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Wie werden lipidbeschichtete mRNA-basierte Impfstoffe zur Expression in Zellen transportiert?

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In dem Video von CNN sagt der Wissenschaftler, dass der Coronavirus-Impfstoff bis 2021 nach ca00:25„Robin Shattock, Leiter der Abteilung für Schleimhautinfektionen und Immunität am Imperial College London“, sagt:

Wir konnten auf die Sequenz zugreifen, die von chinesischen Wissenschaftlern veröffentlicht und weltweit verfügbar gemacht wurde, was eine großartige Sache war. Und wir gingen von dieser Sequenz dazu über, einen Teil der Sequenz zu identifizieren, der für die Oberflächenproteine ​​des Virus kodiert. Und wir verwenden diese Sequenz, um unseren Impfstoff herzustellen.

Wir verwenden einen bestimmten Ansatz, bei dem wir einen synthetischen Impfstoff auf der Grundlage von RNA herstellen, also im Wesentlichen genetischer Code, den wir im Wesentlichen in ein Lipidtröpfchen verpacken und dieses verwenden, um in einen Muskel zu injizieren; es exprimiert dieses Protein, und der Körper erkennt es als fremd und bildet schützende Antikörper.

Ich gehe davon aus, dass die erwähnte RNA mRNA ist, und sobald sie das Zytoplasma der Muskelzellen des Impfstoffempfängers erreicht, wird sie exprimiert und irgendwie an die Zellmembran zurückgeführt, wo sie von den passierenden Lymphozyten als fremd erkannt wird.

Fragen:

  1. Ist das grundsätzlich so weit richtig?
  2. Wenn ja, was verursacht die Verschmelzung des Lipidtröpfchens mit Muskel- (oder anderen) Zellen überhaupt?

Ich kann darauf keine verbindliche Antwort geben, da meine Doktorarbeit auf der mRNA-Lieferung unter Verwendung von Peptiden anstelle von Lipiden beruhte, aber viele der Konzepte sind die gleichen. Ich habe auch keine Zeit, richtige Zitate zu liefern, aber das ist wahrscheinlich zu viel für einen Kommentar.

mRNA ist jedenfalls ein sehr zerbrechliches Molekül, das im Blut durch Serumnukleasen extrem schnell abgebaut werden kann. Daher müssen wir die mRNA schützen, indem wir sie mit einer anderen Chemikalie mischen, in diesem Fall einer Mischung aus positiv geladenen Lipiden. Die positiv geladenen Lipide werden vom negativ geladenen Phosphatrückgrat der mRNA angezogen und bilden ein Nanopartikel, das die mRNA im Inneren einfängt und vor den Nukleasen verbirgt. Die Lipide sind oft, aber nicht immer, PEGyliert, was bedeutet, dass ein Molekül Polyethylenglykol (PEG) an das Lipid gebunden ist. Die PEG-Gruppen bilden eine Schicht auf der äußeren Oberfläche des Nanopartikels, die hilft, die Proteinbindung zu verhindern.

Diese mRNA-Lipid-Nanopartikel werden dann einem Patienten injiziert. Dies wird wahrscheinlich eine intramuskuläre Injektion sein, damit die Partikel am ehesten von Muskelzellen aufgenommen werden. Der genaue Mechanismus, der erklärt, warum Lipid-Nanopartikel von Zellen angezogen werden, ist nicht ganz klar, aber es ist wahrscheinlich eine Kombination aus elektrostatischer Anziehung zwischen dem positiv geladenen Nanopartikel und der negativ geladenen Zellmembran und Proteinen, die an das Nanopartikel binden und dann von Rezeptoren erkannt werden die Zelloberfläche.

Nachdem das Partikel von einer Zelle aufgenommen wurde, wird es normalerweise in einer membrangebundenen Struktur namens Endosom gefangen. Wenn das Endosom reift, wird es angesäuert, und wenn der pH-Wert von etwa 7 auf etwa 5,5 sinkt, wird das Nanopartikel zerstört. Die Lipide, aus denen das Nanopartikel besteht, können mit den Lipiden, aus denen die endosomale Membran besteht, verschmelzen, diese Membran aufbrechen und das Endosom aufbrechen, wodurch die mRNA in das Zytoplasma entweichen kann.

Im Zytoplasma findet die mRNA ein Ribosom und produziert Protein. Wie Sie sagten, wird das Protein in diesem Fall membrangebunden und auf der äußeren Oberfläche der Zellen für eine eventuelle Immunerkennung exprimiert.


Synthetische mRNA: Produktion, Einführung in Zellen und physiologische Konsequenzen

Jüngste Fortschritte haben es möglich gemacht, mRNA in vitro zu synthetisieren, die beim Einbringen in Säugerzellen relativ stabil ist, eine verminderte Fähigkeit zur Aktivierung der angeborenen Immunantwort gegen exogene (virusähnliche) RNA aufweist und effizient in Protein übersetzt werden kann. Es wurden auch synthetische Methoden entwickelt, um mRNA mit einzigartigen Untersuchungseigenschaften wie Photovernetzung, Fluoreszenzemission und Bindung von Liganden durch Klick-Chemie herzustellen. Synthetische mRNA hat sich in zahlreichen Anwendungen, die für die menschliche Gesundheit von Vorteil sind, als wirksam erwiesen, z spezifische Veränderungen der DNA. Dieses einleitende Kapitel bietet Hintergrundinformationen zu den folgenden 20 Kapiteln dieses Bandes, die Protokolle für diese Anwendungen synthetischer mRNA präsentieren.

Schlüsselwörter: Cap-Analoga Kationische Lipide Elektroporation Immuntherapie Angeborene Immunität Nukleoporation Poly(A) Proteinexpression Translationale Effizienz mRNA-Stabilität.


Pfizer, Biontech Covid-19-Impfstoff verwendet eine Technologie, die zukünftige Immunisierungen revolutionieren könnte

Letzte Woche veröffentlichte Pfizer vorläufige Ergebnisse, die zeigten, dass sein Impfstoffkandidat zu mehr als 90 Prozent bei der Vorbeugung von symptomatischer Covid-19 wirksam ist. Am Montag ergänzte Moderna die ermutigenden Nachrichten mit ersten Ergebnissen seiner Phase-3-Studie, die zeigten, dass sein experimenteller Impfstoff 94,5 Prozent wirksam bei der Vorbeugung der Krankheit ist. Solch konsistente Ergebnisse in dieser Phase der Studien zu sehen, sei ein gutes Zeichen, sagte del Rio.

„Da habe ich das Gefühl, ‚Gee, Pfizer war kein Zufall‘“, sagte er. „Das ist echt. Das funktioniert tatsächlich.“

Obwohl die Ergebnisse beruhigend sind, sind die Ergebnisse noch vorläufig – die vollständigen Studienergebnisse wurden noch nicht in einer von Experten begutachteten Zeitschrift veröffentlicht, die von anderen Wissenschaftlern überprüft werden kann – und es ist noch nicht bekannt, wie lange die Impfstoffe Schutz bieten könnten oder ob sie in allen Bereichen gut funktionieren werden alle Altersgruppen und Ethnien.

Einer der Hauptunterschiede zwischen den beiden Impfstoffkandidaten ist die Lagerung. Beide erfordern zwei Dosen, aber der Impfstoff von Pfizer muss bei Temperaturen von minus 94 Grad Fahrenheit oder kälter gelagert werden, was praktische Bedenken hinsichtlich der Art und Weise, wie sie versendet und verbreitet werden könnten, aufgeworfen hat. Der Impfstoff von Moderna erfordert keine ultrakalte Lagerung und kann bei normalen Kühlniveaus – zwischen etwa 36 bis 46 Grad Fahrenheit – 30 Tage lang stabil bleiben.

Diese Unterscheidung ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, wie die synthetische mRNA oder Boten-RNA der Impfstoffe verpackt ist, so Paula Cannon, außerordentliche Professorin für Mikrobiologie an der Keck School of Medicine der University of Southern California. mRNA ist für sich genommen ein fragiles Molekül, was bedeutet, dass sie mit einer schützenden, fettigen Hülle umhüllt werden muss, um sie stabil zu halten.

Die Kühlbedingungen könnten damit zu tun haben, wie die mRNA hergestellt und stabilisiert wurde, sagte Cannon, obwohl diese genauen Details Eigentum der Unternehmen sind.

Dr. Drew Weissman, Medizinprofessor an der Perelman School of Medicine der University of Pennsylvania, war ein früher Pionier in der mRNA-Impfstoffforschung und arbeitet jetzt mit BioNTech zusammen, einem deutschen Biotechnologieunternehmen, das eine Partnerschaft mit Pfizer eingegangen ist. Er sagte, die Arbeit an der Verbesserung des experimentellen Impfstoffs werde fortgesetzt – einschließlich der Verbesserung seiner Lageranforderungen.

„Es gibt definitiv Verbesserungen, die bereits entwickelt werden“, sagte er.

Sowohl der Pfizer-Impfstoff als auch der Moderna-Impfstoff werden mit synthetischer Boten-RNA hergestellt. Im Gegensatz zur DNA, die genetische Informationen für jede Zelle des menschlichen Körpers trägt, steuert die Boten-RNA die Proteinproduktion des Körpers viel gezielter.

„Wenn ein bestimmtes Gen seine Arbeit verrichten muss, erstellt es eine Kopie von sich selbst, die als Boten-RNA bezeichnet wird“, sagte Cannon. „Wenn DNA die große Gebrauchsanweisung für die Zelle ist, dann ist Messenger-RNA so, als würde man nur eine Seite, die man braucht, fotokopieren und in die Werkstatt mitnehmen.“

Der Pfizer-Impfstoff und der Moderna-Impfstoff verwenden synthetische mRNA, die Informationen über das charakteristische Spike-Protein des Coronavirus enthält. Die Impfstoffe funktionieren im Wesentlichen, indem sie Anweisungen einschleichen, die den Körper anweisen, eine kleine Menge des Spike-Proteins zu produzieren. Sobald das Immunsystem dieses Protein erkennt, beginnt der Körper anschließend mit der Produktion von schützenden Antikörpern.

„Diese Antikörper wirken nicht nur gegen das kleine bisschen Spike-Protein, das nach der Impfung gebildet wurde, sondern erkennen und verhindern auch, dass das Coronavirus in unsere Zellen gelangt, wenn wir in Zukunft exponiert werden“, sagte Cannon. "Das ist wirklich ein cleverer Trick."

Aber so elegant dieser Mechanismus in der Theorie auch ist, mRNA-Impfstoffe standen seit ihrer Entwicklung in den 1990er Jahren vor echten biologischen Herausforderungen. In frühen Tierversuchen verursachten die Impfstoffe beispielsweise besorgniserregende Entzündungen.

„Das wurde zu einer der großen Fragen: Wie bekommt man das in den Körper, ohne eine Entzündungsreaktion zu erzeugen?“ sagte Norman Baylor, Präsident und CEO von Biologics Consulting und ehemaliger Direktor des Office of Vaccines Research and Review der FDA.

Obwohl bisher keines der Unternehmen ernsthafte Sicherheitsbedenken gemeldet hat, werden die Wissenschaftler die Teilnehmer beider Studien im Laufe der Zeit weiterhin überwachen.

„Wenn Sie versuchen, das Immunsystem auszutricksen – was ein Impfstoff tut – besteht immer die Besorgnis, dass Sie unbeabsichtigte Nebenwirkungen haben könnten“, sagte Cannon. „Das Immunsystem ist unglaublich kompliziert und von Person zu Person unterschiedlich.“


Wie kann die Wirksamkeit des Impfstoffs berechnet werden, wenn Teilnehmer an klinischen Phase-3-Studien nicht absichtlich dem Virus ausgesetzt sind?

Die Personen in den klinischen Studien wurden in zwei Gruppen eingeteilt – diejenigen, die den Impfstoff erhielten, und diejenigen, die eine Scheinimpfung erhielten. Sie wären zur Arbeit und Schule gegangen und hätten soziale Interaktionen gehabt, wie sie es normalerweise tun. Da klinische Studien der Phase 3 hauptsächlich an Orten mit sehr aktiven Pandemien wie den USA und Brasilien durchgeführt wurden, wäre eine bestimmte Anzahl von Teilnehmern in ihrem täglichen Leben dem Virus ausgesetzt gewesen, das COVID-19 verursacht.

Die Wirksamkeit wurde berechnet, indem die Anzahl der Infektionen zwischen denen, die den Impfstoff erhielten, und denen, die die Scheinimpfung erhielten, verglichen wurde.

Die Wirksamkeit ist, wie gut der Impfstoff in klinischen Studien wirkt. Wirksamkeit ist, wie gut ein Impfstoff oder ein Produkt in realen Umgebungen funktioniert.


Ergebnisse

Generierung und Charakterisierung von SAM, die Influenza-NP- und M1-Antigene kodieren

Die NP- und M1-Gene in voller Länge wurden aus dem revers transkribierten RNA-Genom des Influenzavirus A/PR/8/34 (H1N1) amplifiziert und dann als zwei monocistronische (SAM(NP) oder SAM( M1)) und einen bicistronischen (SAM(M1-NP))-Vektoren (Fig. 1A). Die entsprechenden ssRNAs wurden synthetisiert in vitro durch eine enzymatische Transkriptionsreaktion von einer linearen Plasmid-DNA-Matrize unter Verwendung einer T7-RNA-Polymerase [31]. Die in vitro Die Aktivität der monocistronischen und bicistronischen SAM-Replicons wurde nach Elektroporation in BHK-Zellen gemessen und mit einer selbstamplifizierenden Kontroll-RNA bekannter Potenz (STD) verglichen. Die Anwesenheit von intrazellulären dsRNA-Molekülen als Marker der RNA-Amplifikation wurde durch Durchflusszytometrie bewertet ( 1B ). Die Häufigkeiten von dsRNA + BHK-Zellen nach Transfektion mit den beiden monocistronischen SAM(NP)- und SAM(M1)- oder SAM(M1-NP)-bicistronischen Replikons waren vergleichbar oder höher als die mit dem STD erhaltenen, was darauf hindeutet, dass die neuen Replikons selbst- verstärkt. Die Häufigkeiten von dsRNA + - und Protein + -Zellen waren für jedes Replikon vergleichbar, was darauf hindeutet, dass die Antigenexpression parallel zur RNA-Amplifikation war.

(a) SAM(NP)-, SAM(M1)- und SAM(M1-NP)-Konstrukte mit einer 5'-Kappe, vier nicht-strukturellen Genen (nsp1-4), einem subgenomischen 26S-Promotor (grauer Pfeil), dem Impfstoff-Antigen ( s) und einen 3' polyadenylierten Schwanz. (b-d) Selbstamplifikation von SAM-Replikons und Antigenexpression, bewertet nach Transfektion von BHK-Zellen mit den verschiedenen Replikons. (b) Der Prozentsatz von BHK-Zellen, die für replizierende SAM-Vektoren (dsRNA + Zellen) positiv waren und das entsprechende Protein (Protein + Zellen) exprimierten, wurde durch Durchflusszytometrie analysiert und als Mittelwert ± SD angegeben. (c) Zelllysate von BHK-Zellen, die mit dem PR8-Virus (0,1 Infektionsmultiplizität) (Spur 1) infiziert, scheintransfiziert (Spur 2) oder mit SAM(NP) (oberes Feld) und SAM(M1) (unteres ) transfiziert wurden Panel) (Spur 3) oder SAM(M1-NP) (Spur 4) wurden durch Western-Blot unter reduzierenden Bedingungen analysiert. (d) Die Häufigkeit von NP- und M1-exprimierenden BHK-Zellen, die mit Mock-, SAM(NP), SAM(M1) oder mit den bicistronischen SAM(M1-NP)-Replikons transfiziert wurden, wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. (e) Häufigkeit (Mittelwert ± SD) und mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von BHK-Zellen, die NP- oder M1-Antigene nach Transfektion mit den verschiedenen SAM/LNP-Formulierungen exprimieren. Statistische Analysen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. *P<0,05 im Vergleich zu den SAM(NP)- oder SAM(M1)-behandelten Gruppen. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Die Antigenexpression durch BHK-Zellen nach Transfektion mit den verschiedenen SAM-Replikons wurde weiter durch Western Blot ( 1C ) und Durchflusszytometrie ( 1D ) charakterisiert. Sowohl M1- als auch NP-Proteine, die von den monocistronischen (Spur 3) oder bicistronischen (Spur 4) Vektoren exprimiert wurden, zeigten in den Western-Blots Banden mit Molekulargewichten, die den jeweiligen Proteinen äquivalent sind, die von PR8-Virus-infizierten BHK-Zellen exprimiert werden (Spur 1) (Fig. 1C). . Schließlich war der Prozentsatz von NP- oder M1-exprimierenden BHK-Zellen für monocistronische und bicistronische Replikons größer als 70 %, und die Mehrheit der mit dem bicistronischen Replikon transfizierten BHK-Zellen co-exprimierte M1 und NP ( 1D ). Zum in vivo Studien wurden SAM-Vektoren mit LNPs verkapselt. Die mittlere Partikelgröße und Polydispersität wurden durch dynamische Lichtstreuung für SAM(NP)/LNP, SAM(M1)/LNP, [SAM(M1)+ SAM(NP)]/LNP und SAM(M1-NP)/LNP gemessen. Z-Durchschnittsdurchmesser reichten von 130 bis 142 nm mit einem niedrigen Polydispersitätsindex (Daten nicht gezeigt), was auf kleine einheitliche Lipidpartikel hinweist, die mehr als 95 % der mRNA einkapseln können [31]. Schließlich zeigte eine Durchflusszytometrie-Analyse, dass der Prozentsatz und der MFI von BHK-Zellen, die die NP- oder M1-Antigene nach Transfektion mit den verschiedenen SAM/LNP-Formulierungen exprimierten, zwischen einzelnen Antigen- und Kombinationsgruppen vergleichbar waren ( 1E ).

Immunogenität von SAM(NP)- und SAM(M1)-Impfstoffen

Um die Immunogenität von SAM-Replikons zu beurteilen, die NP- und/oder M1-Antigene exprimieren, wurden BALB/c-Mäuse i.m. zweimal im Abstand von acht Wochen mit 0,1 μg SAM(NP), SAM(M1), einer Mischung aus SAM(NP)+SAM(M1) oder SAM(M1-NP) und mit LNP verabreicht. Eine Infektion mit einer niedrigen Dosis des PR8-Virus und eine Behandlung mit PBS wurden als positive bzw. negative Kontrollen verwendet.

NP- und M1-spezifisches IgG waren bereits nach der ersten Dosis in den Seren von SAM-immunisierten Mäusen nachweisbar und wurden durch die zweite Immunisierung geboostet (S1A Abb). Mäuse, die die einzelnen Antigene erhalten hatten, erreichten 1,5- bis 2-fach höhere Antikörpertiter (P<0,01) als diejenigen, die mit beiden Antigenen geimpft wurden, was darauf hindeutet, dass NP und M1 eine leichte antigene Interferenz induzieren [38, 39]. Seren von SAM-immunisierten Mäusen konnten die PR8-Virusinfektion von MDCK-Zellen nicht neutralisieren in vitro (S1B Abb), im Einklang mit der internen Lage dieser Antigene im Virus [40].

Ausgehend von der Schlüsselrolle, die NP- und M1-spezifische T-Zellen gegen Influenza-Erkrankungen spielen [12, 14], konzentrierten wir die nächste Analysereihe auf die Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellen durch ICS und Durchflusszytometrie (Abb. 2 .). ). Antigen-spezifische, Zytokin-sezernierende Zellen wurden unter den CD44-starken CD8 + und CD4 + T-Zell-Untergruppen identifiziert, wie zuvor beschrieben [30] in Milzzellen von immunisierten Tieren stimuliert in vitro mit NP147-155 Peptid (Fig. 2A), rekombinantes NP-Protein (Fig. 2B) oder mit M1-abgeleitetem Peptidpool (Fig. 2C). NP-spezifische CD8 + T-Zellen waren bereits 10 Tage nach der ersten Immunisierung nachweisbar und wurden bis Woche 6 bei einer Häufigkeit von etwa 0,1–0,2% gehalten (Abb. 2A). 10 Tage nach der zweiten Immunisierung wurde ein 10-facher Anstieg beobachtet, wobei die Häufigkeiten von NP-spezifischen CD8 + T-Zellen von 1 bis 2% der gesamten CD8 + T-Zellen reichten und nach 6 Wochen auf 0,6–0,9% kontrahierten. Die Mehrheit der NP-spezifischen CD8 + T-Zellen waren IFN-γ + und IFN-γ + /TNF-α + , charakteristisch für einen Effektor-Phänotyp. In PR8-exponierten Mäusen und in irgendeiner SAM(M1)-Impfstoffgruppe wurden zu keinem der getesteten Zeitpunkte M1-spezifische CD8 + T-Zellen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).

(a-b) BALB/c-Mäuse (n = 24/Gruppe) wurden i.m. immunisiert. zweimal im Abstand von 8 Wochen mit 0,1 µg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) oder mit 0,2 µg SAM(NP)+SAM(M1). Zehn Tage und 6 Wochen nach jeder Immunisierung wurde die Häufigkeit von Antigen (Ag)-spezifischen, Zytokin-sezernierenden CD8 + (a) oder CD4 + (b, c) T-Zellen durch Durchflusszytometrie an stimulierten Splenozyten bestimmt in vitro mit dem NP147-155 Peptid (a), rekombinantes NP-Protein (b) oder mit dem M1-abgeleiteten Peptidpool (c). Der Farbcode zeigt die verschiedenen Kombinationen von Zytokinen an, die von den jeweiligen Zellen produziert werden. Als Kontrolle wurde eine Gruppe von Mäusen mit einer niedrigen Dosis des Influenzavirus PR8 infiziert. Daten aus zwei getrennten und zusammengeführten Experimenten. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. *P<0,05 im Vergleich zu SAM(NP) (a-b) und SAM(M1) (c). Die Häufigkeiten von Ag-spezifischen CD4 + und CD8 + T-Zellen waren signifikant höher (P<0,05) in allen SAM-immunisierten und PR8-exponierten Gruppen als in PBS zu allen Zeitpunkten. Induktion von Antigen-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen durch SAM(NP)- und SAM(M1)-Impfstoffe

In ähnlicher Weise waren NP-spezifische CD4 + T-Zellen bereits 10 Tage nach der ersten Immunisierung nachweisbar und waren überwiegend Th0 (IL-2 + /TNF-α + , TNF-α + und IL-2 + ) und multifunktionales Th1 (IFN -γ + /IL-2 + /TNF-α + ) (Fig. 2B). Die zweite Immunisierung erweiterte NP-spezifische CD4 + T-Zellen in allen Immunisierungsgruppen, insbesondere der multifunktionalen Th1-Subpopulation (IFN-γ + /IL-2 + /TNF-α + ). Die Häufigkeiten von NP-spezifischen CD4 + T-Zellen reichten von 0,1–0,2% bis zu 6 Wochen nach der ersten Immunisierung, stiegen bis zu 0,3–0,5% 10 Tage nach der zweiten Immunisierung an und sanken 6 Wochen danach auf 0,1–0,3%. Zwischen den verschiedenen SAM-geimpften Gruppen wurden keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Intensität oder Qualität der Reaktionen beobachtet, außer 6 Wochen nach 2 Zeitpunkt, als die Intensität der NP-spezifischen T-Zell-Reaktionen bei mit SAM immunisierten Mäusen (M1- NP) im Vergleich zu den anderen beiden SAM-geimpften Gruppen. M1-spezifische CD4 + T-Zellen zeigten eine Kinetik und einen ähnlichen Phänotyp wie NP-spezifische CD4 + T-Zellen, wenn auch mit geringeren Häufigkeiten ( 2C ). Es wurden keine Unterschiede in der Häufigkeit von Antigen-spezifischen T-Zellen beobachtet, die durch SAM(M1) allein oder in Kombination mit SAM(NP) induziert wurden.

Mäuse, die zuvor einer niedrigen Dosis des PR8-Virus ausgesetzt waren, zeigten ungefähr 0,6 % bzw. 0,1 % NP-spezifischer CD8 + - und CD4 + -T-Zellen, die nach einer zweiten Exposition gegenüber dem Virus nicht anstiegen. Es ist wahrscheinlich, dass HA-spezifische Antikörper, die durch die erste Exposition gegenüber PR8 induziert wurden, die zweite Virusinfektion neutralisierten und somit den Rückruf und die Expansion von NP-spezifischen T-Zellen verhinderten.Niedrige Häufigkeiten von M1-spezifischen CD4 + T-Zell-Antworten, aber keine M1-spezifischen CD8 + T-Zellen wurden in infizierten Mäusen nachgewiesen, wie es bei SAM-immunisierten Mäusen beobachtet wurde. In PBS-behandelten Mäusen wurden keine NP- oder M1-spezifischen T-Zellen nachgewiesen. Ähnliche Immunprofile wurden beobachtet, wenn die Gesamtzahlen statt der Häufigkeiten von Antigen-spezifischen CD4- und CD8-T-Zellen berichtet wurden (Daten nicht gezeigt).

Zusätzlich zur Zytokinsekretion charakterisierten wir den Gedächtnis-Phänotyp antigenspezifischer T-Zellen in der Milz immunisierter Mäuse durch Messung der Effektorfrequenz (TEFF, CD44 hoch /CD62L niedrig /CD127 niedrig), Effektorspeicher (TEM, CD44 High /CD62L Low / CD127 High) und Zentralspeicher (TCM, CD44 hoch /CD62L hoch /CD127 hoch) T-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung ( 3 ).

Zehn Tage und 6 Wochen nach jeder Immunisierung wurde die Häufigkeit von NP-spezifischen (a-b) oder M1-spezifischen (c) Zytokin-sezernierenden Zellen innerhalb des zentralen Gedächtnisses bestimmt: TCM (CD44 hoch /CD62L hoch /CD127 hoch), der Effektorspeicher: TEM (CD44 hoch /CD62L niedrig / CD127 hoch) und der Effektor: TEFF (CD44 hoch /CD62L niedrig /CD127 niedrig) Untergruppen. Pfeile zeigen die Immunisierungszeiten an. Daten aus zwei getrennten und zusammengeführten Experimenten. Statistische Analysen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. *P<0,05 im Vergleich zu SAM(NP) (a-b) oder SAM(M1) (c).

Niedrige Frequenzen von Antigen-spezifischem TCM, TEM und TEFF Zellen wurden nach der ersten Immunisierung mit allen SAM-Impfstoffen gemessen, während nach der zweiten Immunisierung die Häufigkeit von NP-spezifischen CD8 + TCM Zellen wurde bis zu 0,2% geboostet (Abb. 3A), und einige NP- und M1-spezifische CD4 + TCM Zellen wurden ebenfalls nachgewiesen (Fig. 3B und 3C). Die Frequenzen von CD8 + und CD4 + TEM und TEFF stieg nach der zweiten Impfung an, erreichte am Tag 10 den Höhepunkt und kontrahierte nach 6 Wochen. Diese Kinetik wurde sowohl für CD8 + als auch für CD4 + beobachtet, ohne größere Unterschiede zwischen den immunisierten Gruppen, außer für NP-spezifisches CD4 + TEM Zellen, die eine signifikant reduzierte Häufigkeit in SAM(NP)+SAM(M1)- und SAM(M1-NP)-Impfstoffgruppen im Vergleich zu SAM(NP)-immunisierten Mäusen zeigten. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass SAM-Impfstoffe eine starke Aktivierung von CD8 + als CD4 + T-Zellen und eine Erweiterung des Effektorgedächtniskompartiments induzieren.

Induktion zytotoxischer T-Zellen durch SAM(NP)-Impfstoff

Schließlich charakterisierten wir antigenspezifische T-Zellen, die durch SAM-Impfstoffe induziert wurden, auf zytotoxische Aktivität in vitro und in vivo (Abb. 4). Die Zytotoxizität von T-Zellen wurde durch Quantifizierung der Oberflächenexpression von CD107a als Maß für den Degranulationsprozess [41] bei in vitro Antigenstimulation von Splenozyten von immunisierten Tieren. Nach zwei Immunisierungen mit SAM(NP) allein oder in Kombination mit SAM(M1) war die Mehrheit der NP-spezifischen CD8 + -T-Zellen CD107a + ( 4A ). Die Immunisierung mit SAM(NP) allein induzierte im Vergleich zu den Kombinationsimpfstoffen eine höhere Häufigkeit von CD107a + NP-spezifischen CD8-T-Zellen (P<0,05). Wir haben CD107a nicht auf NP- oder M1-spezifischen CD4 + T-Zellen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass SAM-Formulierungen keine zytotoxischen CD4 + T-Zellen induzierten.

Die Induktion von NP-spezifischen CD8 + T-Zellen durch SAM(NP) allein oder in Kombination mit SAM(M1) wurde 10 Tage nach der zweiten Immunisierung charakterisiert. (a) Oberflächenexpression von CD107a auf stimulierten Splenozyten in vitro mit NP147-155 wurde durchflusszytometrisch beurteilt. Die Daten zeigen die Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden CD8 + T-Zellen, die CD107a exprimieren (schwarze Balken) oder nicht (graue Balken). (b) Prozentsatz von in vivo NP-spezifische Zielzelllyse, berechnet für jede Immunisierungsgruppe. (c) Repräsentative Histogramme, die die Häufigkeit von Influenza NP . zeigen147-155-gepulst (CFSE + ) und HIV Gag197-2015-gepulste (CMTMR + ) Zielzellen, die in jeder Immunisierungsgruppe 18 h nach dem adoptiven Transfer gewonnen wurden. Statistische Analysen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. *P<0.05 **P<0,01 im Vergleich zu SAM(NP).

Um die auszuwerten in vivo zytotoxische Aktivität von NP-spezifischen CD8 + T-Zellen wurde eine äquivalente Anzahl von CFSE-markierten oder CMTMR-markierten Splenozyten mit dem H2-K d -restringierten NP . gepulst147-155 Peptid (0,5 μM CFSE) oder mit einem nicht verwandten HIV-Gag197-205 Peptid (10 μM CMTMR) und wurden adoptiv in Mäuse übertragen, die mit 0,1 μg SAM(NP), 0,2 μg SAM(NP)+SAM(M1) oder 0,1 μg SAM(M1-NP) immunisiert wurden. Der Prozentsatz an CFSE + - und CMTMR + -Zellen, die in der Milz vorhanden waren, wurde 18 h später durch Durchflusszytometrie gemessen ( 4B und 4C ). Eine spezifische Lyse von > 93% wurde in SAM(NP)-immunisierten Mäusen gemessen, während 74% und 60% der spezifischen Lyse in SAM(NP)+SAM(M1)- bzw. SAM(M1-NP)-immunisierten Gruppen nachgewiesen wurden . Bei mit PBS behandelten Mäusen wurde keine spezifische Lyse nachgewiesen, was die Antigen-Spezifität der zytotoxischen Aktivität bestätigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die SAM-Formulierungen NP-spezifische CD8 + T-Zellen mit zytotoxischer Aktivität induzierten in vivo gegen Zielzellen, die mit dem H2-K d -restringierten immundominanten NP-Peptid gepulst wurden. Darüber hinaus beobachteten wir eine verbesserte in vivo zytotoxische Aktivität bei SAM(NP)-geimpften Mäusen im Vergleich zu Mäusen, die mit den Kombinationsimpfstoffen immunisiert wurden, in Übereinstimmung mit den beobachteten Häufigkeiten von CD107a + NP-spezifischen CD8 + T-Zellen in vitro in den jeweiligen Immunisierungsgruppen (Fig. 4A).

Schutzwirkung bei Mäusen gegen Provokation mit homologen und heterosubtypischen Influenzaviren

Um die Schutzwirkung von SAM-Impfstoffen zu untersuchen, wurden BALB/c-Mäuse zweimal im Abstand von acht Wochen mit 0,1 µg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) oder 0,2 µg SAM(NP) immunisiert. +SAM(M1)-Vektoren in LNPs formuliert und mit einer tödlichen Dosis des Maus-adaptierten homologen PR8-Influenzavirus gereizt. Als Kontrollen schlossen wir zwei Gruppen von Mäusen ein, die zuvor einer niedrigen Dosis von PR8- oder HK68-Influenzaviren ausgesetzt waren. Überleben, Gewichtsverlust und klinische Scores wurden 14 Tage nach der Challenge gemessen (Fig. 5).

BALB/c-Mäuse (n = 18) wurden i.m. immunisiert. zweimal im Abstand von 8 Wochen mit 0,1 µg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) oder mit 0,2 µg SAM(NP)+SAM(M1). Vier Wochen nach der letzten Injektion wurden die Mäuse mit den homologen PR8 (a-d) oder den heterosubtypischen HK68 (e-g) Influenzaviren herausgefordert. Mäuse wurden 14 Tage nach der Infektion auf Überleben (a und e), Körpergewichtsverlust (b und f) und klinische Bewertung (c und g) überwacht und euthanasiert, wenn die klinische Bewertung 4 erreichte. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. (d) Virustiter, gemessen in Lungen, die an den Tagen 3, 6 und 17 nach der Influenza-Provokation gesammelt wurden, und ausgedrückt als fache Erhöhung im Vergleich zu vorinfizierten Proben. Einzelne Mäuse, Mittelwert und SD sind angegeben. Die Daten stammen aus zwei unabhängigen und zusammengeführten Experimenten. Statistische Analysen wurden mit der Log-Rank-Analyse (Mantel-Cox-Test) (a, e) und dem Mann-Whitney-U-Test (b, c, d, f, g) durchgeführt: *P<0.05, **P<0.01, ***P< 0,001 im Vergleich zur PBS-behandelten Gruppe.

Mäuse, die mit SAM-Replikons immunisiert wurden, die NP entweder allein oder in Kombination mit M1 exprimierten und mit LNP formuliert waren, waren gegen eine tödliche Infektion mit dem homologen PR8-Virus geschützt und zeigten eine wesentlich und signifikant höhere (P<0,0001) Überlebensrate im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollmäusen (Fig. 5A). Mäuse, die mit SAM(NP), SAM(NP)+SAM(M1) und SAM(M1-NP) Impfstoffen immunisiert wurden, hatten Überlebensraten von 71, 70 bzw. 78%. Im Gegensatz dazu war die Verabreichung des SAM(M1)-Impfstoffs allein nur schwach schützend (25% Überlebensrate) und unterschied sich statistisch nicht von PBS-behandelten Kontrollmäusen (5% Überlebensrate). Wie erwartet, waren PR8-präexponierte Mäuse vollständig vor der homologen Provokation geschützt, während Mäuse, die dem heterosubtypischen HK68-Virus präexponiert waren, teilweise geschützt waren (78%), mit Überlebensraten ähnlich denen des SAM(M1-NP)-Impfstoffs. Bei allen Immunisierungsgruppen wurde ein vorübergehender Körpergewichtsverlust als Zeichen einer Influenza-Erkrankung beobachtet. Mit den NP-exprimierenden Replikons geimpfte Mäuse zeigten jedoch im Vergleich zu PBS-behandelten Tieren eine schnellere Genesung von der Krankheit, wie durch einen signifikant verringerten Körpergewichtsverlust (Fig. 5B) und klinische Bewertungen (Fig. 5C) gezeigt wurde. Tatsächlich hatten Tiere, die mit SAM(NP)- und Kombinationsimpfstoffen (NP+M1 oder M1-NP) immunisiert wurden, 3 Tage nach der Influenza-Infektion im Vergleich zu mit PBS behandelten Mäusen signifikant reduzierte Virustiter in der Lunge (P<0,01) und nach 6 Tagen vollständig von Influenzaviruspartikeln befreit (Fig. 5D). Körpergewichtsverlust und klinische Scores zeigten einen mittleren Krankheitsgrad bei SAM(M1)-immunisierten Mäusen in Übereinstimmung mit den Überlebensergebnissen und der langsameren Kontrolle der Lungenvirustiter.

Um den durch SAM-Impfstoffe verliehenen Kreuzschutz zu bestimmen, haben wir Mäuse mit dem heterosubtypischen HK68-Stamm herausgefordert und das Überleben, den Verlust des Körpergewichts und die klinischen Gesamtwerte bewertet. Alle SAM-Impfstoffe waren mit einem Überleben von 100 %, einem verringerten Gesamtgewichtsverlust und niedrigen klinischen Scores verbunden (Abb. 5E–5G). Im Gegensatz dazu zeigten mit PBS behandelte Mäuse ein schlechteres Ergebnis mit einer Überlebensrate von 30 %, einem Körpergewichtsverlust von über 15 % auf dem Höhepunkt der Infektion (Tage 6–8) und klinischen Werten über 3. Die unterschiedliche Schutzwirkung von SAM( M1)-Impfstoff in den homologen und heterosubtypischen Infektionsmodellen könnte auf die unterschiedliche Virulenz von PR8- und HK68-Viren zurückzuführen sein [42], wie die unterschiedlichen Überlebensraten bei PBS-behandelten Mäusen nahelegen.

Wirkung von SAM-Impfstoffen auf die T-Zell-Reaktion der Lunge nach Influenzavirus-Provokation

Die Impfung kann die T-Zell-Reaktion auf eine Influenza-Infektion an der Eintrittsstelle des Virus beeinflussen. Daher charakterisierten wir die Lungen-T-Zell-Zusammensetzung an Tag 0, 3, 6 und 17 nach PR8-Challenge in SAM(NP), SAM(M1), SAM(NP)+SAM(M1) oder SAM(M1-NP)- geimpfte Mäuse (Fig. 6).

BALB/c-Mäuse wurden i.m. immunisiert. zweimal im Abstand von 8 Wochen mit PBS, 0,1 µg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) oder mit 0,2 µg SAM(NP)+SAM(M1). Vier Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden Mäuse mit dem PR8-Virus infiziert. NP-spezifische CD8-T-Zellen, die nach der Infektion in der Lunge rekrutiert wurden, wurden durchflusszytometrisch charakterisiert. (a) Anzahl NP-spezifischer CD8 + T-Zellen. Die Daten stammen von einzelnen Mäusen (als Punkte dargestellt), während durchgezogene Spuren den Mittelwert ± SD anzeigen. (b) Kumulative Häufigkeit von Ag-spezifischen, Zytokin-sezernierenden CD8 + T-Zellen, angegeben als absolute Zahl pro Lunge. Der Farbcode stellt die verschiedenen Kombinationen von Zytokinen dar, die von den jeweiligen Zellen produziert werden, nachdem in vitro Stimulation mit Medium (m), NP147-155 Peptid (NP) oder M1-Peptidpool (M1), wie angegeben. (c) Absolute Anzahl von NP-spezifischen CD8 + T-Zellen positiv (schwarzer Balken) oder nicht (grauer Balken) für CD107a. Daten aus zwei unabhängigen und zusammengeführten Experimenten. Statistische Analysen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. *P<0.05 **P<0,01 verglichen mit der PBS-behandelten Gruppe.

Zum Zeitpunkt der Influenza-Provokation (Tag 0), H2-K d /NP147-155 Pentamer + CD8 + T-Zellen waren bereits in der Lunge von mit SAM(NP) und Kombinationen immunisierten Mäusen nachweisbar, jedoch nicht mit SAM(M1) oder PBS. Ihre Zahl nahm in allen Immunisierungsgruppen am Tag 6 nach der Infektion zu und blieb am Tag 17 in den SAM(NP)- und Kombinationsgruppen hoch ( 6A ). IFN-γ + /TNF-α + , TNF-α + und IFN-γ + NP-spezifische CD8 + T-Zellen wurden in SAM(NP)- und Kombinationsgruppen bereits am Tag 0 nachgewiesen. Ihre Häufigkeit nahm am Tag 6 nach Infektion zu und zeigte am Tag 17 einen komplexeren IFN-γ + /IL-2 + /TNF-α + -Phänotyp. Schließlich wurden M1-spezifische CD8 + T-Zellen an Tag 6 und 17 in der SAM(M1)-Impfstoffgruppe nachgewiesen. aber nicht in den Kombinationsformulierungsgruppen (Fig. 6B). In Übereinstimmung mit dem von ICS beobachteten Effektor-Phänotyp waren die meisten NP-spezifischen CD8 + -T-Zellen, die in den Lungen von NP-immunisierten Tieren gefunden wurden, CD107a + ( 6C ).

Da antigenspezifische CD4 + T-Zellen auch eine Rolle bei der Vermittlung des Schutzes spielen können, indem sie zur Entwicklung der Effektorfunktionen von CD8 + T-Zellen beitragen [43, 44], charakterisierten wir NP- und M1-spezifische CD4 + T-Zellen der Lunge nach Impfung und anschließender Influenza-Infektion. Das nach systemischer Immunisierung beobachtete charakteristische CD4 Th1-Profil (Fig. 2) wurde nach Infektion durch lungeninfiltrierende antigenspezifische CD4 + -T-Zellen, die IFN-γ und TNF-α exprimierten, allein oder in Kombination aufrechterhalten (S2 Fig.). Schließlich zeigte die histologische Analyse der Lungen von geimpften Mäusen, dass die hohe Anzahl von Effektor-CD8 + - und CD4 + -T-Zellen, die ab Tag 6 nach der Provokation vorhanden waren, keine offensichtliche Pathologie induzierte, sondern eher mit einem niedrigen histopathologischen Score assoziiert war (S3 Abb.) .

Insgesamt legen diese Daten nahe, dass die Impfung die T-Zell-Antwort in der Lunge nach einer Influenza-Provokation beeinflusst. Mit SAM(NP)-Impfstoffen immunisierte Mäuse zeigten eine schnelle und verstärkte Rekrutierung von zytotoxischen CD8 + T-Zellen und polyfunktionellen CD4 + Th1-Zellen in die Lunge, was mit einer effizienten Kontrolle des Virus, reduzierten Lungenläsionen und einer signifikant verbesserten Überlebensrate einherging .

Gleichzeitige Verabreichung des SAM(M1-NP)-Impfstoffs mit einem monovalenten inaktivierten Influenza-Impfstoff

Ein idealer kreuzprotektiver Influenza-Impfstoff sollte sowohl humorale Antworten gegen das Oberflächen-HA-Antigen als auch T-Zell-Antworten gegen die intern konservierten Influenza-Antigene (NP und M1) induzieren [45, 46]. Daher haben wir die Möglichkeit der Verwendung eines RNA-basierten SAM(M1-NP)-Impfstoffs in Kombination mit einem monovalenten inaktivierten Influenza-Impfstoff (MIIV) aus dem A/California/7/2009 (H1N1)-Virus (Cal/H1N1) untersucht. BALB/c-Mäuse wurden i.m. immunisiert. zweimal im Abstand von acht Wochen mit 0,1 µg SAM(M1-NP)- oder SAM(GFP)-Kontrollvektor in LNP, kombiniert mit einer suboptimalen Dosis von MIIV (0,1 µg), die ausgewählt wurde, um die mögliche Synergie mit SAM-Impfstoffen zu bewerten. Als negative bzw. positive Kontrolle wurden mit PBS behandelte Mäuse und Mäuse, die zuvor einer niedrigen Dosis des PR8-Influenzavirus ausgesetzt worden waren, verwendet. Einen Monat nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse mit der 10-fachen letalen Dosis des PR8-Virus infiziert, um die Stringenz des Modells zu erhöhen, und wurden 14 Tage nach der Infektion überwacht.

SAM(M1-NP)+MIIV-immunisierte Mäuse zeigten eine signifikant erhöhte Überlebensrate im Vergleich zu PBS-behandelten Mäusen mit 91 bzw. 20 %, während MIIV allein unter diesen experimentellen Bedingungen nur einen teilweisen Schutz bot (37 % des Überlebens) (Abb 7A). Alle immunisierten Tiere zeigten im Verlauf der Beobachtung Krankheitszeichen, wobei ein vorübergehender Gewichtsverlust vier Tage nach der Infektion seinen Höhepunkt erreichte ( 7B ). Zu unserer Überraschung überlebten 80 % der Tiere in der SAM(GFP)+MIIV-Vektor-Kontrollgruppe die Infektion, obwohl wir zuvor gezeigt haben, dass SAM(GFP) allein weder H1-spezifische Immunantworten auslöste noch Mäuse vor einer Herausforderung schützte mit dem PR8-Virus [30].

BALB/c-Mäuse (n = 20) wurden i.m. zweimal im Abstand von 8 Wochen mit 0,1 µg SAM(M1-NP) oder SAM(GFP) in Kombination mit 0,1 µg MIIV (Cal/H1N1). Vier Wochen nach der letzten Injektion wurden die Mäuse mit der 10-fachen tödlichen Dosis des heterologen Influenza-PR8-Virus gereizt. Mäuse wurden 14 Tage nach der Infektion auf Überleben (a) und Körpergewichtsverlust (b) überwacht. Die Daten zeigen den Mittelwert einzelner Mäuse ± SD. Die Daten stammen aus zwei getrennten und zusammengeführten Experimenten. Statistische Analysen wurden mit der Log-Rank-Analyse (Mantel-Cox-Test) durchgeführt. ***P<0,001 im Vergleich zu PBS. (c) Neutralisierende Titer gegen Cal- und PR8-Viren in Seren, die zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung gesammelt wurden. (d, e) Zehn Tage nach der zweiten Immunisierung wurde die Häufigkeit antigenspezifischer Zytokin-sezernierender CD8+ (d) oder CD4+ (e) T-Zellen durch Durchflusszytometrie an stimulierten Splenozyten bestimmt in vitro mit einem Cal/H1-Peptidpool (d, e) oder einem PR8/H1-Peptidpool (d, e). Die Daten stammen aus zwei unabhängigen und zusammengeführten Experimenten. Statistische Analysen mit dem Mann-Whitney-U-Test wurden an Gesamtzytokinen durchgeführt. *P<0,05 im Vergleich zu MIIV.

Um einen möglichen adjuvanten Effekt [47, 48] des ssRNA-Vektors zu untersuchen in vivo, verglichen wir die durch die verschiedenen Impfstoffkombinationen induzierten adaptiven Immunantworten, indem wir die Antigen-spezifischen funktionellen Antikörpertiter ( 7C ) und die T-Zell-Frequenzen ( 7D und 7E) zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung messen. Die Virusneutralisationstiter gegen den Impfstamm A/California/7/2009 (H1N1) lagen im Bereich von 1,5x10 4 bis 2x10 4 und unterschieden sich in den Seren nicht signifikant von Mäusen, die mit SAM(M1-NP)+MIIV oder SAM(GFP)+ . immunisiert wurden MIIV und MIIV allein, während keine neutralisierende Aktivität gegen das PR8-Virus gefunden wurde ( 7C ), was frühere Beobachtungen bestätigt [30]. Im Gegensatz dazu führte die Kombination von SAM(M1-NP) oder SAM(GFP) mit MIIV zu einer erhöhten Häufigkeit von Cal/H1-Impfstoff-spezifischen und PR8/H1-kreuzreaktiven CD8+- und CD4+-T-Zellen im Vergleich zu MIIV (Abb. 7D und 7E .). ). H1-spezifische CD8 + T-Zellen zeigten einen polyfunktionellen Effektor-Phänotyp bestehend aus Kombinationen von IFN-γ und TNF-α. Darüber hinaus hat die gleichzeitige Verabreichung von SAM-Replikons mit MIIV den üblichen Th0/Th2-Phänotyp, der durch MIIV hervorgerufen und durch die Produktion von IL-13/IL-4 gekennzeichnet ist, zu einem Th0/Th1-Profil verschoben, das von der Produktion von IFN-γ/ dominiert wird. TNF-α/IL-2 und IL-2/TNF-α. Das ähnliche T-Helfer-Muster, das beobachtet wurde, wenn SAM-Vektoren, die M1-NP- oder GFP-Antigene kodieren, mit MIIV kombiniert wurden, legt nahe, dass die Polarisation der T-Zell-Antwort auf die Replikons zurückzuführen war an sich, und war wahrscheinlich nicht antigenabhängig. Schließlich wurden normalerweise NP- und M1-spezifische T-Zell-Antworten in Mäusen beobachtet, die mit SAM(M1-NP) + MIIV immunisiert wurden (S4 Fig.).

Diese Ergebnisse zeigten, dass die gleichzeitige Verabreichung von SAM(M1-NP) und MIIV eine breitere Immunität induzierte, was zu einem verbesserten Schutz gegen heterologe Influenzaviren im Vergleich zu MIIV allein führte. Dies ist auch der erste Beweis dafür, dass die Kombination von ssRNA-Vektoren und proteinbasierten Impfstoffen möglich sein könnte, um die Wirksamkeit aktueller saisonaler und pandemischer Influenza-Impfstoffe zu verbessern.


Einführung

Der Schwerpunkt dieser Überprüfung liegt auf Tests zur Freisetzung von Impfstoffchargen oder -chargen, die für die Überwachung kritischer Qualitätsmerkmale (CQAs) und die Sicherstellung einer konsistenten Herstellung hochwertiger und gut charakterisierter Impfstoffprodukte unerlässlich sind. In dieser schnelllebigen Entwicklungslandschaft ist es besonders wichtig, dass die Kontrolle über Qualität und Konsistenz aufrechterhalten wird, während die Produktion hochskaliert und die globalen Lieferketten vorangetrieben werden. Analytisches Bridging durch den Nachweis der CQA-basierten Vergleichbarkeit zwischen Chargen wird in COVID-19-Impfstoffprogrammen umso mehr benötigt, um den Bedarf an zeitaufwändigem und teurem klinischem Bridging zu minimieren.

Das Portfolio der in der Entwicklung befindlichen COVID-19-Impfstoffe ist groß und wird täglich erweitert, wobei alle verfügbaren neuartigen und traditionellen Impfstoffplattformtechnologien genutzt werden. Unter diesen hat die mRNA-Plattform kürzlich die ersten beiden COVID-19-Impfstoffe geliefert, die auch die ersten Impfstoffprodukte dieser Technologieplattform sind 1,2,3,4 . Darüber hinaus hat die virale Vektorplattform, die zuvor zwei Impfstoffe gegen Ebola lieferte, unter Verwendung sowohl replizierender als auch nicht replizierender Vektoren 5,6,7, jetzt Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 8,9,10,11,12 geliefert. Zu den weiteren verwendeten Plattformen gehören abgeschwächte Lebendviren (LAV), inaktivierte Viren und rekombinante Proteine ​​und proteinbasierte virusähnliche Partikel (VLPs), die alle seit langem zugelassene Impfstoffe gegen andere Viren liefern.Dennoch gibt es Möglichkeiten, schnellere, sensitivere und robustere Batch-Release-Assays zu implementieren.

Zwischenanalysen von Daten aus Phase-3-Studien mit mRNA-Impfstoffen haben eine ausgezeichnete Wirksamkeit gezeigt 13,14 . Innerhalb der mRNA-Plattform scheinen selbstreplizierende oder selbstamplifizierende mRNA-Konstrukte (sa-mRNA) den Vorteil einer potentiellen Wirksamkeit bei einer niedrigeren Dosis zu bieten 15 . Dies muss jedoch insbesondere im Zusammenhang mit SARS-CoV-2 noch nachgewiesen werden.

In dieser Überprüfung werden Möglichkeiten aufgezeigt, die Geschwindigkeit von Chargenfreigabetests zu verbessern, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Dies ist besonders wichtig für Impfstoffe gegen COVID-19, die eine schnelle Freigabe von Impfstoffchargen erfordern, um eine dringende Lieferung zu gewährleisten. Robuste und schnellere Turnaround-Assays für die Wirksamkeit und andere ausgewählte CQA werden auch für die Überwachung der langfristigen und beschleunigten Stabilität wichtig sein. Die Anforderungen an Toolboxen und Assays hängen von der Impfstoffplattform und dem Produkt ab, obwohl es Gemeinsamkeiten gibt. Insbesondere werden wir uns auf Potenztests konzentrieren, die für die Bereitstellung sicherer und immunogener Dosen von Impfstoffen von entscheidender Bedeutung sind. Obwohl für die bewährten Plattformen wie LAV und rekombinante Proteine ​​Assays etabliert sind, können für einige CQA schnellere und robustere In-vitro-Assays entwickelt werden.

Neben Antigen enthält die endgültige Formulierung des Impfstoffwirkstoffprodukts (DP) häufig Hilfsstoffe und Hilfsstoffe wie Stabilisatoren oder Kryoschutzmittel. Chargenfreigabetests für DP müssen Schlüsseltests für diese Komponenten umfassen. Darüber hinaus muss jede mögliche Interferenz dieser Komponenten in Antigenassays, z. B. Potenz, ausgeschlossen oder angegangen werden.

Mit Stand vom 25. Januar 2021 befinden sich laut der laufenden Landschaftsanalyse von CEPI 16,17 weltweit etwa 58 Impfstoffkandidaten in verschiedenen Phasen klinischer Studien, und einige stehen kurz vor dem Eintritt in die Phase-1-Studie am Menschen. Sechzehn Impfstoffkandidaten befinden sich bereits in Phase 2b/3-Studien, während sich der Rest in 1, 1/2 und 2 klinischen Phasen befindet. In den kommenden Wochen können sich einige dieser Datenpunkte möglicherweise aufgrund der kürzlich erfolgten Notfallzulassung (nach Abschluss der Phase 3) einiger Impfstoffe ändern, die in die Phase 4 nach der Zulassung eintreten könnten.

Im Laufe der Jahre haben Aufsichtsbehörden wie die Food and Drug Administration (FDA) der USA und die European Medicines Agency (EMA) sowie die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Richtlinien und Empfehlungen für die Qualitätskontrolle von Impfstoffen, die von verschiedenen Plattformen hergestellt werden, bereitgestellt Technologien. Allgemeine Richtlinien für Impfstoffe gegen COVID-19 wurden veröffentlicht 18,19,20,21,22,23,24,25 , und spezifischere Empfehlungen werden derzeit erarbeitet.

Prinzipien der analytischen Bewertung nach CQA

CQA-basierte Assays sind größtenteils produkt- und plattformspezifisch. Zusätzliche kritische Assays, z. B. restliche Wirtszellen und prozessbedingte Verunreinigungen wie DNA, Proteine, DNAase, Trypsin und Serumalbumin, können generisch sein, haben jedoch Auswirkungen auf die Produktsicherheit und -integrität. Quantitative und sensitive Methoden sind für solche Verunreinigungen gut entwickelt und werden hier nicht diskutiert. Mikrobiologische Tests, einschließlich Sterilität, sind von entscheidender Bedeutung, um die Sicherheit jedes Produkts zu gewährleisten. Herkömmliche, kulturbasierte Sterilitätstests, die einige Wochen erfordern, sind oft der langsamste und geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Freisetzung von Impfstoffchargen. Es wurde über schnelle und zuverlässige Sterilitätstestverfahren berichtet, die jedoch bisher nur eine begrenzte behördliche Akzeptanz für die Freigabe von Zelltherapieprodukten mit kurzer Haltbarkeitsdauer gefunden haben 26 . Diese können im Zusammenhang mit der schnelleren Chargenfreigabe von Impfstoffen gegen COVID-19 weiter bewertet werden.

Wirksamkeitstests für LAV-Impfstoffe haben traditionell Zellkultur-basierte Infektiositätstests verwendet, wie z. Diese CPE-basierten Verfahren werden auch für virale Vektorimpfstoffe verwendet. Alternative Methoden mit erhöhter Nachweisempfindlichkeit, während die essentielle Zellinkubation am vorderen Ende gehalten wird, wurden ausgiebig untersucht. Diese Methoden können die Durchlaufzeit erheblich verkürzen und einen höheren Durchsatz bieten. Im Hinblick auf die schnelle Entwicklung und Bereitstellung von Impfstoffen gegen SARS-CoV-2 gibt es jetzt dringenden Bedarf und Gelegenheiten, solche Assays mit Strenge und im Hinblick auf die behördliche Akzeptanz zu implementieren. Es ist möglich und in der Tat sehr wünschenswert, Schnelligkeit mit Qualität zu verbinden sowie innovative Analysemethoden zu implementieren, die auch die Präzision und Genauigkeit verbessern.

Es scheint, dass die Mehrheit der Entwickler entweder das Spike-Glykoprotein voller Länge (S-Protein) oder einen Teil davon, wie das Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE-2) Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen ausgewählt hat, während über 50 Impfstoffkandidaten auch mehr als ein Ziel enthielten, zB S-, M-, E- und N-Proteine ​​(siehe Fig. 1). Bei allen Nukleinsäure- und viralen Vektor-basierten Projekten sollte die Expression der den jeweiligen Transgenen entsprechenden Proteinantigene idealerweise im Rahmen von Potenztests in geeigneten Zellen getestet werden. Es wird erwartet, dass Antikörper, die in den Seren von Impfstoffempfängern erzeugt wurden, SARS-CoV-2-bindende und neutralisierende Antikörper enthalten. Veröffentlichte Daten legen nahe, dass das S-Protein neutralisierende Antikörper induzieren könnte 27 .

Die Anzahl der Projekte wird für jedes Zielantigen angezeigt. Die verschiedenen verwendeten Plattformtechnologien sind mit unterschiedlichen Farben codiert, wie im Einschub definiert.

Die Qualität eines Impfstoffs muss durch analytische Methoden bewertet werden, die seine Identität, Reinheit, strukturelle Integrität und biologische Aktivität als Maß für die Wirksamkeit widerspiegeln. Diese Messungen und die quantitative Bestimmung der zu verabreichenden Dosen müssen so genau und präzise wie möglich sein, obwohl die speziellen Assays zur Quantifizierung dieser CQA von der Plattform und dem Produkt abhängen, das den Impfstoffempfängern verabreicht wird. Der In-vitro-Potenzassay als ein Beispiel wird für verschiedene Technologien variieren (siehe Tabelle 1). Selbst für einen Entwickler, der eine bestimmte Plattform verwendet, werden mehrere Standorte rund um den Globus genutzt, um die Herstellung und den schnellen Vertrieb von Hunderten Millionen Dosen in verschiedenen Teilen der Welt zu ermöglichen. Daher ist die Festlegung und Einhaltung von Spezifikationen für qualitätsanzeigende Assays von größter Bedeutung, um die Lieferung sicherer und wirksamer Impfstoffe von gleichbleibender Qualität weltweit sicherzustellen.

Viele Entwickler verfügen über umfangreiches Know-how in analytischen Assays für die Chargenfreigabe und Charakterisierung im Zusammenhang mit der Entwicklung von Impfstoffen gegen Prä-COVID-19-Erreger unter Verwendung derselben Technologieplattformen. Es ist jedoch von größter Bedeutung, sich auf die Implementierung der Assays und Tools zu konzentrieren, die die direktesten und genauesten Indikatoren oder Ersatzmaße für Sicherheit, Wirksamkeit und Immunogenität sind. Die Entwicklung und Durchführung dieser Methoden kann von der klinischen Phase abhängen. Die kritischen Assays wie die oben genannten sollten bis zum klinischen Eintritt (Phase 1/2a) qualifiziert und idealerweise vor Phase 3 validiert werden. Die Entwicklung reproduzierbarer, wissenschaftlich fundierter Assays und Standards in der präklinischen Phase ermöglicht einen effizienten Prozess Optimierung, erleichtert regulatorische Interaktionen und den Eintritt in die Klinik.

In-vitro-Methoden werden typischerweise für die Chargenfreigabe von Chemie, Herstellung und Kontrolle (CMC) bevorzugt, da sie präziser und robuster als In-vivo-Assays sind und eine viel kürzere Durchlaufzeit haben. Jedoch kann eine Korrelation zwischen der relativen In-vitro-Potenz (IVRP) und der In-vivo-Immunogenität (in einem relevanten Tiermodell) als Hintergrundgrund für einen Potenztest wünschenswert sein. Die Entwicklung dieser Korrelation in dosisabhängiger Weise kann die Entwicklung immunologischer Assays ergänzen, die Virus-bindende sowie Virus-neutralisierende Antikörper in Tieren und später in klinischen (humanen) Seren nachweisen und quantifizieren können.

Analytische Vergleichbarkeit

Die CQA-basierte Bewertung der Vergleichbarkeit von Los zu Los ist ein wichtiger Bestandteil der CMC-Aktivitäten. Dadurch wird sichergestellt, dass Impfstoffchargen, die für aufeinanderfolgende Phasen klinischer Studien verwendet werden, auf der Grundlage der wichtigsten CQA des Produkts wie Wirksamkeit, Reinheit und physikalisch-chemischer Integrität gleichwertig sind. Die Aufrechterhaltung der Vergleichbarkeit zwischen Material in kleinerem Maßstab, wie es häufig in präklinischen Toxizitätsstudien und Phase-1-Studien verwendet wird, mit Material für klinische Studien der späteren Phase (CTM), das durch Prozesse in größerem Maßstab hergestellt wird, ist eine behördliche Anforderung. Jede Prozessmodifikation und Formulierungsänderung zwischen diesen Phasen, wie die Zugabe eines zugelassenen Stabilisators, müsste ebenfalls durch eine CQA-basierte Vergleichbarkeit belegt werden. Dies ist Teil der Good Manufacturing Practice (GMP) und bietet einen Schutz vor potenziell kostspieligen und zeitaufwändigen klinischen Überbrückungen. Der Nachweis der Vergleichbarkeit zwischen Phase 3 und kommerziellen Chargen ist erforderlich und ist besonders kritisch, wenn es um Scale-Up oder Scale-Out geht, obwohl die Prozesse für Arzneimittelsubstanzen (DS) und Arzneimittelprodukte (DP) vor Phase 3 abgeschlossen waren.

Die Vergleichbarkeitsanalyse kann für COVID-19-Impfstoffe eine zusätzliche Dimension haben, da selbst für ein einzelnes Produkt in vielen Fällen ein Technologietransfer zwischen einem Entwickler und einem Produktionspartner mit höherer Kapazität stattfinden muss, um den großen globalen Bedarf zu decken. Die Aufstellung eines klaren Plans zwischen den beteiligten Partnern, unterstützt durch entsprechende regulatorische Beratung, wird es ermöglichen, die Vergleichbarkeit zwischen Prozessen und Produktchargen sicherzustellen.

Beispiele für CQA-basierte Assays

Ein „Potenztest“ für einen Impfstoff ist in Wirklichkeit ein biologischer Aktivitätstest, der ein Surrogat für die durch das Antigen auszulösende Immunantwort ist. Dies ist typischerweise ein produkt- und/oder plattformabhängiger Assay. Während die Potenz eng mit der Dosis zusammenhängt, können quantitative Methoden zur Messung dieser Attribute von der Plattform abhängen. Beispielsweise wird für ein rekombinantes Proteinantigen die Dosis- (oder Gehalts-)Messung typischerweise durch einen quantitativen Proteinassay oder eine Absorption im nahen Ultraviolett (UV) durchgeführt, während die Wirksamkeit durch einen Immunoassay in einer Reihe vorbestimmter Dosen gemessen wird, wie z ein Surrogat der biologischen Immunantwort. Bei LAV-Impfstoffen können andererseits sowohl Dosis als auch Potenz als infektiöser Titer ausgedrückt werden, obwohl der Inhalt, mit dem ein Impfling dosiert wird, auch nicht-infektiöse oder defekte virale Genome enthält. In diesem Fall sollte die Gesamtzahl der Viruspartikel oder Genomkopien gemessen werden, um das Verhältnis von infektiösem zu gesamtem Virustiter zu verfolgen. Bei inaktivierten Virusimpfstoffen wird das Ausmaß der Inaktivierung durch den Verlust des infektiösen Titers gemessen, während ein Immunoassay gegen ein Schlüsselepitop des Virus, das noch einen spezifischen mAb oder polyklonale Seren binden kann, als Dosis verwendet werden kann als Potenztest. Für genetisch in virale Vektoren inserierte Antigene wurde der infektiöse Titer des Vektors oft als Dosis sowie als Potenz verwendet, obwohl in anderen Fällen die Gesamtzahl der viralen Partikel als Dosis angegeben wurde. Außerdem wird die Expression des Zielantigens, das durch das inserierte Gen kodiert wird, in einer geeigneten Zelllinie als Potenztest erwartet. Bei DNA- und RNA-Antigenen kann die Dosis leicht durch Absorptions- und Fluoreszenzmethoden oder durch quantitative PCR (qPCR) gemessen werden. Die Wirksamkeit sollte jedoch separat durch Transfektion geeigneter Zelllinien und Expression des Proteinantigens gemessen werden.

Die Wirksamkeit ist auch ein primärer Stabilitätsindikator und muss für alle Kandidatenantigene in Bulk (DS) sowie für formulierte DP als Funktion der Zeit überwacht werden. Andere stabilitätsanzeigende CQA umfassen physikalische, chemische und strukturelle Integrität. Aggregation, Abbau oder strukturelle Entfaltung können zu einem Verlust der biologischen Wirksamkeit führen und können Toxizitätsprobleme auslösen, z. B. durch Induzieren einer unerwünschten Immunantwort. Je nach Art des Antigens, d. h. der Technologieplattform, sind diese Assays unterschiedlich, aber es gelten die gleichen Grundprinzipien.

Rekombinante Impfstoffe auf Proteinbasis

Für Untereinheits- und VLP-Antigene und tatsächlich für alle Antigenklassen bildet eine dosisabhängige Korrelation zwischen in vitro-Potenz und Immunantwort in Tiermodellen oft die Grundlage für eine potenziell wirksame und sichere Dosisauswahl in klinischen Studien. Als Chargen-Freisetzungsassay wird jedoch ein in vitro-Wirksamkeitsassay typischerweise aus einigen Gründen bevorzugt, einschließlich höherer Präzision, geringerer Variabilität zwischen den Assays, schnellerer Durchlaufzeit und höherem Durchsatz. Tatsächlich scheint dies die Präferenz von Entwicklern und Aufsichtsbehörden für Impfstoffe zu sein, die gegen SARS-CoV-2 entwickelt werden. Bei Antigenen, die überwiegend über einen humoralen Weg wirken, kann die Immunantwort oder „Immunogenität“ bestimmt werden, indem die Konzentrationen von Antikörpern in Tierseren gemessen werden, die an Zielepitope auf dem Antigen binden. Typischerweise werden Immunoassays wie Bindungs- und kompetitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) und Surface Plasmon Resonance (SPR) verwendet. T-Zell-vermittelte Antworten oder zellvermittelte Immunität (CMI) werden durch Auswertung der Induktion von Zytokinen wie Interferonen (IFN), Interleukinen (IL) und Tumornekrosefaktoren (TNF) bestimmt. Weitere präklinische Arbeiten außerhalb von CMC können Tests auf Neutralisation des gesamten Virus bei einem relevanten Titer durch in Tierseren erzeugte Antikörper umfassen.

Es gibt mehrere Beispiele für rekombinante Untereinheiten auf Proteinbasis und VLP-Antigene, für die erfolgreich in vitro-Potenztests entwickelt wurden. Für zugelassene VLP-Impfstoffe gegen das Hepatitis-B-Virus (HBV) und das humane Papillomavirus (HPV) ist beispielsweise die Korrelation zwischen in vitro-ELISA und in vivo-Produktion neutralisierender Antikörper gut etabliert 28,29,30. IVRP-Assays wurden von den Aufsichtsbehörden akzeptiert. Für einen trimeren Post-Fusions-F-Protein-basierten Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Impfstoff, der sich in der klinischen Entwicklung befand (aber kein zugelassenes Produkt war), wurde die Korrelation zwischen einem Sandwich-ELISA IVRP und der In-vivo-Immunogenität nachgewiesen 31 , und IVRP war als Chargen-Freisetzungs-Potenzassay verwendet.

Während ELISA in verschiedenen Formen wie Direktbindung, kompetitiv oder Sandwich eine weit verbreitete und zuverlässige Technologie ist, bieten neuere Immunoassay-Technologien eine schnelle Durchlaufzeit, einen hohen Durchsatz und eine gute Präzision. Ein Beispiel ist VaxArray, eingeführt von InDevR 32 . Darüber hinaus sind SPR und Bio-Layer-Interferometrie (BLI) alternative Optionen für direkte Antigen-Antikörper-Bindungsassays 33,34 . Der ursprünglich gegen das S-Protein von SARS-CoV entwickelte mAb CR3022 bindet auch mit hoher Affinität an SARS-CoV-2 (aber nicht neutralisierend) und kann für ELISA oder einen dieser alternativen Immunoassays als Lot Release Potency Assay verwendet werden . SARS-CoV-2 S-Protein RBD-spezifische mAbs wurden berichtet 27 , und mehrere sind im Handel erhältlich. Es wurde ein Surrogat-SARS-CoV-2-Virus-Neutralisationsassay veröffentlicht, der auf einer Antikörper-vermittelten Hemmung der Interaktion zwischen S-Protein und Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE-2)-Rezeptor basiert 35 .

Die Zuverlässigkeit eines Potenzimmunoassays hängt von der Genauigkeit und Präzision eines unabhängigen Assays zur Messung des Gehalts (der Dosis) des verwendeten Antigens ab. Für rekombinante Proteinantigene sind spektrophotometrische Methoden (wie Extinktion bei 280 nm oder A280nm) oder ein Proteinassay auf Farbstoffbasis verwendet werden. Messungen von A280nm sollte Korrekturen für die Lichtstreuung enthalten, die aus der Proteinaggregation resultieren kann.

Physikochemische und strukturelle Integrität von Proteinantigenen sind weitere CQS, die sowohl die Wirksamkeit als auch die Sicherheit beeinträchtigen können. Die Konservierung von Schlüsselepitopen kann durch Bindung spezifischer mAbs bestimmt werden, was auch einen Hinweis auf die Gesamtintegrität und Stabilität der Tertiärstruktur geben kann. Direkte Messungen der Stabilität von Sekundärstrukturen und der thermischen Entfaltung von Proteinantigenen können durch Zirkulardichroismus (CD) im fernen UV und Differentialscanningkalorimetrie (DSC) verfolgt werden. Dies sind relativ schnelle und unterstützende Tools, wenn auch nicht von hoher Auflösung. Als Teil einer umfassenden strukturellen Charakterisierung höherer Ordnung wurde Kryo-Elektronenmikroskopie an einem Kandidatenantigen, NVAX-CoV2373, durchgeführt, das eine stabilisierte Form des Präfusions-Spike-Glykoproteins 36 ist. Während der Entwicklung bis hin zu einem abschließenden Prozess bietet eine detaillierte strukturelle Charakterisierung eine solide Grundlage für die Struktur-Funktions-Korrelation für Proteinantigene. Sobald diese Grundlage geschaffen ist, kann ein einfacher funktioneller Assay (z. B. Antikörperbindung), der konsistent mit strukturellen Störungen korreliert, als Surrogat-CQA-Assay dienen. Neben der anfänglichen Quantifizierung des Reinheitsgrades sollten der Proteinabbau und die posttranslationale Modifikation auf Primärstrukturebene beobachtet und in das Stabilitätsprogramm integriert werden. Während VLPs selbstassoziierte Proteineinheiten von wohldefinierter Größe darstellen, sollte die Möglichkeit einer unspezifischen Proteinaggregation durch gut beschriebene hydrodynamische Methoden, z. B. auf Lichtstreuung basierende Techniken, überwacht werden. Die Aggregation von HPV11- und HPV16-L1-VLPs korrelierte direkt mit dem Potenzverlust, gemessen durch die Antikörperproduktion bei Mäusen 37 . Eine unspezifische Aggregation kann möglicherweise auch eine unerwünschte Immunantwort verursachen.

In der Vergangenheit erforderten rekombinante Impfstoffe auf Proteinbasis immer Adjuvantien für eine optimale Immunantwort. Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxid, -phosphat und Hydroxy-Phosphat-Sulfat sind seit Jahrzehnten die einzigen zugelassenen Hilfsstoffe. In den letzten Jahren wurden mehrere neue Adjuvantien auf Basis von Lipid A wie Monophosphoryl-Lipid A und Glucopyranosyl-Lipid A in einer stabilen Emulsion (MPLA, GLA-SE), Squalen (AS03, MF59) und Saponinen (Matrix-M) zugelassen in Impfstoffprodukten oder für klinische Studien. Ein weiteres Beispiel ist die synthetische DNA von Cytosinphosphoguanin (CpG). Die aktuelle Pipeline von Impfstoffkandidaten gegen SARS-CoV-2 umfasst die stabilisierte Präfusionsform des Oberflächenproteins in Kombination mit Adjuvanzien wie AS03, CpG 1018, MF-59 und Matrix-M 38,39,40,41 . In diesen Fällen muss die DP-Freisetzung des Impfstoffs Reinheitsprofile solcher Adjuvantien beinhalten.

Nukleinsäure-basierte Impfstoffe: pDNA- und mRNA-Plattformen

Gemeinsamkeiten und Unterschiede

Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis kodieren für ausgewählte Proteinantigene und verlassen sich auf menschliche Zellen, um diese Antigene nach der Verabreichung zu produzieren. Sowohl pDNA- als auch mRNA-Technologien werden bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen SARS-CoV-2 verwendet, die auf Nukleotidsequenzen basieren, die das S-Protein in menschlichen Zellen exprimieren würden. Die Neutralisation durch Antikörper, die in Tierseren erzeugt wurden, sowie der Schutz gegen Virusbelastung bei geimpften Tieren wurden verwendet, um die Auswahl einer potenziell sicheren und immunogenen Dosis für erste klinische Studien zu unterstützen. In den frühen Phasen klinischer Studien (Phase 1/2a) kann es aus regulatorischer Sicht ausreichend sein, ein CMC-Paket mit CQA-basierten Tests wie genetische Identität, Konformationsreinheit und Inhalt voranzutreiben. Dies könnte durch den Nachweis einer antigenspezifischen Immunantwort in Tiermodellen unter Verwendung eines serologischen Tests wie dem Plaque-Reduktions-Neutralisationstest unterstützt werden.In Phase 3 wird jedoch erwartet, dass ein Potenztest die Expression des Proteinantigens in einer relevanten Zelllinie zeigt und mit der in vivo-Expression korreliert. WHO-Richtlinien und regulatorische Dokumente von EMA und FDA haben diese Empfehlungen kürzlich gegeben 42,43,44 . Außerdem wurde eine Leitlinie veröffentlicht, die Aussehen, Identität, Wirksamkeit und Integritätsanalysen für die Chargenfreigabe durch die amtliche Kontrollbehörde (OCABR) von mRNA-Impfstoffen auflistet 23 .

Die Antigenexpression in transfizierten Zellen kann qualitativ z. B. durch Western-Blot-Analyse mit Antikörpern gegen SARS-CoV-2 nachgewiesen werden. Während der Impfstoffentwicklung, die auf SARS-CoV abzielte, wurde dies für einen experimentellen DNA-Impfstoff erreicht, der die Nukleoprotein (N-Protein) kodierende Sequenz verwendet 45 . Die quantitative Bestimmung der Antigenspiegel kann durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten SARS-CoV-2 S-Protein-Antikörpern für pDNA- (und mRNA-) Projekte erfolgen, die die kodierende Sequenz dieses Antigens verwenden. Die Durchflusszytometrie wurde zum quantitativen Nachweis der Antigenexpression in Impfstoffkandidaten auf Nukleinsäurebasis verwendet 46 . Die Transgenexpression von pDNA-Impfstoffen kann auch auf RNA-Ebene in transfizierten Zellen durch RT-PCR quantifiziert werden 47 .

Transfektionseffizienzen als Maß für die Wirksamkeit von mRNA-Konstrukten in dendritischen Zellen und mehreren anderen Zelllinien wurden unter Verwendung von fluoreszenzmarkierter mRNA und durchflusszytometrischer Detektion bestimmt 48 . Beispiele umfassen mRNA-Transkripte, die Tollwut- und Zika-Antigene codieren 49,50.

Es gibt einen grundlegenden Unterschied im Wirkmechanismus zwischen pDNA- und mRNA-Antigenen. Dies führt zu mehreren wichtigen Unterschieden in den Eigenschaften der resultierenden Produkte. pDNA-Antigene erfordern einen intrazellulären Transport, um die Transkription im Zellkern zu erreichen, gefolgt von einem Austritt in das Zytosol, wo die Translation stattfindet. Andererseits werden mRNA-Antigene direkt in das Zellzytoplasma zur Translation in das entsprechende Protein eingebracht. Dieser Unterschied ist der wahrscheinlichste Grund, warum die erforderlichen Dosen für pDNA-Impfstoffe typischerweise viel höher sind als die von mRNA-Impfstoffen. pDNA-Impfstoffe werden am besten durch Elektroporation mit einem speziellen Gerät nach intramuskulären oder subkutanen Injektionen verabreicht. Das Gerät erfordert eine behördliche Zulassung, kann aber nach seiner Zulassung zur Elektroporation aller pDNA-Antigene verwendet werden, sofern keine Änderungen am Design vorgenommen werden. pDNA-Antigene haben normalerweise eine höhere Stabilität und die Formulierungsanforderungen sind einfacher, während mRNA-Antigene typischerweise physikalisch weniger stabil sind und eine Einkapselung durch Lipid-Nanopartikel (LNP) erfordern, um sie vor dem Abbau durch RNAsen zu schützen. Dies führt auch zu einer relativ größeren Anzahl von Freisetzungs- und Charakterisierungstests für mRNA-basierte DPs.

Bioanalytische Fortschritte bei der mRNA-Plattform

Selbstreplizierende RNA oder sa-mRNA ist eine Weiterentwicklung der mRNA-Plattform mit dem Potenzial, eine äquivalente Immunantwort bei einer niedrigeren Dosis als für Standard-mRNA benötigt 51 zu erreichen. Ein in vitro-Potenzassay für ein sa-mRNA-Konstrukt wurde entwickelt, um die Replikationseffizienz zu messen, indem intermediäre doppelsträngige RNA (dsRNA) und vergleichbare Proteinexpression in einzelnen Zellen durch einen antigenspezifischen Antikörper erfasst werden. Dieser Assay basiert auf dem indirekten Antikörper-Markierungsansatz, bei dem die Proteinexpressionsleistung durch Transfektion von Antigen-kodierter mRNA in Baby-Hamster-Nieren-(BHK)-Zellen gefolgt von einer Färbung mit Fluorochrom-markiertem Primärantikörper 52 gemessen wird. Die Häufigkeiten der fluoreszierenden positiven Zellen zeigen den Grad der Proteinexpression an und bestätigen die Antigenidentität innerhalb von 48 Stunden. Dieses Verfahren könnte leicht den Nachweis mehrerer Proteine ​​in einer einzelnen Zelle ermöglichen und könnte als plattformbasierter Ansatz angepasst werden, indem sekundäre Antikörper verwendet werden, um mehrere antigenspezifische Antikörper nachzuweisen. Während des Replikationszyklus produzierte intrazelluläre dsRNA ist ein Marker für die RNA-Amplifikation. BHK-Zellen, die mit Influenza- und Zika-Virus-sa-mRNA transfiziert waren, berichteten über eine hohe Häufigkeit von dsRNA-positiven Zellen, die mit Anti-dsRNA-Antikörper gefärbt (gemessen durch Durchflusszytometrie) waren, was den Start der Selbstamplifikation enthüllte 52,53 . Interessanterweise wurde festgestellt, dass das immunogene Profil des Zika-Virus-sa-mRNA-Impfstoffs mit der Häufigkeit von dsRNA-positiven BHK-Zellen und der Proteinexpression vergleichbar ist 53 . In ähnlicher Weise könnten auch Direkt- und Sandwich-ELISA unter Verwendung von elektroporierten Zellen mit RNA-Impfstoffen entwickelt werden. Das aktuelle Portfolio an mRNA-basierten COVID-19-Impfstoffkandidaten umfasst sa-mRNA-Kandidaten.

Entwickler von mRNA-Impfstoffen haben der Stabilität und dem effizienten Transport von Antigenen große Aufmerksamkeit geschenkt. Da das Capping am 5'-Ende einen Einfluss auf Stabilität und Translation haben kann, ist der Prozentsatz der gecappten RNA ein CQA, der quantitativ gemessen werden sollte. Typischerweise für diesen Zweck eingesetzte Methoden wurden überprüft 48 . Für die Formulierung und Verabreichung von Arzneimitteln wurden LNPs ausgiebig mit dem Ziel verwendet, die angeborene Immunantwort zu stimulieren, und diese Studien umfassen klinische Studien 54 . In jüngerer Zeit wurde gefunden, dass mRNA-Transkripte, die für RSV-F-Protein vor und nach der Fusion kodieren und in LNP formuliert sind, in Nagetiermodellen eine schützende Immunantwort auslösen 55 . Diese Formulierungen beinhalten typischerweise die Einkapselung von mRNA in LNP. Daher sollte auch die Verkapselungseffizienz als CQA bestimmt werden. Die mittlere hydrodynamische Größe und Größenverteilung (Polydispersität) von LNP sollte innerhalb des Zielspezifikationsbereichs gehalten werden. Zur Überwachung dieser Parameter sind dynamische oder Mehrwinkellichtstreutechniken geeignet. Die Menge und Reinheit jedes im LNP verwendeten Lipids müssen überwacht werden, da diese Parameter wahrscheinlich zur Wirksamkeit und Sicherheit beitragen. Es wurde berichtet, dass die Formulierung von zwei Kandidaten für sa-mRNA-Impfstoffe gegen das Zika-Virus mit einer kationischen Nanoemulsion (CNE) eine starke Immunität bei Mäusen und nicht-menschlichen Primaten induziert 53 . In diesem Fall wurde eine einfache Mischung des mRNA-Antigens mit dem CNE-Adjuvans verwendet.

Die möglichst vollständige Entfernung von dsRNA im Endprodukt, das aus in vitro transkribierten mRNA-Transkripten resultiert, ist wichtig, da dsRNA bekanntermaßen eine unerwünschte lokale Immunantwort an der Injektionsstelle hervorruft. Eine einfache Methode zur Entfernung von dsRNA wurde berichtet 56 . Dies ist ein weiterer CQA, der in Bezug auf die Sicherheit quantitativ überwacht werden sollte.

Im Zusammenhang mit der physikalischen Stabilität von mRNA-basierten Impfstoffen wurde eine signifikant verbesserte thermische Stabilität für einen gefriergetrockneten Tollwut-Glykoprotein-mRNA-Kandidaten-Impfstoff 57 erreicht. Die genetische Stabilität sollte auch während der Lagerung im Laufe der Zeit überwacht werden.

Kürzliche Lieferungen von COVID-19-Impfstoffen von der mRNA-Plattform

mRNA-basierte Technologien stellen eine relativ neue Plattform dar. Zwei der modifizierten mRNA-basierten Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 haben die klinischen Phasen 58,59,60,61 schnell durchlaufen und haben kürzlich Produkte geliefert, die von mehreren Aufsichtsbehörden eine Notfallgenehmigung (EUA) erhalten haben. Diese Produkte, BNT-162b2 und mRNA-1273, wurden von Pfizer-BioNTech bzw. Moderna Therapeutics entwickelt. Beide basieren auf nicht-replizierenden mRNA-Sequenzen, die für das S-Protein voller Länge kodieren und in LNP verpackt sind, um Schutz gegen RNAsen zu bieten. Der Bewertungsbericht der EMA zu BNT162b2 bietet eine umfassende Zusammenfassung der Tests, die mit diesem Produkt durchgeführt wurden 3 . Produktspezifische Tests umfassen in vitro bioanalytische Chargenfreigabe- und Charakterisierungsassays für das Antigen und LNP.

Impfstoffe auf viraler Vektorbasis

Virale vektorisierte Impfstoffe stellen einen bedeutenden Teil des globalen Portfolios dar, wobei 60 Impfstoffkandidaten gegen SARS-CoV-2 entwickelt werden. Impfstoffkandidaten basieren auf replizierenden und nicht replizierenden Vektoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV), Masern, modifizierte Vaccinia ankara (MVA), Adenovirus 26 und 5 (Ad26, Ad5) und Schimpansen-Adenovirus Oxford-Konstrukt 1 ( ChAdOx1). Diese Impfstoffe werden entweder in einem homologen oder einem heterologen Prime-Boost-Schema oder in einem Einzeldosis-Schema evaluiert. Vor COVID-19 wurden zwei Produkte gegen Ebola lizenziert, die virale Vektorplattformen verwenden. Darüber hinaus wurden für alle oben genannten Vektoren 62,63,64,65,66 klinische Studien berichtet, die akzeptable Sicherheitsprofile belegen. Die Bewertung der Sicherheit eines viralen vektorisierten Impfstoffs basiert auf den gleichen Prinzipien wie bei LAV. Außerdem ist es vom Standpunkt der CMC aus notwendig, die Konzentration von replikationskompetenten viralen Partikeln zu überwachen, die während der Herstellung eines replikationsdefizienten viralen Vektors auftreten können. Die Wirksamkeit eines viralen vektorisierten Impfstoffs sollte idealerweise sowohl die Infektiosität als auch die Transgenexpression widerspiegeln 67,68,69,70. Die Expertengruppe der Europäischen Pharmakopöe (Gruppe 15) hat Leitlinien zu geeigneten Analysestrategien für virale vektorisierte Impfstoffe bereitgestellt 71 und darüber hinaus wurden OCABR-Richtlinien für Analysen von nicht replizierenden humanen und Schimpansen-Adenovirus-vektorisierten Impfstoffen veröffentlicht 21,22 .

Virusvektorisierte Impfstoffe werden typischerweise basierend auf der Infektiosität und/oder den gesamten Viruspartikeln dosiert. Assays zur Bestimmung der Infektiosität viraler vektorisierter Impfstoffe basieren auf den gleichen zellbasierten Prinzipien und unterliegen den gleichen Herausforderungen wie unten für LAV beschrieben. Von den derzeit zugelassenen Produkten für Ebola nutzt der rekombinante VSV-basierte Impfstoff gegen den Zaire-Stamm des Ebola-Virus (rVSV-ZEBOV) eine Kombination aus durch den TCID50-Test ermittelter Infektiosität und durch den Tröpfchen-Digital-Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR)-Test ermittelten Gesamtvirenpartikel 72. In ähnlicher Weise wird der Ad26.ZEBOV/MVA-BN®-Filo heterologe Prime-Boost-Ebola-Impfstoff prime auf der Grundlage der gesamten Viruspartikel, die durch qPCR und qPCR-basierter Potenztest (QPA) bestimmt wurden, dosiert. QPA kombiniert qPCR mit einem auf Gewebekulturen basierenden Infektiositätsassay, um die Adenovirus-(Prime)-Potenz zu quantifizieren, während die Boost-MVA-BN®-Filo-Potenz ausschließlich auf der Infektiosität durch eine durchflusszytometriebasierte Methode bestimmt wird 73 . Der Durchsatz und die Durchlaufzeit der letztgenannten Infektiositätsassays sind im Vergleich zu den klassischen TCID50 verbessert, da die höhere Nachweisempfindlichkeit eine Verkürzung der Zellvirus-Inkubationszeit von 7 Tagen oder länger auf 2 Tage ermöglicht. Darüber hinaus werden auch die Genauigkeit und Präzision der Analyse verbessert und qPCR ermöglicht eine automatisierte Analyse 74 .

Die Quantifizierung von Viruspartikeln kann auch unter Verwendung verschiedener Instrumente zur Partikelgrößenbestimmung erfolgen. Beispielsweise verfolgt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), z. B. NanoSight ® (Malvern Instruments Ltd) und ZetaView ® (Particle Metrix GmbH), die Brownsche Bewegung von Partikeln durch eine Durchflusszelle in Echtzeit. Aus dem Video werden Parameter wie Partikelgröße und -anzahl bestimmt, die mit der VP-Menge 75 korreliert werden können. Ein weiteres schnelles Analyseverfahren zur Quantifizierung viraler Partikel ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), bei der die Säule die Trennung intakter Viruspartikel von anderen zellulären Verunreinigungen oder fragmentierten Viruspartikeln ermöglicht 76 .

Bei Impfstoffen auf Adenovektorbasis, die häufig für die COVID-19-Reaktion verwendet werden, werden Absorptionsmessungen üblicherweise zur Quantifizierung von Viruspartikeln verwendet, wobei Methoden verwendet werden, die auf der Korrelation zwischen dem Proteingehalt von Adenovirus-Präparaten und der Absorption bei 260 nm (für virale DNA) basieren ) mit entsprechenden Kontrollen 77,78 . Die Verwendung solcher Verfahren ermöglicht prozessinterne Kontrollen der Adenovirus-Partikelkonzentration und eine Hochdurchsatzanalyse für die Freisetzung. Darüber hinaus sind mehrere kommerzielle Kits erhältlich, die die Produktion viraler Hexonproteine ​​verwenden, um infektiöse Titer von adenoviralen Stammbeständen in 48 Stunden zu analysieren.

Anfänglich werden semiquantitative Assays wie Gelelektrophorese und Western Blot akzeptiert, um die Transgenexpression viraler vektorisierter Impfstoffe zu zeigen, obwohl für klinische Studien und Zulassungen im Spätstadium quantitativere Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit erforderlich sind. Eine Vielzahl von Verfahren kann angewendet werden, einschließlich biochemischer (z. B. Proteinbindung, enzymatische Reaktionen), immunchemischer (z. B. Durchflusszytometrie, ELISA) und molekularer (z. B. PCR, Microarray). Beispielsweise verwendet der von Janssen Impfstoffe lizenzierte Ebola-Impfstoff ELISA zur Bestimmung der Transgen-Expression im adenoviralen Prime-Impfstoff und Durchflusszytometrie für den MVA-Boost 79,80 .

Da virale vektorisierte Impfstoffe rekombinante Produkte sind, ist die genetische Stabilität ein wichtiger CQA, um zu beweisen, dass das interessierende Gen sowie der Vektor nicht beeinträchtigt sind. Dies wird im Allgemeinen in Charakterisierungsstudien vor der Zulassung und nicht für die Chargenfreigabe getestet. Dies geschieht durch Passieren des Virus, normalerweise mehrere Passagen über die Herstellungspassage hinaus, und Sequenzieren mehrerer nachfolgender Passagen unter Verwendung von entweder Sanger oder Next Generation Sequencing (NGS).

Jüngste Fortschritte bei der Verabreichung von Impfstoffen auf viraler Vektorbasis gegen COVID-19

Zwischenanalysen der klinischen Phase-3-Studie für den auf ChAdOx1 basierenden Impfstoff (AZD1222) von AstraZeneca-Oxford wurden veröffentlicht 81 , und dieser Impfstoff hat in Großbritannien und vielen anderen Ländern EUA erhalten 82 . Die klinische Phase-3-Studie wurde insbesondere in den USA aufgrund eines unerwünschten Ereignisses verlangsamt, obwohl es in extrem geringer Häufigkeit und ohne nachgewiesene Verbindung mit dem Impfstoff beobachtet wurde. Dies zeigt die kritische Rolle der bioanalytischen Charakterisierung in vollem Umfang, obwohl das Ansprechen bei jedem Individuum selbst für eine Placebo-Injektion nicht mit 100%iger Sicherheit vorhergesagt werden kann. Zwischenergebnisse der Ad26.SARSCoV-2.S-Impfstoffstudien von Johnson und Johnson wurden veröffentlicht 83,84 . Dieser Impfstoff hat den Vorteil der Lagerstabilität im Kühlschrank (2–8 °C) und bietet die Möglichkeit einer protektiven Wirksamkeit ab einer Einzeldosis. Dieser Impfstoff hat jetzt EUA von der FDA erhalten 85 .

Attenuierte Lebendimpfstoffe

Diese Plattform produziert seit Jahrzehnten einige der wirksamsten Impfstoffe und hat eine solide Erfolgsbilanz in Bezug auf die Sicherheit, wie die weltweite Anwendung des Masern- und Röteln-Impfstoffs bei Säuglingen zeigt. Die ältere Technologie der Attenuierung durch Mehrfachpassage durch Zellen und die neuere Einführung der Attenuierung durch Gentechnik sind wirksam. Zu den Sicherheitsbedenken gehört jedoch das Erreichen des Gleichgewichts zwischen dem Auslösen einer schützenden Immunantwort und dem Verursachen einer impfstoffinduzierten Infektion. Bei gentechnisch veränderten Viren muss die Abwesenheit von Reversionsmutanten überwacht werden, und NGS ist in dieser Hinsicht ein wirksames Instrument. Das Thema Potenz versus Sicherheit lässt sich am besten durch möglichst genaue und präzise Potenztests angehen. Herkömmliche infektiöse Titerassays wie TCID50, die von den Aufsichtsbehörden weithin akzeptiert werden, weisen oft große Standardabweichungen auf. Abhängig vom Virus können diese Assays aufgrund der geringen Sensitivität des CPE-Nachweises eine lange Durchlaufzeit haben, was eine große Anzahl von Replikationszyklen erfordert, damit ein ausreichender Prozentsatz der Zellpopulation durch Infektion abgetötet wird. Wie oben im Abschnitt über virale vektorbasierte Impfstoffe beschrieben, bieten PCR- oder fluoreszenzbasierte Nachweistechniken einen sensitiveren Nachweis und ermöglichen dadurch eine Verkürzung der Inkubationszeit mit Zellen. Veröffentlichte Beispiele dieser Anwendungen bei mehreren LAVs umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Masern, Rotavirus, VSV und HIV-1 86,87,88 . Der Fluoreszenz-Fokus-Assay (FFA), ein auf Fluoreszenz-Antikörpern basierender infektiöser Titer-Assay, bietet den Vorteil der Sensitivität, der automatisierten Herdzählung und des relativ hohen Durchsatzes. Im Vergleich zu Plaque- und TCID50-Assays kann die Infektion von Zellen früher im Prozess quantitativ nachgewiesen werden, anstatt auf die Zellmembranlyse warten zu müssen. Daher kann der infektiöse Titer als fokusbildende Einheit im Vergleich zu einem CPE-basierten Assay deutlich schneller bestimmt werden. FFA wird als Batch-Freisetzungs-Potenztest für einen zugelassenen LAV-Influenza-Impfstoff verwendet 89 . Es ist jedoch wichtig festzustellen, dass die Fokusbildung eine Folge einer Infektion ist und nicht einfach ein Bindungsereignis beobachtet wird, das möglicherweise nicht zu CPE führt. Der Nachweis der Übereinstimmung mit dem Plaque- oder TCID50-Assay kann ein Teil des FFA-Validierungsprozesses sein 90 . Mit geeigneten Kontrollen könnte FFA einen sensitiven und relativ schnellen zellbasierten Potenztest für SARS-CoV-2-LAV-Projekte bereitstellen. Eine neue markierungsfreie Technologie für infektiöse Messungen basiert auf der Laserkraftzytologie zum Nachweis und zur Quantifizierung von virusinfizierten Zellen. Er scheint empfindlicher und viel schneller als der TCID50-Assay zu sein und kann eine höhere Präzision bieten 91 . Dieses Verfahren kann auch für schnelle In-Prozess-Tests während der Herstellung verwendet werden.

Nicht-klinische und klinische Assays

Außerhalb von CMC werden in der präklinischen und klinischen Studienphase spezifische Assays entwickelt, um die bei Tieren bzw. Menschen induzierten Immunantworten zu testen. Diese Assays werden weiter auf Robustheit getestet, qualifiziert und in späteren Phasen validiert, um den Impfstoffentwicklungsprozess zu unterstützen. Häufig können Herausforderungen wie Variabilität in der In-vivo-Biologie und technische Unterschiede zwischen Laboratorien den Vergleich von Daten erschweren, die von einzelnen Laboratorien in späten Phasen und multizentrischen Studien erstellt wurden. Darüber hinaus erhöhen auch mehrere Assays, die für Impfstoffe verschiedener Modalitäten entwickelt wurden, die Komplexität. Um einige dieser Herausforderungen für ein zuverlässiges immunologisches Profiling jedes Impfstoffkandidaten auf der Grundlage verschiedener Plattformen zu mildern und robuste Assays bereitzustellen, um den Regulierungsprozess zu erleichtern, hat CEPI ein globales Netzwerk von sieben Central Laboratories (CLs) eingerichtet. Immunantworten, die während der präklinischen und klinischen Phase durch verschiedene Impfstoffe hervorgerufen werden, werden durch die Implementierung gemeinsamer Protokolle, Antikörperstandards und gleichwertiger Schlüsselreagenzien in diesen Labors analysiert 92,93 .

Die Antikörper-vermittelte Immunantwort beruht auf der B-Zell-Erkennung von Antigenen und der Freisetzung von Antikörpern. ELISA wird häufig verwendet, um humorale Antworten zu bewerten. CEPI wählte ELISA-Methoden aus, die Signale von SARS-CoV-2 S-, RBD- und N-Protein-IgG-Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen in voller Länge ausnutzen und erfassen. ELISA misst nur bindende Antikörper, während der Nachweis funktioneller Antikörper entscheidend für die Wirksamkeit des Impfstoffs ist und als goldener Standard gilt. Robuste Neutralisationsassays auf Pseudovirus- und Wildtyp-Virusbasis wurden entwickelt, um neutralisierende Antikörper gegen SARS-CoV-2 nachzuweisen, da sie zum Nachweis von Antikörpern entwickelt wurden, die die Virusreplikation hemmen können. Diese Assays sind entweder validiert oder qualifiziert.

Die CMI-Antwort beruht hauptsächlich auf T-Zellen und wird oft mit Enzyme-linked Immunospot (ELISPOT) oder Durchflusszytometrie beurteilt. Der von CEPI unterstützte ELISPOT ist ein Immunfärbungsassay, der sich auf eine quantitative Messung der Häufigkeit der Zytokin-sekretierenden T-Zellen konzentriert. Dieser ELISPOT-Assay ermöglicht den Nachweis spezifischer TH1 (IFN-γ) und TH2 (IL-5) Zytokine produzierender T-Zellen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die mit SARS-CoV-2-Peptiden stimuliert werden, die das S-Protein in voller Länge umfassen. Diese Zytokine wurden häufig bei mit SARS-CoV-2 infizierten Personen nachgewiesen und sagen einen Immunschutz voraus 94 .

Klinische Assays werden verwendet, um Immunantworten zu quantifizieren, die bei menschlichen Probanden nach der Immunisierung erzeugt werden, während Potenzassays entwickelt wurden, um optimale Dosen zu messen und biologische Aktivitäten zu ersetzen, die möglicherweise zu gewünschten Immunantworten führen würden. Beim Aufbau eines Potenztests ist es wünschenswert, eine wissensbasierte Hypothese bezüglich des Wirkmechanismus eines Impfstoffs zu haben, der mit einer klinisch relevanten Immunantwort korrelieren kann. Für SARS-CoV-2-Impfstoffe ist jedoch noch keine Korrelation des Schutzes beim Menschen bekannt, obwohl der Schutz in Tiermodellen für einige Impfstoffkandidaten nachgewiesen wurde 47,58 . Während ein solcher Hinweis auf eine protektive Wirksamkeit, der typischerweise bei einer Handvoll Tieren erhalten wird, sicherlich vielversprechend ist, ist er kein garantierter Prädiktor für die protektive Wirksamkeit beim Menschen. Dennoch ist es sehr ermutigend, dass frühe klinische Studien gezeigt haben, dass die Dosierungen, die auf der Grundlage von Potenztests für die CMC-Chargenfreisetzung ausgewählt wurden, zu hohen Immunantworten geführt haben 58,95 . Die Entwicklung nicht-klinischer Immunoassays könnte synergistisch dazu beitragen, funktionell sinnvolle und qualitative Potenzassays zu etablieren.

Die meisten Entwickler von SARS-CoV-2-Impfstoffen verwenden „interne“ Assays, Reagenzien und Referenzreagenzien. Dies macht es schwierig, Immunantworten verschiedener Impfstoffe zu vergleichen. Daher ist es wichtig, Assays und Reagenzien zu standardisieren, um klinische Studien in fortgeschrittenen Phasen zu unterstützen. Um dieses Problem anzugehen, hat CEPI die Entwicklung eines von der WHO anerkannten internationalen Antikörper-Referenzstandards 96 unterstützt, und Impfstoffentwickler werden ermutigt, diesen Standard in immunologische Assays aufzunehmen. Darüber hinaus verwenden CLs im globalen Labornetzwerk von CEPI gemeinsame Schlüsselreagenzien, darunter Beschichtungsprotein, SARS-CoV-2-Virusstamm, Viruspseudopartikel, Peptidpools für die PBMC-Stimulation, Standards und Kontrollen. Dieser duale Ansatz ermöglicht einen unparteiischen Vergleich von Daten aus Impfstoffversuchen.

Schlusskommentare

Die COVID-19-Pandemie hat die Bemühungen um die Entwicklung von Impfstoffen weltweit mit einer beispiellosen Dringlichkeit ausgelöst. Entwickler aus der biopharmazeutischen Industrie, kleinen und großen sowie akademischen Labors haben sich der Mission verschrieben, die aktuelle Pandemie zu beenden. Alle bisher entwickelten Impfstoff-Plattformtechnologien, alte und neue, werden eingesetzt. Aufsichtsbehörden haben die Prüfung von Anträgen von Prüfärzten, die den Eintritt in und das Fortschreiten durch klinische Studien anstreben, priorisiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die ersten beiden mRNA-Impfstoffe an mehr als 25 Millionen Menschen im Rahmen der EUA verabreicht. Vier virale vektorisierte Impfstoffe sind dicht gefolgt, um in verschiedenen Ländern die Zulassung für den Notfall zu erhalten, sowie vier inaktivierte Coronavirus-Impfstoffe. Da klinische Studien für viele weitere Impfstoffkandidaten fortgeschrittene Phasen mit Zehntausenden von Freiwilligen erreichen, werden Qualitätsmerkmale von Impfstoffkandidaten, die für die Sicherheit und Immunogenität entscheidend sein können, von den Entwicklern bewertet und von den Aufsichtsbehörden in enger interaktiver Weise streng überprüft. Basierend auf der umfangreichen Datensammlung, die bereits aus klinischen Studien am Menschen und aus laufenden Impfungen mit EUA-zugelassenen Produkten in mehreren Ländern gesammelt wurde, ist klar, dass die Sicherheitsprofile von Impfstoffen, die mit neueren Plattformen hergestellt wurden, ausgezeichnet waren. Um den dringenden Anforderungen praktisch der gesamten Weltbevölkerung gerecht zu werden, sollten analytische Assays mit hoher Zuverlässigkeit und kurzen Durchlaufzeiten zum Testen der CQA jedes Produkts implementiert werden. Solche Assays wurden in der Literatur im Rahmen der Entwicklung oder Erforschung anderer Impfstoffe beschrieben und können für Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 beispielsweise in Messungen der biologischen Aktivität oder Potenz angepasst werden. Batch-Release-Assays sollten vorzugsweise in vitro durchgeführt werden. Dies ist nicht nur für die Einhaltung der 3R-Prinzipien geeignet, sondern auch aus praktischen Erwägungen vorzuziehen, einschließlich Zeitersparnis und Verringerung der mit Tierversuchen verbundenen Nichtreproduzierbarkeit, die oft zu kostspieligen und unnötigen Ablehnungen von Chargen guter Qualität führt. Reagenzien für immunchemische und biochemische In-vitro-Assays, darunter der mAb CR3022, RBD des S-Proteins und humanes ACE2, werden jetzt in Zusammenarbeit mit PATH und NIBSC geeigneten Entwicklern zur Verfügung gestellt. Robuste und schnellere Assays für CQA werden den Technologietransfer zwischen den Produktionsstandorten beschleunigen, der für viele COVID-19-Projekte erforderlich ist, um den großen Versorgungsbedarf aller Bevölkerungsgruppen der Welt zu decken. Ein gut durchdachter CMC-Plan wird auch behördliche Überprüfungen und Genehmigungen erleichtern. Darüber hinaus ermöglichen ausgewählte CQA-basierte bioanalytische Bewertungsmethoden, die in diesem Review teilweise beschrieben werden, den Vergleich der Qualitätskonsistenz zwischen Impfstoffchargen, die in verschiedenen klinischen Phasen verwendet werden, und bilden eine wertvolle Brücke, die sich auf kommerzielle Produkte ausdehnt.


6. Präklinische und klinische Anwendungen von LNPs als Abgabesysteme für RNA-basierte Impfstoffe

Die Anwendung von LNPs als Abgabesysteme für RNA-basierte Impfstoffe ist vorteilhaft, um das volle Potenzial des Impfstoffs auszuschöpfen, da diese Systeme dazu dienen, das große verkapselte Nukleinsäuremolekül vor Nukleaseabbau zu schützen [1,121]. Als Abgabesysteme passieren LNPs die Zellmembran zur zellulären Aufnahme (durch Endozytose) und geben ihre eingeschlossene mRNA erst nach endosomalem Entweichen in das Zytosol ab. LNPs können auch die angeborene Immunantwort beeinflussen und den mRNA-Impfstoffen synergistische adjuvante Wirkungen verleihen [2].

Die verschiedenen Anwendungsrollen von RNA sowohl für präventive als auch für therapeutische Zwecke haben zu unterschiedlichen Anwendungen von RNA-basierten Impfstoffen sowohl gegen infektiöse Pathogene als auch gegen Krebs geführt. Viele Forschungsstudien, die sich auf LNPs als Abgabesysteme für selbstamplifizierende mRNA und konventionelle mRNA gegen verschiedene Infektionskrankheiten konzentriert haben, haben eine robuste und schnelle Immunstimulation bei verschiedenen Tierarten gezeigt [9,27,29,30,122,123,124]. Beispiele für mRNA-Impfstoffe in verschiedenen Lipid-basierten Formulierungen, die für präklinische Studien gegen Infektionskrankheiten und Krebs entwickelt wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Darüber hinaus wurden verschiedene mRNA-Impfstoffformulierungen, die zum Schutz vor Infektionskrankheiten entwickelt wurden, in klinische Studien aufgenommen, um ihre Wirksamkeit zu bewerten. Tabelle 2 fasst den Status dieser klinischen Studien zusammen. Die klinische Studie von Bahl et al. [27] und gesponsert von Moderna Therapeutics gilt als die erste Humanstudie ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03076385","term_id":"NCT03076385">> NCT03076385 ), das einen LNP-formulierten mRNA-Impfstoff verwendet, der für das HA-Antigen der Influenza H10N8 kodiert. Diese Studie ergab, dass alle 31 Teilnehmer nach zwei intramuskulären Immunisierungen (mit 100 µ g des Impfstoffs) im Abstand von 3 Wochen im Abstand von 3 Wochen spezifische Antikörpertiter von � gegen das HA-Antigen der Influenza H10N8 entwickelten, was auf eine gute Immunogenität des Impfstoffs hinweist. Darüber hinaus zeigte die Studie, dass im Serum von 87% der geimpften Teilnehmer nach 43 Tagen Impfung Virus-neutralisierende Antikörper-Titer von � vorhanden waren. Die Ergebnisse aus Humanstudien wurden trotz niedriger Titerwerte im Vergleich zu denen aus Tiermodellen als zufriedenstellend angesehen [27]. Ähnliche Ergebnisse wurden von der Gruppe von Feldman et al. [125]. Die Arbeit dieser Autoren zeigte, dass LNP-formulierte mRNA-Impfstoffe, die Volllängen-HA der Influenzastämme H10N8 und H7N9 kodieren, sicher waren und bei gesunden Erwachsenen nach intramuskulärer Impfung mit zwei Dosen im Abstand von 3 Wochen im Abstand von 100 und 25 . robuste humorale Immunantworten hervorrufen konnten µg Dosisstufen [125]. Die Autoren berichteten auch, dass die Sicherheits- und Reaktogenitätsprofile beider Impfstoffe, die in Dosen von bis zu 100 µg verwendet wurden, mit denen vergleichbar waren, die für zugelassene Impfstoffe mit oder ohne Adjuvantien erhalten wurden [125].

Tabelle 2

mRNA-Impfstoffe, die in klinische Studien gegen Infektionskrankheiten und Krebs eingetreten sind.

Sponsoring-HerstellermRNA-ImpfstoffLiefersystemZielTestnummerBühneStatusReferenz
Infektionskrankheiten
Moderna Therapeutics/Nationales Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (NIAID)mRNA-1273 (perfusionsstabilisierter S-Protein-mRNA-Impfstoff)LNPCOVID-19 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04470427","term_id":"NCT04470427">> NCT04470427Phase IIIAktiv, nicht rekrutierend[126]
BioNTech / Pfizer BNT162
(3 LNP–mRNA-Impfstoffe)
LNPCOVID-19 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04537949","term_id":"NCT04537949">> NCT04537949Phase IIIRekrutierung[126]
CureVacCV7202 (sequenzoptimiert)LNPTollwut <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03713086","term_id":"NCT03713086">> NCT03713086Phase IAktiv, nicht rekrutierend, PCD: Januar 2022[127]
Moderna TherapeuticsmRNA-1440 (Nukleosid-modifiziert)LNPGrippe H10N8 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03076385","term_id":"NCT03076385">> NCT03076385Phase IAbgeschlossene PCD: Oktober 2018[27,125]
Moderna TherapeuticsmRNA-1851 (Nukleosid-modifiziert)LNPGrippe H7N9 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03345043","term_id":"NCT03345043">> NCT03345043Phase IAktiv, nicht rekrutierend, PCD: Februar 2020[27,125]
Moderna TherapeuticsmRNA-1653 (Nukleosid-modifiziert)LNPHMPV/HPIV3 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03392389","term_id":"NCT03392389">> NCT03392389Phase IAbgeschlossen, PCD: Juli 2019[2]
Moderna TherapeuticsmRNA-1325 (Nukleosid-modifiziert)LNPZika <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03014089","term_id":"NCT03014089">> NCT03014089Phase IAbgeschlossen, PCD: Juli 2019[123]
Moderna TherapeuticsmRNA-1893 Zika <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04064905","term_id":"NCT04064905">> NCT04064905Phase IAktiv, nicht rekrutierend, PCD: Februar 2021[123]
Moderna TherapeuticsmRNA-1647 und mRNA-1443 (Nukleosid-modifiziert)LNPHCMV
<"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03382405","term_id":"NCT03382405">> NCT03382405Phase IAktiv, nicht rekrutierend, PCD: Juli 2020[2]
Moderna TherapeuticsmRNA-1388 (Nukleosid-modifiziert)LNPChikungunya <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03325075","term_id":"NCT03325075">> NCT03325075Phase IAbgeschlossen, PCD: November 2019[2]
Krebsimmuntherapie
BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbHmRNA-Lipoplex (Lipo–MERIT)LiposomenTAAs (fortgeschrittenes Melanom) <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02410733","term_id":"NCT02410733">> NCT02410733Phase IAktiv, nicht rekrutierend[128]
BioNTech AGmRNA-Lipoplex (TNBC–MERIT)LiposomenTAAs (dreifach negativer Brustkrebs) <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02316457","term_id":"NCT02316457">> NCT02316457Phase IAktiv, nicht rekrutierend[129]

HCMV, humanes Cytomegalovirus hMPV, humanes Metapneumovirus HPIV3, humanes Parainfluenzavirus Typ 3 LNP, Lipid-Nanopartikel-PCD, geschätzter primärer Abschlusstermin TAAs, tumorassoziierte Antigene.

6.1. RNA/LNP-Impfstoffe gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)-Infektion

Heutzutage sind RNA-basierte Impfstoffe zu einer der effektivsten Impfstofftechnologien geworden, die zum Schutz vor der Pandemie durch das Coronavirus (COVID-19) entwickelt wurden, die im Dezember 2019 aufgrund einer Infektion mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV- 2) [122].

Verschiedene präklinische Studien [130,131,132,133,134] wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit und Immunogenität von Impfstoffen basierend auf LNP–mRNA, die für das SARS-CoV-2-Spike-Protein oder die Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne kodiert, zu bewerten. Zum Beispiel produzierte die Immunisierung von Mäusen mit selbstamplifizierender RNA, die das Virus-Spike-Protein kodiert, das in der LNP-Formulierung eingekapselt ist, deutlich hohe SARS-CoV-2-spezifische Antikörper und induzierte eine robuste zelluläre Immunantwort im Vergleich zum elektroporierten pDNA-Impfstoff. Diese Beobachtungen wurden der Natur der verwendeten LNP-Formulierung zugeschrieben [132].

Eine weitere präklinische Studie untersuchte die Immunogenität von Nukleosid-modifizierter mRNA, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein in voller Länge oder die Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne in Mäusen kodiert. Es wurde beobachtet, dass die beiden Impfstoffe nach einer Einzeldosis neben starken Antikörperreaktionen auch starke T- und B-Zell-Antworten induzierten [130]. Darüber hinaus wurde von Moderna Therapeutics, Cambridge, MA, USA, ein mRNA-Impfstoff (mRNA-1273), der das Spike-Protein von SARS-CoV-2 in der LNP-Formulierung codiert, entwickelt. Die Immunisierung von nicht-menschlichen Primaten mit diesem Impfstoff führte zu einer hohen neutralisierenden Aktivität und bemerkenswert erhöhten S-Protein-spezifischen Antikörpern [135].

Die Ergebnisse aus präklinischen Studien zu in LNPs formulierten mRNA-Impfstoffen waren vielversprechend für die Bereitstellung einer Impfstofflösung für COVID-19 und ermöglichten den Transfer von RNA-basierten Impfstoffen in klinische Studien. Moderna mRNA-1273 gilt als der erste Impfstoff, der in klinische Studien der Phase I aufgenommen wurde (ClinicalTrials.gov-Kennung <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04283461","term_id": "NCT04283461">> NCT04283461) nur 42 Tage nach Identifizierung der genetischen Sequenz von SARS-CoV-2 [122]. Das Herstellerunternehmen gab kürzlich bekannt, dass dieser Impfstoff auf Grundlage der ersten Zwischenanalyse der klinischen Phase-III-Studien (ClinicalTrials.gov-Kennung <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04470427 .) zu 94 % wirksam ist ","term_id":"NCT04470427">> NCT04470427) [136].

Verschiedene Institutionen und Pharmahersteller nutzen verschiedene LNPs als Plattformtechnologien, um RNA-basierte Impfstoffe gegen COVID-19 zu entwickeln. Der von BioNTech (Mainz, Deutschland) in Zusammenarbeit mit Pfizer (New York, NY, USA) entwickelte mRNA-Impfstoff (BNT162) wurde beispielsweise so konzipiert, dass er vier verschiedene mRNA-Formate umfasst, die auf Antigene des S-Proteins und der Rezeptorbindungsdomäne abzielen und als LNP-Formulierung formuliert [122,137,138]. Am 9. November 2020 berichteten BioNTech (Mainz, Deutschland) und Pfizer (New York, NY, USA), dass der Impfstoff BNT162 gemäß der ersten vorläufigen Wirksamkeitsanalyse der klinischen Phase III zu mehr als 90 % gegen COVID-19 wirksam war Studien (ClinicalTrials.gov Identifier: <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04368728","term_id":"NCT04368728">> NCT04368728) [139].

Insgesamt kann die Verwendung von LNPs zur Formulierung von mRNA-basierten Impfstoffen als vielversprechender Ansatz zur Impfung gegen SARS-CoV-2 angesehen werden. Diese Formulierungen auf Lipidbasis können schnell hergestellt werden und beschleunigen somit die Impfstoffentwicklung. Verschiedene in LNPs formulierte mRNA-basierte Impfstoffe gegen COVID-19 haben sich in verschiedenen klinischen Studien als sicher und immunogen erwiesen. Die aus Tierstudien gewonnenen Daten zeigten, dass LNP–mRNA-Impfstoffe eine starke neutralisierende Antikörperantwort induzierten und einen hohen Schutz gegen SARS-CoV-2 boten.

6.2. RNA/LNP-Impfstoffe gegen Influenzavirus-Infektion

Auf mRNA basierende Influenza-Impfstoffe gehören zu den am umfassendsten untersuchten mRNA-Impfstoffen, da ihre Wirksamkeit bei kleinen Tieren leicht zu bewerten ist und zusätzlich die Möglichkeit, induzierte T- und B-Zell-Antworten zu messen. Es wurde berichtet, dass ein selbstamplifizierender mRNA-Impfstoff innerhalb kurzer Zeit hergestellt werden kann, sobald die genetische Sequenz, die das Influenza-Hämagglutinin (HA)-Antigen kodiert, identifiziert ist [4]. Darauf aufbauend wurde innerhalb von 8 Tagen nach Identifizierung der Gensequenz des HA-Antigens ein selbstamplifizierender mRNA-Impfstoff gegen einen Stamm der H7N9-Influenza in China hergestellt (in LNPs verkapselt) und bei Mäusen als immunogen nachgewiesen [4].

Lindgrenet al. [28] entwickelten auch einen modifizierten, nicht replizierenden mRNA-Impfstoff, der für HA eines pandemischen H10N8-Influenza-Stamms in einer LNP-Formulierung kodiert. Die intramuskuläre und intradermale Immunisierung von Rhesusaffen mit diesem Impfstoff führte nach jeder Impfung zu einer Ausweitung der B-Zell-Antworten zusammen mit der Bildung von Keimzentren (GCs) in drainierenden Lymphknoten. Darüber hinaus wurde ein Anstieg der H10-spezifischen follikulären T-Helferzellen beobachtet und mit hochaviden Antikörperreaktionen korreliert, die nach der saisonalen Influenza-Impfung beim Menschen auftreten, was auf eine Serokonversion hinweist [28].

Ein universeller Grippeimpfstoff wurde mit einer mRNA–LNP-Formulierung entwickelt, um eine starke Immunantwort gegen konservierte Epitope (chimäre und kopflose Hämagglutinin-Strukturen) verschiedener Virusstämme zu induzieren. Dieser universelle Grippeimpfstoff erzeugte Antikörper gegen die Stieldomäne von Hämagglutinin und zeigte einen guten Schutz von Tieren gegen eine Vielzahl von Influenzaviren [140]. Ein weiterer umfassend schützender Grippeimpfstoff wurde von Pardi et al. [29] in denen Nukleosid-modifizierte mRNA–LNPs verwendet wurden, die das Influenzavirus-HA in voller Länge exprimieren. Eine einzelne Immunisierung mit dem formulierten Impfstoff führte in verschiedenen Tiermodellen (Mäuse, Kaninchen und Frettchen) zu HA-Stiel-spezifischen Antikörperreaktionen und bot somit Schutz vor homologen, heterologen und heterosubtypischen Influenzavirus-Infektionen bei Mäusen.

Darüber hinaus wurden LNPs zur Abgabe eines modifizierten mRNA-Impfstoffs verwendet, der für die HA von H10N8- oder H7N9-Influenzastämmen kodiert [27]. Der formulierte Impfstoff erzeugte bei Mäusen, Frettchen und Cynomolgus-Affen robuste, schnelle und lang anhaltende Immunantworten.

6.3. RNA/LNP-Impfstoffe gegen Tollwutvirusinfektion

LNPs wurden verwendet, um mRNA-Impfstoffe gegen Tollwutvirusinfektion zu formulieren. Ein sequenzoptimierter, unmodifizierter mRNA-Impfstoff, der das Tollwutvirus-Glykoprotein (RABV-G) kodiert, wurde von Lutz et al. [9]. Eine einmalige Immunisierung von Cynomolgus-Affen mit diesem Impfstoff führte zur Induktion der Virusneutralisationstiter, die die von der Weltgesundheitsorganisation festgelegten Referenzwerte (0,5 IE/ml) überschritten, um mit dem Schutz beim Menschen zu korrelieren. Diese Titer waren dosisabhängig und wurden nach der zweiten Immunisierung der Tiere am 28. Tag noch um das 20-fache gesteigert. Die Autoren stellten fest, dass der Schutz gegen Tollwut während des Beobachtungszeitraums von 1 Jahr stabil blieb [9].

6.4. RNA/LNP-Impfstoffe gegen Zika-Virus-Infektion

Die Verwendung von mRNA/LNPs-Impfstoffen zum Schutz gegen das Zika-Virus wurde in der Literatur von verschiedenen Forschungsgruppen beschrieben [30, 31, 123]. Die Gruppe von Pardi et al. [30] haben gezeigt, dass einzelne intradermale Impfungen von Mäusen (30 µ g Dosis) oder Rhesusaffen (50 µ g Dosis) mit Nukleosid-modifiziertem mRNA/LNPs-Impfstoff, der das Prämembran- und Hüllglykoprotein (prM𠄾) von Das Zika-Virus führte in beiden Tiermodellen zu einer starken und anhaltenden schützenden Immunität mit Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen das Zika-Virus. Ähnliche Ergebnisse wurden von Richner et al. [123] nach intramuskulärer Impfung von Mäusen mit zwei 10 µg-Dosen eines modifizierten mRNA/LNPs-Impfstoffs, der für das prM𠄾-Glykoprotein des Zika-Virus kodiert. Weiterhin haben die Gruppen von Richner et al.[31,123] entwickelten einen mRNA/LNP-Impfstoff mit Mutationen, die das konservierte Fusionsschleifen-Epitop des E-Proteins zerstören. Es wurde festgestellt, dass dieser mutierte mRNA-Impfstoff sowohl in Zellkulturen als auch in Mäusen gegen eine Zika-Virus-Infektion schützt und die Produktion von Antikörpern verringert, die die Dengue-Virus-Infektion (die eng mit der Zika-Virus-Infektion verwandt ist) verstärken. Derselbe Impfstoff wurde auf seine Fähigkeit untersucht, den Fötus vor angeborenen Fehlbildungen zu schützen, die während der Schwangerschaft aufgrund der Übertragung des Zika-Virus auftreten können. Die Autoren berichteten, dass zwei Impfungen mit dem Impfstoff die trächtige Maus vor einer mütterlichen, plazentaren und fetalen Infektion durch das Zika-Virus schützten [31].

Darüber hinaus können auf mRNAs basierende Impfstoffe entworfen werden, um mehrere mRNAs zu liefern, die für verschiedene Antigene kodieren, um nach einer einzigen Immunisierung eine Immunität gegen mehrere Pathogene oder gegen verschiedene Antigene des gleichen infizierenden Pathogens zu erzeugen. Diese multivalenten mRNAs, die für verschiedene Antigene kodieren, sind besonders nützlich, um verschiedene Immunantworten zu stimulieren oder um auf Antigene abzuzielen, die in mehreren Lebenszyklen des infizierenden Pathogens exprimiert werden [2]. Die Arbeit von John et al. [32] beschrieben die Produktion von LNPs, die Nukleosid-modifizierte mRNAs verkapseln, die für die fünf verschiedenen Untereinheiten des pentameren Proteinkomplexes des humanen Cytomegalovirus (CMV) und Glykoprotein B (gB) kodieren. Der hergestellte Impfstoff wurde in vivo effizient verabreicht und führte nach intramuskulärer Immunisierung sowohl bei Mäusen als auch bei nicht-menschlichen Primaten zu wirksamen Immunantworten und weitgehend neutralisierenden Antikörpern. Die Autoren formulierten auch einen zusätzlichen LNP/mRNA-Impfstoff, der für das immundominante CMV-T-Zell-Antigen pp65 kodiert. Die Verabreichung dieses herkömmlichen Impfstoffs mit dem pentameren Protein und dem gB-Impfstoff führte zu multiantigenen oder breiten T-Zell-Antworten und beeinträchtigte nicht die Antikörperspiegel, die durch die Impfung von Mäusen mit dem multivalenten pentameren Protein produziert wurden [32]. Der mRNA-Impfstoff, der die pentameren Proteine ​​des humanen CMV exprimiert, befindet sich in der klinischen Bewertung und befindet sich derzeit in der klinischen Phase-I-Studie [2].

6.5. RNA/LNP-Impfstoffe gegen Krebs

Krebsimpfstoffe wirken entweder prophylaktisch (um Infektionen durch krebserregende Viren zu verhindern) oder therapeutisch (um bestehenden Krebs zu behandeln). Der erste therapeutische Krebsimpfstoff Sipuleucel-T (provenge) wurde 2010 zur Behandlung von Prostatakrebs zugelassen [141,142]. Der klinische Nutzen von Krebsimpfstoffen zur Verringerung des Wiederauftretens von Krebs und zur Verbesserung des Gesamtüberlebens der Patienten wurde in verschiedenen Studien nachgewiesen [141,143].

In Krebsimpfstoffen können verschiedene Antigene, wie tumorassoziierte Antigene (TAAs) und tumorspezifische Antigene (TSAs), kodiert werden. TAAs umfassen Proteine, die in Krebszellen überexprimiert werden, aber auch in normalen Zellen vorkommen. e TSAs werden nur in Tumorzellen exprimiert und stammen von onkogenen Proteinen von Viren oder von Proteinen, die durch Genmutationen oder Umlagerungen gebildet werden [23]. Darüber hinaus können Mutationen in Tumorzellen während der Progression und Karzinogenese zur Produktion von veränderten Proteinen führen, die als Neoantigene bezeichnet werden. Diese Arten von Proteinen können durch die Analyse genetischer Mutationen in einer einzelnen Krebszelle erkannt werden. Die Verwendung von Neoantigenen könnte die Herstellung personalisierter Neoepitop-Krebsvakzine ermöglichen, die bei der Verbesserung der Toleranz und der Begrenzung der normalen Gewebetoxizität sowie bei der Verbesserung der Antitumor-Immunantwort im Vergleich zu herkömmlichen Krebsimpfstoffen von Vorteil sein könnten [23,142]. Personalisierte RNA-Mutanom-Impfstoffe [144] und personalisierte Peptid-Impfstoffe [145] sind Beispiele für personalisierte Impfstoffe, die in klinischen Phase-I-Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt haben.

Die Sicherheit, Immunogenität und Verträglichkeit des ersten personalisierten IVAC-MUTANOMEs (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH), bei dem es sich um einen Poly-Neoepitop-kodierenden RNA-Impfstoff handelt, wurde in klinischen Phase-I-Studien untersucht (ClinicalTrials.gov-Kennung: <"Typ": "clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02035956","term_id":"NCT02035956">> NCT02035956), die auf mutierte Neoantigene zur Behandlung von Patienten mit Melanom abzielen. Es wurde eine starke Immunantwort gegen die Impfantigene beobachtet. Darüber hinaus wurde gegen 60 % der 125 ausgewählten Neoepitope eine T-Zell-Antwort ohne unerwünschte Arzneimittelwirkungen erzeugt, was auf eine gute Verträglichkeit des Impfstoffs durch die eingeschlossenen Patienten hinweist [146].

Die Möglichkeit, aus einer Tumorprobe RNA zu gewinnen, patientenspezifische Antigene herzustellen und anschließend einen personalisierten Impfstoff zu formulieren, zählt zu den Vorteilen von mRNA-Krebsimpfstoffen gegenüber anderen Impfstofftypen. Darüber hinaus können Signale, die durch die Toll-like-Rezeptoren TLR3, TLR7 und TLR8 bereitgestellt werden, die Adjuvanz von mRNA zur Verstärkung der Immunantwort widerspiegeln [23]. Darüber hinaus bergen mRNA-Impfstoffe kein Infektionsrisiko und ihre Herstellung ist schnell, skalierbar und kostengünstig [14.142.147].

mRNA-Impfstoffe stimulieren eine spezifische Immunantwort, wenn das kodierte Antigen in Proteine ​​im Zytosol von Antigen-präsentierenden Zellen oder APCs (entweder dendritische Zellen (DCs) oder Makrophagen) translatiert wird. Die exprimierten Proteine ​​werden CD8+-T-Zellen auf Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I präsentiert, wodurch die zelluläre Antwort stimuliert wird. Die Induktion einer unterstützenden CD4+-T-Helferzellantwort, die für die Krebsimmuntherapie entscheidend ist, kann durch Fusion des mRNA-kodierten Antigens mit MHC-Klasse-II-Verkehrssignalen, die von lysosomalen Proteinen stammen, erfolgen [23,147,148,149,150]. Daher können mRNA-Impfstoffe entwickelt werden, um krebsspezifische Antigene zu kodieren, um eine spezifische T-Zell-Immunantwort gegen Tumorzellen zu erzeugen [25].

Klinische Studien und die In-vivo-Verabreichung personalisierter mRNA-Krebsimpfstoffe verwenden sichere und biokompatible Nanopartikelsysteme wie Lipid-Nanopartikel und Liposomen, um die mRNA-Lieferung zu formulieren und zu optimieren [25,142]. Die Anwendung von nanopartikulären Systemen als Träger für mRNA-Krebsvakzine bietet Vorteile beim Schutz der mRNA vor dem Abbau zusätzlich zur Verstärkung der Antitumorantworten durch die Möglichkeit der gemeinsamen Abgabe des Impfstoffs mit einem Adjuvans und die Verwendung von Liganden, um dendritische Zellen zu bekämpfen Zellen. Darüber hinaus können nanopartikuläre Systeme die Möglichkeit bieten, die Freisetzung und Verteilung des Impfstoffs zu kontrollieren [44,142].

Personalisierte mRNA-Krebsimpfstoffe, die für verschiedene Antigene kodieren, wurden in Lipid-Nanosystemen formuliert und befinden sich bereits in klinischen Studien ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03897881","term_id":"NCT03897881 ">> NCT03897881, <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02316457","term_id":"NCT02316457">> NCT02316457, <"type":"clinical-trial" ,"attrs":<"text":"NCT03313778","term_id":"NCT03313778">> NCT03313778, <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03480152"," term_id":"NCT03480152">> NCT03480152, <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03323398","term_id":"NCT03323398">> NCT03323398) [23,25] . Die erfolgreiche Anwendung von LNPs zur Verkapselung personalisierter mRNA-Impfstoffe wurde für die Behandlung von Patienten mit Melanomen beschrieben [144]. Alle Patienten zeigten T-Zell-Antworten gegen die Neoepitope des Impfstoffs. Darüber hinaus wurden bei zwei Probanden nach Beginn der Impfung stark reduzierte Metastasenraten beobachtet, die zu einem verlängerten Überleben der Patienten führten [144].

Um eine starke zytotoxische CD8-T-Zellantwort zu induzieren, hat die Gruppe von Oberli et al. [44] entwickelten LNPs für den Transport eines mRNA-Impfstoffs, der für das immunologische Modellprotein Ovalbumin (OVA) kodiert. Die Autoren identifizierten eine optimale Formulierung, die ein ionisierbares Lipid (cKK-E12) und ein Additiv (Natriumlaurylsulfat) enthält. Die optimale Formulierung zeigte eine erhöhte T-Zell-Antwort, wenn das Molverhältnis von cKK-E12 von 35 % auf 10 % reduziert wurde. Die Immunisierung von Modellmäusen mit transgenem OVA-exprimierendem Tumor oder mit aggressivem B16F10-Melanom unter Verwendung des formulierten mRNA-Impfstoffs, der die entsprechenden Antigene codiert, führte zu einer starken Aktivierung der CD8-T-Zell-Immunität zusätzlich zu einem langsamen Tumorwachstum, einer Schrumpfung des Tumors und folglich zu einem verlängerten Überleben der behandelten Mäuse [44].

Eine Steigerung der LNP-Potenz durch Abgabe ihrer verkapselten mRNA kann durch Anheften verschiedener Einheiten an die Oberfläche von LNPs erreicht werden, um spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen anzusteuern. Alternativ kann die gleichzeitige Verabreichung von LNPs mit Adjuvanzien die Stimulation der Immunantwort verstärken [1,47,112]. Zum Beispiel reduzierte der Einbau von TLR4-Agonisten (Lipopolysaccharid LPS) in LNPs das Tumorwachstum und sorgte für ein längeres Überleben bei Mäusen mit B16F10-Melanom [44]. In ähnlicher Weise haben Verbeke et al. [112] zeigten, dass die gemeinsame Abgabe der Nukleosid-modifizierten mRNA mit TLR4-Agonisten (Monophosphoryl-Lipid A MPLA) innerhalb von DOTAP–-Cholesterin-mRNA-Lipoplexen die angeborene Immunität induzierte und eine hohe Antigenexpression in vivo ermöglichte. Darüber hinaus hat die Gruppe von Lee et al. [47] bauten das Lipopeptid Tripalmitoyl-S-glycerylcystein (Pam3), das ein TLR1- und TLR2-Agonist ist, als Adjuvans in LNPs ein, die OVA-mRNA einkapseln. Die Verwendung der Pam3–LNP-Formulierung zur intramuskulären Immunisierung von Mäusen führte zu einer hohen Expression von Tumorantigenen mit verstärkter zellulärer Immunstimulation [47].

Zusätzlich zu den Vorteilen von LNPs bei der Abgabe von mRNA-Krebsvakzinen können LNPs so gestaltet werden, dass sie mRNAs abgeben, die Zytokine kodieren, um die Immunantwort zu aktivieren und Tumorzellen abzutöten, ohne dass gesunde Zellen toxisch oder Nebenwirkungen haben [25]. Die Effizienz von mRNA–LNPs, die für Interleukin-12 (IL-12) kodieren, ein Beispiel für Zytokine mit Antikrebsaktivität, wurde von der Gruppe von Lai et al. [151] zur Unterdrückung des Tumorwachstums in transgenen Mausmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC). Die systemische Verabreichung der formulierten mRNA–LNPs führte nicht zu einer Toxizität von gesundem Gewebe, reduzierte jedoch das Wachstum des Lebertumors und verlängerte das Überleben der behandelten Mäuse [151].

Eine weitere Strategie zur Erhöhung der Spezifität therapeutischer mRNAs wurde von der Gruppe von Jain et al. [45]. Die Autoren untersuchten die Möglichkeit, therapeutische mRNAs zu verwenden, um erkrankte oder krebsartige Zellen zu programmieren, um ein toxisches Protein zu synthetisieren, das die Selbstzerstörung dieser Zellen verursacht, ohne gesunde Zellen zu schädigen. Zu diesem Zweck wurden microRNA (miRNA) Zielstellen in modifizierte mRNAs eingebaut, die für toxische oder apoptotische Proteine ​​wie Caspase oder PUMA (p53 hochregulierter Modulator der Apoptose) kodieren. Das Vorhandensein von miRNA-Bindungsstellen ermöglicht das Targeting von miRNAs, die nur in gesunden Zellen vorhanden sind, und ermöglicht diesen Zellen dann, die toxische mRNA zu erkennen und abzubauen. Es wurde festgestellt, dass die intratumorale Verabreichung von LNPs, die mit diesen kombinierten miRNA–mRNA-Sequenzen beladen waren, bei Mäusen die Expression toxischer Proteine ​​aus der mRNA gesunder Zellen verhinderte, aber in Tumorzellen selektiv Apoptose auslöste, ohne systemische Toxizität zu verursachen [45].


Die mRNA-Technologie gab uns die ersten COVID-19-Impfstoffe. Es könnte auch die Arzneimittelindustrie auf den Kopf stellen

Ich hatte ihr in die Augen gestarrt, wie sie es befohlen hatte, aber als ein Arzt auf meiner anderen Seite anfing, mich mit einer Nadel zu stechen, drehte ich meinen Kopf. “Schau es dir nicht an,” sagte der erste Arzt. Ich gehorchte.

Das war Anfang August in New Orleans, wo ich mich als Teilnehmer an der klinischen Studie für den Pfizer-BioNTech COVID-19-Impfstoff angemeldet hatte. Es war eine Blindstudie, was bedeutete, dass ich nicht wissen sollte, ob ich das Placebo oder den echten Impfstoff bekommen hatte. Ich fragte den Arzt, ob ich das wirklich anhand der Spritze erkennen könnte. “Wahrscheinlich nicht,”, antwortete sie, “aber wir wollen vorsichtig sein. Dies ist sehr wichtig, um es richtig zu machen.”

Ich wurde zu einem Versuchskaninchen, weil ich nicht nur nützlich sein wollte, sondern auch ein tiefes Interesse an den wundersamen neuen Rollen hatte, die jetzt die RNA spielt, das genetische Material, das das Herzstück neuer Arten von Impfstoffen, Krebsbehandlungen und Genen bildet -Bearbeitungstools. Ich schrieb ein Buch über die Berkeley-Biochemikerin Jennifer Doudna. Sie war eine Pionierin bei der Bestimmung der Struktur der RNA, was ihr und ihrem Doktorvater half, herauszufinden, wie es der Ursprung allen Lebens auf diesem Planeten sein könnte. Dann erfanden sie und ein Kollege ein RNA-gesteuertes Gen-Editing-Tool, das ihnen 2020 den Nobelpreis für Chemie einbrachte.

Das Tool basiert auf einem System, mit dem Bakterien Viren bekämpfen. Bakterien entwickeln in ihrer DNA geclusterte sich wiederholende Sequenzen, sogenannte CRISPRs, die sich an gefährliche Viren erinnern und dann eine RNA-gesteuerte Schere einsetzen, um sie zu zerstören. Mit anderen Worten, es ist ein Immunsystem, das sich anpassen kann, um jede neue Welle von Viren zu bekämpfen, genau das, was wir Menschen brauchen. Jetzt, da der kürzlich zugelassene Pfizer-BioNTech-Impfstoff und ein ähnlicher Impfstoff von Moderna langsam in den USA und Europa eingeführt werden, wurde RNA eingesetzt, um eine völlig neue Art von Impfstoff herzustellen, der, wenn er genügend Menschen erreicht, den Kurs ändern wird der Pandemie.

Bis zum letzten Jahr hatten sich die Impfstoffe über mehr als zwei Jahrhunderte zumindest konzeptionell nicht sehr verändert. Die meisten wurden nach der Entdeckung des englischen Arztes Edward Jenner aus dem Jahr 1796 modelliert, der feststellte, dass viele Milchmädchen gegen Pocken immun waren. Sie waren alle mit einer Form von Pocken infiziert, die Kühe befällt, aber für den Menschen relativ harmlos ist, und Jenner vermutete, dass sie durch die Kuhpocken immun gegen Pocken waren. Also nahm er etwas Eiter aus einer Kuhpockenblase, rieb es in die Kratzer, die er im Arm seines 8-jährigen Sohnes seines Gärtners gemacht hatte, und setzte das Kind dann (das war in den Tagen vor den Bioethik-Panels) den Pocken aus. Er wurde nicht krank.

Zuvor wurden Impfungen durchgeführt, indem den Patienten eine kleine Dosis des eigentlichen Pockenvirus verabreicht wurde, in der Hoffnung, dass sie einen leichten Fall bekommen und dann immun sind. Jenners großer Fortschritt bestand darin, einen verwandten, aber relativ harmlosen Virus zu verwenden. Seitdem basieren Impfungen auf der Idee, einen Patienten einem sicheren Faksimile eines gefährlichen Virus oder anderen Keims auszusetzen. Dies soll das adaptive Immunsystem der Person in Gang setzen. Wenn es funktioniert, produziert der Körper Antikörper, die manchmal viele Jahre lang jede Infektion abwehren, wenn der eigentliche Keim angreift.

Ein Ansatz besteht darin, eine sicher abgeschwächte Version des Virus zu injizieren. Das können gute Lehrer sein, weil sie der Realität sehr ähnlich sehen. Der Körper reagiert, indem er Antikörper bildet, um sie zu bekämpfen, und die Immunität kann ein Leben lang halten. Albert Sabin hat diesen Ansatz in den 1950er Jahren für den oralen Polioimpfstoff verwendet, und so wehren wir heute Masern, Mumps, Röteln und Windpocken ab.

Während Sabin versuchte, einen Impfstoff auf Basis eines abgeschwächten Polio-Virus zu entwickeln, gelang Jonas Salk ein sicherer Ansatz: mit einem abgetöteten oder inaktivierten Virus. Diese Art von Impfstoff kann dem Immunsystem einer Person immer noch beibringen, wie man das lebende Virus abwehrt, verursacht jedoch weniger wahrscheinlich schwerwiegende Nebenwirkungen. Zwei chinesische Unternehmen, Sinopharm und Sinovac, haben diesen Ansatz genutzt, um Impfstoffe gegen COVID-19 zu entwickeln, die derzeit in China, den Vereinigten Arabischen Emiraten und Indonesien nur begrenzt eingesetzt werden.

Ein anderer traditioneller Ansatz besteht darin, eine Untereinheit des Virus zu injizieren, beispielsweise eines der Proteine, die sich auf der Hülle des Virus befinden. Das Immunsystem wird sich dann an diese erinnern und dem Körper ermöglichen, eine schnelle und robuste Reaktion aufzubauen, wenn er auf das eigentliche Virus stößt. So funktioniert beispielsweise der Impfstoff gegen das Hepatitis-B-Virus. Die Verwendung nur eines Fragments des Virus bedeutet, dass sie einem Patienten sicherer injiziert und leichter hergestellt werden können, aber sie sind oft nicht so gut in der Herstellung einer langfristigen Immunität. Das in Maryland ansässige Biotech Novavax befindet sich in der späten Phase der klinischen Studien für einen COVID-19-Impfstoff mit diesem Ansatz und ist die Grundlage für einen der beiden Impfstoffe, die bereits in Russland eingeführt werden.

Das Pestjahr 2020 wird als die Zeit in Erinnerung bleiben, in der diese traditionellen Impfstoffe durch etwas grundlegend Neues ersetzt wurden: genetische Impfstoffe, die ein Gen oder einen genetischen Code in menschliche Zellen einschleusen. Die genetischen Anweisungen veranlassen die Zellen dann, selbstständig sichere Bestandteile des Zielvirus zu produzieren, um das Immunsystem des Patienten zu stimulieren.

Für SARS-CoV-2 – das Virus, das COVID-19 verursacht – ist die Zielkomponente sein Spike-Protein, das die äußere Hülle des Virus besetzt und es ihm ermöglicht, menschliche Zellen zu infiltrieren. Eine Methode hierfür besteht darin, das gewünschte Gen unter Verwendung einer als rekombinante DNA bekannten Technik in ein harmloses Virus einzufügen, das das Gen in menschliche Zellen einschleusen kann. Um einen COVID-Impfstoff herzustellen, wird ein Gen, das Anweisungen zum Aufbau eines Teils eines Coronavirus-Spike-Proteins enthält, in die DNA eines geschwächten Virus wie eines Adenovirus eingearbeitet, das eine Erkältung verursachen kann. Die Idee ist, dass sich das neu konstruierte Adenovirus in menschliche Zellen einschleichen wird, wo das neue Gen die Zellen dazu bringt, viele dieser Spike-Proteine ​​​​zu produzieren. Infolgedessen wird das Immunsystem der Person darauf vorbereitet, schnell zu reagieren, wenn das echte Coronavirus zuschlägt.

Dieser Ansatz führte zu einem der frühesten COVID-Impfstoffkandidaten, der am treffend benannten Jenner Institute der University of Oxford entwickelt wurde. Wissenschaftler dort haben das Spike-Protein-Gen zu einem Adenovirus entwickelt, das bei Schimpansen die Erkältung verursacht, beim Menschen jedoch relativ harmlos ist.

Die leitende Forscherin in Oxford ist Sarah Gilbert. Sie arbeitete an der Entwicklung eines Impfstoffs gegen das Atemwegssyndrom im Nahen Osten (MERS) unter Verwendung des gleichen Schimpansen-Adenovirus. Diese Epidemie ging zurück, bevor ihr Impfstoff eingesetzt werden konnte, aber es gab ihr einen Vorsprung, als COVID-19 zuschlug. Sie wusste bereits, dass das Schimpansen-Adenovirus erfolgreich das Gen für das Spike-Protein von MERS in den Menschen eingebracht hatte. Sobald die Chinesen im Januar 2020 die genetische Sequenz des neuen Coronavirus veröffentlichten, begann sie, sein Spike-Protein-Gen in das Schimpansenvirus einzubauen, und wachte jeden Tag um 4 Uhr morgens auf.

Ihre 21-jährigen Drillinge, die alle Biochemie studierten, meldeten sich freiwillig als Frühtester, bekamen den Impfstoff und sahen, ob sie die gewünschten Antikörper entwickelten. (Das taten sie.) Versuche mit Affen, die im März in einem Primatenzentrum in Montana durchgeführt wurden, brachten ebenfalls vielversprechende Ergebnisse.

Bill Gates, dessen Stiftung einen Großteil der Finanzierung bereitstellte, drängte Oxford, sich mit einem großen Unternehmen zusammenzuschließen, das den Impfstoff testen, herstellen und vertreiben könnte. So schmiedete Oxford eine Partnerschaft mit AstraZeneca, dem britisch-schwedischen Pharmaunternehmen. Leider erwiesen sich die klinischen Studien als schlampig, da einigen Teilnehmern die falschen Dosen verabreicht wurden, was zu Verzögerungen führte. Großbritannien hat es Ende Dezember für den Notfall zugelassen, und die USA werden dies wahrscheinlich in den nächsten zwei Monaten tun.

Johnson & Johnson testet einen ähnlichen Impfstoff, bei dem ein menschliches Adenovirus anstelle eines Schimpansen-Virus als Transportmechanismus verwendet wird, um ein Gen zu tragen, das für die Herstellung eines Teils des Spike-Proteins kodiert. Diese Methode hat sich in der Vergangenheit als vielversprechend erwiesen, könnte jedoch den Nachteil haben, dass Menschen, die bereits diesem Adenovirus ausgesetzt waren, möglicherweise eine gewisse Immunität dagegen haben. Ergebnisse der klinischen Studie werden noch in diesem Monat erwartet.

Darüber hinaus sind zwei weitere Impfstoffe auf der Grundlage gentechnisch veränderter Adenoviren jetzt in begrenztem Umfang erhältlich: einer von CanSino Biologics, der in China beim Militär eingesetzt wird, und ein anderer namens Sputnik V vom russischen Gesundheitsministerium.

Es gibt eine andere Möglichkeit, genetisches Material in eine menschliche Zelle zu bringen und sie dazu zu bringen, die Bestandteile eines gefährlichen Virus, wie die Spike-Proteine, zu produzieren, die das Immunsystem stimulieren können. Anstatt das Gen für die Komponente in ein Adenovirus zu manipulieren, können Sie dem Menschen einfach den genetischen Code für die Komponente als DNA oder RNA injizieren.

Beginnen wir mit DNA-Impfstoffen. Forscher von Inovio Pharmaceuticals und einer Handvoll anderer Unternehmen haben im Jahr 2020 einen kleinen DNA-Kreis erstellt, der für Teile des Coronavirus-Spike-Proteins kodiert. Die Idee war, dass die DNA, wenn sie in den Kern einer Zelle gelangen könnte, sehr effizient Anweisungen für die Produktion der Spike-Protein-Teile produzieren könnte, die dazu dienen, das Immunsystem zu trainieren, auf die Realität zu reagieren.

Die große Herausforderung für einen DNA-Impfstoff ist die Lieferung. Wie kann man den kleinen DNA-Ring nicht nur in eine menschliche Zelle, sondern auch in den Zellkern bringen? Das Injizieren einer großen Menge des DNA-Impfstoffs in den Arm eines Patienten führt dazu, dass ein Teil der DNA in die Zellen gelangt, aber dies ist nicht sehr effizient.

Einige der Entwickler von DNA-Impfstoffen, darunter Inovio, versuchten, die Abgabe in menschliche Zellen durch eine Methode namens Elektroporation zu erleichtern, bei der dem Patienten an der Injektionsstelle Elektroschockimpulse verabreicht werden. Das öffnet Poren in den Zellmembranen und lässt die DNA eindringen. Die elektrischen Impulskanonen haben viele winzige Nadeln und sind nervtötend anzusehen. Es ist nicht schwer zu verstehen, warum diese Technik unpopulär ist, insbesondere bei denen auf der Empfängerseite. Bisher wurde kein einfacher und zuverlässiger Abgabemechanismus entwickelt, um DNA-Impfstoffe in den Zellkern menschlicher Zellen zu bringen.

Das führt uns zu dem Molekül, das sich im COVID-Impfstoffrennen als siegreich erwiesen hat und den Titel des TIME-Magazins Molecule of the Year verdient: RNA. Seine Geschwister-DNA ist berühmter. Aber wie viele berühmte Geschwister leistet DNA nicht viel Arbeit. Es bleibt hauptsächlich im Kern unserer Zellen gebunkert und schützt die darin kodierten Informationen. RNA hingegen geht tatsächlich raus und erledigt die Dinge. Die von unserer DNA kodierten Gene werden in RNA-Schnipsel transkribiert, die aus dem Kern unserer Zellen in die Proteinherstellungsregion vordringen. Dort überwacht diese Boten-RNA (mRNA) den Zusammenbau des angegebenen Proteins. Mit anderen Worten, anstatt nur zu Hause zu sitzen und Informationen zu kuratieren, werden echte Produkte hergestellt.

Wissenschaftler wie Sydney Brenner in Cambridge und James Watson in Harvard identifizierten und isolierten erstmals mRNA-Moleküle im Jahr 1961. Es war jedoch schwierig, sie für unsere Zwecke zu nutzen, da das Immunsystem des Körpers oft die mRNA zerstörte, die die Forscher konstruierten und einzuführen versuchten in den Körper. Im Jahr 2005 zeigten dann Katalin Kariko und Drew Weissman von der University of Pennsylvania, wie man ein synthetisches mRNA-Molekül so optimieren kann, dass es in menschliche Zellen gelangen kann, ohne vom körpereigenen Immunsystem angegriffen zu werden.

Als die COVID-19-Pandemie vor einem Jahr ausbrach, beschlossen zwei innovative junge Pharmaunternehmen, diese Rolle der Messenger-RNA zu nutzen: das deutsche Unternehmen BioNTech, das eine Partnerschaft mit dem US-Unternehmen Pfizer und Moderna mit Sitz in Cambridge, Massachusetts, eingegangen ist Ihre Mission war es, Boten-RNA zu entwickeln, die die Codebuchstaben trägt, um einen Teil des Coronavirus-Spike-Proteins zu bilden, das CCUCGGCGGGCA … &mdasha beginnt, um es in menschlichen Zellen einzusetzen.

BioNTech wurde 2008 von dem Ehepaar Ugur Sahin und Ozlem Tureci gegründet, die sich Anfang der 90er Jahre während ihrer Ausbildung zum Arzt in Deutschland kennenlernten. Beide stammten aus türkischen Einwandererfamilien und teilten ihre Leidenschaft für die medizinische Forschung, so dass sie einen Teil ihres Hochzeitstages im Labor verbrachten. Sie gründeten BioNTech mit dem Ziel, Therapien zu entwickeln, die das Immunsystem stimulieren, um Krebszellen zu bekämpfen. Es wurde auch bald führend bei der Entwicklung von Medikamenten, die mRNA in Impfstoffen gegen Viren verwenden.

Im Januar 2020 las Sahin in der medizinischen Fachzeitschrift Lancet einen Artikel über ein neues Coronavirus in China. Nachdem er es beim Frühstück mit seiner Frau besprochen hatte, schickte er eine E-Mail an die anderen Mitglieder des BioNTech-Vorstands, in der er sagte, es sei falsch zu glauben, dass dieses Virus so leicht kommen und gehen würde wie MERS und SARS. "Diesmal ist es anders", sagte er ihnen.

BioNTech startete ein Crash-Projekt, um einen auf RNA-Sequenzen basierenden Impfstoff zu entwickeln, den Sahin innerhalb weniger Tage schreiben konnte, der dazu führen würde, dass menschliche Zellen Versionen des Spike-Proteins des Coronavirus herstellen. Als es vielversprechend aussah, rief Sahin Kathrin Jansen an, die Leiterin der Impfstoffforschung und -entwicklung bei Pfizer. Die beiden Unternehmen arbeiteten seit 2018 zusammen, um Grippeimpfstoffe mit mRNA-Technologie zu entwickeln, und er fragte sie, ob Pfizer eine ähnliche Partnerschaft für einen COVID-Impfstoff eingehen möchte. "Ich wollte dich gerade anrufen und dasselbe vorschlagen", antwortete Jansen. Der Deal wurde im März unterzeichnet.

Inzwischen wurde ein ähnlicher mRNA-Impfstoff von Moderna entwickelt, einem viel kleineren Unternehmen mit nur 800 Mitarbeitern. Ihr Vorsitzender und Mitbegründer, Noubar Afeyan, ein in Beirut geborene Armenier, der in die USA einwanderte, war 2010 von mRNA fasziniert worden, als er einen Vortrag einer Gruppe von Harvard- und MIT-Forschern hörte. Gemeinsam gründeten sie Moderna, das sich zunächst auf die Verwendung von mRNA konzentrierte, um personalisierte Krebsbehandlungen zu entwickeln, aber bald damit begann, mit der Technik zu experimentieren, um Impfstoffe gegen Viren herzustellen.

Im Januar 2020 nahm Afeyan eine seiner Töchter mit in ein Restaurant in der Nähe seines Büros in Cambridge, um ihren Geburtstag zu feiern. Mitten beim Essen bekam er eine dringende SMS vom CEO seiner Firma Stéphane Bancel in der Schweiz. Also eilte er bei eisigen Temperaturen nach draußen und vergaß, seinen Mantel zu schnappen, um ihn zurückzurufen.

Bancel sagte, er wolle ein Projekt zur Verwendung von mRNA starten, um einen Impfstoff gegen das neue Coronavirus zu versuchen. Zu diesem Zeitpunkt hatte Moderna mehr als 20 Medikamente in der Entwicklung, aber keines davon hatte die Endphase der klinischen Studien erreicht. Trotzdem autorisierte Afeyan ihn sofort, mit der Arbeit zu beginnen. "Mach dir keine Sorgen um den Vorstand", sagte er. “Einfach in Bewegung.” Da die Ressourcen von Pfizer fehlten, war Moderna auf die Finanzierung durch die US-Regierung angewiesen. Anthony Fauci, Leiter des Nationalen Instituts für Allergien und Infektionskrankheiten, unterstützte ihn. "Los geht's", erklärte er. “Was auch immer es kostet, machen Sie sich keine Sorgen.”

Bancel und sein Moderna-Team brauchten nur zwei Tage, um die RNA-Sequenzen zu erstellen, die das Spike-Protein produzieren würden, und 41 Tage später schickte es die erste Schachtel mit Fläschchen an die National Institutes of Health, um mit frühen Studien zu beginnen. Afeyan hat ein Bild dieser Kiste auf seinem Handy.

Ein mRNA-Impfstoff hat bestimmte Vorteile gegenüber einem DNA-Impfstoff, der ein neu konstruiertes Virus oder einen anderen Abgabemechanismus verwenden muss, um durch die Membran zu gelangen, die den Zellkern schützt. Die RNA muss nicht in den Zellkern gelangen. Es muss lediglich in den leichter zugänglichen äußeren Bereich der Zellen, das Zytoplasma, transportiert werden, wo Proteine ​​​​konstruiert werden.

Die Impfstoffe von Pfizer-BioNTech und Moderna tun dies, indem sie die mRNA in winzige ölige Kapseln einkapseln, die als Lipid-Nanopartikel bekannt sind. Moderna arbeitet seit 10 Jahren daran, seine Nanopartikel zu verbessern. Damit hatte es gegenüber Pfizer-BioNTech einen Vorteil: Seine Partikel waren stabiler und mussten nicht bei extrem niedrigen Temperaturen gelagert werden.

Bis November kamen die Ergebnisse der Spätphasenstudien von Pfizer-BioNTech und Moderna mit überzeugenden Ergebnissen zurück: Beide Impfstoffe waren zu mehr als 90 % wirksam. Ein paar Wochen später, als COVID-19 in weiten Teilen der Welt erneut auf dem Vormarsch war, erhielten sie eine Notfallgenehmigung von der US-amerikanischen Food and Drug Administration und wurden zur Vorhut der Biotech-Bemühungen, die Pandemie einzudämmen.

Die Fähigkeit, Boten-RNA zu codieren, um unseren Wünschen nachzukommen, wird die Medizin verändern. Wie bei den COVID-Impfstoffen können wir mRNA anweisen, unsere Zellen dazu zu bringen, Antigene und Moleküle herzustellen, die unser Immunsystem stimulieren und uns vor vielen Viren, Bakterien oder anderen Krankheitserregern schützen könnten, die Infektionskrankheiten verursachen. Darüber hinaus könnte mRNA künftig als Vorreiter von BioNTech und Moderna zur Krebsbekämpfung eingesetzt werden. Durch einen Prozess namens Immuntherapie kann die mRNA kodiert werden, um Moleküle zu produzieren, die das Immunsystem des Körpers veranlassen, Krebszellen zu identifizieren und abzutöten.

Wie Jennifer Doudna und andere entdeckten, kann RNA auch so konstruiert werden, dass sie auf Gene zur Bearbeitung abzielt. Mithilfe des von Bakterien adaptierten CRISPR-Systems kann RNA scherenartige Enzyme zu bestimmten DNA-Sequenzen führen, um ein Gen zu eliminieren oder zu bearbeiten. Diese Technik wurde bereits in Studien zur Heilung der Sichelzellenanämie eingesetzt. Jetzt kommt es auch im Krieg gegen COVID zum Einsatz. Doudna und andere haben RNA-gesteuerte Enzyme entwickelt, die SARS-CoV-2 direkt nachweisen können und schließlich verwendet werden könnten, um es zu zerstören.

Noch umstrittener könnte CRISPR verwendet werden, um “Designerbabys” mit vererbbaren genetischen Veränderungen zu erschaffen. Im Jahr 2018 verwendete ein junger chinesischer Arzt CRISPR, um Zwillingsmädchen so zu konstruieren, dass sie keinen Rezeptor für das AIDS-erregende Virus hatten. Es gab einen sofortigen Ausbruch von Ehrfurcht und dann Schock. Der Arzt wurde denunziert, und es gab Forderungen nach einem internationalen Moratorium für vererbbare Gen-Editierungen. Aber im Zuge der Pandemie könnte die RNA-gesteuerte genetische Bearbeitung, um unsere Spezies weniger empfänglich für Viren zu machen, eines Tages akzeptabler erscheinen.

Während der gesamten Menschheitsgeschichte waren wir einer Welle von Virus- und Bakterienseuchen ausgesetzt. Eine der frühesten bekannten war die Babylon-Grippe-Epidemie um 1200 v. Die Pest von Athen 429 v. tötete fast 100.000 Menschen, die Antonine-Pest im 2. Jahrhundert tötete 5 Millionen, die Pest von Justinian im 6. Jahrhundert tötete 50 Millionen und der Schwarze Tod des 14. Jahrhunderts forderte fast 200 Millionen Menschenleben, fast die Hälfte Europas Population.

Die COVID-19-Pandemie, bei der im Jahr 2020 mehr als 1,8 Millionen Menschen ums Leben kamen, wird nicht die letzte Plage sein. Dank der neuen RNA-Technologie wird unsere Abwehr gegen die meisten zukünftigen Plagen jedoch wahrscheinlich immens schneller und effektiver sein. Wenn neue Viren auftauchen oder das aktuelle Coronavirus mutiert, können Forscher die mRNA eines Impfstoffs schnell umcodieren, um die neuen Bedrohungen zu bekämpfen. “Es war ein schlechter Tag für Viren,”Der Vorsitzende von Moderna, Afeyan, sagt über den Sonntag, als er die ersten Ergebnisse der klinischen Studien seines Unternehmens erhielt. “Es gab eine plötzliche Verschiebung im evolutionären Gleichgewicht zwischen dem, was die menschliche Technologie tun kann, und dem, was Viren tun können. Wir werden vielleicht nie wieder eine Pandemie haben.”

Die Erfindung leicht umprogrammierbarer RNA-Impfstoffe war ein blitzschneller Triumph des menschlichen Einfallsreichtums, aber sie basierte auf jahrzehntelanger neugieriger Forschung zu einem der grundlegendsten Aspekte des Lebens auf dem Planeten Erde: wie Gene in RNA transkribiert werden, die Zellen erzählen welche Proteine ​​zusammengebaut werden. Ebenso entstand die CRISPR-Gen-Editing-Technologie aus dem Verständnis der Art und Weise, wie Bakterien RNA-Schnipsel verwenden, um Enzyme zu leiten, um Viren zu zerstören. Große Erfindungen entstehen aus dem Verständnis der Grundlagenwissenschaften. Die Natur ist so schön.

Isaacson, ein ehemaliger Herausgeber von TIME, ist der Autor von The Code Breaker: Jennifer Doudna, Gene Editing, and the Future of the Human Race, das im März veröffentlicht wird. Nach der Zulassung des Pfizer-Impfstoffs entschied er sich, in der klinischen Studie zu bleiben und wurde noch nicht „entblindet“.


Und hier kommt die Behauptung, dass COVID-19-Impfstoffe Krebs verursachen

Ich habe jedoch eine häufige Anti-Impfstoff-Behauptung vergessen. Es ist eine, die ich über den COVID-19-Impfstoff noch nicht gesehen hatte, obwohl es eine jahrzehntelange Behauptung über frühe Versionen des Polio-Impfstoffs ist, die in den späten 1950er und frühen 1960er Jahren verwendet wurden, nämlich dass Impfstoffe Krebs verursachen . (Es ist eine Behauptung, die sich verändert und metastasiert hat, um eine “chronische Entzündung” – die zu Krebs beitragen kann – durch Impfstoffe im Allgemeinen als Krebsursache hervorzurufen.) Sie erinnern sich an diese uralte Behauptung, nicht wahr? dass, weil frühe Versionen des Polio-Impfstoffs mit einem Virus (SV40) kontaminiert waren, die vor über 60 Jahren an Kinder verabreichten Polio-Impfstoffe für eine Krebswelle in den letzten zwei Jahrzehnten verantwortlich sind. Ich habe in meinem unnachahmlichen Detail diskutiert, wie diese Behauptung untersucht wurde und im Jahr 2013 festgestellt wurde, dass sie keine wissenschaftliche Grundlage hat. Jetzt wurde diese Behauptung für den COVID-19-Impfstoff umfunktioniert. Nein, Antivaxxer behaupten nicht, dass die COVID-19-Impfstoffe von Moderna, Pfizer/BioNTech oder Johnson & Johnson mit SV40 kontaminiert sind. Vielmehr konzentrieren sie ihre falsche Behauptung, dass COVID-19-Impfstoffe in den kommenden Jahrzehnten eine Krebswelle verursachen werden, auf das mRNA-basierte Design dieser Impfstoffe und eine Kirschenauswahlstudie des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center aus dem Jahr 2018 (um ihre Fehlinformationen die Patina der wissenschaftlichen Seriosität). Ich habe diese Behauptung (noch) nicht weit verbreitet gesehen, aber als ausgebildeter Molekularbiologe dachte ich, ich würde versuchen, sie im Keim zu ersticken, bevor sie zu stark wächst.

Fangen wir mit diesem Tweet an:

Grundsätzlich repliziert DNA von einer DNA-Matrize und führt zu einem doppelsträngigen Molekül, das sehr stabil ist, da es komplementäre Sequenzen aufweist, die sequenzspezifisch eng aneinander binden. Diese DNA-Matrize wird von Enzymen abgewickelt, die die Matrize verwenden, um einzelsträngige RNA-Stränge herzustellen, die dann von einem Ribosom verwendet werden, um Protein aus Aminosäuren herzustellen. Noch einmal, um es einfach auszudrücken, jedes Nukleotid entspricht einem Buchstaben des Codes, jede Drei-Nukleotid-Sequenz (Codon) entspricht einem “Wort”, das in eine Aminosäure übersetzt wird. Da es vier Nukleotide gibt, gibt es 64 mögliche Codons. Da es nur 20 Aminosäuren gibt, bedeutet dies, dass die meisten Aminosäuren von mehr als einer Kombination von Nukleotiden oder mehr als einem Codon kodiert werden, d. h. der genetische Code ist redundant. Natürlich ist es komplizierter, wie dieses Diagramm zeigt:

Nachdem der genetische Code vor 60 Jahren geknackt wurde, stellte sich schnell heraus, dass die RNAs, die für Proteine ​​kodieren, oft nicht direkt nach der Transkription vollständig gebildet sind. RNA beginnt oft als längere Vorläufer-RNA (eine Prä-mRNA), die an die endgültige mRNA-Sequenz gespleißt wird, bevor sie aus dem Kern in das Zytoplasma transportiert wird, um die Produktion von Protein im Zytoplasma anzutreiben. Kurz gesagt enthält die anfangs transkribierte Vorläufer-RNA Sequenzen, die als “Exons” und “Introns” bekannt sind. In Genen enthalten Exons die Nukleotidsequenzen, die das eigentliche Protein kodieren, während Introns Nukleotidsequenzen enthalten, die für nichts kodieren, aber wichtige Sequenzen haben können, die die Genproduktion und -aktivität regulieren. Hier eine Illustration des Spleißvorgangs aus Wikipedia:

Dieses Diagramm ist eigentlich ziemlich einfach, mit zwei Exons und einem Intron. Einige Gene haben viele Exons und Introns, die mehrere Spleiße erfordern, wie in diesem Diagramm:

Habe ich vergessen zu erwähnen, dass mRNAs auch so verarbeitet werden, dass sie an einem Ende ein “cap” und am anderen Ende einen As (einen Poly-A-Schwanz) haben? Der Poly-A-Schwanz ist sehr wichtig bei der Regulierung der mRNA-Stabilität und daher ihrer Halbwertszeit im Zytoplasma. Wie bei jedem biologischen Prozess können auch bei diesen Spleißvorgängen Dinge schief gehen. Mutationen an der Spleißstelle können beispielsweise zu falsch gespleißten mRNAs und Proteinen ohne Exons führen:

Ich könnte weiter und weiter und weiter machen. Es gibt normale Gene, die durch alternatives Spleißen mehr als ein Protein produzieren können:

Wenn das Spleißen manchmal schief geht, kann dies dazu führen, dass ein verkürztes Protein an einem Ende fehlt. Wenn beispielsweise ein Intron an zwei Exons gebunden bleibt, besteht die Möglichkeit, dass das Ribosom (der Enzymkomplex, der mRNA in Protein übersetzt) ​​lange vor ihm auf ein „ erreicht das andere Ende des Introns, an dem die Transkription gerade stoppt. All dies beinhaltet noch nicht einmal die anderen molekularen Modifikationen, die die RNA auf ihrem Weg von der Transkription zur Prä-mRNA durch das Spleißen zur endgültigen „reifen„mRNA erfahren kann.

Es überrascht nicht, dass, wenn diese Art von Fehlern in Genen auftritt, die wichtig für Prozesse sind, die das Zellwachstum und die Zellinvasion regulieren, Krebs entstehen kann, entweder durch ein falsches Spleißen, indem eine regulatorische Region im Protein entfernt wird, die es in Schach hält, oder durch die Produktion eines Proteins, das dies nicht tut funktionieren wie es soll. Beispiele für Krebserkrankungen, die durch eine Mutation an der Spleißstelle verursacht oder beschleunigt werden, häufen sich. Es ist diese letztere Möglichkeit, ein verkürztes Protein, das nicht funktioniert, das die von Wells falsch angewendete Arbeit untersucht. Die durch die Trunkierung beeinträchtigten Proteine ​​sind Tumorsuppressorproteine, deren Funktion darin besteht, das Wachstum oder andere Prozesse zu stoppen, die bei übermäßiger Aktivität zu Krebs führen können.

Was zeigte das Papier? Das Interessante an der Arbeit ist, dass sie das Vorhandensein von Spleißfehlern in Tumorsuppressorgenen bei einer bestimmten Krebserkrankung, chronischer lymphatischer Leukämie, ohne Mutationen an den Spleißstellen zeigte, um zu erklären, wie diese Proteine ​​aufgrund von Spleißfehlern abgeschnitten wurden, oder, wie die Autoren setze es ins Manuskript:

Wir entdeckten eine weit verbreitete Hochregulierung von verkürzten mRNAs und Proteinen in primären CLL-Zellen, die nicht durch genetische Veränderungen erzeugt wurden, sondern stattdessen durch intronische Polyadenylierung auftraten

Den durch intronische Polyadenylierung erzeugten verkürzten Proteinen fehlen oft die tumorsuppressiven Funktionen der entsprechenden Volllängenproteine ​​(wie DICER und FOXN3), einige wirkten sogar onkogen (wie CARD11, MGA und CHST11). Bei der CLL ist die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen durch aberrante mRNA-Prozessierung wesentlich häufiger als der Funktionsverlust solcher Gene durch genetische Ereignisse.

Was bedeutet das alles? Erstens, um es noch einmal zu wiederholen und zu vereinfachen: Die Autoren entdeckten verkürzte mRNAs und Proteine ​​für eine Reihe von Tumorsuppressorgenen in CLL, die nicht durch DNA-Mutationen in den Genen selbst erklärt werden konnten, wie zum Beispiel Mutationen an der Spleißstelle. Sie führten viele andere Kontrollen durch, beispielsweise stellten sie sicher, dass die Erklärung für die verkürzten Proteine ​​nicht in der Spaltung durch Proteasen lag, Enzyme, die Proteine ​​an bestimmten Aminosäuresequenzen schneiden. Nachdem andere Möglichkeiten ausgeschlossen wurden, zeigten die Autoren, dass diese mRNAs und Proteine ​​aufgrund eines als intronische Polyadenylierung bezeichneten Prozesses verkürzt wurden. Aber was ist das?

Polyadenylierung ist der Prozess, bei dem eine Reihe von Adenosinen (As) an das 3′-Ende eines RNA-Moleküls hinzugefügt werden. Auf diese Weise wird der Poly-A-Schwanz an das Ende einer mRNA angehängt, aber es stellt sich heraus, dass dies ein üblicher Prozess für die Polyadenylierung in Introns ist. Dieses Verfahren ist weit verbreitet und wurde vor gut einem Jahrzehnt geschätzt.Es ist an der Diversifizierung der Produkte von Immunzellen-mRNAs beteiligt, der Prozess wird so erklärt:

In der Spleißliteratur werden Isoformen, die durch die Erkennung eines IpA-Signals erzeugt werden, oft als „alternative letzte Exons“-Ereignisse beschrieben. Es wird angenommen, dass Gene, die IpA-Isoformen erzeugen, konkurrierende Spleiß- und Polyadenylierungssignale beherbergen, die eine Messenger-RNA (mRNA) voller Länge produzieren, wenn das Spleißen die Polyadenylierung verdrängt und ansonsten eine verkürzte mRNA produziert. Da das bestimmende Ereignis die Erkennung eines IpA-Signals ist, nennen wir diese Transkripte IpA-Isoformen. Durch die Analyse von 3'-Ende-Sequenzierungsdaten ist es nun möglich, die weit verbreitete Expression von IpA-Isoformen zu erkennen.

Oder einfacher ausgedrückt, ob es sich um ein verkürztes Protein oder ein Protein voller Länge handelt, hängt vom Gleichgewicht zwischen Spleißen und Polyadenylierung an der Stelle im Intron ab. Wenn es mehr Spleißaktivität gibt, erhalten Sie viel mehr vom gesamten Protein. Wenn es mehr Polyadenylierung gibt, erhalten Sie viel mehr von dem verkürzten Protein. Das Labor von Mayr fand heraus, dass zu viel Polyadenylierung zu verkürzten Tumorsuppressorproteinen bei CLL führen kann, die zur Entwicklung des Krebses beitragen, weshalb laut der MSKCC-Pressemitteilung, die die Ergebnisse ziemlich gut erklärt:

Diese Ergebnisse helfen, ein seit langem bestehendes Rätsel zu erklären, nämlich dass CLL-Zellen relativ wenige bekannte DNA-Mutationen aufweisen. Einigen CLL-Zellen fehlen sogar bekannte Mutationen. Tatsächlich könnten die mRNA-Veränderungen, die das Team von Dr. Mayr entdeckte, für die fehlenden DNA-Mutationen verantwortlich sein.

Da CLL ein so langsam wachsender Krebs ist und Menschen mit CLL oft viele Jahre leben, ist es noch zu früh, um zu sagen, ob diese mRNA-Veränderungen mit einer schlechteren Prognose verbunden sind.

Es gibt einige wichtige Unterschiede zwischen den mRNA-Veränderungen und einer echten DNA-Mutation. Am wichtigsten ist, dass die Inaktivierung von Tumorsuppressoren durch mRNA meist nur teilweise erfolgt, nur etwa die Hälfte der relevanten Proteinmoleküle in den Tumorzellen sind verkürzt. Dies reicht jedoch in vielen Fällen aus, um die Funktion der vorhandenen normalen Versionen vollständig zu überschreiben. Und weil diese Kürzung für 100 verschiedene Gene gleichzeitig gelten könnte, können sich die Änderungen summieren.

Warum hat das alles nichts mit mRNA-basierten Impfstoffen zu tun, die Krebs verursachen? Ich bin froh, dass Sie gefragt haben, und hoffe, dass es Ihnen nichts ausmacht, dass ich diese Gelegenheit genutzt habe, um im molekularbiologischen Sinne ein bisschen zu experimentieren. Die Biologie, die Wells missbraucht, ist eigentlich ziemlich komplex und faszinierend, und ich komme nicht mehr oft dazu, über reine Molekularbiologie zu sprechen. Ich hoffe, ich habe mit der Erklärung nicht zu viele Leser verloren, aber ich wette auch, dass mehr als ein paar von euch bereits herausgefunden haben, warum das, was Wells hausiert, völliger Unsinn ist. Wenn nicht, los geht's.


Ein mRNA-Impfstoff gegen Influenza

Ein Influenza-Impfstoff aus stabilisierter mRNA könnte es ermöglichen, bei der Entwicklung und Herstellung von Impfstoffen mit der viralen Evolution Schritt zu halten.

In der Welt der Infektionskrankheiten bleibt Influenza eine anhaltende Geißel. Die genetische Veränderlichkeit des Virus sorgt für ein endloses immunologisches Katz-und-Maus-Spiel, das ein komplexes Überwachungssystem erfordert, um virale Veränderungen zu verfolgen. Eine Möglichkeit, der Plastizität des Influenzavirus entgegenzuwirken, besteht darin, die Plastizität von Impfstoffdesign und -produktion zu erhöhen. In dieser Ausgabe stellt Petsch et al. 1 schlagen vor, dass dies mit mRNA-Impfstoffen erreicht werden könnte, die schnell modifiziert und hergestellt werden können. Die Studie ist die erste Anwendung von mRNA-Impfstoffen gegen eine Infektionskrankheit und zeigt in mehreren Tiermodellen den Schutz vor Influenza und ebnet den Weg für zukünftige klinische Bewertungen.


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