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Dimerisierung von Immunglobulin G

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Ich würde gerne die spezifischen Determinanten für die Bildung von IgG-Dimeren wissen. Nach meinem Verständnis ist der Stamm des Antikörpers ein Homodimer aus zwei schweren Ketten, die durch zwei Disulfidbrücken, die Gelenkregion genannt, kovalent verbunden sind. Gibt es einen Zusammenhang zwischen der konstanten Region? Meine Lektüre würde nein vorschlagen, aber ich habe keine spezifische Referenz als solche gefunden.


Für humanes IgG1 und 4 sind die einzigen Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten die beiden in der Hinge-Region. IgG2 hat 4 Disulfide im Scharnier und IgG3 hat 11:

In der Fc-Region gibt es Disulfide innerhalb der schweren Kette, und natürlich gibt es nicht-kovalente Bindungen zwischen den beiden schweren Ketten (sowie den leichten Ketten), um die Struktur aufrechtzuerhalten, aber abgesehen von der Hinge-Region die einzige andere Zwischenkette Disulfide liegen zwischen schwer und leicht.

Hier ist ein interessanter Überblick über die Bildung und Struktur von klassischen (in den 1960er Jahren bestimmten) und nichtklassischen (vor kurzem entdeckten) Disulfidbrücken in humanen IgGs.


Fragmente von bakterieller Endoglykosidase S und Immunglobulin G zeigen jeweils Subdomänen, die zur Deglykosylierung beitragen *

Endoglycosidase S (EndoS) ist eine Glycosid-Hydrolase, die vom Bakterium sezerniert wird Streptococcus pyogenes. EndoS hydrolysiert bevorzugt die n-gebundene Glykane aus der Fc-Region von IgG während der Infektion. Diese Hydrolyse behindert die Fc-Funktionalität und trägt zur Immunevasionsstrategie von S. pyogenes. Hier untersuchen wir den Mechanismus der Deaktivierung von Humanserum-IgG durch EndoS. Wir exprimierten Fragmente von IgG1 und zeigten, dass EndoS gegen alle katalytisch aktiv war, einschließlich der isolierten CH2-Domäne der Fc-Domäne. In ähnlicher Weise versuchten wir zu untersuchen, welche Domänen innerhalb von EndoS zur Aktivität beitragen könnten. Die bioinformatische Analyse der Domänenorganisation von EndoS bestätigte die früheren Vorhersagen einer Chitinasedomäne und einer leucinreichen Wiederholung, zeigte aber auch ein mutmaßliches Kohlenhydratbindungsmodul (CBM) gefolgt von einer C-terminalen Region. Die Verwendung exprimierter Fragmente von EndoS, Circulardichroismus des isolierten CBM und eine Fusion der CBM-C-terminalen Region ergaben gefaltete Domänen, die von einer β-Faltblatt- bzw. α-Helixstruktur dominiert wurden. Kernspinresonanzanalyse des CBM mit Monosacchariden war ein Hinweis auf die Kohlenhydratbindungsfunktionalität. Eine funktionelle Analyse von Verkürzungen von EndoS zeigte, dass, während der C-Terminus von EndoS für die Aktivität entbehrlich ist, seine Deletion die Hydrolyse von IgG-Glykanen behindert.


Klassen von Immunglobulinen

Die fünf Hauptklassen von Immunglobulinen sind IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Diese werden durch die Art der schweren Kette im Molekül unterschieden. IgG-Moleküle haben schwere Ketten, die als Gamma-Ketten bekannt sind IgMs haben Mu-Ketten IgAs haben Alpha-Ketten IgEs haben Epsilon-Ketten und IgDs haben Delta-Ketten.

Unterschiede in den Polypeptiden der schweren Kette ermöglichen es diesen Immunglobulinen, bei verschiedenen Typen von Immunantworten und in bestimmten Stadien der Immunantwort zu wirken. Die für diese Unterschiede verantwortlichen Polypeptidproteinsequenzen finden sich hauptsächlich im Fc-Fragment. Während es fünf verschiedene Typen von schweren Ketten gibt, gibt es nur zwei Haupttypen von leichten Ketten: Kappa (κ) und Lambda (λ).

Antikörperklassen unterscheiden sich in ihrer Wertigkeit durch eine unterschiedliche Anzahl von Y-ähnlichen Einheiten (Monomeren), die sich zum vollständigen Protein verbinden. Beim Menschen haben funktionierende IgM-Antikörper zum Beispiel fünf Y-förmige Einheiten (Pentamer), die insgesamt 10 leichte Ketten, 10 schwere Ketten und 10 Antigenbindungen enthalten.

IgG-Klasse

  • Molekulargewicht: 150.000
  • H-Kettentyp (MW): Gamma (53.000)
  • Serumkonzentration: 10 bis 16 mg/ml
  • Prozent des gesamten Immunglobulins: 75%
  • Glykosylierung (nach Gewicht): 3%
  • Verteilung: intra- und extravaskulär
  • Funktion: sekundäre Antwort

IgM-Klasse

  • Molekulargewicht: 900.000
  • H-Kettentyp (MW): mu (65.000)
  • Serumkonzentration: 0,5 bis 2 mg/ml
  • Prozent des gesamten Immunglobulins: 10 %
  • Glykosylierung (nach Gewicht): 12%
  • Verteilung: meist intravaskulär
  • Funktion: Primärantwort

IgA-Klasse

  • Molekulargewicht: 320.000 (sekretorisch)
  • H-Kettentyp (MW): Alpha (55.000)
  • Serumkonzentration: 1 bis 4 mg/ml
  • Prozent des gesamten Immunglobulins: 15%
  • Glykosylierung (nach Gewicht): 10%
  • Verteilung: intravaskulär und Sekrete
  • Funktion: Schleimhäute schützen

IgD- und IgE-Klasse

  • Molekulargewicht: 180.000
  • H-Kettentyp (MW): Delta (70.000)
  • Serumkonzentration: 0 bis 0,4 mg/ml
  • Prozent des gesamten Immunglobulins: 0,2%
  • Glykosylierung (nach Gewicht): 13%
  • Verbreitung: Lymphozytenoberfläche
  • Funktion: unbekannt
  • Molekulargewicht: 200.000
  • H-Kettentyp (MW): Epsilon (73.000)
  • Serumkonzentration: 10 bis 400 ng/ml
  • Prozent des gesamten Immunglobulins: 0,002 %
  • Glykosylierung (nach Gewicht): 12%
  • Verbreitung: Basophile und Mastzellen im Speichel und Nasensekret
  • Funktion: Schutz vor Parasiten

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Abstrakt

Die endständigen Kohlenhydratreste des n-Glykan auf dem Immunglobulin G (IgG) Fragment kristallisierbar (Fc) bestimmen, ob IgG pro- oder antiinflammatorische Rezeptoren aktiviert. Das IgG Fc allein wird bei Zugabe von α2–6-gebundenem . stark entzündungshemmend n-Acetylneuraminsäure-Reste zum n-Glykan, was das Interesse an der Verwendung dieser Einheit in neuen Therapien für Autoimmunerkrankungen stimuliert [Kaneko et al. (2006) Wissenschaft313, 670–3]. Die vollständige Fc-Sialylierung wurde jedoch aufgrund einer Kombination aus Verzweigungsspezifität und wahrgenommenem Schutz durch Glykan-Protein-Wechselwirkungen als schwierig angesehen. Hier berichten wir über die Herstellung hoher Mengen an disialyliertem Fc unter Verwendung ausreichender Mengen einer hochaktiven α2–6-Sialyltransferase (ST6Gal1)-Präparation, die in einer transient transformierten humanen Zellkultur exprimiert wird. Überraschenderweise sialylierte ST6Gal1 die beiden Termini des binantennären Glykans vom Komplextyp auf eine bemerkenswert ähnliche Weise, wie sie für die freien n-Glykan, was darauf hindeutet, dass das Fc-Polypeptid die ST6Gal1-Spezifität nicht stark beeinflusst. Darüber hinaus scheint die Sialylierung eines der beiden Zweigterminus das Bewegungsverhalten des nicht dramatisch zu verändern n-Glykan, wie durch Lösungs-NMR-Spektroskopie beurteilt. Zusammengenommen legen die Daten die n-Glykan nimmt zwei verschiedene Zustände ein: einen mit beiden Glykantermini, die von enzymatischer Modifikation durch eine α1–6Man-Zweig-Wechselwirkung mit der Polypeptidoberfläche sequestriert sind, und einen mit beiden Glykantermini, die dem Hauptlösungsmittel ausgesetzt und frei von Glykan-Polypeptid-Wechselwirkungen sind. Die Ergebnisse legen neue Wege nahe, durch die disialyliertes Fc als entzündungshemmender Effektor wirken kann.


Abstrakt

Antikörpertherapeutika sind mittlerweile weit verbreitet und bieten einen neuen Ansatz zur Behandlung schwerer Krankheiten wie rheumatische Erkrankungen und Krebs. Als Therapeutika eingesetzte monoklonale Antikörper müssen von hoher Qualität sein und ihre Sicherheit muss gewährleistet sein. Aggregierter Antikörper ist ein Abbauprodukt, das während des Herstellungsprozesses erzeugt werden kann. Um die hohe Qualität und Sicherheit von Antikörpertherapeutika aufrechtzuerhalten, ist es notwendig, den Mechanismus der Aggregation zu verstehen und Technologien zur strikten Kontrolle der Aggregatbildung zu entwickeln. Hier untersuchten wir ausführlich die konformativen und kolloidalen Eigenschaften isolierter konstanter Antikörperdomänen und lieferten Einblicke in den molekularen Mechanismus der Antikörperaggregation. Isolierte Domänen (CH2-, CH3-, CL- und CH1-CL-Dimer) von humanem Immunglobulin G wurden synthetisiert, unter Verwendung von 49 Lösungsbedingungen (pH 2–8 und 0–300 mM NaCl) solubilisiert und durch Circulardichroismus, intrinsisches Tryptophan . charakterisiert Fluoreszenz und dynamische Lichtstreuung. Salzinduzierte Konformationsänderungen und Oligomerbildung wurden kinetisch durch NaCl-Sprungmessungen (von 0 bis 300 mM bei pH 3) analysiert. Phasendiagramme zeigten, dass die Domänen unterschiedliche Konformations- und Kolloidstabilitäten aufweisen. Die ungefalteten Fraktionen von CH3 und CH2 bei pH 3 waren größer als die von CL und CH1-CL-Dimer. Die Sekundär- und Tertiärstrukturen und Partikelgrößen von CH3 und CH2 zeigten, dass diese Domänen in nicht nativen Zuständen empfindlich auf die Salzkonzentration reagierten. Kinetische Analysen legen nahe, dass die Oligomerbildung durch CH3 und CH2 durch teilweise rückgefaltete Konformationen verläuft. Die kolloidale Stabilität von CH3 in nicht-nativen Zuständen ist unter den getesteten Bedingungen die niedrigste der vier Domänen. Wir schlagen vor, dass der Einfluss der konstanten IgG-Domänen auf die Aggregation der Reihenfolge CH3 > CH2 > CH1-CL-Dimer > CL folgt. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass CH3 die wichtigste Rolle bei der Förderung der intakten Antikörper-Aggregation unter sauren Bedingungen spielt.


Antikörperfunktionen

Antikörper, die Teil der humoralen Immunantwort sind, sind an der Erkennung und Neutralisierung von Krankheitserregern beteiligt.

Lernziele

Unterscheiden Sie zwischen Affinität, Avidität und Kreuzreaktivität bei Antikörpern

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • Antikörper werden von Plasmazellen produziert, können aber, sobald sie sezerniert sind, unabhängig gegen extrazelluläre Pathogene und Toxine wirken.
  • Antikörper binden an spezifische Antigene von Pathogenen, diese Bindung kann die Infektiosität von Pathogenen hemmen, indem wichtige extrazelluläre Stellen blockiert werden, wie z. B. Rezeptoren, die am Eintritt in die Wirtszelle beteiligt sind.
  • Antikörper können auch die angeborene Immunantwort induzieren, um ein Pathogen zu zerstören, indem sie Phagozyten wie Makrophagen oder Neutrophile aktivieren, die von Antikörper-gebundenen Zellen angezogen werden.
  • Affinität beschreibt, wie stark ein einzelner Antikörper ein bestimmtes Antigen bindet, während Avidität die Bindung eines multimeren Antikörpers an mehrere Antigene beschreibt.
  • Ein multimerer Antikörper kann einzelne Arme mit geringer Affinität aufweisen, aber aufgrund synergistischer Effekte zwischen den Bindungsstellen eine insgesamt hohe Avidität aufweisen.
  • Kreuzreaktivität tritt auf, wenn ein Antikörper an ein anderes, aber ähnliches Antigen bindet als das, für das er hergestellt wurde. Dies kann die Pathogenresistenz erhöhen oder zu einer Autoimmunreaktion führen.

Schlüsselbegriffe

  • Begierde: das Maß für den Synergismus der Stärke individueller Wechselwirkungen zwischen Proteinen
  • Affinität: die Anziehung zwischen einem Antikörper und einem Antigen

Antikörperfunktionen

Differenzierte Plasmazellen sind entscheidende Akteure in der humoralen Immunantwort. Von besonderer Bedeutung sind die von ihnen sezernierten Antikörper gegen extrazelluläre Pathogene und Toxine. Einmal sezerniert, zirkulieren Antikörper frei und wirken unabhängig von Plasmazellen. Manchmal können Antikörper von einem Individuum auf ein anderes übertragen werden. Zum Beispiel kann eine Person, die kürzlich eine erfolgreiche Immunantwort gegen einen bestimmten Krankheitserreger hervorgebracht hat, Blut an einen nicht-immunen Empfänger spenden, wodurch eine vorübergehende Immunität durch Antikörper im Blutserum des Spenders verliehen wird. Dieses Phänomen, das als passive Immunität bezeichnet wird, tritt auch während des Stillens auf natürliche Weise auf, was gestillte Säuglinge in den ersten Lebensmonaten sehr resistent gegen Infektionen macht.

Antikörper umhüllen extrazelluläre Krankheitserreger und neutralisieren sie, indem sie Schlüsselstellen auf dem Krankheitserreger blockieren, die ihre Infektiosität erhöhen, wie Rezeptoren, die Krankheitserreger an Wirtszellen „andocken“. Die Antikörperneutralisation kann verhindern, dass Krankheitserreger in Wirtszellen eindringen und diese infizieren, im Gegensatz zum zytotoxischen T-Zell-vermittelten Ansatz, bereits infizierte Zellen abzutöten, um das Fortschreiten einer etablierten Infektion zu verhindern. Die neutralisierten antikörperbeschichteten Erreger können dann über die Milz gefiltert und im Urin oder Stuhl ausgeschieden werden.

Mechanismen der Antikörperwirkung: Antikörper können eine Infektion hemmen, indem sie (a) die Bindung des Antigens an sein Ziel verhindern, (b) ein Pathogen zur Zerstörung durch Makrophagen oder Neutrophile markieren oder (c) die Komplementkaskade aktivieren.

Antikörper markieren auch Krankheitserreger für die Zerstörung durch phagozytische Zellen, wie Makrophagen oder Neutrophile, da sie von Makromolekülen, die mit Antikörpern komplexiert sind, stark angezogen werden. Phagozytäre Verstärkung durch Antikörper wird als Opsonisierung bezeichnet. In einem anderen Verfahren, der Komplementfixierung, binden IgM und IgG im Serum an Antigene, wodurch Andockstellen bereitgestellt werden, an die sequentielle Komplementproteine ​​binden können. Die Kombination von Antikörpern und Komplement verstärkt die Opsonisierung noch weiter und fördert eine schnelle Beseitigung von Krankheitserregern.

Affinität, Avidität und Kreuzreaktivität

Nicht alle Antikörper binden mit der gleichen Stärke, Spezifität und Stabilität. Tatsächlich weisen Antikörper je nach molekularer Komplementarität zwischen Antigen- und Antikörpermolekülen unterschiedliche Affinitäten (Anziehung) auf. Ein Antikörper mit einer höheren Affinität für ein bestimmtes Antigen würde stärker und stabiler binden. Es wäre zu erwarten, dass es eine schwierigere Abwehr gegen das Pathogen darstellt, das dem spezifischen Antigen entspricht.

Antikörperaffinität, Avidität und Kreuzreaktivität: (a) Affinität bezieht sich auf die Stärke einzelner Interaktionen zwischen Antigen und Antikörper, während sich Avidität auf die Stärke aller kombinierten Interaktionen bezieht. (b) Ein Antikörper kann mit verschiedenen Epitopen kreuzreagieren.

Der Begriff Avidität beschreibt die Bindung von Antikörperklassen, die als verbundene, multivalente Strukturen (wie IgM und IgA) sezerniert werden. Obwohl die Avidität die Bindungsstärke misst, genau wie die Affinität, ist die Avidität nicht einfach die Summe der Affinitäten der Antikörper in einer multimeren Struktur. Die Avidität hängt von der Anzahl identischer Bindungsstellen auf dem nachzuweisenden Antigen sowie anderen physikalischen und chemischen Faktoren ab. Typischerweise werden multimere Antikörper, wie pentameres IgM, als mit einer geringeren Affinität als monomere Antikörper, aber mit einer hohen Avidität klassifiziert. Im Wesentlichen gleicht die Tatsache, dass multimere Antikörper viele Antigene gleichzeitig binden können, ihre etwas geringere Bindungsstärke für jede Antikörper/Antigen-Wechselwirkung aus.

Antikörper, die nach Bindung an ein Epitop auf einem Antigen sezerniert werden, können eine Kreuzreaktivität für dieselben oder ähnliche Epitope auf verschiedenen Antigenen aufweisen. Kreuzreaktivität tritt auf, wenn ein Antikörper nicht an das Antigen bindet, das seine Synthese und Sekretion ausgelöst hat, sondern an ein anderes Antigen. Da ein Epitop einer so kleinen Region (der Oberfläche von etwa vier bis sechs Aminosäuren) entspricht, ist es möglich, dass unterschiedliche Makromoleküle über kurze Regionen die gleichen molekularen Identitäten und Orientierungen aufweisen.

Kreuzreaktivität kann von Vorteil sein, wenn eine Person eine Immunität gegen mehrere verwandte Krankheitserreger entwickelt, obwohl sie nur einem von ihnen ausgesetzt oder gegen sie geimpft wurde. Zum Beispiel kann eine Antikörper-Kreuzreaktivität gegen die ähnlichen Oberflächenstrukturen verschiedener gramnegativer Bakterien auftreten. Umgekehrt können Antikörper gegen pathogene molekulare Komponenten, die Eigenmolekülen ähneln, Wirtszellen fälschlicherweise für die Zerstörung markieren und Autoimmunschäden verursachen. Patienten, die einen systemischen Lupus erythematodes (SLE) entwickeln, weisen häufig Antikörper auf, die mit ihrer eigenen DNA reagieren. Diese Antikörper können ursprünglich gegen die Nukleinsäure von Mikroorganismen erzeugt worden sein, später aber mit Selbstantigenen kreuzreagiert haben. Dieses Phänomen wird auch molekulare Mimikry genannt.


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Materialen und Methoden

Materialien

PECAM-1.3, ein muriner anti-humaner PECAM-1-mAb, der für die Ig-Homologiedomäne 1 spezifisch ist (Sun et al. 1996b), wurde mit Alexa 488 unter Verwendung eines Proteinmarkierungskits (Molecular Probes) fluoreszenzmarkiert. Ein Maus-Anti-Mensch-mAb, spezifisch für FKBP-12, MAR4 (Maus-Anti-Mensch-α5 Integrin) und IIA1 (Maus-Anti-Human-β1 Integrin) wurden von PharMingen bezogen. P1D6 (Maus anti-human α5 Integrin) und P4C10 (Maus-Anti-Human-β1 Integrin) wurden von GIBCO BRL bezogen. AP1510 und der pCF1E-Vektor, der für FKBP-cDNA kodiert, wurden von ARIAD Pharmaceuticals, Inc. (Cambridge, MA) bereitgestellt. PMSF wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Chemische Vernetzungsmittel, Bis(sulfosuccinikidyl)suberat (BS 3 ) und Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP) wurden von Pierce Chemical Co. bezogen. DTSSP ist durch Thiol spaltbar, wohingegen BS 3 nicht spaltbar ist.

Konstruktion von cDNAs, die für PECAM-1/FKBP-1- und PECAM-1/FKBP-2-Fusionsproteine ​​kodieren

Eine oder zwei Kopien des FK506-bindenden Proteins (FKBP), FKBP-12, wurden an den COOH-Terminus der zytoplasmatischen Domäne von PECAM-1 unter Verwendung von standardmäßigen überlappenden PCR-Techniken fusioniert ( 1 ). PECAM-1/FKBP-1, das ein FKBP-Motiv enthält, wurde durch PCR hergestellt. Ein Segment von PECAM-1 wurde vom Aminosäurerest 375 bis zum COOH-Terminus von PECAM-1 unter Verwendung von PECAM-1-Primer 1 (5'-CCTGTCAAGTAAGGTGGTGGAGTCT-3') und PECAM-1-Primer 2 (5'-CACCTGCA-CGCCTCTAGAAGTTCCATCAAGGGAGCC-) amplifiziert. 3') und wurde mit einem FKBP-Motiv voller Länge unter Verwendung von FKBP-Primer 3 (5'-GGCTCCCTTGATGGAACTTCTAGAGGCGTGCAGGTG-3') und FKBP-Primer 4 (5'-GTCCTGAATGCTCTTCCAGGCGGCCGCTTATGCGTAGTCTGGTAC-3') verbunden. Anschließend wurden die beiden Segmente mit den Primern 1 und 4 zusammengemischt und eine sekundäre Überlappungs-PCR durchgeführt. Das endgültige amplifizierte Produkt wurde mit Nhe I und Not I verdaut und in ähnlich geschnittene Wildtyp-PECAM-1-cDNA eingefügt, die in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3 kloniert worden war. PECAM-1/FKBP-2, das zwei an den COOH-Terminus von PECAM-1 fusionierte FKBP-Domänen enthält, wurde durch Hinzufügen einer zweiten FKBP-Domäne zu PECAM-1/FKBP-1 konstruiert. Die Integrität und Authentizität beider Konstrukte wurde durch Nukleotidsequenzierung bestätigt.

Entwicklung von stabilen PECAM-1/FKBP-1– und PECAM-1/FKBP-2-exprimierenden HEK-293-Zelllinien

HEK (humane embryonale Niere)-293-Zellen und humane Erythroleukämie (HEL)-Zellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in MEM- bzw. RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum bei . kultiviert 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2. HEK-293-Zellen wurden in 100-mm-Schalen bis zu 80–90% Konfluenz gezüchtet, mit 10 μg pcDNA3.0 (Invitrogen) inkubiert, die PECAM-1/FKBP-1 oder PECAM-1/FKBP-2 in einem Lipofectamin-Gemisch enthielt ( GIBCO BRL) für 4 h in serumfreiem Medium (Sigma-Aldrich). Die Zellen wurden weitere 48 h in serumhaltigem MEM kultiviert, bevor 0,6 mg/ml G418 (Geneticin GIBCO BRL) zugegeben wurden. G418-resistente Zelllinien wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Zelloberflächenexpression von PECAM-1/FKBP-1 und PECAM-1/FKBK2 analysiert. Zellklone wurden durch Zellsortierung und Subklonierung in begrenzter Verdünnung erhalten. Die Eigenschaften von mindestens drei verschiedenen klonalen Linien wurden untersucht, um den Einfluss der klonalen Variation auf den beobachteten Phänotyp zu bestimmen.

Western Blot und Immunpräzipitationsanalyse

HEL- und HEK-293-Zellen wurden unter Verwendung von 0,01% Trypsin und 10 mM EDTA angehoben, in sterilem HPBS gewaschen und bei einer Endkonzentration von 10 6 Zellen/ml resuspendiert. Die chemische Vernetzung wurde durch Zugabe von 2 mM BS 3 oder DTSSP für 1 h bei 4 °C initiiert und dann wurden 50 mM Tris-HCl zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Zelllysate wurden in Lysepuffer (2% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 2 mM PMSF) hergestellt und die 15.000 g Die in Triton lösliche Fraktion wurde sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem 7% SDS-Polyacrylamidgel analysiert. Nach dem Transfer auf eine Immobilion-P-Membran (Millipore) wurden Proteine ​​mit Antikörpern gegen PECAM-1 (PECAM-1.3) oder FKBP-12 in Verbindung mit verstärkter Chemilumineszenz-Immundetektion (Amersham Pharmacia Biotech) mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG . sichtbar gemacht (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Für die Immunpräzipitationsanalyse wurden Detergenszelllysate wie oben hergestellt und die Triton-löslichen Fraktionen wurden mit 10 &mgr;g/ml PECAM-1,3 IgG über Nacht bei 4°C inkubiert. Immunkomplexe wurden mit 50 μl einer 50%igen Aufschlämmung von Protein G-Sepharose für 1 h bei 4 °C eingefangen und dann fünfmal mit Immunpräzipitations-Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 150 mM NaCl und 2 .) gewaschen % Triton X-100). Gebundene Proteine ​​wurden von den Beads durch 10 min Kochen in 30 &mgr;l SDS-reduzierendem Puffer eluiert und wie oben beschrieben durch SDS-PAGE analysiert.

Durchflusszytometrie

4 µg PECAM-1.3 oder PECAM-1/IgG in 100 µl HPBS wurden zu 5 × 10 5 Wildtyp- oder transfizierten HEK-293-Zellen in 100 µl HPBS gegeben und 60 min bei Raumtemperatur im An- oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von AP1510. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation mit 1 ml HPBS gewaschen und dann in 100 µl HPBS resuspendiert, die 1 µg FITC-markierte Ziege-anti-Mensch- oder Ziege-anti-Maus-IgG--Kette (Jackson ImmunoResearch Laboratories) enthielten. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 4°C wurden die Zellen noch einmal in HPBS gewaschen und dann einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen.

Fluoreszenzmikroskopie

Wildtyp- oder stabil transfizierte 293-Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM AP1510 für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit 5 μg/ml Alexa 488-konjugiertem PECAM-1.3 für 30 Minuten bei 4°C. Die Zellen wurden dann gewaschen, mit 1% Formaldehyd fixiert und unter Verwendung eines Cytospin-Präparats auf Glasobjektträger montiert. Die Zelloberflächenverteilung von PECAM-1 wurde unter Verwendung eines Zeiss-Fluoreszenzmikroskops (ZEISS) analysiert.

Quantitative Bewertung der Bindung von 293-Zellen an immobilisiertes Fibronectin

Anhaftende 293-Zellen wurden unter Verwendung von 0,01% Trypsin und 10 mM EDTA abgehoben, in sterilem HPBS gewaschen und bei 10 6 Zellen/ml in vorgewärmtem (37°C) serumfreiem Medium resuspendiert. Nach Inkubation mit 2 µg/ml Calcein AM (Molecular Probes) für 30 min bei 37 °C wurden die Zellen gewaschen und mit 10 6 Zellen/ml in vorgewärmtem serumfreiem Medium resuspendiert und dann erneut inkubiert, diesmal mit unterschiedlichen Konzentrationen von AP1510 in Gegenwart ausgewählter Antikörper für 30 min bei 22 °C. 200-μl-Zellaliquote wurden dann in die Vertiefungen von 96-Well-Mikrotiter-Gewebekulturplatten (Dynatech Laboratories) gegeben, die entweder mit 10 μg/ml Fibronektin (Sigma-Aldrich) oder 10 mg/ml BSA (ICN Biomedicals) beschichtet waren. Antikörper-Kompetitionsexperimente wurden durchgeführt, indem Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen ausgewählter Integrin-spezifischer mAbs für 30 Minuten bei 22 °C vorinkubiert wurden, bevor die Zellen in die Vertiefungen gegeben wurden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 70 &mgr;l 4% Formaldehyd für 15 min bei 37 °C gestoppt und die gesamte Well-Fluoreszenz wurde in einem CytoFluor-Fluoreszenz-Plattenlesegerät (PerSeptive Biosystem) bestimmt. Locker anhaftende und ungebundene Zellen wurden dann durch Waschen der Vertiefungen mit vorgewärmtem serumfreiem Medium entfernt und die Fluoreszenz wurde erneut gemessen, um die prozentuale Zelladhäsion zu bestimmen.


DISKUSSION

Als Mitglied der Atlastin-GTPase-Familie, die die Fusion verschiedener ER-Tubuli in Pflanzenzellen vermittelt, ist die mechanistische Grundlage der Wirkung von RHD3 bei der ER-Membranfusion noch nicht gut untersucht. Frühere Studien zeigten, dass RHD3 eine GTP-abhängige homotypische Interaktion eingeht, die durch die Phosphorylierung an den divergenten Sequenzen des CT von RHD3 verstärkt werden kann ( Chen et al., 2011 Ueda et al., 2015). Obwohl die Struktur von RHD3 nicht aufgeklärt wurde, simulierten wir aufgrund der hohen Strukturähnlichkeit zwischen RHD3 und Sey1p, einem Hefemitglied der Atlastin GTPasen, die Struktur des zytosolischen N-Terminus von RHD3. Die simulierte zytosolische Struktur von RHD3 legt nahe, dass sich die GDs und die ersten beiden 3HBs von zwei RHD3-Monomeren zu einem Dimer verdrillen könnten. In Übereinstimmung mit dieser Simulation stellen wir fest, dass ein RHD3 voller Länge sowohl mit seiner GD als auch mit seiner mittleren Domäne homotypische Wechselwirkungen eingehen kann. Wenn die potentielle polare Bindung zwischen D185 eines RHD3-Monomers und R101 eines anderen Monomers in der Grenzfläche des Dimers unterbrochen wird, wird die Wechselwirkung zwischen einem RHD3 voller Länge und der GD von RHD3 geschwächt. In ähnlicher Weise könnten Mutationen in den ersten beiden 3HBs in der mittleren Domäne auch die Interaktion zwischen einem RHD3 voller Länge und seiner mittleren Domäne reduzieren. Wir vermuten, dass die durch seine GD und 3HBs vermittelte Dimerisierung von RHD3 sehr wahrscheinlich ist. Interessanterweise hat die Expression des GD- oder zytosolischen N-Terminus von RHD3 in Pflanzenzellen einen negativen Einfluss auf die Bildung des polygonalen ER-Netzwerks, was darauf hindeutet, dass die Funktion des endogenen RHD3 beeinträchtigt ist. Dieser Einfluss beruht möglicherweise auf der Interaktion zwischen dem GD- oder zytosolischen N-Terminus von RHD3 und dem endogenen RHD3 voller Länge. In tierischen Zellen wird angenommen, dass, um die Fusion unterschiedlicher ER-Membranen zu erleichtern, der zytosolische N-Terminus von Atlastin-1 in zwei verschiedenen ER-Membranen zuerst eine Dimerisierung zwischen GDs durchläuft, um verschiedene ER-Membranen miteinander zu verbinden. Diese Dimerisierung wird dann durch 3HBs in der mittleren Domäne stabilisiert, wonach eine von der GTP-Hydrolyse abhängige Konformationsänderung auftritt, um die ER-Membranen zu fusionieren. Da die Interaktion zwischen einem RHD3 voller Länge und seinem GD oder den ersten beiden 3HBs für die effiziente ER-Fusion erforderlich war, denken wir, dass ein ähnlicher Mechanismus für RHD3 existieren könnte.

Ein wesentlicher Unterschied zwischen RHD3 und Atlastin-1 besteht darin, dass die vorhergesagte, durch Helixbündel angereicherte mittlere Domäne von RHD3 viel länger ist als die von Atlastin-1 (Stefano und Brandizzi, 2014). Wie RHD3 hat auch Sey1p eine mittlere Domäne, die länger ist als Atlastin-1. Es wurde gezeigt, dass die Deletion von 3HB-3 und 3HB-4 Sey1p inaktiviert (Yan et al., 2015). Hier finden wir, dass in RHD3 3HB-3 und 3HB-4 eine entscheidende Rolle bei der Proteinstabilität von RHD3 spielen. Obwohl sowohl 3HB-1 als auch 3HB-2 für eine mögliche Dimerisierung von RHD3 erforderlich sind, ist es interessant festzustellen, dass die 3HB-1-Mutanten RHD3(A285P) und RHD3(L355P) an dick gebündelten ER-Tubuli lokalisiert sind, während die 3HB-2-Mutanten RHD3( L379P) and RHD3(A434P) form punctates and aggregations on the ER tubules. This suggests that the mutations in 3HB-2 (L379P and A434P) may also influence the distribution of RHD3 on ER tubules.

RHD3 is an ER localized protein. Our results indicate that the TMs of RHD3 are important for the targeting and retention of RHD3 in the ER. The TMs not only serve as an ER membrane anchor, they are also able to interact with each other. Atlastin-1 in animal cells undergo a GTP-independent association through its TMs. This TM-mediated association is proposed to increase the density of Atlastin-1 at the site of membrane tethering ( Liu et al., 2012 Yan et al., 2015), so multiple cycles of dimerization of Atlastin-1 in the different membranes can occur for the efficient ER membrane fusion. Likely, RHD3 may also undergo a TM-mediated association for the efficient ER membrane fusion in plant cells.

Although the TMs are important for the targeting and retention of RHD3 in the ER, we also found the amphipathic helix located in the CT of RHD3 has an ability for the ER and Golgi targeting. Given the fact that a large portion of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is in the cytosol, we think a portion of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is anchored to the membrane of the ER and Golgi. When the hydrophobic residues on the same hydrophobic face in the amphipathic helix are replaced by the acidic residues, all the mutations abolished the membrane attachment ability of the CT of RHD3 however, different hydrophobic residue replacement did not compromise the membrane association of the CT of RHD3. Thus, it is highly likely that the membrane anchoring of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is due to a hydrophobic interaction between the amphipathic helix and membrane lipids. The amphipathic helix of Atlastin-1 has been proposed to facilitate the ER membrane fusion by providing the driving force for outer leaflet mixing of two different membranes through interacting with and destabilizing the lipid bilayer ( Liu et al., 2012). The mutations in the hydrophobic residues on the same hydrophobic face in the helix not only abolish the membrane attachment ability of the CT of RHD3, the full-length RHD3 with such mutations in the amphipathic helix also has reduced ability to rescue ƊSey1p und rhd3-8 Mutanten. This indicates that membrane anchoring mediated by the amphipathic helix of RHD3 also play a role in the efficient ER membrane fusion, possibly through its interaction with lipid bilayers like the amphipathic helix of Atlastin-1.

It is interesting to note that a portion of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is not only anchored to the ER membrane, but also the Golgi membrane. This is probably a reflection of the specific organization of the ER-Golgi interface in plant cells that Golgi is physically linked to the ER ( Sparkes et al., 2009). However, when the CT of yeast Sey1p was expressed in plant cells, no Golgi targeting is revealed ( Supplemental Fig. S5A ), but replacing the amphipathic helix in the CT of yeast Sey1p with the amphipathic helix of RHD3 will target YFP to the Golgi or ER membrane ( Supplemental Fig. S5B ), so the Golgi targeting of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is RHD3 specific and is determined by the amphipathic helix of the CT of RHD3. However, the full-length RHD3 is ER localized ( Chen et al., 2011), so the physiological relevance of this Golgi membrane preference of the CT of RHD3 is not clear.

CONCLUSIONS

Based on our systemic structure-function analysis of RHD3, we hypothesize that, to mediate different ER membrane fusion, different RHD3 molecules in different ER membranes need to undergo homotypic interaction through their GDs and middle domains. Likely, RHD3 may also undergo a TM-mediated association to increase the density of RHD3 in the same ER membrane for efficient ER membrane fusion. Meanwhile, the amphipathic helix of the C terminus of RHD3 would attach to the ER membrane to disturb the lipid bilayer to facilitate the membrane fusion.


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