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18.3: Stickstoffausscheidung und der Harnstoffkreislauf - Biologie

18.3: Stickstoffausscheidung und der Harnstoffkreislauf - Biologie



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Der Harnstoffzyklus

Jetzt sind wir in der Lage zu sehen, was mit überschüssigem NH . passiert3/NH4+ die sich in den Mitochondrien der Leber anreichert. Wenn Ihre Ernährung reich an Proteinen und damit Aminosäuren ist, da diese nicht als Proteine ​​​​per se gespeichert werden können, werden sie zu Energie verstoffwechselt und die Stoffwechselprodukte können in Fett oder Kohlenhydrate umgewandelt werden. Die Blätter überschüssigen Stickstoff, der meist als Harnstoff zur Ausscheidung endet.

Harnstoff ist ein sehr wasserlösliches, ungiftiges Molekül, das Biochemiker im Labor verwenden, um Proteine ​​chemisch zu denaturieren (bei Konzentrationen von 3-6 m). Klinische Blutharnstoffkonzentrationen werden als Blutharnstoff ausgedrückt Stickstoff (BUN), die von 7 bis 20 mg/dL N reichen, was 2,5 bis 7,1 . entspricht mM Harnstoff. Die Serumspiegel hängen hauptsächlich vom Gleichgewicht zwischen der Harnstoffsynthese in der Leber und seiner Elimination durch die Niere ab. Normale zelluläre Harnstoffkonzentrationen sollten ähnlich sein.

Harnstoff wird durch einen sogenannten Harnstoffzyklus produziert, wie in der Abbildung unten gezeigt.

Arginosuccinat-Lyase

Die Namen der Enzyme sind:

  • CPS1: Carbamoylphosphat-Synthase I
  • OTC: Ornithin-Transcarbamoylase
  • ASS1: Arginosuccinat-Synthase 1
  • ASL: Arginosuccinase-Lysase (auch bekannt als Arginosuccinase)
  • ARG1: Arginase

Es ist farbcodiert, um die Quellen der C- und N-Atome zu kennzeichnen. Ein N stammt von Ammoniak (oder indirekt vom Amido-N von Glutamin), während das C-Atom von Carbonat stammt. Das andere kommt vom Amin von Aspartat. Beachten Sie, dass 3 ATPs verwendet werden, um den Zyklus zu versorgen. Beachten Sie auch die Guanidinogruppe von Arginin (NH(NH2+)NH2) ist der unmittelbare Donor der 2 N-Atome in der Stufe, die Harnstoff erzeugt. Wenn Sie wissen, dass eine Aminosäure der unmittelbare Donor der N-Atome im Harnstoff ist, können Sie dies leicht vorhersagen.

Schauen wir uns nun einige der Schritte an, beginnend mit denen, die mit ATP betrieben werden, bei denen auch Stickstoff in die Vorläufer von Harnstoff eingebaut wird.

Carbamoylphosphat-Synthase I (CPS I)

Dieses Enzym katalysiert den ersten "festgelegten" Weg des Weges und macht den Reaktanten, der in den Zyklus eintritt, Carbamoylphosphat. Es erfordert einen spezifischen Cofaktor, N-Acetyl-Glutamat (NAG), der durch die Acetylierung von Glutamat durch Acetyl-COA unter Verwendung eines Enzyms NAG-Synthase hergestellt wird, das durch Arginin aktiviert wird. Die Reaktion ist nicht Teil des Zyklus, sondern liefert den Input dafür.

Eine zytosolische Version dieses Enzyms, CPS II, wird verwendet, um Arginin- und Pyrimidin-Nukleotide unter Verwendung von Glutamin als Donor von NH . zu synthetisieren4+die mit Carboxyphosphat reagiert, um Carbamoylphosphat zu produzieren. Es wird nicht von der NAG reguliert.

CPS I bietet eine Möglichkeit zur Bildung eines (C=O)NH2 Einheit für Harnstoff durch Kondensieren von Bicarbonat und Ammoniak zu einem Carbamat, das ein hochenergetisches "Motiv" in Bezug auf seine Hydrolyse enthält, erzeugen. (Anmerkung: Dies bedeutet nicht, dass die gebrochene Bindung hochenergetisch ist, eine Fehlbezeichnung, die in vielen Büchern zu finden ist.) Daher wird die Reaktion von 2 ATPs als Energiequelle angetrieben. Harnstoff ist dann ein Molekül, das sowohl NH3/NH4+ aber auch Karbonat.

Ein Reaktionsmechanismus für Carbamoylphosphat-Synthase ist unten gezeigt.

Die beiden hochenergetischen Motivmoleküle (wiederum in Bezug auf ihre Hydrolyseprodukte) werden vor unspezifischer Hydrolyse geschützt, wenn das gemischte Anhydrid einen sequestrierten Tunnel entlang zu einer distaleren Phosphorylierungsstelle im multimeren Enzym passiert.

Die Struktur unten zeigt 2 ADP und ein NAG gebunden an eine Kette des Multimers. Das "frei schwebende" NAG, ADP und Ionen (Magnesium und Kalium) würden an das andere nicht gezeigte Monomer gebunden.

​iCn3D-Modell: ersetzen

Das Protein liegt in einem Monomer-Dimer-Gleichgewichtsgemisch vor. Jedes Monomer hat 1 NAG und 2 ADP, die die zwei unterschiedlichen Bindungsstellen für die zwei unterschiedlichen Phosphorylierungsschritte darstellen, wie in der obigen Reaktion gezeigt. Die beiden Phosphorylierungsstellen sind durch einen Tunnel verbunden, der den Durchgang des gemischten Anhydrids zur Carbamat-Phosphorylierungsstelle ermöglicht. Das NAG ist eindeutig ein allosterischer Modifikator, da es nicht in der Nähe der Phosphorylierungsstellen gebunden ist. Bei der Bindung an die Apo-Form des Enzyms ruft es eine große Konformationsänderung hervor, die es einer kompetenten Enzymkonformation mit einem vollständigen Tunnel ermöglicht, vorzuherrschen.

Bilder des Tunnels für ein Monomer des menschlichen CPS I-Enzyms sind unten gezeigt.

Oben: ADPs werden unten raumfüllend mit CPK-Farbe angezeigt. Der Tunnel zwischen den beiden ADP-Standorten ist in Magenta hervorgehoben. Das gelbe Molekül ist NAG, das wiederum seine Aktivierungswirkung durch die Bindung an eine allosterische Stelle entfaltet, wodurch der Tunnel effektiv geöffnet wird.

Das nächste Bild zeigt das Enzymmonomer in einer anderen Ausrichtung mit einem Tunnel, der mit hergestellt wurde ChExVis: ein Werkzeug zur Extraktion und Visualisierung von molekularen Kanälen. Die große rote und grüne Kugel zeigte die Oberflächenöffnungen.

Das obere Feld in der Abbildung unten zeigt den Radius des Tunnels in Angström von der roten Kugel zur grünen Kugel im obigen Bild. Das untere Feld zeigt ein Maß für die Hydrophobie (rot)/Hydrophilie (blau) der den Tunnel umgebenden Aminosäuren.

ASS1: ArginoSuccinat-Synthase 1

Ein weiteres ATP wird gespalten, um die Umwandlung von Citrullin zu Arginosuccinat voranzutreiben, das im nächsten Schritt leicht gespalten werden könnte, um die Aminosäure Arginin zu bilden.

ASL: Arginosuccinase-Lysase (auch bekannt als Arginosuccinase)

Dieses Enzym katalysiert eine Beta-Eliminierungsreaktion, die entweder über einen E2- oder E1-Mechanismus ablaufen kann. Ein allgemeiner, aber sehr abgekürzter Mechanismus, der eine zweistufige (E1)-Eliminierung über ein Carbanion-Zwischenprodukt zeigt, ist unten gezeigt.

Das folgende Modell Arginosuccinat (AS11) bindet im aktiven Zentrum eines von vier Monomeren von ASL aus Mycobacterium tuberculosis (6IEN). Die wichtigsten katalytischen Reste scheinen Ser 262 und His 161 zu sein, die als allgemeine Säuren/Basen wirken, um die Protonenabstraktion und -redonierung zu erleichtern. Lys 288 scheint einen atypischen pKa (6,0) zu haben, der die Deprotonierung von Ser 262 erleichtern könnte, was ihm erlaubt, als allgemeine Base zu wirken. https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/iub.2000

https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/i...qKVpmzdwBzFJL8 O

Ornithin-Transcarbamyolase

Der Reaktionsmechanismus ist hier recht einfach. Das Carbamoylphosphat ist ein aktiviertes Elektrophil, in dem das Carbonyl C von einem deprotonierten Amino von Ornithin angegriffen wird, um Citrullin zu produzieren. Das Gen befindet sich beim Menschen auf dem X-Chromosom, so dass Mutationen bei Männern zu einem "hyperammonämischen Koma" und zum Tod führen. Heterozygote Weibchen können asymptomatisch sein oder im Allgemeinen tödlich sein. Heterozygote Weibchen sind entweder asymptomatisch oder haben Probleme aufgrund von Defekten in der Pyrmidin-Biosynthese, die durch eine proteinarme Ernährung mit Arginin-Zusatz gelindert werden können.

Arginase

Es gibt zwei allgemeine Varianten dieses Enzyms, Arginase I ist ein zytosolisches Enzym, das in der Leber exprimiert wird und an der Harnstoffsynthese beteiligt ist. Arginase II ist ein mitochondriales Enzym und allgemeiner am Argininstoffwechsel beteiligt.

„Das Substrat L-Arginin bindet an das aktive Zentrum, koordiniert aber nicht direkt an die Metallionenzentren. Das metallverbrückende Hydroxid initiiert dann einen nukleophilen Angriff auf die Guanidiniumgruppe des Substrats, was zur Bildung einer tetraedrischen Zwischenstufe führt ein durch Asp-128 vermittelter Protonentransfer auf die austretende Aminogruppe, der Zusammenbruch der tetraedrischen Zwischenstufe liefert die Produkte l-Ornithin und Harnstoff. Im letzten Schritt, um das aktive Zentrum zu regenerieren und die Produkte freizusetzen, tritt ein Wassermolekül ein, um die zweikerniger Mangancluster, wodurch sich das Harnstoffprodukt zu einer terminalen Koordinationsstelle von Mangan 1 bewegt -Lösungsmittel wird durch die Seitenkette von His-141 vermittelt."

Das folgende Modell zeigt das aktive Zentrum der humanen Arginase I (3KV2) im Komplex mit dem Inhibitor N(omega)-Hydroxy-nor-L-arginin, in dem eines der Guanidino-Ns durch ein OH ersetzt ist. Die beiden grauen Kugeln sind Mn-Ionen.

Hier ist ein weiteres Modell, das ein Wasser des aktiven Zentrums (480) in der Nähe der MN-Ionen zeigt. Wassermoleküle können als Liganden wirken und Metallionen im Übergangszustand über eine koordinative kovalente Bindung binden. Der pKa des gebundenen Wassers verschiebt sich zu einem niedrigeren Wert, wodurch es wahrscheinlicher wird, dass es zu OH . deprotoniert-, das sowohl eine bessere Base als auch ein besseres Nucleophil ist. Wasser 480 im aktiven Zentrum scheint eine koordinative kovalente Bindung mit dem Mn-Ion zu bilden, wodurch ein Hydroxid des aktiven Zentrums gebildet wird, das die Guanidinogruppe von Arginin angreift, was zur Bildung von Harnstoff und Ornithin führt.

Ein statisches Bild:

​Verordnung

Wenn überschüssige Aminosäuren/Proteine ​​verbraucht werden, kann eine Veränderung der Genexpression die Spiegel der Enzyme im Harnstoffzyklus erhöhen. Kurzfristig wird die Aktivität durch das Enzym Carbamoylphosphatsynthase reguliert, das den Zugang zum Zyklus ermöglicht, dessen Aktivität durch N-Acetylglutaminsäure reguliert wird und den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt katalysiert. Wie oben gezeigt, ist das Enzym ohne den allosterischen Regulator NAG funktionell inaktiv. Der NAG-Spiegel wird durch das Enzym NAG-Synthase bestimmt, das selbst durch freies Arginin, die unmittelbare Vorstufe von Harnstoff im Zyklus, reguliert wird. Zusätzliches Arginin wird Patienten mit einem Harnstoff-Störungssystem verabreicht und seine Wirkung tritt wahrscheinlich durch die Regulierung der NAG-Synthase auf.

Die Verbindung zwischen dem Harnstoffzyklus und dem TCA-Zyklus

Zwei der Hauptwege, die Sie erforscht haben, der TCA- und der Harnstoffzyklus, sind keine linearen, sondern zyklische Wege. Welche Vorteile bietet "rund" gegenüber linearen? Vielleicht bietet ein Vergleich mit ökonomischen Pfaden einen Anhaltspunkt. In einer linearen Wirtschaft werden Rohstoffe verwendet, um ein Produkt herzustellen, das schließlich als Müll entsorgt wird. Leider dominieren lineare Pfade unsere Welt zu einem hohen Preis für unsere Umwelt. Um die Ineffizienzen in einer linearen Wirtschaft zu verringern und sie rentabler zu machen sowie Umweltschäden und den damit verbundenen Klimawandel zu verringern, sollte die Welt zu einer Kreislaufwirtschaft übergehen. Eine Kreislaufwirtschaft zeichnet sich durch die sogenannten 3Rs aus: reduzieren, wiederverwenden und recyceln. Das spart Ressourcen und Energie. Diese Eigenschaften gelten auch für zirkuläre biochemische Stoffwechselwege, da reduzierte Mengen an Metaboliten wiederverwendet und recycelt werden.

Vor diesem Hintergrund sollte es nicht überraschen, dass der Harnstoff- und der TCA-Zyklus miteinander verbunden sind, zumal Fumarsäure ein Produkt des Harnstoffzyklus und ein zyklischer Metabolit des TCA-Zyklus ist. Außerdem ist Asparaginsäure für Oxalacetat nur einen Transaminatinschritt entfernt.

Einer der Stickstoffe im Harnstoff stammt aus dem Amin von Aspartat, das durch die Transaminierung von Oxalacetat aus dem TCA-Zyklus zu Aspartat gebildet werden kann. Da der TCA-Zyklus ein Zyklus ist, muss ein Äquivalent eines Oxalacetats in den Zyklus zurückkehren. Dies geschieht indirekt aus Fumarat, einem TCA-Zwischenprodukt, das als Nebenprodukt des Harnstoffzyklus produziert wird, aber das Fumarat wird im Zytoplasma produziert. Dort wird es in Malat umgewandelt, das durch ein Transportprotein, den mitochondrialen 2-Oxoglutarat/Malat-Transporter, in die Mitochondrien transportiert werden kann, der Teil eines weiteren in der Abbildung oben gezeigten Zyklus ist, der Asparat-Arginosuccinat-Shunt. Die Einführung von Fumarat in das Shuttle erfolgt durch die Asparat-Arginosuccinat-Shunt in der Abbildung oben gezeigt. Sobald Malat in die mitochondriale Matrix eindringt, kann es direkt in Oxalacetat umgewandelt werden.

Beachten Sie, dass diese verknüpften Zyklen das Vorhandensein von sowohl mitochondrialen als auch zytoplasmatischen Formen der verschiedenen Enzyme () und ein Gleichgewicht zwischen zwei Schlüsselaminosäuren über die mitochondriale Teilung hinweg erfordern, Gluatamat und Asparatat. Ein solches Schlüsselenzym ist WIEpartat Amino Transferase (AST), auch bekannt als glutamat ÖXalacetat TRansaminase (HABE), benannt nach der Umkehrreaktion von Aspartat + α−Ketoglutarat ↔ Oxalacetat + Glutamat. Wie im vorherigen Kapitelabschnitt erwähnt, kann dieses Schlüsselenzym bei einer Leberschädigung im Blut gefunden werden, daher werden seine Werte routinemäßig bei medizinischen Tests auf Leberfunktionsstörungen verwendet.

Eine weitere Schlüsselfunktion des Malat-Asparat-Shuttles besteht darin, reduzierte "Äquivalente" von NADH, das im Zytoplasma durch Glykolyse und Fettsäureoxidation produziert wird, in die Mitochondrien zu bringen. Es gibt keinen Membrantransporter für NAD+ oder NADH. Stattdessen kann zytoplasmatisches Malat, das durch die zytosolische Reduktion von Oxalacat durch NADH produziert wird, in die Matrix transportiert werden, die es bei der Rückumwandlung zu Oxalacetat wieder in mitochondriales NADH umwandeln kann. Das NADH kann dann verwendet werden, um die ATP-Produktion über mitochondriale Elektronentransport-/oxidative Phosphoylierungswege anzutreiben.

Aus energetischer Sicht werden vier Phosphoanhydrid-Bindungen in 2 ATP-Molekülen verwendet, um ein Harnstoffmolekül herzustellen. Dieser hohe Energieaufwand wird teilweise durch ATP ausgeglichen, das aus den "Fumarat-Äquivalenten" hergestellt wird, das durch die Asparat-Arginosuccinat- und Asparat-Arginosuccinat-Shunts und die Passage von NADH durch oxidative Phosphorylierung in die Mitochondrien gelangt.


Ontogenese von Stickstoffmetabolismus und -ausscheidung

Bei vielen Fischarten wird das frühe Muster des Stickstoffmetabolismus und der Stickstoffausscheidung durch die Dominanz von Aminosäuren als primärer Brennstoff und durch das daraus resultierende giftige Endprodukt Ammoniak beeinflusst. Pelagische Eier von marinen Knochenfischen beim Laichen enthalten einen großen Dotterpool von FAA. Während der letzten Eizellreifung entstehen die FAA durch Hydrolyse spezifischer Eigelbproteine ​​und unterstützen die Eihydratation. Zu Beginn der exogenen Fütterung nehmen Meeresfischlarven mit ihrer Zooplankton-Beute zwangsläufig einen neuen Vorrat an FAA auf und können so trotz geringer proteolytischer Kapazität des Darms eine Aminosäure-basierte Energiedissipation fortsetzen. Die Ausscheidungsraten von Ammoniak nehmen mit dem Entwicklungsstadium zu, aber auch zum Zeitpunkt des Schlüpfens sammelt sich Ammoniak in beträchtlichen Mengen an. In der Vergangenheit wurde die Harnstoffausscheidung bei Embryonen und Larven von Knochenfischen als von untergeordneter Bedeutung angesehen, aber in letzter Zeit wurden während der Embryogenese bei einigen Arten erhebliche Mengen an Enzymen des Harnstoffzyklus nachgewiesen, trotz geringer oder nicht nachweisbarer Spiegel bei den Erwachsenen. Die Mechanismen der Stickstoffausscheidung wurden nur bei Embryonen von Süßwasser-Regenbogenforellen untersucht, bei denen die Ammoniakausscheidung vom Partialdruckgradienten von NH . abhängt3. Zukünftige Forschungen zu einer Vielzahl von Arten mit unterschiedlichen Lebensgeschichten und Umgebungen werden unser Verständnis der Ontogenese der Stickstoffausscheidung erweitern.


Veränderte Muster der Stickstoffausscheidung und des Aminosäurekatabolismus während des Lebenszyklus des Meerneunauges (Petromyzon marinus)

Der kieferlose Fisch, das Meerneunauge (Petromyzon marinus), verbringt einen Teil seines Lebens als höhlenbewohnende, in Suspension ernährte Larve (Ammocoete), bevor er eine Metamorphose in ein frei schwimmendes, parasitisches Jungtier durchläuft, das sich vom Blut von Fischen ernährt. Wir sagten voraus, dass Tiere in diesem juvenilen, parasitären Stadium eine große Fähigkeit haben, Aminosäuren abzubauen, wenn große Mengen an proteinreichem Blut aufgenommen werden. Die sechs- bis 20-fach höheren Ammoniakausscheidungsraten (J(Amm)) bei postmetamorphen (nicht fressenden) und parasitären Neunaugen im Vergleich zu Ammocoeten legten nahe, dass die Basalraten des Aminosäurekatabolismus nach der Metamorphose anstiegen. Dies war wahrscheinlich auf eine größere basale Aminosäurekatabolisierungskapazität zurückzuführen, bei der die hepatische Glutamatdehydrogenase (GDH)-Aktivität bei parasitären Neunaugen im Vergleich zu Ammocoeten sechsmal höher war. Immunblotting zeigte auch, dass die GDH-Menge bei parasitären Neunaugen um das Zehnfache bzw. Dreifach höher war als bei Ammocoeten bzw. stromaufwärts wandernden Neunaugen. Höhere hepatische Alanin- und Aspartat-Aminotransferase-Aktivitäten bei den parasitären Neunaugen deuteten ebenfalls auf eine verbesserte Fähigkeit zum Abbau von Aminosäuren in diesem Lebensstadium hin. Im Gegensatz zu parasitären Neunaugen bestätigte der zweifach größere Pool freier Aminosäuren im Muskel von stromaufwärts liegenden Wanderneunaugen, dass diese Periode des natürlichen Hungers von einer ausgeprägten Proteolyse begleitet wird. Carbamoylphosphat-Synthetase III wurde in geringen Mengen in der Leber von parasitären und stromaufwärts wandernden Neunaugen nachgewiesen, es gab jedoch keine Hinweise auf eine extrahepatische (Muskel, Darm) Harnstoffproduktion über den Ornithin-Harnstoff-Zyklus. Der Nachweis der Arginaseaktivität und hoher Argininkonzentrationen in der Leber in allen untersuchten Lebensstadien lässt jedoch darauf schließen, dass die Argininhydrolyse eine wichtige Quelle für Harnstoff ist. Wir schließen daraus, dass die Metamorphose von einer metabolischen Reorganisation begleitet wird, die die Fähigkeit der parasitären Meerneunaugen erhöht, intermittierend große Aminosäuremengen, die durch die Aufnahme von proteinreichem Blut von ihren Beutetieren/Wirten entstehen, abzubauen. Die anschließende Erzeugung von energiereichen Kohlenstoffgerüsten kann dann oxidiert oder für die Glykogen- und Fettsäuresynthese zurückgehalten werden, die wesentliche Brennstoffe für die vorgelagerten Wanderungs- und Laichphasen des Lebenszyklus des Meerneunaugens sind.


Wie Insekten stickstoffhaltige Abfälle ausscheiden

Mikroorganismen und wirbellose Tiere verwenden primitivere und einfachere Mechanismen, um ihre Stoffwechselabfälle loszuwerden, als das Säugetiersystem der Nieren- und Harnfunktion. Drei Ausscheidungssysteme entwickelten sich in Organismen vor komplexen Nieren: Vakuolen, Flammenzellen und Malpighische Tubuli.

Lernziele

  • Erklären Sie, wie Vakuolen, die in Mikroorganismen vorhanden sind, Abfall ausscheiden
  • Beschreiben Sie, wie Flammenzellen und Nephridien in Würmern Ausscheidungsfunktionen erfüllen und das osmotische Gleichgewicht aufrechterhalten
  • Erklären Sie, wie Insekten Malpighische Tubuli verwenden, um Abfallstoffe auszuscheiden und das osmotische Gleichgewicht aufrechtzuerhalten
  • Identifizieren Sie allgemeine Abfälle und Abfallsysteme

Harnstofftransport

Das Harnstofftransporter (UT)-A1-Protein wird in der apikalen Plasmamembran des terminalen inneren medullären Sammelrohrs (IMCD) exprimiert (10�). Es besteht aus 12 transmembranumspannenden Domänen, die durch eine zytoplasmatische Schleife verbunden sind ( Abbildungen 2 und ​ und 3) 3 ) (13). UT-A3 ist die N-terminale Hälfte von UT-A1 und wird auch im IMCD, hauptsächlich in der basolateralen Membran, exprimiert, kann aber nach Vasopressin-Stimulation in der apikalen Membran nachgewiesen werden (14,15). UT-A2 ist die C-terminale Hälfte von UT-A1 und wird in der dünnen absteigenden Extremität exprimiert (11,15�). UT-A4 sind die N-terminalen 25 % von UT-A1, die an die C-terminalen 25 % gespleißt sind (11). Das UT-B1-Protein wird in roten Blutkörperchen (11, 16, 17) und in nicht gefensterten Endothelzellen exprimiert, die für die absteigende Vasa recta charakteristisch sind, insbesondere in denen, die außerhalb der Sammelrohrcluster liegen (18).

Harnstofftransporter entlang des Nephrons. Der Cartoon und die Histologie zeigen die Harnstofftransporter (UT-A1/UT-A3, UT-A2 und UT-B1) entlang des Nephrons. UT-B1 findet sich hauptsächlich in der Vasa recta, UT-A2 im dünnen absteigenden Schenkel der Henle-Schleife und UT-A1 (apikal) und UT-A3 (basolateral) im inneren Markraum. Abgeändert von Referenz 12, mit Genehmigung.

Die vier renalen UT-A-Proteinisoformen. UT-A1 ist das größte Protein mit 12 Transmembranhelices. Die Helices 6 und 7 sind durch eine große intrazelluläre Schleife verbunden, von der neuere Studien gezeigt haben, dass sie für die funktionellen Eigenschaften von UT-A1 von entscheidender Bedeutung ist (1). UT-A3 ist die N-terminale Hälfte von UT-A1, während UT-A2 die C-terminale Hälfte von UT-A1 ist. UT-A4 ist das N-terminale Viertel von UT-A1, das an das C-terminale Viertel gespleißt ist. Abgeändert von Referenz 13, mit Genehmigung.

Harnstoff-Handling entlang des Nephron

Harnstoff wird über den Glomerulus gefiltert und tritt in den proximalen Tubulus ein. Die Harnstoffkonzentration im Ultrafiltrat ähnelt der im Plasma, sodass die Harnstoffmenge, die in den proximalen Tubulus gelangt, durch die GFR gesteuert wird. Im Allgemeinen werden 30%�% der gefilterten Harnstofffracht ausgeschieden. Die Harnstoffkonzentration steigt in den ersten 75 % des proximalen Tubulusknäuels an und erreicht dort einen etwa 50 % höheren Wert als im Plasma (11). Dieser Anstieg resultiert aus der Entfernung von Wasser, sekundär zum Salztransport, und wird über den Rest des proximalen Tubulus aufrechterhalten. Der Harnstofftransport durch den proximalen Tubulus wird nicht durch Vasopressin (auch als antidiuretisches Hormon bezeichnet) reguliert, sondern wird durch eine Zunahme des Natriumtransports erhöht.

Es gibt zwei Arten von Henle-Schleifen: lange Schleifen in den juxtamedullären Nephronen und kurze Schleifen in den kortikalen Nephronen. Der Unterschied besteht darin, dass Nephronen mit kurzen Schlingen ein dünnes aufsteigendes Glied fehlt (Abbildung 4). Alle Teile der kurzen Schlingen sind für Harnstoff durchlässig, aber die Richtung und das Ausmaß der Harnstoffbewegung variieren mit dem diuretischen Zustand des Tieres (11). Die Harnstoffkonzentration im frühen distalen Tubulus (am Ende der Schleife) kann bei antidiuretischen Ratten das 7-fache der Plasmakonzentration erreichen, höher als die Konzentration am Anfang der Schleife. Daher unterstützen die dazwischenliegenden Segmente die Harnstoffsekretion unter antidiuretischen Bedingungen. Im Gegensatz dazu gibt es bei der Wasserdiurese keinen Unterschied in der proximalen tubulären Bewegung des Harnstoffs, während es in den kurzen Schlingen zu einer Nettoresorption von Harnstoff kommt (11).

Aufbau des Nephrons. Der Cartoon zeigt den Kortex (oben), die äußere Medulla (Mitte) und die innere Medulla (unten) und zeigt die Lage der verschiedenen Substrukturen des Nephrons, die wie folgt beschriftet sind: 1, Glomerulus 2, proximaler gewundener Tubulus 3S und 3l, proximaler gerader Tubulus im kurz geschlungenen Nephron (3S) und langes Nephron (3l) 4S und 4l, dünner absteigender Schenkel 5, dünner aufsteigender Schenkel 6S und 6l, medullärer dicker aufsteigender Schenkel 7, Macula densa 8, distaler gewundener Tubulus 9, kortikaler Sammelgang 10, äußerer medullärer Sammelgang 11, anfänglicher innerer medullärer Sammelgang und 12, endständiger innerer medullärer Sammelgang. Abgeändert von Referenz 11, mit Genehmigung der American Physiological Society.

Abbildung 5 fasst die Harnstoffpermeabilitäten für die verschiedenen Nephronsegmente der Rattenniere zusammen. Die Harnstoffdurchlässigkeit der proximalen gewundenen Tubuli ist höher als die der proximalen geraden Tubuli. Dünne absteigende Gliedmaßen kurzer Schlingen haben eine geringe Harnstoffdurchlässigkeit im äußeren Mark, aber eine höhere Harnstoffdurchlässigkeit in den langen Schlingen im inneren Mark. Die erhöhte intraluminale Harnstoffkonzentration in dünnen absteigenden Gliedmaßen resultiert aus einer Änderung des Harnstoff:Wasser-Verhältnisses aufgrund von Wasserverlust. Obwohl die bei verschiedenen Tieren gemessenen absoluten Harnstoffpermeabilitätswerte erhebliche Unterschiede aufweisen, besteht allgemein Einigkeit darüber, dass Harnstoff unter antidiuretischen Bedingungen in das Lumen dünner Gliedmaßen sezerniert wird (11). Darüber hinaus wird die Harnstoffkonzentration durch die Wasserresorption erhöht, die durch das hypertone medulläre Interstitium getrieben wird, das aus der Bewegung von Harnstoff aus dem IMCD resultiert.

Gemessene Harnstoffpermeabilitäten in den verschiedenen Nephronabschnitten einer Rattenniere. CCD, kortikaler Sammelrohr DCT, distaler gewundener Tubulus IMCD, innerer medullärer Sammelrohr mTAL, medullärer dicker aufsteigender Schenkel OMCD, äußerer medullärer Sammelgang PCT, proximaler gewundener Tubulus PST, proximaler gerader Tubulus tAL, dünner aufsteigender Schenkel tDL, dünner absteigender Schenkel. Abgeändert von Referenz 11, mit Genehmigung der American Physiological Society.

Die Harnstoffkonzentration steigt in dünnen aufsteigenden Gliedmaßen (11) aufgrund des Gradienten für die Harnstoffsekretion, der durch die Harnstoffresorption aus dem IMCD bereitgestellt wird. Der Gradient nimmt ab, wenn dünne aufsteigende Gliedmaßen aufsteigen, und die treibende Kraft, um Harnstoff in das röhrenförmige Lumen zu bewegen, nimmt ebenfalls ab. Die Harnstoffkonzentration erreicht zu Beginn des dicken aufsteigenden Marks ein mit dem umgebenden Interstitium äquiosmolares Niveau. Im Gegensatz zu dünnen aufsteigenden Gliedmaßen haben dicke aufsteigende Gliedmaßen eine geringere Harnstoffdurchlässigkeit (11,16). Es gibt jedoch insgesamt eine Zunahme der Harnstoffkonzentration im Lumen vom Beginn des dicken aufsteigenden Schenkels bis zum distalen gewundenen Tubulus.

Der distale gewundene Tubulus weist eine geringe Harnstoffdurchlässigkeit auf, jedoch wird in diesem Abschnitt etwas Harnstoff resorbiert, so dass die Harnstoffkonzentration von ungefähr 110% der gefilterten Beladung durch den Anfangsabschnitt des kortikalen Sammelgangs auf ungefähr 70% abnimmt. Sowohl die kortikalen als auch die äußeren medullären Sammelrohre weisen eine geringe Harnstoffpermeabilität auf (11,16). Im Gegensatz dazu weist das IMCD eine hohe Harnstoffpermeabilität auf, die durch Vasopressin erhöht wird. Es kommt zu einer ausgedehnten Harnstoffresorption aus dem IMCD-Lumen in das Interstitium. Die aus dem IMCD austretende röhrenförmige Flüssigkeit (Urin) enthält etwa 50 % der gefilterten Harnstoffmenge.

Urinkonzentrationsmechanismus

Harnstoff und Harnstofftransporter spielen bei den inneren Markprozessen zur Produktion von konzentriertem Urin eine Schlüsselrolle. Die Bedeutung von Harnstoff wird seit fast 8 Jahrzehnten geschätzt, seit Gamble et al. erstmals beschrieben ȁkann Wassersparsamkeit in der Nierenfunktion bezogen auf Harnstoff” (19). Proteinmangel reduziert die maximale Konzentrationsfähigkeit des Urins und wird durch Harnstoffinfusion oder Korrektur der Proteinmangelernährung wiederhergestellt (11,16). Eine verminderte maximale Urinkonzentrationsfähigkeit ist bei mehreren gentechnisch veränderten Mäusen vorhanden, denen unterschiedliche Harnstofftransporter fehlen, einschließlich UT-A1/A3-, UT-A2-, UT-B1- und UT-A2/B1-Knockout-Mäusen (11,12,16) . Obwohl der Mechanismus, durch den das innere Mark den Urin konzentriert, umstritten bleibt, muss also ein von Harnstoff oder Harnstofftransportern abgeleiteter Effekt eine Rolle spielen (11,16,17).

Der am weitesten verbreitete Mechanismus für die Produktion von konzentriertem Urin im inneren Mark ist die Hypothese des passiven Mechanismus, die von Kokko und Rector (20) und Stephenson (21) vorgeschlagen wurde. Der passive Mechanismus erfordert, dass die interstitielle Harnstoffkonzentration des inneren Markraums die Harnstoffkonzentration im Lumen des dünnen aufsteigenden Gliedes überschreitet. Wird dem tiefen inneren Mark eine unzureichende Harnstoffmenge zugeführt, ist die Konzentrationsfähigkeit des Urins herabgesetzt, da die für die passive NaCl-Resorption aus dem dünnen aufsteigenden Glied notwendigen chemischen Gradienten nicht hergestellt werden können. Der primäre Mechanismus für die Harnstoffabgabe in das innere medulläre Interstitium ist die Harnstoffresorption aus dem terminalen IMCD (22). Die Harnstoffresorption wird durch die Harnstofftransporterproteine ​​UT-A1 und UT-A3 vermittelt (11, 16, 17). Abbildung 2 zeigt die Lage der wichtigsten Harnstofftransportproteine, die an der Urinkonzentration beteiligt sind.

Auch der UT-B1-Harnstofftransporter spielt eine wichtige Rolle bei der Urinkonzentration (11). Das UT-B1-Protein wird in roten Blutkörperchen und der absteigenden Vasa recta exprimiert (11). UT-B1 ist das Kidd-Blutgruppenantigen, ein untergeordnetes Blutgruppenantigen. Menschen mit UT-B1-Mangel können ihren Urin nicht konzentrieren 𾠀 mOsm/kg H2O, auch nach Wasserentzug und Vasopressingabe (23). UT-B1-Knockout-Mäuse haben im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen auch eine reduzierte maximale Urinkonzentrationsfähigkeit (24). Diese Daten legen nahe, dass der Harnstofftransport in den roten Blutkörperchen für einen effizienten Gegenstromaustausch wichtig ist, der für eine maximale Urinkonzentration erforderlich ist (25). Wenn rote Blutkörperchen in die Medulla absteigen, sammeln sie Harnstoff an, um im osmotischen Gleichgewicht mit dem medullären Interstitium zu bleiben. Wenn die roten Blutkörperchen in der aufsteigenden Vasa recta aufsteigen, müssen sie Harnstoff verlieren. In Abwesenheit von UT-B1 sind die roten Blutkörperchen nicht in der Lage, Harnstoff schnell genug zu verlieren und einen Teil des Harnstoffs aus dem Mark in den Blutkreislauf aufzunehmen, wodurch die Effizienz des Gegenstromaustauschs und die Konzentrationsfähigkeit des Urins verringert werden (25).

Schnelle Regulation von Harnstoff-Transporterproteinen

Vasopressin.

Vasopressin reguliert die beiden IMCD-Harnstofftransporter UT-A1 und UT-A3. Vasopressin erhöht die Phosphorylierung und die Akkumulation der apikalen Plasmamembran von UT-A1 und UT-A3 (14, 26). Vasopressin phosphoryliert die Serine 486 und 499 in UT-A1, und beide müssen mutiert werden, um die Vasopressin-Stimulation zu eliminieren (27). Vasopressin erhöht den Harnstofftransport, die Harnstofftransporterphosphorylierung und die Akkumulation der apikalen Plasmamembran durch zwei cAMP-abhängige Wege: Proteinkinase A und durch cAMP aktiviertes Austauschprotein (28) ( 6 ). Gentechnisch veränderte Mäuse, denen UT-A1 und UT-A3 fehlen, haben eine reduzierte Urinkonzentrationsfähigkeit, einen reduzierten interstitiellen Harnstoffgehalt im inneren Mark und keinen durch Vasopressin stimulierten Harnstofftransport in ihren IMCDs (29).

Harnstofftransport durch eine IMCD-Zelle. Vasopressin bindet an das V2R, befindet sich auf der basolateralen Plasmamembran und aktiviert die α Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins Gsα. Die Aktivierung des G-Proteins stimuliert AC zur Synthese von cAMP. Der Anstieg von intrazellulärem cAMP stimuliert mehrere nachgeschaltete Proteine, einschließlich PKA und Epac, die UT-A1 phosphorylieren und seine Akkumulation in der apikalen Plasmamembran erhöhen. Harnstoff tritt durch UT-A1 in die IMCD-Zelle ein und tritt an der basolateralen Plasmamembran aus über UT-A3. AC, Adenylylcyclase Epac, Austauschprotein direkt aktiviert durch cAMP Gs, G-Protein stimulierende Untereinheit P, Phosphat PKA, Proteinkinase A V2R, V2 Vasopressin-Rezeptor. Abgeändert von Referenz 13 mit Genehmigung.

Hypertonie.

Der Harnstofftransport über das IMCD wird unabhängig durch Hypertonie reguliert (11,16,17). Die Harnstoffpermeabilität steigt bei perfundierten IMCDs bei erhöhter Osmolalität schnell an, selbst in Abwesenheit von Vasopressin (30, 31). Vasopressin und Hyperosmolalität haben eine additive stimulierende Wirkung auf die Harnstoffpermeabilität (11,16,17). Hyperosmolalität erhöht, ähnlich wie Vasopressin, die Phosphorylierung und die Plasmamembranakkumulation von sowohl UT-A1 als auch UT-A3 (14,26,32,33). Hyperosmolalität und Vasopressin signalisieren jedoch über verschiedene Wege: Hyperosmolalität über Anstieg der Proteinkinase Cα und intrazelluläres Kalzium und Vasopressin über Anstieg der Adenylylcyclase (11,16,17). Hyperosmolalität stimuliert nicht den Harnstofftransport in der Proteinkinase Cα Knockout-Mäuse und sie haben einen Urinkonzentrationsdefekt (31,34,35).

Langfristige Regulierung von Harnstofftransportern

Vasopressin.

Vasopressin reguliert langfristig die IMCD-Harnstofftransporter durch Veränderungen der Proteinhäufigkeit (11,16,17). Die Verabreichung von Vasopressin über 2 Wochen an Ratten, die einen angeborenen Mangel an Vasopressin haben und daher einen zentralen Diabetes insipidus haben, erhöht die UT-A1-Proteinhäufigkeit im inneren Mark (36). Das Unterdrücken von endogenem Vasopressin durch wasserbeladene Ratten für 2 Wochen verringert die UT-A1-Proteinhäufigkeit (36). Der Anstieg der UT-A1-Proteinhäufigkeit nach Vasopressin-Gabe entspricht dem Zeitverlauf für den Anstieg des inneren medullären Harnstoffgehalts nach Vasopressin-Gabe an Ratten, die einen angeborenen Mangel an Vasopressin haben. Die UT-A3-Proteinexpression ist bei Ratten, die 3 Tage lang mit Wasser versorgt werden, verringert und bei Ratten, die 3 Tage lang mit Wasser eingeschränkt werden, erhöht. Die Wirkung von Vasopressin auf die UT-B1-Häufigkeit ist unklar, da einige Studien eine Zunahme und andere eine Abnahme zeigen (11,16,17).

Proteinarme Diäten.

Rats fed a low-protein diet for at least 2 weeks have a decrease in the fractional excretion of urea (37). This results, at least in part, from the functional expression of vasopressin-stimulated urea permeability in the initial IMCD, a segment in which it is not normally present, and an increase in UT-A1 protein abundance (11,16,17). The effect of a low-protein diet on the other urea transporters has not been studied.

Adrenal Steroids.

Glucocorticoids increase the fractional excretion of urea (38). Despite this increase, serum urea nitrogen (SUN) increases in patients given glucocorticoids. This indicates that the increase in urea excretion is insufficient to offset the increase in production in patients given glucocorticoids.

Adrenalectomy, which eliminates both glucocorticoids and mineralocorticoids, produces a urine concentrating defect, although the mechanism is unknown (11). Adrenalectomy increases UT-A1 protein abundance and urea permeability in rat terminal IMCDs (39). Administering dexamethasone to adrenalectomized rats decreases UT-A1 protein abundance and urea permeability (39). Both UT-A1 and UT-A3 protein abundances decrease in rats given dexamethasone (40). The decrease in urea transporters in dexamethasone-treated rats could explain the increase in the fractional excretion of urea because a reduction in urea transporter abundance could result in less urea being reabsorbed and, thus, more being excreted.

Administering mineralocorticoids to adrenalectomized rats also decreases UT-A1 protein abundance in the inner medulla (41). This decrease can be blocked by spironolactone, a mineralocorticoid receptor antagonist (41). Both mineralocorticoid and glucocorticoid hormones appear to work through their respective receptors because spironolactone does not block the decrease due to dexamethasone (41).

Acidosis.

Metabolic acidosis is a common complication of renal failure. Acidosis increases protein degradation and shifts the nitrogen and urea loads within the kidney (42). UT-A1 protein abundance increases in the inner medulla of acidotic rats, which may represent compensation for the loss of kidney concentrating ability (increase in urine volume and a decrease in urine osmolality) that occurs during acidosis (43).

Hypokalemia.

Prolonged hypokalemia can cause a decrease in urine concentrating ability (44). The abundance of UT-A1, UT-A3, and UT-B1 proteins in the inner medulla is reduced in rats fed a potassium-restricted diet (44,45). UT-A2 protein abundance was reduced in one study but increased in another (44,45). The reason for the different findings is unclear.

In summary, renal urea transport and urea transport proteins mediate a central role in the urine concentrating mechanism. Urine concentrating defects have been demonstrated in several urea transporter knockout mice (11,12,16). In many clinical conditions associated with altered urine concentrating ability or water homeostasis, changes in urea excretion and urea transporters may be contributory factors.


Materialen und Methoden

Experimental animals

Laboratory-reared Rivulus marmoratus Poey were maintained as described previously (Frick and Wright, 2002). Wild-caught fish were collected from Twin Cays and Little Lagoon Cay, near Dangriga, Belize, and held as described previously (Frick and Wright, 2002).

Experimental protocol

Excretion during emersion

Two separate experiments were performed on laboratory-reared fish. (i) Fish were exposed in air for 12 h (n=18) and then returned to water excretion rates were measured every 2 h following emersion and compared with rates measured ‘pre-emersion’. (ii) Fish were exposed in air for 11 days (n=6), and excretion rates were measured during emersion and compared with rates measured in fish under control conditions (immersion).

Under air-exposed conditions, the fish were removed from water and placed onto a moist substratum (filter paper and cotton batting saturated with approximately 2 ml of 16 ‰ sea water). In experiment ii, the amount of urea and ammonia excreted over a 24 h period was measured after 1, 3, 5, 7, 9 and 11 days of air-exposure and under control conditions. Technical control experiments were performed in which a known amount of ammonia and urea were placed on the filter paper and left for 24 h to determine whether there was any loss (or gain) due to bacterial contamination or other factors. The filter paper and cotton were collected after 24 h, and the water was carefully extracted.

Ammonia volatilization

To measure the amount of ammonia excreted through volatilization, an apparatus was constructed similar to that used by Davenport and Sayer (1986). Air was first bubbled through acidified distilled water (ADW) (pH 6) to remove any ammonia in the air supply. The air was then passed into a second chamber containing the fish on filter paper saturated with 16 ‰ sea water at pH 6. The air exiting the second chamber was bubbled through a third chamber containing 0.5 mol l –1 KOH, which removed CO2. Air from the third chamber was bubbled through five separate acid traps each containing ADW to ‘fix’ any ammonia present in the air. Preliminary studies showed that five acid traps were necessary to ensure maximal recovery of the volatilized ammonia. Control trials were run in which filter paper was saturated (i) with ammonia-free, pH 6, 16 ‰ sea water or (ii) with a known amount of ammonia (100 μmol l –1 ) in 16 ‰ sea water, pH 6. These control trials established that no ammonia volatilization was measured in the absence of a fish.

Routes of excretion

To determine the sites of JAmm und JUrea in laboratory-reared R. marmoratus, a Plexiglas chamber (see Wells and Pinder, 1996) was used to separate the anterior (representing primarily branchial excretion) and posterior (cutaneous, kidney and intestinal excretion) of the fish. Fish were lightly anaesthetized in 2-phenoxy-ethanol (1.2 ml l –1 ) to reduce stress during the restraining period. The head end of the fish was then positioned through a small hole (approximately 5 mm in diameter) in a 3 cm×3 cm piece of dental dam, forming a tight seal around the fish just posterior to the operculum. Under control conditions (n=7), 4 ml of 16 ‰ sea water was placed into both the front and back ends of the chamber. In a separate group of fish, moist pieces of cotton were placed in the front and back ends of the chamber during air-exposure (n=7). After 1 h, water or cotton/filter samples were collected for later determination of ammonia and urea concentrations. In a preliminary experiment, to test for leakage across the dental dam barrier, a dye was placed in one half of the chamber and distilled water in the other half. Absorbance at 660 nm was used to quantify leakage. There was negligible (<1 %) leakage between the anterior and posterior portions of the chamber.

Nitrogen metabolism

Laboratory-reared fish held under air-exposed and control conditions were killed after 1, 4 and 10 days. Tissue samples were stored at –80°C and analysed within 3 weeks. Tissue ammonia, urea and FAA levels and enzyme activities were measured in whole-body samples (n=6) as adequate amounts of individual tissues were not available because of the small size of the fish and the limited number of fish available. Although whole-animal samples include both intracellular and extracellular fluid, values represent mostly tissue intracellular concentrations (approximately 95 % of volume).

Amphibious fish typically experience water loss during emersion, which could concentrate tissue solutes (e.g. ammonia, urea or FAAs). Wet mass measurements were taken in laboratory-reared fish after 1, 3 and 10 days of air-exposure (n=7) and under control conditions (n=7) to test for significant mass loss.

Analytical techniques

Ammonia and urea analyses

The concentrations of ammonia and urea levels in the water were determined as described previously (Frick and Wright, 2002). Ammonia levels in the acid traps of the volatilization experiment were determined using the method of Verdouw et al. (1978).

Tissue ammonia and urea levels of whole fish were determined as described previously (Frick and Wright, 2002) and were expressed as mmol N g –1 wet mass. All spectrophotometric measurements were performed using a Perkin Elmer UV/VIS spectrophotometer (Lambda 2) (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA).

Tissue amino acid analysis

Tissue FAA levels were measured using high-performance liquid chromatography (HPLC) (Hewlett-Packard series II 1090 liquid chromatograph), as described previously (Frick and Wright, 2002).

Enzyme analysis

Frozen tissues (whole fish) were ground to a fine powder under liquid nitrogen. The powdered tissue was then diluted 23-fold with extract buffer (50 mmol l –1 Hepes buffer, pH 7.5, 50 mmol l –1 KCl, 1 mmol l –1 dithiothreitol and 0.5 mmol l –1 EDTA), homogenized on ice (Euro Turrax T20b homogenizer) for three bursts of 10 s and then sonicated (Vibracell CV18 2368) for three bursts of 10 s. The homogenate was centrifuged (14 000 g, 4°C) for 10 min, and the resulting supernatant was used to measure the activities of the enzymes Ala-AT, Asp-AT, GDH, ME, CCO and CS. For the OUC enzymes (CPSase, OTCase and ARG) and the accessory enzyme GS, an additional step was carried out. The resulting supernatant was passed through a Sephadex G-25 column (10 ml) equilibrated with extract buffer to remove low-molecular mass (<5000 g mol –1 ) substrates and effectors (Felskie et al., 1998). The protein concentration of the extract was measured before and after filtration to calculate the dilution factor of the column.

The activities of OUC enzymes were measured as described previously: OTCase by Wright et al. (1995), ARG by Felskie et al. (1998) and GS by Shankar and Anderson (1985). CPSase activity was determined using the reaction mixture described by Chadwick and Wright (1999), and [ 14 C]carbamoyl phosphate production was measured using the technique described by Anderson et al. (1970). OTCase, ARG, GS and CPSase activities were measured at 27°C for consistency with methods in the literature. The limits of detection for these assays were estimated to be 0.04 nmol g –1 min –1 for CPSase, 0.01 μmol g –1 min –1 for OTCase and ARG and 0.08 μmol g –1 min –1 for GS (Chadwick and Wright, 1999).

The activities of both CPSase II and III were measured. CPSase II requires glutamine as a substrate, does not require N-acetylglutamate, AGA (nor is it affected by the addition of AGA) and is inhibited by UTP. CPSase III requires glutamine and AGA as substrates, and is not inhibited by UTP. Thus, to differentiate between CPSase II and III, activities were measured in the presence of glutamine alone (CPSase II), glutamine+AGA (CPSase II and III) and glutamine+AGA+UTP (CPSase III). To assess the ability of these fish to utilize ammonia as a substrate in the OUC rather than glutamine (as reported in H. fossilis) (Saha et al., 1997), preliminary tests were run using 5 mmol l –1 NH4Cl in place of glutamine. As activities in the presence of ammonia were relatively low compared with activities in the presence of glutamine, only glutamine was used as a substrate in subsequent experiments.

GDH, Ala-AT, Asp-AT, CS and ME were measured at 25°C, as described by Singer and Ballantyne (1991). CCO activity was measured at 25°C using the assay of Blier and Guderley (1988). The protein concentrations of extracts were measured using the method of Bradford (1976) with bovine serum albumin as a standard.

Statistical analyses

All data are presented as means ± standard error of the mean ( s.e.m .). Single-factor analyses of variance (ANOVAs) were used to examine the differences between control and air-exposed values for tissue analysis (levels of urea and ammonia and enzyme activities) and excretion rates. Amino acid data were analyzed using a General Linear models procedure using the SAS system (version 6.12 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The Tukey test was used to determine where differences were significant (P⩽0.05) between treatment and control fish. Assumptions for normality were verified by generating appropriate residual plots. Data transformations (logarithmic, square root and inverse square root) were used when appropriate to meet the above assumptions.


18.3: Nitrogen Excretion and the Urea Cycle - Biology

Sixteen male Holstein calves were assigned to four treatments at 3 days of age. Treatments were whole milk, an all milk protein commercial replacer, a whey protein milk replacer, and a high fat whey protein milk replacer all fed at 10% of body weight. All treatments were isonitrogenous. Chopped wheat straw was fed ad libitum. Calves underwent preputial re-section for collection of urine. Five-day nitrogen balance trials were at 1, 5, 9, and 13 wk. Basic nitrogenous components of urine were separated with an amino acid analyzer. Analysis of body weights and straw intakes by balance period showed no differences. Nitrogen balance was lower for the whey protein and high fat milk replacers than for milk. Nitrogen digested was lower for commercial and whey protein milk replacers than for milk. Nitrogen retained was lower for the commercial, whey protein, and high fat milk replacers than for milk. Nitrogen excretion in urine and feces was greater for the commercial milk replacer treatment. The excretion of ornithine, arginine, lysine, 1-methylhistidine, and 3-methylhistidine was greater in the urine of the commercial and high fat milk replacer groups than in the urine of the milk group. Several ninhydrin positive compounds also were increased. Quantitative measurement of excreted basic nitrogenous compounds in urine may improve the evaluation of nitrogen metabolism in balance experiments.

Nutrition Institute, Ruminant Nutrition Laboratory. Beltsville, MD 20705.

Nutrition Institute, Dairy Food Nutrition Laboratory, Beltsville, MD 20705.


Abstrakt

In living organisms, nitrogen arise primarily as ammonia (NH3) and ammonium (NH4 + ), which is a main component of the nucleic acid pool and proteins. Although nitrogen is essential for growth and maintenance in animals, but when the nitrogenous compounds exceeds the normal range which can quickly lead to toxicity and death. Urea cycle is the common pathway for the disposal of excess nitrogen through urea biosynthesis. Hyperammonemia is a consistent finding in many neurological disorders including congenital urea cycle disorders, reye’s syndrome and acute liver failure leads to deleterious effects. Hyperammonemia and liver failure results in glutamatergic neurotransmission which contributes to the alteration in the function of the glutamate-nitric oxide-cGMP pathway, modulates the important cerebral process. Even though ammonia is essential for normal functioning of the central nervous system (CNS), in particular high concentrations of ammonia exposure to the brain leads to the alterations of glutamate transport by the transporters. Several glutamate transporters have been recognized in the central nervous system and each has a unique physiological property and distribution. The loss of glutamate transporter activity in brain during acute liver failure and hyperammonemia is allied with increased extracellular brain glutamate concentrations which may be conscientious for the cerebral edema and ultimately cell death.


Urea Production and Metabolism

Clinical Uses

Uremic symptoms are principally due to the accumulation of ions and toxic compounds in body fluids (79). Because protein-rich foods are the major source of these waste products, CKD can be considered a condition of protein intolerance. Indeed, it has been known since at least 1869 that restricting the amount of protein in the diet of patients with kidney diseases improves their uremic symptoms (80). More recently, we learned that dialysis efficacy is reflected in the removal of urea because changes in urea accumulation reflect changes in accumulated metabolic waste products. Again, this is not a new concept: The link between dietary protein and urea has been recognized since at least 1905, when Folin reported that urea excretion varies directly with different levels of dietary protein (81). These relationships were elegantly documented by Cottini et al. (Figure 12), who fed patients with CKD different amounts of protein (expressed on the abscissa as nitrogen intake because 16% of protein is nitrogen) (82). With low levels of dietary protein (e.g., approximately 12 g protein/d equivalent to approximately 2.5 g nitrogen), nitrogen balance was negative, indicating that this level of dietary protein causes progressive loss of protein stores. When the diet was raised >4 g nitrogen/d, nitrogen balance became positive, signifying that protein stores were being maintained. With progressively more dietary protein, nitrogen balance remained positive but changed minimally. Instead, when dietary protein was above the level required to maintain nitrogen balance and protein stores, it was used to make urea. Clearly, urea production reflects the level of protein in the diet and the risk of developing complications of uremia. In addition, a high-protein diet invariably contains excesses of salt, potassium, phosphates, and so forth (83). The clinical problems that arise from high-protein diets in patients with CKD were recently highlighted in reports concluding that increases in salt intake or serum phosphorus will block the beneficial influence of angiotensin-converting enzyme inhibitors to delay the progression of CKD (84,85).

Urea excretion in adult humans with varying degrees of kidney malfunction fed milk, egg, or an amino acid mixture: assessment of nitrogen balance. Modified from reference 82, with permission.

Urea has special properties that can be used to evaluate the severity of uremia or the degree of compliance with prescribed changes in the diet. These properties include the following: (1) a very large capacity for hepatic urea production from amino acids, (2) urea is the major circulating pool of nitrogen and it crosses cell membranes readily so there is no gradient from intracellular to extracellular fluid under steady-state conditions, and (3) the volume of distribution of urea is the same as water (the urea space is estimated as 60% of body weight) (86–88).

One clinically useful calculation is the steady-state SUN (SSUN), which reflects the severity of uremia because it estimates the degree of accumulation of protein-derived waste products. The SSUN calculation is useful because uremic symptoms are unusual when SSUN is <70 mg/dl.

The requirements for the calculation are that the patient with CKD is in the steady state (i.e., his or her SUN and weight are stable) and urea clearance in liters per day is known. Using the equation below, the amount of dietary protein that will yield a SSUN of 70 mg/dl can be calculated as: The following steps are used to calculate the SSUN. First, the prescribed dietary protein in grams per day is converted into dietary nitrogen by multiplying the grams per day of dietary protein by 16%. Second, the nonurea nitrogen in grams of nitrogen excreted per day is calculated as the excretion of all forms of nitrogen except urea. This amount is approximated as 0.031 g nitrogen/kg per day multiplied by the nonedematous, ideal body weight (4,89). Third, the nonurea nitrogen is subtracted from the nitrogen intake to obtain the amount of urea nitrogen that must be excreted each day in the steady state. Finally, dividing the urea nitrogen excretion in grams per day by the urea clearance in liters per day yields the SSUN in grams per liter.

For example, consider a 70-kg adult with a urea clearance of 14.4 L/d (or 10 ml/min) who is eating 76 g protein/d. His SSUN (in grams per liter) is calculated from the following: 12.2 g/d dietary nitrogen−(0.031 g nitrogen/kg per day times 70 kg). The result is divided by the urea clearance in liters per day and multiplied by 100 to convert SSUN 0.69 g/L to 69 mg/dl.

This calculation arises from the demonstration that in the steady state, the production of urea is directly proportional to the daily protein intake (Figure 12). The only other assumption is that urea clearance is independent of the plasma urea concentration, which is reasonable for patients with CKD. The key concept is that steady-state concentrations of nitrogen-containing waste product produced during protein catabolism will increase in parallel to an increase in the SSUN (4,82,89). By varying the amount of dietary protein, changes in the diet can be integrated with different values of the SSUN. As shown in Table 1, similar concepts can be used to determine whether a patient is complying with the prescribed protein content of the diet (81,86,88).

Estimation of protein intake from urea metabolism

These examples emphasize that the net production of urea in patients with CKD (also known as the urea appearance rate) can be used to estimate protein intake (4,82,89). For dialysis patients, the same relationships have been labeled as “urea generation” or the “normalized protein catabolic rate” (nPCR). Obviously, the nPCR equals the net urea production rate or the urea appearance rate except that it is not expressed per kilogram of body weight. However, the designation nPCR is misleading because the rates of protein synthesis and “catabolism” are far greater than the protein catabolic rate: The nitrogen flux in protein synthesis and degradation amounts to 45–55 g nitrogen/d, equivalent to 280–350 g protein/d (1). The principle of conservation of mass, however, indicates the difference between whole-body protein synthesis and degradation does estimate waste nitrogen production.

Urea Nitrogen Reutilization

Discussion of urea metabolism would be incomplete without addressing urea degradation. It is calculated from the plasma disappearance of injected [ 14 C]urea or [ 15 N]urea (88,90) and averages about 3.6 g nitrogen/d in both normal individuals and patients with uremia. The 3.6 g nitrogen/d arises from degradation of urea by ureases of gastrointestinal bacteria thereby supplying ammonia directly to the liver (88). Because this source of nitrogen could be used to synthesize amino acids and ultimately protein, the degradation of urea has been intensively studied (91). The evidence negates the hypothesis that urea degradation is nutritionally important. First, the amount of urea degraded has been expressed as an extrarenal urea clearance by dividing the rate of urea degradation by the SSUN. In normal adults, the extrarenal urea clearance averages approximately 24 L/d if this value were present in patients with CKD and a high SUN, the amount of ammonia derived from urea would be very high (79,88). However, the quantity of ammonia arising from urea in patients with CKD is not significantly different from that of normal individuals, indicating that the extrarenal clearance of urea in patients with CKD must be greatly reduced the mechanism for this observation is unknown (88).

Results from other testing strategies lead to the conclusion that it is unlikely that urea degradation contributes a nutritionally important source of amino acids to synthesize protein. We fed patients with CKD a protein-restricted diet and measured the turnover of urea using [ 14 C]urea. The results were compared with those obtained in a second experiment in which patients received neomycin/kanamycin as nonabsorbable antibiotics in order to inhibit bacteria that were degrading urea. In roughly half of the patients, antibiotic administration blocked urea degradation but there was no associated increase in urea appearance. This result means that ammonia arising from degradation is simply recycled into urea production and hence does not change urea appearance (90). We also addressed the hypothesis that removal of nitrogen released by urea degradation would suppress synthesis of amino acids and thereby worsen Bn. In this case, the hypothesis was rejected because inhibiting urea degradation with nonabsorbable antibiotics actually improved Bn (92). Finally, Varcoe et al. measured the turnover of urea and albumin simultaneously and concluded that the contribution of urea degradation to albumin synthesis was minimal (93).

The possibility that ammonia from urea degradation is used to synthesize amino acids was recently examined in hibernating bears (94). The authors noted that hibernating bears have very low values of SSUN (approximately 5–10 mg/dl) despite a decrease in GFR and they suggested that SSUN was low because urea was being used to synthesize amino acids. This finding would contribute to another oddity of hibernating bears, namely that their muscle mass and other stores of protein are relatively “spared” from degradation. Why the metabolism of hibernating bears might differ from that of patients with CKD is unknown and we applaud the investigators who gathered the information as experimenting on bears is quite tricky, even if they are hibernating.

Is Urea Toxic?

Because excess dietary protein produces uremic symptoms and because urea is the major source of circulating nitrogen, the potential for toxic responses to urea have been investigated using different experimental designs. Johnson et al. added urea to the dialysate of hemodialysis patients who were otherwise well dialyzed (95). Complications induced by the added urea were minimal until the SSUN was chronically >150–200 mg/dl. This led to gastrointestinal irritation. There was no investigation of ammonia or inhibitors of urea degradation so the effect of urea can only be considered an association. An indirect evaluation of both mice with CKD and cultured cells revealed that urea may stimulate the production of reactive oxygen species. Reddy et al. concluded that a high SUN not only increased reactive oxygen species but also caused insulin resistance (96). However, it is difficult to assign insulin resistance to a single factor considering that there are so many uremia-induced complex metabolic pathways (97,98). It will be interesting to evaluate whether the production of reactive oxygen species initiates similar events in patients with CKD.

Another potential role of urea in producing uremia-induced toxicity is through the development of protein carbamylation, which could disrupt the structure of a protein interfering with signaling pathways and so forth. Stim et al. reported that the rate of carbamylation of hemoglobin increased in parallel with the increase in SUN and that carbamylation was significantly higher in patients with ESRD compared with normal individuals (99). These responses were confirmed by Berg et al. (100) except that the carbamylated protein was albumin, rather than hemoglobin. Thus, carbamylation of several proteins can occur in uremic individuals but whether this produces toxic reactions has not been defined.

Finally, there are patient-based reports that cast doubt on the hypothesis that urea is a toxin. Hsu et al. studied a man and a woman from a family of patients who had chronic but unexplained azotemia. Results of the evaluation indicated that the high SUN arose from a autosomal dominant genetic defect in urea reabsorption (101). Kidney function of the two participants revealed subnormal urea clearances but otherwise normal values of inulin clearance, urea excretion, and responses of urea clearance to diuresis and antidiuresis plus normal sodium clearances. Although the mechanism for the familial azotemia was not identified, the report is relevant because the participants had no clinical or laboratory findings attributable to the increase in SUN despite years of values varying from 49 to 65 mg/dl and from 55 to 60 mg/dl, respectively. In another case study, Richards and Brown studied a woman with prolonged azotemia to examine the association between a high SUN and the development of uremic symptoms (102). The participant subsisted on a diet consisting primarily of fish and a protein powder, yielding urea nitrogen production rates of 40–50 g/d for years. Although the participant maintained a SUN of 50–80 mg/dl for years, she had normal values of hemoglobin, plasma creatinine, BP, and no weight loss. Together, these reports indicate that even a prolonged increase in the concentration of urea does not produce toxic reactions, at least in patients with normal kidney function.

Urea is the largest circulating pool of nitrogen and its production changes in parallel to the degradation of dietary and endogenous proteins. These facts and other properties of urea can be used to estimate the degree of uremia and the compliance with prescribed amounts protein in the diet. The available evidence in patients with CKD suggests that reutilization of ammonia derived from urea degradation for the synthesis of amino acids and proteins is minimal. Whether the evidence would be more persuasive under extreme conditions, such as in hibernating bears, is unknown. The ability of urea to create toxicity is unsettled but years of high SUN values do not produce toxic reactions in individuals with otherwise normal kidney function.

In conclusion, renal urea and ammonia metabolism mediate critical roles in nitrogen balance, urine concentration, and acid-base homeostasis. In this review, we evaluated critical processes involved in these homeostatic mechanisms. Abnormal urea and ammonia metabolism both result from and can lead to a wide variety of conditions, including methods for evaluating issues that are critical to caring for patients with impaired renal function.