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Doppel-PCR mit Tailed Primer

Doppel-PCR mit Tailed Primer


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Ich möchte eine Doppel-PCR mit Universal-Tailed-Primer machen. Die erste PCR würde ein Amplikon mit Schwanz erzeugen. Die zweite PCR würde ein mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Fragment erzeugen. Hier ist mein Protokoll. Können Sie mir sagen, ob ich falsch liege?

  • Ist mein zweiter PCR-Forward-Primer so konzipiert, dass er gut zum Schwanz passt?
  • Wie wäre das Verhältnis von Primer, wenn ich die beiden PCRs zu einer zusammenführen möchte?

Faust-PCR (funktioniert)

In Fettdruck haben Sie den Schwanz M13(-20)

Vorwärts: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTTCTGCAGTTGTACTGAGTGAA-3'
Rückseite: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Für 1 Probe mischen

  • Wasser = 15,8 µL
  • MgCl2 (25mM) = 18µL
  • Puffer (5x) = 6µL
  • dNTP (4mM) = 1,5µL
  • Vorwärts(20 pmol/µL) = 1µL
  • Umgekehrt (20 pmol/µL) = 1µL
  • GoTaq (5U/µL) = 0,15 µL
  • DNA (50ng/µL) = 1 µL

Zweite PCR ( funktioniert nicht = kein Fragmentsignal )

Vorwärts: 5'-[FAM]-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
Rückseite: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Für 1 Probe mischen

  • Wasser = 15,8 µL
  • MgCl2 (25mM) = 18µL
  • Puffer (5x) = 6µL
  • dNTP (4 mM) = 1,5 µL
  • Vorwärts(20 pmol/µL) = 1µL
  • Umgekehrt (20 pmol/µL) = 1µL
  • GoTaq (5U/µL) = 0,15 µL
  • DNA (50ng/µL) = 1µL von meinem vorherigen Amplikon

Ich bin mir nicht sicher, Ihre Frage zu verstehen. Ich kann sagen, dass wir in meinem Labor auch Fluoreszenzfarbstoffe (für die SSR-Erkennung) verwenden. Aber wir machen es mit einem einstufigen Ansatz:

Unsere Forward-Primer sind wie Ihre, denen die Fluo-Sequenz (M13-Forward-Primer) vorausgeht. Aber anstatt eine zweite PCR zu machen, fügen wir direkt den Fluo-Primer (nennen wir ihn M13-FAM) in die erste PCR hinzu. Es ist WIRKLICH wichtig, Ihren M13-Vorwärts-Primer in einer geringeren Menge als den Rückwärts-Primer zu verwenden (Faktor 10 für mich). Um das zu erreichen verwende ich 0,1mM Primerlösungen und mische meine Primer vorher

Für 96 Wells (20µL/Well)

Primer-Mix

  • 1,25 µL M13-F-Primer
  • 12,5 µL R-Primer
  • 240 µL Wasser

PCR-Mix

  • 200 µL Primer-Mix
  • 20 µl M13-FAM
  • Master-Mix 1 ml
  • Wasser 1 ml



Bemerkungen:

  1. Mikat

    Thank you, went to read.

  2. Andres

    Zugegeben, dies ist Informationsspaß

  3. Net

    Es scheint mir, dass es bereits besprochen wurde, nutzen Sie die Forumsuche.

  4. Faruq

    There may be another option



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