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Was bestimmt die Reversibilität der Zelle der G0-Phase im Zellzyklus?

Was bestimmt die Reversibilität der Zelle der G0-Phase im Zellzyklus?


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Von Weinbergs Die Biologie des Krebses: Eine kürzlich durch Mitose gebildete Zelle muss sich entscheiden, ob sie erneut eine neue Runde des aktiven Wachstums und der Teilung einleitet oder sich in den Nicht-Wachstumszustand G0 zurückzieht. Diese Entscheidung wird stark von mitogenen Wachstumsfaktoren in der Zellumgebung beeinflusst. Ihr Fehlen oder Vorhandensein von anti-mitogenen Wachstumsfaktoren wird die Standardentscheidung auslösen, von der Mitose in den G0-Ruhezustand überzugehen. Der Rückzug aus dem Zellzyklus in G0 ist oft reversibel (die Zelle kann wieder in aktives Wachstum und Teilung eintreten), jedoch verlassen einige Zellen den Zellzyklus irreversibel (z. B. Neuronen).

Hier kommt meine Frage: Was bestimmt in der Zelle, ob die Zelle in den reversiblen (Ruhe) oder irreversiblen (seneszenten) Zustand von G0 geht? Ich habe festgestellt, dass es etwas mit der RNA-Menge zu tun hat (geringer RNA-Gehalt reversibel), aber ich verstehe nicht, warum ein niedriger RNA-Gehalt bedeutet, dass sich die Zelle wieder vermehren sollte. Und gibt es noch andere Kriterien, die bestimmen, ob die Zelle in den Ruhezustand oder in den irreversiblen Zustand übergeht? (Ich suche nach genauen Molekülen und Mechanismen, je detaillierter, desto besser!)


Die Antwort ist ziemlich kompliziert. Eines der Hauptprobleme beim Verständnis der Faktoren, die die Seneszenz gegenüber der Stille antreiben, war das Fehlen einer klaren, einheitlichen molekularen Definition von Seneszenz. Allerdings können mehrere Tumorsuppressoren, einschließlich p16 (und der anderen Gene, die den INK/ARF-Locus besetzen) sowie TP53 die Expression von Seneszenz-assoziierten Transkriptionsprogrammen modulieren.

Darüber hinaus ist auch die epigenetische Remodellierung, einschließlich der Heterochromatinisierung an E2F-Zielgenen (die ein Haupttreiber der Zellzyklusprogression durch die S phas sind) bekannt, ein Merkmal der Seneszenz.

Ein sehr guter Ausgangspunkt für einen Überblick über die Literatur zum Thema ist https://www.nature.com/articles/nrc3960?message-global=remove


Was bestimmt die Reversibilität der Zelle der G0-Phase im Zellzyklus? - Biologie

Der Pregnane-X-Rezeptor (PXR) ist ein wichtiger Transkriptionsregulator, der eine wichtige Rolle im Zellstoffwechsel und Zellwachstum spielt, indem er die Transkription einer Art metabolisierender Enzyme reguliert.

Zielsetzung

Es sollte untersucht werden, ob Rifampicin das Wachstum von HepG2-Zellen beeinflusst und die Hemmung auf den G0/G1-Phasenstopp zurückzuführen ist.

Methoden

PXR-Knockdown-Experimente unter Verwendung von RNAi zeigten, dass die durch Rifampicin vermittelte Zellzyklusphase aufgrund der Aktivierung von PXR anhält. Die Ergebnisse zeigten auch, dass der Zellphasenarrest durch Rifampicin Zellen vor UVB-induzierten DNA-Schäden schützen könnte. Das Expressionsniveau des Retinoid-X-Rezeptor-Alpha (RXRα) in Zellen ist ein weiterer Schlüsselfaktor für den durch Rifampicin vermittelten Stillstand der Zellzyklusphase. Sowohl die Überexpression als auch die fehlende Expression von RXR&agr; in der Zelle verringerten die durch Rifampicin vermittelte Zellarrest-Effizienz. In der Studie fanden wir, dass Rifampicin das Wachstum von HepG2-Zellen hemmte und zeigten, dass die Hemmung auf den G0/G1-Phasenstillstand durch Durchflusszytometrie-Analyse zurückzuführen ist.

Abschluss

Die Ergebnisse zeigten, dass RXRα die Zellzyklusphasen-Übergangsrate von HepG2 fördert. Die kompetitive Bindung von Rifampicin-aktiviertem PXR mit RXRα ist ein Hauptgrund, die Zellzyklusphase durch Hemmung der Kombination von RXRα mit anderen Partnern zu stoppen. Rifampicin könnte die Zellwachstumsrate fördern, wenn RXRα in Zellen übermäßig exprimiert als PXR.


Einführung

Die Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2)/Angiotensin-(1-7)/Mas-Achse ist ein wohlbekannter Gegenregulationsweg im Renin-Angiotensin-System (RAS) 1 . In dieser Achse wird Angiotensin-(1-7) aus Angiotensin I oder Angiotensin II über die katalytische Aktivität von ACE2, einem ACE-Homolog, hergestellt, und die humanen Plasmakonzentrationen von immunreaktivem Angiotensin-(1-7) werden mit 1,0– 9,5 pmol/l 2 . Es gibt zahlreiche Beweise für die endotheliale Schutzwirkung der ACE2/Angiotensin-(1-7)/Mas-Rezeptor-Achse. Diese Achse ist ein kürzlich entdeckter Signalweg, der die Wirkungen von Angiotensin II in einer Reihe von Geweben umkehren kann, hauptsächlich durch Hemmung des Zellwachstums, der Migration und Entzündung, die als Folge der Angiotensin-II-Aktivität auftreten, wodurch ein nachteiliger Umbau und die nachfolgende Dysfunktion des Herz-Kreislauf-System 1,3,4,5,6,7 . Eine chronische Angiotensin-(1-7)-Infusion wurde auch angezeigt, um die Nierenendothelfunktion durch Erhöhung des endogenen Stickstoffmonoxids bei Apolipoprotein E-defizienten Mäusen zu verbessern 8 . Im Gegensatz dazu verursacht der Knockout des Angiotensin-(1-7)-Mas-Rezeptors eine endotheliale Dysfunktion bei C57Bl/6-Mäusen 9 . Kürzlich berichteten wir auch, dass eine Behandlung mit Angiotensin-(1-7) die durch glykiertes Albumin induzierte endotheliale Interleukin-6-Produktion signifikant abschwächen könnte 10 . Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Amplifikation von ACE2/Angiotensin-(1-7)/Mas einen Schutz gegen die Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion bietet. Der dominante Einfluss einer akuten Angiotensin-(1-7)-Behandlung auf Endothelzellen bleibt jedoch unklar.

Die quantitative Proteomik ist ein wichtiger Zweig der Proteomik, der verwendet wird, um alle Proteine ​​zu quantifizieren und zu identifizieren, die von einem Genom oder in einem komplexen Gemisch exprimiert werden. Isobare Tags für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) wurden 2004 von Ross . entwickelt et al. Dieser einzigartige Ansatz markiert Proben mit vier unabhängigen isobaren Tags mit derselben Masse und nach Fragmentierung in der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) produziert die Technik vier einzigartige Reporterionen (m/z von 114 bis 117), die quantitative Informationen basierend auf die Integration der Peakflächen der vier verschiedenen Proben 11 . Die fortschrittliche Kombination von Proteomik und Bioinformatik bietet eine bequeme Möglichkeit, primäre Veränderungen im globalen Proteom zu untersuchen, wie beispielsweise die molekularen Expressionsniveaus in Zellen zu jedem Zeitpunkt oder für jede Behandlung. Mit der Entwicklung der Bioinformatik gibt es weitere Studien, die gelfreie quantitative proteomische Plattformen verwenden, um die variablen und komplexen physiologischen Prozesse zu untersuchen 12,13,14 .

Cofilin-1 ist ein 19-kDa-Protein, das in Eukaryoten ubiquitär vorhanden ist und die Aktinfilamentdynamik während der Motilität, Entwicklung und Zytokinese fördert 15 . Cofilin-1 ist ein Mitglied der ADF/Cofilin-Familie. Diese Familie besteht aus drei Mitgliedern: Cofilin-1 (CFL1, Nicht-Muskel-Cofilin), Cofilin-2 (CFL2, Muskel-Cofilin) ​​und ADF (Destrin) 16 . Cofilin-1 ist das Hauptprotein, und seine Regulation wird mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht 17,18,19 . Im Jahr 2013, Yang et al. schlugen auch vor, dass Cofilin-1 ein neuer Biomarker für die schlechte Prognose von Gallenblasenkrebs ist 20 . Ob die Expressionsniveaus von Cofilin-1 jedoch für die Regulation des Zellzyklus und der Autophagieprogression in humanen Aorten-Endothelzellen (HAECs) wichtig sind, ist noch unklar.

Wir verwendeten die iTRAQ-Analyse, um die Proteinexpression von HAECs als Reaktion auf die Behandlung mit Angiotensin-(1-7) für 6 Stunden quantitativ zu profilieren. Das Protein Cofilin-1 wurde aus der duplizierten iTRAQ-Analyse als einzigartiger Kandidat identifiziert, der eine höhere Abdeckung (>30%) und eine konsistente Überexpression (>1,2-fach) in Angiotensin-(1-7)-behandelten Endothelzellen zeigte als in den unbehandelte Zellen. Basierend auf einer Reihe molekularbiologischer Validierungen wurde Cofilin-1 erstmals als Regulator von Zellzyklusarrest, Autophagie und Apoptose in HAECs identifiziert. Diese Studie verbessert unser Verständnis der Rolle von Cofilin-1 bei der HAEC-Homöostase unter der ACE2/Angiotensin-(1-7)/Mas-Achse.


Simvastatin-induzierter Zellzyklusarrest durch Hemmung der STAT3/SKP2-Achse und Aktivierung von AMPK zur Förderung der p27- und p21-Akkumulation in hepatozellulären Karzinomzellen

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zeichnet sich durch eine schlechte Prognose aus und ist weltweit eine der führenden krebsbedingten Todesursachen. Simvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der die Cholesterinsynthese durch Hemmung des Mevalonat-Wegs verringert und weit verbreitet zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt wird. Simvastatin zeigt krebshemmende Wirkungen gegen mehrere bösartige Erkrankungen. Die molekularen Mechanismen, die den krebshemmenden Wirkungen von Simvastatin auf HCC zugrunde liegen, sind jedoch noch nicht gut verstanden. In dieser Studie zeigten wir einen Simvastatin-induzierten G0/G1-Arrest durch Induktion der p21- und p27-Akkumulation in HepG2- und Hep3B-Zellen. Simvastatin förderte auch die Aktivierung der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), die durch Erhöhung der Transkription eine Hochregulierung von p21 induziert. In Übereinstimmung mit diesem Befund fanden wir, dass die genetische Abschaltung von AMPK die p21-Expression reduzierte, jedoch hatte die AMPK-Abschaltung keine Wirkung auf die p27-Expression in HCC-Zellen. Simvastatin verringerte die Skp2-Expression auf transkriptioneller Ebene, was zu einer Akkumulation von p27 führte, indem es den proteasomalen Abbau verhinderte, ein Effekt, der durch einen Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3)-Hemmung vermittelt wird. Die konstitutive STAT3-Aktivierung hielt eine hohe Skp2-Expression und eine niedrigere p27-Expression aufrecht und verhinderte signifikant den G0/G1-Arrest in Simvastatin-behandelten HCC-Zellen. Mevalonat verringerte die Simvastatin-induzierte AMPK-Aktivierung und rettete die Phospho-STAT3- und Skp2-Expression in HCC-Zellen, was zur Verhinderung des G0/G1-Arrests durch Hemmung der p21- und p27-Akkumulation führte. Darüber hinaus verringerte Simvastatin das Tumorwachstum bei HepG2-Xenograft-Mäusen signifikant. Übereinstimmend fanden wir, dass Simvastatin auch die p21- und p27-Expression in Tumorschnitten erhöht, indem es die Skp2-Expression reduziert und die AMPK-Aktivierung und STAT3-Suppression in denselben Tumorgeweben induziert. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse die Existenz eines neuen Signalwegs, bei dem Simvastatin den G0/G1-Arrest durch Hochregulieren von p21 und p27 durch Aktivierung von AMPK bzw. Hemmung der STAT3-Skp2-Achse induziert. Die Ergebnisse identifizieren neue Targets, die die vorteilhaften Antikrebswirkungen der Simvastatin-Behandlung auf HCC in vitro und in vivo erklären.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Figuren

Simvastatin induziert p21- und p27-abhängige…

Simvastatin induziert einen p21- und p27-abhängigen G0/G1-Zellzyklusarrest in HCC-Zelllinien.…

Simvastatin-induziertes p21- und p27-Protein…

Die Simvastatin-induzierte Hochregulierung der p21- und p27-Proteine ​​war mit einer Transkriptionsaktivierung und Protein…

Simvastatin-induzierte AMPK-Aktivierung und p21…

Simvastatin-induzierte AMPK-Aktivierung und p21-Hochregulation induzierten teilweise G0/G1-Arrest in HepG2-Zellen.…

Die Simvastatin-induzierte p27-Hochregulierung war Skp2-abhängig…

Die Simvastatin-induzierte p27-Hochregulierung war Skp2-abhängig und förderte den Zellzyklusarrest in der G0/G1-Phase in…

STAT3C-Mutanten behielten die Skp2-Expression bei…

STAT3C-Mutanten behielten die Skp2-Expression bei, um die Akkumulation von p27 und den G0/G1-Zellzyklus zu verhindern…

Exogenes Mevalonat unterdrückte die inhibitorische…

Exogenes Mevalonat unterdrückte die hemmende Wirkung von Simvastatin auf das Zellwachstum, indem es…

Simvastatin hemmte das HepG2-Tumorwachstum…

Simvastatin hemmte das HepG2-Tumorwachstum bei Xenotransplantat-Mäusen. HepG2-Tumor tragende BALB/c-Nacktmäuse…


Zellzyklus bei Krebs

Der Zellzyklus, der Prozess, durch den Zellen fortschreiten und sich teilen, ist das Herzstück von Krebs. In normalen Zellen wird der Zellzyklus durch eine komplexe Reihe von Signalwegen gesteuert, durch die eine Zelle wächst, ihre DNA repliziert und sich teilt. Dieser Prozess beinhaltet auch Mechanismen, um sicherzustellen, dass Fehler korrigiert werden, und wenn nicht, begehen die Zellen Selbstmord (Apoptose). Bei Krebs kommt es aufgrund genetischer Mutationen zu einer Fehlfunktion dieses Regulationsprozesses, was zu einer unkontrollierten Zellproliferation führt.

Die Wirkstoffforschungs- und -entwicklungsprogramme von Cyclacel Pharmaceuticals bauen auf wissenschaftlichen Fortschritten beim Verständnis dieser molekularen Mechanismen auf. Durch unsere Expertise entwickeln wir zellzyklusbasierte, mechanismusgerichtete Krebstherapien, die den natürlichen Prozess des Körpers nachahmen, um das Wachstum von Krebszellen zu stoppen. Dieser Ansatz kann die Schädigung normaler Zellen und die begleitenden Nebenwirkungen, die durch konventionelle Chemotherapeutika verursacht werden, begrenzen.

Die Professoren Sir David Lane und David Glover, zwei unserer wichtigsten Wissenschaftler, haben sich eine führende Position in der Entdeckung und Entwicklung von Zellzyklus-Medikamenten erarbeitet. Sir David entdeckte das p53-Protein, ein wichtiges regulatorisches Gen, das bei etwa zwei Dritteln der Krebspatienten Fehlfunktionen aufweist. David Glover entdeckte mehrere Gene (Aurora- und Polo-Kinasen), die die Mitose antreiben und die in mutierter Form mit vielen Krebsarten in Verbindung gebracht werden.

Die Zellzyklus-Biologie

  1. die G1- oder Gap-Phase, in der die Zelle wächst und sich darauf vorbereitet, DNA zu synthetisieren
  2. die S- oder Synthesephase, in der die Zelle DNA synthetisiert
  3. die G2- oder zweite Lückenphase, in der sich die Zelle auf die Teilung vorbereitet und
  4. die M- oder Mitosephase, in der die Zellteilung stattfindet.

Ein zweiter solcher Kontrollpunkt tritt in der G2-Phase nach der DNA-Synthese in der S-Phase, aber vor der Zellteilung in der M-Phase auf. Zellen verwenden einen komplexen Satz von Enzymen, die Kinasen genannt werden, um verschiedene Schritte im Zellzyklus zu steuern. Cyclin-abhängige Kinasen oder CDKs sind eine spezifische Enzymfamilie, die Signale verwenden, um Zellzyklusmechanismen einzuschalten. CDKs selbst werden aktiviert, indem sie Komplexe mit Cyclinen bilden, einer anderen Gruppe von regulatorischen Proteinen, die nur für kurze Zeit im Zellzyklus vorhanden sind. Wenn sie richtig funktionieren, wirken zellzyklusregulierende Proteine ​​als körpereigene Tumorsuppressoren, indem sie das Zellwachstum kontrollieren und den Tod geschädigter Zellen induzieren. Genetische Mutationen, die die Fehlfunktion oder das Fehlen eines oder mehrerer der regulatorischen Proteine ​​an Zellzyklus-Checkpoints verursachen, können dazu führen, dass der "molekulare Schalter" dauerhaft eingeschaltet wird, was eine unkontrollierte Vermehrung der Zelle ermöglicht, was zu Karzinogenese oder Tumorentwicklung führt.


Diskussion

iPS-Zellen bieten eine einzigartige Plattform zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Pluripotenz und der nuklearen Reprogrammierung. Im Vergleich zu Mauszellen ist die Reprogrammierung menschlicher Körperzellen jedoch zeitaufwändiger und weniger effizient. Obwohl allgemein bekannt ist, dass der Reprogrammierungsprozess epigenetische und metabolische Remodellierung beinhalten würde, bleibt die der Reprogrammierung zugrunde liegende molekulare Regulation noch weitgehend mysteriös [30].

Kürzlich wurde von mehreren kleinen Molekülen berichtet, die die Reprogrammierung verstärken oder Reprogrammierungsfaktoren ersetzen. Diese Chemikalien üben durch epigenetische Modifikationen oder Signalübertragungswege positive Effekte aus. Dennoch ist es notwendig, auch die Nebenwirkungen rigoros zu testen. Einige durch Chemikalien erzeugte Modifikationen können zu genetischen Aberrationen und genetischer Dysregulation führen [31].

Die Zellteilung ist ein Schlüsselparameter, um die epigenetische Reprogrammierung zur Pluripotenz voranzutreiben. Die Hemmung des P53/P21-Signalwegs oder die Überexpression von Lin28 erhöht die Zellteilungsrate und beschleunigt die Kinetik der iPSC-Bildung [32]. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat gezeigt, dass eine hohe Proliferationsrate ein frühes Ereignis bei der Reprogrammierung ist, während der Zellzyklusarrest durch p15, p16 oder p21 die Retrovirus-induzierte Reprogrammierung hemmt [33]. Eine beschleunigte Zellteilung könnte die Zahl der Zielzellen erhöhen, bei denen jede Tochterzelle eine unabhängige Wahrscheinlichkeit hat, ein iPSC zu werden, oder die DNA-Replikation könnte die Voraussetzung dafür sein, dass epigenetische Veränderungen, wie Histonmodifikationen, die Übergänge zur Pluripotenz ermöglichen [30 ]. Diese Studien lieferten überzeugende Beweise dafür, dass molekulare Ereignisse im frühen Zellzyklus während der Reprogrammierung eine Schlüsselrolle beim Erreichen von Pluripotenz spielen können.

Es ist bekannt, dass eine effiziente Transduktion von Reprogrammierungsfaktoren für die Pluripotenz essentiell ist. Unter Verwendung eines Dox-induzierbaren transgenen Systems wurde gezeigt, dass der Reprogrammierungsprozess 10–12 Tage anhaltende Transgenexpression erfordert, um Pluripotenzmarker zu aktivieren [34]. Eine unzureichende Infektion mit partiellen Faktoren, beispielsweise nur mit Oct4 und c-Myc, führt in der Regel zu einer partiellen Reprogrammierung [11]. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Synchronisation einen reversiblen Zellzyklusarrest bei G0/G1 erzeugt und einen koinzidenten Zellzyklusrhythmus erreicht, der die Infektionseffizienz erhöht. Basierend auf diesem Protokoll verbesserten wir die Reprogrammierungseffizienz signifikant auf 1,4 % in HDF und 2,6 % in ASC (Nanog-positive Klone, Abbildung 3F, Tabelle S1). Diese Synchronisationsstrategie kann auch verwendet werden, um die Retrovirus-vermittelte Transgenexpression in anderen Forschungskontexten zu fördern.

Während des Reprogrammierungsprozesses durchlaufen die Zielzellen eine dramatische morphologische Veränderung von einem mesenchymalen Phänotyp zu einem ES-ähnlichen epithelialen Merkmal [35]. MET gilt auch als Kennzeichen der Initialphase und als notwendig für die Reprogrammierung [29] [36]. Es wird darauf hingewiesen, dass die BMP-Signalgebung mit OSKM synergetisch wirkt, um MET zu fördern [37]. Interessanterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass synchronisierte HDF und ASC nach der Infektion eine einheitliche MET aufwiesen und die somatische Reprogrammierung des Menschen erleichterten. Eine mögliche Interpretation ist, dass synchronisierte Zellen (vor der G2/M-Phase) dazu neigen, durch Retroviren infiziert zu werden, was zu einer effizienteren Expression von Transgenen führt. Darüber hinaus schafft die Synchronisation die Möglichkeit einer gleichzeitigen Infektion in den meisten Zellen, gefolgt von einer synchronisierten Expression von Reprogrammierungsfaktoren in einzelnen Zellen. Schließlich kann eine bestimmte auto- oder interzelluläre Regulation nach synchronisierter Expression von Transgenen eine homologe MET auslösen und zu Pluripotenz führen.

Es ist schwierig, vollständige und partielle Reprogrammierung anhand der Zellmorphologie zu unterscheiden, da die partiellen Klone viel zahlreicher sind als die ES-ähnlichen. Es wurde berichtet, dass die Reprogrammierung ein stochastischer Prozess ist und die meisten infizierten Zellen aufgrund der Unfähigkeit, die epigenetische Barriere zu überwinden, in einem teilweise reprogrammierten Zustand gefangen waren [4]. Daher ist eine detaillierte Untersuchung des transkriptionellen und epigenetischen Resets unerlässlich, um eine partielle Reprogrammierung auszuschließen. In somatischen Zellen sind die Promotoren von Oct4 und Nanog stark methyliert, was eine Repression auf Transkriptionsebene widerspiegelt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass synchronisierte HDF- und ASC-abgeleitete iPSCs eine hohe Demethylierung in den Oct4- und Nanog-Promotorregionen zeigten.

Da humane iPSC der ESC ähnlich sind, wählten wir ESC-abgeleitete EB als Kontrolle, um die Differenzierungsfähigkeit von iPSC zu testen, wie zuvor beschrieben [7], [38]. Wir fanden heraus, dass die Expression von Pax6 und Sox17 (außer in GATA6) geringer war als die von ES-EB, obwohl alle ausgewählten iPSC-Linien in unserer Studie Teratome erzeugen können, einen Goldstandard für Pluripotenz [39]. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Schlussfolgerungen überein, dass humane iPSC ähnlich, aber nicht identisch mit ESC ist [1]. Es ist auch akzeptabel, dass iPSC dazu neigen, in die abgeleiteten Spenderzellen umzudifferenzieren [40], [41], wie in unseren Ergebnissen (Abbildung 5 B) gezeigt wurde, wurde eine relativ höhere GATA6-Expression nachgewiesen. Frühere Ergebnisse haben auch die ungleichen Expressionsniveaus in verschiedenen iPSC-Linien nach Differenzierung gezeigt [7], [38], [42].

Zusammenfassend liefern unsere Ergebnisse einen direkten Beweis dafür, dass die Zellzyklussynchronisation die MET- und Reprogrammierungseffizienz stark fördert, ohne dass zusätzliche Chemikalien erforderlich sind. Unsere Ergebnisse bieten neue Einblicke in den Prozess der Reprogrammierung und werden für die effiziente Generierung krankheitsspezifischer iPSCs von Nutzen sein.


Ergebnisse

Überexpression von MPS-1 wird in den transfizierten UMSCC-1-Tumorzellen und dem konditionierten Medium nachgewiesen

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von MPS-1 das Tumorzellwachstum beeinflussen kann, wurden im ersten Schritt die UMSCC-1-Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomzellen mit einem der beiden Plasmide transfiziert, die die cDNA für MPS-1 enthalten, die mit His(6) an C . markiert ist -terminal oder das Kontrollplasmid. Nach mehreren Zellsortierungen durch Durchflusszytometrie exprimierten mehr als 95 % der Zellen EGFP. Die Zelllysate wurden durch Western-Blotting analysiert, was bestätigte, dass das MPS-1-Protein in UMSCC-1/MPS-1-Zellen im Vergleich zu UMSCC-1/Kontrollzellen stark exprimiert wurde (Abb. 1 .).ein). Um die subzelluläre Position von MPS-1 zu bestimmen, überprüften wir das Vorhandensein von MPS-1 bei der Zytosolextraktion und der Kernextraktion. Dabei zeigte sich, dass MPS-1 nicht nur ein zytosolisches Protein, sondern auch ein nukleäres Protein ist (Abb. 1 .).B). Darüber hinaus zeigte eine Dot-Blotting-Analyse des konditionierten Mediums aus den kultivierten Zellen, dass MPS-1-Protein mit His-Tag in das konditionierte Medium aus UMSCC-1/MPS-1-Zellkultur sezerniert wurde ( 1C), was mit unseren früheren Ergebnissen übereinstimmt, dass MPS-1 im Serum von Patienten mit HNSCC quantitativ nachgewiesen werden konnte. 14

Exogenes MPS-1-Protein ist sowohl in den UMSCC-1-Zellen als auch in den konditionierten Medien vorhanden. (ein) MPS-1-transfizierte (M) Zellen exprimieren das Protein in Zelllysaten. Western-Blots wurden mit einem monoklonalen Anti-His-Antikörper sondiert, der His-markiertes MPS-1-Protein (~10 kDa) erkennt. MPS-1-Protein mit His-Tag wurde nur in UMSCC-1/MPS-1-Zellen (M) und nicht in UMSCC-1/Kontrollzellen (C) nachgewiesen. β-Actin wurde als Proteinbeladungskontrolle verwendet. (B) MPS-1 befindet sich nicht nur im Zytosol, sondern auch im Zellkern. (C) Dot-Blotting unter Verwendung des gleichen Anti-His-Antikörpers zeigte, dass His-markiertes MPS-1 in den konditionierten Medien von UMSCC-1/MPS-1-Zellen (M) nachgewiesen wurde, jedoch nicht in den Kontrollzellen (C). [Farbabbildung kann in der Online-Ausgabe eingesehen werden, die unter www.interscience.wiley.com verfügbar ist.]

Erhöhte Expression von MPS-1 hemmt das Wachstum von Tumorzellen in vitro und in vivo

Um die Wirkung der erhöhten Expression von MPS-1 auf das Wachstum von HNSCC-Zellen zu testen, führten wir in vitro Zellwachstumsassay. Wie in Abb. 2 gezeigteinwurde das Wachstum von UMSCC-1-Zellen, die MPS-1 in hohem Maße exprimieren, im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant gehemmt (P < 0,01).

Ein hoher MPS-1-Proteinspiegel hemmt das Wachstum von UMSCC-1-Zellen in vitro und in vivo. (ein) kontrolltransfizierte (♦) oder MPS-1-transfizierte ( ▪) Zellen (1 × 10 4 Zellen/ml) wurden in 12-Well-Platten ausplattiert und an 4 aufeinanderfolgenden Tagen gezählt (*P < 0,01). Riegel, SD. (B) 2 × 10 6 Zellen wurden männlichen Nacktmäusen subkutan in die linke Flanke injiziert, die Tumorgröße wurde jede Woche gemessen und das Tumorvolumen wurde berechnet. (*P < 0,01 für Kontrolle gegen MPS-1). Riegel, SD. (C) wurden bei der Tötung repräsentative Tumoren bei den Mäusen gezeigt (Pfeil, Tumor). (D) Nach der Tötung wurden die Tumoren geerntet und gewogen. Säulen, mittleres Tumorgewicht Riegel, SD. (*P = 0,016. C: Kontrolle M: ​​MPS-1). [Farbabbildung kann in der Online-Ausgabe eingesehen werden, die unter www.interscience.wiley.com verfügbar ist.]

Um zu bestimmen, ob hohe MPS-1-Spiegel auch das Tumorwachstum hemmen in vivo, 2 Tierversuche wurden durchgeführt. In einem Experiment, 42 Tage nach Injektion von UMSCC-1/MPS-1-Zellen in die linke Flanke von Nacktmäusen, bildete keine der Mäuse Tumoren an der Injektionsstelle (0 von 6 Mäusen bildete einen Tumor). Im Gegensatz dazu entwickelten alle Mäuse (6 Mäuse), die eine Impfung mit UMSCC-1/Kontrollzellen erhielten, Tumoren. Bei einer Wiederholung des gleichen Experiments entwickelten alle Mäuse (6 Mäuse), denen UMSCC-1/MPS-1-Zellen injiziert worden waren, Tumore, jedoch war der Beginn der Tumorentwicklung im Vergleich zu UMSCC-1/Kontrollzellen verzögert (Anfallzeit: 28 Tage für UMSCC-1/MPS-1-Zellen vs. 14 Tage für UMSCC-1/Kontrollzellen). Die Überwachung des Tumorvolumens zeigte, dass UMSCC-1/Kontrollzellen schneller wuchsen als UMSCC-1/MPS-1-Zellen in vivo (P < 0,01) (Abb. 2B). Nach der Tötung am 47. Tag betrugen die mittleren Gewichte der Primärtumore 0,17 g (n = 6) bzw. 0,68 g (n = 4) für UMSCC-1/MPS-1 bzw. UMSCC-1/Kontrolltumore (P = 0,016) (Abb. 2C und D). Zusammenfassend zeigten diese Daten eindeutig, dass MPS-1 auf hohem Niveau ein starker Inhibitor des HNSCC-Zellwachstums sowohl in vitro und in vivo.

Erhöhte Expression von MPS-1 beeinträchtigt die Proliferationsrate von Tumorzellen

Nachdem wir festgestellt hatten, dass die MPS-1-Überexpression den Beginn der HSNCC-Tumorbildung verzögern und das Tumorzellwachstum bei Mäusen verlangsamen kann, wollten wir herausfinden, wie ihre Anwesenheit das Tumorwachstum verändert. MPS-1-Protein enthält 1 Zinkfingerdomäne des C4 Typ und ein auf zyklisches Adenosinmonophosphat reagierendes Element, daher könnte es an der DNA-Reparatur und der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt sein. 22, 23 Um die Wirkung der MPS-1-Überexpression in der Zellzykluskontrolle in HNSCC UMSCC-1-Zellen zu untersuchen, führten wir eine DNA-Zellzyklusanalyse durch Propidiumiodid-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse an kultivierten Zellen durch. Es zeigte sich, dass die Überexpression von MPS-1 einen Zellzyklusstillstand verursachte, wie durch die erhöhte Anzahl von Zellen in der G0/G1-Phase angezeigt (UMSCC-1/Kontrolle: 42,76 % vs. UMSCC-1/MSP-1: 51,37%) während verringerte Zellzahl in der S-Phase (UMSCC-1/Kontrolle: 28,42%) vs. UMSCC-1/MPS-1: 19,12%). Die Zellzyklusanalyse zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Anzahl apoptotischer Zellen in der Sub-GO-Phase (Abb. 3ein). Wir haben die Tumorschnitte weiter für Ki-67 immungefärbt, einen Proliferationsmarker, der in allen aktiven Phasen des Zellzyklus vorhanden ist (G1, S, G2 und Mitose), aber in ruhenden (G0)-Zellen nicht vorhanden. Unsere Daten zeigten, dass 18,73 ± 6,23 % der UMSCC-1/Kontroll-Tumorzellkerne Ki-67 positiv gefärbt waren, während nur 5,13 ± 2,94 % der UMSCC-1/MPS-1-Tumorzellkerne Ki-67-positiv waren (P = 0,0003) (Abb. 3B und C). Darüber hinaus überprüften wir die apoptotischen Tumorzellen durch TUNEL-Färbung auf Tumorschnitten und fanden heraus, dass nur sehr wenige Zellen TUNEL-positiv waren, entweder für UMSCC-1/Kontroll- oder UMSCC-1/MPS-1-Tumoren (Abb. 3 .).D). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die Überexpression des MPS-1-Proteins in UMSCC-1-Zellen eher zu einem Zellwachstumsstopp als zur Apoptose führt und die Tumorzellproliferationsrate unterdrückt, was zumindest teilweise zu dem sowohl beobachteten beeinträchtigten Tumorzellwachstum beiträgt in vivo und in vitro.

Die Überexpression von MPS-1 reduziert die Tumorzellproliferation. (ein) DNA-Zellzyklus-Assay wurde durch Propidiumiodid-Färbung und Durchflusszytometrie durchgeführt. (B) Kerne wurden mit Antikörper gegen humanes Ki-67 (ursprüngliche Vergrößerung × 100) braun gefärbt (Pfeile). (C) Prozentsatz der mit Ki-67-Antikörper positiv gefärbten Kerne. Säulen, durchschnittlicher Prozentsatz von Ki-67-positiven Kernen in 5 mikroskopischen Feldern Riegel, SD. (*P = 0,0003. C: Kontrolle M: ​​MPS-1). (D) Apoptose-Assay an Tumorgeweben durch TUNEL-Färbung (ursprüngliche Vergrößerung × 100). Nur wenige Zellen sind sowohl in Kontroll- als auch in MPS-1-Tumoren positiv gefärbt. Der positive Kontrollobjektträger wurde vor der Färbung mit DNase I behandelt.

Das gehemmte, von UMSCC-1/MPS-1 gebildete Tumorwachstum steht im Zusammenhang mit der Unterdrückung der Tumorangiogenese

Es wurde gezeigt, dass die Tumorangiogenese ein Hauptfaktor für das Wachstum von Tumoren ist 24, daher entschieden wir uns zu untersuchen, ob die Hemmung des Wachstums von Tumoren, die von UMSCC-1/MPS-1-Zellen gebildet werden, mit der veränderten Tumorangiogenese zusammenhängt. Wir bestimmten die mittlere Mikrogefäßdichte durch Zählen der Tumormikrogefäße, die positiv durch CD34-Antikörper gefärbt wurden, in 5 nicht überlappenden Bereichen auf jedem Tumorabschnitt. Unsere Daten zeigten, dass Tumoren, die von UMSCC-1/MPS-1-Zellen gebildet wurden, eine geringere mittlere Mikrogefäßdichte (24,5 ± 6,7/Feld) aufwiesen als die von UMSCC-1/Kontrollzellen (69,2 ± 16,4/Feld) (P = 0,0003) (Abb. 4ein und B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Unterdrückung der Tumorangiogenese ein weiterer Faktor ist, der zum beeinträchtigten Wachstum von HNSCC-Tumorzellen beiträgt, die mehr MPS-1-Protein exprimieren.

Erhöhtes MPS-1 ist mit einer verringerten Mikrogefäßdichte verbunden. (ein) Tumor-Mikrogefäß wurde mit Antikörper gegen Maus-CD34 gefärbt (Pfeil, Mikrogefäß). (B) Anzahl der Schiffe wurde gezählt. Säulen, durchschnittliche Gefäßzahlen in 5 mikroskopischen Feldern (Originalvergrößerung × 100) Riegel, SD. (*P = 0,0003 für Kontrolltumore [C] vs. MPS-1-Tumoren [M]).

Erhöhte Expression von MPS-1 reduziert die Paxillin-Expression

Da MPS-1 eine Zinkfingerdomäne von C . enthält4 Typ und befindet sich im Zellkern, was darauf hindeutet, dass MPS-1 ein Protein sein könnte, das an der Regulation der Expression anderer Gene beteiligt ist. MPS-1-Zelllinie und 61–66 % in UMSCC-1/MPS-1-Tumoren. Um die Gen-Array-Ergebnisse auf Proteinebene zu bestätigen, wurde ein Western-Blotting durchgeführt und bestätigt, dass Paxillin-Protein, ein Gerüstprotein für lokale Adhäsion und Signalübertragung, sowie ein Molekül, das mit Zellwachstum und Angiogenese in Verbindung steht (siehe unten), signifikant weniger in sowohl UMSCC-1/MPS-1-Zelllinie als auch Tumoren als ihre jeweiligen Kontrollen (P = 0,003) (Abb. 5ein, B und C). Immunhistochemische Färbungen auf Tumorschnitten zeigten, dass das Paxillin-Protein hauptsächlich im Zytoplasma exprimiert wurde. Im Vergleich zur Kontrollgruppe exprimieren weniger Tumorzellen Paxillin-Protein und auch der Proteinspiegel war in der UMSCC-1/MPS-1-Gruppe niedriger (Abb. 5 .).D). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass MPS-1 die Paxillin-mRNA-Transkription und damit die Paxillin-Proteinexpression in Tumorzellen herunterreguliert.

Erhöhtes MPS-1 unterdrückt die Paxillin-Proteinexpression. (ein) Western-Blotting zeigte, dass die Expression des Paxillin-Proteins in der MPS-1-transfizierten UMSCC-1-Zelllinie (M) im Vergleich zur Kontrollzelllinie (C) unterdrückt war. (B) Die Paxillin-Proteinexpression war in den von UMSCC-1/MPS-1-Zellen gebildeten Tumoren geringer (C1, C2, C3: Tumoren von 3 Kontrollmäusen M1, M2, M3: Tumoren von 3 MPS-1-Mäusen). (C) Das Verhältnis der Intensität der Proteinbande von Paxillin zu β-Aktin durch Western-Blotting wurde mit Image J Software berechnet. Säulen, durchschnittliches Verhältnis Riegel, SD. (*P = 0,003 für Kontrolltumore vs. MPS-1-Tumoren). (D) Paxillin-Protein wurde mit monoklonalem Maus-Anti-Human-Paxillin-Antikörper gefärbt. Protein wurde in weniger Tumorzellen auf niedrigerem Niveau in der UMSCC-1/MPS-1-Gruppe exprimiert als in der Kontrollgruppe (repräsentative Bereiche wurden in Originalvergrößerung × 100 gezeigt).


Antiproliferative Aktivitäten anderer Mitglieder der C/EBP-Familie

Obwohl C/EBPα am intensivsten untersucht wurde, zeigen auch mehrere andere Familienmitglieder antiproliferative Aktivität.

C/EBPβ

Die erzwungene Expression von C/EBPβ in HepG2-Hepatokarzinomzellen stoppt die Zellen an oder nahe der G1-S-Grenze (Buck et al., 1994). Dieser Effekt erfordert sowohl die bZIP-Domäne als auch die N-terminalen Transaktivierungssequenzen und wird von der transkriptionell inerten LIP-Isoform nicht reproduziert. Darüber hinaus weisen C/EBPβ-Knockout-Mäuse eine lymphoproliferative Störung auf, was darauf hindeutet, dass C/EBPβ die Expansion des lymphoiden Zellkompartiments hemmt (Screpanti et al., 1995). Mehrere Beobachtungen weisen auch auf eine antiproliferative Funktion von C/EBPβ in epidermalen Keratinozyten hin: (1) Expression von C/EBPβ in BALB/MK2-Keratinozyten hemmt die Koloniebildung (2) Mäuse, denen C/EBPβ fehlt, zeigen eine leichte epidermale Hyperplasie und (3) Keratinozyten, die von C/EBPβ-Mutantenmäuse zeigen in vitro einen teilweise defekten Ca 2+ -induzierten Wachstumsstillstand (Zhu et al., 1999). Auch die Expression der Differenzierungsmarker Keratin 1 (K1) und K10 ist in diesen Zellen reduziert, was darauf hindeutet, dass C/EBPβ sowohl den Proliferationsarrest als auch differenzierungsspezifische Gene reguliert. Somit trägt C/EBP&bgr; zum Wachstumsstillstand und zur Differenzierung von Keratinozyten bei, was den dualen Funktionen von C/EBP&agr; in terminal differenzierenden Zellen ähnlich ist.

Die ektopische Expression von C/EBPβ in primären Fibroblasten induziert den Zellzyklus-Austritt durch einen Mechanismus, der RB-E2F-Aktivität erfordert (T. Sebastian, S. Thomas, J. Sage und P.F.J., unveröffentlicht). C/EBPβ-arrestierte Fibroblasten weisen morphologische Merkmale auf, die auf seneszente Zellen hinweisen. Ein ähnlicher seneszenter Zustand wird auch durch Überexpression von Ras V12 und anderen Onkogenen in primären, nicht-immortalisierten Zellen hervorgerufen (Lin und Lowe, 2001, Serrano et al., 1997). Ras V12-exprimierende Primärzellen treten in einen irreversiblen G1-Arrest ein, der die Induktion der p16 INK4a -RB- und p19 ARF -p53-Tumorsuppressorwege erfordert. This oncogene-induced, `premature' senescence is thought, like apoptosis, to provide a barrier to neoplastic transformation and cancer. Interestingly, Ras V12 -expressing C/EBPβ –/– MEFs fail to senesce and instead continue to proliferate, although (in contrast to p19 ARF - or p53-deficient cells) they are not fully transformed (T. Sebastian, S. Thomas, J. Sage and P.F.J., unpublished). C/EBPβ seems to function in concert with RB-E2F to arrest cells at the G1-S boundary, probably by repressing S-phase genes. Thus, C/EBPβ is an important regulator of cell-cycle exit/senescence induced by Ras V12 in primary cells. Post-translational activation of C/EBPβ by Ras-stimulated kinases (Hanlon and Sealy, 1999 Mo et al., 2004 Nakajima et al., 1993 Shuman et al., 2004) may be one pathway by which oncogenic Ras V12 signaling is linked to premature senescence.

Growth arrest induced by C/EBPβ is highly context specific, because in several cases C/EBPβ displays growth-promoting activity. For example, mammary epithelial cells (MECs) from C/EBPβ –/– female mice have a proliferation defect that leads to impaired ductal morphogenesis and a failure to lactate (Robinson et al., 1998 Seagroves et al., 1998). Conversely, ectopic C/EBPβ expression in a human MEC cell line (MCF10A) induces hyper-proliferation and the cells acquire a partially transformed phenotype (Bundy and Sealy, 2003). A growth-stimulatory effect of C/EBPβ is also observed in macrophage tumor cells (Wessells et al., 2004). Interestingly, deletion of the CEBPB gene renders mice totally resistant to carcinogen-induced skin tumor development (Zhu et al., 2002), and low levels of C/EBPβ expression enhance, rather than inhibit, Ras V12 -induced focus formation in NIH 3T3 cells (Shuman et al., 2004 Zhu et al., 2002). A data-mining approach has also associated C/EBPβ expression with cyclin-D1-dependent tumors (Lamb et al., 2003). Hence, C/EBPβ can function as a pro-oncogenic transcription factor that promotes proliferation and/or survival of some tumor cells. How it stimulates mitotic growth and why it elicits completely opposite effects on proliferation in different cellular contexts are intriguing questions for future investigation.

C/EBPδ

DeWille and coworkers have described a role for C/EBPδ in G0 arrest of MECs. Proliferating HC11 or COMMA D mammary cells express low levels of C/EBPδ, but when they undergo G0 arrest in response to serum withdrawal, C/EBPδ mRNA and protein levels increase significantly (O'Rourke et al., 1997 O'Rourke et al., 1999). The effect is specific to G0 MECs, since C/EBPδ levels do not increase in other cells, nor is induction observed when MECs arrest at other stages of the cell cycle. Expression of C/EBPδ antisense RNA inhibits endogenous C/EBPδ expression and prevents the cells from entering G0 upon serum withdrawal. Further experiments have implicated the transcription factor STAT3 in activating CEBPD gene transcription in response to low levels of serum (Hutt et al., 2000). A cytokine or related factor, acting in an autocrine manner, might therefore control CEBPD induction by activating Jak/STAT3 signaling. Indeed, oncostatin M induces growth arrest in MECs by a C/EBPδ-dependent mechanism (Hutt and DeWille, 2002).

C/EBPδ also regulates proliferation of MECs in vivo. C/EBPδ is induced during mouse mammary gland involution, which is the period following the end of lactation when extensive tissue remodeling and regression occur (Gigliotti and DeWille, 1998). Female C/EBPδ-knockout mice reproduce and lactate normally (Sterneck et al., 1998) however, nulliparous mutant animals display increased mammary ductal growth and branching, and show a higher epithelial bromodeoxyuridine (BrdU) labeling index than wild-type controls (Gigliotti et al., 2003). Involution and associated cellular apoptosis was not affected, although other work shows that these responses are delayed in C/EBPδ –/– animals (E. Sterneck, personal communication). The different results might reflect the fact that C/EBPδ –/– mice of different strain backgrounds were used in the two studies. The involvement of C/EBPδ in control of MEC proliferation raises the possibility that C/EBPδ functions as a tumor suppressor. It will therefore be interesting to determine whether tumor-associated C/EBPδ mutations exist and contribute to the transformed phenotype of cancer cells.

C/EBPϵ

C/EBPϵ is expressed exclusively in hematopoietic cells and their progenitors. C/EBPϵ-null mice are viable but lack functional neutrophils and eosinophils, and eventually develop myelodysplasia (Verbeek et al., 2001 Yamanaka et al., 1997). Conversely, forced expression of C/EBPϵ induces differentiation of promyelocytic leukemia cells (Lekstrom-Himes, 2001 Truong et al., 2003). These findings indicate a role for C/EBPϵ in differentiation and proliferation arrest of myeloid progenitors. The antiproliferative activity of C/EBPϵ might involve E2F-RB, since interactions with E2F1 and pRB have been observed and C/EBPϵ can repress transcription of E2F targets such as Mein C (Gery et al., 2004). C/EBPϵ thus mimics many of the functions of C/EBPα and may provide a second pathway by which terminal granulocytic differentiation is implemented (Zhang et al., 2002).


Quiescence stem cells are at the heart of mutation susceptibility and life expectancy

Protecting the stem cell compartment from DNA damage is not an easy task for a long-lived animal and requires considerable effort. How difficult this task is may be illuminated when considering the endogenous somatic mutation rate in human cells in vivo. Adult human cells, e.g., skin fibroblasts have accumulated hundreds of mutations even in sun-protected areas most likely due to replication errors 44,45 suggesting that aging humans gradually harbor mutations in cancer-driver genes and that exogenous factors such as ultraviolet (UV) light further predisposes the rate of mutation to a level that frequently results in cancer. In sun-exposed human epidermis, the burden of somatic mutations averaged two to six mutations per megabase per cell. 46 From studies with human organoid cultures derived from stem cells from donors of ages varying from 3 to 87 years-old, it has been shown that the mutational load increases steadily over time at a rate of approximately 40 novel mutations every year. 47 Although it is unclear whether this rate of mutations is sufficient to drive cancer development in different tissues, it highlights the existence of mechanisms that protect stem cell populations and delay the accumulation of cancer-driver mutations until reaching the end of the reproductive age. Reduction of mutation rates can be achieved by attenuating endogenous and exogenous deleterious effects on DNA integrity. The observation that human somatic cells “accumulate mutations 4 to 25 times more rapidly than germline cells do” 48 suggests the existence of potential areas of intervention by which the mutation burden load could be further reduced. Establishment of a “deep quiescence” state 49 in the stem cell population, along with enhanced detoxification and more efficient DNA repair may keep the mutational load low enough to prevent cancer beyond the reproductive age and enhance the natural life expectancy.

A relationship between life expectancy and mutation rate has been suggested by Failla in the 1950s, when he stated that “the important point is that the average spontaneous mutation rate of a somatic cell of a short-lived species be higher than that of the somatic cells of a long-lived species and approximately in the inverse ratio of the life spans”. 50 Whether Failla has been right is still unclear but a recent study by Blokzijl et al. 47 summarized some of their findings by saying that “although variation in tissue-specific mutation spectra in mice has been reported previously, we observed a difference in both mutation rate and spectrum in human cells. This indicates that mutation data derived from mice are not necessarily suitable for interpreting mutational processes and their consequences in humans.” 47 Similarly, Vijg et al. 51 suggest that mutation rate per base and replication in mouse germ cells and somatic cells is significantly higher than in humans. In their Fig. 6, they state: “The somatic mutation rate was nearly two orders of magnitude higher than the germline mutation rate in both species in mice, both the germline and somatic mutation rates were several times higher than their human equivalents.” This may explain why in some studies the cancer rate in mice is considerably higher than in humans. 8

One of the studies on somatic mutational load in human fibroblasts suggested that the majority of these mutations occur during development when the proliferation rate is high, whereas few are added in adult life when proliferation in fibroblasts is low. 45 This supports the notion that replication is a “dangerous” process associated with errors that can accumulate astonishing numbers of mutations over time and form the platform on which cancer cells may build upon. E.g., human cells of self-renewing tissues such as colon and intestine add about 40 mutations every year. 47

There is growing evidence that understanding human adult stem cell biology and the factors regulating stem cell proliferation and quiescence will help to improve our ideas about the carcinogenic process as well as conditions associated with aging and tissue degeneration. The complexities of stem cell biology and human stem cell terminology and nomenclature are still confusing. 52 Although quiescent stem cells in the mouse can rescue tissues after catastrophic irradiation, the question remains whether this response to massive cell death is the true purpose of such quiescent stem cells. It is interesting to note that these putative reserve stem cells, activated by catastrophic events, are often found in the digestive tract (intestine crypts, basal cell layer of oral, esophageal and anal squamous epithelia). Quiescence of these cells may also guarantee that even if cytotoxic reagents taken up with food, these toxins will not destroy the entire stem cell compartment but just the “lower” quality active stem cell compartment. Recently, a similar idea has been tested in intestinal crypts. 53 Kaiko et al. 53 claim that metabolites from the microbiome can have inhibitory effects on crypt stem cells but the structural organization of the crypt prevents that such metabolites reach critical concentration at the base of the crypt and therefore will generally not affect the stem cells. The principal idea is that the stem cell compartment may require a protective shield and a back-up system that prevents toxic products passing through or generated within the digestive system from causing irreversible damage. The ability to overcome this threat by having a relatively inert reserve stem cell population that can repair the tissue once the active stem cell population is exhausted, could be advantageous. The catastrophic events that are brought upon experimental mice or human patients undergoing radio- and chemotherapy may only represent extreme situations, in which the reserve stem cell compartment becomes evident. In general, these reserve stem cells may work undetected and may have evolved to confront the acute problem of toxic substances impairing tissue and stem cell function.

Another question is whether quiescent stem cells are actually required for a short-lived animal like the mouse. As Clevers pointed out “it appears somewhat counterintuitive that cells whose only raison d'être is the generation of daughter cells, would rarely divide”. 52 From an evolutionary point of view, does a mouse need quiescent stem cells to achieve the major function quiescent stem cells supposedly have: to maintain a tissue over prolonged time with minimal stem cell divisions to avoid tumorigenesis and repair the tissue once the active stem cells have been eliminated? Even if this hypothesis is true for humans, little evidence substantiates the idea that relative quiescence reduces tumorigenesis in an animal with a lifespan of several decades. Many unanswered questions await a new generation of comparative and evolutionary stem cell biologists. However, if quiescence reduces mutation rates and thereby enhances organismal survival then accumulation of mutations and mutation in genes regulating DNA repair should at least be associated with aging and tumorigenesis (somatic mutation theory combined with a stem cell theory of aging). Indeed, basically all known premature aging syndromes have a connection to DNA repair or nuclear architecture. Furthermore, mutations accumulate with age, DNA repair systems deteriorate with age and many models of impaired DNA repair result in reduced lifespan (summarized in ref. 54 ). Both these theories of aging (mutational and stem cell) can be closely related especially if adult tissue stem cells can become cancer-initiating cells and accumulation of mutations in stem cells leads to senescence or impaired stem cell function. There is some evidence that defects in stem cell DNA repair contribute to aging. 55,56,57,58 Whether short-lived mammals have lower quality DNA repair systems than long-lived mammals is unclear and may not be necessary when focusing on stem cells and their protection by quiescence rather than by higher DNA repair rates. 59 Again, our descriptive findings in human oral mucosa indicate that the quiescent basal cell layer expresses elevated levels of several key repair genes (e.g., XPC and associated factors). 21 It is interesting that several experiments on stem cell populations and especially quiescence have identified an innate immune system association. 32,60 Oki et al. 32 report that the top six gene ontology (GO) terms associated with quiescent fibroblasts are all related to inflammation, immune defense and wound response. Protecting the quiescence stem cells on every level that may alter its genetic integrity (DNA mutations and integration of viral genomes, e.g., HPV) seems to be the priority of the quiescent state. Therefore, gene signatures relevant for DNA repair and innate immunity may be characteristic for quiescent stem cells.


Targeting cleavage and polyadenylation specific factor 1 via shRNA inhibits cell proliferation in human ovarian cancer

Cleavage and polyadenylation specificity factor 1 (CPSF1), a member of CPSF complex, has been reported to play a key role in pre-mRNA 3′-end formation, but its possible role in ovarian cancer remains unclear. In the present study, we found the mRNA level of CPSF1 was overexpressed in ovarian cancer tissues using Oncomine Cancer Microarray database. Then the loss-of-function assays, including CCK-8, colony formation and flow cytometry assays, were performed to determine the effects of CPSF1 on cell viability, proliferation, cell cycle and apoptosis of human ovarian cancer cell lines (SKOV-3 and OVCAR-3). The results indicated that depletion of CPSF1 suppressed cell viability, impaired colony formation ability, induced cell cycle arrest at G0/G1 phase and promoted cell apoptosis in ovarian cancer cells. Furthermore, knockdown of CPSF1 upregulated the expression of cleaved caspase-3 and PARP and downregulated CDK4/cyclin D1 expression. These data suggested that CPSF1 could promote ovarian cancer cell growth and proliferation in vitro and its depletion might serve as a potential therapeutic target for human ovarian cancer.

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Bemerkungen:

  1. Ojo

    Danke für Ihre Unterstützung.

  2. Chaz

    Ich entschuldige mich, aber meiner Meinung nach haben Sie nicht Recht. Lassen Sie uns darüber diskutieren. Schreiben Sie mir in PM, wir werden kommunizieren.

  3. Nitis

    Stimmen Sie zu, das ist der lustige Satz

  4. Toli

    Hey! Ich schlage vor, Beiträge mit Ihrem Blog auszutauschen.

  5. Fonsie

    Ich denke, du hast nicht Recht. Treten Sie ein, wir diskutieren. Schreib mir per PN, wir reden.

  6. Vayle

    Es ist also nicht weit von der Unendlichkeit :)

  7. Bayen

    Vielleicht stimme ich Ihrem Satz zu



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