Ausschluss einzelner Faktoren schrittweise reduziert, bis nur noch vier Gene übrig waren, die ausreichend und notwendig waren, um iPSCs zu induzieren [5]. Trotz des enormen Potenzials für iPSCs in der Erforschung von Humanerkrankungen gibt es noch einige Einschränkungen bei der Anwendung von iPSCs in der Klinik. Der langsame Umprogrammierungsprozess und die geringe Umprogrammierungseffizienz erschweren detaillierte mechanistische Studien und potenzielle Anwendungen dieser Technologie. Anfangs erfahren nur etwa 0,1 bis 1 % der Körperzellen Veränderungen auf Transkriptionsebene und werden schließlich zu pluripotenten Stammzellen, wenn Methoden ohne Genomintegration eingesetzt werden [37].

In den letzten Jahren wurden Ansätze ständig verfeinert und optimiert, um die Effizienz zu verbessern und das Verhältnis von iPSC-Kolonien zu Gesamtkolonien zu erhöhen [55, 56]. Die Methode mit den ursprünglichen 4 TFs [5, 6] bleibt jedoch die bevorzugte Option. Zu den Methoden, die untersucht wurden, um die klinisch relevante iPSC-Genabgabe zu erleichtern, gehören Plasmide [57], piggyBac-Vektoren [58] und Minicircle-Vektoren [59]. Obwohl der iPSC-Reprogrammierungsansatz über virale Vektoren eine relativ höhere Reprogrammierungseffizienz als die nicht-virale Lieferung zeigt, kann das Genom durch die Integration anderer Gensequenzen mutiert werden, was Sicherheitsbedenken aufwirft [38]. Außerdem, c-Myc ist ein Onkogen und dies erhöht das Risiko der Tumorbildung [39]. Jüngste Studien haben erfolgreich transgenfreie und genetisch einwandfreie iPSCs mithilfe von Proteintransduktion [32, 33], nicht integrierenden viralen Vektoren wie Sendai-Virus [60], episomalen Vektoren [61], Transfektion von modifizierten mRNA-Transkripten [62] und kleinen Molekülen erzeugt [34–36] (Abbildung 1). Adenovirus- und Sendai-Virus-Transduktionstechniken vermeiden eine exogene DNA-Integration in das Wirtsgenom und sind hocheffizient, aber Zellen neigen dazu, das Virusgenom zu tragen. Somit können im Vergleich zu den traditionellen viralen Methoden die nichtviralen Ansätze verwendet werden, um qualifizierte iPSCs ohne das Risiko einer Insertionsmutagenese zu erzeugen. Die Ergebnisse dieser Methoden waren jedoch meist erfolglos. Versuche einer Reprogrammierung mit Proteinen waren erfolgreich, aber die Effizienz der Produktion ist extrem gering (

Eine Alternative zur Erzeugung von iPSCs besteht darin, die interessierende Zielzelle direkt aus differenzierten Zellen zu erzeugen. In einer ersten Reihe von Experimenten, die von Vierbuchen et al. durchgeführt wurden, wurden Fibroblasten direkt in induzierte neuronale Zellen (iNCs) umprogrammiert, indem die Expression neuronaler Linien-spezifischer TFs induziert wurde [64]. Der kombinierte Ausdruck von nur drei Faktoren, Ascl1, Brn2, und Myt1l, war ausreichend, um embryonale und postnatale Fibroblasten der Maus schnell und effizient in funktionelle Neuronen umzuwandeln in vitro [64]. Diese iNCs exprimieren mehrere neuronenspezifische Proteine, erzeugen Aktionspotentiale und bilden funktionelle Synapsen [64]. Nachfolgende Studien zeigten, dass andere neurogene Faktoren, nämlich Ngn2, Ascl1, und DLX2, kann auch früh-postnatale Astrozyten in Neuronen umprogrammieren in vitro, einschließlich sowohl GABAergen als auch glutamatergen Schicksalen [65–67]. Anschließend wurden verschiedene Neuronen wie die cholinergen [68] und die dopaminergen [69] Neuronen aus vielen differenzierten Zelltypen hergestellt, darunter Hepatozyten [70], Perizyten [71] und adulte Astrozyten [72], am häufigsten jedoch aus Fibroblasten [64 ]. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Überexpression einiger weniger „Master“-Faktoren ausreicht, um eine relativ schnelle, direkte Änderung der spezifischen Abstammungslinie in Zellen zu bewirken, die aus verschiedenen embryonalen Schichten stammen. Die Generierung von iNCs aus nicht-neuronischen Linien könnte den Ausgangspunkt für die Verwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin darstellen und auch nützlich sein, um unser Wissen über die neuronale Entwicklung und die neurologische Krankheitspathogenese zu verbessern [73].

4. Anwendungen von iPSCs bei neurodegenerativen Erkrankungen

Durch die Etablierung der iPSC-Technologie können adulte Körperzellen einen pluripotenten Zustand entwickeln [3–5, 74]. Tatsächlich haben menschliche iPSCs die ethischen Beschränkungen effektiv umgangen und dieser Ansatz ermöglichte es, iPSCs aus Biopsieproben von willkürlich ausgewählten Individuen herzustellen und diese Zellen anschließend ohne Bedenken in Bezug auf Rasse, genetischen Hintergrund oder Gesundheitszustand zu erhalten, zu erweitern und zu lagern [8]. Darüber hinaus ermöglichen iPSCs aufgrund ihrer ESC-ähnlichen Pluripotenz die Produktion einer Vielzahl von abgeleiteten Zellen wie Neuronen, nicht nur für Anwendungen in der regenerativen Medizin wie der Transplantationstherapie, sondern auch für die Modellierung menschlicher Krankheiten und die Entwicklung neuer Medikamente [8].

Neurodegenerative Erkrankungen treten auf, wenn sich Neuronen zu verschlechtern beginnen. Veränderungen in diesen Zellen führen dazu, dass sie abnormal funktionieren und schließlich zum Untergang der Zelle führen. Die Inzidenz dieser Krankheiten wird mit steigender Lebenserwartung voraussichtlich dramatisch ansteigen, was eine erhebliche wirtschaftliche und soziale Belastung darstellt. Tiermodelle (z. B. transgene Tiere oder Knockout-Tiere) neurodegenerativer Erkrankungen wurden erstellt, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und eine Plattform zum Testen therapeutischer Strategien bereitzustellen [8, 14, 17, 75, 76], aber die Konstruktion von Modellen, die genau und die menschliche Pathologie vollständig zu reproduzieren, bleibt problematisch. Darüber hinaus gibt es aufgrund von Speziesvariationen und Unterschieden in der Zelllinienspezifität erhebliche Debatten darüber, ob Krankheitsmodelle von Tieren und Zelllinien die natürlichen Phänomene, die bei menschlichen Patienten auftreten, genau widerspiegeln [8]. Interessanterweise wurden krankheitsspezifische iPSCs bei Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen etabliert, was Forschungswege für die Untersuchung zugrunde liegender Mechanismen und die Erforschung von Therapien eröffnet. Kürzlich wurden humane iPSCs von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS, PD, AD und SMA erfolgreich differenziert in vitro in krankheitsrelevante Zelltypen, einschließlich Motoneuronen (MNs), dopaminergen Neuronen und Oligodendrozyten [77] (Tabelle 2).

4.1. Alzheimer-Krankheit

AD ist die häufigste Form der senilen Demenz und ist durch die Bildung von senilen Plaques (SP) gekennzeichnet, die aus extrazellulär abgelagerten β-Amyloid (Aβ) und auch neurofibrilläre Tangles (NFT), die Tau enthalten, ein intrazellulär aggregiertes, hyperphosphoryliertes Protein, das zur Gruppe der Mikrotubuli-assoziierten Proteine ​​(MAP) gehört [78]. Die Pathogenese der AD wurde im letzten Jahrzehnt intensiv untersucht [78, 79]. Die Mechanismen, die den Neuronendefekten und Synapsenschäden bei AD zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar und derzeit gibt es keine wirksamen Therapien für AD.Glücklicherweise bietet die jüngste Entwicklung eines AD-Krankheitsmodells unter Verwendung von iPSCs Zugang zu Zelltypen, die bisher in ausreichender Menge oder Qualität nicht erhältlich waren, und dies bietet spannende Perspektiven für die Aufklärung der Ätiologie der AD und für die Entwicklung potenzieller Therapeutika [20]. Mehrere Gruppen haben seitdem Neuronen aus humanen iPSCs erzeugt, die Mutationen in Genen tragen, die für Amyloid-Vorläuferprotein (APP) und Presenilin (PS) kodieren, was zeigt, dass sie den APP-Prozessierungsweg rekapitulieren und einen innovativen Ansatz zur Untersuchung der Pathogenese von AD bieten [11, 80, 81].

Kondo et al. abgeleitete humane iPSCs von Patienten mit atypischer früh einsetzender familiärer AD (fAD) mit APP-E693Δ-Mutation, die offensichtliche früh einsetzende Symptome der AD, aber ohne Aβ Ablagerung [82] sowie von sporadischer AD (sAD) und differenzierten sie in Nervenzellen [11]. Sie fanden heraus, dass Aβ Oligomerakkumulation führte zu endoplasmatischem Retikulum (ER) und oxidativem Stress [11]. Außerdem ist das akkumulierte Aβ Oligomere waren nicht proteolytisch resistent und die anschließende Behandlung mit Docosahexaensäure (DHA) linderte die Stressreaktionen in den neuronalen Zellen der AD [11]. Diese Ergebnisse können die unterschiedlichen klinischen Ergebnisse erklären, die mit der DHA-Behandlung erzielt werden, und legen nahe, dass DHA tatsächlich für eine bestimmte Untergruppe von Patienten wirksam sein könnte [11]. Tatsächlich zeigten von menschlichen iPSCs abgeleitete Neuronen erhöhte Spiegel von

die auf die Behandlung mit . ansprachen γ-Sekretasehemmer [81] und diese Ergebnisse unterstützten frühere Beobachtungen bezüglich der Wirkung von PS-Mutationen [83].

In einer anderen Studie, β-Sekretase-Inhibitoren wurden in von iPSCs abgeleiteten, gereinigten Neuronen von Patienten mit fAD untersucht, das durch eine Duplikation des APP-Gens verursacht wurde (APP genannt

) und traurig [80]. Im Vergleich zu nicht dementen Kontrollen wiesen die Neuronen der Patienten signifikant höhere Werte der pathologischen Marker auf

, Phospho-tau (Thr 231) und aktive Glykogen-Synthase-Kinase-3β (aGSK-3β) [80]. Behandlung der gereinigten Neuronen mit β-Sekretasehemmer verursachten eine signifikante Reduktion von Phospho-tau (Thr 231) und aGSK-3β Ebenen [80]. Diese Ergebnisse deuten auf eine direkte Beziehung zwischen der proteolytischen Verarbeitung von APP, aber nicht auf A . hinβ, in GSK-3β Aktivierung und Tau-Phosphorylierung in menschlichen Neuronen [80].

4.2. Parkinson-Krankheit

PD ist die zweithäufigste chronisch-progressive neurodegenerative Erkrankung. Die klinischen Merkmale von Parkinson, die durch Kombinationen von motorischen Problemen gekennzeichnet sind, nämlich Bradykinesie, Ruhetremor, Starrheit, gebeugte Haltung, „Einfrieren“ und Verlust von Haltungsreflexen, resultieren höchstwahrscheinlich aus dem Verlust von dopaminergen (DA) Neuronen in das substantia nigra pars compacta [84, 85]. Unser Verständnis des zugrunde liegenden molekularen Mechanismus der Parkinson-Krankheit wird durch den eingeschränkten Zugang zu betroffenen menschlichen DA-Neuronen, auf denen experimentelle Forschung basiert, behindert. Die Mehrzahl der PD-Fälle treten sporadisch auf, wobei bis zu 20 % der Patienten mit familiären monogenen Formen der Erkrankung vorstellig werden [43]. Patientenspezifische iPSCs aus idiopathischen PD-Fällen ermöglichen die Erzeugung von Mittelhirn-DA-Neuronen, die die gleiche genetische Zusammensetzung wie die Patienten aufweisen und viele wichtige Eigenschaften mit den nigralen DA-Neuronen bei den PD-Patienten teilen [44]. Darüber hinaus können die von iPSC abgeleiteten DA-Neuronen des Mittelhirns in die adulte Nagetierschicht transplantiert werden, wo sie Arborisierung zeigen und funktionelle Effekte vermitteln, wie durch die Reduzierung der Amphetamin- und Apomorphin-induzierten Rotationsasymmetrie bestimmt [86]. Allerdings projizierten 16 Wochen nach der Transplantation nur wenige DA-Neuronen in das Wirtsstriatum [86].

Obwohl monogene Formen der PD nur einen kleinen Prozentsatz der PD-Fälle ausmachen [87], ist das Verständnis, wie Mutationen dieser Gene die Degeneration von DA-Neuronen verursachen, von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung des Krankheitsmechanismus und für die Identifizierung krankheitsmodifizierender Medikamente. Mutationen in GBA, LRRK2, PARK2, PARK7 (DJ-1), PINK1,α-Synuclein (SNCA), oder UCHL1 kann zu monogenen Formen von PD oder erhöhter PD-Anfälligkeit führen, was auf eine wichtige Rolle dieser Proteine ​​in der Pathogenese der Krankheit hindeutet [43]. SNCA ist das erste Gen, das mit autosomal-dominanter familiärer Parkinson-Krankheit verbunden ist, das ein synaptisches Vesikel-assoziiertes Protein kodiert, das in Lewy-Körperchen in großer Häufigkeit vorkommt [44]. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden iPSCs von einem Parkinson-Patienten mit einer Verdreifachung der SNCA Gen [88]. Im Vergleich zu den normalen Kontrollen, die von einem nicht betroffenen Verwandten ersten Grades stammten, produzierten DA-Neuronen, die von diesem Patienten stammten, die doppelte Menge an α-Synuclein-Protein [88]. Mutation der LRRK2 Gen ist die häufigste Mutation im Zusammenhang mit Parkinson [44, 89]. iPSCs mit dem S.G2019S Mutation (G2019S-iPSCs) in der LRRK2 Gen konnten sich in DA-Neuronen differenzieren und zeigten eine erhöhte Expression wichtiger Gene der oxidativen Stressreaktion sowie eine Hochregulation von α-Synuclein-Protein [89].

PINK1 ist ein Gen, das eine mitochondriale Kinase kodiert, die Zellen vor mitochondrialem Stress schützt und den mitochondrialen Abbau reguliert [90]. Verlust von PINK1 wurde mit einem erhöhten oxidativen Stress in Verbindung gebracht [91]. Seibler et al. berichteten, dass Fibroblasten von genetischer Parkinson mit PINK1 Mutationen können umprogrammiert und in dopaminerge (DA) Neuronen differenziert werden [85]. Die Neuronen zeigten nach der mitochondrialen Depolarisation eine beeinträchtigte Rekrutierung von lentiviral exprimierten Parkin zu Mitochondrien, erhöhte mitochondriale Kopienzahl und Hochregulierung des wichtigen Regulators der mitochondrialen Biogenese, PGC-1α [85]. Wichtig ist, dass diese Veränderungen durch lentivirale Expression von Wildtyp . korrigiert wurden PINK1 in mutierten iPSC-abgeleiteten PINK1 Neuronen [85].

4.3. Amyotrophe Lateralsklerose

ALS ist eine im Erwachsenenalter beginnende neurodegenerative Erkrankung, an der die oberen und unteren MNs des motorischen Kortex, des Hirnstamms und des Rückenmarks beteiligt sind und zu Muskeldenervation, -schwund und -tod führen [92]. Es gibt keine wirksamen Heilmittel für ALS, obwohl das Benzothiazol-Riluzol die Progressionsrate verlangsamt und das Überleben um drei Monate verlängert [93]. Etwa 10 % der ALS-Fälle sind familiär (fALS) und werden durch Mutationen in einem von mindestens 32 bekannten genetischen Loci verursacht, zu denen Superoxiddismutase 1 (SOD1) [94], Teer-DNA-bindendes Protein-43 (TDP-43) [95], fusioniert im Sarkom (FUS) [47] und C9ORF72 [48]. Sporadische ALS (sALS) machen 90 % der Fälle aus, und in diesen Fällen ist die genetische Ätiologie weitgehend unbekannt [96]. Kürzlich wurden ALS-Krankheitsmodelle entwickelt, die von Patienten abgeleitete iPSCs verwenden, um die Pathogenese von ALS zu erforschen und Medikamentenstrategien zu testen [97–99].

Mutationen in SOD1 sind die am besten untersuchten Mutationen im Zusammenhang mit ALS [94]. Forscher erstellten von iPSC abgeleitete MNs von Patienten mit dem häufigsten nordamerikanischen ALS-Genotyp, A4V SOD1, sowie D90A SOD1 [100]. Die Aggregation von Neurofilamenten (NF) gefolgt von einer Neuritenschwellung trat früh bei spinalen MNs auf, jedoch selten bei Nicht-MNs [100]. Diese Veränderungen waren mit der Bindung von Mutanten . verbunden SOD1 in der 3′ UTR von NF-L mRNA, verminderte Stabilität von NF-L mRNA und damit veränderter Anteil an NF-Untereinheiten [100]. Darüber hinaus wurden solche MN-selektiven Veränderungen durch die Expression einer einzelnen Kopie der Mutante nachgeahmt SOD1 in menschlichen ECs und wurden durch genetische Korrektur der SOD1 Mutation in den iPSCs des Patienten [100]. Wichtig ist, dass die bedingte Expression von NF-L im SOD1 Von iPSC abgeleitete MNs korrigierten den Anteil der NF-Untereinheiten, wodurch die NF-Aggregation und die Neuritendegeneration abgeschwächt wurden [100]. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass eine NF-Fehlregulation der Mutante zugrunde liegt SOD1-vermittelte NF-Aggregation und axonale Degeneration bei ALS-MNs.

TDR43 wird bei 95 % der ALS in zytoplasmatischen Einschlüssen gefunden, und etwa 4 % der familiären ALS werden durch Mutationen in TDP-43 verursacht [96]. Genetische Analysen identifizierten sowohl bei familiären als auch sporadischen ALS-Fällen mehr als 30 Mutationen im TDP-43-Gen [97]. Egawaet al. fanden heraus, dass von iPSCs abgeleitete MNs von ALS-Patienten, die Mutationen in TDP-43 trugen, zytosolische Aggregate bildeten, die denen ähnlich waren, die in postmortalem Gewebe von ALS-Patienten beobachtet wurden, und verkürzte Neuriten aufwiesen, wie in einem Zebrafischmodell von ALS beobachtet [99]. Derzeit sind mehr als 30 verschiedene Mutationen, darunter die M337V-Mutation, bei ALS-Patienten beschrieben [96]. Von M337V-TDP-43-iPSCs abgeleitete MNs waren anfälliger für zellulären Stress und zeigten eine erhöhte Anfälligkeit bei einer Vielzahl von in vitro Kulturassays [98, 99].

4.4. Spinale Muskelatrophie

SMA gehört zu den häufigsten genetischen neurologischen Erkrankungen, die Säuglingssterblichkeit verursachen [101] und ist durch die Degeneration spinaler MNs und Muskelatrophie gekennzeichnet [102]. Klinisch zeigen Patienten mit SMA typischerweise im Alter von 6 Monaten Symptome und sterben im Alter von 2 Jahren [103]. Obwohl die genetische Ursache von SMA dem Überlebensmotorneuron 1 zugeordnet wurde (SMN1)-Gen, das zum selektiven Abbau von MNs führt, sind die Mechanismen, die der selektiven MN-Degeneration bei SMA zugrunde liegen, weitgehend unbekannt [102].

Ebertet al. berichteten über die Erzeugung von iPSCs aus Hautfibroblastenproben, die einem Kind mit SMA entnommen wurden, und anschließend wurden die iPSCs in MNs differenziert, die im Vergleich zu MNs der nicht betroffenen Mutter des Kindes besondere Defekte aufwiesen [103]. SMA-abgeleitete iPSCs, die mit Valproat oder Tobramycin behandelt wurden, zeigten einen signifikanten Anstieg der SMN-Spiegel im Vergleich zu unbehandelten iPSCs [103]. Darüber hinaus haben Chang et al. abgeleiteten iPSCs aus den Fibroblasten von SMA-Patienten und stellten fest, dass SMA-iPSCs eine reduzierte Fähigkeit zur Bildung von MNs und aberranten Neuritenwachstums zeigten [104]. Die ektope SMN-Expression in diesen iPSC-Linien stellte die normale Differenzierung von Motoneuronen wieder her und rettete den Phänotyp des verzögerten Neuritenwachstums [104]. Diese umfassenden Daten legen nahe, dass die beobachteten Anomalien tatsächlich durch einen SMN-Mangel und nicht durch die klonale Variabilität der iPSC verursacht werden.

Cortiet al. generierten iPSCs aus Hautfibroblasten von SMA-Patienten unter Verwendung nichtviraler, nichtintegrierender episomaler Vektoren und verwendeten einen Zielgenkorrekturansatz basierend auf einzelsträngigen Oligonukleotiden, um die SMN2 Gen in ein SMN1-ähnliches Gen [101]. MNs, die durch Differenzierung von SMA-iPSCs gebildet wurden, reproduzierten krankheitsspezifische Merkmale, die in MNs verbessert wurden, die von genetisch korrigierten SMA-iPSCs abgeleitet wurden [101]. Darüber hinaus verlängerte die Transplantation von korrigierten MNs aus SMA-iPSCs in ein SMA-Mausmodell die Lebensdauer der Tiere und verbesserte den Krankheitsphänotyp [101].

4.5. Down-Syndrom

Das DS oder Trisomie 21 (T21)-Syndrom ist eine der häufigsten Chromosomenanomalien und ist durch geistige Behinderung, kognitive Beeinträchtigung und Defizite beim Lernen und Gedächtnis gekennzeichnet. Das Syndrom wird durch eine zusätzliche Duplikation von Chromosom 21 verursacht, das miRNAs einschließlich miR-99a, miR-155 und miR-802 enthält [51]. Die Gehirne mit DS zeigen auch viele neuropathologische Merkmale, einschließlich Veränderungen der Neurogenese und Synaptogenese und des frühen Auftretens von AD-ähnlichen Symptomen [51]. Erwachsene mit Down-Syndrom entwickeln eine früh einsetzende AD, höchstwahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Expression eines Gens auf Chromosom 21, das für APP kodiert [105]. Shiet al. fanden heraus, dass kortikale Neuronen, die aus von DS-Patienten stammenden iPSCs generiert wurden, das AD-pathogene Peptidfragment A . produziertenβ42, die in Zellkörpern und Dendriten unlösliche intra- und extrazelluläre Amyloidaggregate und hyperphosphoryliertes Tau-Protein bildeten [105].

Andere Forscher konnten eine Beeinträchtigung der Neurogenese bei DS mit iPSCs modellieren, die aus T21-Fruchtwasserzellen (AF) durch lentivirale Abgabe und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) abgeleitet wurden [106]. T21 AF-iPSCs wurden durch die Expression pluripotenter Marker und durch ihre Fähigkeit zur Differenzierung in alle drei Keimblätter durch Bildung von Embryoid Bodies charakterisiert in vitround Teratome in vivo, sowie durch ihre einzigartigen chromosomalen Karyotypen: drei Paare von Chromosom 21 [106]. Allerdings erzeugten die T21 AF-iPSC-NPCs im Vergleich zu Kontrollen weniger Neuronen und zeigten Entwicklungsdefekte während der Neurogenese [106]. In DS-Neuronen hemmte die Überexpression von miR-155 und miR-802 die Expression des Ziels, des Methyl-CpG-bindenden Proteins 2 (MeCP2) [107]. In T21 AF-iPSC-NPCs fanden die Forscher, dass die Expressionsniveaus von miR-155 und miR-802 stark erhöht waren und es eine niedrige Expression von Methyl-CpG-bindendem Protein 2 (MeCP2) gab, was die Beobachtungen in DS . widerspiegelte Neuronen [106].

4.6. Polyglutamin-Krankheit

Polyglutamin-Erkrankungen umfassen eine Familie neurodegenerativer Erkrankungen, die aus einer CAG-Triplett-Repeat-Expansion in einem bestimmten Gen entstehen [108]. Diese Expansion gipfelt in der Expansion eines pathogenen Proteins, das einen kritisch erweiterten Glutamintrakt enthält, der die Proteinfaltung verändert [108]. Zu den Proteinfehlfaltungsstörungen gehören HD, spinobulbäre Muskelatrophie, dentatorubrale pallidoluysische Atrophie und mehrere spinale Kleinhirnataxien [108]. iPSC-Studien konzentrierten sich bisher hauptsächlich auf die Huntington-Krankheit [109–111]. Die HK ist eine genetisch dominante neurodegenerative Erkrankung, die durch einen fortschreitenden Verlust der motorischen und kognitiven Funktion gekennzeichnet ist, der durch die Degeneration ausgewählter neuronaler Populationen innerhalb der Basalganglien und der Großhirnrinde verursacht wird [112]. Die Pathologie der Huntington-Krankheit wird hauptsächlich durch die Trinukleotid-Repeat-Expansion (CAG) (>39 CAG-Repeats manifestiert sich in der Krankheit) auf Chromosom 4 angetrieben, was zu einem erweiterten Polyglutamin-Trakt an der kodierenden Stelle des Huntingtin-Proteins (HTT) führt [53, 113]. iPSCs-basierte Modelle von Huntington-Patienten mit einer CAG-Repeat-Expansion wurden ursprünglich von Zhang et al. [109]. Sie fanden heraus, dass die von iPSCs abgeleiteten Neuronen im Vergleich zu normalen Zellen eine erhöhte Caspase-Aktivität nach Wachstumsfaktor-Entzug zeigten [109]. Die Expansion des Polyglutamintrakts im Huntingtin-Protein führt zu einem massiven Zelltod im Striatum von Huntington-Patienten. An et al. wiesen das expandierte Polyglutamin durch die Verwendung des krankheitsspezifischen Antikörpers 1C2 nach, der die expandierte Polyglutaminstrecke erkennt [110]. Eine andere Studie zeigte, dass die Transplantation von neuralen Vorläufern, die von Huntington-patientenspezifischen iPSCs mit 72 CAG-Repeats (HD72-iPSCs) in YAC128-Mäuse stammten, das Verhalten der transplantierten Mäuse signifikant verbesserte [111]. Interessanterweise bildeten die transplantierten HD72-iPSC-abgeleiteten neuralen Vorläufer effizient GABAerische Neuronen, aber nach der Transplantation wurden keine EM48-positiven Proteinaggregate nachgewiesen [111].

5. Bewerbung im Therapeutik-Studium

Aufgrund der inhärenten Diskrepanz zwischen der Arzneimittelpharmakologie bei heterologen in vitro Zellmodelle und Wirkstoffwirksamkeit in vivo, die Suche nach mehr Vorhersagen in vitro Systeme ist eine der dringendsten Herausforderungen der modernen Wirkstoffforschung [76]. Ein Grund für das Scheitern vieler Wirkstoffkandidaten beim Menschen ist die schlechte Vorhersagekraft präklinischer biologischer Modelle [76]. Verbesserte pharmakologische in vitro für die Profilerstellung wären Primärproben des richtigen auf Medikamente gerichteten menschlichen Gewebes erforderlich oder Bona Fide humane krankheitsrelevante Zellen [76]. Mit dem Aufkommen der iPSC-Technologie ist nun ein einfacher Zugang zu einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Zielzellen in Reichweite. Die Technologie ermöglicht die unbegrenzte Vermehrung von Zellen, die direkt von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen stammen, und die Differenzierung in die anfälligen neuronalen Subtypen, was die Entdeckung einzigartiger, humanspezifischer Krankheitsmodelle verspricht [3, 73, 77].

Genetische Anfälligkeit für Krankheiten ist ein Merkmal der meisten neurodegenerativen Erkrankungen, und da von Patienten stammende iPSCs den genetischen Hintergrund des Spenders tragen, ermöglicht dies eine genaue Modellierung genetischer Erkrankungen in vitro [44]. Somit kann eine personalisierte Medizin wie eine spezifische medikamentöse Behandlung und eine zellbasierte Transplantation mit benötigtem Gewebe unter Verwendung von patientenbezogenen krankheitsspezifischen iPSCs durchgeführt werden. Prüfen in vivo Funktion von proteinbasierten humanen iPSC-abgeleiteten NPCs und/oder DA-Neuronen wurden Transplantationsstudien in einem etablierten Nagetiermodell der PD mit striatalen Läsionen durchgeführt [114]. Wie durch Amphetamin-induzierte Rotationsscores bestimmt, führte eine hochkonzentrierte Zelllösung von Pro-NPCs, aber nicht die Zellen der terminalen Differenzierung, zu einer dramatischen funktionellen Erholung bei Parkinson-Ratten [114], was das klinische Potenzial von iPSCs für die personalisierte Zelltherapieanwendung unterstützt. Darüber hinaus können iPSCs auch für das Screening chemischer Bibliotheken zur Wirkstoffentdeckung verwendet werden [99, 115] sowie für die anschließende Prüfung auf Wirkstofftoxizität und -wirksamkeit [116]. Beispielsweise wurde zunächst festgestellt, dass Neuronen, die aus humanen iPSCs stammen, anfällig für Aggregate sind [116]. Anschließend durchsuchten die Forscher mithilfe der iPSCs eine chemische Bibliothek mit mehreren hundert Verbindungen und entdeckten mehrere kleine Moleküle wie GW8510 als wirksame Blocker gegen Toxizität [116]. Diese ebnen den Weg für eine rationalisierte, wirtschaftliche und effiziente Wirkstoffforschung und eine verbesserte Wirkstoffforschung.

Langfristiges Ziel iPSC-basierter Strategien ist es, patientenspezifische Spenderzellen für die Transplantationstherapie zu erzeugen und damit die ethischen Probleme und die fehlende Gewebe- und Zellverfügbarkeit zu überwinden und gleichzeitig die Immunabstoßung zu vermeiden, die eine wesentliche Komplikation in der aktuellen Transplantationsmedizin darstellt [ 4]. Mehrere Studien berichten über die Transplantation von iPSCs in neurodegenerative Krankheitsmodelle, insbesondere Nagetiermodelle [86, 114, 117, 118]. Eine frühe Studie zeigte, dass aus humanen iPSCs gewonnene neuronale Zellen in das fetale Mausgehirn transplantiert werden können [117]. Eine andere Studie zeigte, dass PD-abgeleitete iPSCs, die in Dopamin-Neuronen differenziert wurden, in das Striatum von adulten Nagetieren transplantiert werden konnten, wo einige Zellen Axone entwickelten, die in das Striatum hineinragten [86]. 6-Hydroxydopamin-(6-OHDA-)-läsionierte Ratten, denen die iPSC-erzeugten Neuronen transplantiert wurden, zeigten eine reduzierte Amphetamin- und Apomorphin-induzierte Rotationsasymmetrie [86]. Nizzardoet al.fanden ALS-Mäuse, die durch systemische Verabreichung von neuralen Stammzellen (NSCs) behandelt wurden, die von ALS-Patienten-iPSCs stammten, eine verbesserte neuromuskuläre Funktion, eine Pathologie der motorischen Einheit und eine signifikant verlängerte Lebensdauer im Vergleich zu Kontroll-ALS-Mäusen aufwiesen [118]. Eine andere Studie zeigte auch, dass die Transplantation von humanen proteinbasierten iPSCs (d. h. ohne virale oder andere DNA-basierte Vektoren abgeleitet) in Ratten mit Striatumläsionen motorische Defizite retten könnte [114].

6. Schlussfolgerungen und zukünftige Richtungen

In diesem Review haben wir unser Augenmerk auf neurodegenerative krankheitsspezifische iPSCs gerichtet und den aktuellen Stand der Forschung auf diesem Gebiet beschrieben. Wie oben diskutiert, haben iPSC-Forscher neue Strategien zur Untersuchung der Pathophysiologie menschlicher Erkrankungen entwickelt und Testsysteme für das Wirkstoffscreening sowie für die regenerative Medizin bereitgestellt. Die moderne Technik zur Generierung personalisierter iPSCs verändert unsere Denkweise hinsichtlich der Erforschung der Krankheitspathogenese und Therapieentwicklung. Unser Verständnis der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen wird derzeit durch die Schwierigkeiten bei der Gewinnung lebender Neuronen von Patienten und die Unfähigkeit, die sporadischen Formen der Erkrankung zu modellieren, eingeschränkt. Die Umprogrammierung adulter Körperzellen von Patienten in iPSCs und Neuronen kann diese Schwierigkeiten überwinden.

Aktuelle Forschungen deuten darauf hin, dass die für neurodegenerative Erkrankungen spezifische iPSC-Technologie die Erprobung von niedermolekularen Therapeutika und Zelltransplantationstherapien vor dem Einsetzen klinischer Symptome oder während der Anfangsstadien der Krankheit beschleunigen wird, damit Therapeutika schneller menschliche Patienten erreichen können. Vor der klinischen Anwendung von iPSCs müssen jedoch in naher Zukunft noch einige wichtige Fragen geklärt werden. Zu diesen Themen gehören die Erzeugung homogener Populationen von iPSCs und die Entwicklung effizienter Methoden zur Induktion und Authentifizierung von Zielzelltypen. Trotz großer Versprechen und intensiver Forschung zur iPSC-Technologie haben iPSCs noch kein Patientenleben gerettet. Die kontinuierliche Interaktion zwischen Forschern in den Bereichen grundlegende Stammzellbiologie, klinische Erforschung von Krankheiten, translationale Forschung, Pharmazie, Regulierungswissenschaft und Systembiologie wird entscheidend sein, um sicherzustellen, dass das Potenzial von iPSCs, die einen signifikanten Beitrag zur menschlichen Gesundheit leisten, zum Tragen kommt. iPSCs befinden sich in einer frühen, aber spannenden und vielversprechenden Entwicklungsphase, aber es bleiben noch viele Probleme, die vor dem Einsatz in der Klinik angegangen werden müssen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Wissen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 31171129 und 81460748) unterstützt.

Verweise

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Reprogrammierungsansätze

In der Säugetierentwicklung gehen vaskuläre Vorläufer hauptsächlich aus dem lateralen und posterioren Mesoderm hervor [33].Somit können Gefäßzellen aus der Differenzierung von iPSCs über drei Hauptstrategien abgeleitet werden: (1) iPSC-Differenzierung zum Mesoderm gefolgt von einer zelltypspezifischen Wachstumsfaktorbehandlung, (2) Kultur auf Polymerbeschichtungen (extrazelluläre Matrix) in Gegenwart von löslichen, Signalmoleküle und (3) genetische Manipulation von iPSCs durch ektopische Expression von Abstammungs- oder Zelltyp-spezifischen Transkriptionsfaktoren (Fig. 2).

iPSCs-basierte Erzeugung von Gefäßzellen. iPSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und in jeden Zelltyp des menschlichen Körpers zu differenzieren und sind daher attraktive Ressourcen, um eine unbegrenzte Anzahl von Gefäßzellen zu erzeugen. Die Differenzierung von iPSC wird durch Induktion der mesodermalen Differenzierung eingeleitet, entweder unter Bedingungen, die die Selbstaggregation der iPSCs zu dreidimensionalen embryoiden Körpern (EB) mit oder ohne zusätzliche Behandlung mit mesodermal-induktiven Faktoren fördern, oder durch Zugabe von mesodermal-induktiven Faktoren (BMP4 , Activin A/Nodal, FGF2- und GSK3-Inhibitoren oder WNT-Liganden) in chemisch definierten Monoschichtsystemen. Eine sukzessive Behandlung mit zelltypspezifischen Wachstumsfaktoren für die gewünschten Zelltypen erlaubt dann die Isolierung und Expansion der ausgewählten Gefäßzellen unter chemisch definierten Zellkulturbedingungen. Eine Sortierung nach zelltypspezifischen Zelloberflächenmarkern unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder immunomagnetischer Trennung könnte weiterhin verwendet werden, um die Reinheit der erzeugten Gefäßzellen zu erhöhen. Humane iPSC-abgeleitete Gefäßzellen, insbesondere Endothelzellen und glatte Muskelzellen, erwiesen sich als realistische Methode, um patientenspezifische Zellen zu gewinnen und für die Untersuchung von Krankheiten und deren Therapie einzusetzen. Diese Zellen stellen ein potenziell wertvolles Werkzeug für die Entwicklung robuster und reproduzierbarer Gefäßgewebe (Stammzellen-basiertes Gefäß-Engineering) für Krankheitsmodellierungs- und Wirkstoff-Screening-Anwendungen dar. Hypothetisch könnten Gefäßzellen auch durch einen direkten Programmieransatz erhalten werden, nämlich durch ektopische (Über-)Expression von gefäßzellspezifischen Transkriptionsfaktoren (TF) in humanen iPSCs oder durch die Einführung zelltypspezifischer microRNA (miR)-Moleküle, die Funktionen in RNA-Silencing und posttranskriptioneller Regulation der vaskulären Genexpression

Die Induktion der mesodermalen Differenzierung kann durch Bedingungen erreicht werden, die die Selbstaggregation der iPSCs zu dreidimensionalen embryoiden Körpern (EB) fördern, oder durch die Zugabe von Mesoderm-induktiven Faktoren in chemisch definierten Monolayer-Systemen. Die evolutionär ältesten Familienmitglieder Nodal, Activin und BMP sind Mitglieder der Transforming Growth Factor β (TGFβ) Superfamilie von Morphogenen, die TGFβs, Inhibine, knochenmorphogenetische Proteine ​​(BMPs), Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (GDF) und andere umfasst [ 34,35,36]. Kombinierte Gradienten der Nodal- und BMP-Signalgebung innerhalb des Primitivstreifens initiieren die Keimschichtbildung, kontrollieren die Endoderm- und Mesoderm-Keimschichtspezifikation und auch deren nachfolgende Musterbildung, während sie die Neuroektodermbildung blockieren [37, 38]. Die Activin/Nodal-Signalgebung erreicht die Mesendoderm-Spezifikation durch Interaktion mit anderen Schlüsselsignalwegen, insbesondere BMP und WNT, wobei die WNT-Signalgebung auch eine wesentliche Funktion bei der Mesodermbildung spielt, indem sie den PI3K/ERK-Signalweg blockiert und dadurch GSK3β hemmt, von dem bekannt ist, dass es Mesoderm . induziert Differenzierung [39, 40]. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF). FGF trägt zu diesem Prozess nicht nur durch die Förderung der Mesodermbildung, sondern auch durch die Hemmung der endodermalen Entwicklung bei [41]. Daher sind Activin und Nodal für die mesodermale Induktion essentiell, während FGF und WNT für ihre Aufrechterhaltung verantwortlich sind und BMP für ihre Musterbildung verantwortlich ist. Activin A/Nodal, BMP4, FGF2 und WNT-Liganden (z. B. WNT3A) oder GSK3-Inhibitoren (kanonische WNT-Aktivatoren, z. B. CHIR-99021) waren die derzeit am häufigsten verwendeten mesoderm-induktiven Faktoren. Es wurde gezeigt, dass induzierte mesodermale Vorläuferzellen dann ein bipotentes Differenzierungspotential mit der Fähigkeit besitzen, Endothel- und SMC-Linien zu erzeugen [42].

Egal, welcher Weg der mesodermalen Induktion gewählt wird, die verschiedenen Linien von Gefäßzellen entstehen dann aus der proliferierenden und differenzierenden iPSC in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrixmolekülen, Wachstumsfaktorinhibitoren, kleinen Molekülen und neutralisierenden Antikörpern, die verwendet werden können, um die Anreicherung der Endothelzellen oder SMC oder die Linie der Wahl fördern. Zur Identifizierung der Zelllinie der Wahl und zur Anreicherung der Zellen durch eine Form der Zellsortierung und -isolierung (Durchflusszytometrie-Sortierung oder immunomagnetische Trennung), monoklonale Antikörper zur Identifizierung spezifischer Zelloberflächenmoleküle oder genetische Markierung der iPSC mit linienspezifischen Fluoreszenz-Reportersystemen sind erforderlich. Nachfolgende Zugaben zahlreicher Wachstumsfaktoren (wie unten beschrieben) fördern die Gefßzellproliferation, -differenzierung und eventuelle Reifung während der in vitro-Kultur weiter.


Krankheitsmodellierung und Medikamentenscreening

Es wird allgemein angenommen, dass die Zelltransplantationstherapie die beste medizinische Anwendung von iPSCs darstellt. Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening sind unserer Meinung nach mindestens ebenso wichtig wie die Anwendungen der Zelltherapie (Yamanaka, 2010). Tiermodelle haben enorm zu einem besseren Verständnis der Krankheitsmechanismen beigetragen. Allerdings sind der Verwendung von Tiermodellen im Hinblick auf eine genaue Rekapitulation menschlicher Krankheiten Grenzen gesetzt. So wurde beispielsweise eine Reihe von Medikamenten entwickelt, die therapeutische Wirkungen in Nagetiermodellen der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) zeigten. Leider erwiesen sich alle von ihnen bei menschlichen Patienten als unwirksam, was die Notwendigkeit von Krankheitsmodellen mit menschlichen Zellen unterstreicht (Desnuelle et al., 2001 Shefner et al., 2004).

Krankheitsspezifische iPSC-Linien wurden erstmals 2008 von zwei Gruppen beschrieben (Dimos et al., 2008 Park et al., 2008) und in vitro Die Rekonstruktion des Krankheitszustandes gelang erstmals bei der spinalen Muskelatrophie (SMA) (Ebert et al., 2009 Ebert et al., 2012). Diese Studien zeigten nicht nur die Möglichkeit der Reproduktion von Krankheitsphänotypen durch die Verwendung von von Patienten stammenden iPSCs, sondern auch die potentiellen Anwendungen der Verwendung dieser Zellen für das Arzneimittelscreening. Bis heute wurden viele patientenspezifische iPSC-Linien etabliert und für die Krankheitsmodellierung verwendet und sollen Studien zu seltenen Krankheiten erleichtern (Bellin et al., 2012). Eine der entscheidenden Fragen in Bezug auf von Patienten stammende iPSCs ist eine angemessene Kontrolle. Obwohl ESCs und iPSCs von gesunden Spendern leicht erhältlich sind, sind die großen Unterschiede im genetischen Hintergrund mit Kontroversen bezüglich ihrer Verwendung für Vergleiche mit erkrankten Zellen verbunden. Zellen von gesunden Familienmitgliedern wie Müttern und Brüdern sind bessere Vergleichskontrollen, da sie weniger genetische Unterschiede zu den Zellen von erkrankten Spendern aufweisen. Jüngste Fortschritte bei Gen-Editing-Technologien unter Verwendung von Zinkfinger-Nukleasen und Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektor-Nukleasen haben die Genkorrektur in patientenspezifischen iPSC-Linien realistischer gemacht (Hockemeyer et al., 2009 Hockemeyer et al., 2011).


Scheinwerfer

Abstoßungssichere Transplantate aus eigenen Zellen? Erfahren Sie mehr über das Behandlungs- und Forschungspotenzial von iinduzierten pluripotenten Stammzellen
(iPS-Zellen) in diesem Feature-Artikel und 4-teiliger Videoserie.

Hämatologe George Q. Daley, MD, PhD, Direktor für Stammzelltransplantation
Programm, hat Kinder mit Blutkrankheiten sterben sehen, oft weil sie keine Kandidaten für eine Knochenmarktransplantation sind, die derzeit das beste Mittel zur Behandlung vieler dieser Krankheiten ist. Daley hofft, pluripotente Stammzellen einsetzen zu können, um sicherere, genetisch abgestimmte Knochenmarktransplantationen für Patienten herzustellen. Weiterlesen.

Kinder mit schweren Immunschwächen können keine Katze streicheln, im Sandkasten spielen oder sogar einen Elternteil umarmen, ohne eine lebensbedrohliche Infektion zu riskieren. Erfahren Sie mehr darüber, wie iPS-Zellen Forschern helfen, diese Krankheiten zu verstehen und neue Behandlungen zu erforschen.


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Bei Kreative Biolabs, erhöhen wir Ihre Forschungs- und Datenrelevanz, indem wir induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) aus einem spezifischen klinischen Patientenprofil erwerben und umprogrammieren. Unsere Pipeline ist so konzipiert, dass sie das Projekt des Kunden und die spezifischen Assay-Anforderungen für zelluläre Eigenschaften und Funktionen erfüllt.

IPSC-Neuprogrammierungsdienst

Die direkte Umprogrammierung von somatischen Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) ist eine wertvolle Methode, um patientenspezifische Stammzellen jeglicher Abstammung ohne Verwendung embryonaler Materialien herzustellen. Seit dem ersten Bericht über die Erzeugung von iPS-Zellen aus murinen Fibroblasten unter Verwendung der retroviralen Transduktion eines definierten Satzes von Transkriptionsfaktoren wurden verschiedene neue Strategien entwickelt, um die Reprogrammierungstechnologien zu verbessern. Verfahren zur Faktorreprogrammierung fallen in zwei große Kategorien: chemische und transgene Reprogrammierung. Es wurde berichtet, dass viele kleine Moleküle die Reprogrammierung fördern, wenn sie mit klassischen Reprogrammierungsfaktoren verwendet werden. Creative Biolabs hat Streamed-Line-Protokolle für eine effiziente iPSC-Generierung mit viralen Vektoren, DNA (Plasmid), RNA und rekombinanten Proteinen entwickelt. Jeder unserer Dienstleistungen wird ein umfassender Bericht zur Verfügung gestellt, der für Veröffentlichungen geeignet ist.

  • Retrovirus-Vektor
  • Lentiviren-Vektor
  • Adenovirus-Vektor
  • Sendai-Virus-Vektor
  • PiggyBac Transposon-Vektor
  • Episomaler Plasmidvektor
  • Direkte Lieferung von synthetischen mRNAs.
  • Reife doppelsträngige miRNAs
  • Faktorabgabe durch Protein

Die wichtigsten Faktoren, die bei der Entscheidung über ein Reprogrammierungsverfahren zur Erzeugung von iPSCs zu berücksichtigen sind, sind die zu reprogrammierende Zelle, die Fähigkeit des Reprogrammierungsverfahrens, diesen Zelltyp adäquat zu reprogrammieren, sowie ob das Vorhandensein integrierter Sequenzen in den iPSCs die nachgeschaltete Anwendung behindert .

Abb.1 Die aktuellen Reprogrammierungsstrategien, die verwendet werden, um pluripotente Stammzellen aus adulten Körperzellen zu induzieren. (Lai, 2011)

IPSC-Kulturdienst

Creative Biolabs ist weltweit führend in der Zellkultur, einschließlich der induzierbaren Zellliniengenerierung und der induzierten pluripotenten Stammzellkultur. Creative Biolabs bietet IPSC-Wartungsdienste und groß angelegte pluripotente Zellproduktion im 2D- und 3D-Format. Basierend auf unserer Expertise in der Zell- und Stammzellbiologie haben Wissenschaftler von Creative Biolabs einzigartige Medien entwickelt, die für die iPSC-Forschung unverzichtbar sind. Darüber hinaus wurden spezielle Produkte im Zusammenhang mit fortschrittlicher Zellkultur erfolgreich etabliert, um das Problem der täglichen Kulturarbeit zu lösen, darunter Mykoplasmen-Nachweiskits und BacAway-Kontaminationskontrollmittel.

Pluripotenter Charakterisierungsdienst

Technologische Fortschritte haben es immer einfacher gemacht, iPSC zu erzeugen, aber die Eigenschaften der verschiedenen produzierten Linien können je nach Quelle, Ableitung, Passagenanzahl und Kulturbedingungen variieren. Um die Pluripotenz, Qualität, Identität und Sicherheit der pluripotenten Zelllinien bei ihrer Gewinnung und Erhaltung zu bestätigen, ist es wichtig, eine Reihe von Charakterisierungsanalysen durchzuführen. Unsere Assay-Entwicklung wird von Wissenschaftlern mit umfangreicher Erfahrung in der pluripotenten Charakterisierung geleitet. Unsere Assay-Entwicklungsteams arbeiten nahtlos mit unseren Ressourcen zur iPSC-Generierung, Genom-Editierung und Zelldifferenzierung zusammen und bieten einen vollständig integrierten Service für Kunden, die führend im Bereich der iPSC-basierten Wirkstoffforschung werden möchten.

IPSC Genom Editing Service

Creative Biolabs bietet kundenspezifische Genome Editing Services in menschlichen Zellen, einschließlich Zelllinien und von Patienten stammenden Zellen. Obwohl Genome Editing für viele somatische Zelltypen nicht verfügbar ist, können unsere iPSC-basierten Dienste durch Genome Editing flexibel an Ihre Bedürfnisse angepasst werden.

  • Gen-Knock-out
  • Geninsertion
  • Gen Mutation
  • Genkorrektur oder Genersatz
  • Induzierbare Genexpressions-/Genüberexpressionsmodelle

IPSC-Unterscheidungsdienst

Creative Biolabs verfügt über umfassendes Know-how in der iPSC-Differenzierung und kann die flexibelsten, anpassungsfähigsten und anpassbarsten Lösungen für Ihr Projekt anbieten. Es stehen verschiedene Zelltypen wie Hepatozyten, Kardiomyozyten und Nervenzellen zur Verfügung. Weitere Dienstleistungen umfassen qRT-PCR von Pluripotenzgenen, Karyotypisierung zur Beurteilung der genomischen Stabilität und Tri-Lineage-Differenzierung zur Beurteilung der Pluripotenz in vitro.

Abb.2 Schematischer Überblick über Ansätze zur 1) Differenzierung glatter Muskelzellen (SMC) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), 2) Verwendung von SMC zur Modellierung von Gefäßerkrankungen und 3) Modulierung der Zellfunktion durch verschiedene Mikroumgebungssignale. (Ji, 2017)

Merkmale unserer Dienstleistungen

  • Benutzerdefinierter iPSC-Dienst
  • Eine Lösung aus einer Hand für Ihre iPSC-Anforderungen
  • Kompetentes wissenschaftliches Team
  • Hocheffizient
  • Strenge Qualitätskontrollprotokolle
  • Niedrige Kosten und rechtzeitige Einreichung
  • Pipeline aus einer Hand
  • Bester After-Sales-Service

Prozess und Zeitachse

Mit erstklassiger Expertise in der Ableitung, dem Scale-up von Bioprozessen und der Differenzierung von induzierten humanen pluripotenten Stammzellen kann unser Serviceteam die iPSC-Projekte abschließen und Ihnen pluripotente Stammzellen in nur 16-24 Wochen zur Verfügung stellen. Die tatsächlichen Zeitpläne variieren je nach Art der bereitgestellten Zelle, der Wahl der iPSC-Technologie und der Wahl anderer alternativer Charakterisierungsdienste.

Die Potenziale der iPS-Zelltechnologie in zellbasierten Therapien, in der Reproduktionsmedizin und in der biomedizinischen Forschung sind zu groß, um sie zu ignorieren. Richtige Reprogrammierungsstrategien sind entscheidend für die Erzeugung patienten- und krankheitsspezifischer Stammzellen, die in der regenerativen Medizin verwendet werden können. Kreative Biolabs' Stammzellprogramm bietet Weltklasse-Know-how in der Generierung, dem Scale-up von Bioprozessen und der Differenzierung von iPSCs und nutzt dies, um Lösungen für Ihre iPSC-Anforderungen bereitzustellen. Kontaktieren Sie uns noch heute, um Ihr iPSC-Projekt mit einem technischen Spezialisten zu besprechen.


Humane neuronale Stammzellen (iPSC-derived, ALS)

Neurale Stammzellen (NSCs) sind sich selbst erneuernde, multipotente Zellen, die den Haupt-Phänotyp des Nervensystems erzeugen. Sie differenzieren hauptsächlich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten [1] . Die jüngste Entdeckung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) überwindet nicht nur die ethischen und logistischen Probleme im Zusammenhang mit humanen embryonalen Stammzellen, sondern bietet auch eine flexible Plattform zur Erzeugung verschiedener differenzierter Zelltypen aus erkrankten Personen. Von iPSC abgeleitete NSCs sind eine potenziell wertvolle Quelle für in vitro Modelle für komplexe, polygene menschliche Erkrankungen und sind potenziell nützlich für die Wirkstoffforschung und zellbasierte Therapieanwendungen [2] .

iXCells Biotechnologies bietet hochwertige menschliche neurale Stammzellen (NSCs), die aus normalen oder erkrankten iPS-Zelllinien gewonnen werden. Diese Zellen exprimieren typische Marker von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen, z.B. Nestin, Pax6 und Sox1 (Abbildung 1 und Abbildung 2), mit einer Reinheit von mehr als 97 % (Abbildung 3). Die Zellen wurden vollständig auf ihre Selbsterneuerung und Multipotenz hin charakterisiert. Die von iPSC abgeleiteten NSCs können in Astrozyten oder Motoneuronen differenziert werden (Abbildung 4).

Alle von iXCells bereitgestellten Zellen sind negativ für Mykoplasmen, Bakterien, Hefen und Pilze. HIV-1, Hepatitis B und Hepatitis C. Die grundlegenden Spenderinformationen (Geschlecht / Alter / Rasse) werden für jede gekaufte Zellcharge bereitgestellt.

Abbildung 1. Von iPSC abgeleitete NSCs exprimieren Nestin und Pax6.

Figur 2. Von iPSC abgeleitete NSCs exprimieren Nestin und Sox1.

Figur 3. Mehr als 97 % der NSCs sind Nestin-positiv.

Figur 4. Von iPSC abgeleitete NSCs können in GFAP + Astrozyten (A) oder HB9 + Motoneuronen (B) differenziert werden.

Produktdetails

Humane neurale Stammzellen aus iPSCs (normal, krank)

Packungsgrösse

Wachstumseigenschaften

[1] Alenzi, F. Bahkali, A (2011). „Stammzellen: Biologie und klinisches Potenzial“. Afrikanisches Journal für Biotechnologie 10 (86): 19929–40.

[2] Dolmetsch R, Geschwind DH. (2011) „Das menschliche Gehirn in einer Schüssel: das Versprechen von iPSC-abgeleiteten Neuronen“. Zelle. 145(6):831-4.

Osaki, T., Uzel, S.G., &, Kamm, R.D. (2020). On-Chip-3D-neuromuskuläres Modell für Arzneimittelscreening und Präzisionsmedizin bei neuromuskulären Erkrankungen. Naturprotokolle, 15(2), 421-449. doi:10.1038/s41596-019-0248-1 -- Erfahren Sie mehr


Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind eine neue Art von pluripotenten Stammzellen, die erstmals 2006 in Mäusen erzeugt wurden. Sie stellen eine potenziell wichtige Ressource für Anwendungen in der regenerativen Medizin dar. In diesem Abschnitt werden wir uns ansehen, wie iPSCs hergestellt werden, warum sie wichtig sein könnten und wie sie eines Tages einen Beitrag in der Medizin leisten könnten.

Was für Zellen sind iPS-Zellen?

Induzierte pluripotente Stammzellen oder iPS-Zellen) wurden durch Einbringen einer kleinen Anzahl von Genen in gewöhnliche menschliche somatische (differenzierte) Zellen etabliert. Diese pluripotenten Zellen können sich in jeden Zelltyp des Körpers differenzieren und sich in Kultur unbegrenzt vermehren. iPS-Zellen wurden erstmals von der Gruppe von Professor Shinya Yamanaka an der Universität Kyoto erzeugt.

Der Prozess, eine Zelle von einem differenzierten in einen pluripotenten Zustand zu verändern, wird als Reprogrammierung bezeichnet. Die von der Yamanaka-Gruppe entwickelte Methode hat sich als hoch reproduzierbar, relativ einfach erwiesen und gilt als großer wissenschaftlicher Durchbruch.

Archivierung induzierter Pluripotenz

Wie werden iPS-Zellen wahrscheinlich genutzt?

Es wird angenommen, dass iPS-Zellen bei der Aufklärung von Krankheitsursachen, der Entwicklung neuer Medikamente sowie bei der Zelltransplantationstherapie und anderen Formen der regenerativen Medizin nützlich sein werden. Regenerative Medizin ist eine Therapie, die darauf abzielt, durch Krankheit oder Verletzung verloren gegangene Funktionen wiederherzustellen. In der regenerativen Medizin werden beispielsweise bei Diabetes mellitus Zellen transplantiert, die den Blutzuckerspiegel regulieren können, oder bei Traumata mit durchtrennten Nerven die Transplantation von Nervenzellen, die helfen können, die unterbrochene Verbindung wiederherzustellen. iPS-Zellen könnten verwendet werden, um diese transplantierten Zellen herzustellen.

Durch die Gewinnung von iPS-Zellen aus den Körperzellen von Patienten mit hartnäckigen Erkrankungen und deren Differenzierung in die Zellen des erkrankten Gewebes erhoffen wir uns, der Forschung die Aufklärung der Ursachen der jeweiligen Erkrankung zu ermöglichen. Ein Beispiel sind Krankheiten, die durch Veränderungen im Gehirn entstehen, da Gehirnzellen von lebenden Patienten nur sehr schwer zu gewinnen und zu untersuchen sind. Mit iPS-Zellen hoffen die Forscher, gesunde und kranke Zellen vergleichen zu können.

Mit iPS-Zellen wird es auch möglich sein, pharmazeutische Wirksamkeit, Nebenwirkungen und Toxizität in einer Weise zu bewerten und zu testen, die im menschlichen Körper nicht möglich ist, was der Entwicklung neuer Medikamente einen großen Impuls geben sollte. Sobald die Sicherheit gewährleistet ist, können wir uns zusätzlich über Anwendungen in der regenerativen Medizin freuen, einschließlich der Zelltransplantationstherapie mit Transplantation von Gewebe- und Organzellen, die durch Differenzierung aus patienteneigenen iPS-Zellen entstanden sind.

Das Potenzial von iPS-Zellen

Welche Forschung hat zur Erzeugung von iPS-Zellen geführt?

Wissenschaftler untersuchen seit Jahrzehnten die Möglichkeit regenerativer Ansätze zur Behandlung menschlicher Erkrankungen. 1981 etablierten Professor Martin Evans und Kollegen von der Universität Cambridge (UK) die erste Linie embryonaler Stammzellen (ES) der Maus. ES-Zellen sind ein bekannter Typ pluripotenter Zellen, aus denen jede Art von Zelle im Körper entstehen kann.

Siebzehn Jahre später etablierte Professor James Thomson die erste humane ES-Zelllinie, die als erste physiologische Quelle pluripotenter humaner Zellen das Interesse am Potenzial regenerativer Medizinanwendungen steigerte. Menschliche ES-Zellen sind jedoch problematisch, da ihre Gewinnung die Zerstörung von menschlichen Embryonen im Frühstadium beinhaltet, die bei In-vitro-Fertilisationsverfahren übrig geblieben sind, was zu verschiedenen ethischen und religiösen Debatten geführt und Regierungen in vielen Ländern dazu veranlasst hat, ihre Herstellung zu beschränken und zu verwenden, was es in einigen Fällen sogar für legitime Forschungszwecke schwierig macht, sie zu verwenden. Darüber hinaus würden aufgrund der Schwierigkeit, ES-Zellen von einzelnen Patienten zu gewinnen, menschliche ES-Zellen-basierte Zelltherapien in vielen Fällen die Verwendung von Zellen beinhalten, die aus Stammzellen einer anderen Person erzeugt wurden, was das Problem der Abstoßung durch das Immunsystem des Empfängers aufwerfen würde System.

Viele Labore auf der ganzen Welt untersuchten alternative Quellen für pluripotente Zellen, um diese Probleme zu vermeiden, als die Gruppe von Professor Shinya Yamanaka 2006 erstmals über Maus-iPS-Zellen berichtete, kurz darauf folgten 2007 menschliche iPS-Zellen.

Wie unterscheiden sich iPS-Zellen von menschlichen embryonalen Stammzellen?

Humane embryonale Stammzellen (ES) werden hergestellt, indem Zellen aus einem 6-7 Tage alten Embryo entnommen und in Kultur gezüchtet werden. Im Gegensatz dazu können induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung von Zellen eines erwachsenen Körpers, wie beispielsweise der Haut, erzeugt werden, die reichlich vorhanden und harmlos zu entfernen sind. Da dies nicht die Zerstörung eines Embryos erfordert, werden viele der ethischen Probleme vermieden, die menschliche ES-Zellen umgeben. Darüber hinaus ist es im Gegensatz zu humanen ES-Zellen möglich, patientenspezifische iPS-Zellen abzuleiten und in differenzierte Zellen verschiedener Typen zu induzieren, die dann ohne Risiko einer Immunabstoßung wieder in den Patienten transplantiert werden können.

Wie hat die Gruppe von Professor Shinya Yamanaka erstmals iPS-Zellen erzeugt?

Professor Shinya Yamanaka untersuchte die Gene, die in embryonalen Stammzellen (ES) exprimiert werden, und begann im Jahr 2000 mit der Suche nach einer alternativen Quelle für pluripotente Stammzellen. Seine Gruppe fand heraus, dass durch das Einführen einiger weniger dieser Gene – Oct3/4, Sox2, KLf4 und c-Myc – in somatische Zellen der Maus (Fibroblasten) durch retrovirale Vektoren und Kultivieren der Zellen für einige Wochen die Zellen umprogrammiert werden konnten in einen pluripotenten Zustand, der dem von ES-Zellen ähnelt, der im Körper in Zellen verschiedener Typen differenziert werden kann. Sein Team berichtete erstmals 2006 über seinen Erfolg mit Maus-iPS-Zellen und im November 2007 mit menschlichen iPS-Zellen.

Gibt es andere Methoden zum Erstellen von iPS-Zellen?

Labore auf der ganzen Welt arbeiten an neuen Methoden, um Pluripotenz zu induzieren. Zum Beispiel berichtete die Gruppe von Professor James Thomson in den Vereinigten Staaten gleichzeitig mit dem Bericht über menschliche iPS-Zellen durch die Shinya Yamanaka-Gruppe über eine Technik zur Herstellung menschlicher iPS-Zellen unter Verwendung einer etwas anderen Kombination von Genen - Oct3/4, Sox2, Nanog und Lin28 .

Eine Reihe anderer Gruppen haben verschiedene virale Vektoren, wie Lentiviren und Adenoviren, verwendet, Gene durch Chemikalien ersetzt und rekombinante Proteine ​​verwendet.

Nach dem ersten Durchbruch hat CiRA verschiedene Generierungsmethoden erforscht und ist es gelungen, eine Generationsmethode mit höherer Sicherheit zu etablieren. Dies wurde beispielsweise dadurch erreicht, dass das L-Myc-Gen das c-Myc-Gen ersetzte, von dem angenommen wurde, dass es das Risiko der Karzinogenese erhöht, und indem episomale Plasmide verwendet wurden, um erfolgreich humane iPS-Zellen ohne den Einsatz viraler Vektoren zu erzeugen, von denen angenommen wird, dass sie Krebs verursachen, indem sie das ursprüngliche Genom schädigen.

Können iPS-Zellen von Menschen jeden Alters hergestellt werden?

Ja, in Japan wurden iPSCs von Menschen im Alter von 6 bis 81 Jahren gewonnen. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Pluripotenz dieser Zellen.

Wann wird es möglich sein, iPS-Zellen in der Entwicklung neuer Medikamente (Drug Discovery) und in der regenerativen Medizin einzusetzen?

Im Vergleich zu 2006, als die Generation von iPS-Zellen erstmals angekündigt wurde, hat die iPS-Zellforschung große Fortschritte gemacht. Zu seinen Errungenschaften zählen die Förderung der Forschung zur Etablierung von Standards für iPS-Zellen, die Etablierung von Methoden zur Herstellung sicherer iPS-Zellen und die Bestätigung der therapeutischen Wirkungen und der Sicherheit an Labortieren. Im Jahr 2013 begann die klinische Forschung zur Bestätigung der Sicherheit beim Menschen. Aus Sicherheits- und anderen Gründen gibt es keinen festen Termin, aber die Forscher sind bestrebt, medizinische Anwendungen so schnell wie möglich verfügbar zu machen.

In welchen Geweben und Organen können ihre Zellen aus iPS-Zellen generiert werden?

Nach aktuellen Forschungsergebnissen aus Japan und Übersee sind iPS-Zellen in der Lage, sich in die konstituierenden Zellen einer Vielzahl von Geweben und Organen, darunter Nerven, Herzmuskel und Blut, zu differenzieren. Organe sind jedoch aufgrund ihrer dreidimensionalen (3D) Struktur komplexer. Kleine Lebern wurden beschrieben (Nature. 2013 Juli 25 499: 481-484), aber es gibt noch keine Berichte über große 3D-funktionelle Organe von menschlicher Größe. Dies ist ein Bereich, der eine Kombination von iPS-Zelltechnologien mit 3D-Druckern, Biomaterialien und anderen Technologien erfordert.

Wenn die iPS-Zelltechnologie etabliert ist und medizinische Anwendungen möglich werden, wird die Behandlung aller Krankheiten und Verletzungen möglich sein?

Theoretisch sollten sich iPS-Zellen in jeden der Zelltypen differenzieren können, aus denen der Körper besteht, aber das bedeutet nicht unbedingt, dass sie für jeden Zweck anwendbar sind. Ein relevantes Beispiel können Fälle von Hirnverletzungen sein, bei denen das Gedächtnis gespeichert ist, da die Bildung des Gedächtnisses und damit verbundene Fragen ein großes Rätsel auf dem Gebiet der Neurowissenschaften bleiben. Es kann auch Situationen geben, in denen es vorzuziehen ist, anstatt Zellen zu verwenden, auf das Aufkommen neuer Medikamente und therapeutischer Geräte zu warten. Durch die parallele Entwicklung von Partnerschaften mit anderen Forschungsbereichen müssen wir untersuchen, bei welchen Krankheiten die iPS-Zelltechnologie wirksam behandelt werden kann.

Ich habe in den Medien gelesen, dass iPS-Zellen eine Immunabstoßung verursachen können. Ist das wahr?

Im Mai 2011 wurden aus Mäusen hergestellte iPS-Zellen in andere genetisch identische Mäuse transplantiert. Aus den Ergebnissen wurde berichtet, dass iPS-Zellen wahrscheinlich eher eine Immunreaktion hervorrufen als embryonale Stammzellen (ES), und dieser Befund wurde in den Medien breit diskutiert (Zhao et al. Nature. 2011 May 13474(7350): 212- 215). Zu einer Zeit, als es noch keine klare Analyse gab, welche Reaktion nach einer Transplantation von iPS-Zellen auftreten könnte, war dies ein wichtiger Bericht. CiRA glaubte jedoch, dass detailliertere Tests erforderlich seien und antwortete mit einem Kommentar, der in einer US-Zeitschrift veröffentlicht wurde (Okita et al. Circulation Research 2011 Sep16109(7):720-721.).

In der von Zhao und seinen Kollegen durchgeführten Studie wurden bei der Transplantation undifferenzierte iPS-Zellen verwendet, dies unterscheidet sich jedoch deutlich von der tatsächlichen medizinischen Anwendung. Die Transplantation von undifferenzierten iPS-Zellen führt zur Bildung von Teratomen, so dass Zellen beim Einsatz in der medizinischen Praxis zunächst zur vollständigen Differenzierung in den Zielzelltyp induziert werden und erst nach Entfernung undifferenzierter Zellen transplantiert werden können. Wenn sich Tumore in unserem Körper bilden, reagiert das Immunsystem, um sie zu zerstören. Selbst wenn Teratome durch die Transplantation autologer iPS-Zellen in undifferenziertem Zustand entstehen, wie in der Studie von Zhao et al., ist nur zu erwarten, dass eine Immunreaktion auftritt, um sie zu zerstören.

Im Jahr 2013 führten CiRA-Professor Jun Takahashi und seine Gruppe Forschungen durch, bei denen aus iPS-Zellen generierte Nervenzellen in Affengehirne transplantiert wurden. Sie berichteten, dass aus iPS-Zellen stammende Neuronen, die mit den eigenen Zellen des Tieres hergestellt wurden, fast keine Immunreaktion verursachten. Wir müssen nun untersuchen, ob unter diesen Bedingungen, die denen der tatsächlichen medizinischen Transplantationspraxis entsprechen, eine Immunreaktion auftritt.

Welche Probleme sind mit der Sicherheit von iPS-Zellen verbunden?

In Japan und Übersee wird geforscht, um eine Zelltransplantationstherapie mit iPS-Zellen zu realisieren. Ein besorgniserregendes Sicherheitsproblem ist das Risiko der Tumorbildung. Insbesondere CiRA hat seine Ressourcen auf dieses Thema konzentriert.

Im Großen und Ganzen gibt es zwei Haupttheorien über den Mechanismus, durch den iPS-Zellen Tumore bilden können. Eine Theorie besagt, dass iPS-Zellen Tumoren entweder als Reaktion auf die Reaktivierung der in die Zelle eingebrachten Reprogrammierungsfaktoren oder durch eine Schädigung des ursprünglichen Zellgenoms durch die künstliche Insertion der Reprogrammierungsfaktoren bilden. Als Reaktion darauf wurde nach optimalen Reprogrammierungsfaktoren gesucht, die keine Reaktivierung verursachen, und ein Verfahren zur Erzeugung von iPS-Zellen entwickelt, bei dem Reprogrammierungsfaktoren nicht in die Zellchromosomen eingebaut werden und somit eine Schädigung des Wirtsgenoms vermieden wird.

Die andere Theorie besagt, dass Reste von undifferenzierten Zellen – Zellen, die die Differenzierung zum Zielzelltyp nicht erfolgreich abgeschlossen haben – oder andere Faktoren zur Bildung von Teratomen, einer Art gutartigen Tumors, führen. Diese Theorie erfordert die Erforschung der Proliferation und Differenzierung von iPS-Zellen.

1. Suche nach optimalen Reprogrammierungsfaktoren
Als Professor Shinya Yamanaka und sein Forschungsteam die erfolgreiche Generierung von Maus-iPS-Zellen ankündigten, verwendeten sie als einen der Reprogrammierungsfaktoren c-Myc, von dem bekannt ist, dass es ein Onkogen ist, also ein krebserregendes Gen. Es gab Hinweise darauf, dass dieses Gen innerhalb der Zelle aktiviert werden und die Bildung eines Tumors verursachen könnte. Im Jahr 2010 berichteten CiRA-Dozent Masato Nakagawa und sein Team jedoch, dass L-Myc ein vielversprechender Ersatzfaktor für c-Myc ist. Mit L-Myc erzeugte iPS-Zellen zeigen nicht nur nahezu keine Tumorbildung, sondern auch eine hohe Erfolgsrate und eine hohe Pluripotenz.

2. Suche nach optimalen Vektoren
Als die zur Erzeugung von iPS-Zellen erforderlichen Reprogrammierungsfaktoren in die Zellen der Haut oder anderer Körpergewebe eingefügt wurden, verwendeten frühe Verfahren ein Retrovirus oder Lentivirus als "Vektor" oder Träger. Bei diesen Verfahren werden die Zielgene in die Viren eingefügt, mit denen die Zellen dann infiziert wurden, um die Zielgene zu liefern. Bei Verwendung eines Retrovirus oder Lentivirus als Vektor werden die Viren jedoch zufällig in die genomische DNA der Zellen eingebaut. Dies kann dazu führen, dass einige der ursprünglichen Gene der Zellen verloren gehen oder in anderen Fällen aktiviert werden, was zu krebsartigen Veränderungen führt.

Um diesem Risiko zu begegnen, untersuchten CiRA-Dozent Keisuke Okita und sein Team 2008 die Verwendung eines zirkulären DNA-Fragments, eines sogenannten Plasmids, das nicht in das Zellchromosom eingebaut wird, als Ersatz für die Retrovirus- oder Lentivirus-Methoden. Auf diese Weise entwickelten sie eine Methode zur Erzeugung von iPS-Zellen, bei der die Reprogrammierungsfaktoren nicht in das Zellchromosom eingebaut werden. Im Jahr 2011 verbesserten Okita und sein Team die Effizienzgenerierung weiter, indem sie sechs Faktoren in ein selbstreplizierendes episomales Plasmid einführten – OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC und p53shRNA.

3. Etablierung einer Methode zur Generierung und zum Screening sicherer Zellen
Sobald iPS-Zellen induziert wurden, sich in die somatischen Zielzellen zu differenzieren, unter Verwendung der geeigneten Gene und Geninsertionsverfahren, wie oben erläutert, kann man sich darauf verlassen, dass die differenzierten Zellen nicht in den undifferenzierten Zustand zurückkehren. Es kann jedoch manchmal ein Rest von undifferenzierten Zellen vorhanden sein, die den Prozess der Differenzierung in die Zielzellen nicht abgeschlossen haben, und es ist möglich, dass diese Zellen, wie wenige auch immer, einen Tumor bilden können. Wissenschaftler hatten bereits festgestellt, dass verschiedene iPS-Zelllinien, selbst wenn sie mit derselben Methode vom gleichen Individuum erzeugt wurden, dennoch Unterschiede in den Proliferations- und Differenzierungspotentialen aufweisen können. Dies bedeutete, dass bei Verwendung von iPS-Zellen mit geringem Differenzierungspotential die Gefahr bestand, dass ein Zellrest in der Zellgruppe nicht vollständig differenzieren und zur Bildung eines Teratoms führen könnte. 2013 entwickelte ein Team um CiRA-Dozent Kazutoshi Takahashi und Dr. Michiyo Aoi, heute Assistenzprofessor an der Universität Kobe, eine einfache Methode, um nach iPS-Zelllinien zu suchen, die ein hohes Potenzial zur Differenzierung in Nervenzellen haben. Es besteht auch das Risiko einer Tumorentstehung durch genomische oder andere Schäden, die im Stadium der iPS-Zellerzeugung oder im nachfolgenden Kulturstadium auftreten. CiRA-Assistenzprofessor Akira Watanabe und sein Team haben mit modernster Ausrüstung eine sensitive Methode entwickelt, um genomische und andere Schäden in iPS-Zellen nachzuweisen.

4. Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Differenzierung in den Zielzelltyp
Bei der Zelltransplantationstherapie werden iPS-Zellen nicht direkt in den menschlichen Körper transplantiert. Stattdessen werden Zellen transplantiert, nachdem sie zuerst in den Zielzelltyp differenziert wurden. Daher ist es wichtig, ein zuverlässiges Verfahren zu entwickeln, um iPS-Zellen zur Differenzierung in den Zielzelltyp zu induzieren. CiRA arbeitet derzeit an der Entwicklung einer Technologie zur Differenzierung von iPS-Zellen in eine Reihe unterschiedlicher Zelltypen. CiRA-Professor Jun Takahashi und sein Team haben eine hocheffiziente Methode entwickelt, um iPS-Zellen dazu zu bringen, sich zu Dopamin-produzierenden Nervenzellen zu differenzieren. 2014 berichteten CiRA-Professor Koji Eto und sein Team über eine Methode zur Herstellung von Blutplättchen aus iPS-Zellen, die sowohl zuverlässig ist als auch hohe Volumina liefern kann. Diese Erkenntnisse stellen einen großen Schritt in Richtung einer auf iPS-Zellen basierenden regenerativen Medizin bei Nervenkrankheiten wie Parkinson und Blutkrankheiten wie der aplastischen Anämie dar.

Bis wann werden Sicherheitsprobleme überwunden?

Seit 2006 erstmals über die Generierung von iPS-Zellen berichtet wurde, hat die Forschung zu großen Fortschritten bei den Generierungsmethoden geführt, und es werden auch Methoden zur Qualitätsbewertung eingeführt. Im Jahr 2014 wurden einem Patienten mit altersbedingter Makuladegeneration (AMD) aus iPS-Zellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen transplantiert, ein bedeutender Meilenstein in der klinischen Anwendung der iPS-Zelltechnologie. Darüber hinaus ist im Fall von Rückenmarksverletzungen, Parkinson-Krankheit (Pressemitteilung 2014.03.07, Pressemitteilung 2013.09.27, Pressemitteilung 2012.01.27), Herzinsuffizienz und Blutkrankheiten einschließlich aplastischer Anämie die Sicherheit von iPS-Zell-basierten regenerativen Medizin wurde in Tierversuchen untersucht mit der Hoffnung, dass sie in den nächsten Jahren bei Patienten eingesetzt wird.

Aus Patientenzellen erzeugte iPS-Zellen können verwendet werden, um Zellen zu erzeugen, die das von der Krankheit betroffene Gewebe replizieren. Diese Technik bietet die Aussicht, mit iPS-Zellen die Wirksamkeit, Nebenwirkungen und Toxizität von Medikamenten zu testen und neue Medikamente und Therapien zu entwickeln. Welche Probleme müssen gelöst werden, um dieses Ziel zu erreichen?

Verglichen mit der Verwendung von tierischen Zellen oder anderen Materialien wird die Forschung mit Zellen, die aus von Patienten stammenden iPS-Zellen generiert werden, wahrscheinlich Modelle hervorbringen, die die Mechanismen menschlicher Krankheiten genauer widerspiegeln. Mit anderen Worten, es sollte uns ermöglichen, bessere Antworten auf die Frage nach der Entstehung von Krankheiten zu geben, und sollte daher nützlicher sein bei der Suche nach Medikamenten, die das Fortschreiten der Krankheit aufhalten, verzögern oder heilen können. Darüber hinaus werden iPS-Zellen aus einer Reihe unterschiedlicher genetischer Hintergründe erzeugt, sie dazu gebracht, sich in Zellen des Herzens, der Leber oder anderer Organe zu differenzieren, die für Arzneimittelnebenwirkungen anfällig sind, und dann diese Zellen den chemischen Verbindungen ausgesetzt, auf denen die Arzneimittel basieren , kann untersucht werden, ob diese Verbindungen die grundlegende Organfunktion beeinträchtigen oder andere Nebenwirkungen haben.

Diese Art der Forschung wird nicht nur die Zelltransplantation vorantreiben, sondern auch Therapien für mehr Patienten zugänglich machen. Wir freuen uns daher, dass diese Forschung in Zukunft stark gefördert wird. Ob Anomalien, die mit der iPS-Zelltechnologie auf zellulärer Ebene beobachtet wurden, jedoch die wahre Ursache für die tatsächliche Krankheit des Patienten sind, muss sorgfältig untersucht werden. Eine breit angelegte Forschung ist auch erforderlich, um die Wirksamkeit von Medikamenten zu untersuchen, die mit iPS-Zelltechniken entdeckt wurden, und ob diese Medikamente ausreichend sicher sind.

Über CiRA

Die folgenden Antworten basieren auf Informationen, die ab Oktober 2015 verfügbar waren.


Stammzellwissenschaftler und Postdoc-Stellen, Abteilung für präklinische Innovation

Nationales Gesundheitsinstitut
Nationales Zentrum zur Förderung der Translationswissenschaften
Abteilung für präklinische Innovation
Abteilung Chemische Genomik
Stammzell-Translationslabor
Rockville, Maryland

Beschreibung

NCATS, eine wichtige Forschungskomponente des NIH, sucht Bewerbungen von qualifizierten Kandidaten mit Expertise in Entwicklungsbiologie und humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), um Stammzellwissenschaftler und Postdoktorandenstellen im Stem Cell Translation Laboratory (SCTL) innerhalb der Chemical Genomics zu besetzen Zweigstelle der Abteilung für präklinische Innovation des Zentrums. Das SCTL konzentriert sich auf die Translation humaner pluripotenter Stammzellen wie iPSCs in klinische Anwendungen und die Wirkstoffforschung durch die Entwicklung innovativer Technologien, Methoden und umfassender Multi-Omics-Datensätze durch Differenzierung in relevante Zelltypen in 2-D/3-D-Zellkultursystemen . Erfolgreiche Kandidaten haben die Möglichkeit, ihre Fähigkeiten in einem hochdynamischen Umfeld zu entwickeln, eingebettet in ein Team leidenschaftlicher Wissenschaftler, die an einer Vielzahl von Projekten im Zusammenhang mit der translationalen Stammzellbiologie arbeiten. Sie haben die Möglichkeit, mit erfahrenen Bioinformatikern am NCATS, externen Dienstleistern und Mitarbeitern an führenden akademischen Einrichtungen zu interagieren.

Kernaufgaben

Die ausgewählten Kandidaten werden Teil eines multidisziplinären Teams innovativer Wissenschaftler mit Expertise in den Bereichen Assay-Entwicklung, High-Throughput- und High-Content-Screening, Compound-Management, Automatisierungstechnik, Bioinformatik, medizinische Chemie und verschiedene „-omics“-Technologien. Sie arbeiten in einem hochkreativen Umfeld und konzentrieren sich auf wichtige Aspekte der menschlichen Pluripotenz und zellulären Differenzierung unter Verwendung modernster Technologien (z. B. Einzelzellanalyse, Tiefensequenzierung, Roboterzellkultur, Hochdurchsatz-Elektrophysiologie, Genom-Editierung). Sie führen genaue und vollständige Aufzeichnungen über alle wissenschaftlichen Experimente nach festgelegten Verfahren und stellen sicher, dass diese Aufzeichnungen und Rohdaten ordnungsgemäß aufbewahrt werden. Sie erstellen auch technische Berichte, Manuskripte und Patentanmeldungen und präsentieren die Arbeit intern und extern bei Bedarf Beratern und Mitarbeitern.

Qualifikationen

Jeder Bewerber muss über einen fortgeschrittenen Abschluss (M.D. und/oder Ph.D.) in einem relevanten Bereich verfügen. Berücksichtigt werden außergewöhnliche Kandidaten mit Master-Abschluss und starkem Hintergrund in der Stammzellbiologie. Kandidaten mit Erfahrung in der Wirkstoffforschung, Zell- und Gewebezüchtung, Zellsignalisierung oder quantitativer Biologie werden ermutigt, sich zu bewerben. Die idealen Kandidaten sollten Teamplayer mit hohem wissenschaftlichen Anspruch sein und die Fähigkeit besitzen, in einem interaktiven, schnelllebigen Umfeld zu arbeiten. Sie müssen eigenmotiviert neue Technologien erlernen und mit den Methoden und Konzepten der Stammzellbiologie und regenerativen Medizin vertraut sein.

Stipendien/Leistungen

Es werden jährliche Stipendien gewährt und basieren auf dem NIH Postdoctoral Intramural Research Training Award-Skala Krankenversicherungsleistungen sind verfügbar.Die Stipendiaten können auch an den Kursen der Foundation for Advanced Education in the Sciences am NIH teilnehmen.

So bewerben Sie sich

Bitte senden Sie ein Anschreiben, in dem Ihr Interesse an der Stelle beschrieben wird, einen aktuellen Lebenslauf und ein vollständiges Literaturverzeichnis sowie die Namen und Kontaktdaten für drei Referenzen an [email protected]

Die Prüfung der Bewerbungen beginnt sofort und wird bis zur Besetzung der Stelle fortgesetzt.