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Genomweite Methylierungsanalyse: technische Fehlerquellen?

Genomweite Methylierungsanalyse: technische Fehlerquellen?


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Wir führen eine genomweite Analyse der Methylierung mittels Bisulfit-Sequenzierung für eine Insektenart durch. Frühere experimentelle Techniken haben das Vorliegen von Methylierung in diesem Organismus nahegelegt, einschließlich einer AFLP-Analyse unter Verwendung methylierungsempfindlicher Restriktionsenzyme und einer Differentialexpressionsanalyse unter Verwendung eines Methylierungsinhibitors.

Unsere Bisulfit-Sequenzierungsdaten geben uns jedoch im Wesentlichen keine Hinweise auf eine Methylierung. Wenn dieser Befund wahr ist, wird es eine ziemlich große Sache sein. Aber bevor wir diesen Weg gehen, wollen wir sicherstellen, dass wir alle technischen Fehlerquellen ausgezählt haben.

  • Zuerst fragten wir uns, ob die Bisulfit-Behandlung fehlgeschlagen war, stellten aber schnell fest, dass dies das Ergebnis nicht erklären würde. Wenn die Umwandlung von C --> T mit einer extrem hohen Rate fehlgeschlagen wäre, würden Sie erwarten, dass überall Methylierung zu sehen ist. Das ist das Gegenteil von dem, was wir sehen, nämlich keine Methylierung.

  • Zweitens fragten wir uns, ob es bei der Bisulfit-Behandlung eine Art "Überbelichtungsproblem" gab, das dazu führte, dass sogar methyliertes Cs in Ts umgewandelt wurde. Wir haben ein Papier gefunden, das dieses Phänomen beschreibt[1], aber Berichte, die wir finden können, deuten darauf hin, dass dies in einer geringen (<10 %) Rate geschieht, was unsere Daten nicht erklären kann.

  • Drittens haben wir uns gefragt, ob es vielleicht ein Problem mit der Reads-Zuordnung zum Genom gibt, wir haben eine Mapping-Effizienz von mindestens 70% für jede BS-seq-Probe, also kann es auch nicht daran liegen.

Gibt es andere technische Fehlerquellen, die wir berücksichtigen und prüfen sollten, bevor wir diesem Ergebnis glauben?


  1. Genereux DP, Johnson WC, Burden AF, Stöger R, Laird CD (2008)Fehler bei der Bisulfit-Umwandlung von DNA: Modulation der Frequenzen von unangemessenen und fehlgeschlagenen Umwandlungen. Nukleinsäureforschung, 36(22):e150, doi:10.1093/nar/gkn691.

Invasive und nicht-invasive nicht-funktionierende gonadotrope Hypophysentumoren unterscheiden sich im DNA-Methylierungsgrad von sich wiederholenden LINE-1-Elementen

Obwohl die Autoren die meisten Kommentare angemessen behandelt haben, gibt es einige kleinere Bedenken, die beachtet werden sollten:

  • Der Paragraph &ldquoLINE-1-Sequenz enthält zwei offene Leserahmen, L1-ORF1 und L1-ORF2, die für ORF1p (RNA-Bindungsprotein) bzw. ORF2p (Reverse Transkriptase und Endonuklease) kodieren. Diese beiden Proteine ​​kooperieren, um eine Retrotransposon-Sequenz in neue Chromatin-Zielstellen einzuführen [13]&rdquo wurde nicht von der Diskussion in den Einführungsteil verschoben. Diese Bedenken wurden von den Autoren nicht angesprochen. Obwohl sie den Einführungsteil verbessert haben, gibt es immer noch keine Informationen über die beiden offenen Leserahmen.
  • Der Satz &ldquoBeim Vergleich der Expressionsniveaus von L1-ORF1 und L1-ORF2 zwischen invasiven und nicht-invasiven Tumoren wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (Abbildung 2a)&rdquo sollte kurz vor dem Satz &ldquo . verschoben werdenAnalyse der LINE-1-Methylierungs- und Expressionsniveaus&hellip.&rdquo. Bitte geben Sie auch (Abbildung 2b) am Ende dieses Satzes an &ldquoAnalyse der LINE-1-Methylierungs- und Expressionsniveaus&hellip.&rdquo.
  • In Zeile 223 sollte Abbildung 2c anstelle von Abbildung 2b erscheinen.
  • In der Legende von Fig. 2 ist (b) nicht angegeben.
  • In Abbildung 3 befinden sich keine Bilder oder Grafiken, wenn die Datei heruntergeladen wird. Bitte korrigieren Sie diesen Fehler.

Kommentar des Rezensenten: Die Absatz-&ldquoLINE-1-Sequenz enthält zwei offene Leserahmen, L1-ORF1 und L1-ORF2, die für ORF1p (RNA-Bindungsprotein) bzw. ORF2p (Reverse Transkriptase und Endonuklease)-Proteine ​​kodieren. Diese beiden Proteine ​​kooperieren, um eine Retrotransposon-Sequenz in neue Chromatin-Zielstellen einzuführen [13]&rdquo wurde nicht von der Diskussion in den Einführungsabschnitt verschoben. Dieses Anliegen wurde von den Autoren nicht angesprochen. Obwohl sie den Einführungsteil verbessert haben, gibt es immer noch keine Informationen über die beiden offenen Leserahmen.

Antwort: Wir entschuldigen uns für dieses Versäumnis. Der Satz wurde in überarbeitetes Manuskript verschoben. Wir stimmen zu, dass es im Einführungsabschnitt platziert werden sollte.

Kommentar des Rezensenten: Der Satz &bdquo.Als wir die Expressionsniveaus von L1-ORF1 und L1-ORF2 zwischen invasiven und nichtinvasiven Tumoren verglichen, wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (Abbildung 2a)&rdquo sollte kurz vor den Satz &bdquoAnalyse der LINE-1-Methylierung und Expressionsniveaus&hellip.&rdquo verschoben werden. Bitte geben Sie auch (Abbildung 2b) am Ende dieses Satzes &ldquoAnalysis of LINE-1 Methylation and Expression Levels&hellip.&rdquo an.

Antwort: Dies wurde im überarbeiteten Manuskript korrigiert.

Kommentar des Rezensenten: In Zeile 223 sollte Abbildung 2c anstelle von Abbildung 2b erscheinen.

Antwort: Dieser Fehler wurde im überarbeiteten Manuskript korrigiert.

Kommentar des Rezensenten: In der Legende von Fig. 2 ist (b) nicht angegeben.

Antwort: Dies wurde im überarbeiteten Manuskript korrigiert.

Kommentar des Rezensenten: Wenn die Datei heruntergeladen wird, befinden sich in Abbildung 3 keine Bilder oder Grafiken. Bitte korrigieren Sie diesen Fehler.

Antwort: Die Abbildung 3 wurde in eine überarbeitete Manuskript-MS-Word-Datei eingebettet, wie wir durch das Einreichungssystem leicht überprüfen können. Es war wahrscheinlich aufgrund eines technischen Fehlers für die Rezensenten nicht verfügbar. Diese Datei enthält hochauflösende Bilder, die bei der Verarbeitung der Manuskriptdatei Probleme verursachen können. Dabei achten wir besonders darauf, dass den Gutachtern mit dieser Einreichung ein vollständiges Manuskript zur Verfügung gestellt wird.

Rusetska et al. analysierten die Methylierungsgrade und versuchten, die Rolle repetitiver LINE-1-Elemente im Tumorwachstumsverhalten in einer Kohorte bestehend aus 54 invasiven und 26 nicht-invasiven gonadotropen Adenomen zu bewerten. Sie fanden heraus, dass das repetitive Element von LINE-1 bei nicht funktionierenden gonadotropen Hypophysentumoren im Vergleich zu den nicht-neoplastischen Hypophysen und bei invasiven Tumoren im Vergleich zu den nicht-invasiven Gegenstücken signifikant häufiger hypomethyliert war. Aber weder die Expression von zwei LINE-1-Transkripten (durch RT-PCR), L1-ORF1 und L1-ORF2, noch das Protein, L1ORF1p, das als Surrogat für die LINE-1-Expression verwendet wurde, differenzierte höchstwahrscheinlich den Wachstumsstatus von PitNET die Variabilität der ausgewerteten Variablen widerspiegelt. Sie beobachteten auch eine signifikante, aber niedrige Korrelation zwischen der LINE-1-Methylierung und der Expression der beiden Transkripte, jedoch nicht mit dem Protein. Sie fanden auch heraus, dass die Hemmung der DNA-Promotor-Methylierung die Expression sowohl der L1-ORF1- als auch der L1-ORF2-Transkripte in gonadotropen Zelllinien erhöht, obwohl das Ansprechen auf die Behandlung je nach Zelllinientyp variiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Manuskript gut geschrieben ist, der Befund der Hypomethylierung von LINE-1 in Hypophysentumoren neu ist, und trotz der Versuche der Autoren blieb seine funktionelle und prognostische Rolle möglicherweise aufgrund der geringen Anzahl von Proben in jeder Gruppe schwer fassbar , die Variabilität der molekularen Befunde und klinischen Merkmale der Kohorte (primär vs. rezidivierend, onkozytäre Varianten, Größe usw.).

Linie 52 - Bei Krebs beim Menschen treten sowohl lokale als auch globale Veränderungen der DNA-Methylierung auf im Genom [9].

Zeile 179 &ndash Leerzeichen zwischen from und 75,05% hinzufügen

  • Spalte G &ndash Rechtschreibfehler des Tumors
  • Geben Sie weitere Details zur Knosp-Klassifikation an, nennen Sie den Unterschied zwischen primären und neu diagnostizierten Tumoren
  • addiere die Werte der molekularen Erkenntnisse

Vergleich zwischen gonadotropen Adenomen mit oder ohne onkozytären Merkmalen?

Diskutieren Sie die Begründung einer "klaren Beziehung zwischen DNA-Methylierung und LINE-1-Expression wurde in L&betaT2 nicht beobachtet" im Vergleich zu den Ergebnissen in der anderen Zelllinie.

Kommentar des Rezensenten: Abbildung 3 fehlt.

Antwort: Die Abbildung 3 wurde in eine überarbeitete Manuskript-MS-Word-Datei eingebettet, wie wir durch das Einreichungssystem leicht überprüfen können. Es war wahrscheinlich aufgrund eines technischen Fehlers für die Rezensenten nicht verfügbar. Diese Datei enthält hochauflösende Bilder, die bei der Verarbeitung der Manuskriptdatei Probleme verursachen können. Dabei achten wir besonders darauf, dass den Gutachtern mit dieser Einreichung ein vollständiges Manuskript zur Verfügung gestellt wird.

Kommentar des Rezensenten: Linie 52 - Bei Krebs beim Menschen treten sowohl lokale als auch globale Veränderungen der DNA-Methylierung im Genom auf [9].

Antwort: Nach Empfehlung korrigiert.

Kommentar des Rezensenten: 179 &ndash Platz zwischen von und 75,05 % hinzufügen

Antwort: Korrigiert

Kommentar des Rezensenten: Zusatztabelle &ndash Spalte G &ndash Rechtschreibfehler des Tumors

Antwort: In der überarbeiteten Zusatztabelle korrigiert.

Kommentar des Rezensenten: Geben Sie weitere Details zur Knosp-Klassifikation an, nennen Sie den Unterschied zwischen primären und neu diagnostizierten Tumoren

addiere die Werte der molekularen Erkenntnisse

Antwort: Wir haben die Spalte mit Details zur Knosp-Klassifizierung für jeden Patienten eingeführt.

Wir haben fälschlicherweise beide Begriffe &ldquoprimär&rdquo und &ldquoneu diagnostiziert&rdquo verwendet. Es ist die gleiche Kategorie. &ldquoPrimär&rdquo wurde im Sinne von neu diagnostizierten, im Gegensatz zu rezidivierenden Tumoren verwendet. In der überarbeiteten Zusatztabelle haben wir als Kategorie &ldquoneu diagnostiziert&rdquo verwendet.

Die Ergebnisse der molekularen Analyse (L1-DNA-Methylierungsgrad und relative L1-ORF1 und L1-ORF2 expression) für jeden Patienten wurden in die überarbeitete Zusatztabelle 1 aufgenommen.

Kommentar des Rezensenten: Vergleich zwischen gonadotropen Adenomen mit oder ohne onkozytären Merkmalen?

Antwort: Zwischen Onkozytomen und Tumoren ohne onkozytäre Merkmale wurde kein signifikanter Unterschied in der LINE-1-Methylierung beobachtet. Diese Informationen wurden in das überarbeitete Manuskript im Ergebnisabschnitt 3.1 aufgenommen.

Kommentar des Rezensenten: Diskutieren Sie die Begründung einer "klaren Beziehung zwischen DNA-Methylierung und LINE-1-Expression wurde in L&betaT2 nicht beobachtet" im Vergleich zu den Ergebnissen in der anderen Zelllinie.

Antwort: Es scheint, dass &alphaT3-1-Zellen gegenüber DNA-Methylierungsinhibitoren empfindlicher sind. Beide Zelllinien wurden von normalen gonadotropen Hypophysenzellen der Maus (nicht Tumorzellen) abgeleitet, der Hauptunterschied zwischen diesen Zellen besteht jedoch darin, dass sie gonadotrope Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien darstellen. &alphaT3-1-Zellen wurden durch Immortalisierung von gonadotropen Zellen der Maushypophyse im Expressionsstadium der alpha-Untereinheit, jedoch vor der Aktivierung des LHB-Gens, das für LH (beta-Untereinheit) kodiert, abgeleitet. Somit sind sie unreife gonadotrope Zellen. L&betaT2-Zellen wiederum wurden im Stadium der Expression sowohl der Alpha- als auch der LH-beta-Untereinheiten immortalisiert, daher repräsentieren sie reife Gonadotropinen.

Die epigenetische Regulation spielt eine Rolle bei der Differenzierung von Hypophysenzellen [1&ndash3]. Epigenetische Regulation alternativer Promotoren und Enhancer in Vorläufer-, unreifen und reifen gonadotropen Zelllinien Chromatinstatus und Transkriptionsfaktorbindung an Gonadotropin-Promotoren in gonadotropen Zelllinien) und es ist zu erwarten, dass sich unreife und reife Zellen derselben Linie unterscheiden können in: Regulierung der epigenetischen Maschinerie.

Dazu gehören Unterschiede in der Bearbeitung des DNA-Methylierungsmusters. Es wurde klar gezeigt, dass &alphaT3-1-Zellen ein höheres Expressionsniveau des Tet1-Proteins aufweisen, das direkt an der aktiven DNA-Demethylierung beteiligt ist [3]. Es ist möglich, dass aufgrund der physiologischen DNA-Demethylierungsaktivität in &alphaT3-1 höher ist, die experimentelle Hemmung von DNA-Methylatrsferasen in diesen Zellen wirksamer ist als in L&betaT2-Zellen (mit geringerer DNA-Demethylierungsaktivität). Sowohl der natürliche aktive Demethylierungsprozess als auch die Hemmung von DNA-Methyltransferasen wirken synergistisch.

Natürlich ist diese Erklärung spekulativer Natur. Diese Erklärung wurde im Abschnitt Diskussion des überarbeiteten Manuskripts eingeführt.

  1. Laverrière, J.N. L&rsquoHôte, D. Tabouy, L. Schang, A.L. Quérat, B. Cohen-Tannoudji, J. Epigenetische Regulation alternativer Promotoren und Enhancer in Vorläufer-, unreifen und reifen gonadotropen Zelllinien. Mol.-Nr. Zelle. Endokrinol.2016, 434, 250&ndash265.
  2. Xie, H. Hoffmann, H.M. Iyer, A. K. Brayman, M. J. Ngo, C. Sunshine, M. J. Mellon, P. L. Chromatinstatus und Transkriptionsfaktorbindung an Gonadotropin-Promotoren in gonadotropen Zelllinien. Repro. Biol. Endokrinol.2017, 15, 86.
  3. Yosefzon, Y. David, C. Tsukerman, A. Pnueli, L. Qiao, S. Boehm, U. Melamed, P. An epigenetic switch repressing Tet1 in Gonadotropien aktiviert die Fortpflanzungsachse. Proz. Natl. Akad. Wissenschaft2017, 114, 201704393.
  • Kleine Tippfehler sind noch in der Tabelle vorhanden ("wiederkehrend", "Merkmale")
  • Einheit der LINE-1-Methylierungsstufen fehlt

Kommentar des Rezensenten: Kleine Tippfehler sind noch in der Tabelle vorhanden ("wiederkehrend", "Merkmale")

Antwort: Diese Tippfehler in der Zusatztabelle wurden korrigiert. Das gesamte Manuskript wurde sorgfältig auf Fehler überprüft und zusätzliche typografische und grammatikalische Fehler wurden gefunden und korrigiert.

Und Abbildung 1 wurde aufgrund eines Tippfehlers in Abbildung 1c geändert

Kommentar des Rezensenten: Einheit der LINE-1-Methylierungsstufen fehlt

Antwort: Die Einheit (%) wurde zu jedem Wert in der Spalte mit den Daten zum DNA-Methylierungsgrad in der Zusatztabelle hinzugefügt.

Dieses Manuskript ist eine Wiedervorlage einer früheren Einreichung. Im Folgenden finden Sie eine Liste der Peer-Review-Berichte und der Antworten der Autoren aus dieser Einreichung.

Das wissenschaftliche Design des Manuskripts hat mir sehr gut gefallen. Die Methoden sind gut dargestellt und die Ergebnisse beantworten die wissenschaftliche Fragestellung.

Mein Vorschlag für das Manuskript: Invasive und nicht-invasive, nicht funktionierende Hypophysentumore unterscheiden sich im DNA-Methylierungsgrad von LINE-1-repetitiven Elementen

In diesem Artikel betonen die Autoren die Bedeutung globaler DNA-Methylierungsgrade in PiTNETs.

Die Daten sind gut dargestellt, aber angesichts der begrenzten Zahlen eindeutig vorläufige Daten. Sie könnte als Pilotstudie vorgelegt werden.

Ein Vorschlag könnte die Bewertung der Tumoraggressivität mit Bewertung von Proliferationsfaktoren und Tumorsuppressorgenen und möglicherweise der Anzahl vorhandener Mitosen sein.

Mein Vorschlag für das Manuskript: Invasive und nicht-invasive, nicht funktionierende Hypophysentumore unterscheiden sich im DNA-Methylierungsgrad von repetitiven LINE-1-Elementen

In diesem Artikel betonen die Autoren die Bedeutung globaler DNA-Methylierungsgrade in PiTNETs.

Die Daten sind gut dargestellt, aber angesichts der begrenzten Zahlen eindeutig vorläufige Daten. Sie könnte als Pilotstudie vorgelegt werden.

Kommentar des Rezensenten: Ein Vorschlag könnte die Bewertung der Tumoraggressivität mit Bewertung von Proliferationsfaktoren und Tumorsuppressorgenen und möglicherweise der Anzahl vorhandener Mitosen sein.

Antwort:Dieses Problem wurde auch von den anderen Rezensenten angesprochen. In dem überarbeiteten Manuskript haben wir Ergebnisse der ki67-Färbung und Daten zum Rezidiv verwendet, um zu untersuchen, ob eine unterschiedliche LINE-1-Methylierung bei nach diesen Parametern stratifizierten Patienten gefunden werden kann und ob sie eine Rolle bei aggressivem Tumorwachstum spielt. Wir fanden einen Unterschied zwischen Patienten mit ki67 <3% und >3% (das Hauptkriterium eines atypischen Hypophysentumors). Es wurden auch keine Unterschiede zwischen primären und rezidivierenden Tumoren sowie zwischen Tumoren, die innerhalb der Nachbeobachtung rezidivierten und solchen ohne Rezidiv gefunden. Leider konnten für diese Analysen nur geringe Patientenzahlen verwendet werden, da nur 5 Patienten einen ki67index >3% aufwiesen. 12 rezidivierende Tumoren wurden in die Studiengruppe aufgenommen und ein Rezidiv in der Nachsorge wurde nur bei 10 Patienten beobachtet. Eine längere Nachbeobachtungszeit (in dieser Studie beträgt die mediane Nachbeobachtungszeit 5 Jahre 10 Monate (71 Monate)) würde es wahrscheinlich ermöglichen, wertvollere Daten über das Wiederauftreten von Tumoren nach der Behandlung zu sammeln. Im überarbeiteten Manuskript sind die Ergebnisse im Ergebnisabschnitt 3.1 beschrieben. Klinische Daten zur ki67-Färbung wurden in Tabelle 1 mit Probenbeschreibung und in Zusatztabelle 1 aufgenommen.

Dieser Bericht untersucht den Methylierungsgrad von repetitiven Elementen des Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1) und die Expression von zwei offenen Leserahmen (L1-ORF1 und L1-ORF2), die in der LINE-1-Sequenz in invasiven und nicht-invasiven nicht funktionierenden PitNETs enthalten sind.

  • Die Autoren verwenden entweder gonadotrope PitNETs oder nicht funktionierende Tumoren entlang des Manuskripts. Diese Nomenklatur ist verwirrend, da gonadotrope PitNETs funktionierende oder nicht funktionierende PitNETs sein können. Da sie in der Einleitung erklärten, dass die Mehrheit der nicht funktionierenden PitNETs einen gonadotropen Ursprung hat, sollten sie im gesamten Manuskript nicht funktionierende PitNETs verwenden, um konsistenter zu sein.
  • Bei vielen Tumorarten wurde über eine reduzierte LINE-1-Methylierung berichtet. Die Autoren beschreiben eine Verringerung der LINE-1-Methylierung bei invasiven vs. nicht-invasiven, nicht funktionierenden PitNETs. Sie zeigen jedoch keine LINE-1-Methylierungswerte in normalen Hypophysen, was absolut notwendig ist, um die Rolle der LINE-1-Methylierung bei nicht funktionierenden PitNETs zu verstehen.
  • In Bezug auf die Experimente in Zelllinien zeigen die Autoren einen signifikanten Anstieg der L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsniveaus nach 5-AzaC-Behandlung in aT3-1 aber nicht in LbT2-Zellen. Erstens, beziehen sich die signifikanten p-Werte in den Diagrammen auf die höchste 5-AzaC-Konzentration? Zweitens zeigen sie nur zwei unabhängige Experimente (n=2), was nicht ausreicht, um die tatsächliche Wirkung von 5-AzaC und die Beziehung zwischen DNA-Methylierung und L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsniveaus klar zu unterscheiden, noch um eine statistische Analyse durchzuführen . Die Zahl der Versuche sollte erhöht werden. Darüber hinaus sollten Wundheilungs- oder Transwell-Invasionsexperimente nach 5-AzaC-Behandlung durchgeführt werden, um zu verstehen, ob die reduzierte Methylierung und die Erhöhung der L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsspiegel mit einer Erhöhung der Invasivität verbunden sind.
  • Die Autoren zeigen auch immunhistochemische Ergebnisse von L1-ORF1p in invasiven und nicht-invasiven Tumoren unter Verwendung eines Antikörpers, der zuvor von Rodíc et al. 2014. Sie zeigen eine mäßige bis hohe Expression in allen Tumoren, die mit einer wirklich homogenen Färbung analysiert wurden, aber es werden keine positiven oder negativen Kontrollen eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Färbung vollständig spezifisch ist. Rodíc et al. berichten über die Expression von L1-ORF1p in verschiedenen Geweben, die als interne Kontrollen verwendet werden können. Darüber hinaus sollten auch normale Hypophysen analysiert werden.
  • Die Abschnitte Zusammenfassung und Einführung sollten verbessert werden. Die Zeilen 243-246 aus der Diskussion sollten in den Einführungsabschnitt verschoben werden.
  • Besteht ein Zusammenhang zwischen L1-ORF1p und klinischen/pathologischen Parametern wie Ki67 oder p53?
  • Zeile 124: 5-Azac sollte mit dem vollständigen Namen erscheinen, da dies zum ersten Mal beschrieben wird.
  • Im Zellkulturschnitt sollte angegeben werden, ob die Zelllinien auf Mykoplasmenkontamination getestet wurden.
  • Abschnitt 3.1: Es wird beschrieben, dass bei 54 invasiven und 26 nicht-invasiven Tumoren LINE-1-Methylierungsniveaus bestimmt wurden, die nicht mit den Zahlen in Tabelle 1 übereinstimmen.
  • Abbildung 1a: Es wird "invasiv und nicht-invasive NFPA" angegeben, aber die NFPA-Nomenklatur wurde zuvor nicht erwähnt.
  • Abschnitt 3.3: Die Autoren beschreiben &ldquoDie Analyse der LINE-1-Methylierung und der Expressionsspiegel zeigte eine signifikante negative Korrelation für beide mRNAs: L1-ORF1 (Spearman R=0,2680 p=0,0169) und L1-ORF2 (Spearman R=0,2720 p=0,0153)&rdquo. Der Graph dieser Korrelation muss in Abbildung 2 aufgenommen werden.
  • Zeile 179: Die bezüglich der L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsniveaus beschriebenen p-Werte stimmen nicht mit den p-Werten überein, die in den Diagrammen in Abbildung 2a erscheinen, und werden anstelle von Abbildung 2A in Abbildung 1B angezeigt.
  • Zeilen 228-230: Fügen Sie Referenzen ein, um den Satz zu unterstützen.

Dieser Bericht untersucht den Methylierungsgrad von repetitiven Elementen des Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1) und die Expression von zwei offenen Leserahmen (L1-ORF1 und L1-ORF2), die in der LINE-1-Sequenz in invasiven und nicht-invasiven nicht funktionierenden PitNETs enthalten sind.

Kommentar des Rezensenten: Die Autoren verwenden entweder gonadotrope PitNETs oder nicht funktionierende Tumoren entlang des Manuskripts. Diese Nomenklatur ist verwirrend, da gonadotrope PitNETs funktionierende oder nicht funktionierende PitNETs sein können. Da sie in der Einleitung erklärten, dass die Mehrheit der nicht funktionierenden PitNETs einen gonadotropen Ursprung hat, sollten sie im gesamten Manuskript nicht funktionierende PitNETs verwenden, um konsistenter zu sein.

Antwort:Dies wurde korrigiert, wir verwendeten den Begriff nicht funktionierende gonadotrope PitNETs entlang des Manuskripts. Wir führten auch die Aussage &bdquoAlle Proben waren nicht funktionierende gonadotrope PitNETs&rdquo in Abschnitt 2.1 Patienten und Proben ein, um klar darauf hinzuweisen, dass keine funktionierenden gonadotropen Tumoren eingeschlossen waren.

Kommentar des Rezensenten: Bei vielen Tumorarten wurde über eine reduzierte LINE-1-Methylierung berichtet. Die Autoren beschreiben eine Verringerung der LINE-1-Methylierung bei invasiven vs. nicht-invasiven, nicht funktionierenden PitNETs. Sie zeigen jedoch keine LINE-1-Methylierungswerte in normalen Hypophysen, was absolut notwendig ist, um die Rolle der LINE-1-Methylierung bei nicht funktionierenden PitNETs zu verstehen.

Antwort:Wir haben DNA-Methylierungsergebnisse für normale Hypophyse in das überarbeitete Manuskript eingeführt. Dies zeigt einen höheren DNA-Methylierungsgrad bei LINE-1-Elementen in der normalen Hypophyse. Proben von normaler Hypophyse wurden auch für die Immunfärbung mit Anti-L1-ORF1p-Antikörper verwendet.

In Abschnitt 2.1 und ergänzender Tabelle 1 haben wir Informationen zu normalen Hypophysenproben hinzugefügt. Die Ergebnisse der Untersuchung normaler Hypophysenproben wurden in den Abschnitten &ldquo3.1 Ergebnisse&rdquo beschrieben und sind in den Abbildungen 1a, 2a und 3 dargestellt. Die Ergebnisse der normalen Gewebeanalyse wurden auch im Diskussionsabschnitt kommentiert.

Kommentar des Rezensenten: In Bezug auf die Experimente in Zelllinien zeigen die Autoren einen signifikanten Anstieg der L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsniveaus nach 5-AzaC-Behandlung in aT3-1 aber nicht in LbT2-Zellen. Erstens, beziehen sich die signifikanten p-Werte in den Diagrammen auf die höchste 5-AzaC-Konzentration? Zweitens zeigen sie nur zwei unabhängige Experimente (n=2), was nicht ausreicht, um die tatsächliche Wirkung von 5-AzaC und die Beziehung zwischen DNA-Methylierung und L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsniveaus klar zu unterscheiden, noch um eine statistische Analyse durchzuführen . Die Zahl der Versuche sollte erhöht werden. Darüber hinaus sollten Wundheilungs- oder Transwell-Invasionsexperimente nach 5-AzaC-Behandlung durchgeführt werden, um zu verstehen, ob die reduzierte Methylierung und die Erhöhung der L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsspiegel mit einer Erhöhung der Invasivität verbunden sind.

Antwort. Wir führten zwei zusätzliche biologische Wiederholungen des Messexperiments durch L1-ORF1 und L1-ORF2 Expressionsniveaus in Zellen, die mit unterschiedlichen Dosen von 5-AzaC behandelt wurden. Im überarbeiteten Manuskript sind die Ergebnisse von vier Replikaten in Ergebnisabschnitt 3.3 beschrieben und in Abbildung 2 c dargestellt. Das überarbeitete Diagramm zeigt jedes replizierte Experiment. Die Daten wurden mit dem Friedman-Test analysiert, der ein nichtparametrisches Äquivalent des ANOVA-Tests zum Vergleich von mehr als zwei Gruppen von Proben ist.

Im Allgemeinen hat 5-AzaC eine starke zytotoxische Wirkung auf die meisten Zellen. Dieses Mittel wird als Zytostatikum bei hämatologischen Neoplasien eingesetzt. 5-AzaC beeinflusst das Wachstum beider gonadotroper Zelllinien negativ, was durch deutlich niedrigere Zellzahlen und geringere metabolische Aktivität (MTT-Testergebnisse, Daten nicht gezeigt) in Kulturen mit steigenden Konzentrationen dieses Methyltransferase-Inhibitors angezeigt wird. Wir glauben, dass die Durchführung eines Funktionstests an den mit 5-AzaC behandelten Zellen die direkte zytotoxische Wirkung zeigen würde und nicht die indirekte Wirkung einer erhöhten Expression von L1-Elementen widerspiegeln würde. Aus diesem Grund wurden diese Funktionstests nicht durchgeführt.

Kommentar des Rezensenten: Die Autoren zeigen auch immunhistochemische Ergebnisse von L1-ORF1p in invasiven und nicht-invasiven Tumoren unter Verwendung eines Antikörpers, der zuvor von Rodíc et al. 2014. Sie zeigen eine mäßige bis hohe Expression in allen Tumoren, die mit einer wirklich homogenen Färbung analysiert wurden, aber es werden keine positiven oder negativen Kontrollen eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Färbung vollständig spezifisch ist. Rodíc et al. berichten über die Expression von L1-ORF1p in verschiedenen Geweben, die als interne Kontrollen verwendet werden können. Darüber hinaus sollten auch normale Hypophysen analysiert werden.

Antwort: In das überarbeitete Manuskript haben wir Bilder von Kontrollen aufgenommen, die für die Immunreaktivitätsfärbung verwendet wurden: kolorektales Adenokarzinom-Probe &ndash positive Kontrolle normale Niere &ndash negative Kontrolle (beide ausgewählt nach früheren Berichten (Harris et al., 2010 Rodić et al., 2014) und Negativkontrolle (ohne Primärantikörper). Wir verwendeten drei Proben von normalem FFPE-Hypophysengewebe zur Färbung mit dem ati-L1orf1p-Antikörper. Zwei dieser normalen Proben zeigten eine schwache Immunreaktivität, die deutlich niedriger war, als sie in Proben von Hypophysentumor beobachtet wurde. Ein normaler Hypophysenschnitt zeigte eine mäßige Immunreaktivität. Eine Immunfärbung wurde auch an weiteren 23 Tumorproben durchgeführt. Für eine genauere Analyse wurde die Färbereaktivität mit der H-Score-Formel (McCarty et al., 1986), das Informationen über die Anzahl positiver Zellen und die Färbeintensität kombiniert. Die Ergebnisse der Färbung von normalem Hypophysengewebe und Kontrollproben sowie die Ergebnisse des H-Score-Vergleichs wurden in Abschnitt 3.4 der überarbeiteten Ergebnisse beschrieben und sind in der überarbeiteten Abbildung 3 dargestellt.

Kommentar des Rezensenten: Die Abschnitte Zusammenfassung und Einführung sollten verbessert werden. Die Zeilen 243-246 aus der Diskussion sollten in den Einführungsabschnitt verschoben werden.

Antwort: Wir haben die erwähnten Zeilen wie vom Rezensenten vorgeschlagen verschoben und versucht, den Einführungsabschnitt zu verbessern.

Kommentar des Rezensenten: Besteht ein Zusammenhang zwischen L1-ORF1p und klinischen/pathologischen Parametern wie Ki67 oder p53?

Wir überprüften, ob ein Zusammenhang zwischen Ki67 und L1-ORF1p besteht, indem wir den H-Score von Tumoren mit niedrigem Ki67 <3% und Ki67>3% verglichen. Dieser Schwellenwert wurde verwendet, da er ein grundlegendes Kriterium für einen atypischen Hypophysentumor war und diese Klassifikation in den Patientenakten verfügbar war. Wir haben keinen Unterschied beobachtet, müssen jedoch anmerken, dass nur 5 Patienten ki67 >3% hatten. Färbungsergebnisse gegen TP53 waren für einen Großteil der Patienten nicht verfügbar und wurden daher nicht analysiert. Wir testeten auch, ob es einen Unterschied im H-Score bei neu diagnostizierten (n=68) und rezidivierenden Tumoren (n=12) gibt und beobachteten das Fehlen von Unterschieden. Wir haben uns aus zwei Gründen entschieden, diese Ergebnisse nicht in das Manuskript aufzunehmen:

- die Zahl der Patienten mit einem Proliferationsindex >3% sowie der Patienten mit rezidivierenden Tumoren ist gering (5 bzw. 12 Proben), daher ist die Qualität der Analyse eher schlecht.

- In der LINE-1-DNA-Methylierungsanalyse zeigte nur der Vergleich von invasiven und nicht-invasiven PitNETs einen signifikanten Unterschied. Wir glauben, dass dies das Ergebnis ist, das durch eine anschließende Expressionsanalyse ergänzt werden sollte. Bei Patienten, die nach Ki67-Kennzeichnung stratifiziert wurden, oder bei Patienten mit neu diagnostizierten vs. rezidivierenden Tumoren wurde kein Unterschied beobachtet.

Kommentar des Rezensenten:Zeile 124: 5-Azac sollte mit dem vollständigen Namen erscheinen, da dies zum ersten Mal beschrieben wird.

Antwort: In überarbeitetem Manuskript korrigiert.

Kommentar des Rezensenten: Im Zellkulturabschnitt sollte angegeben werden, ob die Zelllinien auf Mykoplasmenkontamination getestet wurden.

Antwort: Die Zellen wurden unter Verwendung des PCR-Assays als mykoplasmenfrei bestimmt. Diese Informationen wurden dem Methodenabschnitt 2.6 hinzugefügt

Kommentar des Rezensenten: Abschnitt 3.1: Es wird beschrieben, dass bei 54 invasiven und 26 nicht-invasiven Tumoren LINE-1-Methylierungsniveaus bestimmt wurden, die nicht mit den Zahlen in Tabelle 1 übereinstimmen.

Antwort: Der Fehler wurde korrigiert. 54 invasive und 26 nichtinvasive Tumoren wurden eingeschlossen.

Kommentar des Rezensenten: Abbildung 1a: Es wird "invasiv und nicht-invasive NFPA" angegeben, aber die NFPA-Nomenklatur wurde zuvor nicht erwähnt.

Antwort: Wir sind uns einig, dass dies korrigiert werden sollte. In den Abbildungen 1 und 2 haben wir im überarbeiteten Manuskript die Begriffe invasive PitNETs und nichtinvasive PitNETs verwendet.

Kommentar des Rezensenten: Abschnitt 3.3: Die Autoren beschreiben &ldquoDie Analyse der LINE-1-Methylierung und der Expressionsspiegel zeigte eine signifikante negative Korrelation für beide mRNAs: L1-ORF1 (Spearman R=0,2680 p=0,0169) und L1-ORF2 (Spearman R=0,2720 p=0,0153)&rdquo. Der Graph dieser Korrelation muss in Abbildung 2 aufgenommen werden.

Antwort: Wir haben Korrelationsgraphen als Abbildung 2b in das überarbeitete Manuskript eingeführt

Kommentar des Rezensenten: Zeile 179: Die bezüglich der L1-ORF1- und L1-ORF2-Expressionsniveaus beschriebenen p-Werte stimmen nicht mit den p-Werten überein, die in den Diagrammen in Abbildung 2a erscheinen, und werden anstelle von Abbildung 2A in Abbildung 1B angezeigt.

Antwort: Auf Vorschlag von Reviewer 3 wurde dieser Satz entfernt, da kein signifikanter Unterschied beobachtet wurde. Wir haben überprüft, dass die in Abbildung 2 gezeigten p-Werte korrekt sind.

Kommentar des Rezensenten: Zeilen 228-230: Fügen Sie Referenzen ein, um den Satz zu unterstützen.

Antwort: Die Referenz wurde in einem überarbeiteten Manuskript bereitgestellt

arris, C. R. et al. (2010) &lsquoAssoziation der nuklearen Lokalisation eines lang eingestreuten nuklearen Element-1-Proteins in Brusttumoren mit schlechten prognostischen Ergebnissen&rsquo, Gene und Krebs, 1(2), S. 115&ndash124. doi: 10.1177/1947601909360812.

McCarty, K.S. et al. (1986) &lsquoVerwendung eines monoklonalen Anti-Östrogen-Rezeptor-Antikörpers bei der immunhistochemischen Untersuchung menschlicher Tumoren&rsquo, Krebsforschung, 46(8 SUPPL.), S. 4244 &ndash 4249.

Nordlund, J. et al. (2013) &lsquoGenomweite Signaturen differentieller DNA-Methylierung bei akuter lymphatischer Leukämie bei Kindern&rsquo, Genombiologie, 14(9), p. r105. doi: 10.1186/gb-2013-14-9-r105.

Rodić, N. et al. (2014) &lsquoLange durchsetzte Element-1-Proteinexpression ist ein Kennzeichen vieler menschlicher Krebsarten&rsquo, American Journal of Pathology, 184(5), S. 1280 &ndash 1286. doi: 10.1016/j.ajpath.2014.01.007.

Sur, D. et al. (2017) &lsquoNachweis des LINE-1-Retrotransposon-RNA-bindenden Proteins ORF1p in verschiedenen anatomischen Regionen des menschlichen Gehirns&rsquo, Mobile DNA. Mobile DNA, 8(1), S. 1&ndash12. doi: 10.1186/s13100-017-0101-4.

Die Ergebnisse der Studie sind nicht sehr neu, da zuvor globale DNA-Methylierungsniveaus in PiTNETs analysiert wurden (auch von den Autoren selbst). Dennoch wurden die Studien im Allgemeinen korrekt durchgeführt, obwohl einige Probleme angegangen werden müssen.

1. Tabelle 1 ist nicht sehr intuitiv zu lesen. Reorganisieren, es ist nicht erforderlich, Median und Bereiche in verschiedenen Dateien zu haben.

2. Nehmen Sie den Median der Tumorgröße in Tabelle 1 auf.

3. Die Autoren beschreiben in der Einleitung, dass eine verminderte Methylierung repetitiver DNA-Sequenzen ein Surrogatmarker für eine globale DNA-Hypomethylierung ist. Würden die Autoren erwarten, dass die in Abbildung 1c gezeigte Korrelation stärker ist?

4. Die Invasion könnte mit der Tumorgröße korreliert sein. Die Autoren sollten feststellen, ob die LINE-1-DNA-Methylierungsgrade mit der Tumorgröße korrelieren. Noch wichtiger, haben die Autoren untersucht, ob die LINE-1-DNA-Methylierungsniveaus mit anderen aggressiven Merkmalen von PitNETs korrelieren, wie z. B. Nachwachsen/Wiederauftreten oder hohe Ki67-Werte? Diese Studien könnten dazu beitragen, die Hypothese der Autoren zu unterstützen, dass eine niedrigere LINE-1-Methylierung relativ zu aggressivem Tumorwachstum ist.

5. Zeile 177-179 „aber der Unterschied war statistisch nicht signifikant&rdquo. Wenn keine statistische Signifikanz vorliegt, was ist der Grund dafür, dass &bdquo ein höheres Expressionsniveau beider Transkripte in invasiven PitNETs beobachtet wurde&rdquo? Bitte umformulieren.

6. Zeile 179. Abbildung 1b ist fälschlicherweise referenziert. Ich nehme an, sie meinten Abbildung 2a: Wenn ja, stimmen die p-Werte im Text nicht mit den p-Werten in den Abbildungen überein.

7. Warum wurden nur 30 Tumoren (von den 80 in die Studie eingeschlossenen Patienten) durch immunhistochemische Färbung analysiert? Gibt es eine Möglichkeit der Bias-Selektion? Wie erklären die Autoren, dass es keine Korrelation zwischen der L1-ORF1p-Immunreaktivität und der LINE-1-DNA-Methylierung oder den Expressionsniveaus der L1-Transkripte gibt?

8. Stellen Sie Bilder mit höherer (und besserer) Vergrößerung für Abbildung 3 bereit, damit das Ausdrucksmuster leicht beobachtet werden kann.

9. Diskussion, Zeile 260: Es wurde eine etwas höhere Expression festgestellt. Es gibt keine statistische Signifikanz, daher bitte diese Aussage entfernen.

Die Ergebnisse der Studie sind nicht sehr neu, da zuvor globale DNA-Methylierungsniveaus in PiTNETs analysiert wurden (auch von den Autoren selbst). Dennoch wurden die Studien im Allgemeinen korrekt durchgeführt, obwohl einige Probleme angegangen werden müssen.

Kommentar des Rezensenten: Tabelle 1 ist nicht sehr intuitiv zu lesen. Reorganisieren, es ist nicht erforderlich, Median und Bereiche in verschiedenen Dateien zu haben.

Antwort: Wir haben versucht, Tabelle 1 durch Trennung von demographischen und klinischen Daten zu verbessern.

Kommentar des Rezensenten: Nehmen Sie den Median der Tumorgröße in Tabelle 1 auf.

Antwort: Leider haben wir in vielen Patientenakten keine genauen Daten zur Tumorgröße. Die Klassifizierung von Makroadenom (Durchmesser >10 mm) vs. Mikroadenom (Durchmesser <10 mm) war verfügbar und wurde in Tabelle 1 und Zusatztabelle 1 eingeführt. Wir waren nicht in der Lage, den Median der Tumorgröße anzugeben.

Kommentar des Rezensenten: Die Autoren beschreiben in der Einleitung, dass eine verminderte Methylierung repetitiver DNA-Sequenzen ein Surrogatmarker für eine globale DNA-Hypomethylierung ist. Würden die Autoren erwarten, dass die in Abbildung 1c gezeigte Korrelation stärker ist?

Antwort: Abbildung 1c zeigt die Korrelation zwischen der LINE-1-Methylierung und dem Gesamtmethylierungsgrad, berechnet aus HM450K-Methylierungs-Arrays. Die Korrelation mit Spearman R=0.58 wurde beobachtet. Natürlich würden wir uns einen stärkeren Zusammenhang wünschen. Wir glauben, dass dieses Ergebnis auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die meisten HM450-Array-Sonden auf Gene und Genregulationsregionen konzentriert sind und daher die verallgemeinerten Ergebnisse der Methylierungsdaten von H450-Arrays den Median der Methylierung in Regionen widerspiegeln, die von den Array-Sonden abgedeckt werden, aber nicht wahr sind Methylierung des gesamten Genoms. Signale von den Sonden, die auf mehrere genomische Positionen ausgerichtet sind, werden gemäß den Empfehlungen a priori aus der Analyse entfernt (Nordlund et al., 2013) und es werden keine Sonden für sich wiederholende Elemente für die Datennormalisierung und -analyse verwendet. In unserem Manuskript haben wir den Begriff &ldquoglobale genomweite Methylierung, bewertet mit HM450K-Methylierungs-Arrays&rdquo verwendet und den Begriff „ganze Genom-Methylierung&rdquo absichtlich vermieden. Im Diskussionsteil des überarbeiteten Manuskripts führten wir die Aussage ein, dass &ldquoDer von uns beobachtete Zusammenhang nicht stark ist, aber es sollte beachtet werden, dass die genomweite Methylierung, die mit Methylierungs-Arrays bewertet wurde, möglicherweise nicht den wahren genomischen Methylierungsgrad widerspiegelt, sondern eher den allgemeinen Methylierungsstatus der genomischen Regionen von Array-Sonden abgedeckt.&rdquo

Kommentar des Rezensenten: Die Invasion könnte mit der Tumorgröße korreliert sein. Die Autoren sollten feststellen, ob die LINE-1-DNA-Methylierungsgrade mit der Tumorgröße korrelieren. Noch wichtiger: Haben die Autoren untersucht, ob die LINE-1-DNA-Methylierungsniveaus mit anderen aggressiven Merkmalen von PitNETs korrelieren, wie z. B. Nachwachsen/Wiederauftreten oder hohe Ki67-Werte? Diese Studien könnten dazu beitragen, die Hypothese der Autoren zu unterstützen, dass eine niedrigere LINE-1-Methylierung relativ zu aggressivem Tumorwachstum ist.

Antwort. Laut Antwort auf den vorherigen Kommentar hatten wir genaue Daten zur Tumorgröße zur Klassifizierung von Makroadenom vs. Mikroadenom. Es wurde kein Unterschied zwischen Makroadenomen und Mikroadenomen beobachtet. Leider handelt es sich bei der überwiegenden Mehrheit der Tumoren in der Studiengruppe um Makroadenome (n=66). Diese Verzerrung resultiert aus der Gewebesammlung. Normalerweise haben Neurochirurgen die Möglichkeit, kleine Mikroadenom-Gewebeproben für die Forschung zu sammeln und einzufrieren, da sie Gewebe für die Diagnose konservieren müssen.

Im überarbeiteten Manuskript haben wir Ergebnisse der ki67-Färbung und Daten zum Rezidiv verwendet, um zu untersuchen, ob bei Patienten, die nach diesen Parametern stratifiziert wurden, ein Unterschied in der LINE-1-Methylierung gefunden werden kann und ob er eine Rolle bei aggressivem Tumorwachstum spielt. Wir fanden einen Unterschied zwischen Patienten mit ki67 <3% und >3% (das Hauptkriterium eines atypischen Hypophysentumors). Es wurde auch kein Unterschied zwischen primären und rezidivierenden Tumoren sowie Tumoren mit Rezidiv innerhalb der Nachbeobachtung und solchen ohne Rezidiv gefunden. Leider konnten für diese Analysen nur geringe Patientenzahlen verwendet werden, da nur 5 Patienten ki67 >3% hatten. 12 rezidivierende Tumoren wurden in die Studiengruppe aufgenommen und ein Rezidiv in der Nachbeobachtung wurde nur bei 10 Patienten beobachtet. Darüber hinaus würden wir für eine wertvollere Analyse des Tumorrezidivs eher eine längere Nachbeobachtungszeit benötigen, um Daten zum Tumorrezidiv nach der Behandlung zu sammeln. Für unsere Kohorte beträgt die mediane Nachbeobachtungszeit 5 Jahre 10 Monate (71 Monate)). Im überarbeiteten Manuskript sind die Ergebnisse im Ergebnisabschnitt 3.1 beschrieben. Klinische Daten zur ki67-Färbung und zum Rezidivstatus wurden in Tabelle 1 und in die ergänzende Tabelle 1 aufgenommen.

Kommentar des Rezensenten: Zeile 177-179 „der Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant&rdquo. Wenn keine statistische Signifikanz vorliegt, was ist der Grund dafür, dass &bdquo ein höheres Expressionsniveau beider Transkripte in invasiven PitNETs beobachtet wurde&rdquo? Bitte umformulieren.

Antwort: Dieser Satz wurde korrigiert: &bdquoAls wir die Expressionsniveaus von L1-ORF1 und L1-ORF2 zwischen invasiven und nichtinvasiven Tumoren wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet&rdquo

Kommentar des Rezensenten. Zeile 179. Abbildung 1b ist fälschlicherweise referenziert. Ich nehme an, sie meinten Abbildung 2a: Wenn ja, stimmen die p-Werte im Text nicht mit den p-Werten in den Abbildungen überein.

Antwort: Der Fehler wurde korrigiert, da die in Zeile 179 angegebenen p-Werte gemäß dem vorherigen Vorschlag aus dem Text entfernt wurden. Wir haben überprüft, dass die p-Werte in Abbildung 2a korrekt sind.

Kommentar des Rezensenten: Warum wurden nur 30 Tumoren (von den 80 in die Studie eingeschlossenen Patienten) durch immunhistochemische Färbung analysiert? Gibt es eine Möglichkeit der Bias-Selektion? Wie erklären die Autoren, dass es keine Korrelation zwischen der L1-ORF1p-Immunreaktivität und der LINE-1-DNA-Methylierung oder den Expressionsniveaus der L1-Transkripte gibt?

Antwort: Die Beziehung zwischen L1-ORF1p-Expression und LINE-1-DNA-Methylierung wurde für die Überarbeitung des Manuskripts sorgfältiger untersucht. Wir führten Immunfärbungen an weiteren 23 Tumorproben durch. Die Färbereaktivität wurde mit der H-Score-Formel (McCarty et al., 1986), die Informationen über die Anzahl positiver Zellen und die Färbeintensität kombiniert. Dies erzeugte numerische Daten, die für die Korrelationsanalyse geeignet sind. Wir führten eine Korrelationsanalyse der L1-ORF1p-Expression und des Methylierungsniveaus durch und beobachteten die Korrelation. Wir vermuten, dass zwei Dinge die Ursache für die fehlende Korrelation unserer Ergebnisse sein können: Schwierigkeiten bei der Quantifizierung immunhistochemischer Daten, die immer auf subjektiver Beobachtung beruhen und natürliche Unterschiede in den Expressionswerten zwischen einzelnen Patienten, die nicht auf eine gestörte Methylierung zurückzuführen sind, sondern widerspiegeln normale interindividuelle Vielfalt. Solche Unterschiede wurden bei früheren Untersuchungen von normalem menschlichem Hirngewebe (Sur et al., 2017) und wir denken, dass sie auch die Ursache für die unterschiedliche Immunreaktivität einer von drei normalen Hypophysenproben sein könnten, die wir im überarbeiteten Manuskript zeigen. Dieser Kommentar wurde im Diskussionsteil des überarbeiteten Manuskripts eingefügt.

Kommentar des Rezensenten: Stellen Sie Bilder mit höherer (und besserer) Vergrößerung für Abbildung 3 bereit, damit das Ausdrucksmuster leicht beobachtet werden kann.

Antwort: Wir haben die Bilder in Abbildung 3 durch Bilder mit 400-facher Vergrößerung ersetzt

Kommentar des Rezensenten: Diskussion, Zeile 260: Es wurde eine etwas höhere Expression festgestellt. Es gibt keine statistische Signifikanz, daher bitte diese Aussage entfernen.

Antwort: Die Aussage wurde entfernt.

Harris, C.R. et al. (2010) &lsquoAssoziation der nuklearen Lokalisation eines lang eingestreuten nuklearen Element-1-Proteins in Brusttumoren mit schlechten prognostischen Ergebnissen&rsquo, Gene und Krebs, 1(2), S. 115&ndash124. doi: 10.1177/1947601909360812.

McCarty, K.S. et al. (1986) &lsquoVerwendung eines monoklonalen Anti-Östrogen-Rezeptor-Antikörpers bei der immunhistochemischen Untersuchung menschlicher Tumoren&rsquo, Krebsforschung, 46(8 SUPPL.), S. 4244 &ndash 4249.

Nordlund, J. et al. (2013) &lsquoGenomweite Signaturen differentieller DNA-Methylierung bei akuter lymphatischer Leukämie bei Kindern&rsquo, Genombiologie, 14(9), p. r105. doi: 10.1186/gb-2013-14-9-r105.

Rodić, N. et al. (2014) &lsquoLange durchsetzte Element-1-Proteinexpression ist ein Kennzeichen vieler menschlicher Krebsarten&rsquo, American Journal of Pathology, 184(5), S. 1280 &ndash 1286. doi: 10.1016/j.ajpath.2014.01.007.

Sur, D. et al. (2017) &lsquoNachweis des LINE-1-Retrotransposon-RNA-bindenden Proteins ORF1p in verschiedenen anatomischen Regionen des menschlichen Gehirns&rsquo, Mobile DNA. Mobile DNA, 8(1), S. 1&ndash12. doi: 10.1186/s13100-017-0101-4.


Hintergrund

Epigenetik ist ein sich schnell entwickelndes Gebiet im Kontext neuer biologischer Entdeckungen sowie der verfügbaren Technologien, die verwendet werden, um solche Erkenntnisse voranzutreiben. Die am häufigsten untersuchte epigenetische Markierung beim Menschen ist die DNA-Methylierung (DNAm), definiert als kovalente Addition einer Methylgruppe an DNA, die am häufigsten an Cytosin-Guanin-Dinukleotiden (CpGs) auftritt [20]. DNAm-Profile ändern sich natürlich während der Entwicklung eines Organismus, was dazu führt, dass die Gewebeidentität der stärkste Prädiktor für die DNAm-Variation ist. Daher kann die DNAm-Variabilität zwischen Geweben, beispielsweise Blut und Gehirn, innerhalb eines Individuums größer sein als die Variabilität, die zwischen Individuen aus demselben Gewebe beobachtet wird [7, 27]. Die interindividuelle Variabilität der DNAm wurde mit einer Reihe verschiedener Quellen in Verbindung gebracht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die zugrunde liegende DNA-Sequenz, Umweltbelastungen und gesundheitliche Folgen. Einer der aktivsten Forschungsbereiche im Zusammenhang mit der interindividuellen DNAm-Variabilität in menschlichen Kohorten konzentriert sich auf die Beziehung zwischen DNAm und Alterung, da es substanzielle Beweise dafür gibt, dass sich DNAm mit dem Alter sowohl linear als auch nicht-linear über das gesamte Leben hinweg verändert Kurs [12].

Die sich schnell entwickelnden neuen Technologien und Ressourcen haben in den letzten zehn Jahren ein exponentielles Wachstum der menschlichen DNAm-Forschung gefördert und unsere Fähigkeit verbessert, Fragen wie die Auswirkungen des Alterns anzugehen. Obwohl viele Methoden zur Messung von DNAm verwendet werden können, sind Illumina-Mikroarrays die gebräuchlichste Methode für populationsbasierte epigenetische Studien, da sie eine wirtschaftliche und zugängliche Hochdurchsatz-Plattform bieten. In etwas mehr als einem Jahrzehnt hat sich die Kapazität der Illumina DNAm Microarray-Plattform von 1506 CpGs auf über 860.000 CpGs erhöht. Die erhöhte Anzahl von CpGs spiegelt sowohl eine bessere Abdeckung über die Gene hinweg als auch eine erweiterte Abfrage genomischer Regionen wider. Zum Beispiel zielte das Illumina 27 K (27 K)-Array auf > 27.000 CpG-Stellen ab und befragte mindestens ein CpG pro Gen, war jedoch auf CpG-Inseln ausgerichtet [2]. Sein Nachfolger, das Array Illumina Infinium Methylation450 (450K) bewertete > 485.000 CpGs und deckte 99% der RefSeq-Gene ab. Das Illumina Infinium MethylationEPIC (EPIC) Array ist das neueste Tool und ermöglicht die Quantifizierung von über 860.000 CpG-Sites, wobei der zusätzliche Inhalt eine höhere Abdeckung spezifischer genomischer Regionen wie Enhancer und nicht-kodierende Regionen bietet. Das EPIC-Array verwendet im Allgemeinen das gleiche DNAm-Messprotokoll wie das 450K-Array und umfasst über 94 % des 450K-Inhalts [24]. Die erhöhte genomische Auflösung und Komplexität des EPIC-Arrays in Verbindung mit fehlenden 6% der 450K-CpGs erfordert jedoch eine Bewertung der Anwendbarkeit etablierter bioinformatischer Werkzeuge, die für die 27K- oder 450K-Arrays etabliert wurden.

Um den Fortschritten in der DNAm-Array-Technologie und dem zunehmenden Datenvolumen gerecht zu werden, wurden viele Pipelines für die Datenvorverarbeitung, -normalisierung und -analyse entwickelt, um die Datenverarbeitung zu rationalisieren [1, 5, 25, 28, 30]. Hier beziehen wir uns auf „Vorverarbeitungsmethoden“ als Algorithmen, die üblicherweise an DNAm-Daten vor der Sonden-Normalisierung durchgeführt werden, einschließlich Methoden zur Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz oder zur Anpassung an Farbstoff-Bias, die, wenn sie nicht angesprochen werden, den dynamischen Bereich von Beta-Werten reduzieren können [31]. Die Normalisierung des Sondentyps ist eine notwendige Anpassung für Illumina-Mikroarray-DNAm-Daten, da es zwei verschiedene Sondendesigns mit unterschiedlichen Beta-Verteilungen gibt [2]. Tools wie die R-Funktion „preprocessNoob“ im minfi-Paket subtrahieren den Hintergrund basierend auf den Intensitäten außerhalb des Bandes (zum Beispiel fluoreszieren Infinium I-Sonden im Farbkanal gegenüber ihrer entworfenen Basiserweiterung). Die Farb- oder Farbstoff-Bias-Einstellung wird angewendet, um den zwei Farbkanälen Rechnung zu tragen, die Typ-II-Sonden verwenden, einen für methylierte und einen für unmethylierte CpGs, da restlicher Farbstoff unerwünschte Variationen einführen kann. Zu den Tools zur Berücksichtigung der Farbabweichung gehören das Bioconductor-Paket „Methylumi“, das auf einer glatten Quantil-Normalisierung basiert, oder die Illumina GenomeStudio-Software, die eine Shift-and-Scaling-Normalisierung implementiert [6]. Obwohl diese Methoden im Vergleich miteinander überprüft wurden [33, 35, 36], wird in der Literatur eine gemischte Vielfalt von Pipelines verwendet, und der Einfluss der Methodenauswahl auf die Erkennung echter positiver Ergebnisse oder die Generierung genauer Vorhersagen sollte sowohl innerhalb als auch übergreifend untersucht werden Array-Technologien.

Ein Werkzeug, das durch verschiedene Vorverarbeitungsmethoden oder das Fehlen bestimmter 450.000 CpG-Stellen auf dem EPIC-Array beeinträchtigt werden könnte, ist die epigenetische Pan-Gewebe-Uhr, ein beliebtes Vorhersagemodell, das das biologische Alter eines Individuums unabhängig vom Gewebetyp unter Verwendung von DNAm bei 353 . schätzt CpGs [12]. Die epigenetische Uhr basiert auf DNAm-Profilen (erhalten aus 27 K- und 450 K-Daten) von 51 verschiedenen Geweben von über 8000 Individuen und berechnet das DNAm-Alter, das nachweislich gut mit dem chronologischen Alter korreliert (R > 0,80) über den Lebensverlauf [14]. Es wird angenommen, dass diese epigenetische Uhr ein genauer molekularer Biomarker des biologischen Alterns ist, und Abweichungen zwischen dem chronologischen und dem DNAm-Alter, die allgemein als epigenetische Altersbeschleunigung bezeichnet werden (die positiv oder negativ sein kann), wurden mit einer Vielzahl von altersbedingten Erkrankungen korreliert. wie Morbus Parkinson, Zeit bis zum Tod, Gebrechlichkeit und kognitiver und körperlicher Verfall [4, 15, 22, 23].

Es gibt mehrere andere DNAm-basierte Altersprädiktoren, über die berichtet wurde [3, 9, 34], aber ein anderer häufig verwendeter Altersprädiktor, der spezifisch für Blutproben ist und als Hannum-Uhr bezeichnet wird, basiert auf Methylierung an 71 CpG-Stellen wurde beobachtet, um das Alter mit beeindruckender Genauigkeit vorherzusagen. Sowohl dem Horvath- als auch dem Hannum-Modell fehlen jedoch CpG-Sites auf dem EPIC-Array (19 der 353 Pan-Gewebe-CpGs und 6/71 der Hannum-CpGs fehlen), und da die 450K-Plattform nicht mehr vorhanden ist verfügbar ist, ist es entscheidend, die Leistungsfähigkeit dieser Tools trotz fehlender Sonden zu beurteilen, wenn der Einsatz fortgesetzt werden soll.

Hier untersuchten wir (1) die Konsistenz zwischen dem aus 450K gemessenen DNAm-Alter und den EPIC-Array-Daten derselben Personen, um den Nutzen von EPIC-Array-Daten zu bewerten, da die in den Horvath- und Hannum-Altersprädiktoren verwendeten Takt-CpGs fehlen, und (2 ), ob sich die DNAm-Altersschätzungen bei verschiedenen Vorverarbeitungsmethoden unterscheiden. Wir fanden heraus, dass EPIC-Daten verwendet werden können, um das DNAm-Alter unter Verwendung beider bewerteter epigenetischer Uhren genau vorherzusagen. Darüber hinaus beobachteten wir Unterschiede im DNAm-Alter zwischen den Vorverarbeitungsmethoden, obwohl die Unterschiede zwischen den Werten unter dem berichteten mittleren absoluten Fehler der epigenetischen Uhr lagen. Schließlich haben wir die genaue Messung des DNAm-Alters mithilfe des Pan-Gewebe-Prädiktors gewebeübergreifend unter Verwendung eines EPIC-Datensatzes mit drei verschiedenen Geweben von 13 Individuen repliziert. Unsere Ergebnisse unterstützen die epigenetische Uhr als robustes Werkzeug, das in Zukunft mit EPIC-Array-Daten angewendet werden kann.


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Wissenschaft Translationale Medizin

Band 2, Ausgabe 54
20. Oktober 2010

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Von Jesper B. Andersen, Valentina M. Factor, Jens U. Marquardt, Chiara Raggi, Yun-Han Lee, Daekwan Seo, Elizabeth A. Conner, Snorri S. Thorgeirsson

Wissenschaft Translationale Medizin 20.10.2010 : 54ra77

Arzneimittelinduzierte Transkription und epigenetische Veränderungen können vorhersagen, ob Leberkrebs erfolgreich mit einem Epigenom-Targeting-Medikament behandelt werden kann.


Materialen und Methoden

WGBS-Daten wurden aus dem Short Read Archive (SRA)/Gene Expression Omnibus (GEO) heruntergeladen oder intern sequenziert (Tabelle S1). WGBS-Daten wurden mit den in (Schultz et al. 2015), um 𠇊llC”-Dateien zu generieren. Die allC-Dateien wurden verwendet, um die Ziel-DNA-Methylierungsgrade zu bestimmen und können von GEO unter der Zugangsnummer <"type":"entrez-geo","attrs":<"text":"GSE72155","term_id":" heruntergeladen werden. 72155">> GSE72155. Vor der Schätzung des Prädiktor-DNA-Methylierungsniveaus wurden die WGBS-Daten mit Cutadapt v1.9 (Martin 2011) von Adaptersequenzen getrimmt und mit Trimmomatic (Bolger et al. 2014) und qualitätsgefiltert mit FASTX-toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). Reads von mindestens 30 bp Länge mit ≥ 20 % der Nukleotide mit einem Qualitätsscore von ≥ 75 % wurden beibehalten. Random Sampling ohne Ersetzen wurde mit zunehmendem Fold-Change von 1 auf 10 5 Reads mit dem Programm fastq-tools (http://homes.cs.washington.edu/) durchgeführt.

dcjones/fastq-tools/). Benutzerdefinierte Perl-Skripte wurden verwendet, um die Anzahl der C m und C ? Stellen für jeden zufällig entnommenen Read und anschließend zur Schätzung des Prädiktor-DNA-Methylierungsniveaus an CpG-, CHG-, CHH- und CH-Stellen (Tabelle S1). Ein gemeinsames Merkmal aller Studien, die WGBS-Daten verwenden, ist die Unfähigkeit, zwischen 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) zu unterscheiden (Huang et al. 2010). Daher stellen die DNA-Methylierungsgrade beide Formen methylierter Cytosine dar, obwohl beachtet werden sollte, dass es in Pflanzengenomen keine Hinweise auf 5hmC gibt (Erdmann et al. 2014).

Prädiktive Modellierung wird verwendet, um die mathematische Beziehung zwischen einem Ziel (abhängige Variable) und verschiedenen Schätzern (unabhängigen Variablen) zu finden, nachfolgende Werte eines oder mehrerer Schätzer werden verwendet, um die Zielvariable unter Verwendung der etablierten mathematischen Beziehung zwischen ihnen vorherzusagen. Das Ziel der SCHNELL m C Modelle war es, referenzbasierte (Ziel) von nicht referenzbasierten (Schätzer) DNA-Methylierungsniveaus vorherzusagen. Diese Modelle gehen davon aus, dass in MethylC-Seq-Daten (Urich et al. 2015): (i) alle Cytosine an CpG-, CHG-, CHH- und CH-Stellen sind methyliert (ii) alle Thymine an TpG-, THG-, THH- und TH-Stellen sind umgewandelte unmethylierte Cytosine oder echte Thymine und (iii) alle Nukleotide sind zufällig im Genom verteilt. Unser Ziel ist es, den Anteil von Cs an potentiellen Zielstellen abzuschätzen, die tatsächlich methyliert sind, m, welches ist

wo C m und C du sind die Gesamtzahl der methylierten bzw. unmethylierten Zielstellen im Genom. Die Standardmethode zur Schätzung m ist die Bestimmung der Werte von ∑ C m und C du durch Kartierung von Bisulfit-Sequenz-Reads zu einem Referenzgenom. Die Zuordnung zu einer Referenz ermöglicht es, unmethylierte Cs, die während der Bisulfit-Sequenzierung in Ts umgewandelt werden, von echten Ts zu unterscheiden. Unsere Methodenschätzungen m nur unter Verwendung von Bisulfit-Sequenz-Reads. Aus den Bisulfit-Sequenzierungsdaten berechnen wir F ^ , das ist:

woSC m ist die Gesamtzahl der methylierten Zielstellen in der Probe und ∑SC ? ist die Summe der unmethylierten Zielstellen, ∑SC du , plus Stellen, die unmethylierten Zielstellen äquivalent sind, ∑ST, nach Bisulfit-Sequenzierung in der Probe, z.B., alle TG-Dinukleotide im Fall der CpG-Methylierung. Mit unseren Annahmen, wenn P GC-Gehalt, dann für CpG-Methylierung, in einer Probe von n sequenzierten Basen ∑SEs wird erwartet, dass C m gleich (¼P 2 m)n (d.h., das Produkt aus der Häufigkeit der CpG-Stellen, der Methylierungswahrscheinlichkeit und der Anzahl der sequenzierten Basen), ∑SEs wird erwartet, dass C u gleich (¼P 2 (1−m))n (d.h., das Produkt aus der Häufigkeit von CpG-Stellen, der Wahrscheinlichkeit einer fehlenden Methylierung und der Anzahl der sequenzierten Basen) und ∑ST wird voraussichtlich gleich (¼P(1−P))n (d.h., das Produkt aus der Häufigkeit von TG-Dinukleotiden und der Anzahl der sequenzierten Basen). Das Einsetzen in Gleichung 2 impliziert, dass der Erwartungswert von F ^ ist mP. Mit unseren Annahmen ist F^ somit eine Schätzung des Produkts aus der Methylierungshäufigkeit von CpG-Stellen und dem GC-Gehalt des Genoms. Daraus folgt, dass F^ geteilt durch den geschätzten genomischen GC-Gehalt p^ eine Schätzung von m ist. Für die anderen drei Methylierungsziele (CH, CHH und CHG) kann in ähnlicher Weise gezeigt werden, dass F^p^ ebenfalls eine Schätzung von m an diesen Zielstellen ist. Wir schätzen den GC-Gehalt anhand der Häufigkeiten von G-Nukleotiden in der Probe, da diese Stellen durch die Bisulfit-Behandlung nicht beeinflusst werden. Der Unterschied zwischen den Schätzungen des GC-Gehalts aus WGBS-Reads liegt im Durchschnitt innerhalb von 4,56 % ± 3,52 % Standardabweichungen des wahren GC-Gehalts. SCHNELL m C berechnet F ^ p ^ aus einer Bisulfitprobe des gesamten Genoms als Schätzung von m der Fraktion von Cs, die methyliert sind.

Eine Verletzung der Annahmen kann zu Ungenauigkeiten bei der Schätzung von F^ führen. Wir besprechen einige dieser Verstöße in Resultate und Diskussionen. Darüber hinaus stellen wir fest, dass, wenn zusätzliche genomische Short-Read-Daten (≥ 500.000 bp) verfügbar sind, der GC-Gehalt und die Häufigkeit der Zielstelle im Genom, z.B., die Häufigkeit von CpG-Dinukleotiden, kann direkt gemessen werden. Daraus lässt sich dann direkt der Anteil der methylierten Zielstellen berechnen, m, anhand der Häufigkeit intakter Zielstellen, z.B., CpG, die in den Bisulfit-Genomdaten verbleiben. Dies sind Stellen, die methyliert wurden und somit der Umwandlung von C zu T entgangen sind.

Datenverfügbarkeit

Alle in dieser Studie verwendeten Daten sind auf den SRA/GEO-Webseiten zu finden. Zugangskennungen sind in Tabelle S1 zu finden.


Genomweite Methylierungsanalyse: technische Fehlerquellen? - Biologie

Einführung Das Kagami-Ogata-Syndrom (KOS14) und das Temple-Syndrom (TS14) sind zwei Erkrankungen, die mit reziproken Veränderungen innerhalb der geprägten Domäne von chr14q32 verbunden sind. Hier stellen wir eine Aufarbeitungsstrategie für die Präimplantationsdiagnostik (PGT) vor, um die Übertragung einer ursächlichen Mikrodeletion zu vermeiden.

Methoden Wir analysierten DNA aus dem KOS14-Indexfall und den Eltern mit methylierungssensitiver ligationsvermittelter Sondenamplifikation und Methylierungspyrosequenzierung. Das Ausmaß der Deletion wurde unter Verwendung von SNP-Arrays kartiert. PGT wurde in Trophektodermproben durchgeführt, um nicht betroffene Embryonen zu identifizieren. Die Proben wurden mittels Multiple Displacement Amplifikation amplifiziert, gefolgt von einer genomweiten SNP-Genotypisierung zur Bestimmung des Risiko-Haplotyps und einer Next-Generation-Sequenzierung zur Bestimmung von Aneuploidien.

Ergebnisse Ein vollständig methyliertes Muster am normalerweise väterlich methylierten IG-DMR und MEG3 DMR beim KOS14-Probanden, begleitet von einem unmethylierten Profil bei der TS14-Mutter, stimmte mit einer mütterlichen bzw. väterlichen Übertragung einer Deletion überein. Eine weitere Analyse ergab in beiden Fällen eine 108-kb-Deletion. Die Vererbung der Deletion auf verschiedenen elterlichen Allelen stimmte mit den gegensätzlichen Phänotypen überein. In-vitro-Fertilisation mit intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und PGT wurden verwendet, um den Deletionsstatus zu überprüfen und einen nicht betroffenen Embryo in dieses Paar zu übertragen. Ein einzelner euploid-nicht betroffener Embryo wurde identifiziert, was zu einem gesunden Baby führte.

Diskussion Wir identifizieren eine Mikrodeletion, die für Mehrgenerationen-KOS14 und TS14 innerhalb einer einzigen Familie verantwortlich ist, bei der Träger ein 50%iges Risiko haben, die Deletion auf ihre Nachkommen zu übertragen. Wir zeigen, dass PGT Paaren mit IDs, die durch genetische Anomalien verursacht wurden, erfolgreich angeboten werden kann.


5 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNGEN

Wir haben vorgeschlagen a referenzfrei Methode zur Durchführung von EWAS, während die Zellmischung angepasst wird. Im Anschluss an die Arbeit von Houseman et al. (2012). et al. (2011). Wir haben auch eine begleitende Bootstrap-Methodik zum Schätzen von Standardfehlern vorgeschlagen.

Unsere Simulationsstudien legen nahe, dass unser vorgeschlagener Ansatz vernünftigerweise unverzerrte Schätzungen der direkte Auswirkung, d. h. der Effekt, der nicht durch den Zelltyp vermittelt wird, und vernünftige Schätzungen des Standardfehlers. Sie schlagen auch eine angemessene Kontrolle des Typ-I-Fehlers und eine angemessene Leistung vor, um direkte Auswirkungen ausreichender Größe zu erkennen. Unsere Simulationen legen auch nahe, dass die von Teschendorff . vorgeschlagene RMT-Methode der Dimensionsschätzung et al. (2011) eignet sich gut zur Abschätzung der Dimension der latenten Struktur. Schließlich ist unsere Methode bei technischen Fehlern von großem Ausmaß genauso gut wie bei der Ersatzvariablenanalyse (SVA) und besser als SVA, wenn der technische Fehler kleiner (aber immer noch realistisch) ist. Wir haben unsere Methode an vier separaten Datensätzen demonstriert. Der erste war ein Datensatz für rheumatoide Arthritis, bei dem die DNA-Methylierung im Blut nach Anwendung unseres referenzfreien Ansatzes eine erhebliche Abschwächung der Wirkung zeigt, selbst im Vergleich zu einem Ansatz, der dem von Liu . ähnlich ist et al. (2013), wobei die DNA-Methylierung für die von Houseman . profilierten Zelltypen angepasst wurde et al. (2012) unter Verwendung der in diesem Papier vorgeschlagenen Methodik. Eine mögliche Erklärung ist, dass DNA-Methylierungseffekte durch Zelltypen vermittelt werden können, die von Houseman nicht profiliert wurden et al. (2012). Der zweite Satz bestand aus PBMC-Daten und den damit verbundenen Auswirkungen der il6-Antwort auf einen potenten Tumorpromotor, für die wir zeigen, dass unser vorgeschlagener referenzfreier Ansatz ähnliche Ergebnisse wie referenzbasierte Ansätze liefert, sich jedoch von einer unbereinigten Analyse unterscheidet. Der dritte Satz war ein Plazenta-Datensatz, für den keine Referenzdaten für Komponentenzelltypen verfügbar waren. In diesem Datensatz zeigten die Effekte von SGA nach Anwendung unserer referenzfreien Methode eine mäßige Abschwächung. Dies legt nahe, dass die Auswirkungen der Wachstumsrestriktion auf die DNA-Methylierung wahrscheinlich weniger durch Veränderungen der Zellverteilung vermittelt werden, ein Ergebnis, das man in einer festen Gewebeprobe wie Plazentagewebe erwarten könnte. Die vierte Analyse verglich Magentumore mit nicht bösartigem Magengewebe und zeigte Unterschiede in den Ergebnissen zwischen mischungsbereinigten und unbereinigten Analysen, jedoch mit signifikanten direkten Effekten, die selbst in den adjustierten Analysen erzeugt wurden. In diesem letzten Beispiel gibt es Hinweise darauf, dass die Ergebnisse der referenzfreien Methode biologisch aussagekräftiger sein können als die von SVA.

Ein interessanter Aspekt unserer Methodik ist ihre Tendenz, „Spikes“ in Vulkanplots zu erzeugen, wie sie in Abbildung 5 oder der ergänzenden Abbildung S12(a) gezeigt sind. Diese werden durch das Schrumpfen von Standardfehlern verursacht, insbesondere bei DMRs, d. h. CpGs, die die Zellmischungen in ⁠ antreiben. Da sich diese CpGs kollektiv statistische Stärke voneinander leihen, sind ihre Standardfehler tendenziell kleiner. Dieses Phänomen ist in den ergänzenden Abbildungen S7(b) und den ergänzenden Daten ersichtlich, die referenzfreie und unbereinigte Standardfehler für die Blut- und PBMC-Datensätze vergleichen sind deutlich kleiner als die entsprechenden Standardfehler aus der unbereinigten Analyse. Das gleiche Phänomen ist in der ergänzenden Abbildung S7(h) ersichtlich, in der die Standardfehler der referenzbereinigten Analyse gegen die entsprechenden Standardfehler der unbereinigten Analyse aufgetragen sind und die Schrumpfung der Standardfehler bei Leukozyten-DMRs demonstriert wird.

Im Gegensatz zu den SVA-Ansätzen von Leek und Storey (2007) und Teschendorff et al. (2011) postulieren wir ein spezifisches Datengenerierungsmodell, das eine faktoranalytische Struktur beinhaltet, die in den zuvor veröffentlichten Methoden implizit ist. Wir integrieren jedoch alle CpG-Merkmale in der faktoranalytischen Struktur, anstatt zu versuchen, eine Teilmenge von Merkmalen auszuwählen, die optimal informativ sind. Während bei der Verwendung aller CpG-Funktionen, die auf einem bestimmten Array vorhanden sind, ein gewisser Präzisionsverlust auftreten kann, betrachten wir dies als akzeptables Opfer für einen agnostischen Ansatz, der es jedem CpG ermöglicht, als DMR zu dienen. Darüber hinaus haben die Ersatzvariablen, für die unser Modell implizit angepasst wird, eine explizite Mischungsinterpretation. Unsere Simulationen legen äquivalente oder bessere Ergebnisse unter Verwendung unserer vorgeschlagenen Methode nahe. In der Magentumoranalyse gibt es einen Hinweis darauf, dass unser referenzfreier Ansatz zu Ergebnissen führen kann, die etwas besser mit der bekannten Biologie übereinstimmen. Der referenzfreie Ansatz kann dies ohne den etwas zeitaufwändigen Vergleich von Kandidaten-Surrogatvariablen mit potentiellen Confoundern erreichen, erreicht dieses Ergebnis jedoch, indem er im Wesentlichen unbereinigte Effektschätzer auf eine Fehlermatrix projiziert, mit einer Linearitätsannahme, die zwar biologisch motiviert , kann manchmal fehlschlagen. Darüber hinaus ist unsere Methode darauf ausgelegt, Zellmischungen zu entfalten, sie ist nicht darauf ausgelegt, Confounder aufzudecken, die spezifisch für technische Variationsquellen sind. Somit könnte SVA auf einer M-Wert-Skala angewendet werden, um Ersatzvariablen zu extrahieren, die nur für die technische Variation spezifisch sind (dh indem diejenigen aus dem Satz geschätzter Ersatzvariablen entfernt werden, die mit biologischen Störfaktoren verbunden sind) und anschließend in unsere Referenz aufgenommen werden. freien Ansatz. Es ist jedoch etwas unklar, wie man vorgehen soll, wenn Chargen mit Phänotypen verwechselt werden. Es sind detailliertere Forschungen erforderlich, um Methoden zu entwickeln, die gleichzeitig lineare Mischeffekte und nichtlineare technische Effekte ausgleichen, wobei Datensätze mit vollständig annotierten technischen Daten wie Chipnummer und Position verwendet werden . Wir sehen diesen Artikel jedoch als einen konkreten Schritt in diese Richtung, und unsere Datenbeispiele zeigen die Praktikabilität unserer Methode.

Unser Ansatz bietet nun die Möglichkeit, eine EWAS-Analyse mit Anpassung an die Mediation nach Zelltyp durchzuführen, auch ohne dass Referenzdatensätze existieren, deren Erhebung teuer oder unmöglich wäre. Wenn es weit verbreitet ist, könnte es den Weg für EWA-Studien ebnen, die robuster sind und ein höheres Potenzial für die Replikation der Ergebnisse aufweisen.


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Die Entdeckung eines schwerwiegenden technischen Fehlers wird die epigenetische Forschung verbessern

Ein Fehler in einer der am weitesten verbreiteten Methoden in der Epigenetik, DIP-seq, kann zu irreführenden Ergebnissen führen, wie Forscher der Linköping University, Schweden, gezeigt haben. Dies kann im Forschungsbereich von großer Bedeutung sein, wo "Big Data" und fortschrittliche Methoden der DNA-Analyse verwendet werden, um riesige Mengen epigenetischer Daten zu untersuchen. Der Fehler kann in zuvor gesammelten DIP-seq-Daten korrigiert werden, was zu neuen Entdeckungen aus früheren Studien der menschlichen Epigenetik führen kann. Die Ergebnisse wurden in der Zeitschrift veröffentlicht Naturmethoden.

Im Prinzip hat jede Zelle unseres Körpers die gleiche DNA-Sequenz. Unterschiedliche Zelltypen verwenden jedoch sehr unterschiedliche Gengruppen. Dies bedeutet, dass zusätzliche Signale benötigt werden, um zu steuern, welche Gene in jedem einzelnen Zelltyp verwendet werden. Ein Typ eines solchen Signals besteht aus chemischen Gruppen, die direkt an die DNA-Sequenz gebunden sind. Diese chemischen Modifikationen der DNA-Sequenz sind Teil des sogenannten "epigenetischen Codes". Die epigenetische Regulation von Genen spielt eine wichtige Rolle in der normalen menschlichen Entwicklung, wird aber auch mit vielen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht.

Forscher der Linköping University haben nun eine Schwachstelle in einer der am häufigsten verwendeten Methoden in der epigenetischen Forschung entdeckt, dem DNA-Immunopräzipitations-Sequenzieren (DIP-seq). Vereinfacht gesagt basiert diese Methode darauf, die Teile der DNA herauszupicken, die ein bestimmtes epigenetisches Signal tragen. Dafür verwenden die Forscher verschiedene Antikörper, die eine bestimmte chemische Struktur erkennen und daran binden. Anschließend werden die Antikörper sortiert und die Sequenzen der DNA, an die sie gebunden haben, bestimmt. Nestors Gruppe stellte fest, dass bestimmte epigenetische Markierungen immer an derselben Stelle auftraten, selbst in DNA, die diese epigenetischen Markierungen überhaupt nicht enthalten sollte.

„Unsere Entdeckung unterstreicht die Bedeutung der experimentellen Validierung beim Einsatz von Hochdurchsatztechnologien in der Forschung. Ohne eine solche experimentelle Strenge können sich weit verbreitete Fehler in aller Öffentlichkeit verbergen, verdeckt durch ihre ‚Konsistenz‘ über Studien hinweg“, sagt Colm Nestor, Assistant Professor am Department of Klinische und experimentelle Medizin und leitender Prüfarzt der Studie.

Durch die Analyse von mehr als 125 bestehenden Datensätzen zeigte die Gruppe von Nestor, dass DIP-seq häufig DNA-Sequenzen nachwies, die keine epigenetischen Markierungen aufwiesen. Diese falsch-positiven Ergebnisse machen 50-90% der nachgewiesenen DNA-Regionen aus, und das Ausmaß des Effekts unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Datensätzen. "Jetzt, da wir von diesem Fehler wissen, ist es extrem einfach, ihn wegzuziehen. Die Korrektur dieser Fehler wird es ermöglichen, aus der Fülle von epigenetischen Daten, die bereits öffentlich zugänglich sind, neue Entdeckungen zu machen", sagt Colm Nestor.

Die Forscher weisen darauf hin, dass die allermeisten Ergebnisse aus früheren Studien richtig sind.

„Wir sollten diese Methoden weiterhin verwenden, aber diese Fehler durch geeignetes experimentelles Design korrigieren“, sagt Colm Nestor.


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Schlüsselwörter : mehrfach nachgewiesene Daten, Langzeitisolationsumgebung, DNA-Methylierung, biochemische/metabolische Parameter, Krankheiten

Zitat: Quan Y, Liang F, Zhu Y, Chen Y, Xu Z, Du F, Lv K, Chen H, Qu L, Xu R, Zhang HY, Xiong J und Li Y (2019) Integrierte Analyse von DNA-Methylierung und Biochemie /Stoffwechselparameter während der langfristigen Isolationsumgebung. Vorderseite. Physiol. 10:917. doi: 10.3389/fphys.2019.00917

Eingegangen: 01. Februar 2019 Angenommen: 04. Juli 2019
Veröffentlicht: 24. Juli 2019.

Airong Qian, Northwestern Polytechnical University, China

Shu Zhang, Vierte Militärmedizinische Universität, China
Chen Wang, Mayo Clinic, USA

Copyright © 2019 Quan, Liang, Zhu, Chen, Xu, Du, Lv, Chen, Qu, Xu, Zhang, Xiong und Li. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (CC BY) verbreitet wird. Die Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung in anderen Foren ist unter Nennung der Urheber und Urheber sowie unter Angabe der Originalpublikation in dieser Zeitschrift im Einklang mit der anerkannten wissenschaftlichen Praxis gestattet. Es ist keine Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung gestattet, die nicht diesen Bedingungen entspricht.


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