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13.1D: Erzeugung von Antikörperdiversität - Biologie

13.1D: Erzeugung von Antikörperdiversität - Biologie


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Lernziele

  1. Definieren Sie die Gentranslokation und beziehen Sie sie auf jeden B-Lymphozyten, der in der Lage ist, einen Antikörper mit einem einzigartig geformten Fab zu produzieren.
  2. Definieren Sie Folgendes:
    1. kombinatorische Vielfalt
    2. verbindungsvielfalt
    3. Affinitätsreifung

In diesem Abschnitt werden wir uns mit der Erzeugung von Antikörperdiversität durch Gentranslokation befassen. Wie bereits erwähnt, hat das Immunsystem des Körpers keine Ahnung, auf welche Antigene es möglicherweise stößt. Daher hat es ein System entwickelt, das die Fähigkeit besitzt, auf jedes erdenkliche Antigen zu reagieren. Das Immunsystem kann dies tun, weil sowohl B-Lymphozyten als auch T-Lymphozyten ein einzigartiges System des Genspleißens entwickelt haben, das als Gentranslokation bezeichnet wird, eine Art Gen-Shuffling-Prozess, bei dem verschiedene unterschiedliche Gene entlang eines Chromosoms aus einer Stelle herausgeschnitten und verbunden werden mit anderen Genen entlang des Chromosoms.

Um diesen Gentranslokationsprozess zu demonstrieren, werden wir untersuchen, wie jeder B-Lymphozyten genetisch so programmiert wird, dass er einen Antikörper produziert, der als B-Zell-Rezeptor (BCR) mit einer einzigartig geformten Fab fungiert. Wie oben erwähnt, besteht der Fab-Teil eines Antikörpers aus 2 Proteinketten: einer schweren und einer leichten (siehe Abbildung (PageIndex{1})).

Der variable schwere Kettenteil des Fab wird durch eine Kombination von 3 Genen kodiert, die als VH (variable Heavy), DH (Diversity Heavy) und JH (Joining Heavy) bezeichnet werden. Der variable leichte Kettenteil des Fab besteht entweder aus einer Kappa-Kette oder einer Lambda-Kette, die durch eine Kombination von 2 Genen, VL (variable light) und JL (joining light), kodiert wird. In der DNA jedes B-Lymphozyten gibt es mehrere Formen von jedem dieser variablen Determinantengene. Obwohl die genaue Anzahl jedes Gens nicht bekannt ist und von Person zu Person variiert, gibt es ungefähr 38-46 VH-Gene; 23 DH-Gene; 6 JH-Gene; 34-38 kappa-VL-Gene; 5 kappa-JL-Gene; 29-33 Lambda-VL-Gene; und 4–5 Lambda-JL-Gene.

Während eine Person Allele für die verschiedenen V(D)J-Gene von jedem Elternteil erbt, exprimiert ein einzelner B-Lymphozyten nur einen geerbten Allelsatz von einem Elternteil. Dies erhöht eine größere Vielfalt von Antikörpern in diesem Individuum.

Durch zufällige Gentranslokation kann sich jede beliebige Kombination der multiplen Formen jedes Gens zusammenfügen (siehe Abbildung (PageIndex{2})), was zu Tausenden von möglichen Genkombinationen führt. Dies wird als kombinatorische Diversität bezeichnet.

Die Gentranslokation der V(D)J-Gene wird initiiert, wenn ein Enzym namens V(D)J-Rekombinase Rekombinationssignalsequenzen erkennt, die sich am 3'-Ende von V-Genen, am 5'-Ende von J-Genen und beiden Enden von D-Genen befinden . Als Ergebnis bildet das Chromosom eine Schleife, die es verschiedenen Genen aus verschiedenen Regionen entlang des Chromosoms ermöglicht, sich auszurichten (siehe Abbildung (PageIndex{3})). In der schweren Kette richten sich jedes J-schwere Gen und jedes D-schwere Gen aus und binden sich zusammen, wenn die Gene von einer Stelle abgeschnitten und an einer anderen eingefügt werden. Anschließend wird eines der V-lastigen Gene an dieses DJ-Segment angehängt. In der leichten Kette ermöglicht das chromosomale Looping jedem V-light-Gen, sich an jedes J-light-Gen anzuheften.

Flash-Animation, die Gentranslokation und kombinatorische Diversität zeigt.

html5-Version der Animation für das iPad, die Gentranslokation und kombinatorische Diversität zeigt.

Während der Gentranslokation verursachen spezialisierte Enzyme in den B-Lymphozyten Spleißungenauigkeiten, wobei zusätzliche Nukleotide an den verschiedenen Genverbindungen hinzugefügt oder deletiert werden. Diese Änderung in der Nukleotidbasensequenz erzeugt eine noch größere Vielfalt in der Fab-Form. Dies wird als junktionale Vielfalt bezeichnet.

Darüber hinaus durchlaufen B-Lymphozyten, wenn sie sich vermehren, eine Affinitätsreifung, ein Prozess, der die Form der Fab-Epitop-Bindungsstelle "fein abstimmt". Dies liegt daran, dass die Immunglobulin-V-Gene von B-Lymphozyten eine 1000- bis 10.000-mal höhere Mutationsrate aufweisen als andere menschliche Gene im Körper. Diese somatische Hypermutation schafft eine große Chance zur Selektion von Varianten B-Lymphozyten mit noch besser passenden Antigen-Bindungsstellen, die genauer zum Epitop passen. Je länger und fester das Antigen an den B-Zell-Rezeptor bindet, desto größer ist die Chance, dass B-Lymphozyten überleben und sich replizieren. Mit anderen Worten, der "Fit" des Antikörpers kann mit der Zeit verbessert werden. Die Affinitätsreifung findet in den Keimzentren der Lymphknoten statt.

Höchstwahrscheinlich produzieren Menschen mindestens 1011 unterschiedlich geformte BCRs. Denken Sie daran, dass die dreidimensionale Form eines Proteins letztendlich durch die Sequenz seiner Aminosäuren bestimmt wird und die Sequenz der Aminosäuren durch die Reihenfolge der stickstoffhaltigen Basen in den für dieses Protein kodierenden Genen bestimmt wird. Zwischen kombinatorischer Diversität, junktionaler Diversität und Affinitätsreifung gibt es wahrscheinlich Milliarden möglicher Genkombinationen und Neuanordnungen, die für die Fab-Teile eines Antikörpers kodieren können. Die Chancen stehen also gut, dass jeder B-Lymphozyten eine einzigartige Reihe von Gentranslokationen durchführt und in der Lage ist, einen Antikörper mit einer einzigartig geformten Epitop-Bindungsstelle zu produzieren.

Da die Gentranslokation ein zufälliger Prozess ist, bilden einige unreife B-Lymphozyten schließlich B-Zell-Rezeptoren, die zu den körpereigenen Antigenen passen. Unreife B-Lymphozyten mit selbstreaktiven B-Zell-Rezeptoren können stimuliert werden, eine neue Genumlagerung zu durchlaufen, um einen neuen Rezeptor zu bilden, der nicht mehr selbstreaktiv ist. Die Erkennung des Selbstantigens kann Gene reaktivieren, die es dem B-Lymphozyten ermöglichen, neue Leichtketten-V-J-Rekombinationen durchzuführen und es dieser Zelle ermöglichen, einen neuen B-Zell-Rezeptor zu exprimieren. Dieser Vorgang wird als Rezeptorbearbeitung bezeichnet.

Alternativ können auch selbstreaktive B-Lymphozyten einer negativen Selektion unterzogen werden. Da das Knochenmark, in dem die B-Lymphozyten produziert und reifen, normalerweise frei von Fremdstoffen ist, müssen dort substanzbindende B-Lymphozyten "selbst" erkennen und durch Apoptose, einen programmierten Zellselbstmord, eliminiert werden. Apoptose führt zur Aktivierung von Proteasen innerhalb der Zielzelle, die dann die Strukturproteine ​​und DNA der Zelle abbauen.

Zusammenfassung

  1. Die adaptiven Immunantworten haben ein System entwickelt, das die Fähigkeit besitzt, auf jedes erdenkliche Antigen zu reagieren, auf das der Körper schließlich durch einen Prozess namens Gentranslokation treffen könnte.
  2. Gentranslokation ist eine Art Gen-Shuffling-Prozess, bei dem verschiedene Gene entlang eines Chromosoms aus einer Stelle herausgeschnitten und mit anderen Genen entlang des Chromosoms verbunden werden, um eine maximale Anzahl verschiedener B-Zell- und T-Zell-Rezeptoren zu erzeugen.
  3. Jeder B-Lymphozyten wird genetisch so programmiert, dass er einen Antikörper produziert, der als B-Zell-Rezeptor (BCR) mit einem einzigartig geformten Fab fungiert.
  4. Der variable Teil sowohl der schweren als auch der leichten Kette des Antikörpers wird von mehreren Genen kodiert und es gibt mehrere Formen von jedem dieser variablen Gene.
  5. Durch zufällige Gentranslokationen kann jede Kombination der multiplen Formen jedes Gens miteinander verbunden werden, was zu Tausenden von möglichen Genkombinationen führt. Dies wird als kombinatorische Diversität bezeichnet.
  6. Während der Gentranslokation verursachen spezialisierte Enzyme in den B-Lymphozyten Spleißungenauigkeiten, wobei zusätzliche Nukleotide an den verschiedenen Genverbindungen hinzugefügt oder deletiert werden und diese Änderung in der Nukleotidbasensequenz eine noch größere Vielfalt in der Fab-Form erzeugt. Dies wird als junktionale Vielfalt bezeichnet.
  7. Während sich B-Lymphozyten vermehren, durchlaufen sie eine Affinitätsreifung, ein Prozess, der die Form der Fab-Epitop-Bindungsstelle durch eine hohe Rate an somatischer Hypermutation "fein abstimmt". Dies schafft eine großartige Möglichkeit zur Selektion von Varianten B-Lymphozyten mit noch besser passenden Antigen-Bindungsstellen, die genauer zum Epitop passen.
  8. Unreife B-Lymphozyten mit selbstreaktiven B-Zell-Rezeptoren können durch einen Prozess namens Rezeptor-Editierung stimuliert werden, eine neue Genumlagerung zu durchlaufen, um einen neuen Rezeptor herzustellen, der nicht mehr selbstreaktiv ist. Alternativ können selbstreaktive B-Lymphozyten auch einer negativen Selektion unterzogen werden, wobei alle B-Lymphozyten, die Substanzen binden, die als "selbst" erkannt werden, binden und durch Apoptose eliminiert werden.

Fragen

Studieren Sie das Material in diesem Abschnitt und schreiben Sie dann die Antworten auf diese Fragen auf. Klicken Sie nicht einfach auf die Antworten und schreiben Sie sie auf. Dies wird Ihr Verständnis dieses Tutorials nicht testen.

  1. Gentranslokation definieren. (ans)
  2. Beziehen Sie die Gentranslokation mit jedem B-Lymphozyten in Verbindung, der in der Lage ist, einen Antikörper mit einem einzigartig geformten Fab zu produzieren. (ans)
  3. Definieren Sie Folgendes:
    1. kombinatorische Vielfalt (ans)
    2. Affinitätsreifung (ans)

V(D)J-Rekombination

V(D)J-Rekombination ist der Mechanismus der somatischen Rekombination, der nur in sich entwickelnden Lymphozyten während der frühen Stadien der T- und B-Zell-Reifung auftritt. Daraus resultiert das sehr vielfältige Repertoire an Antikörpern/Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die in B-Zellen bzw. T-Zellen zu finden sind. Der Prozess ist ein bestimmendes Merkmal des adaptiven Immunsystems.

Die V(D)J-Rekombination bei Säugetieren tritt in den primären lymphatischen Organen (Knochenmark für B-Zellen und Thymus für T-Zellen) auf und ordnet auf nahezu zufällige Weise Variable (V), Verbinden (J) und in einigen Fällen Diversität ( D) Gensegmente. Der Prozess führt schließlich zu neuartigen Aminosäuresequenzen in den Antigen-bindenden Regionen von Immunglobulinen und TCRs, die die Erkennung von Antigenen von fast allen Krankheitserregern einschließlich Bakterien, Viren, Parasiten und Würmern sowie „veränderten Selbstzellen“ ermöglichen, wie in Krebs. Die Erkennung kann auch allergischer Natur sein (z.B. gegen Pollen oder andere Allergene) oder können zu Wirtsgeweben passen und zu Autoimmunität führen.

1987 erhielt Susumu Tonegawa den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin "für seine Entdeckung des genetischen Prinzips zur Erzeugung von Antikörperdiversität". [1]


13.1D: Erzeugung von Antikörperdiversität - Biologie

Antikörper sind bemerkenswert vielfältig und bieten genügend unterschiedliche Kombinationsstellen, um die Millionen von antigenen Formen in der Umwelt zu erkennen. Es werden tatsächlich mehr Arten von Antikörpern produziert als Gene in unserem Genom. Wie entsteht diese enorme Vielfalt?

Im Laufe des letzten Jahrhunderts wurden eine Reihe von Theorien entwickelt, um die Entstehung dieser Vielfalt zu erklären.

Zu Beginn des Jahrhunderts begann Paul Ehrlich, sich mit dem Problem der immunologischen Spezifität zu befassen. Nach seiner Theorie löste die Kombination eines Antigens mit einem "vorgebildeten B-Zell-Rezeptor", der heute als Antikörper bekannt ist, die Zelle aus, mehr von diesen Rezeptoren zu bilden und zu sezernieren. Ehrlich glaubte, dass eine einzelne Zelle Antikörper produzieren könnte, die an mehr als eine Art von Antigen binden könnten, was heute als falsch bekannt ist. Seine Vorstellungen waren der gegenwärtigen Sichtweise der klonalen Selektion sehr nahe, außer dass er vorschlug, dass es mehrere verschiedene Rezeptoren auf derselben Zelle gibt. Seine Theorie war jedoch entscheidend, da sie zeigte, dass das Immunsystem Rezeptoren herstellen kann, bevor es tatsächlich mit den Antigenen in Kontakt kommt. Ehrlichs Ideen stellten die erste selektive Theorie der Antikörperdiversität dar, die darauf hindeutet, dass die Rolle des Antigens darin besteht, einen komplementären Antikörper auszuwählen und die Produktion dieses Antikörpers zu verstärken.

1930 wurde die Lehr- oder Schablonentheorie aufgestellt. Nach dieser Theorie wird ein Antikörpermolekül in Gegenwart des als Matrize fungierenden Antigens synthetisiert. Diese Theorie wurde später um die Annahme erweitert, dass alle Antikörper die gleiche Primärstruktur hatten, sich jedoch in der Konformation ihrer Polypeptidketten unterschieden. Die Unterstützung für diese Theorie geriet in den 1950er Jahren ins Stocken, als die Verteilungschromatographie zeigte, dass Gammaglobulin eine komplexe Mischung ähnlicher Komponenten ist. Es ist heute bekannt, dass Antikörper wie andere Proteine ​​aus Aminosäuren unter Verwendung von mRNA und nicht von Antigen als Matrize synthetisiert werden.

Eine moderne Version der Selektionstheorie wurde 1955 von Jerne entwickelt. Er postulierte das Vorhandensein von Antikörpern aller potentiellen Spezifitäten im Serum des Individuums. Wenn ein Antigen eingeführt wurde, würde es an den komplementären Antikörper binden und dieser Komplex würde dann von einer Antikörper produzierenden Zelle erkannt. Diese Grundidee führte zu der Theorie, die als klonale Selektion bekannt ist und Ende der 1950er Jahre von Burnet und Talmage entwickelt wurde. Die Fähigkeit, auf Agenten in der Umgebung zu reagieren, ist vorhanden, bevor der Agent eingeführt wird. In dieser Theorie wurde vorgeschlagen, dass Antikörper-Strukturgene im Verlauf der Zellproliferation zufällige somatische Mutationen akkumulieren. Daher entsteht jede Antikörpervariation in einer einzelnen Zelle und wird auf unbestimmte Zeit in den Klonen oder Nachkommen dieser Zelle fortgeführt. Somit würde ein exogenes Antigen Zellen mit einem darauf reagierenden Antikörper beeinflussen, was zu einer Stimulation, Proliferation und Produktion des Antikörpers führt. Der Grund für eine schnellere und effektivere Immunantwort beim zweiten Kontakt mit einem Antigen könnte dadurch erklärt werden, dass ein vorheriger Kontakt mit einem Antigen und die Expansion dieser spezifischen Zellklone zu einer stärkeren Reaktion und einer größeren Anzahl beim zweiten Kontakt führen würden . Die klonale Theorie kann helfen zu erklären, wie Antikörper und Antigene interagieren, aber sie erklärt immer noch nicht, wie Antikörperdiversität erzeugt wird.

Beweise gegen die selektiven und lehrreichen Theorien

1947 zeigte Landsteiner, dass das Immunsystem mit der Produktion eines spezifischen Antikörpers für jede der damals synthetisierten organischen Chemikalien reagieren kann. Es wäre dem Immunsystem nicht möglich, Gene für all diese Antikörper zu besitzen, die gegen künstliche Verbindungen gerichtet sind. Haurowitz lieferte eine Argumentation, die ebenfalls der selektiven Theorie widersprach. Ehrlich kam zu dem Schluss, dass Antikörper im Organismus präformiert werden und die Anwesenheit von Antigen lediglich die normale Antikörpersynthese erhöht. Haurowitz erkannte, dass diese Hypothese nur gültig sein konnte, wenn nur wenige natürliche Antigene existierten. Diese Ideen stützten die lehrreiche Theorie, in der ein flexibler Antikörper von einem Antigen beaufschlagt wird, um eine komplementäre Bindungsstelle zu bilden. Es wurde jedoch nie ein Mechanismus für den vorgeschlagenen "Befehl" entdeckt. Andere Probleme bei dieser Theorie beinhalteten bekannte Eigenschaften der Immunantwort wie das immunologische Gedächtnis und dass das Antigen für sehr lange Zeiträume in der Zelle vorhanden sein musste, damit die Struktur des Antikörpers modifiziert werden konnte. In den frühen 1960er Jahren wurde gezeigt, dass die primäre Aminosäuresequenz die dreidimensionale Struktur von Proteinen und damit von Antikörpern bestimmt. Dies diente als weiterer Beweis gegen die lehrreiche Theorie. Daher wurde die Suche nach einer möglichen Theorie fortgesetzt.

Wenn es zwei Arten von Polypeptidketten gibt und es darin variable und konstante Aminosäuresequenzbereiche gibt, wie ist es dann möglich, dass Gene dafür kodieren? Dreyer und Bennett schlugen vor, dass es separate Gene für die konstanten und variablen Regionen gibt. Es gibt nur wenige konstante Gene und eine große Anzahl variabler Gene. Dies führte zur Entwicklung der Keimbahntheorie. Jeder Organismus hat in seiner Keimbahn ein Gen für jede einzigartige Antikörper-Polypeptidkette der variablen Region, die er synthetisieren kann. Separate Gene in Einzelkopien kodieren jede der konstanten Regionen der schweren und leichten Ketten. Während der Differenzierung wird eine einzelne variable Region mit einem Gen für die konstante Region verbunden. Die zahlreichen Gene der variablen Region entstehen durch chemische Evolution, Genduplikation, Mutation und Selektion. Obwohl diese Theorie teilweise richtig ist, hat sie viele Probleme damit. Bei der tatsächlich vorhandenen Vielfalt müssten etwa 10.000.000 Antikörper in der Keimbahn kodiert sein. Gibt es genug DNA für all diese Kopien? Eine Studie zeigte, dass nur etwa 0,2% des gesamten Genoms benötigt werden, um diese Anzahl von Antikörpern zu kodieren. Andere Studien, die Beweise für diese Theorie zeigen, waren schwer zu finden und werden oft auf der Grundlage der Interpretation argumentiert. In einer solchen Studie über die variablen Regionen von Antikörpern wurde gezeigt, dass die Keimbahn aus vielen Untergruppen besteht. Dies geschah jedoch, indem die Anzahl der Gene der konstanten Region durch Zählen der Sequenzen der variablen Region bestimmt wurde, was immer eine steigende Anzahl von Keimbahngenen ergab . Durch Analysieren der Aminosäuresequenzen auf variable Antikörperregionen kann auch die Variation von Lambda- und Kappa-Ketten gesehen und Untergruppen erkannt werden. Je mehr Untergruppen es gibt, desto mehr Keimbahngene sollte es nach dieser Theorie geben. Eine weitere Studie zur Unterstützung der Keimbahntheorie untersuchte die Vererbung von Idiotypen. Die Idee dabei war, dass, wenn alle Gene der variablen Region in der Keimbahn kodiert würden, Beobachtungen desselben Idiotyps bei Mitgliedern derselben Familie üblich sein sollten. Bei Mäusen wurden diese Beobachtungen in einem solchen Ausmaß gemacht, dass die Keimbahntheorie die einzige Erklärung zu sein schien.

Die somatische Keimbahntheorie fordert das Vorhandensein von nur wenigen variablen Genen in der Keimbahn im Gegensatz zu allen. Die Antikörperdiversität wird durch Mutationen in nur einem Gen der variablen Region erzeugt. Die Mehrheit der nützlichen Antikörper wird durch Mutation dieses kleinen Satzes von Genen der variablen Region produziert und die neu erzeugten Antikörper werden durch Antigene selektiert. Dies führt zu zwei Fragen, ist die Mutationsfrequenz hoch genug und wie funktioniert die Selektion im Immunsystem? In Studien zum Vergleich von Mutationen bakterieller Gene wurde festgestellt, dass die Häufigkeit hoch genug ist. Was die Selektion im Immunsystem anbelangt, so würden nur diejenigen Zellen, die Antikörper produzierten, die an Antigene binden, weiter in Antikörper-sekretierende Plasmazellen und langlebige Gedächtniszellen unterteilt werden. Das Problem bei dieser Theorie besteht darin, dass viele Zellen produziert werden, die nicht durch Antigene selektiert wurden. Auch hier wurden Studien auf der Suche nach Unterstützung für diese Theorie gegenüber der Keimbahntheorie analysiert. In jedem Fall können die erhobenen Daten jedoch unterschiedlich interpretiert werden. Durch das Untersuchen von Aminosäuresequenzen zum Beispiel auf die gleiche Weise wie für die Keimbahntheorie wurde festgestellt, dass einige Reste an Positionen für Sequenzen der variablen Region, die von einer Spezies abgeleitet wurden, für Proteine ​​einer anderen Spezies unterschiedlich waren. Dies würde die Keimbahntheorie widerlegen, da sich die Gene nicht wie andere Proteine ​​durch selektive Prozesse entwickelt haben. Auch durch die Untersuchung der Lambda-Ketten in der Maus wurden strukturelle Informationen gefunden, die zeigen, dass Lambda-Varianten die gleichen Gerüstsequenzen haben und daher die Varianten der Untergruppe durch somatische Mutationen erklärt werden können. Eine andere Studie zeigte, dass die Keimbahntheorie Schwierigkeiten hatte, die Tatsache zu erklären, dass Mutationen auf Keimbahngene verteilt wurden, die sich in jeder anderen Hinsicht unterschieden. Die somatische Theorie erklärt diese Allotypen als Marker für Gerüstregionen über einem oder sehr wenigen Keimbahngenen.

Drei wichtige Quellen der Vielfalt

Es ist klar, dass es keine Theorie gibt, die vollständig erklären konnte, wie Antikörperdiversität erzeugt wird. Vielmehr ist es eine Kombination dieser Theorien, die die beste Erklärung liefert. Für das Problem der Erzeugung von Antikörperdiversität gibt es derzeit drei Lösungen. Erstens gibt es eine somatische Rekombination zwischen Elementen, die ein Gen für die variable Region bilden. Eine Anzahl von Gensegmenten rekombiniert, um den Hauptteil des Gens der variablen Region zu verbinden. Dieser Prozess findet während der B-Zell-Ontogenese statt. Zweitens gibt es mehrere Gene der variablen Region in der Keimbahn. Der dritte Faktor ist die somatische Mutation. Primordiale variable Gene mutieren während der B-Zell-Ontogenese, um unterschiedliche Gene in verschiedenen B-Zell-Klonen zu produzieren.

Die erste Lösung zur Erzeugung von Antikörperdiversität ist die Rekombination von Genen. Viele der Aspekte der Genrekombination wurden im Detail untersucht, insbesondere bei der Maus.

In den 1970er Jahren ermöglichte die Verwendung rekombinanter DNA-Technologie den Forschern, die Sequenz der Gen-Rekombination zu bestimmen. Das erste Beispiel ist die Lambda-Lichterkette. Restriktionsendonukleasen wurden verwendet, um DNA zu verdauen. Es wurde festgestellt, dass zwei separate DNA-Segmente für konstante und variable Regionen kodieren.In Zellen, die keinen aktiven Antikörper produzierten, lagen diese Segmente weit auseinander, aber in vollständig differenzierten B-Zellen sind sie nur 1500 Basenpaare voneinander entfernt. Zwischen den variablen und konstanten Regionen befindet sich ein kurzer DNA-Abschnitt, der als J-Segment bekannt ist und mit dem variablen Segment verbunden ist. Das variable Gen kodiert für die variable Region des Antikörpers bis zur Aminosäure 95 und das J-Segment kodiert für den Rest. Dem Gen für das variable Segment geht eine Signal- oder Leadersequenz voraus. Während der B-Zell-Differenzierung rekombiniert eines der keimbahnvariablen Lambda-Gene mit seinem J-Segment, um eine V-J-Kombination zu bilden. Diese DNA-Sequenz wird dann transkribiert, um ein primäres RNA-Transkript zu bilden, das Introns, Exons und die Leader-Sequenz enthält. Als nächstes werden die Introns gespleißt, um mRNA zu erhalten, die die variablen, J- und konstanten Gene vereint. Dieses wird dann in ein Protein übersetzt.

Die Bildung der leichten Kappa-Kette ist ähnlich. Es ist heterogener, weil es eine größere Anzahl von Genen für variable Segmente gibt. Es gibt nur ein Gen für die konstante Region. Die variablen Segmente befinden sich wiederum weit entfernt vom Gen für die konstante Region. In der Maus sind diese variablen Segmente in Sets organisiert, von denen jedes sieben Gene enthält. Es gibt auch J-Gene und Pseudogene, die nie exprimiert werden (fünf bzw. eines in der Maus). Im Wesentlichen ist der Prozess zur Erzeugung des fertigen Proteins der gleiche wie bei der Lambda-Kette. Bei der Differenzierung der Prä-B-Zelle wird eines der variablen Kappa-Gene aus der Keimbahn mit einem J-Kappa-Segment kombiniert. Ein primäres RNA-Transkript wird erstellt und dieses wird in mRNA umgewandelt, die in das Protein übersetzt wird.

Die Rekombination der schweren Kette ist der Rekombination der leichten Kette mit einigen wichtigen Unterschieden ähnlich. Auch hier gibt es variable, konstante und J-Segmente. Es gibt jedoch auch ein anderes Segment, das als D-Segment bekannt ist. Diese Segmente haben stark variable Sequenzen und die Anzahl der vorhandenen Codons unterscheidet sich auch signifikant zwischen den Segmenten. Mehr als ein D-Segment kann sich einer V-J-Kombination anschließen. Die D-Region kann auch in drei verschiedenen Leserastern gelesen werden, ohne Stop-Codons zu erzeugen, was zur Diversität beiträgt. In der Maus gibt es 30 Keimbahn-D-Segmente.

Die Gene der konstanten Domänenregion befinden sich stromabwärts von den J-Segment-Genen. Alle Immunglobulinklassen verwenden den gleichen Satz variabler Regionsgene. Wenn eine Klasse geändert wird, werden nur die konstanten Domänen der schweren Kette getauscht. Dies wurde durch die Verwendung von Doppelmyelomen gezeigt, bei denen gleichzeitig zwei monoklonale Antikörper im Serum vorhanden sind. Wenn beispielsweise IgM- und IgG-Antikörper gleichzeitig vorhanden sind und analysiert werden, wurde gefunden, dass sie die gleichen leichten Ketten und variablen schweren Regionen besitzen, aber unterschiedliche konstante schwere Kettendomänen haben. Somit werden nur die konstanten schweren Regionen geschaltet. Der Klassenwechsel kann von einer somatischen Mutation begleitet oder vorausgegangen sein.

Der genaue Mechanismus, durch den die Rekombination in jeder dieser Situationen stattfindet, ist noch nicht bekannt. Es gibt jedoch zwei hochkonservierte Signalsequenzen, die auf der J-Seite jedes Variablen- und D-Segments gefunden werden. Die Signalsequenzen sind CACAGTG und ACAAAAAAC und sie sind durch eine Spacersequenz getrennt. Die Spacer-Sequenzen sind entweder 12 Basenpaare lang (im Fall von variablen Kappa-, J-Lambda- und D-Spacern) oder 23 Basenpaare (im Fall von variablen Lambda-, Variable-Heavy- und J-Heavy-Spacern) . Allen Keimbahn-D- und J-Segmenten gehen zwei weitere Sequenzen voraus, die durch eine nicht konservierte Sequenz getrennt sind. Die Sequenzen, die der variablen leichten Kette, der variablen schweren Kette oder dem D-Segment folgen, sind komplementär zu denen, die den J-Lambda-, D- oder J-schweren Segmenten vorausgehen, mit denen sie rekombinieren. Die Rekombination kann durch ein Rekombinase-Enzym bewirkt werden.

Vielfalt in verschiedenen Arten

Obwohl Mäuse und Menschen die variable D- und J-Rekombination verwenden können, erzeugen nicht alle Spezies ihr Immunglobulin-Repertoire durch dieses Verfahren. Bei einigen Arten scheint die variable D- und J-Segment-Rekombination nur dazu zu dienen, die Immunglobulin-Genexpression auf eine B-Zell-Linien-spezifische Weise zu aktivieren. Die Genkonversion (später beschrieben) dient der Schaffung eines Immunglobulin-Repertoires. In den Elasmozweigen ist die Genorganisation der schweren Kette ähnlich der der leichten Lambda-Ketten der Maus. Die Grundeinheit ist variabel schwer - D schwer 1 - D schwer 2 - J schwer - konstant schwer und wird mehrfach wiederholt. Ihre Diversität ist begrenzt, da die Rekombination nur innerhalb jeder Wiederholungseinheit und nicht zwischen verschiedenen Gensegmenten erfolgen kann. Bei Hühnern gibt es eine begrenzte Anzahl von Genen, die für Immunglobuline kodieren. Die leichten Ketten enthalten nur ein variables, ein konstantes und ein J-Segment und die schweren Ketten enthalten nur ein variables und ein J-Segment. Stromaufwärts des variablen Lichtgens befindet sich eine Region, die 25 Sequenzen enthält. Diese Sequenzen besitzen kein Leader-Exon oder eine Promotor-Region. Diese Pseudogene werden im Prozess der Genkonversion verwendet. Abschnitte werden in das Gen der variablen leichten Kette eingefügt. Dieser Prozess setzt sich während der gesamten Lebensdauer der B-Zelle fort, auch nachdem sie den Schleimbeutel verlassen haben. Im Gen für die schwere Kette findet ein ähnlicher Prozess statt, um die Diversität zu erhöhen, wobei über 100 variable schwere Pseudogene verwendet werden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass 70-90% der schweren Ketten von Kaninchen-Immunglobulinen von demselben variablen Gensegment kodiert werden, obwohl viele variable schwere Gene vorhanden sind. Wie in der Vogel-B-Zelle wird die Genkonversion verwendet, um Diversität innerhalb des bevorzugt umgeordneten variablen schweren Gensegments zu erzeugen.

Mehrere Keimbahngene: Die zweite Lösung

Wie viele Keimbahngene gibt es? Die zweite Lösung für die Diversität besteht darin, dass es mehrere Keimbahngene der variablen Region gibt. Es gibt ungefähr 200 variable Kappa-Gensegmente der Maus. Diese Schätzung basiert auf Ergebnissen, die aus der Flüssighybridisierungsanalyse und der Southern-Blot-Analyse erhalten wurden. Die Anzahl der humanen variablen -kappa-Gensegmente beträgt 50. Es wurde auch festgestellt, dass es 2 Maus- und 25 humane variable-Lambda-Gensegmente gibt. Ungefähr 200 Maus- und 100 menschliche variabel-schwere Gensegmente existieren. Die Anzahl der J-kappa-, J-Lambda- und J-schweren Gensegmente variiert je nach Spezies zwischen 4 und 6. Die genaue Anzahl der D-Gensegmente ist noch nicht bekannt. Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung der Anzahl von Gensegmenten, aber eine gängige Methode besteht darin, cDNA-Kopien der variablen Regionen aus Myelomproteinen zu konstruieren, die zu bestimmten Mäuse-Schwer-, Lambda- oder variablen Kappa-Untergruppen gehören (je nachdem, welche Gene eine Zählung von ). Diese cDNA-Kopien werden dann an Restriktionsverdaus von embryonaler Maus-DNA hybridisiert. Die durchschnittliche Anzahl von Restriktionsfragmenten, die durch Southern-Filter-Hybridisierungsanalyse beobachtet wurden, wird bestimmt. Dies repräsentiert die Anzahl der Gene pro Untergruppe. Die Aminosäuresequenzierung der variablen Regionen der Maus bestimmt die Anzahl der existierenden Untergruppen. Durch Multiplizieren der Anzahl der Gene pro Untergruppe mit der Anzahl der Untergruppen kann die Gesamtzahl der Gensegmente bestimmt werden.

Der dritte wichtige Prozess, der an der Erzeugung von Diversität beteiligt ist, ist die somatische Mutation, eine strukturelle Veränderung, die ein Gen durchlaufen kann. Dies kann spontan oder unter bestimmten Umgebungsbedingungen geschehen. Es ist ein Prozess, der bei der B-Zell-Reifung auftritt, der die Antikörper-Genregion beeinflusst und die Verfeinerung der Antikörper-Spezifität ermöglicht. Es ist bekannt, dass in allen Genabschnitten somatische Mutationen auftreten und dies zu weiterer Diversität führt. In Studien an der Maus wurde festgestellt, dass eine Mutation an den V-Lambda-, V-Kappa- und V-Schwerketten stattfand.

In der V-Lambda-Kette gibt es ein einzelnes Lambda-Variable-Region-Gen für jede der beiden Lambda-V-Region-Untergruppen. Von den Untergruppen gibt es ein V-Lambda2-Protein und neun verschiedene V-Lambda1-Proteine. Bei einem direkten Vergleich des Proteins mit der DNA kann gesagt werden, dass eine somatische Mutation zu den 8 varianten V-lambda1-Proteinen geführt haben muss. Da bei der Maus wahrscheinlich über zwanzig Lambda-Proteine ​​existieren, können bis zu zwanzig Varianten von einem einzigen Keimbahngen abgeleitet werden.

Im V-Kappa-Segment verwenden Antikörper, die an der Reaktion auf Phosphorylcholin bei Mäusen beteiligt sind, eine Gruppe von Genen der variablen Region der schweren Kette und mindestens drei Gruppen von Genen der V-Kappa-Region der leichten Kette. Diese sind beispielhaft in Maus-Myelomen in den Proteinsequenzen MOPC167 und MOPC511 zu sehen. Da keine dieser Sequenzen in der Keimbahn nachweisbar ist, müssen sie durch eine somatische Mutation aus dem als V-kappa bekannten Gen entstanden sein167.

In den V-schweren Segmenten haben hier Studien gezeigt, dass auch somatische Mutationen aufgetreten sind. Eine Studie ergab zum Beispiel, dass es vier eng verwandte, aber nicht identische Mitglieder des T15 V-schweren Gens gibt. Diese Mitglieder sind wahrscheinlich aufgrund einer somatischen Mutation entstanden.

Ist das neu angeordnete Gen das einzige, das einer Mutation unterliegt, oder unterliegt auch das Keimbahngen? Bei der B-Zell-Reifung ist bekannt, dass sich ein V-Segment von einem Allel an ein J-Segment anschließt und das gegenüberliegende Allel ausschließt. Kann also eine Mutation im nicht umgeordneten allelischen Gen stattfinden? Die Antwort darauf wurde gefunden, als sich das nicht umgeordnete Gen in der Keimbahn befand und daraus geschlossen werden konnte, dass eine somatische Mutation nur im umgeordneten Gen auftritt. Diese Entdeckung führte zu der Vermutung, dass die Umlagerung ein Auslöser für somatische Mutationen sein könnte. In Studien von Gearhart (1983), in denen sechs umgeordnete V-kappa167-Gene kloniert und mit den Sequenzen der Keimbahngene verglichen wurden, wurde eine somatische Mutation innerhalb und um das VJ-Gen herum nachgewiesen, jedoch nicht in der Mitte zwischen dem VJ und dem konstanten, und nicht in und um das konstante Segment. Die Mutationshäufigkeit im V-J-Segment betrug 0,4 %, und viele wiesen umfangreiche Mutationen in einem Bereich um das V-J-Gen auf. An entfernten Stellen wurden keine Mutationen gefunden. Die gefundenen Mutationen waren meist auf Nukleotidsubstitutionen zurückzuführen, ohne dass Transitionen oder Transversionen bevorzugt wurden. Die Mutationen schienen auch in Clustern aufzutreten, die wahrscheinlich durch eine fehleranfällige Reparatur verursacht wurden, die während der Zyklen der Zellteilung auftritt. Daher kamen die Studien von Gearhart zu dem Schluss, dass somatische Mutationen in neu angeordneten Genen in Clustern aufgrund einer Art fehlerhafter Reparaturmechanismen auftreten.

Ein weiterer Einfluss somatischer Mutationen auf die Antikörperdiversität besteht darin, dass sie, wenn sie in großem Umfang auftritt, dazu beiträgt, Antikörper mit höheren Affinitäten für Antigene zu produzieren. Dies geschieht, wenn Antigene mit T-Zellen reagieren und so B-Zellen stimulieren, Oberflächenantikörper mit geringer Affinität zu exprimieren. Weitere Wachstums- und Differenzierungsfaktoren werden eine stärkere Proliferation und Differenzierung der Antikörper-bildenden Zelle induzieren. Dies wird durch Antigene selektiert. Dieses Potenzial der somatischen Mutation zur Steigerung der Affinität wurde durch ortsspezifische Mutagenese nachgewiesen, um Antikörper, die diese Transformation durchlaufen haben, zu rekonstruieren. Dies erhöht auch die Möglichkeit, dass ein Antikörper bei Wechselwirkung mit einem Antigen Veränderungen erfahren kann, die entweder zu einer Abnahme oder einer Zunahme der Reaktivität mit einem Antigen führen.

Die Zeit in der B-Zell-Differenzierung, wenn eine Mutation auftritt, wurde auch unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern aus variablen Keimbahnregionen untersucht. Es zeigte sich, dass Antikörper von IgM und IgG während der ersten sieben Tage nach Antigenexposition keine somatischen Mutationen aufwiesen. Antikörper, die 14 Tage oder länger nach der Exposition gebildet wurden, hatten viele Basenänderungen erfahren. Sobald die somatische Mutation begonnen hat, treten wiederholte Runden über einen Zeitraum von nur wenigen Zellteilungen auf, und somit führen nachfolgende Antigen-Expositionen zu einer fortschreitenden Erhöhung der Affinität des Antikörpers für das Antigen. Alle Basenänderungen treten jedoch nicht während einer Zellteilung auf, und es ist wahrscheinlich, dass die somatische Mutation ausgeschaltet wird, wenn sich die B-Zelle zu einer Plasmazelle differenziert, die große Mengen an Antikörper sezerniert.

Die drei Hauptfaktoren, die die Bildung von Antikörperdiversität beeinflussen, sind nicht die einzigen. Viele andere Mechanismen und Merkwürdigkeiten beeinflussen auch das Ausmaß der Vielfalt.

Pseudogenen, die in allen Arten von Segmenten vorkommen, fehlen die notwendigen Basensequenzen, um eine Rekombination zu ermöglichen, wodurch sie effektiv zu einem Intron werden. Es wird angenommen, dass bis zu einem Drittel der Keimbahngene Pseudogene sind. Pseudogene bewirken die Diversität, indem sie die Anzahl der Gensegmente verringern, die an der Bildung des Antikörpers beteiligt sind. Die genaue Rolle von Pseudogenen ist jedoch nicht bekannt. Sie können bei Rekombinationsereignissen auftreten und den Umfang des Repertoires erhöhen, obwohl sie nicht funktionsfähig sind. Elemente von Pseudogenen können durch Genkonversion (wird später diskutiert) in funktionelle Gene eingeführt werden, wodurch die Diversität erhöht wird.

Eine andere Situation, die zu größerer Diversität führt, ist die Addition von Nukleotiden zwischen den D- und J-Schwerkettensegmenten und zwischen den variablen Schwerkettensegmenten und D-Segmenten. Dieser Prozess wird durch das Enzym terminale Desoxynukleotidtransferase erleichtert. Dies ist als N-Region-Diversität bekannt.

Auch die Paarung von Leichtketten und Schwerketten hat einen Einfluss auf die Diversität der Antikörper. Die große Menge experimenteller Daten legt nahe, dass irgendeine Form von zufälliger kombinatorischer Paarung von schweren Ketten und leichten Ketten verwendet werden kann, um die Antikörperdiversität zu amplifizieren. Es gibt Hinweise darauf, dass sich verschiedene Leichtketten mit den gleichen Schwerketten verbinden können. In der BALB/c-Maus kodiert das gleiche T15-Gen für die schwere Kette, aber es gibt drei verschiedene Gene für die leichte Kette für den Antiphosphorylcholin-Antikörper. Jede dieser leichten Ketten ist in der Lage, sich mit der einzelnen schweren Kette zu verbinden, so dass es drei Familien von Antiphosphorylcholin-Antikörpern gibt.

Die Genkonversion ist ein weiterer wichtiger Faktor bei der Erzeugung von Antikörperdiversität. Genkonversion ist der Mechanismus, bei dem zwei eng verwandte Gene so interagieren, dass die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz des einen mit dem anderen identisch wird. Dieser Prozess wurde in Hefe gezeigt und kann bei Säugetieren vorhanden sein. Ein Säugetier von besonderem Interesse ist das Kaninchen. Die chromosomale Region der schweren Kette bei Kaninchen ähnelt der anderer Säugetiere, außer dass ein variables schweres Gen (V-h1) bevorzugt verwendet wird, wenn zufällige Kombinationen, die die mehreren variabel-schweren, D-schweren und J-schweren Gensegmente verbinden, nicht a Hauptbeitrag zur Antikörperdiversität. Was trägt in diesen Fällen am meisten zur Antikörperdiversität bei? In den Studien von Becker und Knight (1990) an sieben Kaninchen-V-D-J-Genen identifizierten sie mindestens fünf potenzielle Genkonversionsereignisse. Die hohe Häufigkeit dieser Ereignisse legt nahe, dass die Genkonversion ein wichtiges Mittel zur Erzeugung von Antikörperdiversität bei Kaninchen ist. Es kann somatisch oder zwischen Keimbahngenen auftreten, da der Prozess entweder bei der Meiose oder Mitose auftreten kann. Es kann für die Konservierung von Immunglobulin-Gerüstregionen über verschiedene Untergruppen oder Arten verantwortlich sein. Wenn es während der Differenzierung auftritt, kann die Diversität durch die Herstellung von "Hybrid"-Molekülen verstärkt werden, die Segmente exprimieren, die von mehreren verwandten Genen kodiert werden. In diesem Bereich sind noch weitere Untersuchungen erforderlich.

Ein weiteres Ereignis, das zu einer größeren Antikörperdiversität führt, ist der Austausch rekombinatorischer Signalsequenzen. Dies tritt auf, wenn die Signalsequenzen eines variabel-schweren Gensegments intakt an das 5'-Ende einer D-Jh-kodierenden Sequenz fusioniert werden, was zum Verlust von Nukleotiden aus der D-Jh-Sequenz führen kann. Dies kann durch die abwechselnde Auflösung eines Zwischenprodukts bei der Vh-zu-D-Jh-Rekombination verursacht werden. Dieses Auftreten bietet die Möglichkeit, das Targeting von Immunglobulin-Gensegmenten zu verändern. Dies kann auch das Auftreten der Vh-Jh-Verbindung in vivo erklären, bei der die D-Sequenz eliminiert wird.

The Future Appears Bright Antikörper sind natürlich sehr wichtig für uns und es ist ersichtlich, dass in den letzten 100 Jahren viele Theorien aufgestellt wurden, um ihre Vielfalt zu erklären. Ehrlichs Theorien, einschließlich seiner selektiven Theorie, führten zu Beginn des Jahrhunderts, obwohl falsch, schließlich zur Postulierung der klonalen Selektionstheorie. Auch die Lehr- oder Schablonentheorie erwies sich als falsch, aber die entstandenen Ideen inspirierten auch zu weiteren Untersuchungen. In der zweiten Hälfte des Jahrhunderts erfreuten sich zwei neue gegensätzliche Theorien der größten Beliebtheit als Quellen für die Antikörperdiversität. Diese Theorien, die Keimbahntheorie und die somatische Mutationstheorie, wurden ziemlich intensiv erforscht und die Ergebnisse zeigten nie eindeutig auf einen der beiden Mechanismen. Am Ende wurde entschieden, dass beide Theorien richtig waren und dass sie mit anderen Faktoren wie der Rekombination kombiniert wurden, um Diversität zu erzeugen. Einige der Faktoren, die zur Diversität von Antikörpern beigetragen haben, sind Pseudogene, Genkonversion, N-Region-Diversität und die unterschiedliche Paarung von leichten und schweren Ketten sowie der Signalsequenzersatz. Es wurde auch festgestellt, dass verschiedene Arten unterschiedliche Rekombinationsereignisse durchlaufen können, die zu einer erhöhten oder verringerten Diversität führen. Letztendlich wurde in dieser Arbeit versucht, einige der vielen Faktoren, die die Antikörperdiversität beeinflussen, kurz anzusprechen. In Zukunft wird es sicher noch mehr Entdeckungen und ein besseres Verständnis für das vorliegende Problem geben.

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Antikörper-Genumlagerung und Diversität In vivo

Vor der Synthese von Ig-Ketten müssen jedoch Ig-Gene innerhalb eines Genoms sich differenzierender Zellen zusammengesetzt werden (Rearrangement). Der allgemeine Zusammenbauprozess auf hoher Ebene für den Zusammenbau des Gens der schweren Kette und der leichten Kette und die Translation in eine IgG-Antikörpersequenz ist in 2 dargestellt , und JH, Vκ und Jκ Segmente oder Vλ und Jλ Segmente und Paarung der schweren und leichten Ketten, um das primäre Antikörperrepertoire zu erzeugen. Der Prozess der Ig-Diversifikation beim Menschen ist sehr komplex und hierarchisch mit den fünf Stadien der B-Zell-Entwicklung im Knochenmark gekoppelt, wobei jede biochemische und genetische Stufe für den nächsten Schritt benötigt und einer Zellentwicklungsstufe zugeordnet wird.

Abb. 2 Antikörper-Gen- und Protein-Assemblierung in vivo

Abkürzungen: C: konstante Kette D: Diversity-Segment J: Verbindungskette V: variable Kette. Beachten Sie, dass der Einfachheit halber nur einzelne V-, J-, D- und C-Regionen gezeigt werden, diese jedoch aus einer großen Anzahl von Genen ausgewählt werden. Die wichtigsten Prozesse, die zum nächsten Schritt der Antikörper-Assemblierung führen, sind auf der linken Seite angegeben. RNA-Transkripte sind durch "AAA" gekennzeichnet, das die Poly-A-Schwänze bezeichnet.

Die folgenden Antigen-unabhängigen Schritte in der B-Zell-Entwicklung laufen im Knochenmark ab:

  1. Stammzellen-Schwerketten (IGH) und Kappa (κ) und Lambda (λ) Leichte Ketten (IGK und IGL) Gene befinden sich in Keimbahnkonfiguration.
  2. Frühe Pro-B-Zelle – IGH durchläuft eine D-J-Genumlagerung mit Verlust von DNA zwischen den verbundenen D- und J-Segmenten. Nach Induktion des rekombinationsaktivierenden Gens 1 (RAG1), RAG2 und TdT in den Pro-B-Zellen werden die DH- und JH-Gensegmente zuerst durch einen RAG-1,2-abhängigen Prozess verbunden.
  3. Späte Pro-B-Zelle – IGH erfährt eine V-DJ-Umlagerung (VDJ-Umlagerung) mit DNA-Verlust zwischen den verbundenen V- und D-Segmenten. Die Rekombination kann etwas ungenau sein, da während dieses Prozesses mehrere Nukleotide von einer Verbindungsstelle entfernt oder an diese hinzugefügt werden können, so dass eine Kombination von VDJ-Segmenten von H-Ketten zu einer großen Anzahl möglicher Sequenzen (dh Antikörpern) führt. Dieser Umordnungsprozess, bekannt als kombinatorisches Fügen, ist die vorherrschende Quelle für Antikörper
  4. Kleine Prä-B-Zelle – V-J-Umlagerung von Gen(en) der leichten Kette. Die κ-Kette wird zuerst umgeordnet, dann, wenn die Umlagerung beider κ-Allele nicht erfolgreich ist, wird die λ-Kette umgeordnet.
  5. Große Prä-B-Zelle – intrazelluläre Expression und vorübergehende Oberflächenexpression der m-Kette mit invarianter pseudoleichter Kette (Prä-B-Zell-Rezeptor). Eine erfolgreiche Zelloberflächenexpression des Prä-B-Zellrezeptors löst einen allelischen Ausschluss aus, um eine Neuordnung des zweiten Allels zu verhindern, und initiiert auch eine Prä-B-Zell-Proliferation, was zu unterschiedlichen leichten Ketten führt, die mit derselben Neuordnung der schweren Kette in verschiedenen Tochterzellen übereinstimmen.

In der Peripherie finden folgende Antigen-abhängige Schritte der B-Zell-Entwicklung statt:

  1. Unreife B-Zelle – IgM-Oberflächenexpression. Im gängigsten Szenario verbindet sich zuerst ein VDJ-Segment mit Cμ Gene, und anschließend mit Cγ, Cε, Cα Gene, mit Synthese einer kompletten H-IgM-Kette usw. Ohne eine assoziierte L-Kette ist eine Oberflächenexpression nicht möglich und nur zytoplasmatisch μ gefunden wird (Prä-B-Zellen).
  2. Reife naive B-Zelle – IgD und IgM exprimiert auf der Zelloberfläche, hergestellt aus alternativ gespleißten Transkripten.
  3. Lymphoblast – alternatives Spleißen führt zu sekretiertem IgM.
  4. Gedächtnis-B-Zelle – Isotypwechsel zu IgG. Die somatische Hypermutation von IGH tritt im Keimzentrum der Lymphknoten auf. Mutiertes Ig wird auf verbesserte Antigenbindung in einem als Affinitätsreifung bezeichneten Prozess selektiert.
  5. Eine Untergruppe von B-Zellen, die Oberflächen-IgD und IgM exprimieren, unterliegt einer weiteren DNA-Umlagerung, einem Klassenwechsel, der zur Expression von IgG, IgA oder IgE führt, die konstante IgH-Region und damit die mit dem Ig assoziierten Effektorfunktionen ändert, ohne die Spezifität zu ändern
  6. Eine Untergruppe von B-Zellen überlebt als langlebige Gedächtnis-B-Zellen, die schnell auf Antigene reagieren und sich zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen differenzieren.
  7. Terminal differenzierte Plasmazelle – alternatives Spleißen liefert sowohl membrangebundenes als auch sezerniertes Ig.

Der Mechanismus der Genumlagerung wird hier detailliert beschrieben:

Die VDJ-Rekombination erfolgt über eine präzise DNA-Spaltung, die durch die RAG-Proteine ​​(RAG-1 und RAG-2) an kurzen konservierten Signalsequenzen initiiert wird [128]. Was auch immer ihre genaue Rolle ist, die koordinierte Expression in pre-B ist für die Neuordnung der Ig-Gene essentiell, aber die RAG-Aktivität ist in reifen Lymphozyten ausgeschaltet. Umlagerungen werden sorgfältig orchestriert, nach dem Prinzip der Allelischer Ausschluss, das heißt, in jeder B-Zelle wird das Genprodukt von nur einem von jedem Chromosomenpaar transkribiert. Das Gen, das sich auf dem zweiten Chromosom befindet, wird normalerweise nicht verwendet, um die zeitgenössische Synthese von H-Ketten mit unterschiedlichen V-Domänen in einer bestimmten Zelle zu verhindern Allel, ein Begriff, der zwei Gene oder zwei oder mehr alternative Formen eines einzelnen Gens bezeichnet, die dasselbe besetzen Ort. Das Gen auf dem zweiten Chromosom wird nicht umgelagert, es sei denn, es kommt zu einer unproduktiven Umlagerung, wenn Umlagerungen auf beiden Chromosomen unproduktiv sind, kommt es zum Zelltod, wodurch geklärt wird, warum die gleichen B-Lymphozyten während ihrer gesamten Lebensspanne nur eine einzige Art von L-Kette produzieren können (κ oder ). Ig V-, D- und J-Gensegmente werden flankiert von konservierten Rekombinationssignalsequenzen (RSS), bestehend aus einem Heptamer und einem Noname, die durch einen nicht konservierten Spacer von entweder 12 oder 23 Nukleotiden getrennt sind. Die 12–23 Basenpaarregel, die zuerst postuliert wurde, um die Ig-Genumlagerung zu erklären. Während einer Umlagerung kann sich ein Gen mit einer flankierenden Sequenz, die einen Spacer von 12 Basenpaaren enthält, praktisch nur an ein Gen anschließen, dessen flankierende Sequenz einen Spacer von 23 Basenpaaren hat und umgekehrt, wodurch die genaue Reihenfolge der Ig-Gen-Transkriptionen aufgeklärt wird. Erstens erkennt RAG-1 RSS und bildet einen Komplex von RAG-1/RAG-2, der eine einzelne DNA-Sequenz schneidet. Und dann wird eine Haarnadel durch Addition von Kopien der letzten Nukleotide der kodierenden Region (Templat oder “P”-Additionen) oder durch zufällige Nukleotidadditionen durch das Enzym TdT (TdT, “N”-Additionen) gebildet. Die Verbindung der kodierenden Enden der umgeordneten Gensegmente ist aufgrund von Basenadditionen, Basenverlusten und Out-of-Frame-Joining ungenau. Diese Ungenauigkeit beim Verbinden erzeugt eine “junktionale” Vielfalt. In T-Zellen (T-Lymphozyten) gibt es einen ähnlichen Mechanismus der Genumlagerung.

Das Prinzip der Antikörperdiversität ist vollständig verstanden. Es besteht eine sehr enge Beziehung zwischen der Aminosäuresequenz und der Antikörperfunktion. Wie wir wissen, gibt es zwischen zwei Antikörpern, die fast die gleiche Aminosäure haben, eine große unterschiedliche Funktion, selbst wenn eine Aminosäure unterschiedlich ist. Auf dieser Grundlage ist die Genauigkeit der Antikörpersequenzierung in der verwandten Forschung sehr wichtig. Creative Biolabs bietet Weltklasse de novo Antikörper-Sequenzierungsservicemit 100 % Genauigkeit für Forschung, Diagnostik und Therapie.

Referenz: Anne Davidson. Die Rolle von Genumlagerungen variabler Regionen bei der Erzeugung von Autoantikörpern. Zeitgenössische Immunologie. S. 177-19.


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Klonnummern

Jede Klonnummer stellt eine spezifische Zelllinie dar, die verwendet wurde, um den Antikörper zu produzieren. Da Antikörper von mehr als einem Wirt produziert werden, erhält jede geklonte Zelllinie eine einzigartige Klonnummer. Jeder Hybridomzellklon produziert nur einen einzigen reinen Antikörpertyp.

  • Ein Tier, dem ein Antigen injiziert wird, erzeugt mehrere Antikörper gegen viele Epitope. Da Antikörper von B-Zellen produziert werden, kann ein einzelner Klon von B-Zellen Antikörper nur gegen ein einzelnes Epitop produzieren.
  • Monoklonale Antikörper werden aus einem einzigen Zellklon gewonnen und können in größeren Mengen erzeugt werden.
  • Polyklonale Antikörper enthalten mehrere Klone von Antikörpern, die gegen verschiedene Epitope auf dem Antigen produziert werden. Wenn beispielsweise vier Epitope auf dem Antigen vorhanden sind, werden vier verschiedene Klone von Antikörpern produziert.
  • Unterschiedliche Antikörperklone können unterschiedliche Eigenschaften aufweisen und können sogar unterschiedliche Isotypen aufweisen. Sie können auch in verschiedenen Anwendungen funktionieren. Daher ist es am besten, einen Antikörperklon auszuwählen, der für die von Ihnen gewählte Anwendung optimal funktioniert.
  • Es ist wichtig zu erkennen, dass eine Klonnummer nicht gleichbedeutend ist mit der Chargennummer, die oft das Herstellungsdatum angibt.

Spielt MMR eine direkte oder indirekte Rolle bei SHM und CSR?

Die Tatsache, dass MSH2-defiziente Mäuse die SHM-Spektren, die Häufigkeit von CSR und die Eigenschaften der Rekombinationsstellen in CSR verändern, legt nahe, dass MMR bei beiden Prozessen eine direkte und wichtige Rolle spielt (Martin und Scharff 2002a). Einige Forscher haben jedoch vorgeschlagen, dass die Defekte in diesen Prozessen bei den MMR-defizienten Mäusen aufgrund der genomischen Instabilität in sich schnell teilenden B-Zellen zu einem Stillstand der B-Zell-Entwicklung oder zum Verlust apoptotischer oder anderer Signale führten (Frey et al. 1998 Vora et al., 1999). Diese Besorgnis ergibt sich auch aus der Beobachtung, dass die bei MSH2 –/– bzw des MMR-Prozesses und würde voraussichtlich zu den gleichen Mängeln führen (zur Übersicht vgl. Martin und Scharff 2002a). Dieses Rätsel wird durch die Beobachtung verschlimmert, dass die S-Kreuzungen bei Mäusen mit Mängeln an verschiedenen MMR-Proteinen unterschiedlich aussehen. Es wurde erwartet, dass die Sequenzen dieser Rekombinationsstellen die stattgefundenen biochemischen Prozesse aufdecken würden (Stavnezer 2000). Die Sμ-Sγ3-Verbindungen von Milz-B-Zellen von MSH2-defizienten Mäusen, die in vitro zum Umschalten stimuliert wurden, zeigten kürzere Mikrohomologien, mehr stumpfe Verbindungen und mehr Insertionen als Wildtyp-Mäuse (Schrader et al. 2002). Unerwarteterweise wiesen PMS2- oder MLH1-defiziente Mäuse längere Mikrohomologien in den S-Kreuzungen auf als Wildtyp-Mäuse (Ehrenstein et al. 2001 Schrader et al. 2002). Darüber hinaus weisen Mäuse mit doppeltem MSH2/MLH1-Mangel ähnliche Switching Junctions auf wie MLH1-, aber nicht Mäuse mit MSH2-Mangel, obwohl Mäuse mit doppeltem und einfachem Mangel ein ähnliches Ausmaß der Verringerung des Wechsels zu verschiedenen Isotypen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen aufweisen (Schrader et al. 2003). Besonders interessant ist, dass ATPase-defiziente MSH2-Mäuse einen gemischten Phänotyp von Switching Junctions aufweisen, d. Martin et al., 2003). Es ist schwierig, die Bedeutung unterschiedlich großer Mikrohomologien und Insertionen in S-Verbindungen bei Mäusen zu erklären, denen verschiedene MMR-Proteine ​​fehlen. Da der genaue Mechanismus der CSR zum jetzigen Zeitpunkt noch unklar ist, werden zusätzliche in-vivo- und in-vitro-Experimente erforderlich sein, um dies zu klären.

Trotz dieser Unsicherheiten ist es schwer vorstellbar, wie diese Unterschiede in den Mutationsmustern in SHM und den Eigenschaften der S-Verbindungen als Ergebnis eines unspezifischen Stillstands in der B-Zell-Entwicklung entstehen könnten, daher scheinen diese Beobachtungen eine direkte Rolle zu stützen für MMR in SHM und CSR. Eine direkte Rolle von MMR bei SHM wird weiter durch unsere jüngste Beobachtung gestützt, dass Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) mit Antikörpern gegen Exo1 und Mlh1 zeigt, dass sie physikalisch mit der V-Region assoziiert sind, aber nicht mit der C-Region in BL2-Zellen, die SHM durchlaufen (PD Bardwell und MD Scharff, unveröffentlicht). Darüber hinaus weisen mutierte MSH2-ATPase-Mäuse, denen die Reparatur von Fehlpaarungen mangelhaft ist, aber die Fähigkeit zur Signalisierung für Apoptose beibehalten, die Eigenschaften von SHM und CSR auf, die denen von MSH2-kompletten Knock-out-Mäusen ähnlich sind, was darauf hindeutet, dass es sich um die MMR-Aktivität an sich handelt eher am Antikörper-Diversifizierungsprozess beteiligt als an der Auslösung der Apoptose (Martin et al. 2003).


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Leichte und schwere Ketten bestehen aus konstanten und variablen Bereichen

Der Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener Antikörpermoleküle zeigt ein auffallendes Merkmal mit wichtigen genetischen Implikationen. Sowohl leichte als auch schwere Ketten haben eine variable Sequenz an ihren N-terminalen Enden, aber eine konstante Sequenz an ihren C-terminalen Enden. Folglich sind beim Vergleich der Aminosäuresequenzen vieler verschiedener κ-Ketten die C-terminalen Hälften gleich oder zeigen nur geringfügige Unterschiede, während die N-terminalen Hälften alle sehr unterschiedlich sind. Lichterketten haben a konstanter Bereich etwa 110 Aminosäuren lang und eine variable Region gleicher Größe. Die variable Region der schweren Ketten (an ihrem N-Terminus) ist ebenfalls etwa 110 Aminosäuren lang, aber die konstante Region der schweren Kette ist je nach Klasse etwa drei- oder viermal länger (330 oder 440 Aminosäuren). 24-30).

Abbildung 24-30

Konstante und variable Regionen von Immunglobulinketten. Sowohl leichte als auch schwere Ketten eines Antikörpermoleküls haben unterschiedliche konstante und variable Regionen.

Es sind die N-terminalen Enden der leichten und schweren Ketten, die zusammenkommen, um die Antigenbindungsstelle zu bilden (siehe Abbildung 24-21), und die Variabilität ihrer Aminosäuresequenzen liefert die strukturelle Grundlage für die Vielfalt der Antigenbindung Websites. Die Diversität in den variablen Regionen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten ist zum größten Teil auf drei kleine hypervariable Regionen in jeder Kette beschränkt, die restlichen Teile der variablen Region, bekannt als Rahmenregionen, sind relativ konstant. Nur die 5� Aminosäuren in jeder hypervariablen Region bilden die Antigen-Bindungsstelle (Abbildung 24-31). Als Ergebnis ist die Größe der antigenen Determinante, die ein Antikörper erkennt, im Allgemeinen vergleichsweise klein. Es kann beispielsweise auf der Oberfläche eines globulären Proteins aus weniger als 25 Aminosäuren bestehen.

Abbildung 24-31

Hypervariable Antikörperregionen. Stark schematisierte Zeichnung, wie die drei hypervariablen Regionen in jeder leichten und schweren Kette zusammen die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpermoleküls bilden.


Die Erzeugung von Vielfalt: Theorie der klonalen Selektion und der Aufstieg der molekularen Immunologie

In den letzten Jahrzehnten war die Immunologie eines der spannendsten – und erfolgreichsten – Gebiete der biomedizinischen Forschung. In den letzten dreißig Jahren haben Immunologen ein detailliertes Verständnis des einzigartigen Erkennungsmechanismus des Immunsystems und der zellulären und chemischen Mittel erworben, die verwendet werden, um eindringende Organismen zu zerstören oder zu neutralisieren. Dieses Verständnis wurde im Sinne der klonalen Selektionstheorie formuliert, der vorherrschenden Erklärung des Immunverhaltens. Diese Geschichte ist das Thema von Die Generation der Vielfalt.

Ein großes Problem für Immunologen bestand seit langem darin, herauszufinden, wie Zellen des Immunsystems Millionen verschiedener Antikörper produzieren können – und diese nach Bedarf produzieren. Die Theorie der klonalen Selektion erklärt, dass Zellen mit genetischen Anweisungen zur Produktion jedes Antikörpers in geringer Zahl im Körper existieren, bis die Exposition gegenüber dem richtigen Molekül – dem Antigen – das selektive Klonen auslöst, das genau die benötigte Zelle reproduziert. Aber wie kann man aus solch begrenztem genetischem Material so viele verschiedene Antikörper-produzierende Zellen erzeugen? Die Lösung dieser Frage ergab sich aus neuen Anwendungen der Molekularbiologie, und wie die Autoren argumentieren, veränderten die Auswirkungen der neuen Techniken sowohl die Methoden als auch die Konzepte der Immunologie.

Die Generation der Vielfalt ist eine Geistesgeschichte des großen theoretischen Problems der Immunologie und seiner Lösung in der Zeit nach dem Zweiten Weltkrieg. Es wird Immunologen einen wesentlichen Hintergrund zum Verständnis der konzeptionellen Konflikte liefern, die heute auf diesem Gebiet auftreten.


Die Erzeugung von Antikörperdiversität in der Schildkröte

Die Ab-Reaktion bei Reptilien wurde auf Proteinebene untersucht, und bei Schildkröten ähneln einige Aspekte denen kaltblütiger Wirbeltiere anderer Klassen. Die genetischen Grundlagen für diese Merkmale sind nicht klar. Die vorliegende Studie ist die erste über die IgH-Organisation und -Komplexität eines Reptilien-Ig-Gensystems. Der Ansatz zum Klonen von Schildkröten-(Pseudemys scripta)-Sequenzen basiert vollständig auf PCR, und seine Wirksamkeit wird durch das Erhalten umfassender Informationen über ein bisher unerforschtes Ig-Gensystem demonstriert. Eine Reihe von genomischen VH-Sequenzen, die möglicherweise vier Familien repräsentieren, wurden isoliert, ebenso wie ein genomischer C mu 4 -Klon. Diese als Sonden verwendeten Sequenzen lieferten den Beweis, dass es in der Schildkröte einen einzelnen IgH-Locus mit mehreren VH-Genen und einem C-mu-Gen gibt. Bei Northern-Hybridisierungen wies die C mu 4 -Sonde zwei Transkripte der vier VH-Gruppen nach, nur eine wurde exprimiert und mehrere Banden zeigten die Anwesenheit von mindestens zwei Nicht-mu-Transkripten an. Unter Verwendung von reverser Transkriptions-PCR an Milz- oder Leber-RNA wurde eine IgM-Schwerkettensequenz erhalten, ebenso wie eine Reihe von VDJ-Umlagerungen. Unter 32 einzigartigen VDJ-Rearrangements von einem Tier gab es 22 Sequenzvarianten an Gerüst 4, was entweder auf eine sehr große Anzahl von J-Segmenten oder eine somatische Modifikation in der variablen Region hindeutet. Die letztere Interpretation wird durch Punktmutationen unterstützt, die in Rahmen 3 und CDR3 gefunden wurden. Die Anzahl der Änderungen ist deutlich höher als die abgeleitete Taq-Fehleinbaurate (0,05 %).