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Wie nennt man die Veränderung des Verhältnisses von Histon zu Protamin bei Männern mit Unfruchtbarkeit?

Wie nennt man die Veränderung des Verhältnisses von Histon zu Protamin bei Männern mit Unfruchtbarkeit?



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Ich bin weder Biologieforscher noch Student. In einer Arbeit (geschrieben von einem Biologieforscher), die ich ins Englische übersetze, steht folgende Aussage, die laut Text einen Namen haben muss und ich finde den englischen Namen nicht:

Es wird gezeigt, dass sich bei Männern mit Unfruchtbarkeit das Histon-Protamin-Verhältnis ändert und die Änderung wird als…

Wie heißt die Änderung? Ich denke, es ist etwas unnatürlich/abnormal.


Es wird als "abnormale Verpackung" bezeichnet.

Quelle: "Spermienchromatin: Biologische und klinische Anwendungen bei männlicher Unfruchtbarkeit und assistierter Reproduktion“ von Armand Zini & Ashok Agarwal (2011), S. 172.


Assoziation von Samenzytokinen mit reaktiven Sauerstoffspezies und Anomalien des Histonübergangs

Das Ziel dieser Studie ist es, die Beziehungen zwischen der Erhöhung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), dem Histonübergang und den seminalen Zytokinkonzentrationen zu untersuchen.

Methoden

Die Gesamtkonzentrationen von ROS in Samenproben von 6560 Männern wurden gemessen. Aus dieser Stichprobe wurden 118 Fälle mit hohem ROS und 106 Kontrollen rekrutiert. Grundlegende Samenparameter und Histon-zu-Protamin-Verhältnisse wurden analysiert, 400 Samenzytokin- und Rezeptorveränderungen wurden mit Proteinchips getestet und schließlich wurden 18 Zytokine in jeder Probe mit einem Bio-Plex-Cytokin-Assay validiert.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigten, dass die Samenkonzentration von ROS mit Anomalien im Histonübergang der Spermien verbunden war. Im Vergleich zu den Kontrollen wiesen 93 Zytokine signifikante Veränderungen in den Fällen mit hohem ROS auf, von denen 14 in einzelnen Proben weiter verifiziert wurden. Die Konzentrationen von CXCL5, CXCL16, CXCL8, IL-1b, IL-10, CSF3, CCL3 und TNF-α korrelierten signifikant mit dem Histon-Übergangsverhältnis. Darüber hinaus zeigte IL-16 signifikant unterschiedliche Konzentrationen in Kontrollen, normalem Sperma mit hohen ROS-Werten und abnormalem Sperma mit hohen ROS-Werten.

Schlussfolgerungen

Samen-ROS sind mit Anomalien beim Histonübergang der Spermien verbunden. CXCL5, CXCL8, IL-16, CCL8, CCL22, CCL20, CXCL16, IL-1B, IL-6, IL-7, IL-10, CSF3, CCL3, CCL4 und TNF-α haben alle erhöhte Konzentrationen im Sperma mit hohem ROS-Stufen. Diese Daten könnten helfen, die Mechanismen hinter dem Anstieg der ROS- und Samenzytokine und deren Zusammenhang mit einer defekten Spermatogenese zu erklären.


Wie nennt man die Veränderung des Verhältnisses von Histon zu Protamin bei Männern mit Unfruchtbarkeit? - Biologie

Vergleich der ART-Ergebnisse bei Männern mit verändertem mRNA-Protamin-1-/Protamin-2-Verhältnis, die sich einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit ejakulierten und testikulären Spermien unterziehen

Jonás Sarasa 1 , María Enciso 1 , Laura García 2 , Andrea Leza 2 , Klaus Steger 3 , Jon Aizpurua 2
1 iGLS, Alicante 03540, Spanien
2 IVF-Spanien, Alicante 03540, Spanien
3 Klinik für Urologie, Kinderurologie und Andrologie, Molekulare Andrologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, Gießen 35385, Deutschland

Datum der Einreichung08-Mai-2019
Datum der Annahme25.11.2019
Datum der Web-Veröffentlichung24-März-2020

Postadresse:
Jonás Sarasa
iGLS, Alicante 03540
Spanien

Quelle der Unterstützung: Keiner, Interessenkonflikt: Keiner

DOI: 10.4103/aja.aja_146_19

Assistierte Reproduktionstechnologien mit der Verwendung von Spermatozoen und Eizellen für in vitro Befruchtung (IVF) ist die Lösung für viele unfruchtbare Paare, um Eltern zu werden. In einigen Fällen führt die Verwendung von ejakulierten Spermatozoen jedoch zu einer schlechten IVF-Leistung. Einige Studien haben die Verwendung von Hodenspermatozoen bei schwerer männlicher Unfruchtbarkeit vorgeschlagen, aber derzeit gibt es keine Richtlinien zu ihrer Verwendung. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass das mRNA-Protamin 1/Protamin 2 (P1/P2)-Verhältnis ein wertvoller Biomarker für eine schlechte Spermienfunktion ist, der als diagnostischer Schlüssel zur Identifizierung von Fällen verwendet werden könnte, die von der Verwendung von Hoden profitieren würden Spermatozoen. Es wurden insgesamt 23 Paare untersucht, die sich einem Eizellspendezyklus mit mindestens einem vorangegangenen Zyklusversagen unterzogen. Alle Paare durchliefen zwei aufeinander folgende Zyklen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) mit entweder ejakulierten oder testikulären Spermatozoen (TESA). Das Spermien-mRNA-P1/P2-Verhältnis, die Befruchtungsrate, die Blastozystenrate sowie die Schwangerschafts- und Lebendgeburtenrate wurden verglichen. Die Ergebnisse zeigten verbesserte ICSI- und klinische Ergebnisse in Zyklen mit testikulären Spermatozoen bei Männern mit veränderten mRNA-P1/P2-Verhältnissen. TESA-Zyklen zeigten signifikant höhere Befruchtungsraten (mittlere ± Standardabweichung: 76,1% ± 15,1% vs 65,5% ± 18,8%), Blastozystenbildung (55,0% ± 20.3% .) vs 30,8% ± 23,8%) und Blastozyste von guter morphologischer Qualität (28,9% ± 22,9% vs 13.5% ± 17.9%) und auch Verbesserungen bei der Schwangerschaft (60.9% vs 0%) und gesunde Geburtenraten (56,5% vs 0%) als EJACULATE-Zyklen. Die hier beschriebenen Ergebnisse legen nahe, dass bei Patienten mit früheren IVF/ICSI-Versagen und abweichenden mRNA-Protamin-Verhältnissen die Verwendung von Hodenspermatozoen eine gute Alternative zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse sein kann.

Schlüsselwörter: DNA-Schädigung männliche Unfruchtbarkeit mRNA-Protaminverhältnis Spermienchromatin Hodenspermatozoen


So zitieren Sie diesen Artikel:
Sarasa J, Enciso M, García L, Leza A, Steger K, Aizpurua J. Vergleich der ART-Ergebnisse bei Männern mit verändertem mRNA-Protamin-1-/Protamin-2-Verhältnis, die sich einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit ejakulierten und testikulären Spermien unterziehen. Asiatisch J Androl 202022:623-8

So zitieren Sie diese URL:
Sarasa J, Enciso M, García L, Leza A, Steger K, Aizpurua J. Vergleich der ART-Ergebnisse bei Männern mit verändertem mRNA-Protamin-1-/Protamin-2-Verhältnis, die sich einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit ejakulierten und testikulären Spermien unterziehen. Asian J Androl [seriell online] 2020 [zitiert am 23. Juni 2021]22:623-8. Verfügbar unter: https://www.ajandrology.com/text.asp?2020/22/6/623/281367 - DOI: 10.4103/aja.aja_146_19

Jonás Sarasa, Mar໚ Enciso
Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Für eine erfolgreiche Befruchtung bei Säugern und eine adäquate Embryonalentwicklung muss auf die Fusion von Spermatozoon und Eizelle eine Reaktionskaskade folgen, einschließlich DNA-Reparatur, metabolischer Aktivierung der Eizelle und Mikrotubuli-Zusammenbau zur Bildung der mitotischen Spindel. [1],[2] Ein Versagen der Befruchtung oder eine fehlerhafte Entwicklung des Embryos vor der Implantation können auf eine beeinträchtigte Qualität der Eizelle oder des Spermatozoons zurückzuführen sein. [3]

In Bezug auf die Spermienqualität haben einige Studien gezeigt, dass zum einen die Embryoentwicklung und Einnistung zum Teil von der Integrität der Spermien-DNA abhängt [4] und zum anderen, dass die Produktion kompetenter Spermien einen korrekten Austausch der DNA-Bindung erfordert Histone durch spermienspezifische Nukleoproteine, die Protamine genannt werden. [5] Aus diesem Grund wurden diese Parameter als geeignete Biomarker zur Beurteilung des männlichen Fertilitätspotenzials vorgeschlagen. [6] Die Spermien-DNA-Fragmentierung ist ein beliebterer Biomarker als die Spermien-Nukleoprotein-Analyse. Die Analyse der Spermien-DNA-Integrität wurde langsam von in vitro Befruchtungszentren (IVF) weltweit als Teil ihres Standard-Spermiogramms. [7] Die Untersuchung von Protaminen wird jedoch kaum als Routineparameter zur Beurteilung der Spermienqualität angesehen.

Spermienprotamine sind kleine argininreiche Kernproteine, die eine dichtere Verpackung der DNA im Spermatozoon ermöglichen als Histone. Die Hauptrolle dieser Art von Proteinen besteht darin, die DNA-Integrität im Spermienkopf zu bewahren, indem schädliche Angriffe von exogenen oder endogenen Wirkstoffen verhindert werden. [8],[9] Eine regulatorische Rolle für die Chromatinstruktur der Spermien wurde ebenfalls vorgeschlagen. [10],[11] Menschliche Spermatozoen exprimieren zwei Arten von Protaminen: P1 und P2, und beide sind für die Spermienfunktion essentiell. Das relative Verhältnis von P1 zu P2 wird sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in einem Verhältnis von ungefähr 1:1 reguliert. [12],[13] Veränderungen dieses Protaminverhältnisses sind bei fruchtbaren Männern selten, bei unfruchtbaren Männern jedoch häufig [5] und wurden mit schlechter Spermienqualität, erhöhten DNA-Schäden und verminderter Fruchtbarkeit in Verbindung gebracht. [14],[15] Einige Autoren haben vorgeschlagen, dass die Analyse des Protamingehalts in Spermien als Biomarker für die männliche Unfruchtbarkeitsdiagnose im klinischen Umfeld verwendet werden könnte. [13],[16]

Ejakulierte Spermatozoen, die ihre Reifung während der Passage durch die männlichen Fortpflanzungsorgane abgeschlossen haben, haben in der Regel ein besseres Befruchtungspotential als Hodenspermien. [17] Die Verwendung von Spermatozoen, die aus Hodengewebe isoliert wurden, wurde jedoch in einigen Fällen schwerer männlicher Unfruchtbarkeit vorgeschlagen. Studien haben über verbesserte Embryonen- und Schwangerschaftsraten [18], [19] und keine negativen Auswirkungen auf die Gesundheit der Nachkommen durch die Verwendung von Hodenspermien im Vergleich zu denen durch die Verwendung von ejakulierten Spermatozoen berichtet. [20],[21] Diese Ergebnisse können damit zusammenhängen, dass testikuläre Spermien weniger DNA-Schäden aufweisen. [22] Die Erklärung für diese Ergebnisse könnte sein, dass Spermatozoen während ihres Durchgangs durch den männlichen Fortpflanzungstrakt anfällig für Schäden sind. [23] Derzeit wurden keine Richtlinien oder Protokolle bezüglich der Verwendung von Hodenspermien in Fällen schwerer männlicher Unfruchtbarkeit vorgeschlagen, bei denen ejakulierte Spermatozoen verfügbar sind, aber eine schlechte IVF- oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) Leistung gezeigt haben. Einige Studien haben die Verwendung von Hodenspermatozoen bei erhöhter Spermien-DNA-Fragmentierung (SDF) vorgeschlagen. [22],[24],[25] Allerdings ist die Zahl der Studien zu diesem Thema begrenzt.

Es besteht die Notwendigkeit, nach neuen Biomarkern für eine schlechte Spermienfunktion zu suchen, die als diagnostische Schlüssel für die Identifizierung von Fällen dienen könnten, die von der Verwendung von Hoden- statt ejakulierter Spermien profitieren würden. In der vorliegenden Studie schlagen wir vor, dass das mRNA-P1/P2-Verhältnis als wertvoller Indikator für die Reife und Befruchtungsfähigkeit der Spermien verwendet werden könnte, um spezifische Fälle zu identifizieren, die von der Verwendung von Hodenspermatozoen in der assistierten Reproduktionstechnologie (ART) profitieren könnten. Hier untersuchen wir, ob die Verwendung von Hodenspermien die ART-Ergebnisse bei Patienten mit zuvor fehlgeschlagenen ART-Eizellspendezyklen mit ejakulierten Spermatozoen mit veränderten mRNA-P1/P2-Verhältnissen verbessert.

Patientenauswahl

Diese unizentrische, beobachtende und retrospektive Studie umfasste die Überprüfung der Aufzeichnungen von Patienten, die sich zwischen Januar 2014 und Februar 2016 im IVF-Zentrum IVF-Spanien (Alicante, Spanien) behandeln ließen.

Die Studiengruppe umfasste insgesamt 23 subfertile Paare, die sich einer Eizellspende zur Behandlung der assistierten Reproduktion unterzogen. Alle in die Studie eingeschlossenen Paare hatten (i) Dauer der Unfruchtbarkeit ɭ Jahr (ii) keine weibliche Unfruchtbarkeit ohne Uteruspathologie (iii) hatten mindestens einen früheren Eizellspendezyklus in unserem Zentrum mit geringer oder null Blastozystenrate und ohne Schwangerschaft (iv) keine Hinweise auf subklinische Genitalinfektionen oder Leukozytospermie aufwiesen und (v) ein abnormales Spermien-mRNA-P1/P2-Verhältnis aufwiesen. Eine umfassende Beurteilung der Spermienqualität (einschließlich mRNA P1/P2-Verhältnis) wird in unserem Zentrum durchgeführt, wenn eine schlechte oder keine Blastozystenrate beobachtet wird und keine Schwangerschaft erreicht wird. Die Studie wurde vom IVF-Spain Institutional Review Board genehmigt. Von allen Patienten wurde eine unterschriebene Einwilligungserklärung für die Verwendung von Gameten in der Forschung eingeholt.

Alle Paare wurden zwei aufeinanderfolgenden ICSI-Zyklen unterzogen, wobei im ersten ejakulierte Spermatozoen (EJACULATE-Zyklusgruppe) und im zweiten testikuläre Spermatozoen (TESA-Zyklusgruppe) verwendet wurden. Die Entwicklung vor der Implantation und die klinischen Ergebnisse beider Zyklustypen wurden verglichen.

Samenprobenentnahme und Vorbereitung

Ejakulate wurden durch Masturbation vor Ort nach 1𔃀 Tagen sexueller Abstinenz erhalten. Nach der Verflüssigung wurden die Proben verarbeitet und auf Samenvolumen, Spermienzahl, Beweglichkeit, Vitalität, Morphologie und Leukozyten gemäß den aktuellen Laborrichtlinien der Weltgesundheitsorganisation (WHO) untersucht. [26] Das Spermien-mRNA-P1/P2-Verhältnis wurde in allen Fällen analysiert. Dazu wurden 1 ml Aliquots von ejakulierten Spermienproben in RNAlater™-Lösung (Ambion, Heppenheim, Deutschland) konserviert und bis zur Weiterverarbeitung in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Analyse des Protamin-mRNA-Verhältnisses

Das Protamin-mRNA-Verhältnis wurde durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) nach dem zuvor von Rogenhofer beschriebenen Protokoll bewertet et al. [3] Kurz gesagt wurde die RNA-Extraktion mit dem Rneasy Mini Kit und dem Rneasy Plus Micro Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt, die cDNA-Synthese wurde mit Omniscript™ gemäß dem Protokoll des Herstellers (Qiagen) und Protamin 1 und 2 . durchgeführt Die Genexpressionsanalyse wurde durch Echtzeit-RT-qPCR unter Verwendung von iQ™ SYBR Green SuperMix und iCycler (BioRad, München, Deutschland) durchgeführt.

Entnahme von Hodenspermien: TESA

Die Entnahme erfolgte durch standardmäßige testikuläre Spermienabsaugung (TESA) unter örtlicher Betäubung. Das extrahierte Hodengewebe wurde in eine Petrischale gespült, die Kulturmedium (MHM® mit Gentamicin, Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) enthielt. Anschließend wurden die Samenkanälchen mechanisch mit feinen Nadeln, die an Spritzen befestigt waren, zerkleinert, um den Abbau der Samenleiter, den Verlust des Zellinhalts und die Spermienextraktion sicherzustellen. Das Vorhandensein von begeißelten Spermatozoen wurde als erfolgreiche Entnahme für Spermieninjektionen definiert.

Verfahren der assistierten Reproduktionstechnik

Die kontrollierte Stimulation der Eierstöcke der Spender wurde mit einem Antagonistenprotokoll durchgeführt. Die Stimulation der Eierstöcke wurde mit 150� U Tag𕒵 rekombinantem follikelstimulierendem Hormon (rec-FSH Puregon® Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA/Elonva® Merck and Co., Inc. ) oder u-FSH (Fostipur IBSA, Lodi, Italien) 5 Tage nach Absetzen der Antibabypille und ein Antagonist des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) (Ganirelix Orgalutran® Merck and Co., Inc.) zur Hypophysensuppression wurde gemäß a . eingeführt Mehrfachdosis-Protokoll (0,25 mg Tag 𕒵 ), wenn der führende Follikel von 15 mm oder Östradiolkonzentrationen von 800 pg ml 𕒵 erreicht wurden. Die täglichen Dosierungen wurden entsprechend den individuellen ovariellen Reaktionen angepasst, wie durch vaginale Ultraschalluntersuchungen und Serumkonzentrationen von Östradiol und Progesteron ab dem dritten/fünften Tag der Stimulation überwacht. Die Triggerung erfolgte mit 0,4 mg Leuprolidacetat subkutan (Procrin ® Abbot Laboratories, Madrid, Spanien), wenn mindestens 1 Follikel ᡌ mm vorhanden war. Die Eizellen wurden durch transvaginale ultraschallgesteuerte Aspiration 36 h nach Leuprolidacetat gewonnen.

Alle reifen Eizellen (Metaphase II) wurden 4 h nach der Eizellenentnahme mittels ICSI besamt. Die Befruchtung wurde 16󈝾 h nach der Befruchtung beurteilt und als normal angesehen, wenn zwei deutlich unterschiedliche Vorkerne mit Nukleolen vorhanden waren. Embryonen wurden routinemäßig bis zum Blastozystenstadium kultiviert. In allen Fällen wurden Transfers der besten morphologisch verfügbaren Blastozysten durchgeführt. Die Embryoselektion für den Transfer basierte nach Gardner und Schoolcraft auf der Blastozystenreife, dem Trophektoderm und der Differenzierung der inneren Zellmasse (ICM). [27] Der Embryotransfer wurde durch transvaginalen Ultraschall gesteuert.

Ergebnisse der Präimplantationsentwicklung

In Bezug auf die Entwicklung von Embryonen vor der Implantation waren die wichtigsten Ergebnisparameter: (i) Befruchtungsrate (FERT), definiert als Prozentsatz der befruchteten Eizellen der mikroinjizierten Eizellen (ii) Blastozystenbildungsrate (BT), definiert als Prozentsatz der Embryonen, die die Blastozystenstadium und (iii) Blastozystenrate guter Qualität (GQBT), definiert als Prozentsatz der Blastozysten, die nach Gardner-Kriterien als AB-Qualität klassifiziert wurden, an der Gesamtzahl der Blastozysten (27).

Klinische Ergebnisse

Die folgenden klinischen Ergebnisparameter pro Zyklus wurden in beiden Gruppen (EJACULATE-Zyklus- und TESA-Zyklus-Gruppen) untersucht: (i) Beta-Human-Choriongonadotropin (β-hCG) – positive Schwangerschaftsrate (βR), bestimmt durch ein β-hCG-positives Ergebnis (ii) klinische Schwangerschaftsrate (CLI), bestimmt durch die Visualisierung eines Gestationssacks mit einem Embryo, der in der 5. Woche Herzaktivität im Ultraschall zeigt, und (iii) Lebendgeburtenrate (LB), bestimmt durch die Lebendgeburt eines gesunden Babys.

Statistische Analysen

Die Daten wurden unter Verwendung der Software IBM SPSS Statistics Version 20 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) analysiert. Vergleiche von Befruchtung, Blastozystenbildung und qualitativ hochwertigen Blastozystenraten zwischen EJACULATE-Zyklus- und TESA-Zyklus-Gruppen wurden mit gepaarten Studenten durchgeführt T-Test oder Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test je nach Bedarf P ɘ.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

In diese Studie wurden insgesamt 23 Patientinnen aus unserem Eizellspendeprogramm eingeschlossen, bei denen in unserem Zentrum mindestens ein Zyklusversagen aufgetreten war (mit schlechter oder null Blastozystenrate und keiner Schwangerschaft). Das Alter (Mittelwert ± Standardabweichung [s.d.]) der männlichen und weiblichen Partner betrug 46,9 ± 6,6 Jahre bzw. 43,6 ± 4,3 Jahre.

Alle Patienten durchliefen einen ersten Zyklus, bei dem ejakulierte Spermatozoen zur Befruchtung verwendet wurden. Alle ersten Zyklen führten zu einem negativen Ergebnis, entweder ohne Transfer oder Implantationsfehler. Dann wurde in allen 23 Fällen ein zweiter Zyklus mit Hodenspermien durchgeführt, die durch TESA gewonnen wurden.

Das Vorhandensein dieser Veränderungen des mRNA-P1/P2-Verhältnisses zusammen mit dem Versagen im ersten Zyklus mit ejakulierten Spermatozoen leitete die Betrachtung der Leistung von TESA. TESA wurde bei allen 23 in die Studie eingeschlossenen Patienten durchgeführt. Die Erfolgsrate der Spermiengewinnung nach dem Eingriff lag bei 100 %.

Die Verwendung von Hodenspermatozoen war auch mit einer signifikant höheren Blastozystenbildungsrate verbunden (gepaarte Student's T-Prüfung, P < 0,001).Interessanterweise war nicht nur die Häufigkeit von Blastozysten, die als Ergebnis der Befruchtung von Eizellen mit Hodensperma produziert wurden, signifikant höher, sondern auch die morphologische Qualität der produzierten Blastozysten war signifikant besser, mit mehr als 2-fach guten Blastozysten in der TESA-Zyklus-Gruppe im Vergleich zur EJACULATE-Zyklus-Gruppe (Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test, P = 0,018 [Abbildung 1].

Beim Vergleich des Einflusses der Verwendung von ejakulierten und testikulären Spermatozoen auf die klinischen Ergebnisse der ART wurde eine höhere β-hCG-positive Schwangerschaftsrate in den TESA-Zyklen im Vergleich zu den EJACULATE-Zyklen beobachtet (87,0% .). vs 43,5%). Eine signifikant höhere klinische Schwangerschafts- und Lebendgeburtenrate wurde auch in der TESA-Zyklus-Gruppe (60.9% .) bestätigt vs 0% und 56.5% vs 0%).

In dieser Studie liefern wir den ersten Beweis für den erfolgreichen Einsatz testikulärer Spermatozoen bei ICSI bei Patienten mit einem abnormalen Spermien-mRNA-P1/P2-Verhältnis. Wir zeigten eine signifikante Erhöhung der ICSI-Ergebnisse mit Hodenspermatozoen in Bezug auf Befruchtung und qualitativ gute Blastozystenbildung sowie eine Verbesserung der Schwangerschafts- und Lebendgeburtenrate. Unsere Ergebnisse stimmen mit Daten aus einer Reihe früherer Originalstudien überein, die die Wirksamkeit von ICSI mit Hoden im Vergleich zu ejakulierten Spermatozoen bei Männern mit unterschiedlichen Ursachen für Unfruchtbarkeit berichtet haben. Kahraman et al. [28] untersuchten die Wirksamkeit von ICSI mit testikulären und ejakulierten Spermatozoen bei 24 Paaren mit unbeweglichen Spermatozoen. In ihren Ergebnissen berichteten sie über ähnliche Befruchtungsraten zwischen Spermienquellen (53,5 % vs 54,5%), aber eine Zunahme der klinischen Schwangerschaft (57,1% vs 20%) und laufende Schwangerschaftsraten (6 laufend .) vs 0 laufende Schwangerschaft) in der Gruppe der testikulären Spermatozoen. Außerdem, Ben-Ami et al. [29] und Weissman et al. [30] in ihren kleinen Studien mit Patienten mit Kryptozoospermie (n = 17) und schwere Oligoteratoasthenozoospermie (n = 4) deren Partner nach wiederholten ICSI-Zyklen mit ejakulierten Spermatozoen nicht schwanger wurden, zeigten, dass die Verwendung von Hodenspermien mit höheren Geburtenraten verbunden war als diejenigen mit ejakulierten Spermatozoen. In einer anderen Studie hat Greco et al. [22] analysierten die Wirkung der Verwendung von Hodenspermien bei 18 Paaren, deren männliche Partner 󖾃% ejakulierte Spermien mit DNA-Schädigung hatten und die mindestens zwei erfolglose ICSI-Versuche mit ejakulierten Spermatozoen unterzogen hatten. Obwohl sie ähnliche Befruchtungsraten fanden (74.9% vs 70,8%) und Embryomorphologie-Score (51,1% vs 47,6%) für die Behandlungsversuche mit Hoden- bzw. ejakulierten Spermatozoen zeigten ihre Ergebnisse signifikant höhere Implantationsraten (20,7% vs 1.8%) bei ICSI mit testikulären Spermatozoen. Schließlich Daten von Esteves et al. [25] weisen darauf hin, dass die Verwendung von Hodenspermien mit verbesserten ICSI-Ergebnissen bei Männern mit Oligozoospermie und anhaltend hohen DNA-Fragmentierungsgraden der Spermien verbunden ist. Auch beim Vergleich der möglichen negativen Auswirkungen auf die Gesundheit der Nachkommen in Abhängigkeit von der Herkunft der Spermien (Hoden .) wurde kein erhöhtes Risiko für angeborene Fehlbildungen bei der Geburt festgestellt vs ejakulierte Spermien). [20],[21]

Obwohl die Ätiologie der rezidivierenden Entwicklung von Embryonen von schlechter Qualität oder unerklärlicher wiederholter Versagen der assistierten Reproduktion bei ICSI noch unklar ist, ist die Möglichkeit der Existenz eines väterlichen Faktors wie erhöhte DNA-Schäden, Defekte in der Chromatinverpackung oder beides sollte in Betracht gezogen werden. Mehrere Ursachen für die DNA-Fragmentierung wurden vorgeschlagen: (i) oxidativer Stress, (ii) defekte Apoptose und (iii) abnormale Chromatinverpackung. [31] Dieser dritte Ursprung für das Vorliegen von DNA-Schäden kann sowohl zu DNA-Fragmentierung als auch zu abnormalem Protamingehalt führen. Während des Ersatzes von Histonen durch Protamine ist eine endogene Nukleaseaktivität erforderlich, um Kerben zu erzeugen, um Torsionsspannungen abzubauen, um die Chromatinanordnung zu erleichtern. [32],[33] Eine veränderte Kontrolle dieses Prozesses könnte zu Anomalien der Chromatinverpackung und unreparierten DNA-Nicks führen. [31] Darüber hinaus kann ein Protaminmangel die DNA-Anfälligkeit für externen Stress erhöhen, was zu einem höheren Risiko für DNA-Schäden der Spermien führt. [16],[34],[35],[36],[37]

Die Chromatinstabilität der Spermien hängt von der Menge der Disulfidbrücken ab, die während der Spermienreifung während des Nebenhodentransits erworben werden. [35],[37],[38],[39] Spermatozoen mit unvollständiger Chromatinkondensation sind anfällig für erhöhte DNA-Schäden, da sie anfälliger für posttestikuläre Angriffe sind. [31] Dies ist höchstwahrscheinlich der zugrunde liegende Grund dafür, dass bei einigen Personen postuliert wurde, dass die DNA-Fragmentierung in Hodenspermatozoen niedriger sein kann als in ejakulierten Spermatozoen. [19],[24],[25] Das Vorhandensein von DNA-Strangbrüchen, die aus der langen Reise der Spermien von der Produktion bis zur Ejakulation resultieren, kann verhindert werden, indem sie vor ihrem Eintritt in den Nebenhoden entfernt werden. [31] TESA oder testikuläre Spermienextraktion (TESE) würde daher die Selektion weniger geschädigter Spermien ermöglichen. [30] Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass diese Gameten das Potenzial haben, sich zu gesunden Erwachsenen zu entwickeln. Ogur et al. [40] injizierten runde Spermatiden, den ersten haploiden Zelltyp, der aus der Meiose resultierte, in Maus-Oozyten und berichteten, dass sich die Jungtiere normal entwickelten.

Andererseits wurde beschrieben, dass Spermienchromatinverpackungen über den DNA-Schutz hinaus weitere Funktionen erfüllen, wie beispielsweise die Regulation der Genexpression. [10] Im Chromatin menschlicher Spermien bleibt nur ein kleiner Teil der väterlichen DNA an Histone gebunden. [41] Die überwiegende Mehrheit der Spermien-DNA wird durch Protamine zu Toroiden gewickelt. [42] Von diesen drei Strukturtypen werden histongebundene DNA und Matrix-Attachment-Regionen (MARS) vom Embryo vererbt und sind höchstwahrscheinlich für die richtige Entwicklung erforderlich. Die histongebundenen Regionen, die sich hauptsächlich an Genpromotoren in für die Embryonalentwicklung wichtigen Genfamilien befinden, werden nach der Befruchtung zuerst exprimiert. [37],[43],[44] Dann, 2𔃂 h nach der Befruchtung, werden Protamine vollständig durch Histone ersetzt, so dass das väterliche Chromatin das gleiche zugängliche Chromatin wie alle anderen somatischen Zellen hat. [45]

Andere Schichten epigenetischer Informationen bestehen aus der Methylierung von DNA-Regionen. Bei männlichen Gameten treten die meisten während der Spermiogenese beobachteten DNA-Methylierungsmodifikationen hauptsächlich in Spermatogonien und Spermatozyten in der frühen meiotischen Phase auf. [46] DNA-Methylierungsmodifikationen sind fast ausschließlich am Ende der pachytänen Spermatozytenstadien abgeschlossen. Dies kann auch die Ursache dafür sein, dass Hodenspermatozoen erfolgreich gesunde Nachkommen hervorgebracht haben.

Das veränderte Spermien-mRNA-P1/P2-Verhältnis, das in der in dieser Studie ausgewählten Patientengruppe beobachtet wurde, kann eine abnormale Chromatinverpackung der Spermien widerspiegeln. Wie in unserer Studie berichteten Simon und Kollegen, dass ein abweichendes P1/P2-Verhältnis mit einer niedrigen Befruchtungsrate und einer schlechten Embryoqualität verbunden war. [47] Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtete, dass eine schlechte Spermienprotamination mit der Entwicklung von Embryonen von geringer Qualität nach in vitro Düngung. [48] ​​Die korrekte Chromatinstruktur, basierend auf einer angemessenen Histonretention und einem präzisen Protamineinbau, dient als Schutzschicht und auch als regulatorisches Zeichen, das zur Spermienfunktion und Embryoentwicklung beiträgt. Eine veränderte Organisation der Protamin-gebundenen Spermien-Chromatindomäne kann kompromittierenin vitro Ergebnisse der Befruchtungsbehandlung, was zu einer veränderten Expression von Genen führt, die in den frühen Phasen der Entwicklung erforderlich sind. Das Fehlen von Protamin-“marks” im Chromatin, das durch die Verwendung testikulärer Spermatozoen erreicht wird, kann diesen Zellen helfen, die erste Phase der Entwicklung zu überspringen, in der eine korrekte Protaminlokalisierung unerlässlich ist, und liefert bessere Ergebnisse, wenn dieses veränderte Protaminationsmuster fehlt. Daher können nicht nur unfruchtbare Patienten mit hohen Mengen an DNA-geschädigten Spermatozoen, sondern auch Patienten mit verändertem Protamin-Expressionsverhältnis von der Verwendung von Hodenspermien in ihren ART-Behandlungen profitieren.

Trotz der rasanten Entwicklung molekularbiologischer Techniken beschränkt sich die Beurteilung der Samenqualität in den meisten IVF-Zentren weltweit noch immer auf die Analyse von Standardparametern wie Spermienkonzentration, Motilität und Morphologie. [7] Wenn jedoch nur diese Routineparameter bewertet werden, ist es nicht möglich, Veränderungen in der Chromatinorganisation der Spermien zu erkennen, wie z. [49],[50]

Zusammenfassend sind die hier beschriebenen Ergebnisse sehr ermutigend und legen nahe, dass die Verwendung von Hodenspermien von Patienten mit früheren Versagen nach ICSI mit ejakulierten Spermatozoen mit abweichendem mRNA-Protamin-Verhältnis die klinischen Ergebnisse signifikant verbessern könnte. Diese Beobachtungen legen nahe, dass aufgrund der kritischen Rolle von Protaminen bei der Reifung und Funktion der Spermien Veränderungen der Protaminexpression eine wesentliche Ursache für ungeklärte männliche Unfruchtbarkeit sein könnten, und aus diesem Grund stellt das Protamin-mRNA-Verhältnis einen hervorragenden Marker dar, um zusätzlich die Spermienqualität zu analysieren zu Standard-Samenparametern. Es werden Grundlagenforschungsstudien benötigt, die darauf abzielen, die Rolle von Protaminen bei der Spermienfunktion und der Embryonalentwicklung zu verstehen. Darüber hinaus sind weitere Nicht-Selektionsstudien wünschenswert, um den klinischen Nutzen dieses Parameters zu bestätigen.

JS und ME waren am Studiendesign und der Datenanalyse beteiligt und verfassten das Manuskript. LG war an der Probenbearbeitung und Manuskripterstellung beteiligt. AL und KS waren an der Probenbearbeitung beteiligt. JA war am Design und der Betreuung der Studie beteiligt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Alle Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

Die Autoren danken allen Patienten für ihr Einverständnis zur Teilnahme an dieser Studie. Darüber hinaus wird die technische Unterstützung von Barbara Fröhlich und Mareike Buch-Heberling dankbar angenommen. KS wurde durch ein Forschungsstipendium des Universitätsklinikums Gießen und Marburg (UKGM, Projekt 29/2015GI) gefördert. Diese Forschung erhielt keine weiteren spezifischen Zuschüsse von Fördereinrichtungen im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.


Zusammenfassung

Genetische Studien haben die kritische Rolle von Piwi-Proteinen bei der Keimbahnentwicklung bei Tieren aufgeklärt, aber ob Piwi ein tatsächliches Krankheitsgen bei der menschlichen Unfruchtbarkeit ist, bleibt unbekannt. Wir berichten über Keimbahnmutationen beim Menschen Piwi (Hiwi) bei Patienten mit Azoospermie, die ihre Ubiquitinierung und ihren Abbau verhindern. Durch die Modellierung solcher Mutationen in Piwi (Miwi) Knockin-Mäuse zeigen wir, dass die genetischen Defekte direkt für die männliche Unfruchtbarkeit verantwortlich sind. Mechanistisch zeigen wir, dass MIWI die Histon-Ubiquitin-Ligase RNF8 in einer Piwi-interagierenden RNA (piRNA)-unabhängige Weise bindet und die MIWI-Stabilisierung RNF8 im Zytoplasma von späten Spermatiden bindet. Die resultierenden abweichenden Spermien zeigen Histonretention, abnormale Morphologie und stark beeinträchtigte Aktivität, die durch Blockieren der RNF8-MIWI-Interaktion in Spermatiden mit einem RNF8-N-Peptid funktionell gerettet werden können. Zusammengenommen identifizieren unsere Ergebnisse Piwi als Faktor der menschlichen Unfruchtbarkeit und enthüllen seine Rolle bei der Regulierung des Histon-zu-Protamin-Austausches während der Spermiogenese.


Diskussion

Das Spermien-Epigenom ist seit kurzem Gegenstand intensiver Untersuchungen in Forschungslabors der Reproduktionsmedizin/Biologie. Obwohl umfangreiche Fortschritte im Verständnis der Spermienchromatinverpackung in Protamintoroiden [17] erzielt wurden, bleiben genomweite Histonretentionen [10,11,19] und DNA-Methylierung [20] epigenetische Faktoren der Unfruchtbarkeit und ihre Wirkung auf die Embryogenese noch aufgeklärt werden. Diese Studie zeigt, dass ein Verlust von Bindungsstellen für H4K12ac in ausgewählten entwicklungsrelevanten Promotoren in den Spermien subfertiler Männer die Idee einer möglichen epigenetischen Aberration aufkommen lässt, die Spermien subfertiler Männer in die Eizelle transportieren. Die Pyrosequenzierungsanalyse ergab eine Hypomethylierung aller mit H4K12ac interagierenden Promotoren. Dieses Methylierungsmuster wurde in der Population der subfertilen Spermien konserviert. Während die Spermien-DNA-Methylierung normozoospermischer Männer eine niedrige Standardabweichung aufwies, wurde bei den Promotoren der subfertilen Männer eine höhere Variabilität des Methylierungsprozentsatzes festgestellt, jedoch wurden 30% der Methylierung nicht überschritten. Im Gegensatz dazu waren Cytosine innerhalb der CpG-Insel des Protamin-Gens hypermethyliert, und es wurden keine Veränderungen zwischen gesunden Spendern und subfertilen Patienten festgestellt. Darüber hinaus wurde die Bedeutung von H4K12ac aus Spermien für die Bildung von Vorkernen und seine Ähnlichkeit mit der DNA-Demethylierung durch Immunfluoreszenz im Mausmodell bestätigt.

Der Verlust der H4K12ac-Anreicherung auf genomweite Weise und an spezifischen Loci kann seinen Ursprung entweder in einem unsachgemäßen Umbau während der Spermatogenese oder einer verminderten Aktivität von Histonacetyltransferasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs) haben.

Interessanterweise wurde eine reduzierte Bindung von H4K12ac an EP300- und LRP5-Promotoren durch Protamine kompensiert. Auf der anderen Seite deuten Spermien-Phänotypen mit über 50% Anilinblau-Färbung darauf hin, dass in subfertilen Spermatozoen eine erhöhte Menge an Gesamthistonen vorhanden ist. Das Prinzip der Anilinblau-Färbung besteht darin, zwischen lysinreichen Histonen und arginin/cysteinreichen Protaminen zu unterscheiden. Anilinblau-Färbung Lysine histonreicher Kerne unreifer Spermatozoen, wo protaminreiche Kerne reifer Spermatozoen mit relativ geringen Lysinkonzentrationen keine Färbung aufweisen [21]. Die reduzierte Bindung von H4K12ac an entwicklungsrelevante Promotoren könnte durch einen möglichen Verlust der Lysin-12-Acetylierung erklärt werden. Die Acetylgruppe wirkt der positiven Ladung der Epsilon-Aminogruppe des Lysins entgegen, verringert die Gesamtladung der Histone und verringert ihre Affinität für die negativ geladene DNA. Dies bewirkt die Öffnung von Chromatin und die Erleichterung der Rekrutierung der Transkriptionsmaschinerie [22]. Da Spermien transkriptionell inaktive Zellen sind, kann die Interaktion mit H4K12ac innerhalb entwicklungsrelevanter Promotoren die Rekrutierung von Faktoren erleichtern, die die Transkription initiieren.

Ob die Acetylierung selbst nur mit einer Genaktivierung verbunden ist, ist noch nicht sicher, da kürzlich gezeigt wurde, dass Protamine auch Acetylgruppen enthalten [23]. Die Daten identifizieren auch posttranslationale Modifikationen, wie S42- und K49-Acetylierung von Protamin-1 und K64-Acetylierung von Protamin-2 [23]. Die Tatsache, dass Protamine Markierungen tragen, die mit der transkriptionellen Aktivierung verbunden sind, ist faszinierend, da diese Proteine ​​vermutlich für eine enge Verpackung der DNA in Samenzellen sorgen und zur transkriptionellen Stummschaltung beitragen [24].

Die klinischen Aspekte von Histonmodifikationen, die mit Promotoren in Spermien unfruchtbarer Männer interagieren, werden in der Literatur noch nicht ausreichend behandelt. Neben unserer Gruppe Hammoud et al. (2011, 2009) [10,25] haben die Unterschiede in den Histon-Modifikationen der Spermien zwischen gesunden Spendern und Männern untersucht, die ein abweichendes Protamin-P1/P2-Verhältnis aufwiesen und eine unerklärliche schlechte Embryogenese während in vitro Befruchtung (IVF) [26]. Bei der Analyse der H3-Lysin-4-Methylierung (H3K4me) oder H3-Lysin27-Methylierung (H3K27me) berichteten die Autoren von einem sehr ähnlichen Lokalisationsmuster in den Gameten von unfruchtbaren Männern im Vergleich zu fruchtbaren Männern. Es gab jedoch eine Verringerung der Menge an H3K4me oder H3K27me, die als Entwicklungstranskriptionsfaktoren und bestimmter geprägter Gene beibehalten wurden, was mit unseren Ergebnissen in Einklang zu stehen scheint. Bei der Analyse der Verteilung von H3K9ac im Spermiengenom mit ChIP in Kombination mit dem ENCODE-Array identifizierten wir Interaktionen mit entwicklungsrelevanten Promotoren (FAM50A, CAV1, HOXA13, TH, MET, SF1, AFF4, HCFC1, INHA, ELL3, WNT2, CTTNBP2, HOXA10, THOC2, AXIN1) und exonische und intergene Sequenzen. In unserer vorherigen Studie wurde die zufällige Verteilung und Verarmung der H3K9ac-Interaktion an vielen Loci (z. B. CTSD, FLNA, MCF2L, PLXNA3, SG3GLB2, TH) von infertilen männlichen Spermien bestätigt [27]. Ergebnisse aus eigenen und anderen Studien von Forschern deuten auf eine abweichende Verteilung von Histonretentionen im Genom subfertiler Männer hin, und dies scheint eine häufige Beobachtung für mehrere Histonmodifikationen zu sein.

Um zu untersuchen, ob eine Erschöpfung der Bindungsstellen für H4K12ac in entwicklungsrelevanten Promotoren zu einer Veränderung der DNA-Methylierung führen könnte, wurde bei 38 subfertilen Männern die Pyrosequenzierung von 9 Kandidaten-Entwicklungs-Loci, denen H4K12ac fehlt oder signifikant reduziert war, und des Protamin-Promotors untersucht. H4K12ac-Promotoren von fruchtbaren und subfertilen Männern korrelierten mit einer DNA-Hypomethylierung, zeigten jedoch ein übereinstimmenderes Methylierungsmuster im Vergleich zu subfertilen Patienten. Der Verlust von Bindungsstellen führt offensichtlich nicht zu einer Zunahme der DNA-Methylierung, oder möglicherweise werden diese Promotoren durch andere Histon-Modifikationen, wie beispielsweise H3K4me, geschützt. Eine höchst faszinierende Beobachtung aus unseren Ergebnissen war, dass die einzelne CpG-Methylierung bei jedem ausgewählten Promotor der fruchtbaren Gruppe stabil war, während die Methylierung bei subfertilen Patienten innerhalb derselben Gruppe beträchtliche Unterschiede aufwies. Methylierungsstudien mit Pyrosequenzierungsmethoden, die sich auf verschiedene Loci MEST und IGF2⁄H19 ICR1 konzentrierten, zeigten den gleichen Effekt in der Gruppe der subfertilen Patienten [28].

Die genomweite Shotgun-Bisulfit-Sequenzierung aus Spermien-DNA liefert den Beweis, dass die Mehrheit der Promotoren in Spermien, ähnlich wie embryonale Stammzellen, der Methylierung entgehen. Im Gegensatz dazu sind Repeat-Elemente sowohl in Keim- als auch in somatischen Zellen stark methyliert, Retrotransposons aus mehreren Unterfamilien umgehen jedoch die Methylierung während der männlichen Keimzellentwicklung effektiver [20]. In Bezug auf männliche Unfruchtbarkeit haben mehrere Forschungsansätze darauf hingewiesen, dass geprägte Regionen anfälliger für eine Deregulierung des methylierten Musters sind als Promotorregionen [25,26,29]. Dennoch wurde gezeigt, dass die spezifischen Promotoren einschließlich CREM eine signifikant höhere Rate von Methylierung bei Patienten mit abnormaler Protaminierung und Oligozoospermie im Vergleich zur Kontrollgruppe [30]. Diese Studie untersuchte eine große Kohorte von 175 oligozoospermischen Männern und zeigte Epimutationen in H19-DMR und PEG1/MEST-DMR bei 20 % bzw. 3 % der oligozoospermischen Männer. Als mögliche Ursache für Epimutationen identifizierten die Autoren eine Aminosäureveränderung bei DNMT3A in einem Fall und veränderte Methylierungsprofile bei DNMT3L bei acht Männern. Interessanterweise wurde keine Korrelation zwischen dem ART-Outcome und Epimutationen gefunden [31].

Schließlich wurde in der vorliegenden Studie die Relevanz der Koexistenz von väterlich abgeleiteten Chromatin-Aktivmarkierungen (H4K12ac) und 5hmC in den frühen Vorkernstadien des Mausembryos gezeigt. Der väterliche Vorkern weist eine hohe H4K12-Acetylierung auf, die die globale Demethylierung stört. Diese Tatsache könnte zu der Idee führen, dass entwicklungsrelevante Promotoren in Spermien, die mit H4K12ac besetzt sind und einen moderaten Methylierungsgrad aufweisen, für die Übertragung bestimmter epigenetischer Merkmale an den Embryo vorbereitet werden können. Jüngste Berichte von Zebrafischembryonen bestärken die Hypothese, dass das DNA-Methylom der Spermien, aber nicht die Eizelle, während der frühen Embryonalbildung vererbt wird [32]. Eine früher vorgeschlagene und allgemein akzeptierte Theorie besagt, dass der väterliche Vorkern durch den aktiven Prozess durch die Umwandlung von 5mC in 5hmC, katalysiert durch Tet3, und der mütterliche Vorkern durch DNA-replikationsabhängige Demethylierung demethyliert wird [33,34]. Nach unseren Ergebnissen ist der väterliche Vorkern weitgehend demethyliert, bevor die erste DNA-Replikation an PN3 einsetzt.Dies geschieht unabhängig, obwohl 5hmC im väterlichen Vorkern während der DNA-Replikation passiv entfernt wird [35]. Tatsächlich besaß der väterliche Vorkern ein höheres Niveau von 5hmC als der mütterliche Vorkern, was in allen PN-Stadien durch eine starke 5mC-Markierung ersichtlich ist. Allerdings stieg der 5hmC-Wert während der Replikationsphase kontinuierlich an. Eine Erklärung für diese zunehmende Intensität könnte sein, dass 5hmC an der passiven Demethylierung beteiligt sein könnte, und es gibt Hinweise darauf, dass Dnmt1 5hmC schlecht erkennt [36].


Ergebnisse

Hodengewebe

Für beide Hoden pro Mann wurde eine Echtzeit-qRT-PCR für P1, P2 und Bcl2 durchgeführt. Da zwischen rechtem und linkem Hoden kein statistisch signifikanter Unterschied zu beobachten war, wurde der Mittelwert zur weiteren Berechnung herangezogen. Der Mittelwert von P1 bei unfruchtbaren Männern (CT = 33,5 ± 0,23) ist niedriger als in der Kontrollgruppe (CT = 30,5 ± 0,90), während der Mittelwert von P2 bei unfruchtbaren Männern fast identisch ist (CT = 35,6 ± 0,16) und in der Kontrollgruppe (CT = 35,7 ± 0,36). Das Verhältnis P1–P2 beträgt 1:3,2 in der Kontrollgruppe und 1:4 bei unfruchtbaren Patienten. Der Unterschied der Verhältnisse zwischen Kontrollen und unfruchtbaren Männern ist statistisch signifikant (P = 0,0038) (Abb. 1a) und für P2 größer als für P1. Darüber hinaus weisen unfruchtbare Männer im Vergleich zu Kontrollen mehr als die 10-fache Menge an Bcl2-mRNA auf (P = 0,0155) (Abb. 1b). Darüber hinaus zeigt der Bcl2-Gehalt eine positive lineare Korrelation (P = 0,0250) mit dem Verhältnis P1–P2 (Abb. 2a).

(ein) Log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) von Kontrollen und Patienten in Hodenbiopsien (P = 0.0038). (B) Log-Konzentration von Bcl2 normalisiert auf Protamin-2 (ΔCT(P2–Bcl2)) von Kontrollen und Patienten in Hodenbiopsien (P = 0.0115). (C) Log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) von Kontrollen und Patienten in Ejakulaten (P = 0.0002). (D) Log-Konzentration von Bcl2 normalisiert auf Protamin-2 (ΔCT(P2–Bcl2)) von Kontrollen und Patienten in Ejakulaten (P = 7,0 × 10 –6 ). Walisisch zwei Probe T-Prüfung. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ΔCT, Unterschied zwischen CT Werte

(ein) Log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) von Kontrollen und Patienten in Hodenbiopsien (P = 0.0038). (B) Log-Konzentration von Bcl2 normalisiert auf Protamin-2 (ΔCT(P2–Bcl2)) von Kontrollen und Patienten in Hodenbiopsien (P = 0.0115). (C) Log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) von Kontrollen und Patienten in Ejakulaten (P = 0.0002). (D) Log-Konzentration von Bcl2 normalisiert auf Protamin-2 (ΔCT(P2–Bcl2)) von Kontrollen und Patienten in Ejakulaten (P = 7,0 × 10 –6 ). Walisisch zwei Probe T-Prüfung. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ΔCT, Unterschied zwischen CT Werte

(ein) Korrelation zwischen dem log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) und normalisierte Bcl2-Log-Konzentration (ΔCT(P2–Bcl2)) bei Hodenbiopsien (R 2 = 0.3320, P = 0.0250). (B) Korrelation zwischen dem log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) und normalisierte Bcl2-Log-Konzentration (ΔCT(P2–Bcl2)) in Ejakulaten (R 2 = 0.4636, P = 0,0003). Korrelationstest nach Pearson. Kreise stellen Kontrollen dar, Dreiecke Patienten

(ein) Korrelation zwischen dem log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) und normalisierte Bcl2-Log-Konzentration (ΔCT(P2–Bcl2)) bei Hodenbiopsien (R 2 = 0.3320, P = 0.0250). (B) Korrelation zwischen dem log-Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 (ΔCT(P2–P1)) und normalisierte Bcl2-Log-Konzentration (ΔCT(P2–Bcl2)) in Ejakulaten (R 2 = 0.4636, P = 0,0003). Korrelationstest nach Pearson. Kreise stellen Kontrollen dar, Dreiecke Patienten

TESE (n = 74) in Kombination mit ICSI (max. drei Zyklen) ergaben neun Schwangerschaften (12,1 %), die Befruchtungsrate betrug 28,6 ± 2,48 %. Weder die Befruchtungsrate noch die Schwangerschaftsrate zeigten eine signifikante Korrelation mit den P1-P2-Verhältnissen. Zudem konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Schwangerschaftsrate und der Qualität von Eizellen und Embryonen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst.

Ejakuliert

Das Verhältnis P1–P2 beträgt in der Kontrollgruppe ∼ 1:1 und bei unfruchtbaren Männern 1:1,7. Der Unterschied ist statistisch signifikant (P = 0,0002) (Abb. 1c). Es konnte keine Korrelation zwischen der absoluten Spermiendichte und dem P1-P2-Verhältnis bzw. der Menge an Bcl2-mRNA gefunden werden. Allerdings ist die Bcl2-Menge bei unfruchtbaren Männern mehr als das 10-fache der Bcl2-Menge in der Kontrollgruppe (P = 7,0 × 10 –6 ) (Abb. 1d). Darüber hinaus zeigte der Bcl2-Gehalt eine positive lineare Korrelation (P = 0,0003) mit dem Verhältnis P1–P2 (Abb. 2b).

ICSI (1 Zyklus) mit Ejakulaten (n = 95) führte zu 32 Schwangerschaften (32,5 %), die Befruchtungsrate betrug 73,6 ± 2,18 %. Ähnlich wie bei TESE zeigten weder die Befruchtungsrate noch die Schwangerschaftsrate einen signifikanten Zusammenhang mit dem P1–P2-Verhältnis. Zudem konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Schwangerschaftsrate und der Qualität von Eizellen und Embryonen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst.


Histonmodifikationssignaturen in menschlichen Spermien unterscheiden klinische Anomalien

Veränderungen des väterlichen Epigenoms, insbesondere der Bestandteile des Spermienchromatins, können beim Menschen zu Unfruchtbarkeit führen und möglicherweise abweichende Informationen an den Embryo übertragen. Eine Schlüsselkomponente des Spermienchromatins ist die posttranslationale Modifikation von Histonen (PTMs). Wir haben zuvor ein umfassendes Profil von Histon-PTMs in normozoospermischen Spermien identifiziert, jedoch wurden durch Antikörper-basierte Ansätze nur spezifische Histon-PTMs in abnormalen Spermien identifiziert, und umfassende Veränderungen der Histon-PTM-Profile bleiben unbekannt. Hier untersuchen wir, ob Spermien mit Anomalien der Gesamtmotilität, progressiven Motilität und Morphologie im Vergleich zu normozoospermischen Spermienproben veränderte Histon-PTM-Profile aufweisen.

Methoden

Verworfene Samenproben von 31 Männern mit normalen oder abnormalen Samenparametern wurden auf die relative Häufigkeit von PTMs auf Histon H3 und H4 durch „Bottom-up“-Nano-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert.

Ergebnisse

Asthenoteratozoospermische Proben (abnormale Motilität, Vorwärtsprogression und Morphologie, n = 6) zeigt insgesamt eine verminderte H4-Acetylierung an (P = 0,001) sowie Änderungen in H4K20 (P = 0,003) und H3K9-Methylierung (P < 0,04) im Vergleich zu normozoospermischen Proben (n = 8). Asthenozoospermische Proben (abnorme Motilität und Progression, n = 5) zeigte auch eine verminderte H4-Acetylierung (P = 0,04) und verändertes H4K20 (P = 0,005) und H3K9-Methylierung (P < 0,04). Proben mit isolierter abnormaler Progression (n = 6) zeigte hauptsächlich eine verminderte Acetylierung an H4 (P < 0,02) und teratozoospermische Proben (n = 6) erschien den normozoospermischen Proben ähnlich (n = 8).

Abschluss

Spermaproben mit kombinierten und isolierten Anomalien der Gesamtmotilität, progressiven Motilität und Morphologie zeigen im Vergleich zu normozoospermischen Spermien deutliche und veränderte Histon-PTM-Signaturen. Dies liefert den Beweis, dass Veränderungen der Histon-PTMs für die normale Spermienfunktion und Fruchtbarkeit wichtig sein können.


Abstrakt

Die epigenetische Vererbung und ihre zugrunde liegenden molekularen Mechanismen gehören zu den faszinierendsten Bereichen der aktuellen biologischen und medizinischen Forschung. Bis heute haben Studien gezeigt, dass sowohl die weibliche als auch die männliche Keimbahnentwicklung unterschiedlichen Wegen epigenetischer Ereignisse folgt und sowohl Eizellen als auch Spermien ihre eigenen einzigartigen Epigenome besitzen. Befruchtende männliche und weibliche Keimzellen liefern nicht nur ihre haploiden Genome, sondern auch ihre Epigenome, die den Code für die Präimplantations- und Postimplantationsreprogrammierung und die Embryonalentwicklung enthalten. Bei Spermatozoen beispielsweise bilden das DNA-Methylierungsprofil, DNA-assoziierte Proteine, das Verhältnis von Protamin zu Protamin 2, das Verteilungsmuster der Nukleosomen, Histonmodifikationen und andere Eigenschaften eine einzigartige epigenetische Landschaft. Epigenetische Faktoren und Mechanismen besitzen jedoch eine gewisse Plastizität und werden von Umweltbedingungen beeinflusst. Der Lebensstil von Vätern und Müttern, einschließlich körperlicher Aktivität, Ernährung und Exposition gegenüber gefährlichen Stoffen, kann das Epigenom verändern und darüber hinaus die Gesundheit der Kinder beeinträchtigen. In der männlichen reproduktiven Gesundheit tauchen Daten zu epigenetisch vermittelten Auswirkungen der männlichen Ernährung auf die Spermienqualität auf, beispielsweise durch sekundäre Pflanzenstoffe, Mineralien und Vitamine, und es wird bereits eine Ernährungsunterstützung für subfertile Männer genutzt. Darüber hinaus weisen Studien in Tiermodellen und humanepidemiologische Daten auf einen transgenerationalen Effekt des väterlicherseits beigesteuerten Spermienepigenoms auf die Gesundheit der Nachkommen hin.


Charakteristische Strukturmerkmale

Die meisten der für Protamine und DNA-Protamin-Komplexe erhaltenen Strukturinformationen wurden von den Protaminen P1 und P2 von Plazenta-Säugetieren sowie von den Fischprotaminen Salmin und Clupin abgeleitet.

Protamin P1 und P1-ähnliche Fischprotamine

Die P1-Protamine von Plazenta-Säugetieren sind typischerweise 49 oder 50 Aminosäuren lang und enthalten drei Domänen: eine zentrale Arginin-reiche DNA-Bindungsdomäne, flankiert auf beiden Seiten von kurzen Peptidsegmenten mit Cysteinresten. Die Protamine von Monotremen und den meisten Beuteltieren haben ähnliche Sequenzen wie die der Plazenta-Säugetiere, außer dass ihnen Cysteinreste fehlen. Eine Gattung von Spitzmaus-ähnlichen Dasyuridenbeuteltieren, die Planigales, ist eine interessante Ausnahme von dieser Verallgemeinerung, da sie seit ihrer Divergenz von den anderen Dasyuriden fünf oder sechs Cysteinreste in ihren P1-Protaminen gewonnen haben [29]. Bei den meisten Arten besteht die zentrale DNA-Bindungsdomäne typischerweise aus einer Reihe von Ankersequenzen, die 3-11 aufeinanderfolgende Argininreste enthalten, die das Protein an DNA binden. Diese Domäne ähnelt in Größe und Zusammensetzung der gesamten Sequenz vieler Fischprotamine [30–33]. Sequenzvergleiche der Fisch-Protamine mit Säuger-P1-Protaminen zeigen, dass die argininreichen Regionen, die die Ankerdomänen enthalten, konserviert sind (etwa 60-80% Sequenzidentität), aber der Rest der Proteinsequenz weist beträchtliche Variationen auf.

Strukturstudien der Protamine und ihrer Komplexe mit DNA wurden hauptsächlich auf Bull P1 und Salmine beschränkt. Raman-Spektroskopie hat gezeigt, dass das freie Protamin in Lösung unstrukturiert ist [34]. Nach der Bindung an DNA umschlingt P1 die DNA-Helix in der großen Furche (Abbildung 2a) [35], wobei pro Windung der DNA-Helix ein Protaminmolekül gebunden wird [36]. Obwohl noch nicht alle strukturellen Details des DNA-Protamin-Komplexes aufgeklärt wurden (eine kristallographische oder kernmagnetische Resonanzstruktur eines DNA-Protamin-Komplexes wurde noch nicht erhalten), sind die vorherrschenden Wechselwirkungen, die zu der bemerkenswerten Stabilität des Komplexes beitragen, die Kombination von Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatischen Bindungen, die sich zwischen den Guanidiniumgruppen jedes Argininrests in den Verankerungsdomänen des Protamins und den Phosphatgruppen in beiden DNA-Strängen bilden.

Protaminmoleküle binden in der großen Furche der DNA, neutralisieren das Phosphodiester-Rückgrat der DNA und bewirken, dass sich die DNA-Moleküle zu toroidalen Strukturen zusammenrollen. (ein) Modell, das zeigt, wie sich zwei benachbarte Lachs-Protaminmoleküle (blaue Atome) um die DNA-Helix (weiße Atome) wickeln und innerhalb der großen Furche der DNA binden. (B) Scanning-Sonden-Bilder von toroidalen DNA-Protamin-Komplexen, die in vitro auf einer Graphitoberfläche durch Zugabe von Protamin zu lose an der Oberfläche befestigter DNA hergestellt wurden. Die gebildeten Toroide in vitro sind in Größe und Form denen ähnlich, die aus menschlichem Spermienchromatin isoliert wurden (c). (C) Rastersondenmikroskopische Aufnahmen von nativen DNA-Protamin-Toroiden, die aus menschlichem Spermienchromatin gewonnen wurden. Diese Toroide, die die grundlegende Untereinheitsstruktur der protamingebundenen DNA umfassen, enthalten ungefähr 50.000 bp DNA, die in jede donutförmige Struktur aufgewickelt ist.

Im Gegensatz zum Coiling von DNA durch Histone zu Nukleosomen und den höheren Anordnungen von Nukleosomen im somatischen Chromatin induziert die Bindung von Salmin oder Protamin P1 das Coiling und die Kondensation von DNA zu viel größeren toroidalen Chromatin-Untereinheiten [35, 37] . Diese toroidalen Untereinheiten (Abbildung 2b,c), die in nativem Spermienchromatin beobachtet wurden [35] und auch induziert wurden in vitro durch Protaminbindung an DNA [38], haben einen Durchmesser von etwa 50-70 nm, sind 25 nm dick und enthalten schätzungsweise etwa 50.000 bp dicht gepackte, gewundene DNA [39].

Protamin P2

Während Protamin P1 und P2 von einem gemeinsamen Vorläufer der Vorfahren abgeleitet zu sein scheinen, weist P2 mehrere Merkmale auf, die es von P1 unterscheiden. Auf Sequenzebene zeigen P2-Protamine von verschiedenen Spezies die gleiche Variation wie bei P1-Protaminen beobachtet (über 60% Sequenzidentität zwischen P2-Molekülen 50-70% Sequenzidentität zwischen P2- und P1-Molekülen). Allerdings ist das Gen PRM2 kodiert für ein Vorläuferprotein, von dem gezeigt wurde, dass es an DNA bindet und dann proteolytisch verarbeitet wird. Das für Maus-P2 im Detail untersuchte Prozessierungsereignis tritt bei Spermatiden im Spätstadium über einen Zeitraum von mehreren Tagen auf und führt zur Produktion von sechs teilprozessierten Formen der Vorstufe [40, 41]. Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, wurden ungefähr 40% des Aminoterminus des Moleküls entfernt. Die vollständig prozessierte Form des P2-Vorläufers, Protamin P2, ist etwas größer als P1 (63 Aminosäuren in der Maus) und ist die vorherrschende Form von P2 im reifen Spermienkopf.

Anders als bei Nagetieren und den meisten anderen Säugetierarten sind in den Spermien von Menschen, Affen und Affen der Alten Welt zwei unterschiedlich prozessierte Formen von Protamin P2 - P2 und P3 - an DNA gebunden [12, 42]. Bei Neuweltaffen wird nur eine verarbeitete Form beobachtet. Die beiden Formen des P2-Proteins unterscheiden sich nur durch ihre drei aminoterminalen Aminosäuren – P3 ist drei Aminosäuren kürzer (mit 54 Aminosäureresten) als P2 (57 Aminosäuren) – und sie scheinen Produkte derselben zu sein PRM2 Gen. Eine dritte Protamin-P2-Sequenzvariante wurde auch in menschlichen Spermien [42] und Makaken [12] nachgewiesen.

Protamin P2 unterscheidet sich auch von P1 dadurch, dass P2 Zink bindet. Physikalische Messungen an intakten Spermien verschiedener Spezies zeigen, dass die P2-Protamine von Mensch, Maus und Hamster ein Zinkatom pro Molekül koordinieren [43]. Für die Zinkkoordinationsstelle(n) in humanem P2 wurden verschiedene Zinkfingermodelle vorgeschlagen [44, 45]. Jedoch stimmt keines dieser Modelle mit den konservierten Histidin- und Cysteinresten überein, die in den meisten bekannten P2-Protaminen vorhanden sind. Diese Modelle erfordern auch den Großteil der Protamin-P2-Sequenz, um Zink zu umhüllen und zu koordinieren. Es wäre nicht zu erwarten, dass solche Strukturen an die Länge der DNA-Sequenz binden, von der geschätzt wurde, dass sie der P2-Protamin-Fußabdruck ist [36]. Bei den Spermatiden von Hengsten scheint Zink eine wesentliche Rolle bei der Chromatinreifung der Spermien zu spielen [46]. Ein erheblicher Teil des Zinks geht aus Spermienchromatin verloren, wenn die Cysteinthiole in Protamin zu Disulfidbrücken oxidiert werden. Neuere Röntgenabsorptions-Feinstrukturstudien des an Protamin gebundenen Zinks in intakten sich verlängernden Hamsterspermatiden und Nebenhodenspermien (C. Dolan, K. Peariso, M. Corzett, J. Mazrimas, J. Pennerhahn und RB, unveröffentlichte Beobachtungen) legen nahe, dass die Aminosäurereste an der Koordination beteiligt sind nahe dem Carboxy-terminalen Ende von Protamin P2 und die Reste, die an der Koordination beteiligt sind, ändern sich, wenn sich die intra- und interprotaminischen Disulfid-Vernetzungen bilden.


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Schlüsselwörter: männliche Unfruchtbarkeit, Spermien, DNA-Integrität, epigenetische Veränderungen, prognostischer Wert

Zitat: Kumaresan A, Das Gupta M, Datta TK und Morrell JM (2020) Spermien-DNA-Integrität und männliche Fruchtbarkeit bei Nutztieren: Ein Rückblick. Vorderseite. Tierarzt. Wissenschaft 7:321. doi: 10.3389/fvets.2020.00321

Eingegangen: 06. April 2020 Angenommen: 11. Mai 2020
Veröffentlicht: 19. Juni 2020.

Jose Manuel Ortiz-Rodriguez, Universität Extremadura, Spanien
Gemma Gaitskell-Phillips, Universität Extremadura, Spanien
Manuel Hidalgo, Universidad de Córdoba, Spanien

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