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4.11.7: Doppelsträngige DNA-Viren - Pockenviren - Biologie

4.11.7: Doppelsträngige DNA-Viren - Pockenviren - Biologie


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Die Pockenviren sind eine Familie von großen, komplexen, umhüllten DNA-Viren, die eine Vielzahl von Wirbeltier- und Wirbellosenwirten infizieren.

Lernziele

  • Untersuchen Sie Pockenviren auf ihre Bedeutung für menschliche Krankheiten und Forschung

Wichtige Punkte

  • Das bekannteste der Pockenviren waren die Pocken. Pocken sind eine von zwei ausgerotteten Infektionskrankheiten, die andere ist die Rinderpest, die 2011 für ausgerottet erklärt wurde.
  • Die am häufigsten vorkommende und einfachste infektiöse Form des Pockenvirus-Partikels, das reife Virion, besteht aus dem viralen DNA-Genom, das in einen proteinartigen Kern und eine äußere Lipoproteinmembran eingeschlossen ist.
  • Pockenviren weisen ein zeitlich reguliertes Genexpressionsprogramm auf: frühe, intermediäre und späte Gene treiben die DNA-Replikation an, gefolgt von der Expression von Strukturproteinen, die für den Zusammenbau von Nachkommen-Virionen notwendig sind.

Schlüsselbegriffe

  • rekombinant: Dieser Begriff bezieht sich auf etwas, das durch die Kombination vorhandener Elemente zu einer neuen Kombination entsteht. Daher bezieht sich der Begriff rekombinante DNA auf einen Organismus, der im Labor durch Hinzufügen von DNA einer anderen Spezies geschaffen wurde.
  • Lipoprotein: Jeder aus einer großen Gruppe von Protein- und Lipidkomplexen mit vielen biochemischen Funktionen.

Die Pockenviren sind eine Familie von großen, komplexen, umhüllten DNA-Viren, die eine Vielzahl von Wirbeltier- und Wirbellosenwirten infizieren. Pockenviren sind aufgrund ihrer weiten Verbreitung, Pathogenität und ihres zytoplasmatischen Replikationszyklus sowohl medizinisch als auch wissenschaftlich von Bedeutung. Mehrere prominente Mitglieder, darunter das Variolavirus (Erreger der Pocken), das Molluscum contagiosum-Virus (Verursacher einer häufigen Hautinfektion bei Kleinkindern und immunsupprimierten Erwachsenen) und das Affenpockenvirus (Erreger einer pockenähnlichen Krankheit in Teilen Afrikas), sind von große Sorge um die öffentliche Gesundheit und die biologische Verteidigung.

Das bekannteste der Pockenviren waren die Pocken. Pocken waren eine beim Menschen einzigartige Infektionskrankheit, die durch eine der beiden Virusvarianten Variola major und Variola minor verursacht wurde. Die Krankheit ist auch unter den lateinischen Namen Variola oder Variola vera bekannt, was eine Ableitung des lateinischen varius bedeutet, was „gefleckt“ oder varus bedeutet, was „Pickel“ bedeutet. ” Der Begriff „Pocken“ wurde erstmals in Großbritannien im 15.NS Jahrhundert, um Variola von den „großen Pocken“ (Syphilis) zu unterscheiden. Der letzte natürlich vorkommende Pockenfall (Variola minor) wurde am 26. Oktober 1977 diagnostiziert. Nach Impfkampagnen im 19.NS und 20NSJahrhundert bestätigte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) 1979 die Ausrottung der Pocken. Pocken sind eine von zwei ausgerotteten Infektionskrankheiten, die andere ist die Rinderpest, die 2011 für ausgerottet erklärt wurde.

Das prototypische und am besten untersuchte Pockenvirus, das Vacciniavirus (VACV), dient als wirksamer Pockenimpfstoff, als Plattform für rekombinante Impfstoffe gegen andere Krankheitserreger und als effizienter Genexpressionsvektor für die Grundlagenforschung. Entlang seines doppelsträngigen DNA-Genoms von ungefähr 195 kbp kodiert VACV ungefähr 200 Proteine, deren Funktion von viraler RNA- und DNA-Synthese und Virion-Assemblierung bis hin zur Modulation der Immunabwehr des Wirts reicht.

Die am häufigsten vorkommende und einfachste infektiöse Form des Pockenvirus-Partikels, das reife Virion (MV), besteht aus dem viralen DNA-Genom, das von einem proteinartigen Kern und einer äußeren Lipoproteinmembran mit ungefähr 60 bzw. 25 assoziierten viralen Proteinen umhüllt ist. Nach Anheftung an Zelloberflächen und Fusion mit der Plasma- oder Endosomenmembran wird die Replikation des Pockenvirus durch den Eintritt des Viruskerns in das Zytoplasma initiiert, wo alle nachfolgenden Schritte des Lebenszyklus stattfinden. Poxvirus-Kerne beherbergen die virale DNA-abhängige RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren, die für die Expression früher Gene erforderlich sind, die fast die Hälfte des viralen Genoms ausmachen und Proteine ​​kodieren, die für die DNA-Replikation und die intermediäre Gentranskription benötigt werden, sowie eine große Anzahl von Immunmodulatoren.

Pockenviren weisen ein zeitlich reguliertes Genexpressionsprogramm auf, d. h. die Expression von frühen Genen, die für DNA-Replikation und intermediäre Transkriptionsfaktoren kodieren, löst die Expression von intermediären Genen aus, die für späte genspezifische Transkriptionsfaktoren kodieren. Späte Genprodukte bestehen hauptsächlich aus Strukturproteinen, die für den Zusammenbau von Nachkommen-Virionen benötigt werden, sowie aus Enzymen, die für den Einbau in Nachkommen-Virionen bestimmt sind und für die frühe Genexpression während der nächsten Infektionsrunde verwendet werden. Der Aufbau des MV umfasst mehr als 80 virale Genprodukte. Darüber hinaus erwirbt eine Untergruppe von Nachkommen-MVs während des Durchgangs durch das Zytoplasma zwei zusätzliche Membrandoppelschichten, von denen eine während der Exocytose des Partikels verloren geht, um das weniger häufige umhüllte Virion (EV) zu ergeben. Somit ist ein EV im Wesentlichen ein MV mit einer zusätzlichen Membran, in der mindestens sechs einzigartige Proteine ​​assoziiert sind. EVs unterscheiden sich antigen von MVs und sind wichtig für eine effiziente Virusverbreitung im infizierten Wirt und den Schutz vor Immunabwehr. Im Gegensatz dazu werden MVs bei der Zelllyse freigesetzt und können für die Übertragung von Tier zu Tier wichtig sein.


Forscher entdecken, wie sich Pockenviren wie Pocken schnell entwickeln – trotz niedriger Mutationsraten

SEATTLE – 16. August 2012 – Pockenviren, eine Gruppe von DNA-haltigen Viren, zu denen auch die Pocken zählen, sind für eine Vielzahl von Krankheiten bei Mensch und Tier verantwortlich. Sie sind hochgradig virulent und in der Lage, Artengrenzen zu überwinden, doch wie sie dies tun, war aufgrund ihrer geringen Mutationsraten weitgehend ein Rätsel.

Während die Pocken 1980 von der Weltgesundheitsorganisation als offiziell ausgerottet galten, haben Bedenken hinsichtlich ihrer Verwendung als Bioterrorismus-Erreger – und die Feststellung, dass andere Pockenviren wie Affenpocken von Tieren auf Menschen übertragen werden können – ein erneutes Interesse an der Frage geweckt, wie sie replizieren. Diese Informationen könnten zur Entwicklung besserer antiviraler Strategien führen.

Neue Forschungen von Wissenschaftlern des Fred Hutchinson Cancer Research Center und kooperierender Institutionen haben aufgedeckt, wie sich Pockenviren entwickeln, um sich trotz ihrer geringen Mutationsraten schnell an die Abwehr des Wirts anzupassen.

Die Entdeckung liefert neue Erkenntnisse darüber, wie große, doppelsträngige DNA-Viren die Immunität des Wirts umgehen und arzneimittelresistent werden, und sie hat besondere Auswirkungen auf das Verständnis der Mechanismen der Übertragung von Infektionskrankheiten zwischen Tieren und Menschen.

Der Seniorautor Harmit S. Malik, Ph.D., ein Mitglied der Basic Sciences Division des Hutchinson Center, und der Erstautor Nels C. Elde, Ph.D., ein ehemaliger Postdoktorand in Maliks Labor, beschreiben ihre Ergebnisse online vor der 17. August Druckausgabe von Zelle.

„Pockenviren kodieren eine Vielzahl von Genen, die ihnen helfen, der Immunabwehr des Wirts entgegenzuwirken und Infektionen zu fördern“, sagte Elde, jetzt Assistenzprofessor für Humangenetik an der University of Utah School of Medicine. „Trotz zahlreicher Beweise dafür, dass das Genom des Pockenvirus adaptive Veränderungen durchlaufen kann, um die sich entwickelnde Abwehr des Wirts zu überwinden, wissen wir immer noch nicht so viel über die Mechanismen, die an dieser Anpassung beteiligt sind.“

Um die Anpassungsmechanismen zu bestimmen, führten Elde, Malik und Kollegen ein Experiment in Zellkultur mit Vacciniavirus durch, dem Pockenvirustyp, der im Pockenimpfstoff verwendet wird, um die virale Anpassung und Evolution, wie sie in der Natur vorkommt, nachzuahmen.

Frühere Forschungen hatten gezeigt, dass ein Protein zur Abwehr des Wirts namens Proteinkinase R (PKR) eine große Hürde für eine Pockenvirusinfektion darstellt. Als Reaktion darauf haben sich Pockenviren entwickelt, um PKR zu überwinden, indem sie zwei Gene codieren, K3L und E3L, die die Abwehrmechanismen des Wirts vereiteln, die normalerweise eine Virusinfektion verhindern.

Das Team untersuchte, wie sich das Vacciniavirus, wenn es so verändert wurde, dass es das E3L-Gen deletiert, so entwickelt hat, dass es sich in Gegenwart von menschlicher PKR erfolgreich repliziert.

„Die serielle Vermehrung dieses ‚schwächeren‘ Virus führte auf dramatische Weise schnell zu Stämmen, die sich in menschlichen Zellen viel erfolgreicher replizieren“, sagte Malik, der auch ein Early Career Scientist am Howard Hughes Medical Institute ist.

Eine genauere Untersuchung ihres Anpassungsmodus ergab, dass das Virus die PKR schnell besiegen konnte, indem es die Anzahl der Kopien des K3L-Gens in seinem Genom selektiv erhöhte.

Malik verglich diese schnelle Anpassung mit der Ausdehnung des Blasebalgs eines musikalischen Akkordeons. „Mit der Zunahme der K3L-Kopienzahl in nachfolgenden Replikationsrunden stieg auch die Expression des K3L-Proteins und die anschließende Hemmung der Immunantwort“, sagte er. Dies zeigte, dass Viren, die ihr Genom schnell erweitern können, einen unmittelbaren evolutionären Vorteil gegenüber denen haben, die dies nicht können.

In einer weiteren Erweiterung der Akkordeon-Analogie beobachteten die Forscher neben der Beobachtung einer schnellen Genexpansion im E3L-defizienten Vaccinia-Stamm auch, dass sich das Virus nach dem Erwerb einer adaptiven Mutation zusammenzog und eine vorteilhafte Mutation gegen einen kleineren genomischen Fußabdruck eintauschte.

„Unsere Studien deuten darauf hin, dass Genexpansionen trotz ihrer vorübergehenden Natur ein wirksames Mittel zur Anpassung bei Pockenviren darstellen können, sodass sie entweder Immun- oder pharmakologische Herausforderungen überleben können“, sagte Malik. „Das Erkennen der Mittel, mit denen sie diese Expansion durchlaufen, kann effektivere antivirale Strategien gegen diese und verwandte wichtige Krankheitserreger bieten.“

Die Forschung wurde von den National Institutes of Health, der National Science Foundation, dem Howard Hughes Medical Institute und der Life Sciences Research Foundation finanziert. Neben Forschern des Hutchinson Centers und der University of Utah School of Medicine waren auch Mitarbeiter der University of Washington School of Medicine an der Studie beteiligt.


Forscher enthüllen das Innenleben eines viralen DNA-Verpackungsmotors

BILD: Drei Studien haben gezeigt, wie ein viraler DNA-Verpackungsmotor funktioniert und möglicherweise Erkenntnisse für neue Therapeutika oder synthetische molekulare Maschinen liefern. Jedes der fünf Proteine ​​knüllt sich ein. Mehr anzeigen

Bildnachweis: Joshua Pajak, Duke University

DURHAM, N.C. – Eine Gruppe von Forschern hat das detaillierte Innenleben des molekularen Motors entdeckt, der genetisches Material in doppelsträngige DNA-Viren verpackt. Der Fortschritt bietet Einblicke in einen kritischen Schritt im Reproduktionszyklus von Viren wie Pox-Herpes- und Adeno-Viren. Es könnte auch Forscher inspirieren, die mikroskopische Maschinen basierend auf natürlich vorkommenden Biomotoren entwickeln.

Die Forschung wurde von Wissenschaftlern der Duke University, der University of Minnesota, der University of Massachusetts und der University of Texas Medical Branch (UTMB) durchgeführt. Die Ergebnisse erscheinen online in einer Trilogie von Veröffentlichungen in Wissenschaftliche Fortschritte, Proceedings of the National Academy of Sciences und Nukleinsäureforschung.

"Es gab mehrere fehlende Informationen, die uns daran hinderten, die Funktionsweise dieser Art von DNA-Verpackungsmotoren zu verstehen, was unsere Fähigkeit behinderte, Therapeutika zu entwickeln oder neue Technologien zu entwickeln", sagte Gaurav Arya, Professor für Maschinenbau und Materialwissenschaften, Biomedizinische Technik, und Chemie bei Duke. "Aber mit neuen Erkenntnissen und Simulationen konnten wir ein Modell dieses fantastischen Mechanismus zusammenstellen, der das detaillierteste ist, das jemals für diese Art von System erstellt wurde."

Viren gibt es in vielen Varianten, aber ihre Klassifizierung hängt im Allgemeinen davon ab, ob sie ihre genetischen Baupläne in RNA oder einzel- oder doppelsträngige DNA kodieren. Der Unterschied ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung und beeinflusst, wie das genetische Material in neue Viren verpackt wird. Während einige Viren einen Proteinbehälter namens Kapsid um neu produzierte RNA oder DNA bauen, erzeugen andere zuerst das Kapsid und füllen es dann mit dem genetischen Material.

Die meisten doppelsträngigen DNA-Viren gehen den letzteren Weg, der viele Herausforderungen mit sich bringt. DNA ist negativ geladen und möchte nicht auf engstem Raum zusammengepfercht werden. Und es ist in eine extrem dichte, fast kristalline Struktur verpackt, die auch viel Kraft erfordert.

"Der Vorteil davon ist, dass, wenn das Virus bereit ist, eine neue Zelle zu infizieren, der Druck dabei hilft, DNA in die Zelle zu injizieren, sobald sie punktiert ist", sagte Joshua Pajak, ein Doktorand, der in Aryas Labor arbeitet. "Es wurde geschätzt, dass der Druck 800 PSI überschreitet, was fast das Zehnfache des Drucks in einer verkorkten Flasche Champagner ist."

Um DNA bei diesem Druck in ein winziges Kapsid zu zwingen, ist ein extrem leistungsstarker Motor erforderlich. Bis vor kurzem hatten die Forscher nur eine vage Vorstellung davon, wie dieser Motor funktioniert, da er schwer zu visualisieren ist. Der Motor setzt sich nur auf dem im Vergleich zum Motor enormen Viruspartikel zusammen.

"Der Versuch, den mit dem Virus verbundenen Motor zu sehen, ist wie der Versuch, die Details in der Fackel der Freiheitsstatue zu sehen, indem man ein Foto der gesamten Statue macht", sagte Pajak.

Aber auf einer kürzlich durchgeführten Konferenz erfuhr Pajak, dass Marc Morais, Professor für Biochemie und Molekularbiologie an der UTMB, und Paul Jardine, Professor für diagnostische und biologische Wissenschaften an der University of Minnesota, seit Jahren an diesem Motor arbeiteten und die Ausrüstung und Fähigkeiten, die erforderlich sind, um die Details zu sehen. Einige ihrer ersten Ergebnisse schienen den Modellen zu entsprechen, die Pajak mit den wenigen Informationen baute, die bereits verfügbar waren. Die Gruppe war begeistert, dass ihre einzelnen Ergebnisse zu einem gemeinsamen Mechanismus führten, und machte sich schnell daran, das Geheimnis des Virusmotors gemeinsam zu lösen.

In einem Papier veröffentlicht in Wissenschaftliche Fortschritte, lösten Morais und seine Kollegen die Details des gesamten Motors in einer seiner Konfigurationen. Sie fanden heraus, dass der Motor aus fünf Proteinen besteht, die ringförmig miteinander verbunden sind. Jedes dieser Proteine ​​ist wie zwei Saugnäpfe mit einer Feder dazwischen, die es dem unteren Teil ermöglicht, sich in einer helikalen Formation vertikal zu bewegen, damit er am helikalen Rückgrat der DNA greifen kann.

"Da man etwa 100.000 dieser Motoren auf einen Stecknadelkopf stecken könnte und sie alle wackeln, war es schwierig, sie genau zu betrachten", sagte Morais. "Aber nachdem meine UTMB-Kollegen Michael Woodson und Mark White uns geholfen hatten, sie mit einem Kryo-Elektronenmikroskop abzubilden, ergab sich ein allgemeiner Rahmen des Mechanismus."

In einem zweiten Artikel, veröffentlicht in Nukleinsäureforschung, nahm die Morais-Gruppe den Motor in einer zweiten Konfiguration mit Röntgenkristallographie auf. Diesmal waren die unteren Saugnäpfe des Motors alle zu einem ebenen Ring zusammengeknüllt, was die Forscher vermuten ließ, dass der Motor DNA in das Virus transportieren könnte, indem er zwischen den beiden Konfigurationen ratschete.

Um diese Hypothese zu testen, führten Pajak und Arya Hochleistungssimulationen auf Anton 2 durch, dem schnellsten Supercomputer, der derzeit für Molekulardynamiksimulationen verfügbar ist. Ihre Ergebnisse unterstützten nicht nur den vorgeschlagenen Mechanismus, sondern lieferten auch Informationen darüber, wie genau sich die Zahnräder des Motors zwischen den beiden Konfigurationen verdrehen.

Während die Oberseiten der Proteine ​​statisch mit dem Viruspartikel verbunden bleiben, bewegen sich ihre unteren Hälften in einem zyklischen Muster auf und ab, das von einem energietragenden Molekül namens ATP angetrieben wird. Sobald sich alle Proteine ​​nach oben bewegt haben - die DNA mitgeschleppt - setzen die Proteine ​​das Nebenprodukt der chemischen ATP-Reaktion frei. Dies führt dazu, dass der untere Ring die DNA freisetzt und wieder in ihren ursprünglichen helikalen Zustand zurückreicht, wo sie erneut an mehr ATP und DNA greifen, um den Vorgang zu wiederholen.

"Joshua hat viele Hinweise und Informationen zusammengetragen, um dieses Modell zu erstellen", sagte Arya. „Aber ein Modell ist nur dann sinnvoll, wenn es neue Erkenntnisse vorhersagen kann, die wir noch nicht wussten.“

Im Kern besteht das Modell aus einer Reihe mechanischer Aktionen, die zusammenpassen und nacheinander ablaufen müssen, damit alles richtig funktioniert. Die Simulationen von Pajak sagten eine bestimmte Reihe von mechanischen Signalen voraus, die dem Boden der Proteine ​​sagen, ob sie die DNA greifen sollten oder nicht. Wie eine Reihe von fallenden Dominosteinen sollte das Entfernen eines der Signalwege aus der Mitte die Kettenreaktion stoppen und das Signal blockieren.

Um diese Vorhersage zu bestätigen, wandten sich die Forscher an Jardine und ihre Kollegen Shelley Grimes und Dwight Anderson, um zu sehen, ob das Entfernen eines der Signaldominosteine ​​den Motor tatsächlich daran hinderte, DNA zu verpacken. Ein drittes Papier, veröffentlicht in PNAS, zeigt, dass die Sabotage funktioniert hat. Nachdem ein Domino im Signalweg so mutiert war, dass er nicht mehr funktionieren konnte, konnte der Motor immer noch genauso gut Kraftstoff binden und verbrennen, aber es war viel schlimmer, DNA tatsächlich zu verpacken.

„Der neue Mechanismus, der von den hochauflösenden Strukturen und den detaillierten Vorhersagen vorhergesagt wurde, lieferte einen höheren Detaillierungsgrad als wir je zuvor hatten“, sagte Jardine. "Dadurch konnten wir die Rolle kritischer Komponenten des Motors testen und somit die Gültigkeit dieses neuen Mechanismus nach unserem derzeitigen Verständnis beurteilen."

Das Ergebnis ist ein starker Hinweis darauf, dass das Modell der Beschreibung des Verhaltens des Motors in der Natur sehr nahe kommt. Die Gruppe plant, ihren hochintegrierten strukturellen, biochemischen und Simulationsansatz fortzusetzen, um das vorgeschlagene Modell weiter zu testen und zu verfeinern. Sie hoffen, dass dieses grundlegende Verständnis möglicherweise eines Tages zur Bekämpfung von Krankheiten oder zur Entwicklung eines synthetischen molekularen Motors genutzt werden könnte.

„Alle Technologien sind auf die eine oder andere Weise von der Natur inspiriert“, sagte Arya. "Jetzt, da wir wirklich wissen, wie dieser molekulare Motor funktioniert, wird er hoffentlich andere Forscher inspirieren, neue Erfindungen mit denselben Mechanismen zu machen."

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM118817, GM122979, GM127365) und der National Science Foundation (MCB1817338) unterstützt. Kryo-EM-Daten wurden auch in NIH-unterstützten regionalen Kryo-EM-Bildgebungseinrichtungen (1U24 GM116787-01, 1U24 GM116792-01) gesammelt. Die Simulationen wurden auf dem Supercomputer Anton 2 durchgeführt, der von D.E. Shaw Research und gehostet im Pittsburgh Supercomputing Center über das NIH (R01GM116961) und den Comet-Supercomputer, der über die NSF im San Diego Supercomputer Center gehostet wird (ACI-1053575).

"Virale Verpackungs-ATPasen nutzen einen Glutamat-Schalter, um die ATPase-Aktivität und die DNA-Translokation zu koppeln." Joshua Pajak, Rockney Atz, Brendan J. Hilbert, Marc C. Morais, Brian A. Kelch, Paul Jardine und Gaurav Arya. PNAS, 27. April 2021 118 (17) e2024928118. DOI: 10.1073/pnas.2024928118

„Ein virales Genom-Packaging-Motorübergänge zwischen zyklischer und helikaler Symmetrie zur Translokation von dsDNA“, Michael Woodson, Joshua Pajak, Bryon P. Mahler, Wei Zhao, Wei Zhang, Gaurav Arya, Mark A. White, Paul J. Jardine und Marc C. Morais. Wissenschaftliche Fortschritte, 07. Mai 2021: Vol. 1 7, nein. 19, eabc1955. DOI: 10.1126/sciadv.abc1955

„Atomistische Basis der Krafterzeugung, Translokation und Koordination in einem Viral Genome Packaging Motor“, Joshua Pajak, Erik Dill2, Emilio Reyes-Aldrete, Mark A. White, Brian A.Kelch, Paul J. Jardine, Gaurav Arya1 und Marc C. Morais. Nukleinsäureforschung, 2021. DOI: 10.1093/nar/gkab372

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Forscher enthüllen das Innenleben eines viralen DNA-Verpackungsmotors

3D-Modell der DNA. Quelle: Michael Ströck/Wikimedia/ GNU Free Documentation License

Eine Gruppe von Forschern hat das detaillierte Innenleben des molekularen Motors entdeckt, der genetisches Material in doppelsträngige DNA-Viren verpackt. Der Fortschritt bietet Einblicke in einen kritischen Schritt im Reproduktionszyklus von Viren wie Pocken-, Herpes- und Adenoviren. Es könnte auch Forscher inspirieren, die mikroskopische Maschinen basierend auf natürlich vorkommenden Biomotoren entwickeln.

Die Forschung wurde von Wissenschaftlern der Duke University, der University of Minnesota, der University of Massachusetts und der University of Texas Medical Branch (UTMB) durchgeführt. Die Ergebnisse erscheinen online in einer Trilogie von Veröffentlichungen in Wissenschaftliche Fortschritte, Proceedings of the National Academy of Sciences und Nukleinsäureforschung.

"Es gab mehrere fehlende Informationen, die uns daran hinderten, die Funktionsweise dieser Art von DNA-Verpackungsmotoren zu verstehen, was unsere Fähigkeit behinderte, Therapeutika zu entwickeln oder neue Technologien zu entwickeln", sagte Gaurav Arya, Professor für Maschinenbau und Materialwissenschaften, Biomedizinische Technik, und Chemie bei Duke. "Aber mit neuen Erkenntnissen und Simulationen konnten wir ein Modell dieses fantastischen Mechanismus zusammenstellen, der das detaillierteste ist, das jemals für diese Art von System erstellt wurde."

Viren gibt es in vielen Varianten, aber ihre Klassifizierung hängt im Allgemeinen davon ab, ob sie ihre genetischen Baupläne in RNA oder einzel- oder doppelsträngige DNA kodieren. Der Unterschied ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung und beeinflusst, wie das genetische Material in neue Viren verpackt wird. Während einige Viren einen Proteinbehälter namens Kapsid um neu produzierte RNA oder DNA bauen, erzeugen andere zuerst das Kapsid und füllen es dann mit dem genetischen Material.

Drei Studien haben gezeigt, wie ein viraler DNA-Verpackungsmotor funktioniert und möglicherweise Erkenntnisse für neue Therapeutika oder synthetische molekulare Maschinen liefern. Jedes der fünf Proteine ​​zerknittert der Reihe nach und zieht die DNA mit sich, bevor sie sich wieder in ihr ursprüngliches Helixmuster zurückversetzt. Bildnachweis: Joshua Pajak, Duke University

Die meisten doppelsträngigen DNA-Viren gehen den letzteren Weg, der viele Herausforderungen mit sich bringt. DNA ist negativ geladen und möchte nicht auf engstem Raum zusammengepfercht werden. Und es ist in eine extrem dichte, fast kristalline Struktur verpackt, die auch viel Kraft erfordert.

"Der Vorteil davon ist, dass, wenn das Virus bereit ist, eine neue Zelle zu infizieren, der Druck dabei hilft, DNA in die Zelle zu injizieren, sobald sie punktiert ist", sagte Joshua Pajak, ein Doktorand, der in Aryas Labor arbeitet. "Es wurde geschätzt, dass der Druck 800 PSI überschreitet, was fast das Zehnfache des Drucks in einer verkorkten Flasche Champagner ist."

Um DNA bei diesem Druck in ein winziges Kapsid zu zwingen, ist ein extrem leistungsstarker Motor erforderlich. Bis vor kurzem hatten die Forscher nur eine vage Vorstellung davon, wie dieser Motor funktioniert, da er schwer zu visualisieren ist. Der Motor setzt sich nur auf dem im Vergleich zum Motor enormen Viruspartikel zusammen.

"Der Versuch, den mit dem Virus verbundenen Motor zu sehen, ist wie der Versuch, die Details in der Fackel der Freiheitsstatue zu sehen, indem man ein Foto der gesamten Statue macht", sagte Pajak.

Aber auf einer kürzlich durchgeführten Konferenz erfuhr Pajak, dass Marc Morais, Professor für Biochemie und Molekularbiologie an der UTMB, und Paul Jardine, Professor für diagnostische und biologische Wissenschaften an der University of Minnesota, seit Jahren an diesem Motor arbeiteten und die Ausrüstung und Fähigkeiten, die erforderlich sind, um die Details zu sehen. Einige ihrer ersten Ergebnisse schienen den Modellen zu entsprechen, die Pajak mit den wenigen Informationen baute, die bereits verfügbar waren. Die Gruppe war begeistert, dass ihre einzelnen Ergebnisse zu einem gemeinsamen Mechanismus führten, und machte sich schnell daran, das Geheimnis des Virusmotors gemeinsam zu lösen.

In einem Papier veröffentlicht in Wissenschaftliche Fortschritte, lösten Morais und seine Kollegen die Details des gesamten Motors in einer seiner Konfigurationen. Sie fanden heraus, dass der Motor aus fünf Proteinen besteht, die ringförmig miteinander verbunden sind. Jedes dieser Proteine ​​ist wie zwei Saugnäpfe mit einer Feder dazwischen, die es dem unteren Teil ermöglicht, sich in einer helikalen Formation vertikal zu bewegen, damit er am helikalen Rückgrat der DNA greifen kann.

"Da man etwa 100.000 dieser Motoren auf einen Stecknadelkopf stecken könnte und sie alle wackeln, war es schwierig, sie genau zu betrachten", sagte Morais. "Aber nachdem meine UTMB-Kollegen Michael Woodson und Mark White uns geholfen hatten, sie mit einem Kryo-Elektronenmikroskop abzubilden, ergab sich ein allgemeiner Rahmen des Mechanismus."

In einem zweiten Artikel, veröffentlicht in Nukleinsäureforschung, nahm die Morais-Gruppe den Motor in einer zweiten Konfiguration mit Röntgenkristallographie auf. Diesmal waren die unteren Saugnäpfe des Motors alle zu einem ebenen Ring zusammengeknüllt, was die Forscher vermuten ließ, dass der Motor DNA in das Virus transportieren könnte, indem er zwischen den beiden Konfigurationen ratschete.

Um diese Hypothese zu testen, führten Pajak und Arya Hochleistungssimulationen auf Anton 2 durch, dem schnellsten Supercomputer, der derzeit für Molekulardynamiksimulationen verfügbar ist. Ihre Ergebnisse unterstützten nicht nur den vorgeschlagenen Mechanismus, sondern lieferten auch Informationen darüber, wie genau sich die Zahnräder des Motors zwischen den beiden Konfigurationen verdrehen.

Während die Oberseiten der Proteine ​​statisch mit dem Viruspartikel verbunden bleiben, bewegen sich ihre unteren Hälften in einem zyklischen Muster auf und ab, das von einem energietragenden Molekül namens ATP angetrieben wird. Sobald sich alle Proteine ​​nach oben bewegt haben – die DNA mit sich ziehend – setzen die Proteine ​​das Nebenprodukt der chemischen ATP-Reaktion frei. Dies führt dazu, dass der untere Ring die DNA freisetzt und wieder in ihren ursprünglichen helikalen Zustand zurückreicht, wo sie erneut an mehr ATP und DNA greifen, um den Vorgang zu wiederholen.

"Joshua hat viele Hinweise und Informationen zusammengetragen, um dieses Modell zu erstellen", sagte Arya. „Aber ein Modell ist nur dann sinnvoll, wenn es neue Erkenntnisse vorhersagen kann, die wir noch nicht wussten.“

Im Kern besteht das Modell aus einer Reihe mechanischer Aktionen, die zusammenpassen und nacheinander ablaufen müssen, damit alles richtig funktioniert. Die Simulationen von Pajak sagten eine bestimmte Reihe von mechanischen Signalen voraus, die dem Boden der Proteine ​​sagen, ob sie die DNA greifen sollten oder nicht. Wie eine Reihe von fallenden Dominosteinen sollte das Entfernen eines der Signalwege aus der Mitte die Kettenreaktion stoppen und das Signal blockieren.

Um diese Vorhersage zu bestätigen, wandten sich die Forscher an Jardine und ihre Kollegen Shelley Grimes und Dwight Anderson, um zu sehen, ob das Entfernen eines der Signaldominosteine ​​den Motor tatsächlich daran hinderte, DNA zu verpacken. Ein drittes Papier, veröffentlicht in PNAS, zeigt, dass die Sabotage funktioniert hat. Nachdem ein Domino im Signalweg so mutiert war, dass er nicht mehr funktionieren konnte, konnte der Motor immer noch genauso gut Kraftstoff binden und verbrennen, aber es war viel schlimmer, DNA tatsächlich zu verpacken.

„Der neue Mechanismus, der von den hochauflösenden Strukturen und den detaillierten Vorhersagen vorhergesagt wurde, lieferte einen höheren Detaillierungsgrad als wir je zuvor hatten“, sagte Jardine. "Dadurch konnten wir die Rolle kritischer Komponenten des Motors testen und somit die Gültigkeit dieses neuen Mechanismus nach unserem derzeitigen Verständnis beurteilen."

Das Ergebnis ist ein starker Hinweis darauf, dass das Modell der Beschreibung des Verhaltens des Motors in der Natur sehr nahe kommt. Die Gruppe plant, ihren hochintegrierten strukturellen, biochemischen und Simulationsansatz fortzusetzen, um das vorgeschlagene Modell weiter zu testen und zu verfeinern. Sie hoffen, dass dieses grundlegende Verständnis möglicherweise eines Tages zur Bekämpfung von Krankheiten oder zur Entwicklung eines synthetischen molekularen Motors genutzt werden könnte.

„Alle Technologien sind auf die eine oder andere Weise von der Natur inspiriert“, sagte Arya. "Jetzt, da wir wirklich wissen, wie dieser molekulare Motor funktioniert, wird er hoffentlich andere Forscher inspirieren, neue Erfindungen mit denselben Mechanismen zu machen."


Pathogenese

Influenza-Übertragung und Krankheitsmechanismen

Influenzaviren werden durch große Tröpfchen der Atemwege durch Husten, Niesen oder Sprechen oder durch Kontakt mit infizierten Oberflächen übertragen [54]. Influenzaviren binden an Zuckereinheiten auf der Oberfläche von Epithelzellen der Atemwege, wo eine frühe Virusreplikation, -vermehrung und -ausscheidung während einer durchschnittlichen Inkubationszeit von 1𠄲 Tagen stattfindet [55�]. Die maximale Virusreplikation tritt typischerweise innerhalb von 4 Tagen nach Einsetzen der Symptome auf und verschwindet innerhalb von 7� Tagen, was bei Kindern und immungeschwächten Wirten länger anhält [58�]. Im Durchschnitt infiziert eine Person 𠅎in bis zwei weitere Personen, diese Reproduktionszahl (R0) variiert je nach Virusstamm und sozialen und Umweltfaktoren [61]. Eine Virusinfektion beeinträchtigt die Schleimhautbarriere der Atemwege und zerstört die Alveolarkapillarmembran, was zum Austritt von Flüssigkeit und Entzündungszellen in den Alveolarraum führt, was den Gasaustausch beeinträchtigt und zu einer Hypoxämie führt [62, 63]. Bakterielle Koinfektion erschwert oft schwere Fälle, die zu Atemversagen und Tod führen, mit Staphylococcus aureus und Streptokokken-Arten als vorherrschende Kopathogene [64]. Die saisonale Influenzavirusinfektion ist weitgehend auf die Atemwege beschränkt, H5- und H7-HPAI-Viren haben jedoch eine polybasische Spaltstelle innerhalb des Hämagglutinins, die eine Replikation außerhalb der Atemwege ermöglicht [65, 66]. Eine Infektion mit einem Influenza-Stamm verleiht keine vollständige Immunität gegenüber anderen Stämmen oder Subtypen [67].

Masernübertragung und Krankheitsmechanismen

Masern gehören zu den am höchsten ansteckenden Atemwegsinfektionen, die durch den Kontakt mit großen Atemtröpfchen durch Husten, Niesen oder Sprechen durch indirekten Kontakt mit infizierten Oberflächen oder durch kleine infektiöse Tröpfchen, die bis zu 2  Stunden in der Luft schweben können, verbreitet werden [10, 68 ]. Dendritische Zellen, Lymphozyten und Alveolarmakrophagen des Respirationstrakts sind frühe Infektionsziele, bei denen sich Masern während einer durchschnittlichen Inkubationszeit von 8 bis 12 Tagen replizieren und auf lokale Lymphgefäße und respiratorisches Epithel ausbreiten und sich dann im Blut über infizierte Lymphozyten auf Epithel- und Endothelzellen verteilen in den meisten Organen [69�]. Die Infektionsperiode beginnt mit Fieber und erstreckt sich über mehrere Tage nach Auftreten des Hautausschlags [72]. Der geschätzte R0 der Masern ist von der Anfälligkeit des Wirts sowie von sozialen und Umweltfaktoren abhängig [73]. Masern infizieren und zerstören Gewebe im ganzen Körper, schwere Erkrankungen sind jedoch hauptsächlich auf die unteren Atemwege und neurologische Komplikationen zurückzuführen [72]. Eine natürliche Maserninfektion verleiht lebenslange Immunität, und der passive Transfer mütterlicher Antikörper schützt Neugeborene in der frühen postnatalen Phase [74]. Personen, die sich von einer Maserninfektion erholen, haben ein erhöhtes Risiko für eine Sekundärinfektion [75, 76].

SARS- und MERS-CoV-Übertragung und Krankheitsmechanismen

SARS-CoV wird durch große Tröpfchen der Atemwege und durch Kontakt mit infizierten Oberflächen übertragen. Epidemiologische Daten unterstützen auch die Übertragung von SARS-CoV durch kleine Tröpfchen in der Luft, obwohl der geschätzte R0 von 0,86𠄱.83 spricht dagegen, dass dies ein vorherrschender Verbreitungsweg ist [77, 78]. SARS-CoV bindet an Angiotensin-Converting-Enzym (ACE)-2-Rezeptoren auf respiratorischen Epithelzellen, Pneumozyten und alveolären Makrophagen, was zu diffusen alveolären Schäden und Atemversagen führt [79, 80]. SARS ist eine systemische Infektion mit in den meisten Fällen nachgewiesener Virämie, die mehrere Zelltypen und Organe betrifft [81, 82]. Eine akute Nierenschädigung ist multifaktoriell mit Hinweisen auf akute Tubulusnekrose, Vaskulitis und glomeruläre Fibrose, und Manifestationen des zentralen Nervensystems sind zumindest teilweise auf eine direkte Infektion von Neuronen zurückzuführen, die zu Ödemen und Degeneration führt [83].

MERS-CoV wird durch große Tröpfchen der Atemwege und durch Kontakt mit infizierten Oberflächen mit einem geschätzten R0 von ρ bis ϡ außerhalb bzw. innerhalb des Gesundheitswesens übertragen [84]. MERS-CoV bindet Dipeptidyl-Peptidase 4 (DPP4) an respiratorische Epithelzellen und Pneumozyten, wo es während einer Inkubationszeit von 2�  Tagen eine produktive Replikation durchläuft [16]. Die Virusausscheidung aus den unteren Atemwegen kann wochenlang anhalten [85, 86]. Obwohl nicht in allen Fällen dokumentiert, ist eine Virämie mit einer schweren Erkrankung und einer produktiven Infektion von DCs verbunden, und es wird angenommen, dass Makrophagen eine Immundysregulation erleichtern [87, 88]. DPP4 wird weitgehend auf Zellen außerhalb der Lunge exprimiert, jedoch liegen nur wenige Autopsiedaten vor, um die Virusverteilung zu definieren [16, 89].

Übertragung des Variolavirus und Krankheitsmechanismen

VARV wird hauptsächlich durch große Atemtröpfchen und in geringerem Maße durch Kontakt mit kontaminierten Gegenständen wie Schorf, Bettzeug oder Kleidung oder durch luftgetragene kleine Atemtröpfchen übertragen [90, 91]. Es wird angenommen, dass VARV im Atemwegsepithel repliziert und sich auf regionale Lymphknoten ausbreitet [92, 93]. VARV repliziert in Lymphknoten und verbreitet sich über den Blutkreislauf, der entfernte Sehenswürdigkeiten wie Haut, Milz, Knochenmark, Leber, Niere und andere Organe aussät [94]. Fieber manifestiert sich nach einer durchschnittlichen Inkubationszeit von 12 Tagen und Hautausschlag folgt nach 3𠄴 Tagen gleichzeitig mit einer hochgradigen Virusausscheidung aus oropharyngealen Sekreten [95, 96]. Der geschätzte R0 der Pocken liegt zwischen 3,5 und 6 [97]. Eine hochgradige Virämie wird bei hämorrhagischen Pocken häufiger nachgewiesen als bei Pocken vom gewöhnlichen Typ, obwohl die genauen Mechanismen des bei tödlichen Fällen beobachteten Organversagens nicht genau definiert sind [98�].


Forscher enthüllen das Innenleben eines viralen DNA-Verpackungsmotors

Eine Gruppe von Forschern hat das detaillierte Innenleben des molekularen Motors entdeckt, der genetisches Material in doppelsträngige DNA-Viren verpackt. Der Fortschritt bietet Einblicke in einen kritischen Schritt im Reproduktionszyklus von Viren wie Pox-Herpes- und Adeno-Viren. Es könnte auch Forscher inspirieren, die mikroskopische Maschinen basierend auf natürlich vorkommenden Biomotoren entwickeln.

Die Forschung wurde von Wissenschaftlern der Duke University, der University of Minnesota, der University of Massachusetts und der University of Texas Medical Branch (UTMB) durchgeführt. Die Ergebnisse erscheinen online in einer Trilogie von Artikeln, die in Science Advances, Proceedings of the National Academy of Sciences und Nucleic Acids Research veröffentlicht wurden.

„Es gab mehrere fehlende Informationen, die uns daran hinderten, die Funktionsweise dieser Art von DNA-Verpackungsmotoren zu verstehen, was unsere Fähigkeit behinderte, Therapeutika zu entwickeln oder neue Technologien zu entwickeln“, sagte Gaurav Arya, Professor für Maschinenbau und Materialwissenschaften, Biomedizinische Technik, und Chemie bei Duke. „Aber mit neuen Erkenntnissen und Simulationen konnten wir ein Modell dieses fantastischen Mechanismus zusammenstellen, der das detaillierteste ist, das jemals für diese Art von System erstellt wurde.“

Viren gibt es in vielen Varianten, aber ihre Klassifizierung hängt im Allgemeinen davon ab, ob sie ihre genetischen Baupläne in RNA oder einzel- oder doppelsträngige DNA kodieren. Der Unterschied ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung und beeinflusst, wie das genetische Material in neue Viren verpackt wird. Während einige Viren einen Proteinbehälter namens Kapsid um neu produzierte RNA oder DNA bauen, erzeugen andere zuerst das Kapsid und füllen es dann mit dem genetischen Material.

"Der Versuch, den mit dem Virus verbundenen Motor zu sehen, ist wie der Versuch, die Details in der Fackel der Freiheitsstatue zu sehen, indem man ein Foto der gesamten Statue macht."

Joshua Pyjak.

Die meisten doppelsträngigen DNA-Viren gehen den letzteren Weg, der viele Herausforderungen mit sich bringt. DNA ist negativ geladen und möchte nicht auf engstem Raum zusammengepfercht werden. Und es ist in eine extrem dichte, fast kristalline Struktur verpackt, die auch viel Kraft erfordert.

„Der Vorteil davon ist, dass, wenn das Virus bereit ist, eine neue Zelle zu infizieren, der Druck dabei hilft, DNA in die Zelle zu injizieren, sobald sie punktiert ist“, sagte Joshua Pajak, ein Doktorand, der in Aryas Labor arbeitet. "Es wurde geschätzt, dass der Druck 800 PSI überschreitet, was fast das Zehnfache des Drucks in einer verkorkten Flasche Champagner ist."

Um DNA bei diesem Druck in ein winziges Kapsid zu zwingen, ist ein extrem leistungsstarker Motor erforderlich. Bis vor kurzem hatten die Forscher nur eine vage Vorstellung davon, wie dieser Motor funktioniert, da er schwer zu visualisieren ist. Der Motor setzt sich nur auf dem im Vergleich zum Motor enormen Viruspartikel zusammen.

„Der Versuch, den mit dem Virus verbundenen Motor zu sehen, ist wie der Versuch, die Details in der Fackel der Freiheitsstatue zu sehen, indem man ein Foto der gesamten Statue macht“, sagte Pajak.

Aber auf einer kürzlich durchgeführten Konferenz erfuhr Pajak, dass Marc Morais, Professor für Biochemie und Molekularbiologie an der UTMB, und Paul Jardine, Professor für diagnostische und biologische Wissenschaften an der University of Minnesota, seit Jahren an diesem Motor arbeiteten und die Ausrüstung und Fähigkeiten, die erforderlich sind, um die Details zu sehen. Einige ihrer ersten Ergebnisse schienen den Modellen zu entsprechen, die Pajak mit den wenigen Informationen baute, die bereits verfügbar waren. Die Gruppe war begeistert, dass ihre einzelnen Ergebnisse zu einem gemeinsamen Mechanismus führten, und machte sich schnell daran, das Geheimnis des Virusmotors gemeinsam zu lösen.

In einem in Science Advances veröffentlichten Artikel lösten Morais und seine Kollegen die Details des gesamten Motors in einer seiner Konfigurationen. Sie fanden heraus, dass der Motor aus fünf Proteinen besteht, die ringförmig miteinander verbunden sind. Jedes dieser Proteine ​​ist wie zwei Saugnäpfe mit einer Feder dazwischen, die es dem unteren Teil ermöglicht, sich in einer helikalen Formation vertikal zu bewegen, damit er am helikalen Rückgrat der DNA greifen kann.

„Da man etwa 100.000 dieser Motoren auf einen Stecknadelkopf stecken könnte und sie alle wackeln, war es schwierig, sie genau zu betrachten“, sagte Morais.„Aber nachdem meine UTMB-Kollegen Michael Woodson und Mark White uns geholfen hatten, sie mit einem Kryo-Elektronenmikroskop abzubilden, ergab sich ein allgemeiner Rahmen für den Mechanismus.“

In einem zweiten Artikel, der in Nucleic Acids Research veröffentlicht wurde, erfasste die Morais-Gruppe den Motor in einer zweiten Konfiguration mit Röntgenkristallographie. Diesmal waren die unteren Saugnäpfe des Motors alle zu einem ebenen Ring zusammengeknüllt, was die Forscher vermuten ließ, dass der Motor DNA in das Virus transportieren könnte, indem er zwischen den beiden Konfigurationen ratschete.

„Joshua hat viele Hinweise und Informationen zusammengetragen, um dieses Modell zu erstellen. Aber ein Modell ist nur dann sinnvoll, wenn es neue Erkenntnisse vorhersagen kann, die wir noch nicht kannten.“

Gaurav Arya

Um diese Hypothese zu testen, führten Pajak und Arya Hochleistungssimulationen auf Anton 2 durch, dem schnellsten Supercomputer, der derzeit für Molekulardynamiksimulationen verfügbar ist. Ihre Ergebnisse unterstützten nicht nur den vorgeschlagenen Mechanismus, sondern lieferten auch Informationen darüber, wie genau sich die Zahnräder des Motors zwischen den beiden Konfigurationen verdrehen.

Während die Oberseiten der Proteine ​​statisch mit dem Viruspartikel verbunden bleiben, bewegen sich ihre unteren Hälften in einem zyklischen Muster auf und ab, das von einem energietragenden Molekül namens ATP angetrieben wird. Sobald sich alle Proteine ​​nach oben bewegt haben – die DNA mit sich ziehend – setzen die Proteine ​​das Nebenprodukt der chemischen ATP-Reaktion frei. Dies führt dazu, dass der untere Ring die DNA freisetzt und wieder in ihren ursprünglichen helikalen Zustand zurückreicht, wo sie erneut an mehr ATP und DNA greifen, um den Vorgang zu wiederholen.

„Joshua hat viele Hinweise und Informationen zusammengetragen, um dieses Modell zu erstellen“, sagte Arya. „Aber ein Modell ist nur dann sinnvoll, wenn es neue Erkenntnisse vorhersagen kann, die wir noch nicht kannten.“

Im Kern besteht das Modell aus einer Reihe mechanischer Aktionen, die zusammenpassen und nacheinander ablaufen müssen, damit alles richtig funktioniert. Die Simulationen von Pajak sagten eine bestimmte Reihe von mechanischen Signalen voraus, die den Böden der Proteine ​​sagen, ob sie die DNA greifen sollten oder nicht. Wie eine Reihe von fallenden Dominosteinen sollte das Entfernen eines der Signalwege aus der Mitte die Kettenreaktion stoppen und das Signal blockieren.

„Alle Technologien sind auf die eine oder andere Weise von der Natur inspiriert. Jetzt, da wir wirklich wissen, wie dieser molekulare Motor funktioniert, wird er hoffentlich andere Forscher inspirieren, neue Erfindungen mit denselben Mechanismen zu entwickeln.“

Gaurav Arya

Um diese Vorhersage zu bestätigen, wandten sich die Forscher an Jardine und ihre Kollegen Shelley Grimes und Dwight Anderson, um zu sehen, ob das Entfernen eines der Signaldominosteine ​​den Motor tatsächlich daran hinderte, DNA zu verpacken. Ein drittes Papier, das in PNAS veröffentlicht wurde, zeigt, dass die Sabotage funktioniert hat. Nachdem ein Domino im Signalweg so mutiert war, dass er nicht mehr funktionieren konnte, konnte der Motor immer noch genauso gut Kraftstoff binden und verbrennen, aber es war viel schlimmer, DNA tatsächlich zu verpacken.

„Der neue Mechanismus, der von den hochauflösenden Strukturen und den detaillierten Vorhersagen vorhergesagt wurde, lieferte einen höheren Detaillierungsgrad als wir je zuvor hatten“, sagte Jardine. „Dadurch konnten wir die Rolle kritischer Komponenten des Motors testen und somit die Gültigkeit dieses neuen Mechanismus nach unserem derzeitigen Verständnis beurteilen.“

Das Ergebnis ist ein starker Hinweis darauf, dass das Modell der Beschreibung des Verhaltens des Motors in der Natur sehr nahe kommt. Die Gruppe plant, ihren hochintegrierten strukturellen, biochemischen und Simulationsansatz fortzusetzen, um das vorgeschlagene Modell weiter zu testen und zu verfeinern. Sie hoffen, dass dieses grundlegende Verständnis möglicherweise eines Tages zur Bekämpfung von Krankheiten oder zur Entwicklung eines synthetischen molekularen Motors genutzt werden könnte.

„Alle Technologien sind auf die eine oder andere Weise von der Natur inspiriert“, sagte Arya. „Jetzt, da wir wirklich wissen, wie dieser molekulare Motor funktioniert, wird er hoffentlich andere Forscher inspirieren, neue Erfindungen mit denselben Mechanismen zu entwickeln.“

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM118817, GM122979, GM127365) und der National Science Foundation (MCB1817338) unterstützt. Kryo-EM-Daten wurden auch in NIH-unterstützten regionalen Kryo-EM-Bildgebungseinrichtungen (1U24 GM116787-01, 1U24 GM116792-01) gesammelt. Die Simulationen wurden auf dem Supercomputer Anton 2 durchgeführt, der von D.E. Shaw Research und gehostet im Pittsburgh Supercomputing Center über das NIH (R01GM116961) und den Comet-Supercomputer, der über die NSF im San Diego Supercomputer Center gehostet wird (ACI-1053575).

„Virale Verpackungs-ATPasen nutzen einen Glutamat-Schalter, um die ATPase-Aktivität und die DNA-Translokation zu koppeln.“ Joshua Pajak, Rockney Atz, Brendan J. Hilbert, Marc C. Morais, Brian A. Kelch, Paul Jardine und Gaurav Arya. PNAS, 27. April 2021 118 (17) e2024928118. DOI: 10.1073/pnas.2024928118


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4.11.7: Doppelsträngige DNA-Viren - Pockenviren - Biologie

Willkommen auf meiner Pockenvirus-Seite! Diese Website wurde für eine Klasse an der Stanford University mit dem Titel Human Biology 115: Humans and Viruses erstellt, die von Dr. Robert Siegel unterrichtet wird. Klicken Sie hier, um Links zu Websites über andere humane Virusfamilien zu erhalten.

Der Fokus dieser Seite liegt auf Pocken, die seit Anbeginn der Geschichte weltweit verheerende Epidemien verursachten. Im Oktober 1977 wurde diese Krankheit jedoch nach energischen Bemühungen der Weltgesundheitsorganisation als erste vollständig ausgerottet.

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Pockenviren sind die größten und komplexesten aller Viren. Tatsächlich sind sie mit einer Viriongröße von 220-350 x 115-260 nm groß genug, um unter einem Lichtmikroskop gesehen zu werden. Sie infizieren eine Vielzahl von Wirten und werden in zwei Unterfamilien unterteilt: Chordopoxvirinae und Entomopoxviridae. Alle menschlichen Pockenviren gehören zur Unterfamilie Chordopoxovirinae, und die meisten von ihnen gehören entweder zum Orthopoxvirus (Variola, Vaccinia, Kuhpocken) oder zum Parapoxvirus (Orf-Virus). Das Windpockenvirus gehört nicht zu dieser Familie! - Es ist ein Herpesvirus.

  • Genom: doppelsträngige DNA, monopartit, linear, nicht infektiös kodiert über 100 Gene, einschließlich DNA-abhängiger RNA-Transkripase
  • Morphologie: "komplexes", eiförmiges oder ziegelförmiges Nukleokapsid
  • Umschlag: Orthopocken sind umhüllt, Parapocken nicht
  • Reproduzieren: findet im Zytoplasma statt
  • Host-Bereich: Das Wirtsspektrum variiert durch bestimmte Virus-Zoonosen ist weit verbreitet, aber Pocken infizieren nur den Menschen
  • Onkogenität: kann gutartige Tumoren verursachen
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Pockenviren werden am häufigsten durch direkten Kontakt übertragen. Bei Pocken findet sich das Virus in Läsionen der oberen Atemwege, die in Tröpfchensekreten auf andere übertragen werden können, und in Hautläsionen. Obwohl das Virus als hoch ansteckend gilt, verbreitet sich dieser Übertragungsweg relativ langsam.

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Eine Infektion mit einem Pockenvirus führt zu einer zellvermittelten Immunität. Menschen, die mit Pocken infiziert sind, sind in der Regel für den Rest ihres Lebens immun gegen die Krankheit.

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  • Pockenviren, mit beeindruckenden Diagrammen des Genoms und des Replikationsprozesses.
  • Humane POX-Viren, mit Nahaufnahmen von Pocken.
  • Familie: Poxviridae
  • POX-VIREN
  • Edward Jenner (1749-1823)
  • Die Taschen

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  • Dulbecco R und Ginsberg HS. Virologie (2. Aufl.), Philadelphia: J. B. Lippincott Company, 1988, S. 179-191.
  • Leland DS. Klinische Virologie, Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1996, p. 152-3.
  • Metselaar D und Simpson DIH. Praktische Virologie für Medizinstudenten und Praktiker in tropischen Ländern, Oxford: Oxford University Press, 1982, S. 37, 173-83.
  • Siegel R, M.D., Ph.D.
  • Weißer DO und Fenner FJ. Medizinische Virologie (3. Aufl.), Orlando: Academic Press, 1986, S. 278-280, 433-443.

Erstellt von Jennifer Yuan, Humanbiologie, Klasse von 1998
Stanford University, Stanford, CA
Zuletzt geändert: 17. Februar 1999


Antikörpererkennung von immundominanten Vacciniavirus-Hüllproteinen

Das Vaccinia-Virus (VACV) ist ein behülltes doppelsträngiges DNA-Virus und der Wirkstoff des Pockenimpfstoffs. Die systematische Verabreichung dieses Impfstoffs führte zur Ausrottung der zirkulierenden Pocken (Variolavirus, VARV) in der menschlichen Bevölkerung. Als Hommage an den Erfolg wurde die weltweite Impfung Ende der 1970er Jahre eingestellt. Die Wirksamkeit des Impfstoffs wird auf eine robuste Produktion von schützenden Antikörpern gegen mehrere Hüllproteine ​​von VACV zurückgeführt, die gegen eine Infektion mit pathogenen VARV kreuzschützen. Seit dem Ende der weltweiten Impfung besitzen die meisten Kinder und jungen Erwachsenen keine Immunität gegen Pocken. Dies ist besorgniserregend, da Pocken als potenzielle Biowaffe gelten. Obwohl der Pockenimpfstoff als Goldstandard aller Impfstoffe gilt und die gezielten Antigene umfassend untersucht wurden, waren die Epitope, auf die die schützenden Antikörper abzielen, und ihr Bindungsmechanismus bis vor kurzem nur unzureichend charakterisiert. Das Verständnis der genauen Interaktion zwischen den Antikörpern und ihren Epitopen wird bei der Entwicklung besserer Impfstoffe gegen andere Krankheiten hilfreich sein. In diesem Übersichtsartikel werden wir die strukturelle Grundlage der Erkennung der immundominanten VACV-Antigene A27, A33, D8 und L1 durch schützende Antikörper diskutieren und mögliche Auswirkungen auf ihre Schutzkapazität diskutieren.

Schlüsselwörter: Antikörper Antikörper-Antigen-Komplexe Impfung Vacciniavirus Röntgenkristallographie.


ERGEBNISSE

Rekombinante Variola K7L ist eine dimere Protease

GST-markiertes K7L wurde exprimiert in E coli als lösliches Protein (1 mg/Liter Bakterienkultur), gereinigt und mit Thrombin gespalten, wie unter 𠇎xperimentelle Verfahren” beschrieben (siehe Abb. 1). K7L migrierte auf SDS-PAGE mit der erwarteten Größe von 45 kDa ( Abb. 1 B). Die Größenausschlusschromatographie legte eine Molekularmasse von 75� kDa nahe, was eher mit der Homodimerisierung in Lösung übereinstimmt ( Abb. 1 C). Dies wurde durch Vernetzungsexperimente bestätigt, die ein Dimer, aber keine Polymere höherer Ordnung zeigten ( Abb. 1 B). Die analytische Ultrazentrifugation (die nicht von der Molekülform beeinflusst wird) bestätigte, dass K7L als ziemlich starkes Dimer entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart von 25 % Glycerin existiert (ergänzende Abb. 2), mit KD Werte von 0,4 ± 0,2 μ m (kein Glycerin) und 0,2 ± 0,1 μ m (25 % Glycerin). Bei den in unseren Aktivitätsassays verwendeten Konzentrationen wird daher vorhergesagt, dass K7L hauptsächlich dimer ist. K7L konnte mehrere Monate in 50 % Glycerin bei � ଌ oder � ଌ ohne Verlust der proteolytischen Aktivität gelagert werden. Bei höheren Temperaturen verlor das Enzym jedoch seine Aktivität, mit einer Halbwertszeit von 𢏅 h bei 23 ଌ und � min bei 37 ଌ. Aktivitätsmessungen wurden daher bei 20� ଌ durchgeführt.

Die gemeldeten Ziele von K7L sind P25K, P4a und P4b. Um die Aktivität von rekombinantem K7L zu bestimmen, inkubierten wir es mit in vitro translatierte P25K-, P4a- und P4b-Proteine, die von Konstrukten exprimiert wurden, die für die sehr ähnlichen Vaccinia-Proteine ​​kodieren (weil Variola-DNA nicht verfügbar war). Variola und Vaccinia P25K, P4a und P4b unterscheiden sich um 1𠄳%, und alle Sequenzunterschiede sind von den Schnittstellen entfernt, siehe ergänzende Ausrichtungen. Da die Sequenzen einen so hohen Identitätsgrad aufweisen, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Aktivität von Variola K7L gegenüber Vaccinia-Proteinen im Wesentlichen identisch mit der Spaltung der entsprechenden Variola-Proteine ​​wäre. Die Aktivitätsassays wurden in Gegenwart von 40% Glycerin durchgeführt ( 2 ). Es gibt eine mutmaßliche Spaltungsstelle in P4b (Gly 60 ↓Ser 61 ) und zwei in P25K (Gly 18 ↓Ser 19 und Gly 32 𡤺la 33 ). Dementsprechend beobachteten wir zwei Spaltprodukte der erwarteten Molekülmasse für P25K (32 und 30 kDa Abb. 2 C) und eine für P4b (64 kDa Abb. 2 D). Die Spaltung einer der P25K-Stellen war besonders schnell, und wir beobachteten eine langsamere Spaltung der anderen Stelle und von P4b durch K7L. Im Gegensatz dazu wurde P4a unter unseren experimentellen Bedingungen nicht von K7L gespalten ( Abb. 2 E).

Vermutete virale Ziele von K7L und ihren in vitro Spaltmuster. EIN, P4a, P4b, P25K und P17K sind virale Kernproteine, während P21K das Hüllmembranprotein ist. Alternative genbasierte Namen (in Klammern) sowie die mutmaßlichen Schnittstellen und deren Restnummern angegeben. B, die Ausrichtung der Spaltungsstellen ist gezeigt. Säurereste, die die Spaltung verstärken, sind in Fett gedruckt. C, D, und Ewurden Plasmide, die die angegebenen Proteine ​​kodieren, transkribiert und translatiert in vitro. Rekombinantes GST-K7L wurde für die angegebenen Zeiten zugegeben und die Reaktion durch Kochen in SDS-Probenpuffer beendet. SDS-PAGE-Gele wurden mit Streptavidin-HRP entwickelt, um prozessierte und unprozessierte Substratproteine ​​aufzudecken. Banden, die sowohl P4b- als auch P4a-Gelen gemeinsam sind, gehören zu unspezifisch gefärbten Proteinen. Spaltungsreaktionen setzten 0,3 &mgr;m GST-K7L bei 25 °C in 50 mm NaCl, 2 mm DTT, 30 mm Tris, pH 8,0, Puffer ein, der 40 % Glycerin und 12 % v/v des Translationsprodukts enthielt.

Glycerin verbessert die K7L-Aktivität

Um die Aktivität der K7L-Proben zu bewerten, synthetisierten wir mehrere Peptidylsubstrate, die den mutmaßlichen P25K-, P4a- und P4b-Spaltungsstellen entsprechen (Tabelle 1). Die Peptide waren N-terminal acetyliert und enthielten ACC als Fluorophor. Die Aktivität wurde durch die Freisetzung des freien Fluorophors unter Verwendung eines im kinetischen Modus arbeitenden Fluorimeters gemessen. K7L zeigt eine geringe Aktivität gegen Ac-ISAG-ACC, aber seine Aktivität wurde in Gegenwart von 45% Glycerin dramatisch erhöht ( Abb. 3 EIN). Ähnlich wie Glycerin steigerten auch andere Osmolyte wie Betain und Saccharose die Aktivität gegen Ac-ISAG-ACC ( Abb. 3 B). Als Ergebnis wurden routinemäßige Aktivitätsmessungen in Gegenwart von 40� % Glycerin bei einem optimalen pH-Wert von 8,0 durchgeführt ( Abb. 3 C) wenn nicht anders angegeben. Glycerin erhöhte die K7L-Aktivität gegenüber anderen fluoreszierenden Peptiden, die sich von Ac-ISAG-ACC und Proteinsubstraten voller Länge unterscheiden (Daten nicht gezeigt), und daher schließen wir, dass die Osmolytwirkung auf das Enzym und nicht auf das Substrat einwirkt.

TABELLE 1

K7L-Proteolyse von fluorogenen Peptiden

Kinetische Parameter wurden in 30 m m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 100 nM NaCl, 2 m m DTT und 45% Glycerin mit einem Bereich von Peptidkonzentrationen und K7L von 0,2 bis 1,0 μ m bewertet. NM, nicht gemessen. Fehler zeigen die beobachtete Standardabweichung von drei Messungen an.

SequenzquellePeptidsequenzkKatze/KmKm
m1 S1μ m
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 Ac-FFAG-ACC300 ± 5100 ± 15
P25K, Gly 32 𡤺la 33 Ac-VIAG-ACC120 ± 30Nm
P4b, Gly 60 ↓Ser 61 Ac-ISAG-ACC80 ± 30830 ± 110
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 Ac-FYAG-ACC560 ± 90Nm
P4a, Gly 697 ↓Thr 698 Ac-TNAG-ACCKeine SpaltungKeine Spaltung
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 Ac-TIFFAG-ACC570 ± 307,5 ± 3
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 Ac-EDTIFFAG-ACC14.400 ± 30026 ± 7
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 Ac-RYFYAG-ACC880 ± 140Nm
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 Ac-CPRYFYAG-ACC1010 ± 20150 ± 30

Stabilisierende Wirkung von Osmolyten, Salz, pH und Enzymkonzentration auf die K7L-Aktivität. EINgezeigt ist die Aktivität (Geschwindigkeit als Funktion der Ac-ISAG-ACC-Konzentration) in Gegenwart von 10 und 45% Glycerin. Bgezeigt ist ein Vergleich der K7L-Aktivierung durch Betain, Glycerin und Saccharose (Geschwindigkeit als Funktion der Osmolytkonzentration) in 35 &mgr;m Ac-ISAG-ACC. C, gezeigt ist die Wirkung der NaCl-Konzentration auf die K7L-Aktivität in 35 μ m Ac-ISAG-ACC. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden bei 25 °C in 30 m m Tris, pH 8,0 und 2 m m DTT unter Zugabe der verschiedenen Komponenten gemessen. C, gezeigt ist die Wirkung des pH auf die K7L-Aktivität in Gegenwart von 45% Glycerin. D, gezeigt ist die Wirkung der K7L-Konzentration auf die spezifische Aktivität von K7L gegenüber 30 &mgr;m Ac-EDTIFFAG-ACC in Gegenwart von 10 % Glycerin.

Dimerisierung verbessert die K7L-Aktivität

Wir analysierten die Wirkung der K7L-Dimerisierung auf die spezifische Aktivität, indem wir die Konzentrationsabhängigkeit der Spaltung eines ACC-markierten Peptidsubstrats beobachteten ( Abb. 3 D). Die Abhängigkeit hatte eine sigmoidale Form mit AC50 = 0,2 ± 0,1 μ m , was dem entspricht KD Wert bestimmt durch analytische Ultrazentrifugation (siehe oben). Dieses Ergebnis verbindet eindeutig die Aktivität von K7L mit der Dimerisierung.

Schließlich verglichen wir die Aktivitäten von rekombinantem K7L, das in E. coli gegen Vacciniavirus-infizierte Säugerzellen (ergänzende Fig. 3). Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was darauf hindeutet, dass K7L in Säugerzellen nicht unterschiedlich aktiviert wird (z.B. durch posttranslationale Modifikation).

Spezifität des Sondierungssubstrats

Die Substratspezifität von Vaccinia I7L wurde zuvor definiert durch in vivo Spaltungsassays von mutantem P25K (5, 42, 43). Da die veröffentlichten Daten jedoch keine quantitativen Vergleiche der Spaltungseffizienzen lieferten, führten wir eine eingehende Analyse von K7L durch. Die P1-Stelle aller mutmaßlichen natürlichen K7L-Substrate ist ein Gly-Rest.Um die Toleranz von K7L quantitativ zu testen, mutierten wir das konservierte Gly an den Positionen 18 und 32 von P25K zu Ala und verglichen ihre Spaltungseffizienzen mit Wildtyp-P25K. Wie in Abb. 4 gezeigt EIN, wurden beide Stellen von WT P25K in 1 bzw. 9 h vollständig gespalten, wohingegen nach 9 h Inkubation kein Beweis für die Spaltung der Doppelmutante erhalten wurde. Dies deutet auf eine sehr starke Bevorzugung von Gly in der P1-Position von Proteinsubstraten hin.

Subsite-Profiling von K7L und Vergleich mit verwandten Protease-Substratpräferenzen. EIN, P25K und seine Doppelmutante G18A/G32A wurden in einem zellfreien in vitro Transkriptions-/Translationssystem (Promega), gespalten durch rekombinantes K7L-GST für die angegebenen Zeiten und visualisiert nach SDS-PAGE, wie unter 𠇎xperimentelle Verfahren beschrieben.” B, Aminosäurepräferenzen an den P3-P1′-Positionen der Spaltstelle Gly↓Ser 18 von P25K gezeigt, dass Gly 32 immer zu Ala mutiert war, um die quantitative Analyse zu erleichtern. Die Analysen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt wie in der Platte A. Einzelne Mutationen wurden an den Positionen P3-P1′ der Stelle Gly↓Ser 18 eingeführt, wie auf der horizontale Achse. Die vertikale Achse zeigt die relativen Spaltungsraten (%). Cwurde eine Bibliothek von Peptiden konstruiert, die die P2-P4-Positionen untersucht, wie unter 𠇎xperimentelle Verfahren,” beschrieben, und relative Aktivitäten von 0,5 μ m K7L werden in Bezug auf das am effizientesten gespaltene Substrat an jeder Position exprimiert. Alle Reaktionen wurden in 40% Glycerin durchgeführt. Die horizontale Achse zeigt Aminosäuren, die im Standard-Ein-Buchstaben-Code geschrieben sind. Die unnatürlichen Aminosäuren sind: Ö, norleucin B, β-Alanin. D, werden relative Präferenzen für verwandte deSUMOylierende und deubiquitinierende Proteasen verglichen. rot zeigt die höchste Aktivität an Schwarz zeigt die niedrigste an. Die Präferenzen werden nach ihrer Ähnlichkeit mit K7L gruppiert.

Als nächstes untersuchten wir die Spaltung von Tetrapeptid-Substraten und verwendeten einen Ansatz der Positionsscanning-Substratbibliothek, um optimale Präferenzen an den P2-, P3- und P4-Positionen zu definieren. Die P1-Position wurde als Gly fixiert, und die P2-, P3- und P4-Positionen wurden jeweils zufällig auf eine von 18� Aminosäuren, einschließlich Norleucin und β-Alanin, geändert ( Abb. 4 C). Da wir ähnliche Peptidkonzentrationen verwendeten, konnten die relativen Beiträge der Aminosäuresubstitutionen zur Aktivität direkt gemessen werden. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Präferenz für Ala an P2. Die Selektivität an P3 war geringer, aber hydrophobe Reste wurden besonders gut vertragen. Die Position P4 war stärker eingeschränkt als P3 und zeigte eine klare Präferenz für hydrophobe Reste ( Abb. 4 C). Diese Ergebnisse stimmen gut mit den Sequenzmotiven überein, die in den natürlichen Spaltungszielen von K7L existieren ( Abb. 2 C) und unterscheiden K7L von eng verwandten Proteasen im Clan CE ( Abb. 4 D) (39).

Als nächstes nutzten wir unsere peptidbasierten Beobachtungen in einer Mutationsanalyse des mutmaßlichen natürlichen Substrats P25K. Wir mutierten die Positionen P3, P2 und P1′ in der Gly 18 ↓Ser 19-Schnittstelle, während wir eine Ala-Mutation an Gly 31 einführten, um jeglichen Beitrag der sekundären Spaltung zu unterdrücken ( Abb. 4 B). P1′ in der Gly 18 ↓Ser 19-Stelle zeigte eine klare Präferenz für Ser und Ala, die am häufigsten vorkommenden Reste an allen mutmaßlichen natürlichen K7L-Spaltungsstellen ( Abb. 2 B). Wir fanden auch, dass die Substitution von Ala an P2 durch Gly die Spaltungsgeschwindigkeit nicht beeinflusste, was den Vorschlag bestätigt, dass die Spaltung natürlicher Substrate durch Exosite beeinflusst werden könnte (12).

Um diese Ergebnisse zu untermauern, synthetisierten wir individuelle Tetrapeptid-ACC-Substrate, die der optimalen Tetrapeptidsequenz und den Spaltungsstellen von P25K, P4b und P4a entsprechen, und koinkubierten sie mit K7L. Die kKatze/Km Parameter wurden dann aus den Spaltungsdaten berechnet (Tabelle 1), was eine Bevorzugung von Tyr und Phe an der P3-Position offenbart. Diese Ergebnisse zeigen, dass die K7L-Spezifität in den P2-, P1- und P1′-Positionen, die die spaltbare Bindung umgeben, gut mit den Spaltstellen natürlicher Proteinsequenzen korreliert ( 2 , C𠄾). Außerhalb dieser Region brechen die Korrelationen jedoch zusammen.

Kartierung der erweiterten Substratbindungsstelle von K7L

Die Diskrepanzen in den Spaltstellenspezifitäten zwischen Peptid- und Proteinsubstraten jenseits des katalytischen Spalts legten nahe, dass weiter entfernte Reste als P4-P1 die Aktivität beeinflussen könnten. Um die Wirkung entfernter Restpositionen auf die K7L-Aktivität zu bestimmen, verwendeten wir zwei Strategien. In der ersten Strategie erweiterten wir die ACC-basierten Peptidylsubstrate um die P1-P8-Reste, die zu den P25K- und P4a-Spaltungsstellen passen. Kinetische Messungen zeigen, dass die Verlängerung beider Substrate zu den Resten P5 und P6 nur eine geringfügige Erhöhung der Peptidhydrolysegeschwindigkeit ergab. Im Gegensatz dazu förderte die Verlängerung der Substrate an den P7- und P8-Positionen die Hydrolyse um das bis zu 25-fache, während die Hydrolyse des P4a-basierten Peptids fast unverändert blieb. Bemerkenswerterweise wurden negativ geladene Reste in P7 und P8, abgeleitet von den P25K-Spaltungsstellen, gegenüber den neutralen Resten bevorzugt, die an diesen Positionen in den P4a- und P4b-Sequenzen der Stelle gefunden wurden.

In einer zweiten Strategie synthetisierten wir Peptide, die die P9-P4′-Reste von P25K, P4a und P4b bedeckten und an ihrem N-Terminus mit FAM derivatisiert wurden. Dies ermöglichte es uns, die Spaltung durch PR-HPLC von zeitgesteuerten Proben bei niedrigen Substratkonzentrationen von μ m zu überwachen, was eine Abschätzung der katalytischen Effizienz ermöglichte (kKatze/Km) (siehe 𠇎xperimentelle Verfahren”). Die Spaltungsstellen wurden unabhängig durch MALTI-TOF-Massenspektrometrie bestätigt. In Übereinstimmung mit den in Tabelle 1 präsentierten Ergebnissen wurden Peptide, die die Gly 18 &rgr;

Interessanterweise schien das FAM-LDRIITNAGTCTV-Peptid, das die Spaltstelle Gly 697 ↓Thr 698 von P4a überspannt, gegenüber der K7L-Proteolyse resistent zu sein. Dies stimmte mit Daten über das Ac-TNAG-ACC-Peptid überein, die zeigen, dass diese Stelle für die Spaltung durch K7L sehr ungünstig ist (Tabelle 2). In Übereinstimmung bestätigten die MALDI-TOF-Massenspektrometriedaten, dass das FAM-LDRIITNAGTCTV-Peptid selbst durch sehr hohe K7L-Spiegel nicht gespalten wurde (nicht gezeigt). Ähnlich wie beim Ac-EDTIFFAG-ACC-Substrat reduzierte das Entfernen von P9-P7-Resten aus der optimalen P25K-Peptidsequenz seine Spaltungsrate um das �-Fache. Bezeichnenderweise hatte die Verlängerung der Substrate über die spaltbare Bindung in der Hauptrichtung (stromabwärts der spaltbaren Bindung) keinen großen Einfluss auf die Spaltungsgeschwindigkeiten, und eine Verlängerung von P2′ zu P4′ lieferte nur eine bescheidene (weniger als das 2-fache) Verbesserung in Katalyse (Tabelle 2). Insgesamt korrelieren unsere Spaltungsdaten für längere Peptide sehr gut mit der K7L-Aktivität in vitro gegen Proteinsubstrate (P25K und P4b). Basierend auf unseren Daten ist es wahrscheinlich, dass die Gly 697 ↓Thr 698-Stelle des P4a-Proteins ein suboptimales Substrat von K7L ist.

TABELLE 2

K7L-Proteolyse des P9-P4′ FAM-markierten Peptids

Kinetische Parameter wurden in 30 m m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 100 nM NaCl, 2 m m DTT und 45% Glycerin mit 10 µm Peptid und K7L von 0,1 bis 1,0 µm bewertet. O (Norleucin) wurde anstelle von Met verwendet, um die Oxidation des letzteren während der Synthese der DDLQMVIAG𡤺KSK-Sequenz zu verhindern. Fehler weisen auf beobachtete S.D. von zwei Messungen. ND, nicht bestimmt.

Protein, SpaltstellePeptidsequenzkKatze/Km
45% Glycerin15% Glycerin
m1 S1
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 EEDTIFFAGSISE28000 ± 30001300 ± 400
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 EEDTIFFAGSich17500 ± 1500
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 TIFFAGSISE670 ± 220
P25K, Gly 32 𡤺la 33 DDLQ Ö VIAGEINKSK3500 ± 800220 ± 100
P4b, Gly 60 ↓Ser 61 VDDDFISAGEINRNQ2000 ± 500
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 YCPRYFYAGSANBINDUNG2100 ± 500
P4a, Gly 697 ↓Ser 698 LDRIITNAGTCFernseherND
P4a, Gly 697 ↓Thr 698 MutanteLDRIITNAGT S FernseherND
Beweise für die allosterische Exosite-vermittelte Aktivierung von K7L

Die wesentliche Stimulation der Aktivität der K7L-Katalyse auf Substraten, die die Positionen P7 und P8 besetzen, legte zwei Möglichkeiten nahe: 1) erweiterte konzertierte Substraterkennung oder 2) eine Exosit-Wechselwirkung, die als allosterischer Schalter fungiert. Um diese Hypothesen anzugehen, testeten wir, ob P25K die K7L-Proteolyse des Ac-ISAG-ACC-Substrats verbessern könnte. Wir koinkubierten K7L (0.5 μ m ) mit P25K (0.1� μ m ) und maßen dann die Spaltungsgeschwindigkeit des fluoreszierenden Substrats. Die Kontrollproteine ​​Rinderserumalbumin (BSA) und Lysozym hatten keine Wirkung auf die Spaltungsgeschwindigkeit, aber das P25K-Protein steigerte die K7L-Aktivität um das bis zu 2,4-Fache, mit einer maximalen stimulierenden Wirkung bei 8 µm P25K. Höhere P25K-Konzentrationen führten zur Hemmung der K7L-Aktivität gegen Ac-ISAG-ACC ( Abb. 5 EIN). Im Gegensatz dazu zeigte das FAM-EEDTIFFAGSISE-Peptid keine Stimulation von Ac-ISAG-ACC und hemmte stattdessen mit einem IC50 von 37 μ m , ähnlich der Konzentration, bei der P25K beginnt, die Spaltung des Tetrapeptid-Reportersubstrats zu hemmen ( Fig. 5 B). Diese Befunde stimmen mit einem geringen allosterischen Effekt überein, weisen jedoch darauf hin, dass der Hauptmechanismus der verstärkten Spaltung langer Peptide die Anwesenheit einer erweiterten und konzertierten Substraterkennung ist.

Einfluss von Volllängen-P25K und Polynukleotiden auf die K7L-Aktivität. EINist die Aktivierung der Ac-ISAG-ACC-Spaltung durch P25K gezeigt. Die konzentrationsabhängige Aktivierung passt sich einer glockenförmigen Dosis-Wirkungs-Kurve an, mit KEIN = 8 μ m und Kich = 45 μ m . BSA und Lysozym wurden als Kontrollen der unspezifischen Bindung verwendet. B, gezeigt ist die Hemmung der Ac-ISAG-ACC-Spaltung durch FAM-EEDTIFFAGSISE, wobei die Daten an eine Dosis-Wirkungs-Kurve erster Ordnung angepasst sind, Kich = 37 μ m . Die Reaktionen wurden in 30 m m Tris, pH 8,0, mit 40 % Glycerin, 50 m m NaCl, 0,2 m m K7L und 50 m m dem Ac-ISAG-ACC-Substrat durchgeführt. C, Spaltung von P25K durch K7L in Gegenwart verschiedener Cofaktoren gezeigt. 0,3 µm K7L wurde für die angegebenen Zeiten mit 8 µm P25K in Gegenwart von 1 µm Mg 2+ (linkes Feld), humane RNA (0,1 mg/ml) + Mg 2+ (mittleres Panel) oder virale DNA (0,1 mg/ml) + 1 mm Mg 2+ (rechte Tafel). Experimente wurden wie angegeben mit 3, 15 oder 40% Glycerin durchgeführt. Die Verdaus wurden durch SDS-PAGE getrennt. D, die Bilder in C wurden digitalisiert, um die jeweiligen kKatze/Km Werte wie unter 𠇎xperimentelle Verfahren beschrieben.” E, Wirkungen von Glycerin, menschlicher RNA und Mg 2+ Ionen auf der Spaltung von Ac-EDTIFFAG-ACC durch K7L sind gezeigt. K7L (0,1 μ m ) wurde bei 25 °C mit dem Peptid (10 μ m ) co-inkubiert. Die Reaktionen enthielten 30 m m Tris-HCl, pH 8,0, 50 m m NaCl und 2 m m DTT und die angegebenen Konzentrationen an Glycerin. Wo angegeben, 1 m m MgCl2 oder 0,1 mg/ml RNA wurden den Reaktionen zugesetzt.

Polynukleotide stimulieren die Proteolyse von P25K durch K7L

P25K ist ein hochaffiner Polynukleotidbinder (KD = 1𠄲 n m ), einschließlich sowohl RNA als auch DNA (44). Um zu testen, ob Polynukleotide die Spaltung von P25K beeinflussen, koinkubierten wir K7L mit P25K in Gegenwart und Abwesenheit von RNA, doppelsträngiger Vaccinia-DNA und Glycerin. DNA und insbesondere RNA (beide bei 0,1 mg/ml) stimulierten die Spaltung beider P25K-Stellen wesentlich, und ihre Wirkung war bei niedrigeren Glycerinkonzentrationen (3� %) besonders stark ( Abb. 5 , C und D). Es ist möglich, dass Polynukleotide erforderlich sind, um die K7L-Proteolyse des P25K-Proteins zu stimulieren, und dass diese Stimulation nicht die Anwesenheit von hohem Glycerin erfordert. Wichtig ist, dass sowohl RNA (und nicht gezeigte virale DNA) die Spaltung des Ac-EDTIFFAG-ACC-Peptids durch K7L um das 𢏄-fache hemmten (Abb. 5 .). E), was darauf hindeutet, dass K7L dazu neigt, Polyanionen zu binden. Darüber hinaus war die Polynukleotid-Stimulation der Katalyse auf P25K viel höher als die inhibitorische Wirkung gegenüber dem Octapeptid-Substrat. Da die Aktivierung proteinspezifisch ist, schlagen wir vor, dass virale DNA und RNA die Spaltung von P25K beeinflussen, indem sie dessen Interaktion mit K7L an einer allosterischen Stelle fördern.

Peptidbasierte Inhibitoren und Aktivitätssonden

Der Fingerabdruck des bevorzugten K7L-Substrats wurde verwendet, um aktivitätsbasierte Sonden zu entwerfen, die von der K7L-Protease erkannt werden. Dazu wurden die Peptidsequenzen FYAG und EDTIFFAG mit einem N-terminalen Biotin-Tag und einem C-terminalen VME-reaktiven “warhead” funktionalisiert ( Abb. 6 EIN). Die Selektivität und Effizienz des Biotin-AEEAc-EDTIFFA-VME wurde direkt in Markierungsexperimenten mit K7L bestätigt. Um das markierte Material sichtbar zu machen, wurden Proben einem Western-Blotting mit Streptavidin-HRP unterzogen. Obwohl die kurze Sonde K7L nicht sichtbar markierte, war die längere Biotin-AEEAc-EDTIFFA-VME-Sonde bei 25 nm ausreichend, um das aktive Zentrum von K7L zu markieren, in Übereinstimmung mit den gemessenen Inhibitionsratenkonstanten ( 6 B). Die Blockierung der Markierung durch N-Ethylmaleinimid zeigte an, dass die Sonde auf das aktive Zentrum abzielt ( Abb. 6 B).

Eine aktivitätsbasierte Sonde markiert K7L in vitro und in Zellextrakten. EINgezeigt sind chemische Formeln von biotinylierten peptidbasierten Sonden. Die Inhibitionskonstanten wurden berechnet, indem der Aktivitätsabfall pseudoerster Ordnung beobachtet wurde (kobs) in Gegenwart einer Inhibitorkonzentration (ich). B, oberes Panel, K7L (0,2 μ m ) wurde mit den angegebenen Konzentrationen von kurzen (S) und lang (L) Sonden für 15 min bei 25 °C und visualisiert mit Streptavidin-HRP durch SDS-PAGE. Unteres Panelwurde das Gesamtenzym durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-K7L-Antikörpers auf demselben Gel sichtbar gemacht. Cgezeigt ist die Markierung von K7L und I7L in mit Vacciniavirus infizierten (Infektionsmultiplizität = 5, 24 h) BSC-1-Zellen. Wo angegeben, wurde rekombinantes K7L aus einem transfizierten pTF7-3-Vektor co-exprimiert. 10 &mgr;m biotinyliertes EDTIFFAG-VME wurde zu homogenisierten Proben gegeben, für 15 min inkubiert und auf SDS-PAGE geladen. Die biotinylierten Proteine ​​wurden mit Streptavidin-HRP sichtbar gemacht. Die schwarze pfeile geben die Positionen von rekombinantem K7L und viralem I7L auf dem Gel an. Die Pfeil öffnen weist auf das Fehlen der I7L-Bande in einer Probe ohne das Virus hin.

Um zu testen, ob die Biotin-EDTIFFAG-VME-Sonde zelluläres K7L markiert, fügten wir 10 &mgr;m Konzentrationen der Sonde zu Lysaten von BSC-1-Zellen, die mit Vacciniavirus infiziert waren, hinzu. Nach kurzer Inkubation wurden die Lysate durch Western-Blotting mit Streptavidin-HRP analysiert ( Abb. 6 C) und auch mit einem K7L-Antikörper (ergänzende Abb. 4). Die Ergebnisse zeigen, dass die Sonde überwiegend eine 48-kDa-Bande in den virusinfizierten Zellen markierte. Zukünftige Experimente und Sondenoptimierung werden erforderlich sein, um zu bestimmen, ob die hier beschriebenen Sonden in der Lage sind, die virale Infektiosität und/oder Replikation zu hemmen.

Schlussfolgerungen

K7L wird vom MEROPS-Klassifizierungssystem als Mitglied der C57-Familie des Peptidase-Clan CE (45) bezeichnet, einem Clan, der prozessierende Proteasen aus Adenovirus und Afrikanischem Schweinepestvirus, deSUMOylierende Enzyme von Hefe zu Menschen und deubiquitinierende Enzyme aus Pflanzen und . enthält tierpathogene Bakterien (24�, 35). K7L-Orthologe sind in allen Orthopoxviren vorhanden und vermutlich erforderlich. Durch den Einsatz von transienter Expression und konditionalen letalen Virusanalysen wurde zuvor gezeigt, dass I7L, das Vaccinia-Ortholog von K7L, für die Kernproteinprozessierung erforderlich ist (7, 16, 18). Eine bahnbrechende Studie verwendete Extrakte von viral infizierten Zellen, die I7L enthielten, um zu zeigen, dass das Enzym eine Cysteinprotease ist, die in der Lage ist, die Kernproteinvorläufer P4a, P4b und P25K zu spalten (17). Die Autoren waren jedoch nicht in der Lage, katalytisch aktives I7L synthetisiert herzustellen in vitro, was zu dem Schluss führt, dass ein Cofaktor für die Aktivität erforderlich ist.

Unser Erfolg bei der Herstellung von katalytisch aktivem K7L durch Expression in E coli führt uns zu der Annahme, dass die Dimerisierung von K7L und daraus abgeleitet I7L für die Aktivität erforderlich ist und dass die in vitro das früher verwendete Translationssystem (17) erzeugte unzureichende Proteinkonzentrationen, um eine signifikante Dimerisierung zu ermöglichen. Darüber hinaus legen unsere Ergebnisse stark nahe, dass K7L tatsächlich einen Cofaktor für maximale Aktivität benötigt. Obwohl wir seine Identität nicht kennen, haben wir gezeigt, dass Glycerin und andere faltenstabilisierende Osmolyte eine stimulierende Wirkung haben. Darüber hinaus fanden wir, dass Polyanionen unterschiedliche Auswirkungen auf die Aktivität des Enzyms auf Protein haben vis à vis Peptidsubstrate. Zusammen weisen diese Merkmale auf eine multivariate und komplexere Regulation von K7L hin als bei anderen Clan-CE-Mitgliedern, möglicherweise als Folge der strengen Anforderung, dass seine Aktivität überwiegend oder ausschließlich auf das kondensierende Virion lokalisiert werden muss (7, 16, 18 ).

Informationen über andere virale Proteasen aus dem Clan CE sind äußerst begrenzt, und bisher wurde nur die adenoviral prozessierende Protease Adenain biochemisch und strukturell signifikant detailliert charakterisiert (29, 35, 46, 47). Interessanterweise scheinen sich einige Eigenschaften von K7L von anderen Clan-CE-Mitgliedern zu unterscheiden, während andere verwandt sind. Somit funktioniert K7L am effizientesten als Homodimer, was für andere Clan-CE-Enzyme keine gemeldete Voraussetzung ist. Gemeinsam mit anderen Clan-CE-Mitgliedern haben wir jedoch zur Verfügung gestellt in vitro Beweise dafür, dass Kofaktoren die K7L-Aktivität verstärken, obwohl die Details variieren. Somit wird Adenain durch die gleichzeitige Bindung von zwei Cofaktoren aktiviert, dem 11-Reste-Fragment des Kernproteins pIV und viraler DNA (29), während unsere Daten darauf hindeuten, dass sowohl RNA- als auch DNA-Oligonukleotide die K7L-Aktivität gegenüber seinem verwandten Substrat erhöhen können. P25K.

Unsere Analyse der erweiterten Substratbindungseigenschaften von K7L hilft, die Spezifität der Protease für ihre vorhergesagten Substrate zu erklären, und zeigt, dass das Vorhandensein von negativ geladenen Resten an den Positionen P7 und P8 die Spaltung einiger Substrate stark verbessert.Dies impliziert, dass für eine optimale Spaltung natürlicher Substrate eine vom aktiven Zentrum entfernte Exosit-Wechselwirkung erforderlich ist. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wird weder das Peptid, das die P4a-Spaltstelle überspannt, Gly 614 ↓Ser 615, noch das P4a-Protein selbst von rekombinantem K7L gespalten.

K7L wurde als vielversprechendes Ziel für die Pockentherapie vorgeschlagen (10, 11). Tatsächlich wurde über ein kleines Molekül berichtet, das die Reifung des Vaccinia-Kernproteins verhindert (10, 11) und könnte ein Inhibitor von I7L sein. Unsere biotinylierte aktivitätsbasierte Sondenanalyse zeigt, dass K7L in Lysaten von infizierten Zellen aktiv und zielgerichtet ist. Zusammenfassend bieten unsere Ergebnisse viele neue Einblicke in den Mechanismus, die Spezifität und die Regulation der viralen K7L-Protease. Unsere Arbeit bietet auch eine solide Grundlage sowie spezifische molekulare Werkzeuge (Protease-Produktionsmethoden, Assay-Design, Inhibitor-Design und -Synthese), die jetzt verwendet werden können, um die Funktion von K7L in einer zellbasierten Umgebung zu untersuchen.


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Bemerkungen:

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