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Was ist ApoCas9 im CRISPR-Cas9-System?

Was ist ApoCas9 im CRISPR-Cas9-System?


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Ich lese gerade einen Artikel über einen bestimmten Assay von Cas9-Nukleasen. In einem der Experimente haben sie ApoCas9 (Apo-Varianten anderer CRISPR-Nukleasen) als eine Art Kontrolle verwendet.

Aber den ganzen Artikel haben sie ApoCas9 nicht definiert? Ich habe die Definition und Aktivität von ApoCas9 online überprüft, bin aber ohne fruchtbare Ergebnisse gestoßen.

Eine universelle Methode zum sensitiven und zellfreien Nachweis von CRISPR-assoziierten Nukleasen


Im Allgemeinen wird "Apo" verwendet, um ein Apoenzym anzuzeigen - das ist der Proteinteil eines Enzyms ohne essentielle(n) Cofaktor(en).

Dies ist eigentlich in der definiert Experimental Abschnitt des Papiers:

Cas9/Cpf1 ohne gRNA (ApoCas9/Cpf1)

In diesem Fall ist ApoCas9 also eine Cas9-Endonuklease, die nicht an eine Leit-RNA gebunden ist.


CRISPR-Cas9


Einführung in das CRISPR/Cas9-System

Obwohl kürzlich entwickelte programmierbare Bearbeitungswerkzeuge wie Zinkfinger-Nukleasen und Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen die Fähigkeit zur präzisen Genommodifikation deutlich verbessert haben, haben diese Techniken Grenzen. Die CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-Technologie stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber diesen anderen Genom-Editing-Tools der nächsten Generation dar und erreicht ein neues Niveau von Targeting, Effizienz und Benutzerfreundlichkeit. Das CRISPR/Cas9-System ermöglicht ein ortsspezifisches genomisches Targeting in praktisch jedem Organismus.

Das CRISPR/Cas-System vom Typ II ist ein prokaryontisches adaptives Immunantwortsystem, das nichtkodierende RNAs verwendet, um die Cas9-Nuklease zu leiten, um eine ortsspezifische DNA-Spaltung zu induzieren. Dieser DNA-Schaden wird durch zelluläre DNA-Reparaturmechanismen repariert, entweder über den nicht-homologen endverknüpfenden DNA-Reparaturweg (NHEJ) oder den homologiegerichteten Reparaturweg (HDR).

Das CRISPR/Cas9-System wurde genutzt, um eine einfache, RNA-programmierbare Methode zur Vermittlung der Genom-Editierung in Säugerzellen zu entwickeln und kann verwendet werden, um Gen-Knockouts (über Insertion/Deletion) oder Knockins (über HDR) zu generieren. Um Genunterbrechungen zu erzeugen (Abbildung 1), wird eine einzelne Leit-RNA (sgRNA) erzeugt, um die Cas9-Nuklease an eine bestimmte genomische Stelle zu lenken. Cas9-induzierte Doppelstrangbrüche werden über den NHEJ-DNA-Reparaturweg repariert. Die Reparatur ist fehleranfällig, und daher können Insertionen und Deletionen (INDELs) eingeführt werden, die die Genfunktion stören können.

Das Prinzip der CRISPR/Cas9-vermittelten Genunterbrechung. Eine einzelne Leit-RNA (sgRNA), bestehend aus einer crRNA-Sequenz, die spezifisch für das DNA-Ziel ist, und einer tracrRNA-Sequenz, die mit dem Cas9-Protein interagiert (1), bindet an eine rekombinante Form des Cas9-Proteins mit DNA-Endonuklease-Aktivität (2 ). Der resultierende Komplex verursacht eine zielspezifische Spaltung von doppelsträngiger DNA (3). Die Spaltstelle wird durch den DNA-Reparaturweg der nichthomologen Endverbindung (NHEJ) repariert, ein fehleranfälliger Prozess, der zu Insertionen/Deletionen (INDELs) führen kann, die die Genfunktion stören können (4).

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die Genom-Editierung revolutioniert und ermöglicht ein bisher unerreichtes Maß an genomischem Targeting, Effizienz und Einfachheit. Guide-it-Produkte verbessern die Benutzerfreundlichkeit des CRISPR/Cas9-Systems weiter, indem sie eine optimierte Methode bieten für:


Wem gehört CRISPR im Jahr 2021? Es ist noch komplizierter als Sie denken

Die Frage, wem CRISPR gehört, das genetische Editierwerkzeug, von dem erwartet wird, dass es die moderne Medizin verändern wird, ist ein verwirrendes Durcheinander von Rechtsstreitigkeiten, obskuren Namenskonventionen und subtilen Variationen in molekularer Form und Funktion. Die Unternehmen, die letztendlich die Patentrechte an diesen Tools besitzen, werden mit ziemlicher Sicherheit kontrollieren, wer sie verwenden darf, wie sie verwendet werden und wie viel sie kosten.

Der ursprüngliche CRISPR-Patentstreit zwischen der UC Berkeley und dem MIT-Harvard Broad Institute war nicht schön. Patentstreitigkeiten sind selten, aber die Debatte darüber, wem CRISPR-Cas9 gehört, wurde besonders hitzig. Es ist nicht überraschend. Da CRISPR als die Zukunft der Medizin bezeichnet wird, ist die Fähigkeit, einen Teil des Tools zu besitzen und zu lizenzieren, für eine Reihe von Unternehmen, die auf der ursprünglichen CRISPR-Cas9-Technologie basieren, von entscheidender Bedeutung.

Doch wem CRISPR 2021 gehört, ist deutlich komplizierter als noch vor wenigen Jahren. Da immer mehr Unternehmen, Forscher und akademische Einrichtungen Patentanmeldungen für subtil unterschiedliche CRISPR-Moleküle einreichen, ist es nicht mehr möglich, die geistigen Eigentumsrechte auf nur zwei oder drei Big Player einzugrenzen.

Warum CRISPR wichtig ist

CRISPR ist im Wesentlichen ein bakterieller Abwehrmechanismus. Wenn ein Virus ein Bakterium (bekannt als Bakteriophage) infiziert, können die Bakterien ein CRISPR-assoziiertes Molekül (Cas) verwenden, um die DNA des Bakteriophagen zu schneiden. Die Bakterien fügen dann Teile der Phagen-DNA in ihr eigenes Genom ein, damit sie die Phagen in Zukunft erkennen und zerstören können.

Bakteriophagen bauen ihre DNA (in rot, mittleres Bild) in ein Bakterium ein. CRISPR ist im Wesentlichen ein bakterielles Immunsystem, das Phagen-DNA schneidet und speichert, damit die Bakterien den Phagen in Zukunft erkennen und bekämpfen können. Bildnachweis: Victor Padilla-Sanchez, The Catholic University of America, Quelle: National Institutes of Health on Flickr

Das Schöne an Cas-Proteinen ist, dass sie so programmiert werden können, dass sie spezifische DNA-Sequenzen erkennen und schneiden. Aus diesem Grund wird CRISPR oft als „genetische Schere“ bezeichnet. Indem CRISPR einem Cas-Molekül Anweisungen gibt, wo die DNA mit Hilfe eines Leit-RNA-Moleküls (gRNA) geschnitten werden soll, hat CRISPR die Macht, jedes Gen, auf das es programmiert ist, zu deaktivieren.

Die Auswirkungen des Schneidens von DNA sind enorm. CRISPR-basierte Therapeutika haben sich bereits bei Erkrankungen wie erblicher Kinderblindheit und Sichelzellenanämie als klinisch vielversprechend erwiesen. Die Technologie könnte viele genetische Krankheiten heilen, indem sie ein Gen abschaltet, das ursprünglich nicht eingeschaltet sein sollte. CRISPR kann auch DNA schneiden, den Bruch durch ein neues Segment ersetzen und eine fehlerhafte genetische Mutation korrigieren.

Jeder will einen Bissen vom CRISPR-Kuchen

Das bekannteste CRISPR-Cas-Molekül ist Cas9. Hier beginnt der ursprüngliche Kampf um CRISPR-Patente, und der Streit dauert noch an. Sowohl die UC Berkeley als auch das MIT-Harvard Broad Institute beanspruchten im Jahr 2012 geistige Eigentumsrechte an CRISPR-Cas9. Da das Broad Institute bezahlte, um seine Anmeldung zu beschleunigen, wurden seine Patente zuerst vergeben, obwohl die UC Berkeley zuerst eingereicht wurde. Das US-amerikanische Patent- und Markenamt (USPTO) wechselte jedoch zu einem First-to-File-System, das 2013 in Kraft trat und den Rahmen für den Patentstreit bereitete.

Mehrere Unternehmen, die auf den ursprünglichen CRISPR-Cas9-IP-Rechten gegründet wurden, haben auch Überschneidungen in ihren Patenten. Und einige Patente decken nur das Recht ab, CRISPR-Cas9 für bestimmte Krankheiten oder Anwendungen zu verwenden.

Quellen, die für diesen Artikel kontaktiert wurden, erklärten sich nur unter der Bedingung der Anonymität einverstanden, dass sie nicht direkt zitiert werden. Während die CRISPR-Cas9-Patentstreitigkeiten derzeit keine Schlagzeilen sind, treffen die direkt an der Technologie Beteiligten jedoch alle Vorkehrungen, dass ihre Worte in aktuellen oder zukünftigen Gerichtsverfahren nicht falsch ausgelegt werden.

Bis heute sind die Unternehmen, die von jedem der Akteure im Kernpatentstreit um Cas9 gegründet wurden:

Außerhalb des Patentstreits wurden Doudna und Charpentier als Mitentdecker der CRISPR-Schere anerkannt. Ihre ursprüngliche Zusammenarbeit im Jahr 2011 brachte ihnen schließlich den Nobelpreis für Chemie im Jahr 2020 ein. Es war ein historischer Sieg – Doudna und Charpentier waren die ersten Frauen, die sich den Preis teilten und der synthetische Biologie eine neue Ebene des öffentlichen Bewusstseins brachte.

All diese Aufmerksamkeit wurde auf CRISPR-Cas9 gerichtet. Aber Ca9 ist nicht nur ein Molekül. Es ist eine ganze Reihe von Wildtyp- (natürlich vorkommenden) und manipulierten Enzymen zum Binden und Spalten von DNA. Cas9-Moleküle sind auch nicht die einzigen CRISPR-Enzyme. Ganze Familien von CRISPR-Komplexen wie Cas12, Cas14, CasX und CasY wurden von verschiedenen Organisationen, Unternehmen, Forschern und akademischen Einrichtungen entdeckt und patentiert.

Sogar die Namenskonventionen von Cas sind verwirrend. Verschiedene Entitäten verwenden leicht unterschiedliche Benennungsrichtlinien – CasX in einem Benennungssystem ist Cas12e in einem anderen. Einige CRISPR Cas-Enzyme sind auch eng mit anderen verwandt, fast wie molekulare Cousins ​​​​mit wenig Unterschied zwischen ihnen.

Es gibt Hunderte, wenn nicht Tausende von Cas-Variationen, die alle möglicherweise patentiert werden könnten. Hier werden die CRISPR-IP-Rechte noch stärker fragmentiert.

Andere Spieler im Patentspiel

Die ersten Institutionen, die CRISPR entdeckt haben, sind nicht die einzigen, die Patente besitzen. Wer CRISPR ursprünglich entdeckt hat, ist natürlich das Produkt vieler Debatten. Neben der UC Berkeley und Emmanuelle Charpentier entdeckte auch die Universität Vilnius gleichzeitig, wie man Cas9 verwendet. Die Universität Vilnius wurde jedoch von der ursprünglichen Entdeckungsliste gestrichen, da sie nicht alle für die genetische Bearbeitung notwendigen Komponenten demonstrierte.

CRISPR Cas9 (weiß) verwendet Guide-RNA, um die Ziel-DNA-Sequenz zu lokalisieren und zu schneiden. Quelle: WikiMedia

Inzwischen besitzen Unternehmen wie DowDuPont, MilliporeSigma und Cellectis alle CRISPR-Cas9-Patente.

Einige, wie DowDuPoint, haben ihre Patentverträge von mehreren CRISPR-Unternehmen wie Caribou Biosciences und Emmanuelle Charpentier erworben. Ein Patent-Pooling-Lizenzierungsunternehmen, MPEG LA, ist einen anderen Weg gegangen. Das Unternehmen ist dabei, mehrere Patente von verschiedenen Unternehmen anzusammeln, was ihm potentiellen Zugang zu einem breiten Spektrum an geistigem Eigentum von CRISPR ermöglicht.

Das Problem ist jedoch, dass jedes dieser Patente kleine Segmente eines viel größeren Kuchens darstellt. Es ist noch nicht klar, welche Cas-Enzyme oder welche Variationen dieser Enzyme letztendlich nützlich sein werden. Nur weil ein Forscher oder ein Unternehmen CRISPR-Cas-Patente besitzt, bedeutet dies nicht unbedingt, dass die Cas-Komplexe für die genetische Bearbeitung wirksam sind. Die Entdeckung von CRISPR-Cas-Molekülen ist relativ einfach. Es ist viel schwieriger, diejenigen zu finden, die funktionieren.

Was ist, wenn jeder CRISPR besitzt?

Für die Zukunft der CRISPR-Patentrechte gibt es vier mögliche Szenarien. Einer davon ist, dass die meisten Menschen, die CRISPR-Patente beantragen, erfolgreich sind. In diesem Fall könnte es für Forscher und Unternehmer sehr schwierig sein herauszufinden, ob ein Cas-Molekül bereits patentiert ist und wem dieses geistige Eigentum gehört. Dies könnte zu einem Engpass bei Forschung und Entdeckung führen, wenn Forscher gezwungen sind, alle CRISPR-Sorten zu durchsuchen, um die zu finden, die sie benötigen.

CRISPR-Cas9 kann die genetische Mutation korrigieren, die die Produktion des Proteins Dystrophin beeinflusst, die der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) zugrunde liegt. Wiederherstellung von Dystrophin (grün gefärbt), Heilung bei mindestens 60 % der DMD-Patienten. Bildnachweis: Courtney Young, M.S., Melissa Spencer Labor, University of California, Los Angeles. Quelle: NIH

Das zweite Szenario schafft eine Welt, in der viele Institutionen und Unternehmen CRISPR-Rechte besitzen, aber relativ organisiert ist (wenn sich der anfängliche Staub endlich gelegt hat). Es würde Regeln geben, wie CRISPR geteilt und in der Forschung verwendet werden kann, um es leichter zugänglich zu machen.

Ein drittes Szenario wäre ein Monopol auf CRISPR-Cas9-Patente durch einen oder zwei große Akteure. Sie würden die Forschungs- und Produktionslandschaft kontrollieren, indem sie sich mit anderen Spielern zusammenschlossen oder diese aufkauften. Dies ist jedoch ziemlich unwahrscheinlich. Unternehmen und Forscher haben mit ihren eigenen Iterationen von Molekülen wie CasX bereits klarere IP-Rechte entwickelt. Andere Unternehmen haben proprietäre CRISPR-Komplexe entwickelt. Selbst wenn alle Cas9-Patente von einer Einheit übernommen würden, gäbe es noch andere Optionen auf dem CRISPR-Cas-Markt.

Es gibt auch ein viertes Szenario, in dem Cas9 nicht zum Molekül der Zukunft wird. Obwohl Ca9 das erste entdeckte CRISPR-Enzym war, ist es nicht unbedingt das einfachste zu verarbeiten. Molekulare Komplexe wie CasX sind kleiner, leichter an Patienten zu verabreichen und führen weniger genetische Schnitte außerhalb des Ziels durch. Auch wenn Cas9 in Rechtsstreitigkeiten immer noch in aller Munde ist, dürfte es für viele Anwendungen nicht das Molekül der Wahl sein.

Es sollte gesagt werden, dass akademische Institutionen wahrscheinlich kostengünstig Zugang zu Cas-Molekülen haben werden. Es ist für akademische Forscher traditionell üblich, patentierte Life-Science-Tools zu verwenden, wenn sie nicht vorhaben, selbst Gewinne zu erzielen.

Das CRISPR hat und hat nichts

CRISPR-Anwendungen sind nicht auf Biopharma und Therapeutika beschränkt. Plattformen für Agrartechnologie oder Zellkulturfleisch verwenden bereits die CRISPR-Technologie. Bisher funktioniert dieses System gut genug: Etwa ein Dutzend Unternehmen besitzen das erste Cas9-IP, lizenzieren es und erzielen Gewinne, während sie gleichzeitig ihre eigenen Produkte und Therapeutika entwickeln. So soll das Patentsystem funktionieren. Aber in einem Monopol von einem oder zwei großen Playern könnten die Lizenzgebühren, die die Inhaber von geistigem Eigentum abziehen könnten, praktisch unbegrenzt sein.

Es wird erwartet, dass die Entwicklung von Grundnahrungsmitteln mit CRISPR ein Schlüsselinstrument bei der Modifizierung von Nutzpflanzen sein wird, um höhere Erträge zu erzielen und widerstandsfähiger gegen die Auswirkungen des Klimawandels zu sein. Quelle: DOI: 10.1126/science.aar7191

Ein zweites Problem ergibt sich, wenn ein Unternehmen CRISPR für mehrere Anwendungen einsetzen muss, aber mehr als ein Unternehmen Segmente der CRISPR-Rechte für bestimmte Anwendungen besitzt. Neuere Unternehmen müssen möglicherweise mehrere Lizenzgebühren zahlen, um auf die Technologie zuzugreifen. Da diese Gebühren in der Regel hoch sind, insbesondere für ein so leistungsfähiges Tool wie CRISPR, könnten viele vielversprechende Unternehmen allein durch die Gebühren aus dem Spiel geworfen werden. Dieses Szenario könnte Innovation und wissenschaftliche Kreativität ersticken.

Möchten Sie CRISPR immer noch patentieren? Das müssen Sie wissen

Die größte Herausforderung für jeden, der versucht, CRISPR-Patentrechte zu klären, besteht darin, vollständig zu verstehen, wie viele Patente es gibt.

Eine Recherche im USPTO ergab 262 Patente oder Patentanmeldungen, die CRISPR-Cas9 und über 5.000 allgemeine CRISPR-Patente auflisten. Und das sind nur die Patentanmeldungen für Cas9. Dies beinhaltet nicht die wachsende Zahl von Patenten für andere Cas-Moleküle oder noch zu entdeckende Cas-Moleküle. Dies beinhaltet auch keine Patentanmeldungen in anderen großen Regionen der synthetischen Biologie wie China, Europa, Großbritannien und Israel.

Der Wettbewerb um CRISPR-Patente wird in Zukunft wahrscheinlich nicht nachlassen, da immer mehr Unternehmen und akademische Zentren sich dem Rennen anschließen. Das Rennen ist immer globaler geworden, da immer mehr Länder CRISPR-Patente anmelden – neue Patente werden mit einer Rate von 200 pro Monat eingereicht.

Unklar ist, wie sich diese enorme Zahl von CRISPR-Patenten auf die Zukunft der Wissenschaft auswirken wird. Werden sie den Fortschritt behindern, indem sie die kommerzielle Nutzung der Technologie einschränken, oder werden sich Forscher durchsetzen und neue Therapien für jedermann zugänglich machen? Wenn sich der Staub gelegt hat – wenn überhaupt – besteht die Hoffnung, dass die CRISPR-Technologie für ein breites Anwendungsspektrum zu wettbewerbsfähigen Kosten zugänglich sein wird. Die Macht, Biologie zu entwickeln, sollte nicht auf wenige beschränkt sein. Wir befinden uns jetzt im Zeitalter der Biologie. Wenn wir eine bessere Zukunft aufbauen wollen, dürfen wir das grundlegende Versprechen der Wissenschaft nicht im Staub lassen.

Besonderer Dank geht an Marianna Limas für zusätzliche Recherchen und Lana Bandoim für zusätzliches Schreiben für dieses Stück.

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Fiona Mischel

Fiona Mischel ist die Chefredakteurin von SynBioBeta. Sie befasst sich häufig mit Nachhaltigkeit, CRISPR-Forschung, Lebensmittel- und Agrartechnologie sowie Biotechnologie für die Raumfahrt. Sie zeigt mit Leidenschaft, wie wissenschaftliche Innovationen unsere Klimakrise bekämpfen und Gemeinschaften weltweit positiv beeinflussen können.


Themen

Im April 2015 berichtete eine chinesische Gruppe über die erste Anwendung von CRISPR/Cas9 bei (nicht lebensfähigen) menschlichen Embryonen. Diese Entwicklung hat zusammen mit den sinkenden Kosten der Technologie eine große bioethische Debatte darüber ausgelöst, inwieweit die Technologie eingesetzt werden sollte. Die Technologie steht vor zwei großen Problemen.

Das erste Problem ist ein philosophisches Dilemma. Es konzentriert sich darauf, inwieweit CRISPR/Cas9 verwendet werden sollte, um „Keimbahn“-Zellen – Eier und Spermien – zu verändern, die für die Weitergabe von Genen an die nächste Generation verantwortlich sind. Es wird zwar noch viele Jahre dauern, bis die Technologie zur Entwicklung von Designerbabys geeignet ist, aber eine öffentliche Debatte zu diesem Thema hat bereits begonnen. Die Befürchtung ist so groß, dass einige Wissenschaftler, darunter auch einige, die Pionierarbeit bei CRISPR/Cas9 geleistet haben, ein Moratorium für die Verwendung in Keimbahnzellen gefordert haben.

Das zweite Thema ist eines der Sicherheit. Eines der größten Probleme ist, dass die Technologie noch in den Kinderschuhen steckt und das Wissen über das Genom noch sehr begrenzt ist. Viele Wissenschaftler warnen davor, dass die Technologie noch viel Arbeit benötigt, um ihre Genauigkeit zu erhöhen und sicherzustellen, dass Änderungen in einem Teil des Genoms keine Änderungen an anderen Stellen bewirken, die unvorhergesehene Folgen haben könnten. Dies ist besonders wichtig, wenn es um den Einsatz der Technologie für Anwendungen geht, die auf die menschliche Gesundheit ausgerichtet sind. Ein weiterer kritischer Punkt ist, dass ein Organismus, wie eine Pflanze oder ein Insekt, einmal verändert wurde, schwer vom Wildtyp zu unterscheiden ist und, sobald er in die Umwelt freigesetzt wurde, die Biodiversität gefährden könnte.

Die politischen Entscheidungsträger diskutieren noch immer darüber, welche Einschränkungen sie der Technologie auferlegen sollen. Im April 2015 gaben die US National Institutes of Health eine Erklärung heraus, dass sie keine Forschung finanzieren werden, die Genom-Editing-Tools wie CRISPR an menschlichen Embryonen verwendet. In der Zwischenzeit hat die britische Behörde für menschliche Befruchtung und Embryologie, in deren Zuständigkeitsbereich solche Forschungen fallen würden, angegeben, dass die CRISPR/Cas9-Technologie bei Mensch-Tier-Hybridembryonen unter 14 Tagen verwendet werden kann. Jeder Forscher, der in diesem Bereich arbeitet, müsste zuerst eine Lizenz von der Behörde erhalten. Andere führende britische Forschungsräte haben angedeutet, dass sie die weitere Verwendung von CRISPR/Cas9 und anderen Genom-Editing-Tools in der präklinischen Forschung unterstützen.

Während die Aufsichtsbehörden darüber diskutieren, welche Beschränkungen mit CRISPR/Cas9 durchgesetzt werden sollen, ist die Technologie Gegenstand eines großen Patentstreits geworden. Die erste Patentanmeldung für die Technologie wurde von DuPont im März 2007 eingereicht (WO/2007/025097). Dies umfasst den Einsatz der Technologie zur Entwicklung phagenresistenter Bakterienstämme für die Lebensmittelproduktion, Futtermittel, Kosmetika, Körperpflegeprodukte und Veterinärprodukte. Seitdem haben drei stark finanzierte Biotechnologie-Start-ups und ein halbes Dutzend Universitäten Patente angemeldet. In den USA wurden zwei große konkurrierende Patentansprüche eingereicht. Die erste, eingereicht am 25. Mai 2015, basiert auf den Arbeiten von Jennifer Doudna von der University of California, Berkeley, und Emmanuelle Charpentier, ursprünglich an der Universität Wien und jetzt am Helmholz-Zentrum für Infektionsforschung in Deutschland. Die Anmeldung hat 155 Ansprüche und deckt zahlreiche Anmeldungen für eine Vielzahl von Zelltypen ab (US-Patentanmeldung Nr. PCT/US2013/032589). Die zweite wurde vom MIT-Harvard Broad Institute am 12. Dezember 2012 für die Arbeit von Feng Zhang eingereicht, die sich auf die Verwendung von CRISPR/Cas9 zur Genom-Editierung in eukaryotischen Zellen konzentrierte. Es erhielt den Fast-Track-Status und wurde am 15. April 2014 erteilt (US-Patent Nr. 8.697.359). Im April 2015 haben Charpentier und die Universitäten von Kalifornien und Wien das Patent beim US Patent and Trademark Office angefochten. Es wird mehrere Jahre dauern, bis der Patentstreit beigelegt ist. Der juristische Streit um Patente wird die Nutzung von CRISPR für die Grundlagenforschung wahrscheinlich nicht beeinträchtigen, da die Technologie über ein Open-Source-Repository verfügbar ist. Es könnte jedoch Auswirkungen auf klinische Anwendungen haben, die die Technik verwenden.

Dieses wissenschaftliche Profil wurde von Lara Marks im Juni 2016 mit großzügigen Beiträgen von Silvia Camporesi, Xiofan Zeng und Jonathan Lind verfasst. Das Stück wurde im Oktober 2020 von Lara Marks aktualisiert.


Das Gen-Editing-Scherenwerkzeug CRISPR-Cas9 kann auch ein genetischer „Dimmerschalter“ sein

In einer Reihe von Experimenten mit im Labor gezüchteten Bakterien haben Wissenschaftler von Johns Hopkins Beweise dafür gefunden, dass das weit verbreitete Gen-Schneidsystem CRISPR-Cas9 eine zweite Rolle als genetischer Dimmerschalter für CRISPR-Cas9-Gene spielt. Seine Rolle, die CRISPR-Cas9-Aktivität zu reduzieren oder zu dimmen, könnte Wissenschaftlern helfen, neue Wege zur Gentechnik von Zellen für Forschungszwecke zu entwickeln.

CRISPR-Cas9 wurde 1987 erstmals im Genom von Darmbakterien identifiziert und ist eine natürlich vorkommende, aber ungewöhnliche Gruppe von Genen mit einem Potenzial zum Schneiden von DNA-Sequenzen in anderen Zelltypen, die 25 Jahre später erkannt wurde. Sein Wert in der Gentechnik "programmierbare Genveränderung in lebenden Zellen, einschließlich menschlicher Zellen" wurde schnell erkannt, und seine weit verbreitete Verwendung als Genom-"Editor" in Tausenden von Labors weltweit wurde bei der Verleihung des Nobelpreises für Chemie letztes Jahr an seine amerikanischen und französischen Mitentwickler.

CRISPR steht für geclusterte, regelmäßig angeordnete kurze palindromische Wiederholungen. Cas9, das sich auf das CRISPR-assoziierte Protein 9 bezieht, ist der Name des Enzyms, das den DNA-Schnitt herstellt. Bakterien verwenden CRISPR-Cas9 auf natürliche Weise, um virale oder andere potenziell schädliche DNA zu schneiden und die Bedrohung zu deaktivieren, sagt Joshua Modell, Assistenzprofessor für Molekularbiologie und Genetik an der Johns Hopkins University School of Medicine. In dieser Funktion sagt Modell: "CRISPR ist nicht nur ein Immunsystem, es ist ein adaptives Immunsystem, das sich an Bedrohungen erinnern kann, denen es zuvor begegnet ist, indem es sich an einem kurzen Stück seiner DNA festhält, was einem Fahndungsfoto ähnelt." Diese Fahndungsfotos werden dann in "Guide-RNAs" kopiert, die Cas9 sagen, was zu schneiden ist.

Wissenschaftler haben lange daran gearbeitet, die genauen Schritte des Mechanismus von CRISPR-Cas9 zu enträtseln und wie seine Aktivität in Bakterien erhöht oder verringert wird. Auf der Suche nach Genen, die das CRISPR-Cas9-Gen-Schneidsystem für das häufige, Streptokokken verursachende Bakterium entzünden oder hemmen Streptococcus pyogenes, fanden die Johns Hopkins-Wissenschaftler einen Hinweis darauf, wie dieser Aspekt des Systems funktioniert.

Konkret fanden die Wissenschaftler im CRISPR-Cas9-System ein Gen, das bei Deaktivierung zu einer dramatischen Erhöhung der Aktivität des Systems bei Bakterien führte. Das Produkt dieses Gens schien Cas9 neu zu programmieren, um als Bremse zu wirken, anstatt als "Schere", um das CRISPR-System herunterzufahren.

„Aus Sicht der Immunität müssen Bakterien die CRISPR-Cas9-Aktivität steigern, um Bedrohungen zu erkennen und die Zelle von Bedrohungen zu befreien, aber sie müssen sie auch abschalten, um Autoimmunität zu vermeiden, wenn das Immunsystem fälschlicherweise Bestandteile der Bakterien selbst angreift“, sagt Doktorandin Rachael Workman, Bakteriologin, die in Modells Labor arbeitet.

Um die Einzelheiten der „Bremse“ weiter zu bestimmen, bestand der nächste Schritt des Teams darin, das Produkt des deaktivierten Gens (tracrRNA) besser zu verstehen. RNA ist ein genetischer Cousin der DNA und ist für die Ausführung von DNA-"Anweisungen" zur Herstellung von Proteinen von entscheidender Bedeutung. TracrRNAs gehören zu einer einzigartigen Familie von RNAs, die keine Proteine ​​bilden. Stattdessen fungieren sie als eine Art Gerüst, das es dem Cas9-Enzym ermöglicht, Leit-RNA mit dem Fahndungsfoto des Eindringlingsvirus zu tragen und die passenden DNA-Sequenzen des Virus zu schneiden.

TracrRNA gibt es in zwei Größen: lang und kurz. Die meisten der modernen CRISPR-Cas9-Tools zum Schneiden von Genen verwenden die Kurzform. Das Forscherteam stellte jedoch fest, dass das deaktivierte Genprodukt die Langform von tracrRNA war, deren Funktion völlig unbekannt ist.

Die lange und die kurze Form der tracrRNA sind in ihrer Struktur ähnlich und haben gemeinsam die Fähigkeit, an Cas9 zu binden. Die kurze tracrRNA bindet auch an die Guide-RNA. Die lange tracrRNA muss jedoch nicht an die Guide-RNA binden, da sie bereits ein Segment enthält, das die Guide-RNA nachahmt. „Im Wesentlichen haben Langform-tracrRNAs die Funktion der Kurzform-tracrRNA und der Leit-RNA kombiniert“, sagt Modell.

Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass Leit-RNAs normalerweise nach viralen DNA-Sequenzen suchen, lange tracrRNAs jedoch auf das CRISPR-Cas9-System selbst abzielen. Die lange tracrRNA neigt dazu, auf der DNA zu sitzen, anstatt sie zu schneiden. Wenn dies in einem bestimmten Bereich eines Gens passiert, verhindert es, dass dieses Gen exprimiert wird oder funktionsfähig wird.

Um dies zu bestätigen, nutzten die Forscher Gentechnik, um die Länge einer bestimmten Region in der langen tracrRNA zu verändern, damit die tracrRNA eher wie eine Leit-RNA erscheint. Sie fanden heraus, dass sich Cas9 mit der veränderten Langform-tracrRNA wieder mehr wie eine Schere verhielt.

Andere Experimente zeigten, dass in im Labor gezüchteten Bakterien mit einer großen Menge an langer tracrRNA die Spiegel aller CRISPR-bezogenen Gene sehr niedrig waren. Wenn jedoch die lange tracrRNA aus Bakterien entfernt wurde, erhöhte sich die Expression der CRISPR-Cas9-Gene um das Hundertfache.

Bakterienzellen, denen die Langform-tracrRNA fehlte, wurden im Labor drei Tage lang kultiviert und mit ähnlich kultivierten Zellen verglichen, die die Langform-tracrRNA enthielten. Am Ende des Experiments waren Bakterien ohne tracrRNA in langer Form vollständig abgestorben, was darauf hindeutet, dass tracrRNA in langer Form Zellen normalerweise vor Krankheit und Tod schützt, die auftreten, wenn die CRISPR-Cas9-Aktivität sehr hoch ist.

"Wir kamen auf die Idee, dass die Langform die eigene CRISPR-bezogene Aktivität unterdrückt, aber nicht eliminiert", sagt Workman.

Um zu sehen, ob die Langform-tracrRNA umprogrammiert werden könnte, um andere bakterielle Gene zu unterdrücken, veränderte das Forschungsteam die Spacer-Region der Langform-tracrRNA, um sie auf einem Gen sitzen zu lassen, das grüne Fluoreszenz erzeugt. Bakterien mit dieser mutierten Version der langen tracrRNA leuchteten weniger grün als Bakterien, die die normale lange tracrRNA enthielten, was darauf hindeutet, dass die lange tracrRNA gentechnisch verändert werden kann, um andere bakterielle Gene herunterzufahren.

Die Forscher fanden auch die genetischen Komponenten der Langform-tracrRNA in etwa 40% der Streptokokken-Bakteriengruppe. Eine weitere Untersuchung von Bakterienstämmen, die nicht die Langform tracrRNA aufweisen, sagt Workman, wird möglicherweise zeigen, ob ihre CRISPR-Cas9-Systeme intakt sind und andere Möglichkeiten, wie Bakterien das CRISPR-Cas9-System zurückrufen können.

Die in den Experimenten entdeckte Dimmerfähigkeit bietet laut Modell Möglichkeiten, neue oder bessere CRISPR-Cas9-Tools zu entwickeln, die darauf abzielen, die Genaktivität für Forschungszwecke zu regulieren. "In einem Gen-Editing-Szenario möchte ein Forscher möglicherweise ein bestimmtes Gen schneiden, zusätzlich zur Verwendung der langen tracrRNA, um die Genaktivität zu hemmen", sagt er.


Neue, schnelle CRISPR/Cas9-Methode identifiziert Schlüsselgene bei der Rückenmarkregeneration von Zebrafischen

Ein neuer, schneller Screening-Ansatz verwendet die CRISPR/Cas9-Technologie, um mit dem Immunsystem in Verbindung stehende Gene zu identifizieren, die eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von Rückenmarksverletzungen von Zebrafischen spielen. Marcus Keatinge und Themistoklis Tsarouchas von der University of Edinburgh, Großbritannien, und Kollegen präsentieren diese Ergebnisse im Open-Access-Journal PLOS Genetik.

Bei Menschen und anderen Säugetieren heilen durchtrennte Nervenverbindungen des Rückenmarks nicht, so dass eine Rückenmarksverletzung zu einer dauerhaften Lähmung führen kann. Im Gegensatz dazu sind Zebrafische in der Lage, sich von einer Rückenmarksverletzung in einem Prozess zu erholen, der eine Entzündung beinhaltet, die von Makrophagen gesteuert wird – einer Art von Immunsystemzelle. Der genaue Prozess, durch den Makrophagen die Regeneration des Rückenmarks bei Zebrafischen unterstützen, bleibt jedoch mysteriös.

Um diesen Prozess zu klären, entwickelten Keatinge, Tsarouchas und Kollegen eine neue Methode zur schnellen Identifizierung von Makrophagen-bezogenen Genen, die an der Regeneration des Rückenmarks von Zebrafischen beteiligt sind. Die Strategie nutzt die CRISPR/Cas9-Technologie, die es Forschern ermöglicht, gezielt auf bestimmte Gene zu zielen und diese zu stören und so deren Funktion aufzudecken. Moleküle, die als synthetische RNA Oligo CRISPR Guide RNAs (sCrRNAs) bekannt sind, ermöglichen dieses genspezifische Targeting.

Die Forscher wandten die neue Methode an, um die Regeneration des Rückenmarks bei Zebrafischlarven zu untersuchen. Der Schlüssel zu der Methode war ein Prescreening-Schritt, bei dem sie über 350 sCrRNAs testeten, die auf Gene abzielen, von denen bereits bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der entzündungsbedingten Rückenmarkregeneration spielen. Die Einführung dieser sCrRNAs in Zebrafische ermöglichte die Identifizierung von 10 Genen, die, wenn sie zerstört wurden, die Genesung von Rückenmarksverletzungen beeinträchtigten.

Weitere Analysen schränkten die Liste auf vier Gene ein, die für die Reparatur durchtrennter Spinalnervenverbindungen von entscheidender Bedeutung zu sein scheinen, was die neue Methode validiert. Insbesondere ein Gen, tgfb1, scheint eine wesentliche Signalfunktion bei der Kontrolle von Entzündungen während des Genesungsprozesses zu spielen.

Die neue Methode und die neuen Erkenntnisse könnten dazu beitragen, das Verständnis der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischen zu vertiefen. Die Forscher sagen auch, dass die Methode angepasst werden könnte, um nach Genen zu suchen, die auch in anderen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen.

Die Autoren fügen hinzu: „Zebrafische können ihr Rückenmark nach einer Verletzung vollständig regenerieren. Mit einer neuen und sehr schnellen Screening-Plattform entdecken wir Gene des Immunsystems, die für die Regeneration unerlässlich sind Säugetiere zu regenerieren und unsere vielseitige Screening-Plattform an andere Krankheits- oder Verletzungsmodelle bei Zebrafischen anzupassen."


CRISPR-Cas9 für die Therapie: Herausforderungen und Wege, sie zu überwinden

Sundaram Acharya, . Debojyoti Chakraborty , in Genom-Engineering über das CRISPR-Cas9-System , 2020

Abstrakt

Clustered regular interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated (CRISPR Cas) ist eine Komponente des prokaryotischen adaptiven Immunsystems, die in den letzten Jahren für die Genom-Editierung umfunktioniert wurde. Die Präzision, Einfachheit und Flexibilität dieses Systems haben ein breites Spektrum biologischer Anwendungen von der Grundlagenforschung bis hin zur Biotechnologie und Medizin eröffnet. Darüber hinaus bieten die Multiplexing-Fähigkeiten von CRISPR einen vielversprechenden Ansatz für die Modellierung oder Korrektur von häufigen polygenen Störungen zusammen mit ihren monogenen und infektiösen Gegenstücken. Obwohl CRISPR nicht ganz präzise ist und Fragen bezüglich seiner Spezifität und seiner Bereitstellungsmodalitäten bestehen bleiben, hat die Robustheit und breite Anwendbarkeit dieses Genom-Editing-Tools zahlreiche Möglichkeiten eröffnet, diese Probleme anzugehen. In diesem Kapitel werden wir die ersten Fortschritte bei der Entwicklung von CRISPR-Therapeutika, bestehende Verabreichungsmodalitäten, die Herausforderungen vor der CRISPR-Bearbeitung, bevor sie zu einer therapeutischen Möglichkeit werden, und die laufenden Bemühungen um die Entwicklung eines perfekten CRISPR-Systems für die Bench-to-bedside-Anwendung diskutieren.


Was ist ApoCas9 im CRISPR-Cas9-System? - Biologie

a CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, Mathura Road, New Delhi 110025, Indien
Email: [email protected], [email protected]

Abstrakt

Das CRISPR-Cas9-System hat den Prozess der Veränderung der DNA-Sequenz von Organismen revolutioniert. Basierend auf einem vereinfachten Modell der RNA-gesteuerten DNA-Bindung und -Spaltung findet dieser molekulare Werkzeugkasten Anwendung in fast allen Bereichen der biologischen Wissenschaften. Die Geschichte von CRISPR-Cas9 ist eine der Entdeckungen und Entwicklungen, bei denen eine Komponente der adaptiven Immunität von Bakterien genutzt wurde, um wichtige biologische Fragen unter Verwendung bedeutender Inputs aus physikalisch-chemischen Struktur-Funktions-Studien zu beantworten. In this review, we trace the evolution of CRISPR–Cas9 from its predecessor genome editing tools and document its current status with an emphasis on chemical biology aspects of modulating its activity to generate a potent tool for gene therapy applications.


We would like to thank the Sharp lab members for discussion and critical reading of the manuscript, and M. Lindstrom for assistance on constructing figures. This work was supported by United States Public Health Service grants RO1-GM34277 and R01-CA133404 from the National Institutes of Health (P.A.S.), PO1-CA42063 from the National Cancer Institute (P.A.S.), and partially by Cancer Center Support (core) grant P30-CA14051 from the National Cancer Institute. X.W. is a Howard Hughes Medical Institute International Student Research fellow.

Interessenkonflikt: The authors Xuebing Wu, Andrea J. Kriz and Phillip A. Sharp declare that they have no conflict of interests.

Supplementary Materials: The supplementary materials can be found online with this article at DOI 10.1007/s40484-014-0030-x.


New understanding of CRISPR-Cas9 tool could improve gene editing

The 3D structure of a base editor, comprised of the Cas9 protein (white and gray), which binds to a DNA target (teal and blue helix) complementary to the RNA guide (purple), and the deaminase proteins (red and pink), which switch out one nucleotide for another. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott and Audrone Lapinaite)

Within a mere eight years, CRISPR-Cas9 has become the go-to genome editor for both basic research and gene therapy. But CRISPR-Cas9 also has spawned other potentially powerful DNA manipulation tools that could help fix genetic mutations responsible for hereditary diseases.

Researchers at the University of California, Berkeley, have now obtained the first 3D structure of one of the most promising of these tools: base editors, which bind to DNA and, instead of cutting, precisely replace one nucleotide with another.

First created four years ago, base editors are already being used in attempts to correct single-nucleotide mutations in the human genome. Base editors now available could address about 60% of all known genetic diseases – potentially more than 15,000 inherited disorders — caused by a mutation in only one nucleotide.

The detailed 3D structure, reported in the July 31 issue of the journal Wissenschaft, provides a roadmap for tweaking base editors to make them more versatile and controllable for use in patients.

“We were able to observe for the first time a base editor in action,” said UC Berkeley postdoctoral fellow Gavin Knott. “Now we can understand not only when it works and when it doesn’t, but also design the next generation of base editors to make them even better and more clinically appropriate.”

A base editor is a type of Cas9 fusion protein that employs a partially deactivated Cas9 — its snipping shears are disabled so that it cuts only one strand of DNA — and an enzyme that, for example, activates or silences a gene, or modifies adjacent areas of DNA. Because the new study reports the first structure of a Cas9 fusion protein, it could help guide the invention of myriad other Cas9-based gene-editing tools.

“We actually see for the first time that base editors behave as two independent modules: You have the Cas9 module that gives you specificity, and then you have a catalytic module that provides you with the activity,” said Audrone Lapinaite, a former UC Berkeley postdoctoral fellow who is now an assistant professor at Arizona State University in Tempe. “The structures we got of this base editor bound to its target really give us a way to think about Cas9 fusion proteins, in general, giving us ideas which region of Cas9 is more beneficial for fusing other proteins.“

Lapinaite and Knott, who recently accepted a position as a research fellow at Monash University in Australia, are co-first authors of the paper.

“This structure helps us understand base editors at a much deeper level,” said senior author Jennifer Doudna, UC Berkeley professor of molecular and cell biology and of chemistry and Howard Hughes Medical Institute investigator. “Now that we can see what we’re working with, we can develop informed strategies to improve the system.”

Editing one base at a time

In 2012, researchers first showed how to reengineer a bacterial enzyme, Cas9, and turn it into a gene-editing tool in all types of cells, from bacterial to human. The brainchild of Doudna and her French colleague, Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 has transformed biological research and brought gene therapy into the clinic for the first time in decades.

The 3D structure of a base editor as it edits a stretch of DNA. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott)

Scientists quickly co-opted Cas9 to produce a slew of other tools. Basically a mash-up of protein and RNA, Cas9 precisely targets a specific stretch of DNA and then precisely snips it, like a pair of scissors. The scissors function can be broken, however, allowing Cas9 to target and bind DNA without cutting. In this way, Cas9 can ferry different enzymes to targeted regions of DNA, allowing the enzymes to manipulate genes.

In 2016, David Liu of Harvard University and the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard combined a Cas9 with another bacterial protein to allow the surgically precise replacement of one nucleotide with another: the first base editor.

While the early adenine base editor was slow, the newest version, called ABE8e, is blindingly fast: It completes nearly 100% of intended base edits in 15 minutes. Yet, ABE8e may be more prone to edit unintended pieces of DNA in a test tube, potentially creating what are known as off-target effects.

The newly revealed structure was obtained with a high-powered imaging technique called cryo-electron microscopy (cryoEM). Activity assays showed why ABE8e is prone to create more off-target edits: The deaminase protein fused to Cas9 is always active. As Cas9 hops around the nucleus, it binds and releases hundreds or thousands of DNA segments before it finds its intended target. The attached deaminase, like a loose cannon, doesn’t wait for a perfect match and often edits a base before Cas9 comes to rest on its final target.

Knowing how the effector domain and Cas9 are linked can lead to a redesign that makes the enzyme active only when Cas9 has found its target.

“If you really want to design truly specific fusion protein, you have to find a way to make the catalytic domain more a part of Cas9, so that it would sense when Cas9 is on the correct target and only then get activated, instead of being active all the time,” Lapinaite said.

The structure of ABE8e also pinpoints two specific changes in the deaminase protein that make it work faster than the early version of the base editor, ABE7.10. Those two point mutations allow the protein to grip the DNA tighter and more efficiently replace A with G.

“As a structural biologist, I really want to look at a molecule and think about ways to rationally improve it. This structure and accompanying biochemistry really give us that power,” Knott added. “We can now make rational predications for how this system will behave in a cell, because we can see it and predict how it’s going to break or predict ways to make it better.”

“While base editors are now widely used to introduce precise changes in organisms ranging from bacteria to plants to primates, no one has previously observed the three-dimensional molecular structure of a base editor,” said Liu, who obtained his Ph.D. in 1999 from UC Berkeley and is a Howard Hughes Medical Institute investigator. “This collaborative project reveals the beautiful molecular structure of a state-of-the-art, highly active base editor — ABE8e — caught in the act of engaging a target DNA site.”

In addition to Lapinaite, Knott, Doudna and Liu, other paper co-authors are Cody Palumbo and Peter Beal of UC Davis, Enrique Lin-Shiao of UC Berkeley and Michelle Richter and Kevin Zhao of the Broad Institute, a collaboration between Harvard and the Massachusetts Institute of Technology.


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