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Hat Harnstoff in unterschiedlichen Konzentrationen (5 oder 0,5 M) unterschiedliche Auswirkungen auf Proteine?

Hat Harnstoff in unterschiedlichen Konzentrationen (5 oder 0,5 M) unterschiedliche Auswirkungen auf Proteine?


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Das Problem besteht darin, zu erklären, warum jeder Zusatzstoff die Verteilung des Proteins (RMAS) verursacht, wie im folgenden Western-Schlag gezeigt:

In jedem Fall wurden die Homogenate einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation unterzogen und die Überstand/Pellets-Fraktionen wurden getrennt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Gele wurden geblottet und mit einem gegen RMAS erzeugten Antikörper sondiert.

Ich hänge speziell daran fest, die Wirkung der zu erklären 0,5 Mio. Harnstoff vs 5 Mio. Harnstoff auf den löslichen und unlöslichen Proteinen, die durch das Pellet bzw. den Überstand repräsentiert werden. Ich denke, dass bei niedrigen Harnstoffkonzentrationen (0,5 M) das Pelletprotein durch Harnstoff destabilisiert wird und die Löslichkeit zunimmt, was eine Bande zeigt. Lösliche Proteine ​​sind jedoch denaturiert und zeigen keine Bande. Bei 5 M Harnstoff sind die Pelletproteine ​​jedoch reversibel löslich und zeigen sich daher nicht als Bande, während die löslichen Proteine ​​in Ordnung sind und daher eine "normale" Bande zeigen. Ich weiß nicht, ob das die richtige Erklärung ist, könnte mir das bitte jemand erklären??


Was Sie tun müssen, ist, die relativen Mengen des Proteins in der unlöslichen (Pellets) Fraktion mit der löslichen (Überstand) zu vergleichen. Auf diese Weise können Sie feststellen, wie löslich das RMAS durch die Wirkung der angegebenen Verbindung geworden ist.

DTT bricht Disulfidbindungen auf, tut aber nichts anderes, um das Protein aufzulösen, also befindet sich alles im Pellet, ohne dass im Supe nachweisbar ist. NaCl ist ein Salz, das die ionische "Stärke" des Lysepuffers erhöht, aber das Protein nicht wirklich löslich macht, so dass wieder das gesamte Ziel im Pellet bleibt. Auf der anderen Seite befreien Detergenzien wie Triton und SDS das Protein aus der unlöslichen Fraktion und bewegen den größten Teil davon in den Überstand, was zu dem Muster führt, das Sie für sie sehen. Abhängig von der genauen subzellulären Lokalisation des interessierenden Proteins und der Menge und Kombination der verwendeten Detergenzien können Sie im Wesentlichen kein Protein im Pellet sehen, da alles gelöst wurde.

Harnstoff und Guanidiniumhydrochlorid sind chaotrope Mittel, die Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Kräfte und die Schwächung hydrophober Assoziationen unterbrechen, wodurch das Protein denaturiert und sich von anderen Proteinen im Pellet trennt, wodurch es in die Supe eingebracht wird. Dieser Effekt wird im Allgemeinen bei relativ hohen Molaritäten beobachtet (z. B. wird GuHCl oft im Bereich von 6–8 M verwendet), was den Unterschied in der Wirkung erklärt, der bei 0,5 und 5 M Harnstoff beobachtet wird. Bei niedrigen Konzentrationen ist einfach nicht genug Harnstoff vorhanden, um das Protein effektiv zu denaturieren. Das überrascht mich ein wenig nichts tauchte in der 0,5-M-Spur auf, dies ist jedoch nur a simuliert Western mit idealen Ergebnissen - im wirklichen Leben sind die Dinge fast nie ganz so abgedroschen.


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