Doppel-PCR mit Tailed Primer

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Ich möchte eine Doppel-PCR mit Universal-Tailed-Primer machen. Die erste PCR würde ein Amplikon mit Schwanz erzeugen. Die zweite PCR würde ein mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Fragment erzeugen. Hier ist mein Protokoll. Können Sie mir sagen, ob ich falsch liege?

Ist mein zweiter PCR-Forward-Primer so konzipiert, dass er gut zum Schwanz passt?
Wie wäre das Verhältnis von Primer, wenn ich die beiden PCRs zu einer zusammenführen möchte?

Faust-PCR (funktioniert)

In Fettdruck haben Sie den Schwanz M13(-20)

Vorwärts: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTTCTGCAGTTGTACTGAGTGAA-3'
Rückseite: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Für 1 Probe mischen

Wasser = 15,8 µL
MgCl2 (25mM) = 18µL
Puffer (5x) = 6µL
dNTP (4mM) = 1,5µL
Vorwärts(20 pmol/µL) = 1µL
Umgekehrt (20 pmol/µL) = 1µL
GoTaq (5U/µL) = 0,15 µL
DNA (50ng/µL) = 1 µL

Zweite PCR ( funktioniert nicht = kein Fragmentsignal )

Vorwärts: 5'-[FAM]-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
Rückseite: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Für 1 Probe mischen

Wasser = 15,8 µL
MgCl2 (25mM) = 18µL
Puffer (5x) = 6µL
dNTP (4 mM) = 1,5 µL
Vorwärts(20 pmol/µL) = 1µL
Umgekehrt (20 pmol/µL) = 1µL
GoTaq (5U/µL) = 0,15 µL
DNA (50ng/µL) = 1µL von meinem vorherigen Amplikon

Ich bin mir nicht sicher, Ihre Frage zu verstehen. Ich kann sagen, dass wir in meinem Labor auch Fluoreszenzfarbstoffe (für die SSR-Erkennung) verwenden. Aber wir machen es mit einem einstufigen Ansatz:

Unsere Forward-Primer sind wie Ihre, denen die Fluo-Sequenz (M13-Forward-Primer) vorausgeht. Aber anstatt eine zweite PCR zu machen, fügen wir direkt den Fluo-Primer (nennen wir ihn M13-FAM) in die erste PCR hinzu. Es ist WIRKLICH wichtig, Ihren M13-Vorwärts-Primer in einer geringeren Menge als den Rückwärts-Primer zu verwenden (Faktor 10 für mich). Um das zu erreichen verwende ich 0,1mM Primerlösungen und mische meine Primer vorher

Für 96 Wells (20µL/Well)

Primer-Mix

1,25 µL M13-F-Primer
12,5 µL R-Primer
240 µL Wasser

PCR-Mix

200 µL Primer-Mix
20 µl M13-FAM
Master-Mix 1 ml
Wasser 1 ml

Bemerkungen:

Mikat
2022-03-27, 09:35:45

Thank you, went to read.
Andres
2022-04-19, 03:26:16

Zugegeben, dies ist Informationsspaß
Net
2022-05-18, 09:11:15

Es scheint mir, dass es bereits besprochen wurde, nutzen Sie die Forumsuche.
Faruq
2022-05-20, 16:36:26

There may be another option