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Katalytische Triade von Serinproteasen

Katalytische Triade von Serinproteasen



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Wird Serin als Säure in der katalytischen Triade angesehen, die am Wirkmechanismus von Serinproteasen beteiligt ist? Es spendet ihm ein Proton, aber ich bin mir nicht sicher, ob dies wirklich als Säure qualifiziert ist?


Es hängt davon ab, wie Sie eine Säure definieren. Die chemische Definition, die Google bei meiner Suche präsentiert, ist "ein Molekül oder eine andere Spezies, die in Reaktionen ein Proton abgeben oder ein Elektronenpaar aufnehmen kann". Auf dieser Basis ist der Serinrest in der katalytischen Triade ist wirkt als schwach ionisierende Säure.

Natürlich ist eine freie Serin-Hydroxylgruppe in wässriger Lösung nicht sauer, aber eines der wichtigen Merkmale der Enzymkatalyse besteht darin, dass Aminosäurereste in einer anderen Umgebung wirken, die ihre Aktivität steigern kann. Ein Faktor ist die Nähe anderer Reste. Ein anderer ist, dass die effektive Dielektrizitätskonstante im hydrophoben Inneren eines Proteins unterschiedlich sein kann, was Wassermoleküle ausschließen kann.


Sezieren der katalytischen Triade einer Serinprotease

Serinproteasen kommen in praktisch allen Organismen vor und funktionieren sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle , Asp-Triade, eine Oxyanion-Bindungsstelle und möglicherweise andere Determinanten, die den Übergangszustand stabilisieren (Abb. 1). Für Bacillus amyloliquefaciens Subtilisin verleihen diese funktionellen Elemente eine Gesamtgeschwindigkeitserhöhung von mindestens 10(9) bis 10(10) mal der nicht-enzymatischen Hydrolyse von Amidbindungen. Wir haben die katalytische Bedeutung und Wechselwirkung zwischen Resten innerhalb der katalytischen Triade durch individuellen oder mehrfachen Austausch mit Alanin(en) untersucht, indem wir ortsgerichtete Mutagenese des klonierten B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Gens verwendet haben. Alanin-Substitutionen wurden gewählt, um ungünstige sterische Kontakte zu minimieren und das Auferlegen neuer Ladungswechselwirkungen oder Wasserstoffbrücken von den substituierten Seitenketten zu vermeiden. Im Gegensatz zum Effekt von Mutationen in Resten, die an der Substratbindung beteiligt sind, reduzieren die Mutationen in der katalytischen Triade die Turnover-Zahl stark und verursachen nur geringe Auswirkungen auf die Michaelis-Konstante. Kinetische Analysen der multiplen Mutanten zeigen, dass die Reste innerhalb der Triade synergistisch interagieren, um die Hydrolyse der Amidbindung um einen Faktor von ungefähr 2 × 10 (6) zu beschleunigen.


Die katalytische Triade der testesspezifischen Protease 50 (TSP50) ist essentiell für ihre Funktion bei der Zellproliferation

Die testesspezifische Protease 50 (TSP50) ist ein neu identifiziertes Pro-Onkogen und weist eine ähnliche enzymatische Struktur wie viele Serinproteasen auf. Unsere früheren Ergebnisse legten nahe, dass TSP50 die Tumorentstehung durch den Abbau des IκBα-Proteins und die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs fördern könnte, und die Threonin-Mutation in seiner katalytischen Triade könnte die TSP50-vermittelte Zellproliferation dämpfen. Ob jedoch die beiden anderen Reste in der katalytischen Triade von TSP50 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Proteaseaktivität und der Tumorgenese spielen, und die an diesem Prozess beteiligten Mechanismen bleiben unklar. Hier konstruierten und charakterisierten wir drei Mutanten der katalytischen Triade von TSP50 und fanden heraus, dass alle Mutanten die TSP50-induzierte Zellproliferation und Koloniebildung in vitro und die Tumorbildung in vivo signifikant dämpfen konnten, und die Asparaginsäure an Position 206 in der katalytischen Triade spielte a wichtiger als Threonin und Histidin in diesem Prozess. Mechanistische Studien zeigten, dass die Mutanten in der katalytischen Triade die Enzymaktivität von TSP50 aufhoben, aber die zelluläre Lokalisation nicht veränderten. Darüber hinaus zeigten unsere Daten, dass alle drei Mutanten die Aktivierung des NF-κB-Signals unterdrückten, indem sie die Interaktion zwischen TSP50 und dem NF-κB:IκBα-Komplex verhinderten. Am wichtigsten ist, dass wir gezeigt haben, dass TSP50 mit dem IκBα-Protein interagieren und es direkt als neue Protease in vitro spalten kann.

Schlüsselwörter: Katalytische Triade Zellproliferationsmechanismus Mutanten Serinprotease TSP50.


Katalytische Triade von Serinproteasen - Biologie

Serinprotease und Serinprotease-Inhibitoren

Michael J. Page und Enrico Di Cera, Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Serinproteasen gehören zur größten Gruppe proteolytischer Enzyme im menschlichen Genom, die eine wichtige Rolle bei Gesundheit und Krankheit spielen. Die Regulierung ihrer Aktivität in vivo wird durch eine vielfältige Gruppe von Serinprotease-Inhibitoren vermittelt. Es wird ein Überblick über das Zusammenspiel zwischen Serinproteasen und ihren Inhibitoren gegeben. Darüber hinaus werden Ansätze zur Charakterisierung dieser Beziehung diskutiert mit anschließender Betonung, wie solche Maßnahmen auf Pathologien anwendbar sind, die aus einem Defekt von Serinproteasen oder deren Inhibitoren resultieren.

Das Zellleben wird durch die Aktivität von Proteinen vermittelt, und die Kontrolle über ihre Konzentration und ihren Zustand ist wiederum von entscheidender Bedeutung. Enzyme, die Peptidbindungen hydrolysieren, die Proteasen, sind daher kritische Bestandteile des Genoms. Proteasen können als unspezifische Verdauungsmittel oder hochselektive Mediatoren der posttranslationalen Modifikation wirken. Proteasen sind eine vielfältige Gruppe von Enzymen. Über 180 phylogenetisch unterschiedliche Proteasenfamilien wurden durch das MEROPS-Protease-Klassifikationssystem anhand der Proteinfaltung identifiziert und zusätzlich durch phylogenetische Verwandtschaft getrennt (1). Das größte Kontingent dieser Familien umfassen Serinproteasen, die nach ihrer Verwendung der Hydroxylgruppe einer Serinseitenkette als katalytisches Nukleophil benannt werden. Die Regulierung der Proteasefunktion in vivo wird durch mindestens 90 Familien von Proteaseinhibitoren vermittelt. Zusammen steuern diese beiden Gruppen biologische Funktionen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle. Genetische Defekte entweder bei der Protease oder dem Inhibitor können daher zu einer signifikanten Pathologie mit möglicherweise mehreren beeinflussten biologischen Signalwegen führen.

Serinproteasen und ihre Inhibitoren

Mehr als ein Drittel aller bekannten proteolytischen Enzyme sind Serinproteasen (2). Der Familienname leitet sich vom nukleophilen Serinrest im aktiven Zentrum ab, der die Carbonylgruppe der Substratpeptidbindung angreift, um ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt zu bilden. Die Nucleophilie des katalytischen Serins hängt im Allgemeinen von einer katalytischen Triade aus Asparaginsäure, Histidin und Serin ab – allgemein als Charge-Relay-System bezeichnet (3). Erstmals von Blow vor über 30 Jahren in der Struktur von Chymotrypsin (4) beobachtet, wurde dieselbe Kombination in vier anderen dreidimensionalen Proteinfalten gefunden, die die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysieren. Beispiele für diese Faltungen werden bei Trypsin, Subtilisin, Prolyl-Oligopeptidase und ClpP-Protease beobachtet. Viele andere Enzymfamilien verwenden dieselbe katalytische Triade, wie Asparaginasen, Esterasen, Acylasen und β-Lactamasen (5). Die Mutagenese der Asparaginsäure zu Alanin beeinflusst die Hydrolyse der Peptidbindung stärker als die Esterhydrolyse, was darauf hinweist, dass eine vollständige katalytische Triade für die Hydrolyse der stärkeren Peptidbindung erforderlich ist. Es sollte beachtet werden, dass mehrere Serinprotease-Familien einen Dyadenmechanismus verwenden, bei dem Lysin oder Histidin mit dem katalytischen Serin gepaart wird. Andere Serinproteasen weisen jedoch neue katalytische Triaden auf, z. B. ein Histidinpaar in Kombination mit dem nukleophilen Serin. In fast allen berichteten Fällen kann das Serin des aktiven Zentrums durch generische Inhibitoren wie Diisopropylfluorphosphat und Phenylmethansulfonylfluorid inaktiviert werden. Wir werden uns auf die am häufigsten vorkommenden Serinprotease- und Serinprotease-Inhibitor-Familien im menschlichen Genom konzentrieren. Der Leser wird im gesamten Text auch auf andere aktuellere und umfangreichere Übersichtsartikel sowie auf die MEROPS-Datenbank verwiesen, um eine detailliertere Beschreibung der beeindruckenden Vielfalt der Serinprotease- und Inhibitorstruktur, -funktion und -aktivität zu erhalten.

Ein typisches Genom enthält 2-4% der Gene, die für proteolytische Enzyme kodieren. Das gesamte Komplement von Peptidasen innerhalb eines Genoms wird als Degradom bezeichnet (6). Von diesen Proteasen durchlief eine ausgewählte Untergruppe von Peptidasen eine beträchtliche Genduplikation und Divergenz. Die Trypsin-ähnlichen Serinpeptidasen (Clan PA Family S1 Subfamily A in MEROPS Nomenklatur) sind die größte Gruppe homologer Peptidasen im menschlichen Genom, die für verschiedene kritische biologische Prozesse verantwortlich sind. Eine ähnliche Degradom-Zusammensetzung wird bei allen Wirbeltieren beobachtet, was darauf hindeutet, dass die S1A-Peptidase-Familie vor dem Auftauchen der Linie vor etwa 450 Millionen Jahren expandierte. Von 699 Peptidasen beim Menschen sind 178 Serinpeptidasen und 138 davon gehören zur S1-Peptidase-Familie. Die Chymotrypsin-ähnliche Faltung der S1-Peptidase-Familie stellt eine ideale katalytische Plattform dar, die hohen Umsatz, Substratselektivität und verschiedene Regulationsweisen in einem Paket ermöglicht, das leicht mit zusätzlichen Proteindomänen kombiniert werden kann (7).

Clan PA: SI-Peptidasen – die Trypsinen

Chymotrypsin-gefaltete Proteasen sind die größte bekannte Familie von Peptidasen. In bahnbrechenden Studien wurden Verdauungsenzyme wie Trypsin und Chymotrypsin verwendet, die Polypeptidketten an der C-terminalen Seite einer positiv geladenen Seitenkette (Arginin oder Lysin) bzw. eines großen hydrophoben Rests (Phenylalanin, Tryptophan oder Tyrosin) spalten. In der Nomenklatur von Schechter & Berger liegt die hydrolysierte Peptidbindung zwischen den Resten P1 und P1’ des Substrats und wird sowohl in N- als auch in C-terminaler Richtung zunehmend nummeriert. Die Wechselwirkung findet in der ähnlich nummerierten Unterstelle (S) in der Protease statt. Zum Beispiel bindet die S2-Tasche den P2-Rest, die zweite Aminosäure auf der N-terminalen Seite der spaltbaren Bindung. Die Bestimmung anderer Polypeptidsequenzen mehrerer Serinproteasen ergab eine große Enzymfamilie. Trypsin und Chymotrypsin gehören zur S1A-Familie der Clan-PA, während die S1B-Familie verschiedene bakterielle Proteasen und die HtrA-Untergruppe der Proteasen umfasst, die für den intrazellulären Proteinumsatz verantwortlich sind (8). Beide Unterfamilien teilen die beiden β-Fass-Architekturen. Zwei griechische P-Fässer umfassen die Chymotrypsinfalte und sind auf nicht traditionelle Weise homolog (Abb. 1a). Die β-Strang-Topologie der Faltung zeigt die griechische Schlüsselarchitektur in beiden Barrels, doch diese Topologie stammt von Sequenzen, die in die entgegengesetzte Richtung verlaufen. Daher sind die beiden Hälften der Struktur Spiegelbilder im Proteinfaltenraum. Beide Zylinder sind funktionell unterteilt, wobei ein Ende an der Katalyse und ein zweites an der Regulierung beteiligt ist. Das aktive Zentrum liegt in der Spalte zwischen ihnen.

Die konventionelle katalytische Triade in Peptidasen der S1-Familie vermittelt die Hydrolyse der Peptidbindung ( 1b ). Die Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Resten Asp-102 und His-57 (Chymotrypsin-Nummerierung wird verwendet) erleichtert die Abstraktion des Protons von Ser-195 und erzeugt ein potentes Nukleophil. Die Stabilisierung der katalytischen Triade wird durch ein Netzwerk zusätzlicher Wasserstoffbrücken vermittelt, das von mehreren hochkonservierten Aminosäureresten bereitgestellt wird, die die Triade umgeben, insbesondere Thr-54, Ala-56 und Ser-214, und stärker durch eine Disulfidbrücke zwischen den Resten gestützt wird 42 und 58. Die Reaktion verläuft über paarweise tetraedrische Zwischenstufen. Im ersten Schritt führt der nukleophile Angriff durch das Serin zu einem Oxyanion-Zwischenprodukt, das durch die Rückgrat-Amide von Gly-193 und Ser-195 stabilisiert wird. Der Zusammenbruch des tetraedrischen Zwischenprodukts erzeugt ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt, und die Stabilisierung des neu geschaffenen N-Terminus wird durch His-57 vermittelt. Hartley und Kilbey lieferten 1954 den Beweis für das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt (9). In diesen ersten Experimenten wurde durch einen prä-stationären Produktschub korrekt identifiziert, dass eine Bindung an eine Hydroxyleinheit im Chymotrypsin am Reaktionsmechanismus beteiligt war. Die zweite Hälfte des Mechanismus ist eine Umkehrung des ersten Schrittes, bei dem ein Wassermolekül das freie Polypeptidfragment verdrängt und das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt angreift. Auch hier stabilisiert das Oxyanion-Loch das zweite tetraedrische Intermediat, und der Kollaps dieses Intermediats setzt einen neuen C-Terminus im Substrat frei. Von zentraler Bedeutung für die Regulation der Peptidaseaktivität ist die Zymogenaktivierung.

Abbildung 1. (a) Zwei-β-Barrel-Architektur der S1A-Peptidase-Familie (PDB 1OS8). Nach der Aktivierung stabilisiert der Zymogenarm die Spalte des aktiven Zentrums, die zwischen den beiden Fässern liegt. Am C-Terminus befindet sich eine zusätzliche α-Helix. (b) Die kanonische katalytische Triade wird durch die räumliche Anordnung von Asp-102, His-57 und Ser-195 erzeugt, die so positioniert sind, dass sie die Bildung von Wasserstoffbrücken und die Abstraktion des Protons der Hydroxyleinheit erleichtern.

Die Aktivierung der meisten Chymotrypsin-ähnlichen Serinpeptidasen erfordert eine proteolytische Prozessierung eines inaktiven Zymogen-Vorläuferproteins. Die Spaltung des Proprotein-Vorläufers erfolgt bei allen bekannten Mitgliedern der Familie an einer identischen Position: zwischen den Resten 15 und 16. Der entstehende N-Terminus induziert eine Konformationsänderung im Enzym durch Bildung einer intramolekularen elektrostatischen Wechselwirkung mit Asp-194, die beide Oxyanionen stabilisiert Loch und Substratbindungsstelle (10). Die Zymogen-Aktivierung bietet einen starken Regulationsmechanismus, der eine zeitliche Kontrolle über die Protease-Aktivität ermöglicht, eine Fähigkeit, einer vorzeitigen Enzymhemmung zu entkommen, und diese Enzyme in den Kontext von Ketten proteolytischer Ereignisse stellt. Viele Proteasen der Gerinnungs- und Immunwege werden stärker durch allosterische Mechanismen reguliert, an denen einwertige Kationen (Na + ), zweiwertige Kationen (Ca 2+ ), Glykosaminoglykane und Protein-Cofaktoren beteiligt sind (11). Diese Eigenschaften leiten sich von der Struktur der Chymotrypsin-Falte ab und bilden zusammen proteolytische Netzwerke, die für wichtige biologische Prozesse verantwortlich sind, die für die menschliche Gesundheit verantwortlich sind.

Mehrere lebenswichtige Prozesse beruhen auf Clan-PA-Peptidasen. Die wichtigsten davon sind die Blutgerinnung und die Immunantwort, die Kaskaden sequentieller Zymogenaktivierung beinhalten. In beiden Systemen wird die Chymotrypsin-gefaltete Peptidasedomäne mit einer weiteren assoziierten Proteindomäne kombiniert, einschließlich Apfel-, CUB-, EGF-, Fibronektin-, Kringle-, Sushi- und von-Willebrand-Faktor-Domänen. Diese Proteindomänen befinden sich am N-Terminus als Verlängerung des Propeptidsegments der Peptidase. Ein solcher Trend von N-terminal-assoziierten Domänen in der S1A-Peptidase-Familie ist in allen Lebensformen üblich. Die Domänenarchitektur passt gut zum Zymogen-Aktivierungsmechanismus, der den richtigen N-Terminus freisetzt, um die katalytische Aktivität zu ermöglichen. Häufig bleiben die assoziierten Proteindomänen durch eine kovalente Disulfidbindung auf der gegenüberliegenden Oberfläche des aktiven Zentrums der Protease an die Peptidasedomäne gebunden. Viele assoziierte Domänen werden vollständig von einem einzigen Exon in ihrem Peptidase-Gen kodiert und weisen auf eine wichtige Rolle für das Exon-Shuffling während der molekularen Evolution von Clan-PA hin.

S1-Peptidasen im menschlichen Genom werden größtenteils phylogenetisch in sechs Funktionskategorien eingeteilt: Verdauung, Gerinnung und Immunität, Tryptase, Matriptase, Kallikrein und Granzyme. Am Abbau von Proteinen im Verdauungssystem sind verschiedene Enzyme beteiligt. Die Trypsin, Chymotrypsin und Elastasen sind Endopeptidasen, die Polypeptide in kürzere Ketten zerlegen. Weitere Verdauung wird durch verschiedene Exopeptidasen vermittelt (12). Insbesondere die Carboxypeptidasen A und B aus der M14-Familie der Zink-abhängigen Metalloproteasen verkürzen die entstehenden Peptide durch komplementäre Selektivität gegenüber basischen oder aromatischen Resten. Eine unangemessene Freisetzung von Trypsin aus dem Verdauungssystem signalisiert proinflammatorische Reaktionen, die typischerweise durch Tryptase-ähnliche S1-Peptidasen vermittelt werden. Tryptasen sind Hauptkomponenten in sekretorischen Granula von Mastzellen, die aufgrund ihrer homotetrameren Quartärstruktur einzigartig unter den Clan-PA-Peptidasen sind (13). Wie Trypsin vermitteln Tryptasen proinflammatorische Signale durch Protease-aktivierte Rezeptoren 2, jedoch bleibt die Definition anderer Substrate in Gesundheits- und Krankheitszuständen schwer fassbar. Matriptasen sind membrangebundene S1-Peptidasen, die eine ähnliche Primärsubstratselektivität wie Trypsin aufweisen (14). Auch hier sind physiologische Substrate dieser Unterfamilie von Peptidasen weitgehend unbekannt, dennoch werden hohe Genexpressionsniveaus für Matriptasen mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht. Ein ähnlicher Zusammenhang mit Krebs hat zu großem Interesse an der großen Familie der Kallikreine (15) geführt, einer Familie, die allgemein für ihre Rolle bei der Regulierung des Blutdrucks durch das Kininsystem bekannt ist (16). Granzyme sind Mediatoren der gerichteten Apoptose durch natürliche Killerzellen und zytotoxische T-Zellen, die eine Schlüsselrolle bei der Abwehr von Virusinfektionen spielen (17). Einzigartig unter den Clan-PA ist die primäre Selektivität von Granzymen gegenüber sauren Resten in der P1-Position der Substrate. Von der großen Vielfalt an Proteasen in der Clan-PA-Familie S1 sind die Mediatoren der Immunität und der Blutgerinnung besonders gut untersucht worden.

Clan SC: Peptidase-Diversität in der α/β-Falte

Clan-SC-Peptidasen sind a/p-Hydrolase-gefaltete Enzyme, die aus parallelen β-Strängen bestehen, die von α-Helices umgeben sind. Die a/p-Hydrolase-Faltung bietet eine vielseitige katalytische Plattform, die zusätzlich zur proteolytischen Aktivität entweder als Esterase, Lipase, Dehalogenase, Haloperoxidase, Lyase oder Epoxidhydrolase wirken kann (18). Es sind sechs phylogenetisch unterschiedliche Familien von Clan-SC bekannt, und nur vier von ihnen haben eine bekannte Struktur. Die katalytische Zugänglichkeit der α/β-Hydrolase-Faltung könnte der Grund dafür sein, warum Clan-SC-Peptidasen die zweitgrößte Familie von Serinpeptidasen im menschlichen Genom sind. Andere mechanistische Klassen brauchen das katalytische Serin nicht zu verwenden und verwenden stattdessen Cystein oder Glutaminsäure (19). Clan-SC-Peptidasen weisen eine identische Geometrie auf wie die in den Clans PA und SB beobachtete katalytische Triade, jedoch ist diese Konstellation in der Polypeptidsequenz anders geordnet. Die Substratselektivität entwickelt sich aus den a-Helices, die den zentralen β-Faltblatt-Kern umgeben. Innerhalb des Clans SC sind Carboxypeptidasen aus der Familie S10 aufgrund ihrer Fähigkeit, die katalytische Aktivität in sauren Umgebungen aufrechtzuerhalten, einzigartig. Nahezu alle Serinpeptidasen haben eine Aktivität, die auf den Bereich von neutralem bis alkalischem pH beschränkt ist. Viele Clan-SC-Peptidasen hydrolysieren mit einigen Ausnahmen Substrate an der C-terminalen Seite eines Prolinrests. Sowohl endoproteolytische als auch exoproteolytische Aktivitäten treten in Clan-SC auf, was dem Trend in anderen Serinpeptidase-Familien, in denen die Mitglieder überwiegend das eine oder das andere sind, widerspricht. Als Beispiele unterschiedlicher Selektivität in Clan-SC spaltet Prolyl-Oligopeptidase aus der Familie S9 Peptidbindungen innerhalb von Peptiden und entfernt Prolyl-Aminopeptidase aus der Familie S33 N-terminale Prolin- und Hydroxyprolin-Reste aus Peptiden (20). Die Substratselektivität für Peptide mit einer Länge von weniger als 30 Aminosäuren wird von der Zwei-Domänen-Architektur abgeleitet. Ein N-terminaler siebenblättriger Propeller schränkt den Zugang zur C-terminalen α/β-Hydrolasedomäne und wiederum zur Hydrolysestelle der Peptidbindung ein (21). Aufgrund ihrer Selektivität für kleinere Peptide und nicht für Proteine ​​voller Länge werden Clan-SC-Peptidasen als besonders wichtig für Zellsignalmechanismen angesehen.

Beim Menschen sind Clan-SC-Peptidasen oft mit der prolinspezifischen N-terminalen Prozessierung von Peptiden und Proteinen verbunden, doch weisen viele eine nicht-proteolytische Funktion auf. S9 ist die größte Familie von Clan-SC-Peptidasen mit 41 Homologen im menschlichen Genom. Von diesen Homologen sind Prolyl-Oligopeptidase (POP) und Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP-IV) am besten charakterisiert. Die Kristallstruktur von POP zeigte die Zwei-Domänen-Architektur und die Grundlage für die Substratselektivität. Bemerkenswerterweise wurde kein natürlich vorkommender Inhibitor dieser Proteasenfamilie gefunden. Eine mutmaßliche Rolle für POP wurde im Metabolismus verschiedener Neuropeptide vorgeschlagen (22). DPP-IV präsentiert eine ähnliche Zwei-Domänen-Architektur (23). DPP-IV ist ein Transmembranprotein, das für die Verarbeitung von Hormonen und Chemokinen verantwortlich ist. Im menschlichen Genom wurden nur drei Peptidasen der S10-Familie identifiziert, und ihre biologischen Rollen müssen noch aufgeklärt werden. Von drei Peptidasen der S28-Familie beim Menschen ist nur die Dipeptidyl-Peptidase II (DPP-II) charakterisiert. DPP-II katalysiert die Freisetzung von zwei N-terminalen Aminosäuren, wenn sich Prolin oder Alanin in der P1-Position befindet. Achtzehn Peptidasen der S33-Familie befinden sich im menschlichen Genom, jedoch zeigen viele von ihnen keine Peptidaseaktivität. Einige dieser Enzyme katalysieren beispielsweise die Hydrolyse von Epoxidbindungen zu Diolen und spielen eine Rolle bei der Entgiftung oder zellulären Signalübertragung (24).

Clan SB: Familie S8 – Subtilisine

Clan-SB-Peptidasen sind in Pflanzen- und Bakteriengenomen weit verbreitet, mit wenigen Vertretern in einem bestimmten Tiergenom. Diese Proproteinkonvertasen sind jedoch für die Proteinverarbeitung in allen Metazoen von entscheidender Bedeutung. Der Archetyp des Clans SB ist Subtilisin. Subtilisin wurde ursprünglich im grampositiven Bakterium Bacillus subtilis entdeckt und war wie Chymotrypsin eine der frühesten nachgewiesenen Proteinkristallstrukturen (25). Die katalytische Triade von Asparaginsäure, Histidin und Serin findet sich in der exakten geometrischen Organisation, die in den Peptidasen der Clans PA und SC beobachtet wird, jedoch weist die umgebende Proteinfaltung keine Ähnlichkeit auf (Abb. 2). Clan SB enthält auch eine zweite Familie von Peptidasen S53, die Sedolisine. In diesen Peptidasen wird die allgemeine Histidin-Base durch eine Glutaminsäure ersetzt, und das tetraedrische Zwischenprodukt wird durch eine negativ geladene Carboxylgruppe einer Asparaginsäure anstatt durch partielle positive Ladungen stabilisiert. Subtilisine haben sich für Protein-Engineering-Studien als äußerst nützlich erwiesen. Erfolgreiche Beispiele für das Engineering des Subtilisin-Gerüsts umfassen Substratselektivität, thermische Stabilität, Kälteadaption, Stabilität in nichtwässrigen Lösungsmitteln, Fluoridaktivierung und die Fähigkeit, als Peptidligase zu wirken (26). Viele technische Studien zu Subtilisin haben zu stark verbesserten Reinigungsmitteln für den Einsatz in Waschmitteln geführt. Die physiologische Funktion von Clan-SB-Peptidasen ist tendenziell ernährungsorientiert mit ausgewählten Rollen bei der Proteinverarbeitung. Die meisten Clan-SB-Peptidasen bevorzugen es, Substrate an der C-terminalen Seite großer hydrophober Reste zu hydrolysieren. Proprotein-verarbeitende Peptidasen wie Kexin und Furin spalten jedoch nach einem Paar zweibasiger Reste (27). Die meisten Clan-SB-Peptidasen werden außerhalb der Zelle sezerniert oder an der Zellmembran lokalisiert. Eine bemerkenswerte Ausnahme sind die Tripeptidyl-Peptidasen, die für den intrazellulären Proteinumsatz verantwortlich sind.

Abbildung 2. Subtilisin (PDB 1SCN) weist eine identische katalytische Triade auf, die in anderen Serinproteasen und Enzymen beobachtet wird, jedoch innerhalb einer völlig anderen Proteinfaltung.

Innerhalb des menschlichen Genoms wurden 10 Clan-SB-Peptidasen identifiziert, neun gehören zur S8-Familie und nur eine stammt aus der S53-Familie. Obwohl sie für ihre Rolle bei der Verarbeitung von Proteinen entlang des Sekretionsweges bekannt sind, tauchen neue Rollen für Proproteinkonvertasen auf, einschließlich der Regulierung des Plasmaproteinspiegels. Tripeptidyl-Peptidase I (TPP-I) ist der einzige Vertreter der Familie S53 im menschlichen Genom und eine von vielen lysosomalen Peptidasen, die für den Proteinumsatz verantwortlich sind (28). TPP-I entfernt drei Aminosäuren vom N-Terminus kleiner Peptide. Mutationen in TPP-I sind mit infantiler neuronaler Ceroid-Lipofuszinose (Batten-Krankheit) verbunden, der häufigsten neurodegenerativen Erkrankung bei Kindern, die durch eine intrazelluläre Akkumulation von autofluoreszierenden Lipopigmenten gekennzeichnet ist.

Über 90 phylogenetisch unterschiedliche Familien von Protease-Inhibitoren wurden von der MEROPS-Datenbank klassifiziert. Wir werden die aktuelle Diskussion auf die am häufigsten vorkommenden und am besten charakterisierten Gruppen konzentrieren.

Kanonischer Mechanismus: Inhibitoren vom Kunitz- und Kazal-Typ

Im Allgemeinen interagieren Protease-Inhibitoren mit der Peptidase in einer kanonischen substratähnlichen Weise mit der Protease. In dieser Situation interagieren drei bis vier Reste in einer antiparallelen β-Faltblatt-Weise innerhalb des aktiven Zentrums des Enzyms. Viele dieser Protease-Inhibitoren sind kleine Proteine, die typischerweise 30 bis 120 Aminosäuren lang sind (29). Oft enthalten diese kleineren Proteasen-Inhibitoren viele Disulfidbindungen. Viele Proteasen haben extrem hohe Schmelztemperaturen (>80 °C) und behalten ihre native Konformation in Gegenwart starker Chaotrope. Trotz der Heterogenität der Sequenz weist jeder dieser Inhibitoren eine nahezu identische Konformation in der Schleife der reaktiven Stelle auf, die die proteolytische Aktivität einschränkt. Bei diesem Verfahren unterliegt die Schleife der reaktiven Stelle keiner Konformationsänderung, wenn sie mit der Protease komplexiert ist, und der P1-Rest ist so positioniert, dass er den Carbonylkohlenstoff in sehr geringem Abstand zu Ser-195 platziert. Der Carbonylsauerstoff wiederum zeigt auf das Oxyanion-Loch, das mit den Amidgruppen von Gly-193 und Ser-195 H-Brücken bildet. Der Amidstickstoff des P1-Rests ist auf das Oy von Ser-195 gerichtet, nicht gegenüber Ser-214, wie es typischerweise in natürlichen Substraten beobachtet wird. Es wird angenommen, dass sich die letztere Änderung während des katalytischen Spaltungsprozesses verkürzt (30). Die Schleife kann mit anderen Strukturelementen kombiniert werden, um eine Hemmung zu vermitteln, einschließlich einer P-Haarnadel, die der Schleife folgt, oder einer Disulfidbindung in unmittelbarer Nähe der spaltbaren Bindung. Während der Wechselwirkung mit der Protease bleibt die spaltbare Bindung intakt und kann je nach Enzym- und Inhibitorpaarung eine leichte Deformation aus der Planarität oder einen stärker verzerrten Michaelis-Komplex erfahren. Wenige spezifische Kontakte definieren die Wechselwirkung zwischen Protease und Inhibitor außerhalb des aktiven Zentrums, wo die meisten typischerweise hydrophob sind. Die Zusammensetzung der Schleife des reaktiven Zentrums trägt wiederum die signifikanteste Energetik zum Bindungsprozess bei. Eine Veränderung des P1-Rests durch Mutagenese kann daher verwendet werden, um das Hemmprofil dramatisch zu verschieben. Das Fehlen zusätzlicher Kontakte stellt sicher, dass die meisten Serinprotease-Inhibitoren die Aktivität mehrerer Proteasen in vivo regulieren.

MEROPS identifiziert Inhibitoren vom Kunitz-Typ als Familien I2 und I3, doch scheinen sie sich in der Evolutionsgeschichte getrennt entwickelt zu haben. Die Familien I2 und I3 werden wegen ihrer Herkunft aus Tieren bzw. Pflanzen als „Kunitz-A“ und „Kunitz-P“ bezeichnet. Aprotinin, auch bekannt als Rinderpankreastrypsin-Inhibitor, war einer der ersten Protease-Inhibitoren, die 1930 von Kraut und Mitarbeitern identifiziert und isoliert wurden. Die I2-Familie ist wesentlich homogener und soll nur S1-Peptidasen hemmen. Im Gegensatz dazu ist die I3-Familie in zwei phylogenetische Gruppen aufgeteilt, I3A und I3B, die beide typischerweise S1-Peptidasen hemmen, doch Mitglieder der I3A-Familie können potenziell auch die Aspartyl-Proteasen der A1-Familie und die Cystein-Proteasen der C1-Familie hemmen. Die erste Struktur eines I3-Inhibitors war der Komplex aus Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor mit Trypsin von Sweet und Kollegen (31). Die Struktur weist eine β-Fass-Architektur auf, die von einem Paar von β-Strängen bedeckt ist, die durch zwei Disulfidbindungen stabilisiert sind (Abb. 3). Die physiologische Funktion der Kunitz-Typ-Proteasen bleibt vielen anderen Familienmitgliedern als denen beim Menschen unbekannt. Eine Prävention gegen die Verdauung oder das Eindringen von Krankheitserregern wurde auf der Grundlage einer gemeinsamen Fülle von Samen vorgeschlagen. Beim Menschen ist der Tissue Factor Pathway-Inhibitor ein wichtiger Inhibitor vom Kunitz-Typ, der für die Regulierung der Blutgerinnselbildung verantwortlich ist. Inhibitoren vom Kunitz-Typ gehörten aufgrund ihrer Wirksamkeit zu den ersten, die für eine therapeutische Anwendung untersucht wurden. Aprotinin wurde 1993 für die klinische Anwendung in der koronaren Bypass-Operation zugelassen. 15 Jahre später gab es erhebliche Kontroversen über seinen Einsatz angesichts des damit verbundenen Mortalitätsrisikos und der Verfügbarkeit kostengünstigerer Lysin-Analoga, die die gleichen Ziele erreichen (32).

Abbildung 3. Komplexbildung zwischen Trypsin und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor veranschaulicht den Mechanismus von Inhibitoren vom Kunitz-Typ (PDB 1AVW). Stark reduzierte Hydrolyseraten der Peptidbindung führen zu einer Hemmung.

Inhibitoren vom Kazal-Typ werden von der MEROPS-Datenbank als Familie I1 klassifiziert. Der Name leitet sich vom pankreatischen sekretorischen Inhibitor ab, der heute als SPINK1 bezeichnet wird und ursprünglich 1948 von Kazal und Mitarbeitern isoliert wurde. Die SPINK-Familie (Serinprotease-Inhibitor, Kazal) spielt eine wichtige Rolle im Verdauungssystem, in der Lunge, in der Haut und wahrscheinlich in vielen anderen Gewebe im Körper. Im menschlichen Genom können sechs SPINKs identifiziert werden, und jeder enthält mehrere Wiederholungen der Kazal-Typ-Faltung. Mutationen in SPINK1 sind mit einer hereditären Pankreatitis assoziiert (33). Das Netherton-Syndrom ist eine seltene Erkrankung, die die Haut von Patienten befällt und zu ichthyosiformer Dermatose und Haarschaftanomalien führt. Bei Patienten mit Netherton-Syndrom wurde eine Mutation auf Chromosom 5 im SPINK5-Gen gefunden, das für eine Reihe von 15 Inhibitordomänen vom Kazal-Typ kodiert (34). An den Ovomucoid-Inhibitoren der Kazal-Familie wurde eine beträchtliche biochemische Charakterisierung durchgeführt (35). Da innerhalb einer einzelnen Polypeptidkette häufig mehrere Domänen vom Kazal-Typ gefunden werden, müssen sie nicht den gleichen Proteasetyp oder die gleiche Proteasespezifität hemmen. Beispielsweise enthält Hunde-Bikazin zwei Domänen vom Kazal-Typ, wobei eine Domäne Trypsin bevorzugt und die andere Chymotrypsin bevorzugt.

Bait-and-Trap-Mechanismus: Serpins

Serpine kommen in allen Reichen des Lebens vor, ihre Anwesenheit in einem bestimmten Organismus jedoch nicht, was darauf hindeutet, dass die Familie einen signifikanten Gentransfer und Verlust erfahren hat. Der Familienname wurde von Carrell und Travis als Akronym für Serin-Protease-Inhibitor geprägt (36). Serpine sind die am häufigsten vorkommende Form von Serinprotease-Inhibitoren im menschlichen Genom. Mit Ausnahme von Pilzen scheinen alle mehrzelligen Eukaryoten ein oder mehrere Serpin-Gene zu besitzen. Trotz ihrer Allgegenwart werden Serpinen jedoch nur wenige physiologische Funktionen zugeschrieben, die über die beim Menschen bekannten hinausgehen, und insbesondere werden sie mit Pathologien in Verbindung gebracht. Die meisten Serpine sind irreversible Inhibitoren von Serinproteasen der S1-Familie von Peptidasen, wobei ausgewählte Familienmitglieder S9 von Subtilisinen und Cysteinproteasen hemmen. Mehrere Mitglieder der Serpin-Familie haben ihre Fähigkeit verloren, als Inhibitoren zu wirken, und haben neue Funktionen wie Ovalbumin und Pigmentepithel-abgeleiteter Faktor erhalten. Der einzigartige Mechanismus der Protease-Hemmung durch Serpine hat beträchtliche Aufmerksamkeit erregt.

Serpine bestehen aus einem konservierten Kern aus drei β-Faltblättern und acht oder neun a-Helices, die gemeinsam am Hemmmechanismus wirken. Wie bei den Inhibitoren vom Kazal- und Kunitz-Typ beinhaltet der Mechanismus eine oberflächenexponierte Schleife, die als reaktive Zentrumsschleife (RCL) bezeichnet wird. Die RCL präsentiert einen kurzen Abschnitt einer Polypeptidsequenz, die die spaltbare Bindung von P1-P1 trägt. Wie bei anderen Serin-Protease-Inhibitor-Familien dominiert der P1-Rest die Thermodynamik, die die Interaktion zwischen Protease und Inhibitor regelt. Die Exposition des P1-Rests gegenüber Lösungsmittel wird typischerweise durch 15 Aminosäuren N-terminal zum P1-Rest und 5 Reste auf der C-terminalen "Prime"-Seite der spaltbaren Bindung vermittelt. Evidence for dramatic conformational change in the inhibitory mechanism was first provided by the crystal structure of the cleaved form of α1-antitrypsin (37). In this structure and unlike the native form, the reactive center loop was not solvent exposed but occurred as an additional β-strand within the core of the structure.

Dramatic conformational change of both inhibitor and protease is the most recognizable feature of the serpin mechanism (Fig. 4). After formation of the Michaelis-Menten encounter complex, the reactive center loop is cleaved, and an acyl enzyme intermediate is formed as in the normal serine protease catalytic mechanism. However, after bond hydrolysis, the RCL rapidly inserts into the central P-sheet of the serpin, which yields an overall stability enhancement to the inhibitor and traps the acyl-enzyme intermediate. It largely unknown how this change in conformation occurs. Several studies suggest the complex undergoes transient exchange between expelled and partially inserted states (38). Integration of the β-strand into the structure flips the protease from the “top” of the structure to the complete opposite side of the serpin. Because of this, the local environment of the catalytic triad is distorted and therefore cannot complete the catalytic cycle (39). When the process is finished, the previously adjacent P1 and P1’ residues are separated by over 70 A. During this process, the protease has been converted from a metastable free state into a more energetically favored relaxed bound state. Serpins have a considerably lower melting temperature (Tm

60 °C) in isolation than when cleaved (Tm > 100 °C). Unrelated in sequence or structure, the macroglobulin family of protease inhibitors similarly applies scissile bond cleavage, yet the subsequent step involves entrapment of the protease in a cage-like architecture (40). Although most serpins apply this mechanism to inhibit serine proteases irreversibly, a select group has been shown to act reversibly. For example, protein C inhibitor, also known as PAI-1, acts as a reversible inhibitor to the single-chain urokinase-type plasminogen activator. Moreover, several serpins are known to integrate their cleaved RCL into another serpin molecule in trans (41). In turn, serpins can undergo polymerization, which becomes relevant in several pathological conditions.

Figure 4. A large conformational change defines the mechanism of serpin inhibition. Conversion of the Michaelis complex (PDB 1OPH) into cleaved trapped conformation (PDB 1 EZX) traps the RCL of serpin into the p-strand core of inhibitor. A significant gain in stability, therefore, is imparted to the entire serpin structure.

Serpins play key regulatory functions in man. α1-antitrypsin serves a major role in protecting the connective tissue of the lungs from leukocyte-released elastase. The C1 inhibitor restricts proteases of the immune system from unwanted proteolysis and inflammation. Two plasminogen activator inhibitors control fibrinolysis. Viral serpins have also been described that broker their survival and propagation through restricting these same proteolytic pathways. Control of blood clot formation is through antithrombin. However, unlike other serpin family members, the interaction between clotting factor protease and antithrombin is greatly facilitated by heparin or heparin sulfate glycosaminoglycans, which bind to the inhibitor to mediate this effect (42). In turn, antithrombin is directed toward regulation of protease activity at cell surfaces such as the vascular endothelium, which display heparin in various forms.

Exosite recognition: hirudin and other anticoagulant molecules

Numerous strategies have evolved in different pathogenic and parasitic organisms to alter the coagulation cascade for their own benefit. Snake and leech venoms have yielded a plethora of serine proteases and serine protease inhibitors that bear this trait. Many inhibitors function through hijacking the macromolecular recognition regions in blood clotting factors, the earliest known example of which is hirudin, a 66-amino acid residue protein that is an extremely tight binding and selective inhibitor of the blood coagulation protease thrombin. Indeed, the use of leeches in medicine dates back to the Greeks in 200 B.C. However, it was not until 1884 that Haycraft isolated the anticoagulant agent from medicinal leech saliva and termed this agent hirudin. Selective and tight binding results from the cooperative binding at both the anion binding exosite responsible for fibrinogen recognition and active site of thrombin. Notably, unlike nearly all other protease inhibitors, active site recognition involves formation of a parallel β-sheet. Hirudin has been derivatized and modified in various ways to develop direct thrombin inhibitors. Two recombinant forms, lepirudin and desirudin, are available for clinical use to prevent deep-vein thrombosis after surgery and treat heparin-induced thrombocytopenia. However, various problems have limited their use, including bleeding problems, short half-life, and development of antihirudin antibodies. Additional modification of the hirudin platform and other medicinal chemistry strategies aimed at thrombin inhibition is well described in Reference 43.

Characterization of Protease-Inhibitor Interactions

Defining the selectivity and potency of an inhibitor relies on accurate characterization of the protease. In particular, values of kKatze and kKatze/Km are readily obtained using basic enzymology and various commercially available chromogenic and fluorogenic substrates. Proteases act on a single substrate during the catalytic cycle. Therefore, models to interpret data follow classical descriptions of competitive, noncompetitive, and mixed inhibition. As with traditional enzymology, curve-fitting measures combined with graphical validation of data is suggested as a more accurate approach than the use of initial rates analysis. Use of IC50 is to be avoided as the values of this measure are only a crude comparison between reversible inhibitors. For serine proteases, the use of irreversible inhibitors, such as chloromethyl ketones, are extremely useful for determining the amount of active protease in a given protein preparation. Many serine protease inhibitors form stable complexes with their target proteases that can be resolved via gel electrophoresis as a simple and effective means of visualization. However, many protease-inhibitor interactions require more advanced data treatment. Some examples include slow tight-binding mechanisms and higher-order stoichiometries of inhibition (44). Lastly, conformational change can be measured through various biophysical techniques including UV and fluorescence spectroscopy, circular dichroism, and isothermal titration calorimetry.

Serine Proteases and their Inhibitors in Disease

As illustrated above, the human genome encodes a large and diverse population of serine proteases and serine protease inhibitors. Design of small-molecule inhibitors to restrict proteolytic activity continues to garner attention in the pharmaceutical industry. Given the many related proteases in the genome, this task is particularly challenging. Early work focused on active site-directed therapies. However, as evidenced by the naturally occurring serine protease inhibitors, active site recognition enables the regulation of multiple protease targets. Minimization of unwanted side effects is then a significant hurdle. More recent effort has sought the development of therapeutics that focus on other regions of the protease. The crucial role for such regions in biological systems is demonstrated by the blood coagulation and immune system proteases, in which macromolecular recognition is dependent on exosites and the allosteric communication of these regions with the active site.

Diversity of proteases and inhibitors results in a wide range of pathologies that result from disruption in either serine protease or serine protease inhibitor. The earliest descriptions of such imbalances are within the blood coagulation cascade. For example, hemophilia B results from deficiency in coagulation factor IX. In contrast, excessive activation of immune system serine proteases produces inflammatory states. Errors in serine protease inhibitors can have consequences on multiple biological systems. However, overlapping inhibition by multiple families of inhibitor can, in certain instances, lessen the severity of the pathology. Genetic abnormalities in the serpins have also been associated with polymerization and therefore belong to the category of conformational disease. Emphysema, cirrhosis, and thrombosis may result from such aberrant conformational transitions. Neuroserpin may also play a key role in familial encephalopathy because of the formation of inclusion body-like material (45). Understanding the molecular mechanisms of limited proteolysis and their regulation in vivo remains a challenging and insightful venue to improve human health.

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Substrate binding

The process starts with the binding of the substrate in the S1 pocket (Figure 4.54). The S1 pocket in chymotrypsin has a hydrophobic hole in which the substrate is bound. Preferred substrates will include amino acid side chains that are bulky and hydrophobic, like phenylalanine. If an ionized side chain, like that of glutamic acid binds in the S1 pocket, it will quickly exit, much like water would avoid an oily interior.

Figure 4.54 - 2. Binding of substrate to S1 pocket in the active site


9.1.3. Serine is Part of a Catalytic Triad That Also Includes Histidine and Aspartic Acid

Structural Insights, Chymotrypsin: A Serine Protease

Work with interactive molecular models to learn more about the structural bases of active site specificity and reactivity, and some of the ways in which active site residues can be identified.

The determination of the three-dimensional structure of chymotrypsin by David Blow in 1967 was a source of further insight into its mechanism of action. Overall, chymotrypsin is roughly spherical and comprises three polypeptide chains, linked by disulfide bonds. It is synthesized as a single polypeptide, termed chymotrypsinogen, which is activated by the proteolytic cleavage of the polypeptide to yield the three chains. The active site of chymotrypsin, marked by serine 195, lies in a cleft on the surface of the enzyme (Figure 9.6). The structural analysis revealed the chemical basis of the special reactivity of serine 195 (Figure 9.7). The side chain of serine 195 is hydrogen bonded to the imidazole ring of histidine 57. The -NH group of this imidazole ring is, in turn, hydrogen bonded to the carboxylate group of aspartate 102. This constellation of residues is referred to as the catalytic triad. How does this arrangement of residues lead to the high reactivity of serine 195? The histidine residue serves to position the serine side chain and to polarize its hydroxyl group. In doing so, the residue acts as a general base catalyst, a hydrogen ion acceptor, because the polarized hydroxyl group of the serine residue is poised for deprotonation. The withdrawal of the proton from the hydroxyl group generates an alkoxide ion, which is a much more powerful nucleophile than an alcohol is. The aspartate residue helps orient the histidine residue and make it a better proton acceptor through electrostatic effects.

Figure 9.6

Three-Dimensional Structure of Chymotrypsin. The three chains are shown in ribbon form in orange, blue, and green. The side chains of the catalytic triad residues, including serine 195, are shown as ball-and-stick representations, as are two intrastrand (more. )

Figure 9.7

The Catalytic Triad. The catalytic triad, shown on the left, converts serine 195 into a potent nucleophile, as illustrated on the right.

These observations suggest a mechanism for peptide hydrolysis (Figure 9.8). After substrate binding (step 1), the reaction begins with the hydroxyl group of serine 195 making a nucleophilic attack on the carbonyl carbon atom of the substrate (step 2). The nucleophilic attack changes the geometry around this carbon atom from trigonal planar to tetrahedral. The inherently unstable tetrahedral intermediate formed bears a formal negative charge on the oxygen atom derived from the carbonyl group. This charge is stabilized by interactions with NH groups from the protein in a site termed the oxyanion hole (Figure 9.9). These interactions also help stabilize the transition state that precedes the formation of the tetrahedral intermediate. This tetrahedral intermediate then collapses to generate the acyl-enzyme (step 3). This step is facilitated by the transfer of a proton from the positively charged histidine residue to the amino group formed by cleavage of the peptide bond. The amine component is now free to depart from the enzyme (step 4) and is replaced by a water molecule (step 5). The ester group of the acyl-enzyme is now hydrolyzed by a process that is essentially a repeat of steps 2 through 4. The water molecule attacks the carbonyl group while a proton is concomitantly removed by the histidine residue, which now acts as a general acid catalyst, forming a tetrahedral intermediate (step 6). This structure breaks down to form the carboxylic acid product (step 7). Finally, the release of the carboxylic acid product (step 8) readies the enzyme for another round of catalysis.

Figure 9.8

Peptide Hydrolysis by Chymotrypsin. The mechanism of peptide hydrolysis illustrates the principles of covalent and acid-base catalysis. The dashed green lines indicate favorable interactions between the negatively charged aspartate residue and the positively (more. )

Figure 9.9

The Oxyanion Hole. The structure stabilizes the tetrahedral intermediate of the chymotrypsin reaction. Hydrogen bonds (shown in green) link peptide NH groups and the negatively charged oxygen.

This mechanism accounts for all characteristics of chymotrypsin action except the observed preference for cleaving the peptide bonds just past residues with large, hydrophobic side chains. Examination of the threedimensional structure of chymotrypsin with substrate analogs and enzyme inhibitors revealed the presence of a deep, relatively hydrophobic pocket, called the S1 pocket, into which the long, uncharged side chains of residues such as phenylalanine and tryptophan can fit. The binding of an appropriate side chain into this pocket positions the adjacent peptide bond into the active site for cleavage (Figure 9.10). The specificity of chymotrypsin depends almost entirely on which amino acid is directly on the amino-terminal side of the peptide bond to be cleaved. Other proteases have more-complex specificity patterns, as illustrated in Figure 9.11. Such enzymes have additional pockets on their surfaces for the recognition of other residues in the substrate. Residues on the amino-terminal side of the scissile bond (the bond to be cleaved) are labeled P1, P2, P3, and so forth, indicating their positions in relation to the scissile bond. Likewise, residues on the carboxyl side of the scissile bond are labeled P1′, P2′, P3′, and so forth. The corresponding sites on the enzyme are referred to as S1, S2 or S1′, S2′, and so forth.

Figure 9.10

The Hydrophobic Pocket of Chymotrypsin. The hydrophobic pocket of chymotrypsin is responsible for its substrate specificity. The key amino acids that constitute the binding site are labeled, including the active-site serine residue (boxed). The position (more. )

Figure 9.11

Specificity Nomenclature for Protease-Substrate Interactions. The potential sites of interaction of the substrate with the enzyme are designated P (shown in red), and corresponding binding sites on the enzyme are designated S. The scissile bond (also (more. )


An alternate geometry for the catalytic triad of serine proteases

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Chymotrypsin

Consider the mechanism of catalysis of the enzyme known as chymotrypsin. Found in our digestive system, chymotrypsin&rsquos catalytic action is cleaving peptide bonds in proteins and it uses the side chain of a serine in its mechanism of catalysis. Many other protein- cutting enzymes employ a very similar mechanism and they are known collectively as serine proteases. It acts fairly specifically, cutting not all peptide bonds, but only those that are adjacent to specific amino acids in the protein. One of the amino acids it cuts adjacent to is phenylalanine. The enzyme&rsquos action occurs in two phases &ndash a fast phase that occurs first and a slower phase that follows. The enzyme has a substrate binding site that includes a region of the enzyme known as the S1 pocket. Let us step through the mechanism by which chymotrypsin cuts adjacent to phenylalanine.

Figure 6.1.1: mechanism of catalysis of the enzyme chymotrypsin.

The process starts with the binding of the substrate in the S1 pocket. The S1 pocket in chymotrypsin has a hydrophobic hole in which the substrate is bound. Preferred substrates will include amino acid side chains that are hydrophobic, like phenylalanine. If an ionized side chain, like that of glutamic acid binds in the S1 pocket, it will quickly exit, much like water would avoid an oily interior. When the proper substrate binds, it stays and its presence induces an ever so slight shift in the shape of the enzyme. This subtle shape change on the binding of the proper substrate starts the steps of the catalysis and is the reason that the enzyme shows specificity for cutting at specific enzyme positions in the target protein. Only amino acids with the side chains that interact well with the S1 pocket start the catalytic wheels turning.

The slight changes in shape of the enzyme upon binding of the proper substrate cause changes in the positioning of three amino acids (aspartic acid, histidine, and serine) in the active site known as the catalytic triad, during the second step of the catalytic action. The shift of the negatively charged aspartic acid towards the electron rich histidine ring favors the abstraction of a proton by the histidine from the hydroxyl group on the side chain of serine, resulting in production of a very reactive alkoxide ion in the active site. Since the active site at this point also contains the polypeptide chain positioned with the phenylalanine side chain embedded in the S1 pocket, the alkoxide ion performs a nucleophilic attack on the peptide bond on the carboxyl side of phenylalanine sitting in the active site. This reaction, which is the third step of catalysis, breaks the bond and causes two things to happen. First, one end of the original polypeptide is freed and exits the active site. The second is that the end containing the phenylalanine is covalently linked to the oxygen of the serine side chain. At this point we have completed the first (fast) phase of the catalysis.

The second phase of the catalysis by chymotrypsin is slower. It requires that the covalent bond between phenylalanine and serine&rsquos oxygen be broken so the peptide can be released and the enzyme can return to its original state. The process starts with entry of water into the active site. Water is attacked in a fashion similar to that of the serine side chain in the first phase, creating a reactive hydroxyl group that performs a nucleophilic attack on the phenylalanine-serine bond, releasing it and replacing the proton on serine. The second peptide is released in the process and the reaction is complete with the enzyme back in its original state.


4.7: Chymotrypsin

  • Contributed by Kevin Ahern & Indira Rajagopal
  • Professor (Biochemistry and Biophysics) at Oregon State University

The process starts with the binding of the substrate in the S1 pocket. The S1 pocket in chymotrypsin has a hydrophobic hole in which the substrate is bound. Preferred substrates will include amino acid side chains that are hydrophobic, like phenylalanine. If an ionized side chain, like that of glutamic acid binds in the S1 pocket, it will quickly exit, much like water would avoid an oily interior. When the proper substrate binds, it stays and its presence induces an ever so slight shift in the shape of the enzyme. This subtle shape change on the binding of the proper substrate starts the steps of the catalysis and is the reason that the enzyme shows specificity for cutting at specific enzyme positions in the target protein. Only amino acids with the side chains that interact well with the S1 pocket start the catalytic wheels turning.

The slight changes in shape of the enzyme upon binding of the proper substrate cause changes in the positioning of three amino acids (aspartic acid, histidine, and serine) in the active site known as the catalytic triad, during the second step of the catalytic action. The shift of the negatively charged aspartic acid towards the electron rich histidine ring favors the abstraction of a proton by the histidine from the hydroxyl group on the side chain of serine, resulting in production of a very reactive alkoxide ion in the active site. Since the active site at this point also contains the polypeptide chain positioned with the phenylalanine side chain embedded in the S1 pocket, the alkoxide ion performs a nucleophilic attack on the peptide bond on the carboxyl side of phenylalanine sitting in the active site. This reaction, which is the third step of catalysis, breaks the bond and causes two things to happen. First, one end of the original polypeptide is freed and exits the active site. The second is that the end containing the phenylalanine is covalently linked to the oxygen of the serine side chain. At this point we have completed the first (fast) phase of the catalysis.

The second phase of the catalysis by chymotrypsin is slower. It requires that the covalent bond between phenylalanine and serine&rsquos oxygen be broken so the peptide can be released and the enzyme can return to its original state. The process starts with entry of water into the active site. Water is attacked in a fashion similar to that of the serine side chain in the first phase, creating a reactive hydroxyl group that performs a nucleophilic attack on the phenylalanine-serine bond, releasing it and replacing the proton on serine. The second peptide is released in the process and the reaction is complete with the enzyme back in its original state.


Localization and function

The expression of granzymes is restricted to activated T lymphocytes, immature T cells in the thymus (thymocytes), γδ T cells (a small population of specialized T cells mainly found in the gut) and NK cells. Of these, NK cells and γδ T cells constitutively express and store granzymes, whereas in T lymphocytes the production of granzyme mRNA and proteins must be induced following exposure to antigen or following other types of stimulation. Granzymes are expressed by most CD8 + and a smaller proportion of CD4 + T cells sensitized in vitro by antigen or lectin [8]. The gene for granzyme M is only expressed in NK cells, whereas other members of the subfamily encoded by the Met-ase locus have a much wider expression.

Granzymes undergo their final processing by DPP1 at the time of packaging into cytotoxic granules, and they are therefore stored as active enzymes, ready for exocytic release upon contact with a target cell. The granules have two zones, which can be seen at the ultrastructural level. Each has a dense central core, which contains granzymes, the granule toxin perforin and the acidic proteoglycan chondroitin sulphate (CS). The net negative charge of CS enables it to complex granzymes, which are basic and positively charged at granule pH. The outer zone of each granule has a composition more typical of an ordinary lysosome. Granules appear to be distributed randomly in the cytoplasm, but they rapidly move to the site of target-cell contact when conjugation occurs, in a process known as polarization.

Apoptotic function of granzyme B

It is clear that the principal function of granzymes is to induce the death of virus-infected and other potentially harmful cells. They achieve this by accessing key substrates within target cells in a perforin-dependent manner. Perforin-deficient mice thus have a complete deficiency of all granzyme-mediated cell-death pathways and are susceptible to both a broad variety of viral pathogens and other intracellular pathogens, such as Listeria monocytogenes [9]. Granzyme B has the strongest apoptotic activity of all granzymes, as a result of its caspase-like ability to cleave substrates at key aspartic acid residues. But mice deficient in granzyme B expression have a far milder immune deficiency than perforin-null mice, suggesting that there is a degree of functional redundancy in granzyme-induced apoptosis. In vitro, the CTLs of granzyme B-deficient mice induce DNA fragmentation in target cells much more slowly than do CTLs of wild-type littermates [10]. Granzymes other than B have far weaker apoptotic activity, best illustrated by granzyme A, a tryptase that can amplify granzyme-B-mediated cell death. Granzyme A can induce caspase activation far less efficiently than granzyme B, and exerts other pro-apoptotic effects through its ability to cleave down-stream caspase substrates.

The cell-death-inducing properties of granzyme B have recently been studied in detail. Granzyme B can cleave, and therefore activate, several procaspases directly, and can also directly cleave downstream caspase substrates, including the inhibitor of caspase-activated DNase (ICAD). It can thus contribute in a major way to DNA fragmentation in the target cell. Overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 protein in mitochondria inhibits granzyme B completely, however, indicating that mitochondrial disruption is an indispensable feature of granzyme-mediated cell death [11]. Recently, we have shown that in human and mouse cells the pro-apoptotic Bcl-2-family member Bid is cleaved specifically and rapidly by granzyme B distal to the aspartic acid residue at position 75, and that the truncated Bid molecule inserts into the mitochondrial membrane to induce the release of other pro-apoptotic mediators, including cytochrome c and Smac/Diablo [12]. In addition to caspase-dependent mechanisms, there are also caspase-independent pathways: cells in which caspase activity is abolished are nevertheless killed by granzymes, although the caspase-independent mechanisms are poorly understood but probably involve cytoskeletal disruption (Figure 3).

A schematic model of granzyme-B-mediated apoptosis. Granzyme B enters the target cell by endocytosis and leaves the endosomal compartment to access the cytosol in a perforin-dependent manner. The key cytosolic substrate for granzyme B is the pro-apoptotic Bcl-2 family member Bid, which is cleaved distal to aspartic acid at position 75. Truncated Bid (tBid) induces mitochondrial disruption, which can be inhibited by Bcl-2. Disrupted mitochondria release other pro-apoptotic mediators such as cytochrome C and DIABLO/Smac, which subsequently induce caspase activation. Granzyme B also cleaves some caspases directly, but full caspase processing requires activation of the mitochondrial pathway through Bid. There are also caspase-independent pathways to cell death, and although they are poorly characterized, an important step in these pathways appears to be cytoskeletal disruption.

Non-apoptotic granzyme functions

A number of additional functions have also been postulated for granzymes, especially for the trypsin-like granzyme A, which may be involved in regulating B-cell proliferation. Purified mouse granzyme A can be mitogenic for B cells in the absence of antigen, much like other 'tryptases' such as thrombin and trypsin. Granzyme A can cleave a number of extracellular matrix proteins, and thus may facilitate migration of T and NK cells through extracellular tissues. Granzymes can also induce cytokine secretion and directly activate certain cytokines, and may thus amplify some forms of inflammation. Granzyme A can cleave the thrombin receptor after the sequence Leu-Asp-Pro-Arg to induce the release of the interleukins IL-6 and IL-8 from monocytoid cells and the retraction of neurites in oligodendrocytes. A role for granzymes A and B in directly controlling viral infection has been proposed, because mice with a targeted disruption of the genes for granzymes A and B were found to be profoundly susceptible to infection with the cytopathic orthopox virus, ectromelia [13]. Despite this, granzyme A-deficient mice are capable of a normal response to the noncytopathic lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and to the intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes, and they can eradicate several syngeneic tumors with kinetics similar to wild-type littermates.

Substrate specificity and inhibitors of granzymes

Granzymes have very specific substrate preferences, consistent with their role as processing, rather than degradative, enzymes. Digestive proteases, such as trypsin, chymotrypsin and elastase, have a very broad range of substrates, and the amino-acid context of the P1 residue of substrates is far less critical than for granzymes, for which up to five residues neighboring the P1 position may influence recognition and cleavage. Clear substrate preferences have been identified for granzymes A and D and tryptase-2 (all of these are tryptases these are often defined by their ability to cleave Na-CBZ-L-lysine thiobenzyl ester) and for granzyme B (an 'Asp-ase', cleaving at aspartic acid and possibly glutamic acid), granzyme M (also known as 'Met-ase' and cleaving at methionine) and granzyme H (a chymase). Granzyme B is the only mammalian serine protease that prefers acidic side chains [14], a finding of relevance for its role as a pro-apoptotic enzyme as it allows cleavage of Bid and the pro-caspases.

Various synthetic compounds, including peptide thiobenzyl ester, 7-amino-4-methylcoumarin and paranitroanilide (pNA) derivatives, have been tested to determine optimal substrates and cleavage conditions for granzymes. The optimal paranitroanilide substrates are D-Pro-Phe-Arg-pNA for mouse granzyme A and tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA for human granzyme A. Both mouse and human granzymes A are inhibited by serine protease inhibitors such as di-isopropylfluorophosphate, phenylmethylsulfonylfluoride, bezamidine, aprotinin, leupeptin and soybean trypsin inhibitor. In addition, granzyme A of both species can be blocked by a number of physiological inhibitors, such as α2-macroglobulin, antithrombin III and C1 esterase inhibitor, which may protect surrounding tissues from bystander damage following degranulation [15]. Many granzyme A inhibitors inhibit granzyme B only marginally. In one extensive study, the best inhibitor identified was human α1-protease inhibitor, which produced 85% inhibition when used at 10 μg/ml [14].

Granzyme serpins

It has recently become clear that cytotoxic lymphocytes synthesize their own inhibitors (serpins) that act in the cytosol to bind and neutralize mis-sorted or mis-packaged granzymes. Serpin PI-9, expressed in CTLs and NK cells, has glutamic acid as its P1 residue, and this choice (over aspartic acid) influences its capacity to inhibit granzyme B specifically. Bird and colleagues [16] showed that mutating the P1 residue to aspartic acid resulted in poor complex formation with granzyme B, and that the mutated molecule became capable of inhibiting caspases, unlike wild-type PI-9. Kinetic studies indicate that substituting aspartic acid for glutamic acid results in the mutated PI-9 molecule becoming a far better substrate for granzyme B, with a much faster off rate. As serpins act as pseudosubstrates and exert their inhibitory effects by irreversibly binding the protease following cleavage of their inhibitory loop, replacement of aspartic acid with glutamic acid paradoxically results in poor complex formation and poor inhibition. In cells, PI-9 is absent from cytotoxic granules but present in high concentrations in the cytosol. It can therefore block potentially toxic granzyme B molecules that leak out of CTL granules, without inhibiting caspase-dependent death of the CTL occurring through the Fas pathway [16]. Many new intracellular serpins have recently been described, and it is possible that CTLs and NK cells protect themselves with serpins specific for each of their granzymes.


Nitrogen-15 NMR spectroscopy of the catalytic-triad histidine of a serine protease in peptide boronic acid inhibitor complexes

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