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Warum bilden E.coli parallele Cluster?

Warum bilden E.coli parallele Cluster?



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Discalimer: Ich bin kein Biologe. Ich modelliere das E.Coli-Wachstum und im Wikipedia-Gif kann man einige Gruppen beobachten, in denen die Bakterien nebeneinander liegen und ungefähr im gleichen Winkel ausgerichtet sind. Ich habe einige Simulationen durchgeführt und ähnliche Ergebnisse erhalten. Gibt es einen Grund, warum dies passiert?


Die Zellteilung erfolgt durch Teilung in der Mitte des Stäbchens, so dass das Ergebnis zwei Tochterzellen sind, die fast im gleichen Winkel stehen. Im Laufe der Zeit führt dies in Abwesenheit von Bewegung, die Zellen umher bewegt, zu einer Gruppe von Zellen, die nicht unabhängige Zellorientierungen aufweisen.

Weitere Informationen, einschließlich der Art und Weise, wie Menschen sie dazu veranlasst haben, etwas anderes zu tun, finden Sie in diesem Papier.


Bakterienzellen ziehen es vor, sich in paralleler Ausrichtung aneinander anzuheften, damit sie eine maximale Kontaktfläche haben und Biofilm-Cluster bilden können.

Sowohl physikalische Faktoren (wie Brownsche Bewegung, elektrostatische Wechselwirkungen, Schwerkraft, Van-der-Waals-Kräfte und Hydrodynamik) als auch die zelluläre Funktion in Bakterienzellen (bakterielle Motilität, Produktion von Polysacchariden und Funktionen von Strukturen in der äußeren Membran) sind für diese Orientierung verantwortlich.

(Über: https://www.nature.com/articles/srep29516)


Das unerschöpfliche Potenzial von E coli

E coliSeine Widerstandsfähigkeit, Vielseitigkeit, sein breiter Gaumen und seine einfache Handhabung haben ihn zum am intensivsten untersuchten und am besten verstandenen Organismus auf dem Planeten gemacht. Forschungen zu E coli hat ihn in erster Linie als Modellorganismus untersucht, der von jeglicher Naturgeschichte abstrahiert ist. Aber E coli ist weit mehr als nur eine mikrobielle Laborratte. Vielmehr handelt es sich um einen sehr vielfältigen Organismus mit einer komplexen, facettenreichen Nische in freier Wildbahn. Aktuelle Studien zu ‘wild’ E coli haben zum Beispiel viel über seine Präsenz in der Umwelt, seine Vielfalt und Genom-Evolution sowie seine Rolle im menschlichen Mikrobiom und bei Krankheiten enthüllt. Diese Erkenntnisse haben Aspekte seiner Biologie und Ökologie beleuchtet, die weitreichende Fragen aufwerfen und veranschaulichen, wie eine Wertschätzung von E coliNaturgeschichte kann seinen Wert als Modellorganismus ausbauen.


REVIEW Artikel

Arshpreet Bhatwa 1,2 , Weijun Wang 1 , Yousef I. Hassan 1 , Nadine Abraham 1,3 , Xiu-Zhen Li 1 und Ting Zhou 1*
  • 1 Guelph Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, Guelph, ON, Kanada
  • 2 Fachbereich Biologie, University of Waterloo, Waterloo, ON, Kanada
  • 3 Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, Kanada

Rekombinante Proteine ​​werden für industrielle Anwendungen immer wichtiger, bei denen Escherichia coli ist der am häufigsten verwendete bakterielle Wirt für ihre Produktion. Die Bildung von Einschlusskörperchen ist jedoch eine häufig anzutreffende Herausforderung bei der Herstellung löslicher und funktioneller rekombinanter Proteine. Um diese Hürde zu überwinden, wurden verschiedene Strategien entwickelt, indem die Wachstumsbedingungen angepasst, Wirtsstämme von E coli, Ändern von Expressionsvektoren und Modifizieren der interessierenden Proteine. Diese Ansätze werden mit einigen der neuen Entwicklungen in dieser Übersicht umfassend beleuchtet. Darüber hinaus werden die einzigartigen Eigenschaften von Protein-Inclusion Bodies, der Mechanismus und die Einflussfaktoren ihrer Bildung sowie ihre potenziellen Vorteile diskutiert.


Bedeutung genomischer Inseln

Alle pathogenen Stämme von E coli enthalten genomische Regionen (Inseln), die mit einer Reihe von Virulenzgenen beladen sind, die Schlüsselmerkmale für Adhärenz/Kolonisation, Invasion, Sekretion toxischer Verbindungen und Transportfunktionen sowie Siderophorproduktion (Touchon .) kodieren et al., 2009). Einige dieser Kapazitäten sind auch in Kommensale vorhanden E coli Belastungen und kann die Umweltfitness verbessern, obwohl dies oft nicht erkannt wird. Für die Pathogenität ist oft ein vollständiges Komplement von inselübertragenen Merkmalen erforderlich, die zusammen das Verhalten definieren (Touchon et al., 2009). Basierend auf aktuellen Genomsequenzierungsprojekten ist die Diversität über E coli Genome wird heute besser verstanden als je zuvor (Kudva et al., 2002 Touchon et al., 2009). Es ist klar, dass insbesondere horizontale Gentransfers an der Verbreitung der virulenzbezogenen genomischen Inseln über verschiedene E coli Stämme (Ochman und Jones, 2000 Touchon et al., 2009). So hat sich in jüngster Zeit das Bild eines für die Art charakteristischen Kerngenoms von etwa 2000 Genen zusätzlich zu einem offenen Pfannengenom (derzeit etwa 18� Gene) herausgebildet (Touchon et al., 2009), die den großen Einfluss des horizontalen Gentransfers auf die genomische Plastizität der Art veranschaulicht ( Abbildung 1 ). Eine Analyse der Stellen, an denen Einfügungen oder Löschungen bevorzugt auf allen aufgetreten waren E coli Genome identifizierten kürzlich 133 solcher Hotspots (Touchon et al., 2009). 2a veranschaulicht eine hypothetische Darstellung solcher Stellen über die Genome von kommensalen, EHEC- und UPEC-Stämmen. Ein konkretes Beispiel, das in Abbildung 2b dargestellt ist, bietet die pheV tRNA-Hotspot, der die verschiedenen Inserts der Stämme K-12 MG1655, O157:H7 (Sakai) und CTF073 (Touchon et al., 2009). Bemerkenswerterweise enthielten alle vier untersuchten typischen UPEC/ExPEC-Stämme an dieser Stelle durchweg ein ähnliches Insert, das als bezeichnet wird Brei Operon. Es wurde festgestellt, dass dieses Operon eine Rolle in E coli Fitness bei Harnwegsinvasion. Interessanterweise waren einige Genmodule zwischen den pheV Inseln des UPEC-Stammes CFT073 und des Stammes K12 ( 2b ). Im Gegensatz dazu ist die pheV Der Insertions-Hotspot im O157:H7-Stamm (Sakai) bestand aus 32 stammspezifischen kodierenden Regionen, die neben den Genen für mutmaßliches Enterotoxin und Zytotoxin auch Gene für hypothetische Proteine ​​umfassten.

Der Durchschnitt E coli Genom wird durch eine Vielzahl evolutionärer Kräfte geformt, die aus seinen primären (Wirt) und sekundären Habitaten stammen, in denen sowohl biotische (Räuber, Konkurrenten, Betrüger, Abwehrmechanismen des Wirts) als auch abiotisch (pH, Temperatur, UV, Mineralstoffmangel usw.) Drücke vorhanden sind. E coli Stämme besitzen einen Kern von etwa 2000 Genen, die sie mit einem vielseitigen Stoffwechsel ausstatten. Die E coli pan-Genom besteht aus ca. 18� Genen, wovon 11% zum Kern (dunkelblau) gehören, ein Großteil (62%, blau) besteht aus sogenannten ‘persistenten Genen und 26% können als „flüchtige“ Gene angesehen werden (blassblau) (Touchon et al., 2009). Ereignisse des Generwerbs und -verlusts sind durchgängig mit Insertions-/Deletions-Hotspots (rot) verbunden und formen kooperativ die E coli Genom mit selektiv erhaltenen Core/persistenten Genen. Diese Ereignisse können zur Evolution von Genclustern führen, die spezifische E coli Phänotypen, wie z Brei Operon, das an der Pathogenese von Harnwegsinfektionen durch UPEC-Stämme beteiligt ist (siehe Abbildung 2). Der Pfeil stellt einen hypothetischen Gradienten dar, bei dem E coli genomische Merkmale, die höchstwahrscheinlich mit volatilen, persistenten und Core-Genen in Verbindung stehen, werden gezeigt.

Wenn vollständige Genome von E coli Stämme ausgerichtet sind, können typische Insertions-/Deletions-Hotspots an entsprechenden Stellen identifiziert werden, wie sie hypothetisch in (ein). Sowohl die Größe als auch die Genzusammensetzung dieser Regionen können sich zwischen den Stämmen stark unterscheiden, wie in (B) für die pheV Hotspot der tRNA-Insertion. Hier das pheV Hotspots kommensaler (K-12 MG1655), enterohämorrhagischer (EHEC, O157:H7 Sakai) und uropathogener (UPEC, CTF073) Stämme werden nach den Daten von Touchon . verglichen et al. (2009). In unterschiedlichen Mustern/Farben hervorgehobene Abschnitte der Insertions-Hotspots entsprechen verschiedenen Genmodulen (siehe Touchon et al., 2009 für Details). Das Pap-Operon (rot) spielt eine Rolle bei Harnwegsinfektionen, ist eine genomische Signatur von UPEC/ExPEC-Stämmen und findet sich in der pheV Insertions-Hotspots der Stämme CFT073, APEC O1, S88, UMN026 und IAI39. Schwarze Abschnitte stellen Gene/Genmodule dar, die spezifisch für die entsprechenden Stämme sind. Die pheV Insertions-Hotspot im O157:H7-Stamm Sakai besteht aus 32 stammspezifischen CDs, die unter anderem für 22 hypothetische Proteine, 4 Transposasen, 1 mutmaßliches Enterotoxin und 1 mutmaßliches Zytotoxin kodieren. Grün markierte Genmodule sind bei den pheV Inseln der Stämme K-12 und CFT073. Gene in diesen Modulen kodieren unter anderem für Glykolatoxidasen, einen Glykolattransporter und mutmaßliche Nukleosidtriphosphathydrolasen. (Eine Vollfarbversion dieser Figur ist erhältlich unter Das ISME-Journal online).

Trotz der Tatsache, dass wir derzeit über so detaillierte Informationen über die oft erheblichenE coli genomischer Variation fehlt uns ein allgemeines Verständnis dafür, wie sich die genomische Zusammensetzung in einer komplexen offenen Umgebung in spezifisches Verhalten/Überleben niederschlägt. Eine reale Möglichkeit besteht darin, dass wir oft die Umweltrelevanz bestimmter Inselmerkmale übersehen, die für den pathogenen Prozess als wichtig angesehen werden. Ein Beispiel dafür ist das mobile Eisenaufnahme-Operon-System ybt, ursprünglich als sogenannte Insel mit hoher Pathogenität bezeichnet, die häufig in E coli bei asn tRNA-Insertionsstellen (Schubert et al., 2004). Eine Untersuchung von Online-Genomdaten hat uns gezeigt, dass dieses Operon tatsächlich über die verschiedenen verteilt war E coli Untergruppen sowohl in pathogenen als auch in kommensalen Formen (Abbildung 3). Das Operon kann als ein umweltrelevantes Merkmal angesehen werden, das aufgrund seines Vorkommens in vielen Arten und Gattungen der Familie durch horizontalen Gentransfer übertragbar ist Enterobakterien (Schubert et al., 2009). Wir wissen jedoch nicht, was es zu den bereits beträchtlichen eisenfangenden Fähigkeiten von hinzufügt E coli.

Auftreten des Handys ybt Operon, das das Yersiniabactin (Ybt)-Eisengewinnungssystem kodiert E coli Stämme verschiedener phylogenetischer Gruppen und Lebensstile. Alle gezeigten Stämme, mit Ausnahme von ECOR 02 und O6:K5:H1 DSM6601, haben ihre vollständigen Genome sequenziert. Die Insel ist in den Phylotypen B2 und D stark vertreten. Sein Vorkommen bei kommensalen Vertretern der B2-Gruppe deutet auf eine ökologische Relevanz und möglicherweise auf eine Übernahme durch angestammte B2-Typen hin. Eine Rolle der ybt Operon als mögliche ‘saprophytische Insel' postuliert werden kann, da es in Bakterien unterschiedlicher Lebensweise weit verbreitet ist, einschließlich E coli Stämme der phylogenetischen Gruppen A, B1, B2, D und E (Hacker und Carniel, 2001). Eine allgemeine Darstellung der funktionalen und ‘mobilen Abschnitte der Insel ist von Schubert . übernommen et al. (2004) und in der oberen Tafel gezeigt. asn, asn tRNA-Gen int, Integrase-kodierendes Gen. Gene im funktionalen Operoncode für irp, eisenregulierte Proteine, einschließlich irp2 (Ybt-Peptidsynthetase) und irp1 (Ybt-Peptid/Polyketid-Synthetase) ybtA, Transkriptionsaktivator vom AraC-Typ und fyuA, äußeres Membranprotein. Andere Gene/Gencluster, die häufig auf genomischen Inseln vorkommen und die E coli Stämme, die in mehreren Nischen gedeihen oder als Saprophyten, Kommensalen oder Pathogene fungieren, sind diejenigen, die an der Multiarzneimittel-/Antibiotika-Resistenz und an der Produktion von Adhärenzfaktoren beteiligt sind (Übersicht in Hacker und Carniel, 2001).


Catabolite Activator Protein (CAP): Ein Aktivator-Regulator

So wie die trp Operon durch Tryptophanmoleküle negativ reguliert wird, gibt es Proteine, die an die Operatorsequenzen binden, die als positiver Regler Gene einzuschalten und zu aktivieren. Wenn beispielsweise Glukose knapp ist, E coli Bakterien können sich anderen Zuckerquellen als Brennstoff zuwenden. Dazu müssen neue Gene zur Verarbeitung dieser alternativen Gene transkribiert werden. Wenn der Glukosespiegel sinkt, beginnt sich zyklisches AMP (cAMP) in der Zelle anzusammeln. Das cAMP-Molekül ist ein Signalmolekül, das am Glukose- und Energiestoffwechsel beteiligt ist E coli. Wenn der Glukosespiegel in der Zelle sinkt, bindet sich akkumulierendes cAMP an den positiven Regulator Katabolit-Aktivatorprotein (CAP), ein Protein, das an die Promotoren von Operons bindet, die die Verarbeitung alternativer Zucker steuern. Wenn cAMP an CAP bindet, bindet der Komplex an die Promotorregion der Gene, die benötigt werden, um die alternativen Zuckerquellen zu nutzen (Abbildung 1). In diesen Operons befindet sich eine CAP-Bindungsstelle stromaufwärts der RNA-Polymerase-Bindungsstelle im Promotor. Dies erhöht die Bindungsfähigkeit der RNA-Polymerase an die Promotorregion und die Transkription der Gene.

Abbildung 1. Wenn der Glukosespiegel sinkt, E coli kann andere Zucker als Treibstoff verwenden, muss dafür aber neue Gene transkribieren. Wenn die Glukoseversorgung begrenzt wird, steigt der cAMP-Spiegel. Dieses cAMP bindet an das CAP-Protein, einen positiven Regulator, der an eine Operatorregion stromaufwärts der Gene bindet, die für die Verwendung anderer Zuckerquellen erforderlich sind.


4 Der Biofilm als Standardwachstumsmodus

Im Labor werden Bakterien im Allgemeinen planktonisch gezüchtet, aber die in Kulturgefäßen geschaffenen utopischen Mikrokosmen sind darauf ausgelegt, die Bakterienwachstumsraten zu maximieren und nicht die natürlichen Wachstumsbedingungen der Bakterien zu replizieren. Tatsächlich scheinen einige Bakterienarten den Biofilmmodus außerhalb des Labors konstitutiv zu nutzen. Die oralen Streptokokken sind sehr gut an das sessile Wachstum auf der Zahnoberfläche angepasst. Den meisten oralen Bakterienarten fehlt eine Umweltnische und sie kommen fast ausschließlich im Mund vor [24]. Bei diesen Bakterien würde das planktonische Wachstum dazu führen, dass sie schnell vom Speichel weggespült, geschluckt und in den sauren Säften des Magens zerstört werden. Diese Bakterien verbringen wahrscheinlich den größten Teil ihrer natürlichen Existenz als Biofilm. Und doch werden sie oft planktonisch im Labor gezüchtet.

Es ist möglich, dass nur die Anwesenheit eines geeigneten Substrats zur Anhaftung erforderlich ist, um die Biofilmbildung auszulösen. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass unmittelbar nach der anfänglichen Anhaftung von Bakterien an einer festen Oberfläche Veränderungen in der Genregulation auftreten [ 4, 44]. Dies deutet darauf hin, dass Zellen tatsächlich die feste Oberfläche wahrnehmen, an der sie befestigt sind, und dass dieses Sensorsystem eine Signalkaskade auslöst, die zu einigen der frühen Genexpressionsmuster führen kann, die für die Biofilmbildung notwendig sind. Zum Beispiel in P. aeruginosa, Ausdruck von algC, ein Gen, das für die Alginatsynthese benötigt wird, innerhalb von Minuten nach der Anheftung erhöht ist, und wenn S. epidermidis Kontakt mit einer festen Oberfläche, bildet die normalerweise kugelförmige Zelle einen beinartigen Fortsatz [ 45, 46]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Bakterienzellen, ähnlich wie eukaryontische Zellen, Oberflächensensorsysteme besitzen, die intrazelluläre Signale induzieren, die stark genug sind, um zu transkriptionellen und morphologischen Veränderungen zu führen.

Die von Bakterien verwendeten Sensormechanismen zum Nachweis von Adhärenz sind nicht gut verstanden. Veränderungen der wahrgenommenen Osmolarität durch Ladungen auf festen Oberflächen können ein wichtiger Hinweis für Bakterien sein, Oberflächen zu erkennen [ 22]. Es wurde auch gezeigt, dass das Zweikomponentensystem EnvZ-OmpR, das an der Erfassung der Umweltosmolarität beteiligt ist, die Expression von Curli und Colansäure reguliert [ 47, 48]. Die fibrilläre Oberflächenstruktur Curli spielt eine Rolle bei der Adhärenz und Colansäure ist ein Exopolysaccharid, das an der Aggregation beteiligt ist. Die Rolle der Osmolarität bei der Biofilmregulation wurde auch bei Staphylokokken festgestellt [13] und Pseudomonas fluorescens[49]. Insgesamt könnte der Biofilm-Wachstumsmodus der Standard-Wachstumsmodus für zumindest einige Bakterienarten sein, was darauf hindeutet, dass wir uns eher fragen sollten, was den planktonischen Wachstumsmodus auslöst, als was den Biofilm-Wachstumsmodus motiviert.


E coli

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E coli, (Escherichia coli), eine Bakterienart, die normalerweise den Magen und den Darm bewohnt. Wann E coli in verunreinigtem Wasser, Milch oder Lebensmitteln verzehrt oder durch den Stich einer Fliege oder eines anderen Insekts übertragen wird, kann es zu Magen-Darm-Erkrankungen kommen. Mutationen können zu Stämmen führen, die Durchfall verursachen, indem sie Giftstoffe abgeben, in die Darmschleimhaut eindringen oder an der Darmwand kleben bleiben. Die Therapie von Magen-Darm-Erkrankungen besteht größtenteils aus Flüssigkeitsersatz, obwohl in einigen Fällen spezifische Medikamente wirksam sind. Die Krankheit ist in der Regel selbstlimitierend, ohne Hinweise auf Langzeitwirkungen. Gefährliche Stämme, wie z E coli O157:H7 und E coli O104:H4, kann im Extremfall blutigen Durchfall, Nierenversagen und Tod verursachen. Das richtige Garen von Fleisch und das Waschen von Produkten können eine Infektion durch kontaminierte Lebensmittelquellen verhindern. E coli kann bei Frauen auch Harnwegsinfektionen verursachen.


Gramm-Färbung

E. coli wird als gramnegatives Bakterium beschrieben. Dies liegt daran, dass sie mit der Gram-Färbung negativ färben.

Die Gram-Färbung ist eine Differenzierungstechnik, die häufig zur Klassifizierung von Bakterien verwendet wird. Die Färbetechnik unterscheidet zwischen zwei Haupttypen von Bakterien (grampositiv und gramnegativ), indem sie den Zellen Farbe verleiht.

Als gramnegative Bakterien besitzen E. coli eine zusätzliche äußere Membran, die aus Phospholipiden und Lipopolysacchariden besteht. Die Anwesenheit von Lipopolysacchariden auf der äußeren Membran von Bakterien verleiht ihr eine negative Gesamtladung der Zellwand. Aufgrund dieser Eigenschaften behält E. coli während der Gram-Färbung kein Kristallviolett.


Diskussion

Die Möglichkeit der Stickstofffixierung in Pflanzen durch die Einführung von nif Gene in Pflanzenzellen wird seit dem ersten Schritt der Übertragung vorgeschlagen nif Gene von einem diazotrophen Bakterium zu einem nichtdiazotrophen Bakterium wurde vor mehr als 45 Jahren realisiert (35). Dies ist jedoch kein leichtes Ziel, und es gibt viele anerkannte Herausforderungen, darunter die Vielzahl der beteiligten Gene, die Notwendigkeit, eine ausgewogene Expression von Nif-Komponenten aufrechtzuerhalten, den Bedarf an Energie und Reduktionsleistung und die Sauerstoffempfindlichkeit von Stickstoffase. Die Entwicklung von Werkzeugen der synthetischen Biologie hat es ermöglicht nif Cluster-Redesign und kombinatorische Hochdurchsatz-Bibliotheken von Genteilen, um komplexe Kombinationen von Nif-Proteinen in Prokaryoten oder Eukaryoten zu exprimieren (15, 29). Um eine stöchiometrische Expression von Nif-Komponenten zu erreichen, wurde eine Polyprotein-basierte Strategie verwendet, um die Genzahl zu reduzieren, was zu einer ausgewogenen Expression von Proteinkomponenten führte, die für die Nitrogenase-Biosynthese und -Aktivität erforderlich sind (36). Um zu untersuchen, ob pflanzliche Elektronentransportketten ihre prokaryontischen Gegenstücke als Elektronendonatoren ersetzen können, um die Nitrogenase-Katalyse zu unterstützen, wurden aus Pflanzenorganellen abgeleitete Elektronentransportmodule in rekonstituiert E coli und es stellte sich heraus, dass sie als Elektronendonatoren für Nitrogenase dienen (37). Da Pflanzen potenziell die Energie und Reduktionsleistung liefern können, die zur Unterstützung der Nitrogenase-Aktivität erforderlich sind, kann dies die Genzahlen, die für die technische Stickstofffixierung in Pflanzen erforderlich sind, weiter reduzieren.

Pflanzenorganellen gelten aufgrund ihrer Rolle bei der Energieumwandlung seit langem als geeignete Orte für Nitrogenase und könnten daher potenziell die hohen Konzentrationen von ATP und die für die Nitrogenase-Aktivität erforderliche Reduktionsleistung bereitstellen (10). Die Atmungsaktivität der Mitochondrien und das Vorhandensein eines Eisen-Schwefel-Cluster-Assemblys in dieser Organelle legen nahe, dass die mitochondriale Matrix wahrscheinlich sauerstoffarm ist und somit eine geeignete Umgebung für Nitrogenase bieten könnte. Dies wurde durch die bahnbrechende Demonstration bestätigt, dass das Nitrogenase-Fe-Protein, die sauerstoffempfindlichste Komponente der Nitrogenase, in einer vollständig aktiven Form aus aerob angebauter Hefe gereinigt werden kann, wenn es in Mitochondrien exprimiert wird (12). Damit ist das Sauerstoffproblem zumindest für diese Organelle gelöst. Im Gegensatz dazu konnte, wie vielleicht erwartet, eine geringere Fe-Proteinaktivität aus Chloroplasten gewonnen werden, und in diesem Fall war die Einbeziehung der Nif-spezifischen Eisen-Schwefel-Cluster-Assembly-Komponenten NifU und NifS erforderlich, um Aktivität unter aeroben Bedingungen zu erreichen (16).

Obwohl der Aufbau des aktiven Fe-Proteins relativ wenige Nif-Komponenten erfordert, sind die Anforderungen für die Biosynthese des MoFe-Proteins weitaus komplizierter und umfassen mindestens einen minimalen Gensatz von neun Nif-Proteinen mit dem zusätzlichen Bedarf an Molybdän, Homocitrat und S-Adenosylmethionin zur Unterstützung der Biosynthese von FeMo-co. Obwohl viele Nif-Proteine ​​in Hefe- und Pflanzenmitochondrien exprimiert wurden, um eine geeignete stöchiometrische Expression von Komponenten zu erreichen, sind Löslichkeits- und Stabilitätsprobleme aufgetreten (13, 15). In einigen Fällen war es möglich, die Biodiversität von Nif-Proteinen zu nutzen, die aus verschiedenen Diazotrophen stammen. Mit dieser Strategie wurde ein lösliches und in vitro-funktionelles NifB aus M. infernus wurde bei Expression in Hefemitochondrien erhalten (14, 17). Die Expression und der Aufbau des NifDK-Tetramers waren jedoch problematisch, möglicherweise aufgrund einer abweichenden proteolytischen Verarbeitung von NifD. Dies schafft eine beträchtliche Barriere für die Expression des aktiven MoFe-Proteins in Mitochondrien.

Da viele Proteine ​​innerhalb von Organellen im nuklearen Genom kodiert sind, verwenden Engineering-Strategien häufig einen Targeting-Ansatz, bei dem Leader-Peptide verwendet werden, um Proteine, die von nukleären Transgenen exprimiert werden, in Organellen zu transportieren. Protein-Targeting ist besonders wichtig bei der Entwicklung von Mitochondrien, da noch keine stabile und bequeme Transformationsmethode für diese Organellen entwickelt wurde. Dies ist auch für das Engineering von Chloroplasten von Nutzpflanzen relevant, da die Plastidentransformation zwar bei dikotylen Modellpflanzen Routine ist, bei Monokotyledonen jedoch nicht gut etabliert ist. Der auf Organellen abzielende Ansatz erfordert eine effiziente Translokation des Proteins durch beide mitochondrialen Membranen und eine geeignete Prozessierung und Spaltung des Leader-Peptids, sobald das Präprotein in die mitochondriale Matrix eingetreten ist. Normalerweise führt dieser Prozess zur Verarbeitung des Proteins zur richtigen Größe, obwohl es oft wichtig ist, verschiedene Leader-Peptide zu testen, um eine genaue Verarbeitung zu erreichen. Obwohl wir der Ansicht waren, dass eine Reihe von Endopeptidasen-Kandidaten für den Abbau von NifD in der mitochondrialen Matrix verantwortlich sein könnten, konzentrierten wir uns, nachdem wir die für die Spaltung erforderliche Region identifiziert hatten, auf die Möglichkeit, dass die mitochondriale prozessierende Peptidase eine sekundäre Prozessierung von NifD durchführte zu Rest R98. Obwohl die von MPPs erkannten Aminosäuresequenzen signifikant degeneriert sind, deutete die Bedeutung von R98 und die Positionierung eines aromatischen Rests zwei Reste stromabwärts (Y100) auf eine Spaltung durch das MPP hin (38). Die vollständige Konservierung des R98-Äquivalents in Kombination mit dem hochkonservierten Y100-Rest in NifD-Proteinen aus verschiedenen Quellen impliziert, dass das Abbauproblem nicht durch die Nutzung der Biodiversität von NifD-Proteinen gelöst werden kann (38). Tatsächlich fanden wir dies bei der Untersuchung der Stabilität von NifD aus vier verschiedenen Diazotrophen in Hefemitochondrien und entdeckten, dass die Spaltung in jedem Fall durch Konstruktion der äquivalenten R98K-Substitution verhindert werden konnte (Abb. 1E).

Um eindeutig zu bestätigen, dass das MPP für die Spaltung verantwortlich war, rekonstituierten wir Hefe-MPP in E coli und zeigte, dass das Protein eine endoproteolytische Spaltung von NifD durchführt, um die gleichen prozessierten Fragmente zu erzeugen, die in Hefe beobachtet wurden. Diese Aktivität ist nicht spezifisch für Hefe-MPP, da sie auch bei drei pflanzlichen MPPs beobachtet wurde, wobei die Verarbeitung in jedem Fall durch die NifD R98-Variante verhindert wurde (Abb. 2). In Hefe sind beide MPP-Untereinheiten in der Matrix lokalisiert (39), während in Pflanzen beide MPPα und MPPβ Untereinheiten sind vollständig in das Cytochrom integriert bc1 Komplex der Atmungskette als Core1- bzw. Core2-Proteine ​​(40). Schon seit E coli besitzt keine Gene, die für a . kodieren cyt bc1 Komplex (41) könnte die Rekonstitution von MPPs vom Pflanzentyp in diesem Wirt möglicherweise die Verarbeitungsaktivität beeinflussen. Wir beobachteten jedoch, dass die MPPs vom Pflanzentyp das Su9-Leader-Peptid effizient in E coli (Abb. 3B), die frühere Beweise dafür, dass der Elektronentransfer innerhalb des cyt bc1 Komplex ist für die Verarbeitung nicht erforderlich (42).

Obwohl wir innerhalb von NifD eine interne Schnittstelle für MPP identifiziert haben, bleibt die Zugänglichkeit dieser Schnittstelle nach dem Targeting auf Hefemitochondrien unklar. Die Translokation durch die mitochondrialen Membranen erfordert, dass sich NifD in einem ungefalteten Zustand befindet, und während dieser Zeit wird das Protein MPP ausgesetzt, um das Signalpeptid zu entfernen. Wir vermuten, dass MPP während dieser Zeit auch die interne Stelle von NifD spaltet, bevor das Protein in die richtige Form gefaltet wird. Dieses sekundäre Spaltungsereignis könnte vor der Interaktion mit NifK auftreten, was die Schwierigkeit beim Zusammenbau stabiler NifDK-Heterotetramere in Hefemitochondrien erklärt (15). Alternativ ist es möglich, dass MPP NifD erkennt, das nach der Translokation in die mitochondriale Matrix fehlgefaltet ist. Wenn dies jedoch der Fall wäre, wäre es schwierig zu erklären, wie die R98P-Variante eine korrekte Faltung induziert. Darüber hinaus ist die Protease im intakten bakteriellen System gegen Wildtyp-NifD aktiv, was einen starken Beweis dafür liefert, dass die Fehlfaltung nicht die Hauptursache für den Abbau ist. Nichtsdestotrotz ist es wichtig anzumerken, dass die Spaltung von NifD im bakteriellen System nicht unbedingt bedeutet, dass das MPP die reife Form des MoFe-Proteins mit vielen Metallclustern erkennt. Die MPP-Spaltung könnte in Abhängigkeit von der Montagekinetik in einem Stadium vor der Reifung des Nitrogenase-MoFe-Proteins erfolgen. Zum Beispiel könnte Apo-NifDK durch die Protease gespalten werden, aber das Holo-NifDK-Tetramer, das mit Metallclustern gefüllt ist, kann eine Konformation aufweisen, in der die Spaltungsstelle unzugänglich ist. Zusammenfassend ist es schwierig zu unterscheiden, ob die MPP-Spaltung an der internen Stelle in NifD in Hefemitochondrien vor der Faltung dieses Proteins stattfindet oder ob die Spaltstelle während der Reifung des Holo-NifDK-Heterotetramers zugänglich bleibt.

Pflanzenorganellen sind wichtige Ziele für die Einführung heterologer Stoffwechselwege oder komplexer biologischer Systeme für die Pflanzengentechnik. Unsere Ergebnisse heben Probleme hervor, die mit der korrekten Verarbeitung von auf Organellen gerichteten Fremdproteinen verbunden sind, und zeigen das Risiko einer abweichenden Verarbeitung als Folge von unterschwelligen Signalpeptid-Spaltungsstellen in Nicht-Wirts-Proteinsequenzen auf. Obwohl das Auftreten solcher Sequenzen wahrscheinlich zufällig ist, können Signalpeptidspaltungsproteasen als „Gatekeeper“ für Fremdproteine ​​angesehen werden. Da die von den prozessierenden Peptidasen erkannten Aminosäuresequenzen beträchtlich degeneriert sind, ist es schwierig genau vorherzusagen, ob Fremdproteine ​​nach dem Eintritt in die Organellen abgebaut werden. Unser Ansatz zur Rekonstitution von MPPs in E coli bietet einen einfachen biologischen Assay, um die Stabilität vor dem Engineering in Eukaryoten vorab zu bewerten und, falls erforderlich, eine gerichtete Evolution für eine stabile Expression in Mitochondrien durchzuführen.


Einzelmolekül-Enzymologie: Nanomechanische Manipulation und Hybridmethoden

K. Manibog, . S. Sivasankar, in Methoden der Enzymologie, 2017

3.2 Konstruktion von Proteinen für AFM-Kraftmessungen

Rekombinante Proteine ​​können für AFM-Kraftmessungen unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken erzeugt werden. Die einzige Voraussetzung ist, dass die Proteine ​​mit einem molekularen Griff versehen werden, der verwendet werden kann, um das Protein auf einer Oberfläche zu immobilisieren. Während in der Literatur eine Vielzahl von Immobilisierungschemien wie die Immobilisierung über Cys-Reste (Dietz et al., 2006) beschrieben wurde, verwenden wir in unseren Experimenten Streptavidin-Biotin-Chemie, um Ecad zu immobilisieren. Kurz gesagt werden die extrazellulären Domänen voller Länge von Ecad mit einem C-terminalen Avi-Tag (zur Biotinylierung), einer Tev-Sequenz (zur proteolytischen Spaltung) und einem His-Tag (zur Proteinreinigung) in HEK293T-Zellen exprimiert und gereinigt aus den konditionierten Medien unter Verwendung eines Nickel-NTA-Harzes. Nach der Proteinreinigung wird die Avi-Tag-Sequenz mit dem BirA-Enzym (BirA500 Kit Avidity) biotinyliert. Da diese Protokolle in unseren früheren Arbeiten ausführlich beschrieben wurden ( Manibog et al., 2014 Rakshit et al., 2012 Zhang, Sivasankar, Nelson, & Chu, 2009 ) und nicht das Hauptaugenmerk dieser Übersichtsarbeit bilden, werden wir diese nicht diskutieren Methoden genauer.


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