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11.1: Rekombinante DNA- und Genklonierung - Biologie

11.1: Rekombinante DNA- und Genklonierung - Biologie



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Rekombinante DNA ist künstlich hergestellte DNA. DNA aus zwei oder mehr Quellen wird in ein einzelnes rekombinantes Molekül eingebaut.

Herstellung rekombinanter DNA (rDNA) – ein Überblick

  • Behandeln Sie DNA aus beiden Quellen mit derselben Restriktionsendonuklease (in diesem Fall BamHI).
  • BamHI schneidet auf beiden Molekülen dieselbe Stelle

5' GGATCC 3'
3' CCTAGG 5'

  • Die Enden des Schnitts haben ein überhängendes Stück einzelsträngiger DNA.
  • Diese werden "klebrige Enden" genannt, weil sie mit jedem DNA-Molekül, das das komplementäre klebrige Ende enthält, Basenpaare bilden können.
  • In diesem Fall haben beide DNA-Präparate komplementäre klebrige Enden und können somit beim Mischen miteinander paaren.
  • EIN DNA-Ligase verbindet die beiden kovalent zu einem Molekül von rekombinante DNA.

Um nützlich zu sein, muss das rekombinante Molekül viele Male repliziert werden, um Material für die Analyse, Sequenzierung usw. bereitzustellen. Die Herstellung vieler identischer Kopien desselben rekombinanten Moleküls wird als . bezeichnet Klonen. Das Klonen kann in vitro durch einen Prozess namens Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen. Hier werden wir jedoch untersuchen, wie das Klonen erfolgt in vivo.

Das Klonen in vivo kann in . durchgeführt werden

  • einzellige Mikroben wie E coli
  • einzellige Eukaryoten wie Hefe und
  • in Säugerzellen, die in Gewebekultur gezüchtet wurden.

In jedem Fall muss die rekombinante DNA von der Zelle in einer Form aufgenommen werden, in der sie repliziert und exprimiert werden kann. Dies wird durch den Einbau der DNA in a . erreicht Vektor. Als Vektoren können eine Reihe von Viren (sowohl Bakterien- als auch Säugerzellen) dienen. Aber lassen Sie uns hier ein Beispiel für das Klonen mit untersuchen E coli als Gastgeber und a Plasmid als Vektor.

Plasmide

Plasmide sind klein (einige tausend Basenpaare), tragen normalerweise nur ein oder wenige Gene, sind zirkulär und haben ein einzelnes Ursprung der Replikation. Plasmide werden von derselben Maschinerie repliziert, die das Bakterienchromosom repliziert. Einige Plasmide werden ungefähr mit der gleichen Geschwindigkeit wie das Chromosom kopiert, so dass eine einzelne Zelle nur eine einzige Kopie des Plasmids hat. Andere Plasmide werden mit hoher Geschwindigkeit kopiert und eine einzelne Zelle kann 50 oder mehr davon aufweisen.

Gene auf Plasmiden mit hohen Kopienzahlen werden normalerweise in hohem Maße exprimiert. In der Natur kodieren diese Gene oft Proteine ​​(z. B. Enzyme), die das Bakterium vor einem oder mehreren schützen Antibiotika. Plasmide dringen relativ leicht in die Bakterienzelle ein. Dies kommt in der Natur vor und kann für die schnelle Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in Krankenhäusern und anderswo verantwortlich sein. Plasmide können im Labor gezielt in Bakterien eingebracht werden und die Zelle mit den eintreffenden Genen transformieren.

In der obigen Abbildung ist das Knäuel ein Teil eines einzelnen DNA-Moleküls, das über 4,6 Millionen Basenpaare enthält, die ungefähr 4.300 Gene kodieren. Die kleinen Ringe sind Plasmide.

Beispiele für Plasmide

PAMP

  • 4539 Basenpaare
  • ein einziger Replikationsursprung
  • ein Gen (AmpereR)verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin (ein Verwandter von Penicillin)
  • ein Einzel Auftreten der Sequenz

5' GGATCC 3'
3' CCTAGG 5'das, wie wir oben gesehen haben, durch das Restriktionsenzym geschnitten wird BamHI

  • ein Einzel Auftreten der Sequenz

5' AGGCTT 3'
3' TTCGAA 5'das durch das Restriktionsenzym geschnitten wird HindIII

Behandlung von pAMP mit a Mischung von BamHI und HindIII produziert:

  • ein Fragment von 3755 Basenpaare, die beide AmpereR Gen und der Replikationsursprung
  • ein Fragment von 784 Basenpaare
  • beide Fragmente haben klebrige Enden

PKAN

  • 4207 Basenpaare
  • ein einziger Replikationsursprung
  • ein Gen (kanR) verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin.
  • eine einzige Website, die von BamHI
  • eine einzige Website, die von HindIII

Behandlung von pKAN mit a Mischung von BamHI und HindIII produziert:

  • ein Fragment von 2332 Basenpaare
  • ein Fragment von 1875 Basenpaare mit dem kanR Gen (aber kein Replikationsursprung)
  • beide Fragmente haben klebrige Enden

Diese Fragmente können sichtbar gemacht werden, indem die Verdauungsgemische einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen werden. Aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen wandert DNA bei Anlegen eines Gleichstroms in Richtung der positiven Elektrode (Anode). Je kleiner das Fragment ist, desto weiter wandert es im Gel.

Möglichkeiten der Ligatur

Wenn Sie die beiden Restriktionsenzyme entfernen und die Bedingungen dafür schaffen, dass die DNA-Ligase ihre Arbeit verrichten kann, können sich die Teile dieser Plasmide wieder verbinden (dank der Komplementarität ihrer klebrigen Enden).

Das Mischen der pKAN- und pAMP-Fragmente bietet mehrere (mindestens 10) Möglichkeiten von wieder zusammengefügten Molekülen. Einige von diesen produzieren keine funktionellen Plasmide (Moleküle mit zwei oder ohne Replikationsursprung können nicht funktionieren).

Abb. 11.1.4 Rekombinantes Plasmid

Eine interessante Möglichkeit ist der Beitritt von

  • das 3755-bp-pAMP-Fragment (mit AmpereR und einem Replikationsstartpunkt) mit dem
  • 1875-bp-pKAN-Fragment (mit kanR)

Versiegelt mit DNA-Ligase, diese Moleküle sind funktionierende Plasmide, die in der Lage sind, Resistenz gegen . zu verleihen beide Ampicillin und Kanamycin. Sie sind Moleküle von rekombinante DNA.

Da der Replikationsstartpunkt, der es dem Molekül ermöglicht, als Plasmid zu fungieren, von pAMP beigesteuert wurde, wird pAMP als bezeichnet Vektor.

Transformieren E coli

Behandlung von E coli mit der Mischung religierter Moleküle werden einige Kolonien produzieren, die in der Lage sind, sowohl in Gegenwart von Ampicillin als auch Kanamycin zu wachsen.

  • Eine Aussetzung von E coli wird mit dem Gemisch religierter DNA-Moleküle behandelt.
  • Die Suspension wird auf der Oberfläche des Agars ausgestrichen, der sowohl Ampicillin als auch Kanamycin enthält.
  • Am nächsten Tag werden einige wenige Zellen, die gegen beide Antibiotika resistent sind, zu sichtbaren Kolonien mit Milliarden transformierter Zellen herangewachsen sein.
  • Jede Kolonie repräsentiert a Klon von transformierten Zellen.

Jedoch, E coli können gleichzeitig durch mehr als ein Plasmid transformiert werden, daher müssen wir zeigen, dass die transformierten Zellen das rekombinante Plasmid erworben haben.

Die Elektrophorese der DNA von doppelresistenten Kolonien (Klonen) erzählt die Geschichte.

  • Plasmid-DNA aus Zellen, die ihre Resistenz von a . erworben haben rekombinantes Plasmid nur zeigen nur die 3755-bp und 1875-bp-Banden (Klon 1, Bahn 3).
  • Klon 2 (Spur 4) wurde simultan mit religiertem pAMP und pKAN transformiert. (Wir können nicht sagen, ob es auch das rekombinante Molekül aufgenommen hat.)
  • Klon 3 (Spur 5) wurde sowohl durch das rekombinante Molekül als auch durch eine intakte pKAN transformiert.

Klonen anderer Gene

Der oben beschriebene rekombinante Vektor könnte selbst ein nützliches Werkzeug zum Klonen anderer Gene sein. Nehmen wir an, dass innerhalb seiner Kanamycinresistenzgen (kanR) gibt es ein einziges Vorkommen der Folge

5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'

Dieses wird durch das Restriktionsenzym geschnitten EcoRI, wodurch klebrige Enden entstehen.

Wenn wir eine andere DNA-Probe, z. B. aus menschlichen Zellen, mit EcoRI behandeln, werden Fragmente mit den gleichen klebrigen Enden gebildet. Gemischt mit EcoRI-behandeltem Plasmid und DNA-Ligase wird eine kleine Anzahl der menschlichen Moleküle in das Plasmid eingebaut, das dann zur Transformation verwendet werden kann E coli.

Aber wie erkennt man diese Klone von E coli die durch ein Plasmid transformiert wurden, das ein Stück menschlicher DNA trägt?

Der Schlüssel ist, dass die EcoRI-Site innerhalb das kanR Gen, wenn also dort ein Stück menschlicher DNA eingefügt wird, wird die Funktion des Gens zerstört.

Alle E coli Zellen, die durch den Vektor transformiert wurden, können in Gegenwart von Ampicillin wachsen, unabhängig davon, ob er menschliche DNA trägt oder nicht. Aber E coli Zellen, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das menschliche DNA trägt, können in Gegenwart von Kanamycin nicht wachsen. So,

  • Verteilen Sie eine Suspension von behandeltem E coli nur auf Agar mit Ampicillin
  • über Nacht wachsen
  • Übertragen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine kleine Menge jeder Kolonie auf eine identifizierte Stelle auf dem Agar, der Kanamycin enthält
  • (mit einer anderen Ampicillin-Platte genauso verfahren)
  • Über Nacht inkubieren

Alle Klone, die auf Ampicillin weiterwachsen, aber auf Kanamycin nicht wachsen (hier: Klone 2, 5, und 8) wurden mit einem Stück menschlicher DNA transformiert.

Einige rekombinante DNA-Produkte, die in der Humantherapie verwendet werden

Mit solchen Verfahren wurden viele menschliche Gene kloniert E coli oder in Hefe. Damit ist es erstmals möglich, in vitro unbegrenzte Mengen menschlicher Proteine ​​herzustellen. Kultivierte Zellen (E coli, Hefe, Säugerzellen), die mit einem menschlichen Gen transformiert wurden, werden zur Herstellung von mehr als 100 Produkten für die Humantherapie verwendet. Einige Beispiele:

  • Insulin für Diabetiker
  • Faktor VIII für Männer mit Hämophilie A
  • Faktor IX für Hämophilie B
  • menschliches Wachstumshormon (HGH)
  • Erythropoietin (EPA) zur Behandlung von Anämie
  • mehrere Arten von Interferone
  • mehrere Interleukine
  • Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zur Stimulierung des Knochenmarks nach einer Knochenmarktransplantation
  • Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) zur Stimulierung der Neutrophilenproduktion (z. B. nach Chemotherapie) und zur Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Knochenmark ins Blut.
  • Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA) zum Auflösen von Blutgerinnseln
  • Adenosindesaminase (ADA) zur Behandlung einiger Formen von schwerer kombinierter Immundefekt (SCID)
  • Nebenschilddrüsenhormon
  • viele monoklonale Antikörper
  • Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) zur Impfung gegen das Hepatitis-B-Virus
  • C1-Inhibitor (C1INH) zur Behandlung des hereditären Angioödems

Rekombinantní dna

Rekombinantní DNA technologie (někdy obráceně technologie rekombinantní DNA) je v genovém inženýrství postup označení biotechnologických postupů, které takto. Rekombinante DNA, DNA-Moleküle von zwei verschiedenen Spezies, die in einen Wirtsorganismus eingefügt werden, um neue genetische Kombinationen zu erzeugen, die für Wissenschaft, Medizin, Landwirtschaft und Industrie von Wert sind. Da das Gen im Mittelpunkt aller Genetik steht, besteht das grundlegende Ziel von Laborgenetikern darin, Gene zu isolieren, zu charakterisieren und zu manipulieren. Rekombinantní molekuly (Rc-DNA) tedy obsahují úseky DNA rozdílných organismů. Vytvářejí se inzercí cizorodé DNA do vektoru, kterým může být bakteriální plazmid nebo fág

Rekombinante DNA Definition, Schritte, Beispiele und Erfindung

Rekombinant DNA, oder rDNA, ist DNA das entsteht durch Kombinieren DNA aus verschiedenen Quellen durch einen Prozess namens genetische Rekombination. Oft stammen die Quellen von verschiedenen Organismen. Allgemein gesagt, DNA aus verschiedenen Organismen hat die gleiche chemische allgemeine Struktur Rekombinante DNA ist die Methode, zwei oder mehr DNA-Moleküle zu einem Hybrid zu verbinden. Die Technologie wird durch zwei Arten von Enzymen ermöglicht, Restriktionsendonukleasen und Ligase. Eine Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische DNA-Sequenz und schneidet innerhalb oder nahe dieser Sequenz Organismus. Im Grunde beinhaltet dieser Prozess also die Einführung eines fremden Stücks einer DNA-Struktur in das Genom, das unser interessierendes Gen enthält. Rekombinante DNA ist ein DNA-Molekül, das modifiziert wurde, um Gene aus mehreren Quellen aufzunehmen, entweder durch genetische Rekombination oder im Labor Techniken. Im Labor können Bakterien mit rekombinanter DNA transformiert werden. Die genetische Rekombination findet während der Meiose in einem Prozess statt, der als Crossing over Rekombinante DNA oder rDNA bezeichnet wird. Genwissenschaftler können dies tun, um einen einzigartigen DNA-Strang für verschiedene..

Rekombinantní DNA - WikiSkript

Moderne Fortschritte in der Genetik und der rekombinanten DNA- oder rDNA-Technologie haben es Wissenschaftlern ermöglicht, Impfstoffe zu entwickeln, die nicht mehr das Potenzial haben, Krankheiten zu verursachen. Drei verschiedene Arten moderner Präparate basierend auf der rDNA-Impfstofftechnologie werden für Tier- und Humanimpfungen verwendet. Und rekombinant DNA-Molekül ist altså sammensatt von DNA von minst zu forskjellige Kilder. Et rekombinant DNA-molekyl er altså sammensatt av DNA fra minst to forskjellige kilder Die rekombinante DNA-Technologie wird von der Encyclopedia Britannica als das Zusammenfügen von DNA-Molekülen aus verschiedenen Organismen und deren Einfügung in einen Wirtsorganismus definiert, um neue genetische Kombinationen zu erzeugen, die von Wert sind für Wissenschaft, Medizin, Landwirtschaft und Industrie Eine DNA-Ligase verbindet die beiden kovalent zu einem rekombinanten DNA-Molekül. Abbildung 11.1.1 Erstellen einer rDNA. Um nützlich zu sein, muss das rekombinante Molekül viele Male repliziert werden, um Material für die Analyse, Sequenzierung usw. bereitzustellen. Die Herstellung vieler identischer Kopien desselben rekombinanten Moleküls wird als Klonen bezeichnet

Die rekombinante DNA-Technologie spielt eine wichtige Rolle, um den Lebensstil der Menschheit zu verbessern. In der Gesundheitswissenschaft ist seine Rolle sehr wichtig, da es uns eine gute Qualität von Lebensmittelmedikamenten, Hormonen und anderen bietet. .aklectures.com/donate.phpWebsite-Videolink: http://www.aklectures.com/lecture/plasmids-and-recombinant-dna-technologyFacebook-Link:. Rekombinante DNA Rekombinante DNA ist die allgemeine Bezeichnung dafür, ein Stück einer DNA zu nehmen und es mit einem anderen DNA-Strang zu kombinieren. Somit ist der Name rekombinant! Rekombinante DNA wird manchmal auch als Chimäre bezeichnet

Definiere rekombinante DNA. rekombinante DNA-Synonyme, rekombinante DNA-Aussprache, rekombinante DNA-Übersetzung, englische Wörterbuchdefinition von rekombinanter DNA. n. Abk. rDNA Gentechnisch hergestellte DNA, hergestellt durch Transplantieren oder Spleißen von Genen einer Spezies in die Zellen eines Wirtsorganismus einer anderen.. Rekombinante DNA-Definition ist - genetisch veränderte DNA, die normalerweise DNA von mehr als einer Spezies von Organismen enthält

Biotechnologie, die gleichbedeutend mit Gentechnik oder rekombinanter DNA (rDNA) ist, ist ein industrielles Verfahren, das die wissenschaftliche Erforschung der DNA für praktische Anwendungen nutzt. rDNA ist eine Form von. . Det är den process som gör att arvsmassan mellan mammans och pappans kromosomer kan blandas så att avkomman für unika kromosomer DNA-Klonierung und rekombinante DNA. AP.BIO: IST-1 (EU), IST-1.P (LO), IST-1.P.1 (EK) Google Classroom Facebook Twitter. Email. Biotechnologie. Einführung in die Gentechnik. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese. DNA-Klonierung und rekombinante DNA. Dies ist das aktuell ausgewählte Element

Was ist rekombinante DNA-Technologie? - GedankeC

  • Příklad věty s rekombinantní dna, překlad paměť EMEA0.3 Jedna injekční lahvička prášku obsahuje # milionů IU interferonum alfa-#b produkovaného v E. coli rekombinantní DNA technologi
  • bei 95°
  • Rekombinantní DNA vzniká klonováním 1) DNA-Fragment je vložen do vektoru 2) Vektor s fragmentem (rekombinantní DNA) je transformován do hostitele 3) V hostiteli se rekombinantní DNA namnoží 4) Pokud se hostitel rozmnožuje, množěn se i rekombinantní se i 5kombinantní se množení vzniká klo

Rekombinante DNA - ein Überblick ScienceDirect Topic

  • Slovo rekombinace má více významů: . Rekombinace (genetika) - označení pro různé změny v DNA spočívající v jejím rozštípnutí a připojení k jinému řetězci, jíž vznikají nové vlastnosti Meiotická re.kombinace Crossing-over Mitotická rekombinace - vzácnější Rekombinantní DNA technologie V(D)J rekombinace - náhodná kombinace částí genů pro.
  • Die Asilomar Conference on Recombinant DNA war eine einflussreiche Konferenz, die von Paul Berg organisiert wurde, um die potenziellen Biogefahren und die Regulierung der Biotechnologie zu diskutieren, die im Februar 1975 in einem Konferenzzentrum am Asilomar State Beach stattfand. Eine Gruppe von etwa 140 Fachleuten (hauptsächlich Biologen, aber auch Rechtsanwälte und Ärzte) nahm an der Konferenz teil, um freiwillige Beiträge zu erstellen.
  • Während der DNA-Klonierung wird ein neues Gen in eine Schleife bakterieller DNA, ein sogenanntes Plasmid, eingefügt. Wie in der Animation gezeigt, wird das Plasmid zunächst mit einem Restriktionsenzym geschnitten, damit das interessierende Gen, das aus einem anderen Organismus isoliert wurde, in die Schleife eingefügt werden kann
  • Rekombinante DNA-Technologie bezieht sich auf das Zusammenfügen von DNA-Molekülen aus zwei verschiedenen Spezies, die in einen Wirtsorganismus eingefügt werden, um neue genetische Kombinationen zu erzeugen, die für Wissenschaft, Medizin, Landwirtschaft und Industrie von Wert sind
  • Die rekombinante DNA-Technologie kann auf verschiedenen Gebieten verwendet werden. Je nachdem, wo es erforderlich ist, werden zwei interessierende DNAs kombiniert und in den Wirtsorganismus eingefügt, um eine neue genetische Kombination zu erzeugen, die in den erforderlichen Bereichen wie Medizin, Wissenschaft, Landwirtschaft und Industrie verwendet werden kann
  • Rekombinante DNA-Technologie. Die rekombinante DNA-Technologie verändert den Phänotyp eines Organismus (Wirts) durch einen genetisch veränderten Vektor. Dieser Klonierungsvektor wird eingeführt und in das Genom des Organismus integriert. Im Grunde beinhaltet der Prozess also die Einführung eines fremden DNA-Stücks in das Genom, das unser interessierendes Gen enthält
  • Die rekombinante DNA (rDNA)-Technologie bezieht sich auf den Prozess des Verbindens von DNA-Molekülen aus zwei verschiedenen Quellen und deren Einfügung in einen Wirtsorganismus, um Produkte für den menschlichen Gebrauch zu erzeugen. Dieser Prozess umfasst mehrere Schritte, die in einer bestimmten Reihenfolge ablaufen müssen, um das gewünschte Produkt zu erzeugen

Rekombinante DNA ist ein sehr wirksames Werkzeug in der Wissenschaft. Es hat eine Vielzahl von Anwendungen. Es kann in der artenübergreifenden Genetik verwendet werden, bei der DNA von einer Spezies auf eine andere übertragen wird, um eine bessere Qualität von Nahrungsmitteln wie Getreide zu schaffen, um mehrere Kopien eines DNA-Fragments zu erstellen, um gewünschte Eigenschaften in Kreaturen zu integrieren usw. Rekombinante DNA ist künstlich hergestellte DNA. DNA aus zwei oder mehr Quellen wird in ein einzelnes rekombinantes Molekül eingebaut. Herstellung rekombinanter DNA (rDNA): Ein Überblick. Behandeln Sie DNA aus beiden Quellen mit derselben Restriktionsendonuklease (in diesem Fall BamHI). BamHI schneidet dieselbe Stelle auf beiden Molekülen 5' GGATCC 3' 3' CCTAGG 5 Die rekombinante DNA-Technologie hat eine Art von Genetik namens reverse Genetik ermöglicht. Traditionell beginnt die genetische Forschung mit einem mutierten Phänotyp, und durch die Mendelsche Kreuzungsanalyse kann ein Forscher den Phänotyp einem bestimmten Gen zuordnen. Die umgekehrte Genetik geht genau in die entgegengesetzte Richtung

Multiple-Choice-Fragen zur rekombinanten DNA-Technologie :-1. Welche dieser Restriktionsenzyme produzieren stumpfe Enden? A. SaII B. EcoRV C. XhoI D. HindIII. Antwort: B. 2. Das RP13-Gen von Chromosom 17 kodiert für ein Protein _____ . A. beteiligt am Glukosetransport B. ist Bestandteil von Haaren und Nägeln 1. DNA-Ligase: DNA-Ligase wird kommerziell aus E.coli und Bakteriophagen isoliert und in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet. Das Enzym DNA-Ligase verbindet die DNA-Fragmente mit dem Klonierungsvektor. 2. Reverse Transkriptase: RT wird verwendet, um einen komplementären Strang (cDNA) aus einer mRNA-Matrize zu synthetisieren. Es wird auch als RNA-abhängige DNA-Polymere bezeichnet Rekombinante DNA hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, und rekombinante DNA wird erst im 21.. Im Folgenden sind einige der Bereiche aufgeführt, in denen rekombinante DNA einen Einfluss haben wird. Bessere Pflanzen (Trocken- und Hitzebeständigkeit) Rekombinant. Die rekombinante DNA-Technologie führt zu genetisch veränderten Organismen (GVO). Rekombinante DNA erfordert 3 molekulare Schlüsselwerkzeuge: Schneiden von DNA an bestimmten Stellen – meistens durchgeführt durch Enzyme, die als Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme) bezeichnet werden Forschung. Rekombinante DNA besteht normalerweise aus einem interessierenden Gen, hier Insulin von einem Spenderorganismus, eingefügt in einen Vektor, selbstreplizierender DNA von einem anderen Organismus, wie einem Virus oder einem Plasmid, einem kleinen kreisförmigen Stück bakterieller DNA

Die rekombinante DNA-Technologie führt zu genetisch veränderten Organismen (GVO). Rekombinante DNA erfordert 3 molekulare Schlüsselwerkzeuge: Schneiden von DNA an bestimmten Stellen - am häufigsten durch Enzyme, die als Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme) bezeichnet werden. Restriktionsenzyme machen oft gestaffelte Schnitte an spezifischen 4, 6 oder 8 bp palindromischen Sequenzen in Duplex-DNA und hinterlassen charakteristische klebrige Enden, die über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen auf dem Einzelstrang aneinander anlagern können. Rekombinantes Insulin funktionierte gut, und dies gab den Wissenschaftlern die Hoffnung, dass die DNA-Technologie erfolgreich eingesetzt werden könnte, um Substanzen von medizinischer und kommerzieller Bedeutung herzustellen. Eine Genehmigung der zuständigen Behörden für die Verwendung von rekombinantem Insulin zur Behandlung von Diabetes mellitus wurde 1982 erteilt. Seit Banting und Best 1921 das Hormon Insulin entdeckten Rekombinante DNA-Technologie Alle Organismen auf der Erde haben sich aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt, daher verwenden alle Organismen DNA als ihr Vererbungsmolekül. Auf chemischer Ebene ist die DNA gleich, ob sie aus einem mikroskopisch kleinen Bakterium oder einem Blauwal stammt. Als Ergebnis kann DNA von verschiedenen Organismen geschnitten und zusammengefügt werden, [

Hauptunterschied - Gentechnik vs. rekombinante DNA-Technologie Genetische Materialien von Organismen können mit gentechnischen Techniken oder rekombinanter DNA-Technologie verändert werden. Die rekombinante DNA-Technologie ist der Prozess, der verwendet wird, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu erzeugen, das die interessierende DNA und Vektor-DNA trägt, während Gentechnik ein weit gefasster Begriff ist, der verwendet wird, um die Prozesse zu beschreiben. Ein rekombinantes DNA-Molekül wird durch hergestellt. a) Verbindung zweier DNA-Fragmente. b) Verbinden von zwei oder mehr DNA-Fragmenten. c) sowohl a als auch b. d) Zusammenfügen von zwei oder mehr DNA-Fragmenten, die von verschiedenen Organismen stammen. 2. Das durch die Verbindung von DNA-Abschnitten aus zwei verschiedenen Quellen gebildete Gen wird als . bezeichnet Rekombinante DNA und Biotechnologie haben eine neue Ära der diagnostischen Tests eröffnet und die Erkennung vieler genetischer Krankheiten ermöglicht. Das grundlegende Werkzeug der DNA-Analyse ist ein DNA-Fragment, die DNA-Sonde. Eine DNA-Sonde ist ein relativ kleines, einzelsträngiges DNA-Fragment, das einen komplementären DNA-Abschnitt in a erkennt und daran bindet. Rekombinante DNA. Die rekombinante DNA (rDNA)-Technologie beinhaltet die Kombination von DNA-Fragmenten aus zwei Quellen. DNA-Moleküle aus zwei verschiedenen Quellen oder Spezies werden in einen Wirtsorganismus eingefügt. Die daraus resultierende neue genetische Kombination ist von Wert für Wissenschaft, Medizin, Landwirtschaft und Industrie. Die resultierende DNA wird als rekombinante DNA bezeichnet

Rekombinante Desoxyribonukleinsäure ist ein DNA-Abschnitt, der künstlich in die native DNA eines Organismus eingefügt wird.Es gibt eine Vielzahl von Verwendungen für rekombinante DNA in den biologischen Wissenschaften. In der Botanik werden oft Gene von anderen Pflanzen und Tieren in die DNA bestehender Nutzpflanzen eingefügt, um widerstandsfähigere Pflanzen zu machen. Rekombinante DNA oder rDNA ist DNA, die spezifisch für ein Protein kodiert. Diese wird aus genomischer DNA durch ein Restriktionsenzym geschnitten, das DNA an spezifischen Sequenzen entlang der Kette schneidet. Diese Stücke werden dann analysiert und die zur Herstellung des Proteins benötigte DNA wird extrahiert und gereinigt. Da Insulin zwei Polypeptidketten enthält, die durch Disulfidbrücken verbunden sind.

Untersuchen Sie in DNA Interactive: Manipulation die Entstehung rekombinanter DNA, ihre Kontroverse und wie Forscher zusammengearbeitet haben, um die Biotechnologie-Industrie zu gründen. Weitere Informationen finden Sie in der Übersicht über die Arbeit mit rekombinanter DNA (rDNA). Füllen Sie die Registrierung für rekombinante DNA oder synthetische Nukleinsäuremoleküle aus, um Ihre rDNA-Arbeit zu registrieren oder um Ihre Registrierung zu aktualisieren, wenn sich der Umfang Ihrer Arbeit ändert. Dabei wird das gewünschte Segment aus der umgebenden DNA herausgeschnitten und millionenfach kopiert. Der Erfolg der rekombinanten DNA-Technologie, mit der mikrobielle Zellen konstruiert werden können. Der rekombinante Expressionsvektor wird dann in E . transformiert.coli. Das rekombinante E. coli beginnt dann mit der Produktion von hGH. Die rekombinanten E. coli werden aus der Kultur und Massenproduktion durch Fermentationstechnologie isoliert, um hGH zu erhalten. Verwendung von rekombinantem humanem Wachstumshormon (hGH

Rekombinante DNA-Technologie – Werkzeuge, Verfahren und Anwendung

  1. Multiple-Choice-Fragen und -Antworten zu rekombinanter Frage 1: Das Gerät, das DNA über DNA-beschichtete Mikroprojektile in Zellen einbringt, ist als Laser-DNA-Sonde-Genkanone-Impfnadel bekannt Antwort: 3 Frage 2: Ein Tier, das neue genetische Informationen gewonnen hat aus dem Erwerb fremder DNA, als Chimäre gilt ein transgenes Tier als Vektor ein Enzym, das.
  2. Rekombinante DNA ist eine Art von DNA, die künstlich erzeugt wird, indem ein oder mehrere DNA-Stränge in einen anderen DNA-Satz eingefügt werden. Es wird bei der genetischen Modifikation verwendet, um völlig neue Organismen zu schaffen, indem künstliche Bits oder DNA-Stücke von anderen Organismen zu einer bestehenden Kreatur hinzugefügt werden
  3. Rekombinant DNA wird in Laboratorien gebildet, indem genetisches Material aus verschiedenen Quellen zusammengeführt wird. In der Molekularbiologie werden gewünschte Gene mit bakteriellen Plasmiden rekombiniert und in Bakterien exprimiert. Dieser Vorgang wird als molekulares Klonen bezeichnet. Mit dieser Technologie werden nutzbringende Industrieprodukte in großem Maßstab hergestellt
  4. Obwohl die rekombinante DNA-Technologie erstmals in den 1960er und 1970er Jahren aufkam, war das Grundprinzip der Rekombination schon viele Jahre zuvor entdeckt worden. Tatsächlich wurde 1928 Frederick Griffith, ein.

Rekombinante DNA-Technologie und genetische Modifikation sind selten aus dem Rampenlicht der Medien, sei es durch gentechnisch veränderte Pflanzen, gentechnisch veränderte Moskitos, den Einsatz von Genome Editing beim Menschen oder die Rolle, die die DNA-Forensik-Technologie in der Welt der Kriminalität spielt. Die rekombinante Technologie wird bereits regelmäßig bei der Herstellung eingesetzt. Rekombinante DNA ist eine von Wissenschaftlern entwickelte Technologie, die es ermöglichte, ein menschliches Gen in das genetische Material eines gewöhnlichen Bakteriums einzufügen. Dieser rekombinante Mikroorganismus könnte nun das vom menschlichen Gen kodierte Protein produzieren. Wissenschaftler bauen das Humaninsulin-Gen im Labor auf. Ein üblicher Vektor, der in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet wird, ist: Antwortmöglichkeiten . Plasmid. E coli. Pflanzenzelle. CHO-Zellen. Schlagworte: Frage 17 . UMFRAGE . 60 Sekunden . F. Der erste Schritt zur Gentechnik ist: Antwortmöglichkeiten . das interessierende Gen isolieren. DNA-Strang abschneiden. DNA-Fragmente wieder verbinden. Proteine ​​herstellen. Tags: Frage 18 1982 genehmigte die Food and Drug Administration Humulin, das rekombinante Insulin von Eli Lily, das aus speziell modifizierten Bakterien von Genentech hergestellt wird. Es war das erste Medikament, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde, und eines der ersten gentechnisch veränderten Produkte, die den Verbrauchern zur Verfügung standen

Rekombinante DNA-Definition. Rekombinante DNA ist eine im Labor hergestellte Form von DNA. Es wird erzeugt, indem ausgewählte DNA-Stücke von einem Organismus auf einen anderen übertragen werden. Das abgebildete Fläschchen enthält Humaninsulin, eines der ersten therapeutischen Proteine, das gentechnisch kloniert wurde. Das Medikament wird zur Behandlung von Diabetes eingesetzt. In Fällen, in denen es nicht möglich ist, die Genfunktion im Tiermodell zu testen, können Gene zunächst in Bakterien oder Zellkulturen exprimiert werden. Ebenso können die Phänotypen von Genmutationen und die Wirksamkeit von Medikamenten und anderen Wirkstoffen sein. Substantiv. eine Zelle oder ein Organismus, dessen genetisches Komplement aus Rekombination resultiert. das genetische Material, das entsteht, wenn DNA-Abschnitte aus verschiedenen Quellen zusammengefügt werden, um rekombinante DNA zu produzieren

. Sobald ein Zellklon, der ein gewünschtes DNA-Segment trägt, isoliert ist, können unbegrenzte Mengen dieser DNA hergestellt werden. Außerdem DNA. Rekombinante DNA-Moleküle (rDNA) sind DNA-Sequenzen, die durch den Einsatz von Labormethoden (molekulares Klonen) entstehen, um genetisches Material aus mehreren Quellen zusammenzuführen, wodurch Sequenzen entstehen, die sonst in biologischen Organismen nicht zu finden wären. Rekombinante Proteine ​​sind eine neue Kombination von Genen, die bildet DNA. Die rekombinante DNA-Technologie ermöglicht die Produktion von Wildtyp- und modifizierten Human- und Säugetierproteinen in großen Mengen. Rekombinante Proteine ​​werden aus geklonten DNA-Sequenzen hergestellt, die normalerweise ein Enzym oder Protein mit bekannter Funktion kodieren. Rekombinante Influenza-(Grippe-)Impfstoffe werden unter Verwendung rekombinanter Technologie hergestellt. Diese Methode erfordert kein in Eiern gezüchtetes Impfvirus und verwendet keine Hühnereier im Produktionsprozess. Derzeit sind der rekombinante Grippeimpfstoff und der auf Zellkultur basierende Grippeimpfstoff die einzigen eifreien Grippeimpfstoffe, die in den USA zur Verwendung zugelassen sind

Humaninsulin, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wird, ist das erste kommerzielle Gesundheitsprodukt, das von dieser Technologie abgeleitet ist. Die Arbeit an diesem Produkt wurde begonnen, bevor es Bundesrichtlinien für groß angelegte Arbeiten an rekombinanter DNA oder die kommerzielle Entwicklung rekombinanter DNA-Produkte gab. Die Schritte Rekombinante DNA-Definition, DNA, in die ein oder mehrere Segmente oder Gene entweder natürlich oder durch Labormanipulation von einem anderen Molekül oder einem anderen Teil desselben Moleküls eingefügt wurden, was zu einer neuen genetischen Kombination führt. Mehr anzeigen DNA in vitro verbinden, um rekombinante Moleküle zu bilden Die rekombinante DNA-Technologie nutzt die Leistungsfähigkeit mikrobiologischer Selektions- und Screening-Verfahren, um es Forschern zu ermöglichen, ein Gen zu isolieren, das nur 1 von einer Million des genetischen Materials in einem Organismus ausmacht.Die DNA von Der interessierende Organismus wird in kleine Stücke zerlegt, die dann in einzelne Zellen gelegt werden. Ihr Wissen über rekombinante DNA-Technologien wird in Ihrem Verständnis der Bedeutung von GenBank ® gipfeln, der riesigen Datenbank, die die DNA-Sequenz des gesamten Genoms für viele verschiedene Organismen enthält, und verstehen, warum dies nützlich ist

rekombinante DNA-veränderte DNA, die aus der Insertion einer Sequenz (einer ganzen oder teilweisen DNA-Kette), die ursprünglich (biologisch) nicht in dieser Kette vorhanden war, auf chemischem, enzymatischem oder biologischem Wege in die Kette resultiert. Farlex Partner Medical Dictionary © Farlex 201 Im vergangenen Jahrhundert war die rekombinante DNA-Technologie nur eine Vorstellung davon, dass wünschenswerte Eigenschaften im lebenden Körper durch die Kontrolle der Expression von Zielgenen verbessert werden können. In jüngster Zeit hat dieses Feld jedoch einzigartige Auswirkungen auf den Fortschritt im menschlichen Leben gezeigt. Dank dieser Technologie werden wichtige Proteine ​​​​für gesundheitliche Probleme und Ernährungszwecke benötigt. Es wurde seitdem viele Male überarbeitet und aktualisiert, ist aber immer noch der Standard für die Klassifizierung von Experimenten mit rekombinanter Desoxyribonukleinsäure (rDNA) nach Gefährdung und für die Empfehlung geeigneter Eindämmungsniveaus

Bio 102 Praxisprobleme Rekombinante DNA und Biotechnolog Rekombinante DNA wird in Impfstoffen verwendet, bei denen genetisches Material direkt in den menschlichen Körper injiziert wird. Dieses genetische Material liegt in Form eines Plasmids oder einer DNA-Schleife aus dem Fremden vor.. . Amplifizieren der rekombinanten NA Um große Mengen des rekombinanten NA-Moleküls zu gewinnen, muss es amplifiziert werden. Dies wird erreicht, indem die rekombinante NA in einen bakteriellen Wirtsstamm transformiert wird. (Die Zellen werden mit CaCl 2 behandelt à NA wird hinzugefügt à Zellen werden bei 42 C einem Hitzeschock ausgesetzt à NA geht durch einen etwas unbekannten Mechanismus in die Zelle ein. Rekombinante DNA ist eine moderne Technologie, bei der die DNA eines Organismus mit der DNA eines anderen kombiniert wird beinhaltet häufig das Einfügen menschlicher DNA in die DNA eines anderen Organismus.Wenn diese gentechnisch veränderten Organismen kultiviert werden, produzieren sieein menschliches Protein Rekombinante DNA-(rDNA)-Moleküle sind DNA-Moleküle, die durch Labormethoden der genetischen Rekombination (wie molekulares Klonen) gebildet werden, um sie zusammenzubringen genetisches Material aus mehreren Quellen, wodurch Sequenzen entstehen, die sonst im Genom nicht zu finden wären.Rekombinante DNA ist möglich, da DNA-Moleküle aus allen Organismen die gleiche chemische Struktur aufweisen

Rekombinante DNA - Definition und Beispiele Biologie Wörterbuch

Rekombinante DNA heeft tal van toepassingen in de wetenschap en de geneeskunde. Een bekende toepassing van rekombinanter DNA in der Produktion von Insulin. Voorafgaand aan de komst van deze technologie, insuline grotendeels afkomstig van dieren. Insuline kan nu efficiënter geproduceerd Door organismen zoals E. coli en gist rekombinante DNA-Übersicht. Überblick über das Klonen. Abbildung 14-1 auf S. 1 425 Abbildung 14-6, p. 430 Bildung rekombinanter Molekülvermehrung im Vektor Zweck: Amplifikation einzelner DNA-Sequenzen. Schritte zur Herstellung rekombinanter DNA. DNA isolieren. Abbildung 14-2. unter Verwendung von Ultrazentrifugation von einem interessierenden Organismus. DNA schneiden. DNA-Fragmente generieren 10 Hauptanwendungen der rekombinanten DNA-Technologie im Leben 12. November 2020 7. Oktober 2012 von Ranga.nr Es ist der Prozess der Isolierung des gewünschten Gens aus einem interessierenden Organismus und der Übertragung auf einen Organismus der Wahl, um die gewünschtes Produkt in großen Mengen

Video: Was ist rekombinante DNA? - Medizinische Neu

Die 1975 im Asilomar Conference Center in Kalifornien abgehaltene Internationale Konferenz über rekombinante DNA-Moleküle hat einen langen Schatten geworfen. Das damals bahnbrechende Treffen von Wissenschaftlern zur Entwicklung von Richtlinien zur DNA-Forschung bleibt die Vorlage für Foren zur sicheren und ethischen Nutzung der Biotechnologie Rekombinante DNA (rDNA) ist eine Technologie, die Enzyme verwendet, um DNA-Sequenzen von Interesse zu schneiden und zusammenzufügen. Die rekombinierten DNA-Sequenzen können in Vehikel, sogenannte Vektoren, platziert werden, die die DNA in eine geeignete Wirtszelle transportieren, wo sie kopiert oder exprimiert werden kann

Rekombinante DNA-Technologie für die Impfstoffentwicklung Science

  • Alle Versuche, die sich auf DNA-Beweise stützen, und Kontroversen über die Verwendung von gentechnisch verändertem Mais und anderen Organismen
  • Die Untersuchung von Krankheitsgenen und ihrer Funktion bei einem nicht betroffenen Individuum wurde durch die Entwicklung rekombinanter DNA und Klonierungstechniken möglich. Der Begriff Genklonierung umfasst eine Reihe von..
  • Rekombinant DNA ist die Quelle für die direkte Injektion von genetischem Material in den Körper durch Impfstoffe. Das genetische Material wird in Form eines Plasmids oder eines Vektors verpackt und einem fremden Antigen entnommen und von Impfstoffen angegriffen. Wenn die rekombinante DNA durch Muskeln in den Körper injiziert wird, nehmen die Zellen dieses fremde Gen und beginnen mit der Produktion des Gens.
  • Rekombinante DNA-Technologie Der Mensch kann Fortschritte in der DNA-Technologie nutzen, um DNA im Labor zu manipulieren und Mikroorganismen zu verbessern. Bei der rekombinanten DNA-Technologie kann ein DNA-Fragment..
  • Rekombinante DNA: Gene und Genome - Ein kurzer Kurs, 3. Auflage 3. Auflage. Rekombinante DNA: Gene und Genome - Ein kurzer Kurs, 3. Auflage. 3. Auflage. von James D. Watson (Autor), Richard M. Meyers (Autor), Amy A. Caudy (Autor), Jan A. Witkowski (Autor) & 1 mehr. 4,1 von 5 Sternen 22 Bewertungen. ISBN-13: 978-0716728665. ISBN-10: 0716728664
  • Die rekombinante DNA-Technologie verwendet die DNA eines bestimmten Organismus und spleißt diese DNA dann in bakterielle DNA, und dann wird diese DNA geteilt und repliziert. Die bakterielle DNA wird als Plasmid bezeichnet. Plasmide sind diese kleinen kreisförmigen Bereiche zusätzlicher DNA-Moleküle innerhalb eines Bakteriums

Buch über rekombinante DNA. Lesen Sie 3 Rezensionen aus der weltweit größten Community für Leser. Ein Überblick über rekombitante DNA-Techniken und Fortschritte in der Übersichtsarbeit in r.. Eine Sammlung verschiedener c-DNA-Fragmente ist eine c-DNA-Bibliothek. Genbibliotheken werden durch spezielle Techniken gepflegt. Anwendungen der rekombinanten DNA-Technologie: Die Technik der rekombinanten DNA kann wie folgt verwendet werden: 1. Sie kann verwendet werden, um molekulare Ereignisse im biologischen Prozess der zellulären Differenzierung und Alterung aufzuklären. 2

Rekombinante DNA - Shop medisinske leksiko

Adoptierte und Familienmitglieder, die nach ihren biologischen Verwandten suchen, können bis zum 30. April 2018 auf DNAQuest.org ein kostenloses MyHeritage DNA-Kit beantragen. Die Teilnehmer werden ausgewählt und ihre kostenlosen DNA-Kits werden ihnen bis Ende Mai 2018 zugesandt. Ergebnisse werden bereits im Juli 2018 erwartet Rekombinante DNA-Verfahren wurden nun für das Problem der Identifizierung von molekularen Defekten beim Menschen angewendet, die für Erbkrankheiten, somatische Mutationen im Zusammenhang mit Neoplasien, verantwortlich sind. Neben den Anwendungen hat die rekombinante DNA-Technologie auch Nachteile, die wie folgt sind: 1. Antibiotika-resistente Gene werden als Markergen zur Identifizierung transformierter Zellen verwendet. Dies hat zu Antibiotikaresistenzen bei menschlichen Krankheitserregern geführt. 2. Insektenresistente Pflanzen produzieren bestimmte Chemikalien, die für Insekten schädlich sind

1972: Erste rekombinante DNA. Die erste Produktion rekombinanter DNA-Moleküle unter Verwendung von Restriktionsenzymen erfolgte in den frühen 1970er Jahren. Die rekombinante DNA-Technologie beinhaltet das Verbinden von DNA verschiedener Spezies und das anschließende Einfügen der Hybrid-DNA in eine Wirtszelle, oft ein Bakterium Kniha byla v knihovně. Rekombinantní dna

Rekombinante DNA-Technologie - ein Überblick ScienceDirect

Führt rekombinante DNA und Genklonierung ein. Wir haben alle Inhalte für dieses Konzept zur besseren Organisation nach verschoben.Bitte aktualisieren Sie Ihre Lesezeichen entsprechend Rekombinante DNA-Moleküle (rDNA) sind DNA-Moleküle, die durch Labormethoden der genetischen Rekombination (z

11.1: Rekombinante DNA- und Genklonierung - Biologie LibreText

Setzen Sie die gewünschten Gene durch rekombinante DNA-Technologie ein und transformieren Sie dann eine Pflanze und erhalten Sie eine Pflanze mit einem neuen Merkmal. Diese T-DNA muss dann sowohl das gewünschte Gen als auch ein sogenanntes selektierbares Markergen enthalten. Erkunden Sie unseren Katalog Melden Sie sich kostenlos an und erhalten Sie personalisierte Empfehlungen, Updates und Angebote. Der Prozess der Herstellung rekombinanter DNA wird als molekulares Klonen bezeichnet. Das grundlegende Verfahren des molekularen Klonens umfasst das Isolieren von DNA, das Schneiden von DNA, das Verbinden von DNA und das Amplifizieren der rekombinanten DNA. Stanley Cohen und Herbert Boyers historisches Experiment verwendeten Techniken zum Schneiden und Einfügen von DNA, um den ersten maßgeschneiderten Organismus zu schaffen, der rekombinierte oder rekombinante DNA enthält. Cohen und Boyer fügten das von ihnen erzeugte rekombinante DNA-Molekül mittels eines Plasmids in E. coli-Bakterien ein und induzieren dadurch die Aufnahme und Expression einer fremden DNA-Sequenz, die als Transformation bekannt ist . coli. Einheitendefinition Eine Einheit Taq DNA Polymerase ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um 10 nmol Desoxyribonukleotid in 30 min bei 74 °C in die DNA einzubauen. Für eine überlegene PCR-Leistung empfehlen wir DreamTaq DNA Polymerase Všechny informace o produktu Kniha Recombinant DNA Controversy, porovnání cen z internetových obchodů, hodnocení a recenze Recombinant DNA Controversy


Expression und Charakterisierung von rekombinanter humaner Phospholipidhydroperoxid-Glutathionperoxidase

Phospholipidhydroperoxid-Glutathionperoxidase (PHGPx oder GPx4 EC1.11.1.12) ist eine Selenoperoxidase, die Phospholipid- und Cholesterinhydroperoxide direkt reduzieren kann. Das reife cytoplasmatische GPx4 ist ein monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 19,5 kDa. In dieser Studie wurde das menschliche GPx4-(hGPx4)-Gen aus der komplementären DNA-Bibliothek der menschlichen Hepatomzelllinie amplifiziert. Das eukaryotische Expressionsplasmid pSelExpress1-Leader-GPx4 wurde konstruiert und in die eukaryotischen Zellen HEK293T transfiziert. Die Expression von hGPx4 wurde durch Western-Blotting nachgewiesen und das Zielprotein wurde durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie gereinigt. Die Ergebnisse der Aktivität und Kinetik des gereinigten Proteins zeigen, dass das erhaltene Protein einem "Ping-Pong"-Mechanismus folgt, der dem der nativen zytosolischen Glutathionperoxidase (GPx1 EC1.11.1.9) ähnlich ist. Dies ist das erste Mal, dass hGPx4 aus HEK293T-Zellen exprimiert und gereinigt werden konnte, und diese Arbeit wird eine wichtige Quelle für hGPx4 für seine Funktionsstudie in vitro und in vivo bereitstellen.

Schlüsselwörter: eukaryotische Expression Glutathionperoxidaseaktivität Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase Selenocystein Selenoproteinexpression.


Teil 1: Die Grundprinzipien der Genklonierung und DNA-Analyse.

1 Warum Genklonen und DNA-Analyse wichtig sind.

1.1 Die frühe Entwicklung der Genetik.

1.2 Das Aufkommen der Genklonierung und der Polymerase-Kettenreaktion.

1.5 Warum Genklonierung und PCR so wichtig sind.

1.6 So finden Sie sich in diesem Buch zurecht.

2 Vektoren für die Genklonierung: Plasmide und Bakteriophagen.

3 Reinigung von DNA aus lebenden Zellen.

3.1 Herstellung von Gesamtzell-DNA.

3.2 Herstellung von Plasmid-DNA.

3.3 Herstellung von Bakteriophagen-DNA.

4 Manipulation von gereinigter DNA.

4.1 Das Spektrum der DNA-manipulativen Enzyme.

4.2 Enzyme zum Schneiden von DNA – Restriktionsendonukleasen.

4.3 Ligation – Zusammenfügen von DNA-Molekülen.

5 Einführung von DNA in lebende Zellen.

5.1 Transformation – die Aufnahme von DNA durch Bakterienzellen.

5.2 Identifizierung von Rekombinanten.

5.3 Einführung von Phagen-DNA in Bakterienzellen.

5.4 Identifizierung rekombinanter Phagen.

5.5 Einführung von DNA in nichtbakterielle Zellen.

6 Klonierungsvektoren für E coli.

6.1 Klonierungsvektoren basierend auf E coli Plasmide.

6.2 Klonierungsvektoren basierend auf M13-Bakteriophagen.

6.3 Klonierungsvektoren basierend auf 1 Bakteriophagen.

6.4 λ und andere Vektoren mit hoher Kapazität ermöglichen die Konstruktion genomischer Bibliotheken.

6.5 Vektoren für andere Bakterien.

7 Klonierungsvektoren für Eukaryoten.

7.1 Vektoren für Hefe und andere Pilze.

7.2 Klonierungsvektoren für höhere Pflanzen.

7.3 Klonierungsvektoren für Tiere.

8 So erhalten Sie einen Klon eines bestimmten Gens.

8.1 Das Problem der Auswahl.

8.3 Identifizierung eines Klons aus einer Genbibliothek.

8.4 Methoden zur Klonidentifikation.

9 Die Polymerase-Kettenreaktion.

9.1 Die Polymerase-Kettenreaktion im Überblick.

9.3 Nach der PCR: Untersuchung von PCR-Produkten.

9.4 Real time PCR ermöglicht die Quantifizierung der Menge des Ausgangsmaterials.

Teil 2: Die Anwendungen der Genklonierung und DNA-Analyse in der Forschung.

10 Sequenzierung von Genen und Genomen.

10.1 Die Methodik für die DNA-Sequenzierung.

10.2 Wie man ein Genom sequenziert.

11 Untersuchung der Genexpression und -funktion.

11.1 Untersuchung des RNA-Transkripts eines Gens.

11.2 Untersuchung der Regulation der Genexpression.

11.3 Identifizierung und Untersuchung des Translationsprodukts eines klonierten Gens.

12.2 Untersuchungen des Transkriptoms und des Proteoms.

Teil 3: Die Anwendungen der Genklonierung und DNA-Analyse in der Biotechnologie.

13 Produktion von Protein aus geklonten Genen.

13.1 Spezielle Vektoren zur Expression fremder Gene in E coli.

13.2 Allgemeine Probleme bei der Produktion von rekombinantem Protein in E coli.

13.3 Produktion von rekombinantem Protein durch eukaryontische Zellen.

14 Genklonierung und DNA-Analyse in der Medizin.

14.1 Herstellung rekombinanter Arzneimittel.

14.2 Identifizierung von Genen, die für menschliche Krankheiten verantwortlich sind.

15 Genklonierung und DNA-Analyse in der Landwirtschaft.

15.1 Der Gen-Additions-Ansatz in der Pflanzengentechnik.

15.3 Probleme mit gentechnisch veränderten Pflanzen.

16 Genklonierung und DNA-Analyse in der Forensik und Archäologie.


Klonierung, Expression und Funktion von TFC5, dem Gen, das die B"-Komponente des Saccharomyces cerevisiae-RNA-Polymerase-III-Transkriptionsfaktors TFIIIB codiert.

TFC5, das einzigartige und essentielle Gen, das für die B"-Komponente des RNA-Polymerase-III-Transkriptionsfaktors (TF)IIIB von Saccharomyces cerevisiae kodiert, wurde kloniert. Es kodiert für ein Protein mit 594 Aminosäuren (67,688 Da). Escherichia coli-produziertes B" wurde verwendet, um vollständig rekombinantes TFIIIB zu rekonstituieren, das für TFIIIC-gerichtete sowie TATA-Box-abhängige DNA-Bindung und Transkription voll funktionsfähig ist. Die DNase I-Fußabdrücke von vollständig rekombinantem TFIIIB, bestehend aus B", dem 67-kDa-Brf und TATA-Box-bindendem Protein, und TFIIIB rekonstituiert mit natürlichem B" sind nicht zu unterscheiden. Eine verkürzte Form von B" ohne 39 N-terminale und 107 C-terminale Aminosäuren ist auch für die Transkription funktionell.


Genklonierung und DNA-Analyse 8. Auflage

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Vorwort zur achten Auflage xv

Teil I Die Grundlagen der Genklonierung und DNA-Analyse 1

1 Warum Genklonen und DNA-Analyse wichtig sind 3

2 Vektoren für die Genklonierung: Plasmide und Bakteriophagen 15

3 Reinigung von DNA aus lebenden Zellen 29

4 Manipulation gereinigter DNA 53

5 Einführung von DNA in lebende Zellen 83

6 Klonierungsvektoren für E. coli 101

7 Klonierungsvektoren für Eukaryoten 121

8 So erhalten Sie einen Klon eines bestimmten Gens 145

9 Die Polymerase-Kettenreaktion 169

Teil II Die Anwendungen der Genklonierung und DNA-Analyse in der Forschung 187

10 Sequenzierungsgene und Genome 189

11 Untersuchung der Genexpression und -funktion 217

13 Studieren von Transkriptomen und Proteomen 259

Teil III Die Anwendungen der Genklonierung und DNA-Analyse in der Biotechnologie 275

14 Produktion von Protein aus geklonten Genen 277

15 Genklonierung und DNA-Analyse in der Medizin 301

16 Genklonierung und DNA-Analyse in der Landwirtschaft 327

17 Genklonierung und DNA-Analyse in der Forensik und Archäologie 355

Vorwort zur achten Auflage xv

Teil I Die Grundlagen der Genklonierung und DNA-Analyse 1

1 Warum Genklonen und DNA-Analyse wichtig sind 3

1.1 Die frühe Entwicklung der Genetik 4

1.2 Das Aufkommen der Genklonierung und der Polymerase-Kettenreaktion 4

1.3 Was ist Genklonen? 5

1.5 Warum Genklonierung und PCR so wichtig sind 8

1.5.1 Gewinnen einer reinen Probe eines Gens durch Klonen von 8

1.5.2 PCR kann auch verwendet werden, um ein Gen zu reinigen 10

1.6 So finden Sie sich in diesem Buch zurecht 11

2 Vektoren für die Genklonierung: Plasmide und Bakteriophagen 15

2.1.1 Größe und Exemplarnummer 17

2.1.2 Konjugation und Kompatibilität 18

2.1.3 Plasmidklassifikation 19

2.1.4 Plasmide in anderen Organismen als Bakterien 19

2.2.1 Der Phageninfektionszyklus 20

2.2.3 Viren als Klonierungsvektoren für andere Organismen 26

3 Reinigung von DNA aus lebenden Zellen 29

3.1 Präparation von Gesamtzell-DNA 30

3.1.1 Anzucht und Ernte einer Bakterienkultur 30

3.1.2 Herstellung eines Zellextrakts 31

3.1.3 Aufreinigung von DNA aus einem Zellextrakt 33

3.1.4 Konzentration von DNA-Proben 37

3.1.5 Messung der DNA-Konzentration 38

3.1.6 Andere Methoden zur Herstellung von Gesamtzell-DNA 39

3.2 Herstellung von Plasmid-DNA 40

3.2.1 Aufteilung nach Baugröße 41

3.2.2 Trennung nach Konformation 42

3.2.3 Plasmid-Amplifikation 44

3.3 Herstellung von Bakteriophagen-DNA 46

3.3.1 Anzucht von Kulturen zur Erzielung eines hohen λ-Titers 47

3.3.2 Herstellung nicht lysogener λ-Phagen 47

3.3.3 Sammlung von Phagen aus einer infizierten Kultur 49

3.3.4 Aufreinigung von DNA aus λ Phagenpartikeln 49

3.3.5 Aufreinigung von M13-DNA verursacht wenig Probleme 49

4 Manipulation gereinigter DNA 53

4.1 Die Bandbreite der DNA-manipulativen Enzyme 55

4.1.4 DNA-modifizierende Enzyme 58

4.2 Enzyme zum Schneiden von DNA – Restriktionsendonukleasen 59

4.2.1 Entdeckung und Funktion von Restriktionsendonukleasen 60

4.2.2 Restriktionsendonukleasen vom Typ II schneiden DNA an spezifischen Nukleotidsequenzen 61

4.2.3 Stumpfe Enden und klebrige Enden 62

4.2.4 Die Häufigkeit von Erkennungssequenzen in einem DNA-Molekül 63

4.2.5 Durchführung eines Restriktionsverdaus im Labor 64

4.2.6 Analyse des Ergebnisses der Restriktionsendonuklease-Spaltung 66

4.2.7 Abschätzung der Größe von DNA-Molekülen 68

4.2.8 Kartierung der Positionen verschiedener Restriktionsschnittstellen in einem DNA-Molekül 69

4.2.9 Spezielle Gelelektrophoresemethoden zur Trennung größerer Moleküle 70

4.3 Ligation – Zusammenfügen von DNA-Molekülen 72

4.3.1 Die Wirkungsweise der DNA-Ligase 72

4.3.2 Sticky Ends erhöhen die Effizienz der Ligation 74

4.3.3 Anbringen von klebrigen Enden an einem stumpfen Molekül 74

4.3.4 Stumpfe Endligation mit einer DNA-Topoisomerase 79

5 Einführung von DNA in lebende Zellen 83

5.1 Transformation – die Aufnahme von DNA durch Bakterienzellen 85

5.1.1 Nicht alle Bakterienarten sind bei der DNA-Aufnahme gleich effizient 85

5.1.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 86

5.1.3 Selektion für transformierte Zellen 86

5.2 Identifizierung von Rekombinanten 88

5.2.1 Rekombinante Selektion mit pBR322 – Insertionsinaktivierung eines Antibiotikaresistenzgens 89

5.2.2 Insertionsinaktivierung beinhaltet nicht immer Antibiotikaresistenz 90

5.3 Einführung von Phagen-DNA in Bakterienzellen 92

5.3.2 In-vitro-Verpackung von λ Klonierungsvektoren 93

5.3.3 Phageninfektion wird als Plaque auf einem Agarmedium dargestellt 93

5.3.4 Identifizierung rekombinanter Phagen 95

5.4 Einführung von DNA in nicht-bakterielle Zellen 97

5.4.1 Transformation einzelner Zellen 97

5.4.2 Transformation ganzer Organismen 99

6 Klonierungsvektoren für E. coli 101

6.1 Klonierungsvektoren basierend auf E. coli-Plasmiden 102

6.1.1 Die Nomenklatur von Plasmid-Klonierungsvektoren 102

6.1.2 Die nützlichen Eigenschaften von pBR322 102

6.1.3 Der Stammbaum von pBR322 103

6.1.4 Komplexere E. coli-Plasmidklonierungsvektoren 104

6.2 Klonierungsvektoren basierend auf λ Bakteriophage 108

6.2.1 Natürliche Selektion wurde verwendet, um modifizierte λ zu isolieren, denen bestimmte Restriktionsstellen fehlen 108

6.2.2 Segmente des λ-Genoms können ohne Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit gelöscht werden 108

6.2.3 Einfügungs- und Ersetzungsvektoren 110

6.2.4 Klonierungsexperimente mit λ Insertions- oder Ersatzvektoren 112

6.2.5 Lange DNA-Fragmente können mit einem Cosmid 113 . kloniert werden

6.2.6 λ und andere Vektoren mit hoher Kapazität ermöglichen die Konstruktion genomischer Bibliotheken 114

6.3 Klonierungsvektoren zur Synthese von einzelsträngiger DNA 115

6.3.1 Vektoren basierend auf dem M13-Bakteriophagen 115

6.3.2 Hybridplasmid – M13-Vektoren 117

6.4 Vektoren für andere Bakterien 118

7 Klonierungsvektoren für Eukaryoten 121

7.1 Vektoren für Hefen und andere Pilze 121

7.1.1 Selektierbare Marker für das 2 µm Plasmid 122

7.1.2 Vektoren basierend auf dem 2 µm Plasmid – Hefe episomale Plasmide 122

7.1.3 Ein YEp kann in die chromosomale DNA von Hefe 124 inserieren

7.1.4 Andere Typen von Hefeklonierungsvektor 124

7.1.5 Künstliche Chromosomen können verwendet werden, um lange DNA-Stücke in Hefe zu klonen 126

7.1.6 Vektoren für andere Hefen und Pilze 129

7.2 Klonierungsvektoren für höhere Pflanzen 129

7.2.1 Agrobacterium tumefaciens – kleinster Gentechniker der Natur 130

7.2.2 Klonen von Genen in Pflanzen durch direkten Gentransfer 135

7.2.3 Versuche, Pflanzenviren als Klonierungsvektoren zu verwenden 137

7.3 Klonierungsvektoren für Tiere 138

7.3.1 Klonierungsvektoren für Insekten 139

7.3.2 Klonen bei Säugetieren 141

8 So erhalten Sie einen Klon eines bestimmten Gens 145

8.1 Das Auswahlproblem 146

8.1.1 Es gibt zwei grundlegende Strategien, um den gewünschten Klon zu erhalten 146

8.2.1 Markerrettung erweitert den Umfang der Direktauswahl 149

8.2.2 Umfang und Grenzen der Markerrettung 150

8.3 Identifizierung eines Klons aus einer Genbibliothek 150

8.4 Methoden zur Klonidentifikation 153

8.4.1 Komplementäre Nukleinsäurestränge hybridisieren aneinander 154

8.4.2 Kolonie- und Plaque-Hybridisierungssondierung 154

8.4.3 Beispiele für die praktische Anwendung der Hybridisierungssondierung 157

8.4.4 Identifizierungsmethoden basierend auf dem Nachweis des Translationsprodukts des klonierten Gens 164

9 Die Polymerase-Kettenreaktion 169

9.2 PCR im Detail 172

9.2.1 Design der Oligonukleotid-Primer für eine PCR 172

9.2.2 Ermitteln der richtigen Temperaturen für die Verwendung von 174

9.3 Nach der PCR: Untersuchung von PCR-Produkten 176

9.3.1 Gelelektrophorese von PCR-Produkten 177

9.3.2 PCR-Produkte klonen 178

9.4.1 Durchführung eines Realtime-PCR-Experiments 180

9.4.2 Real†-Time-PCR ermöglicht die Quantifizierung der Ausgangsmaterialmenge 182

9.4.3 Schmelzkurvenanalyse ermöglicht die Identifizierung von Punktmutationen 184

Teil II Die Anwendungen der Genklonierung und DNA-Analyse in der Forschung 187

10 Sequenzierungsgene und Genome 189

10.1 Kettenabbruch DNA-Sequenzierung 190

10.1.1 Kettenabbruchsequenzierung in Gliederung 190

10.1.2 Nicht alle DNA-Polymerasen können für die Sequenzierung verwendet werden 192

10.1.3 Kettenabbruch-Sequenzierung mit Taq-Polymerase 193

10.1.4 Einschränkungen der Kettenabbruchsequenzierung 195

10.2 Sequenzierung der nächsten Generation 196

10.2.1 Vorbereiten einer Bibliothek für ein Illumina-Sequenzierungsexperiment 197

10.2.2 Die Sequenzierungsphase eines Illumina-Experiments 199

10.2.3 Ionenhalbleiter-Sequenzierung 201

10.2.4 Sequenzierung der dritten Generation 201

10.2.5 Next Generation Sequencing ohne DNA-Polymerase 202

10.2.6 Steuerung der Next-Generation-Sequenzierung auf bestimmte Gensätze 203

10.3 Sequenzierung eines Genoms 205

10.3.1 Shotgun-Sequenzierung prokaryontischer Genome 206

10.3.2 Sequenzierung eukaryontischer Genome 209

11 Untersuchung der Genexpression und -funktion 217

11.1 Untersuchung des RNA-Transkripts eines Gens 218

11.1.1 Nachweis des Vorhandenseins eines Transkripts in einer RNA-Probe 219

11.1.2 Transcript-Mapping durch Hybridisierung zwischen Gen und RNA 220

11.1.3 Transkriptanalyse durch Primer-Extension 222

11.1.4 Transkriptanalyse durch PCR 223

11.2 Untersuchung der Regulation der Genexpression 224

11.2.1 Proteinbindungsstellen auf einem DNA-Molekül identifizieren 225

11.2.2 Identifizierung von Kontrollsequenzen durch Deletionsanalyse 230

11.3 Identifizierung und Untersuchung des Translationsprodukts eines klonierten Gens 232

11.3.1 HRT und HART können das Translationsprodukt eines klonierten Gens identifizieren 233

11.3.2 Analyse von Proteinen durch in vitro-Mutagenese 234

12.1 Auffinden der Gene in einer Genomsequenz 244

12.1.1 Auffinden von Protein-kodierenden Genen durch Scannen einer Genomsequenz 244

12.1.2 Die Genlokalisierung wird durch die Homologiesuche unterstützt 247

12.1.3 Auffinden von Genen für nichtkodierende RNA-Transkripte 249

12.1.4 Identifizierung der Bindungsstellen für regulatorische Proteine ​​in einer Genomsequenz 250

12.2 Bestimmung der Funktion eines unbekannten Gens 251

12.2.1 Zuordnung von Genfunktionen durch Computeranalyse 251

12.2.2 Genfunktion durch experimentelle Analyse zuordnen 252

13 Studieren von Transkriptomen und Proteomen 259

13.1 Transkriptome studieren 259

13.1.1 Untersuchung von Transkriptomen durch Microarray- oder Chipanalyse 260

13.1.2 Untersuchung von Transkriptomen durch RNA-Sequenzierung 261

13.2 Studium der Proteome 265

13.2.1 Protein-Profiling 266

13.2.2 Protein-Protein-Interaktionen untersuchen 270

Teil III Die Anwendungen der Genklonierung und DNA-Analyse in der Biotechnologie 275

14 Produktion von Protein aus geklonten Genen 277

14.1 Spezielle Vektoren zur Expression fremder Gene in E. coli 280

14.1.1 Der Promotor ist die kritische Komponente eines Expressionsvektors 281

14.1.2 Kassetten und Genfusionen 285

14.2 Allgemeine Probleme bei der Produktion von rekombinantem Protein in E. coli 287

14.2.1 Probleme aufgrund der Sequenz des Fremdgens 288

14.2.2 Probleme durch E. coli 289

14.3 Produktion von rekombinantem Protein durch eukaryontische Zellen 290

14.3.1 Rekombinantes Protein aus Hefe und Fadenpilzen 291

14.3.2 Verwendung tierischer Zellen zur rekombinanten Proteinproduktion 293

14.3.3 Pharming – rekombinantes Protein aus lebenden Tieren und Pflanzen 295

15 Genklonierung und DNA-Analyse in der Medizin 301

15.1 Herstellung rekombinanter Arzneimittel 301

15.1.1 Rekombinantes Insulin 302

15.1.2 Synthese menschlicher Wachstumshormone in E. coli 304

15.1.3 Rekombinanter Faktor VIII 305

15.1.4 Synthese anderer rekombinanter humaner Proteine ​​308

15.1.5 Rekombinante Impfstoffe 308

15.2 Identifizierung von Genen, die für menschliche Krankheiten verantwortlich sind 314

15.2.1 Wie man ein Gen für eine genetische Krankheit identifiziert 315

15.2.2 Genetische Typisierung von Krankheitsmutationen 320

15.3.1 Gentherapie bei Erbkrankheiten 321

15.3.2 Gentherapie und Krebs 323

15.3.3 Die ethischen Fragen, die die Gentherapie aufwirft 324

16 Genklonierung und DNA-Analyse in der Landwirtschaft 327

16.1 Der Gen-Additions-Ansatz in der Pflanzengentechnik 328

16.1.1 Pflanzen, die ihre eigenen Insektizide herstellen 328

16.1.2 Herbizidresistente Pflanzen 334

16.1.3 Verbesserung der ernährungsphysiologischen Qualität von Pflanzen durch Genaddition 337

16.1.4 Andere Gen-Additions-Projekte 338

16.2.1 Antisense-RNA und das Engineering der Fruchtreifung in Tomaten 340

16.2.2 Andere Beispiele für den Einsatz von Antisense-RNA in der Pflanzengentechnik 342


Gentechnisch veränderte Tiere

Keimbahn- und Nichtkeimbahn-transgene Tiere können durch den Einsatz neuer Biotechnologien erzeugt werden. Ektopischer DNA-Transfer (nicht-keimbahntransgen) bezieht sich auf die direkte Verabreichung von DNA-Konstrukten oder transgenen Stammzellen in nicht-reproduktionsfähige Gewebe von Föten oder lebenden Tieren, um transgene Tiere zu erhalten, aber ihre transgenen Eigenschaften werden nicht über die Gameten an zukünftige Generationen weitergegeben [10]. Im Mittelpunkt dieses Artikels steht die Keimbahntransgenese (Abb. 4). Im Wesentlichen basiert die Produktion transgener Tiere auf biochemischen Reaktionen, Zellbiologie, Zellkultur, Embryotransfer sowie fetalem Wachstum und Entwicklung bei Empfängermüttern.

Herstellung transgener Tiere durch Injektion der rekombinanten DNA in den Vorkern einer befruchteten Eizelle (Methode I) oder die Injektion transformierter embryonaler Stammzellen, die die rekombinante DNA enthalten, in eine Blastozyste (Methode II). Bei der ersten und gebräuchlichsten Methode, die für Nutztierarten verwendet wird, wird eine Eizelle kurz nach ihrer Befruchtung chirurgisch entnommen und eine rekombinante DNA (zB die interessierende Plasmid-DNA) wird dann durch eine sehr feine Nadel in den Vorkern der befruchteten Eizelle mikroinjiziert . Die transformierte Eizelle wird in vitro zu einer Blastozyste entwickelt und der Embryo wird dann zur Entwicklung auf eine Leihmutter übertragen. Bei der zweiten Methode werden etablierte embryonale Stammzellen (hergestellt aus einem Präimplantationsembryo), die das interessierende Gen in ihrem Genom exprimieren, mit einer rekombinanten DNA transfiziert. Stabil transformierte ES-Zellen werden selektiert und dann in die innere Zellmasse einer Empfängerblastozyste injiziert. Nach einer kurzen Kulturzeit wird der Embryo, der das rekombinante Gen in seinem Genom enthält, zur Entwicklung auf eine Leihmutter übertragen. Bei beiden Methoden produzieren Leihmütter transgene Nachkommen, aber die Herkunft der Blastozyste ist unterschiedlich

Ein transgenes Tier ist ein Tier, das ein absichtlich in sein Genom eingefügtes fremdes Gen trägt. Das Fremdgen wird in vitro unter Verwendung der rDNA-Technologie konstruiert. Die Plasmid-DNA enthält nicht nur das interessierende Gen, sondern auch andere DNA-Sequenzen, einschließlich eines Promotorsegments (um die Genexpression zu steuern und das Gen auf ein spezifisches Gewebe auszurichten), Enhancer-Sequenzen (um die Genfunktion zu amplifizieren) und ein Markergen (zur Einbau der DNA in das Genom des Tieres nachweisen). Das DNA-Konstrukt wird dann nach einer der beiden etablierten Methoden in das Keimbahngenom des Tieres eingebaut: (a) Injektion der rDNA (auch bekannt als DNA-Konstrukt) in den Vorkern einer befruchteten Eizelle (Methode I) und (b ) Injektion transformierter embryonaler Stammzellen, die die rDNA enthalten, in eine Blastozyste (Methode II). Aufgrund des Fehlens einer etablierten Schweinezelllinie echter embryonaler Stammzellen wurde nur Methode I (genetische Modifikationen in somatischen Zellen und SCNT) verwendet, um gentechnisch veränderte Schweine zu erzeugen [38]. Darüber hinaus können transponierbare Elemente (Transposons) [39] und Retrovirus-Vektoren [40] verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen und zu manipulieren.

Bei der ersten und gebräuchlichsten Methode wird eine Eizelle kurz nach ihrer Befruchtung chirurgisch entnommen und anschließend eine rDNA (z. B. die interessierende Plasmid-DNA) durch eine sehr feine Nadel in den Vorkern der befruchteten Eizelle mikroinjiziert [24]. Alternativ erhält eine Eizelle eine intrazytoplasmatische Injektion von Spermien, die mit einer interessierenden Plasmid-DNA transfiziert sind [41]. Die transformierte Eizelle wird in vitro zu einer Blastozyste entwickelt und die Blastozyste wird dann zur Entwicklung in eine weibliche Leihmutter übertragen. Einige der Nachkommen (transgen) enthalten die rDNA, die in ihr eigenes Genom integriert wurde. Da das Fremdgen sowohl in Keimzellen als auch in somatischen Zellen vorhanden ist, kann es durch Züchtung an neue Nachkommen vererbt werden [24]. Beachten Sie, dass im Fall der Kombination von Klonierungs- und Gentransfertechniken somatische Spenderzellen über Elektroporation oder virale Vektoren gentechnisch verändert werden können, gefolgt von der Produktion transgener Nachkommen durch SCNT.

Bei der zweiten Methode wird ein Gen über embryonale Stammzellen (ES) in Tiere eingebracht. ES-Zellen, die aus dem Präimplantationsembryo stammen, können sich sowohl selbst erneuern als auch pluripotente Eigenschaften beibehalten, um ein Gen-Targeting und einen Beitrag zur Keimbahn nach dem Transfer in den frühen Embryo zu ermöglichen [19]. Kurz gesagt werden ES-Zellen aus einem frühen Embryo zur Kultivierung isoliert, um Zelllinien zu etablieren, gefolgt von der Einführung einer rDNA (z. B. der interessierenden Plasmid-DNA) in ihr Genom durch Zelltransfektion. Stabil transformierte ES-Zellen werden selektiert und dann in die innere Zellmasse einer Empfängerblastozyste injiziert, um an der Entwicklung der Blastozyste zu einem frühen Embryo teilzunehmen. Bei der ersten Methode wird der Embryo, der das rekombinante Gen in seinem Genom enthält, zur Entwicklung in eine weibliche Leihmutter übertragen. Heterozygote transgene Nachkommen werden gepaart, um einen homozygoten transgenen Stamm zu erzeugen.

Vorteile und Anwendungen

Die transgene Tiertechnologie ermöglicht die Einführung eines fremden Gens in die Keimbahn eines Tieres, um ein wünschenswertes Merkmal (z. B. hohe Zuwachsraten an magerem Gewebe und Futtereffizienz) und eine neue Kapazität (z ) in einer Zuchtlinie von Nutztieren. Das Ergebnis ist die erfolgreiche Produktion transgener Tiere, darunter Schweine, Mäuse, Ratten, Rinder, Kaninchen, Schafe, Hühner und Fische [10]. Dies kann die traditionellen Züchtungstechniken ergänzen, um die Effizienz der Tierproduktion zu verbessern, indem es Folgendes verbessert: (a) die Verdauung, Aufnahme und Verwertung von Nahrungsnährstoffen, (b) die Widerstandsfähigkeit gegen Stoffwechsel- und Infektionskrankheiten und (c) die Anpassung an die Lebensumgebung [18 , 42, 43]. Darüber hinaus können transgene Schweine [z. B. α-1,3-Galactosyltransferase-Locus (GGTA1) Knock-out-Schweine, die durch Kerntransfer unter Verwendung von gengerichteten Fibroblasten hergestellt werden] können Organe für die Xenotransplantation in der Biomedizin bereitstellen [44].

Transgene Tiere können ernährungsphysiologisch essentielle Fettsäuren [45] sowie Aminosäuren, therapeutische Proteine ​​[25, 26, 31], ernährungsphysiologisch bedeutsame Proteine ​​[46] und Enzyme zur Eliminierung von antinutritiven Faktoren [47] produzieren. Der letztgenannte Ansatz kann die Effizienz der Nährstoffnutzung verbessern, um die Anzahl der Tiere in den landwirtschaftlichen Betrieben sowie die Umweltbelastung durch Stickstoff und Phosphor zu reduzieren. Transgene Tiere produzieren: (a) Lysozymen, die bakteriostatische Eigenschaften gegen Mastitis verursachende Bakterien aufweisen [48], (b) menschliche und bovine Lactoferrinproteine, die ein antimikrobielles Breitbandspektrum aufweisen [46], und (c) Impfstoffe (z. B. wirksame Malariaimpfstoffe) in der Milch [49].

Als Proof-of-Prinzip wurden transgene Schweine, die menschliches Wachstumshormon exprimieren, vor über 33 Jahren von Hammer et al. [24]. Einige Jahre später wurden transgene Schweine gezüchtet, die bovines Wachstumshormon oder den Wachstumshormon-Releasing-Faktor überexprimierten, um ihre Wachstumsrate und Futtereffizienz zu erhöhen und gleichzeitig den Körperfettgehalt und den Plasmacholesterinspiegel zu senken [50, 51]. Diese positiven Eigenschaften wurden jedoch durch negative Auswirkungen wie eine verringerte Fortpflanzungsleistung, das Auftreten von Krankheiten (z. B. Arthritis, Magengeschwüre, Dermatitis und Nierenerkrankungen) und vorzeitiger Tod ausgeglichen [50]. Diese unerwünschten Wirkungen der Transgenese bei Tieren entstehen aufgrund eines unvollständigen Verständnisses von: (a) Bedingungen (z. B. der Zusammensetzung von Nährstoffen wie Aminosäuren, Glukose, Mineralien und Vitaminen im Medium) für die Kultivierung von Embryonen, (b) regulatorischen Elemente, die für normale Expressionsmuster verantwortlich sind, (c) die Stelle der Fremd-DNA-Integration und (d) die physiologischen Funktionen spezifischer Genprodukte. Viel Forschung ist erforderlich, um diese Forschungsbereiche zu adressieren, um eine wirtschaftliche und ethische Produktion von transgenen Tieren zu ermöglichen.

Ein vielversprechendes Ergebnis der tierischen Transgenese ist die Produktion von Schweinen, die essentielle mehrfach ungesättigte Fettsäuren synthetisieren können. Saeki et al. [52] führten eine Pflanzengen-12-Fettsäure-Desaturase in das weiße Fettgewebe von Schweinen ein. Dieses Enzym entsättigt Ölsäure (C18:1, 9) an C12, um Linolsäure (C18:2, ω6) zu produzieren, eine ernährungsphysiologisch essentielle mehrfach ungesättigte Fettsäure beim Schwein [4]. Linolsäure ist eine Vorstufe für die Synthese von Arachidonsäure (C20:4, ω6), die auch eine ernährungsphysiologisch essentielle mehrfach ungesättigte Fettsäure beim Schwein ist. Darüber hinaus ist Linolsäure vorteilhaft für die Herz-Kreislauf-Gesundheit von Mensch und Schwein. Es gab auch transgene Schweine, die a . exprimierten C. elegans Gen für Fettsäuredesaturase, das Linolsäure in eine ω3 mehrfach ungesättigte Fettsäure umwandeln kann [53]. Im Vergleich zu Wildtyp-Pendants wiesen die transgenen Schweine höhere Konzentrationen von vier mehrfach ungesättigten 3-Fettsäuren auf: α-Linolensäure (C18:3, ω3), Eicosapentaensäure (C20:5, ω3), Docosapentaensäure (C22:5, ω3 ) und Docosahexaensäure (C22:6, ω3). Diese Ergebnisse sind von großer Bedeutung, denn wenn transgene Schweine mehrfach ungesättigte 6- und ω3-Fettsäuren synthetisieren können, kann die Verwendung von pflanzlichen Ölen (z die Produktionskosten für Schweine zu senken.

Ein weiteres vielversprechendes Ergebnis der modernen Biotechnologie ist die Produktion transgener Schweine, die eine mikrobielle Phytase in der Speicheldrüse exprimieren. Eine Linie von transgenen Yorkshire-Schweinen (die Cassie-Linie) wurde zuerst erzeugt, um mikrobielle Phytase im Speichel freizusetzen [54]. Diese Schweinelinie hatte eine erhöhte Fähigkeit, Futterphytat zu verdauen. Wenn zum Beispiel typische kommerzielle Diäten ohne zusätzliches Phosphor (P) gefüttert wurden, wuchsen transgene Eber und Jungsauen und verwerten Futter mit ähnlichen Raten wie bei herkömmlichen, altersentsprechenden Gegenstücken, die mit ähnlichen Diäten mit zusätzlichem P gefüttert wurden Low-P-Diät ohne zusätzliches P behielt 25–40 %, 77–91 % bzw. 27–56 % mehr P während der Entwöhnungs-, Wachstums- und Endphase bei als herkömmliche Yorkshire-Karren, die ähnliche Diäten ohne zusätzliches P erhielten , Zhanget al. [46] produzierten transgene Schweine, die in ihren Speicheldrüsen sowohl Phytase als auch Carbohydrasen (Xylanase plus zwei Arten von β-Glucanase) exprimieren, basierend auf der Isolierung der Gene aus Bakterien und Pilzen. Das transgene Schwein kann beginnen, Phytate und Nicht-Stärke-Polysaccharide im Maul zu hydrolysieren und bis zu 24% weniger Stickstoff und 44% weniger an Abfällen produzieren, verglichen mit nicht-transgenen Schweinen, die das gleiche Futter erhalten. Die quantitativen Unterschiede zwischen diesen Studien können auf Unterschiede in der Expression der Transgene und der Zusammensetzung der Nährstoffe (einschließlich Ca, P und Protein) in der Nahrung zurückzuführen sein [54,55,56]. Potenziell können Schweine, die pflanzliche oder mikrobielle Gene für die Synthese ernährungsphysiologisch essentieller Aminosäuren exprimieren, die Fütterung von P- und Low-Protein-Diäten ohne die Notwendigkeit einer Nahrungsergänzung mit P oder kristallinen Aminosäuren ermöglichen. Eine dieser Aminosäuren ist Threonin [57], das im Verhältnis zum Ferkelwachstum in pflanzlichen Futtermitteln gering ist [58].

Nachteile

Die ursprünglichen Methoden der Tiertransgenese (Pronukleare Injektion und Integration von Viren) hatten eine sehr geringe Effizienz, führten jedoch zu Gen-Silencing, schlechter Regulation der Genexpression und großer Variabilität aufgrund zufälliger Integration von Genen [19]. Ein weiterer großer Nachteil der transgenen Tiertechnologie ist das Auftreten hoher Sterblichkeitsraten vor der Geburt und vor der Entwöhnung bei Nutztierarten, einschließlich Schweinen. Dies kann aus der zufälligen Integration von Genen in das Wirtsgenom resultieren, die zu einer Insertionsmutagenese führt. Zhang et al. [47] berichteten, dass nach Übertragung von 4008 rekonstruierten Embryonen auf 16 Empfängersauen nur 33 lebende Ferkel geboren wurden, wobei die Effizienz der Embryonalentwicklung bis zur Geburt bei < 1% lag. Von den 33 lebendgeborenen Ferkeln waren 25 positiv für ein Transgen, wobei 20 Ferkel die intakte Transgen-Expressionskassette aufwiesen. Enttäuschenderweise überlebten nur 9 transgene Schweine das Absetzen. Diese Probleme, verbunden mit außerordentlich hohen Kosten, müssen überwunden werden, bevor transgene Schweine in der Produktionslandwirtschaft eingesetzt werden. Derzeit konzentriert sich die Forschung an transgenen Nutztieren auf die Nährstoffverwertung [52.53.54.55.56], die Krankheitsresistenz [59.60.61.62.63.64] und biomedizinische Anwendungen wie die Xenotransplantation von Organen ohne das α -1,3-Galactosyltransferase-Gen, das für die hyperakute Abstoßungsreaktion verantwortlich ist [18, 19, 65, 66].

Methode II zur Erzeugung transgener Tiere ist für Nutztiere nicht erfolgreich, da es keinen Bericht über ES oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) gibt, die genetische Veränderungen ertragen können und dennoch zur Keimbahn beitragen [19]. Dies ist ein kritischer Mangel der Schweinemodelle oder möglicherweise des gesamten Viehbestands. Die genetische Modifikation somatischer Zellen gefolgt von der SCNT war die einzige Möglichkeit, gentechnisch veränderte Schweine mit ortsspezifischen Veränderungen zu erzeugen, bis das Genome Editing-System direkt in sich entwickelnde Embryonen injiziert wurde [18, 63,64,65,66].


Ein rekombinantes Fasciola gigantica 14-3-3 Epsilon-Protein (rFg14-3-3e) moduliert verschiedene Funktionen mononukleärer Zellen des peripheren Bluts von Ziegen

Hintergrund: Die Molekularstruktur des Fasciola gigantica 14-3-3 Proteins wurde charakterisiert. Die Beteiligung dieses Proteins an der Pathogenese des Parasiten bleibt jedoch unklar und seine Wirkung auf die Funktionen der angeborenen Immunzellen ist unbekannt. Wir berichten über die Klonierung und Expression eines rekombinanten F. gigantica 14-3-3 epsilon Proteins (rFg14-3-3e) und testen seine Auswirkungen auf spezifische Funktionen von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) von Ziegen.

Methoden: rFg14-3-3e-Protein wurde in Pichia pastoris exprimiert. Western Blot und Immunfluoreszenzassay (IFA) wurden verwendet, um die Reaktivität des rFg14-3-3e-Proteins gegenüber Anti-F zu untersuchen. gigantica- bzw. Anti-rFg14-3-3e-Antikörper. Verschiedene Assays wurden verwendet, um die stimulierenden Wirkungen des gereinigten rFg14-3-3e-Proteins auf spezifische Funktionen von Ziegen-PBMCs zu untersuchen, einschließlich Zytokinsekretion, Proliferation, Migration, Stickoxid (NO)-Produktion, Phagozytose und apoptotische Fähigkeiten. Potentielle Protein-Interaktoren von rFg14-3-3e wurden durch Abfragen der Datenbanken Intact, String, BioPlex und BioGrid identifiziert. Eine Gesamtenergieanalyse jeder der identifizierten Interaktionen wurde durchgeführt. Die Anreicherungsanalyse der Gene Ontology (GO) wurde mit Funcasociate 3.0 durchgeführt.

Ergebnisse: Die Sequenzanalyse zeigte, dass das rFg14-3-3e-Protein eine 100%ige Identität mit dem 14-3-3 Protein von Fasciola hepatica aufwies. Western-Blot-Analysen zeigten, dass das rFg14-3-3e-Protein von Seren von experimentell mit F. gigantica infizierten Ziegen erkannt wird, und Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-rFg14-3-3e-Antikörpern der Ratte zeigte die spezifische Bindung des rFg14-3-3e-Proteins an die Oberfläche von Ziegen-PBMCs. Das rFg14-3-3e-Protein stimulierte Ziegen-PBMCs zur Produktion von Interleukin-10 (IL-10) und transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-β), entsprechend niedrigen Spiegeln von IL-4 und Interferon-gamma (IFN-γ). Außerdem förderte dieses rekombinante Protein die Freisetzung von NO und Zellapoptose und hemmte die Proliferation und Migration von Ziegen-PBMCs und unterdrückte die Monozytenphagozytose. Homologiemodellierung ergab 65% Identität zwischen rFg14-3-3e und menschlichem 14-3-3 Protein YWHAE. Die GO-Anreicherungsanalyse der interagierenden Proteine ​​identifizierte Begriffe im Zusammenhang mit Apoptose, Proteinbindung, Fortbewegung, Hippo-Signalisierung und Leukozyten- und Lymphozytendifferenzierung, was die experimentellen Ergebnisse unterstützt.

Schlussfolgerungen: Unsere Daten legen nahe, dass das rFg14-3-3e-Protein verschiedene zelluläre und immunologische Funktionen von Ziegen-PBMCs in vitro beeinflussen kann und an der Vermittlung der Pathogenese von F. gigantica beteiligt sein könnte. Aufgrund seiner Beteiligung an der F. gigantica-Erkennung durch angeborene Immunzellen könnte das rFg14-3-3e-Protein Anwendungen für die Entwicklung von Diagnostika und therapeutischen Interventionen haben.

Schlüsselwörter: 14-3-3 Epsilon Protein Isoform Fasciola gigantica Ziege Homologie Modellierung Einkernige Zellen des peripheren Blutes.

Interessenkonflikt-Erklärung

Ethikgenehmigung

Alle Protokolle wurden von der Wissenschafts- und Technologiebehörde der Provinz Jiangsu überprüft und genehmigt (Zulassungsnummer: SYXK (SU) 2010–0005).


1 Von Genen zu Genomen 1

1.2 Grundlegende Molekularbiologie 4

1.2.4 Nukleinsäuresynthese 11

1.2.5 Coiling und Supercoilin 11

1.4 Informationsfluss: Genexpression 15

1.5 Genstruktur und Organisation 20

1.6 Verfeinerungen des Modells 22

2 So klonen Sie ein Gen 25

2.2 Übersicht der Verfahren 26

2.3 Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren 29

2.3.1 Aufbrechen von Zellen und Geweben 29

2.3.2 Alkalische Denaturierung 31

2.3.3 Säulenreinigung 31

2.4 Nachweis und Quantifizierung von Nukleinsäuren 32

2.5 Gelelektrophorese 33

2.5.1 Analytische Gelelektrophorese 33

2.5.2 Präparative Gelelektrophorese 36

2.6 Restriktionsendonukleasen 36

2.6.2 Klebrige und stumpfe Enden 40

2.7.1 Ligaturbedingungen optimieren 44

2.7.2 Vermeidung unerwünschter Ligation: alkalische Phosphatase und Doppelverdau 46

2.7.3 Andere Möglichkeiten, DNA-Fragmente zu verbinden 48

2.8 Modifikation von Restriktionsfragmentenden 49

2.8.1 Linker und Adapter 50

2.8.2 Homopolymer-Tailing 52

2.9.1 Plasmidreplikation 54

2.9.3 Wählbare Marker 57

2.9.4 Insertionsinaktivierung 58

2.10 Vektoren basierend auf dem Lambda-Bakteriophagen 61

2.10.2 In vitro Verpackung 65

2.10.3 Insertionsvektoren 66

2.10.4 Ersatzvektoren 68

2.12 Supervektoren: YACs und BACs 72

3 Genom- und cDNA-Bibliotheken 75

3.1.3 Aufbau und Auswertung einer genomischen Bibliothek 83

3.2 Erweitern und Speichern von Bibliotheken 86

3.4 Screening von Bibliotheken mit Gensonden 94

3.4.3 Schritte in einem Hybridisierungsexperiment 99

3.4.4 Screening-Verfahren 100

3.4.5 Sondenauswahl und Generierung 101

3.5 Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern 103

3.6 Charakterisierung von Plasmidklonen 106

3.6.2 PCR und Sequenzanalyse 108

4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 109

4.2.1 Optimierung der PCR-Reaktion 114

4.2.3 Analyse von PCR-Produkten 117

4.3 Klonieren von PCR-Produkten 119

4.5 Reverse-Transkriptions-PCR 123

4.6 Quantitative und Echtzeit-PCR 123

4.6.3 Molekulare Beacons 125

4.7 Anwendungen von PCR 127

4.7.1 Sonden und andere modifizierte Produkte 127

4.7.2 PCR-Klonierungsstrategien 128

4.7.3 Analyse rekombinanter Klone und seltener Ereignisse 129

4.7.4 Diagnoseanwendungen 130

5 Sequenzierung eines klonierten Gens 131

5.1.1 Prinzipien der DNA-Sequenzierung 131

5.1.2 Automatisierte Sequenzierung 136

5.1.3 Erweitern der Sequenz 137

5.1.4 Shotgun Sequencing Contig-Baugruppe 138

5.2 Datenbankeinträge und Anmerkungen 140

5.3.1 Identifizierung der kodierenden Region 146

5.3.2 Expressionssignale 147

5.4 Sequenzvergleiche 148

5.4.2 Proteinsequenzvergleiche 151

5.4.3 Sequenz-Alignments: Clustal 157

5.5.1 Strukturvorhersagen 160

5.5.2 Proteinmotive und Domänen 162

5.6 Bestätigung der Genfunktion 165

5.6.1 Allelischer Ersatz und Gen-Knockouts 166

6 Analyse der Genexpression 169

6.1 Transkription analysieren 169

6.1.2 Reverse Transkription-PCR 171

6.1.3 Vor Ort Hybridisierung 174

6.2 Methoden zur Untersuchung des Promotors 174

6.2.1 Auffinden des Promoters 175

6.3 Regulatorische Elemente und DNA-bindende Proteine ​​179

6.3.1 Hefe-One-Hybrid-Assays 179

6.3.2 DNase I-Footprinting 181

6.3.3 Gel-Retardations-Assays 181

6.3.4 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) 183

6.4 Translationale Analyse 185

6.4.2 Immunzytochemie und Immunhistochemie 187

7 Produkte aus nativen und manipulierten geklonten Genen 189

7.1 Faktoren, die die Expression klonierter Gene beeinflussen 190

7.1.2 Translationsinitiierung 192

7.1.4 Natur des Proteinprodukts 194

7.2 Expression geklonter Gene in Bakterien 195

7.2.1 Transkriptionelle Fusionen 195

7.2.2 Stabilität: Bedingter Ausdruck 198

7.2.3 Expression letaler Gene 201

7.2.4 Translationale Fusionen 201

7.3.1 Klonierungsvektoren für Hefen 204

7.3.2 Hefe-Expressionssysteme 206

7.4 Expression in Insektenzellen: Baculovirus-Systeme 208

7.5.1 Klonierungsvektoren für Säugerzellen 210

7.5.2 Expression in Säugerzellen 213

7.6 Tags und Signale hinzufügen 215

7.6.2 Sekretionssignale 217

7.7 In vitro Mutagenese 218

7.7.1 Ortsgerichtete Mutagenese 218

7.7.4 Synthetische Genome 224

7.7.5 Protein-Engineering 224

8 Genomanalyse 229

8.1 Überblick über die Genomsequenzierung 229

8.2 Next Generation Sequencing (NGS) 231

8.2.1 Pyrosequenzierung (454) 232

8.2.2 SOLiD-Sequenzierung (Applied Biosystems) 235

8.2.3 Bridge-Amplifikationssequenzierung (Solexa/Ilumina) 237

8.2.4 Andere Technologien 239

8.3 De novo Sequenzbaugruppe 239

8.3.1 Sich wiederholende Elemente und Lücken 240

8.4 Analyse und Anmerkung 242

8.4.1 Identifikation von ORFs 243

8.4.2 Identifizierung der Funktion von Genen und ihren Produkten 250

8.4.3 Sonstige Merkmale von Nukleinsäuresequenzen 251

8.7 Gene und Funktionen in Beziehung setzen: genetische und physikalische Karten 260

8.7.2 Geordnete Bibliotheken und Chromosomen-Walking 262

8.8 Transposon-Mutagenese und andere Screening-Techniken 263

8.8.1 Transposition in Bakterien 263

8.8.2 Umsetzung in Drosophila 266

8.8.3 Transposition in andere Organismen 268

8.8.4 Signaturmarkierte Mutagenese 269

8.9 Gen-Knockouts, Gen-Knockdowns und Gen-Silencing 271

9 Analyse genetischer Variation 275

9.1 Einzelnukleotidpolymorphismen 276

9.1.1 Direkte Sequenzierung 278

9.2 Größere Skalenvarianten 280

9.2.1 Microarrays und Indel 281

9.3 Andere Methoden zum Studium der Variation 282

9.3.1 Genomische Southern-Blot-Analyse: Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) 282

9.3.2 VNTR und Mikrosatelliten 285

9.3.3 Pulsfeld-Gelelektrophorese 287

9.4 Humangenetische Variation: Phänotyp mit Genotyp 289 in Beziehung setzen

9.4.2 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) 292

9.4.3 Datenbankressourcen 294

9.4.4 Genetische Diagnose 294

9.5 Molekulare Phylogenie 295

9.5.1 Methoden zum Konstruieren von Bäumen 298

10 Postgenomische Analyse 305

10.1 Transkription analysieren: Transkriptome 305

10.1.1 Differentialschirmung 306

10.1.2 Andere Methoden: Transposons und Reporter 308

10.2 Array-basierte Methoden 308

10.2.1 Expressed Sequence Tag (EST)-Arrays 309

10.2.2 PCR-Produktarrays 310

10.2.3 Synthetische Oligonukleotid-Arrays 312

10.2.4 Wichtige Faktoren bei der Array-Hybridisierung 313

10.3 Transkriptom-Sequenzierung 315

10.4 Translationale Analyse: Proteomik 316

10.4.1 Zweidimensionale Elektrophorese 317

10.4.2 Massenspektrometrie 318

10.5 Posttranslationale Analyse: Proteininteraktionen 320

10.5.1 Zwei-Hybrid-Abschirmung 320

10.5.2 Phagen-Display-Bibliotheken 321

10.7 Integratives Studium: Systembiologie 324

10.7.1 Metabolomische Analyse 324

10.7.2 Pathway-Analyse und Systembiologie 325

11 Modifizierende Organismen: Transgene 327

11.1 Transgenese und Klonierung 327

11.1.1 Häufige Spezies, die für die Transgenese verwendet werden 328

11.1.2 Kontrolle der Transgenexpression 330

11.2 Tiertransgenese 333

11.2.2 Direkteinspritzung 333

11.2.3 Retrovirale Vektoren 335

11.2.4 Embryonale Stammzelltechnologie 336

11.2.6 Gen-Knock-Down-Technologie: RNA-Interferenz 340

11.2.7 Gen-Knock-in-Technologie 341

11.3 Anwendungen transgener Tiere 342

11.4 Prävention und Behandlung von Krankheiten 343

11.4.1 Produktion von Lebendimpfstoffen: Modifikation von Bakterien und Viren 343

11.4.3 Virale Vektoren für die Gentherapie 347

11.5 Transgene Pflanzen und ihre Anwendungen 349

11.5.1 Einführung fremder Gene 349

11.5.2 Gensubtraktion 351

11.6 Transgenetik: eine Coda 353


Neue Baculovirus-Expressionswerkzeuge für die Produktion rekombinanter Proteinkomplexe

Die meisten eukaryotischen Proteine ​​liegen als große Mehrkomponenten-Anordnungen mit vielen Untereinheiten vor, die zusammenwirken, um spezifische zelluläre Aktivitäten zu katalysieren. Viele dieser molekularen Maschinen sind in ihren nativen Wirten nur in geringen Mengen vorhanden, was die Reinigung aus dem Ausgangsmaterial erschwert. Die Entschlüsselung ihrer Struktur und Funktion mit hoher Auflösung hängt oft von einer heterologen Überproduktion ab. Die rekombinante Expression von Multiproteinkomplexen für Strukturstudien kann einen erheblichen, manchmal hemmenden Aufwand an Arbeit und Material nach sich ziehen, insbesondere wenn für eine erfolgreiche Strukturbestimmung eine Veränderung und Diversifizierung der einzelnen Untereinheiten erforderlich ist. Unser Labor hat sich dieser Herausforderung gestellt, indem es Technologien entwickelt hat, die den komplexen Produktions- und Diversifizierungsprozess rationalisieren. Hier überprüfen wir mehrere dieser Entwicklungen für die rekombinante Multiproteinkomplexproduktion unter Verwendung des von uns entwickelten MultiBac Baculovirus/Insektenzell-Expressionssystems. Wir befassten uns auch mit der Parallelisierung und Automatisierung der Genassemblierung für die Expression von Multiproteinkomplexen, indem wir Roboterroutinen für die Generierung von Multigenvektoren entwickelten. In diesem Beitrag konzentrieren wir uns auf verschiedene Leistungsverbesserungen des Baculovirus-Expressionssystems, die wir eingeführt haben: die Modifikationen der Transferplasmide, die Methoden zur Erzeugung von zusammengesetzter multigener baculoviraler DNA und die vereinfachten und standardisierten Expressionsverfahren, die wir mit unserem MultiBac-System beschrieben haben.


Schau das Video: Klonierung. DNA-Klonierung Gentechnik, 37 (August 2022).