ATP für David - Biologie

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ATP

Eine weitere chemische Verbindung, mit der wir uns vertraut machen müssen, ist Adenosintriphospat (ATP). Die wichtigste zelluläre Rolle von ATP ist die als "kurzfristige" Energieübertragungsvorrichtung für die Zelle. Die Hydrolysereaktionen, die eines oder mehrere der Phosphate von ATP freisetzen, sind exergonisch und viele, viele zelluläre Proteine ​​haben sich so entwickelt, dass sie mit ATP auf eine Weise interagieren, die den Energietransfer aus der Hydrolyse zu unzähligen anderen zellulären Funktionen erleichtert. Auf diese Weise wird ATP oft als „Energiewährung“ der Zelle bezeichnet – es hat relativ feste Energiewerte, die zu oder von sich selbst übertragen werden können, und kann diese Energie zwischen vielen potenziellen Spendern und Akzeptoren austauschen. Wir werden viele Beispiele von ATP "bei der Arbeit" in der Zelle sehen - halten Sie Ausschau nach ihnen und versuchen Sie, sie als funktionale Beispiele für die Verwendung von ATP in der Natur zu betrachten, die Sie in einer anderen Reaktion erwarten könnten, oder Kontext.

ATP-Struktur und -Funktion

Das Herzstück von ATP ist das Nukleotid Adenosinmonophosphat (AMP). Wie die anderen Nukleotide besteht AMP aus einer stickstoffhaltigen Base (einem Adeninmolekül), die an ein Ribosemolekül und eine einzelne Phosphatgruppe gebunden ist. Die Anlagerung einer zweiten Phosphatgruppe an dieses Kernmolekül führt zur Bildung von Adenosindiphosphat (ADP); die Addition einer dritten Phosphatgruppe bildet Adenosintriphosphat (ATP).

Abbildung 1: ATP (Adenosintriphosphat) hat drei Phosphatgruppen, die durch Hydrolyse entfernt werden können, um ADP (Adenosindiphosphat) oder AMP (Adenosinmonophosphat) zu bilden.

Die Phosphorylierung oder die Kondensation von Phosphatgruppen an AMP ist ein endergonischer Prozess. Im Gegensatz dazu ist die Hydrolyse von einer oder zwei Phosphatgruppen aus ATP, ein Prozess namens Dephosphorylierung, ist exergonisch. Wieso den? Erinnern wir uns, dass sich die Begriffe endergonisch und exergonisch auf das Vorzeichen der Differenz der freien Energie einer Reaktion zwischen den Produkten und Reaktanten beziehen, G. In diesem Fall weisen wir der Reaktion explizit eine Richtung zu, entweder in Richtung der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung des Nukleotids. Bei der Phosphorylierungsreaktion sind die Reaktanten das Nukleotid und ein anorganisches Phosphat, während die Produkte ein phosphoryliertes Nukleotid und WASSER sind. Bei der Dephosphorylierungs/Hydrolyse-Reaktion sind die Reaktanten das phosphorylierte Nukleotid und WASSER, während die Produkte anorganisches Phosphat und das Nukleotid minus einem Phosphat sind.

Da die Freie Energie von Gibbs eine Zustandsfunktion ist, spielt es keine Rolle, wie die Reaktion abläuft, Sie betrachten nur den Anfangs- und Endzustand. Betrachten wir zum Beispiel die Hydrolyse von ATP. Die Reaktanten ATP und Wasser sind durch ihre atomare Zusammensetzung und die Art der Bindungen zwischen den konstituierenden Atomen charakterisiert, und jeder der Bindungen und ihren möglichen Konfigurationen kann eine gewisse freie Energie zugeordnet werden – ebenso für die Produkte. Wenn wir die Reaktion vom Standpunkt der Produkte und Reaktanten aus untersuchen und fragen: "Wie können wir Atome und Bindungen in den Reaktanten rekombinieren, um die Produkte zu erhalten?", stellen wir fest, dass eine Phosphoanhydrid-Bindung zwischen einem Sauerstoff und einem Phosphor im ATP, eine im Wasser gebrochene Bindung zwischen Sauerstoff und Wasserstoff, eine Bindung zwischen dem OH (das aus der Wasserspaltung stammt) und dem Phosphor (aus dem freigesetzten PO3-2), und es muss eine Bindung zwischen dem H (abgeleitet von der Wasserspaltung) und dem terminalen Sauerstoff am phosphorylierten Nukleotid. Es ist die Summe der Energien, die mit all diesen Bindungsumlagerungen verbunden sind (einschließlich derjenigen, die direkt mit Wasser verbunden sind), die diese Reaktion exergonisch machen. Eine ähnliche Analyse könnte mit der Umkehrreaktion durchgeführt werden.

Notiz:

Mögliche Übung: Verwenden Sie die obige Abbildung von ATP und Ihr Wissen darüber, wie ein Wassermolekül aussieht, um eine Abbildung der oben beschriebenen Reaktionsschritte zu zeichnen: Aufbrechen der Phosphoanhydrid-Bindung, Aufbrechen von Wasser und Bildung neuer Bindungen zu ADP und anorganischem Phosphat. Verfolgen Sie die Atome in verschiedenen Farben, wenn das hilft.

Gibt es etwas Besonderes an den spezifischen Bindungen dieser Moleküle? In verschiedenen Texten wird viel über die Art der Bindungen zwischen den Phosphaten von ATP gemacht. Sicherlich tragen die Eigenschaften der Bindungen in ATP dazu bei, die freie Energie und Reaktivität des Moleküls zu definieren. Obwohl es angemessen ist, Konzepte wie Ladungsdichte und Verfügbarkeit von Resonanzstrukturen auf diese Diskussion anzuwenden, ist es eine besondere Art von Handwinken, auf die wir uns lieber nicht einlassen möchten. Die meisten BIS2A-Studenten haben keine College-Chemie und diejenigen, die dies getan haben, haben diese Begriffe wahrscheinlich nicht in sinnvoller Weise diskutiert. Der Versuch, den Prozess mit den oben genannten Ideen zu erklären, würde also nichts anderes tun, als ein falsches Verständnis zu vermitteln, dazu neigen, ATP eine mystische Qualität zuzuordnen und es sind "besondere" Bindungen, die nicht existieren, und vom eigentlichen Punkt abzulenken, der die Hydrolysereaktion ist wegen der Eigenschaften von ATP exergonisch, aber AUCH wegen der chemischen Eigenschaften von Wasser und denen der Reaktionsprodukte. Für diese Klasse ist es ausreichend zu wissen, dass engagierte Physikochemiker noch immer den Prozess der ATP-Hydrolyse in Lösung und im Kontext von Proteinen studieren und dass sie immer noch versuchen, die enthalpischen und entropischen Schlüsselkomponenten der freien Energien der Komponenten zu erklären. Wir müssen nur ein gewisses Maß an mechanistischer chemischer Unkenntnis akzeptieren und uns mit einer Beschreibung der groben thermodynamischen Eigenschaften begnügen. Letzteres reicht vollkommen aus, um tiefe Diskussionen über die relevante Biologie zu führen.

„Hochenergie“-Anleihen

Was ist mit dem Begriff "Hochenergiebindungen", den wir so oft in Verbindung mit ATP hören? Wenn die Bindungen in ATP nichts "Besonderes" sind, warum hören wir dann immer den Begriff "Hochenergiebindungen" in Verbindung mit dem Molekül? Die Antwort ist täuschend einfach. In der Biologie wird der Begriff "hochenergetische Bindung" verwendet, um eine exergonische Reaktion zu beschreiben, die die Hydrolyse der betreffenden Bindung beinhaltet, die zu einer "großen" negativen Änderung der freien Energie führt. Denken Sie daran, dass diese Änderung der freien Energie nicht nur mit der fraglichen Bindung zu tun hat, sondern vielmehr mit der Summe aller Bindungsumlagerungen in der Reaktion. Was ist eine große Veränderung? Dies scheint eine ziemlich willkürliche Zuordnung zu sein, die normalerweise mit einer Energiemenge verbunden ist, die mit den Arten von anabolen Reaktionen verbunden ist, die wir typischerweise in der Biologie beobachten. Wenn die Bindungen in ATP etwas Besonderes haben, ist dies nicht ausschließlich an die freie Hydrolyseenergie gebunden, da es viele andere Bindungen gibt, deren Hydrolyse zu größeren negativen Unterschieden in der freien Energie führt.

Figur 2: Die freie Hydrolyseenergie verschiedener Bindungstypen kann mit der der Hydrolyse von ATP verglichen werden. Quelle: http://biowiki.ucdavis.edu/Biochemis...perties_of_ATP

Video zu Elektron und Elektron/Proton-Trägern

Für ein 7-minütiges YouTube-Video über die Rolle von Trägern bei der Atmung klicken Sie hier.

Das Radfahren von ATP-Pools

Schätzungen für die Anzahl der ATP-Moleküle in einer typischen menschlichen Zelle reichen von ~3x10⁷ (~5x10^-17 Mol ATP/Zelle) in einem weißen Blutkörperchen auf 5x10⁹ (~9x10^-15 Mol ATP/Zelle) in einer aktiven Krebszelle. Obwohl diese Zahlen groß und bereits erstaunlich erscheinen mögen, bedenken Sie, dass dieser ATP-Pool schätzungsweise 1,5 x pro Minute umschlägt (wird zu ADP und dann wieder zu ATP). Die Erweiterung dieser Analyse ergibt die Schätzung, dass dieser tägliche Umsatz ungefähr dem Äquivalent eines Körpergewichts an ATP entspricht, das pro Tag umgesetzt wird. Das heißt, wenn kein Umsatz/Recycling von ATP stattfand, würde der menschliche Körper ATP im Wert von 1 Körpergewicht benötigen, um zu funktionieren - daher unsere frühere Charakterisierung von ATP als "kurzfristiges" Energieübertragungsgerät für die Zelle.

Während der Pool von ATP/ADP recycelt werden kann, wird ein Teil der Energie, die bei den vielen Umwandlungen zwischen ATP, ADP und anderen Biomolekülen übertragen wird, auch an die Umwelt abgegeben. Um die zellulären Energiepools aufrechtzuerhalten, muss auch Energie aus der Umgebung zugeführt werden. Woher kommt diese Energie? Die Antwort hängt stark davon ab, wo Energie verfügbar ist und welche Mechanismen die Natur entwickelt hat, um Energie aus der Umgebung auf molekulare Träger wie ATP zu übertragen. In fast allen Fällen hat sich der Übertragungsmechanismus jedoch so entwickelt, dass er eine Form der Redoxchemie umfasst. In diesem und den folgenden Abschnitten beschäftigen wir uns mit einigen kritischen Beispielen des Energietransfers aus der Umgebung, Schlüsseltypen der Chemie und biologischen Reaktionen, die an diesem Prozess beteiligt sind, und einigen biologischen Schlüsselreaktionen und zellulären Komponenten, die mit dem Energiefluss zwischen verschiedenen Teilen des Körpers verbunden sind das lebende System. Wir konzentrieren uns zunächst auf Reaktionen, die an der (Wieder-)Erzeugung von ATP in der Zelle beteiligt sind (nicht solche, die an der Bildung des Nukleotids per se beteiligt sind, sondern eher diejenigen, die mit der Übertragung von Phosphaten auf AMP und ADP verbunden sind).

Video-Link

Für eine detailliertere Erklärung von ATP und wie dieses Molekül Energie speichert, sehen Sie sich dieses Video (10 Minuten) an, indem Sie hier klicken. (Vorbehalt - noch nicht BIS2A Instructor validiert)

Wie erzeugen Zellen ATP?

Im Laufe der 3,25 Milliarden Jahre der Evolution haben sich eine Vielzahl von Mechanismen entwickelt, um ATP aus ADP und AMP zu erzeugen. Die meisten dieser Mechanismen sind Modifikationen zu zwei Themen: direkte Synthese von ATP oder indirekte Synthese von ATP mit zwei grundlegenden Mechanismen, die jeweils als bekannt sind: Phosphorylierung auf Substratebene (SLP) und oxidative Phosphorylierung. Diese Themen sind so substanziell, dass sie in den nächsten Modulen ausführlich behandelt werden. Es genügt zu sagen, dass beide Mechanismen auf biochemischen Reaktionen beruhen, die Energie von einer Energiequelle auf ADP oder AMP übertragen, um ATP zu synthetisieren.

Abschließende Lernsumme Pt. II

Oxidative Phosphorylierung ist ein Prozess, bei dem Energie durch eine Reihe von Proteinkomplexen aufrechterhalten wird, die in der inneren Membran der Mitochondrien auftritt, die am Ende ATP produzieren. Dieser Prozess gliedert sich in zwei Teile, die Oxidation von NADH und FADH2 und die Phosphorylierung. Im ersten Schritt erfahren sowohl NADH als auch FADH3 den Prozess des Elektronenverlustes durch Oxidation. Sowohl NADH als auch FADH3 übertragen ihre hochenergetischen Moleküle in zwei verschiedene Proteinkomplexe (Proteinkomplex I und Proteinkomplex II). Die Oxidation von NADH führt zu einem Pumpen von Protonen durch den Proteinkomplex I. Die vom Proteinkomplex I aufgenommenen Elektronen werden dann an einen Elektronenträger namens Ubichinon (Q) abgegeben. Auf der anderen Seite durchläuft FADH3 einen ähnlichen Prozess wie NADH, wenn diese beiden hochenergetischen Moleküle oxidiert werden. Danach wurde ein elektrochemischer Gradient erzeugt, was bedeutet, dass beide Seiten in der elektrischen Ladung unterschiedlich sind. Die Protonen an der Außenseite der Mitochondrienmembran werden dann durch die ATP-Synthease geschoben. Diese Bewegung von Protonen bewirkt, dass sich die ATP-Synthase dreht und ADP und Pi bindet, wodurch ATP produziert wird.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Labortechnik, mit der Millionen von Kopien einer bestimmten DNA-Region hergestellt werden. Diese Technik kann für die Erforschung eines bestimmten Gens verwendet werden, das ein rezessives Merkmal aufweisen kann, oder um den genetischen Marker im Bereich der Forensik während einer Kriminaluntersuchung zu finden. Typischerweise besteht das Ziel der PCR darin, genug von der Ziel-DNA-Region zu machen, damit sie analysiert oder auf andere Weise verwendet werden kann. Zum Beispiel kann durch PCR amplifizierte DNA zur Sequenzierung gesendet, durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht oder für weitere Experimente in ein Plasmid kloniert werden. Die PCR wird in vielen Bereichen der Biologie und Medizin eingesetzt, einschließlich der molekularbiologischen Forschung, der medizinischen Diagnostik und sogar in einigen Zweigen der Ökologie.

Kontrolle des Zellzyklus

Der Zellzyklus-Kontrollzyklus funktioniert genauso wie das Kontrollsystem einer Waschmaschine, und während die Zelle die DNA-Replikation, Mitose usw. durchläuft, wird der Prozess von einem System kontrolliert. Es gibt vier Phasen, durch die der Zellzyklus gesteuert wird, nämlich die G1-, G2-, S- und M-Phase. Das Kontrollsystem wird entweder durch interne oder externe Faktoren beeinflusst. An jedem Prüfpunkt stoppt der Zellzyklus und geht dann zum nächsten Zyklus über, wenn ein gegebenes Signal zum Fortfahren vorliegt.

ATP-Synthase: majestätische molekulare Maschine von einem Vordenker

Abbildung 1. Die gesamte ATP-Synthase-Maschine mit individuell hergestellten Proteinuntereinheiten, die jeweils mit griechischen Buchstaben beschriftet sind. H + -Ionen (Protonen) fließen durch einen speziellen Tunnel in der ATP-Synthase, wie der Pfeil anzeigt. Dies induziert eine mechanische Bewegung und zwingt die Achse und die Basis, sich wie eine Turbine zusammenzudrehen. Bei der Bildung von ATP-Molekülen werden fast 100% des Drehimpulses in chemische Energie umgewandelt! Pro 10 Protonen werden drei ATPs produziert.

(Angepasst von Kanehisa Laboratories, <www.genome.jp/kegg>)

Das Leben hängt von einem unglaublichen Enzym namens ATP-Synthase ab, dem kleinsten Rotationsmotor der Welt. 1 Dieser winzige Proteinkomplex bildet eine energiereiche Verbindung, ATP (einDenosin TriPHosphat). Jede der 14 Billionen Zellen des menschlichen Körpers führt diese Reaktion etwa eine Million Mal pro Minute durch. Über ein halbes Körpergewicht ATP wird täglich hergestellt und konsumiert!

Alle Lebewesen müssen ATP herstellen, das oft als &ldquoEnergiewährung des Lebens&rdquo bezeichnet wird. ATP ist ein kleines Molekül mit einer großen Aufgabe: sofort nutzbare Energie für zelluläre Maschinen bereitzustellen. ATP-gesteuerte Proteinmaschinen treiben fast alles an, was in lebenden Zellen vor sich geht, einschließlich der Herstellung von DNA, RNA und Proteinen, der Beseitigung von Trümmern und des Transports von Chemikalien in, aus und innerhalb von Zellen. Andere Kraftstoffquellen werden diese zellulären Proteinmaschinen aus den gleichen Gründen nicht antreiben, aus denen Öl, Wind oder Sonnenlicht einen Benzinmotor nicht antreiben.

Logisches Denken über einen Automotor führt uns zu der Annahme, dass nur ein kluger Mensch (mit Verstand und Willen) eine Maschine bauen könnte, die Energie von einer Form in eine andere umwandelt, um ein Auto zu bewegen. 2 Die Maschine zeigt geordnete, nicht zufällige Proportionen und die geschickte Verwendung voneinander abhängiger Teile, die die richtige Größe, Form und Stärke haben, um für einen Gesamtzweck zusammenzuarbeiten. Die gleiche Schlussfolgerung von der Maschine zurück zum Hersteller wird gültig von Maschinen, die in &ldquonature&rdquo gefunden werden, zurück zu ihrem Schöpfer abgeleitet. 3 Jeder weiß, dass ein Gemälde von einem Maler stammt, denn das Gemälde zeigt eine bestimmte Komplexität oder ein komplexes und erkennbares Muster, das nicht eine Eigenschaft der Farbe. Das heißt, die Farbmoleküle organisieren sich beispielsweise nicht spontan zu einem Porträt der Mona Lisa. 4

Figur 2: Banddiagramm einer Draufsicht des Kopfteils der ATP-Synthase, genannt „F“₁-ATPase“. Es hat sechs Proteinuntereinheiten und besteht aus drei aktiven Zentren, in denen bei jeder vollen Umdrehung der Achse drei ATP-Moleküle gebildet werden. Das ganz obere Ende der Achse ist gerade sichtbar und lehnt an der oberen rechten Innenwand von F₁. Zelluläre Maschinen bauen den Kopf auf, wonach er sich auf der Basis selbst zusammenbaut.

ATP-Synthase kommt auf den inneren Membranen von Bakterienzellen und den innersten Membranen von Mitochondrien und Chloroplasten vor, bei denen es sich um membrangebundene Strukturen in tierischen und pflanzlichen Zellen handelt (siehe Abbildung 1).

ATP-Synthase stellt ATP aus zwei kleineren Chemikalien her, ADP und Phosphat. Die ATP-Synthase ist so klein, dass sie diese winzigen Moleküle einzeln manipulieren kann. Die ATP-Synthase muss eine andere Energieform in neue ATPs umwandeln. Diese Energie liegt in Form eines Wasserstoffionen-(H + )-Gradienten vor, der von einem anderen Proteinsystem als der ATP-Synthase erzeugt wird. 5 Wasserstoffionen strömen durch die ATP-Synthase wie Wind durch eine Windmühle. Dieser besteht aus einem positiv geladenen elektrischen Strom, im Gegensatz zu unseren Elektromotoren, die einen negativen Elektronenstrom verwenden.

ATP-Synthase ist ein komplexer Motor und Bilder sind notwendig, um ihn zu beschreiben. Wissenschaftler verwenden clevere Techniken, um die genaue Position jedes der vielen Tausend Atome aufzulösen, aus denen große Moleküle wie die ATP-Synthase bestehen. 6 Dieser Proteinkomplex enthält mindestens 29 separat hergestellte Untereinheiten, die zu zwei Hauptteilen zusammenpassen: dem Kopf (Abbildung 2) und der Basis (Abbildung 3). 7 Die Basis ist auf einer flachen Membran verankert (Abbildung 1) wie ein Knopf an einem Hemd (außer dass die Knöpfe an einer Stelle fixiert sind, während die ATP-Synthase überall auf der Ebene ihrer Membran wandern kann). Der Kopf der ATP-Synthase bildet ein Röhrchen (Abbildung 2). Es besteht aus sechs Einheiten, in drei Paaren. Diese bilden drei Sätze von Andockstationen, von denen jede ein ADP und ein Phosphat enthält. Die ATP-Synthase enthält einen Stator (stationärer Teil), der sich um die Außenseite der Struktur herum wölbt, um den Kopf an der Basis zu verankern (Abbildung 1).

Figur 3: Ein Banddiagramm (Seitenansicht) der Basis der ATP-Synthase, genannt &lsquoF₀&rquo;-Teil. Es besteht aus zwölf spiralförmigen Proteinuntereinheiten, die kreisförmig angeordnet sind und die Wand einer Röhre bilden. Dieses Rohr stellt einen Tunnel durch die Membran (nicht gezeigt) bereit, in der es verankert ist.

Jetzt können wir uns die erstaunliche, effiziente Art und Weise ansehen, wie diese wunderbare Mikromaschine funktioniert. Beachten Sie in Abbildung 1 eine helikale Achse, die mit &ldquo&gamma&rdquo bezeichnet ist, in der Mitte der ATP-Synthase. Diese Achse verläuft durch die Mitte sowohl des Kopfes als auch der Basis der ATP-Synthase wie ein Bleistift in einer Papp-Toilettenpapierröhre.

Hier ist das &ldquomagische&rdquo: Wenn ein Strom winziger Wasserstoffionen (Protonen) durch die Basis und aus der Seite der ATP-Synthase fließt und durch die Membran strömt, zwingen sie die Achse und die Basis, sich zu drehen. 8 Die steife Mittelachse drückt gegen die Innenwände der sechs Kopfproteine, die sich abwechselnd leicht verformen und neu bilden. 9 In jeder Ihrer Billionen von Zellen drehen sich viele Tausend dieser Maschinen mit über 9.000 U/min. 10

Die sich drehende Achse verursacht Quetschbewegungen des Kopfes, um ein ADP neben einem Phosphat auszurichten, wodurch ATP und Hellip in Schaufelladungen gebildet werden. Viele andere zelluläre Proteinmaschinen verwenden ATP und zerlegen es wieder in ADP und Phosphat. Dieses wird dann durch die ATP-Synthase wieder in ATP zurückgeführt. Lubert Stryer, Autor von Biochemie fügt hinzu,

Figur 4: Gesamt-3D-Molekülstruktur des ATP-Synthase-Rotors von Stock et al 7, abzüglich des Stators.

Dieser Motor ist unglaublich High-Tech-Design in Nanogröße.

Evolutionswissenschaftler haben vorgeschlagen, dass sich der Kopfteil der ATP-Synthase aus einer Klasse von Proteinen entwickelt hat, die verwendet werden, um DNA während der DNA-Replikation zu entwinden. 12

Wie könnte sich jedoch ATP-Synthase aus etwas "entwickeln", das ATP benötigt, das von ATP-Synthase hergestellt wird, um zu funktionieren? Dieser bizarre Vorschlag unterstreicht die Rolle unserer Überzeugungen bei der Interpretation von Ursprüngen. Evolutionisten werden oft von einer Voreingenommenheit angetrieben, die sie nicht zugeben: dem methodologischen Naturalismus. Dies ist die Annahme, dass die Prozesse, die die Betrieb von Phänomenen sind alles, was wir verwenden können, um die Ursprung dieser Phänomene. Diese Philosophie schließt Gott per Dekret aus (nicht aus Wissenschaft oder Vernunft). 13

Schöpfungswissenschaftler, die dasselbe ATP-Synthase-&ldquo-Phänomen&rdquo betrachten, haben auch eine Voreingenommenheit: Übernatürliche Ursprünge sind in einem theistischen Universum möglich. Die große Frage ist: Wessen Voreingenommenheit ist richtig? Ich behaupte, dass eine Schöpfungsverzerrung eindeutig wahr ist, weil sie sowohl nach den Prinzipien der Kausalität als auch nach dem offenbarten Wort des Schöpfers selbst Sinn macht.

Wir könnten auch in Betracht ziehen, dass ATP-Synthase durch Prozesse hergestellt wird, die alle ATP benötigen, wie z. Und die Herstellung der 100 Enzyme/Maschinen, die dafür benötigt werden, benötigt ATP! Und die Herstellung der Membranen, in denen die ATP-Synthase sitzt, benötigt ATP, aber ohne die Membranen würde es nicht funktionieren. Dies ist ein wirklicher Teufelskreis, den Evolutionisten erklären müssen.

Was ist mit den Eigenschaften des Einen, der die erstaunlichen Fähigkeiten des ATP-Synthase-Nanomotors entwickelt hat? Denken Sie daran, dass je kleiner eine Maschine ist, desto genialer der Aufwand, um sie zu bauen.

ATP-Synthase spricht von Weisheit, Intelligenz, Fähigkeit oder Rationalität in ihrem Schöpfer, einige der genauen Eigenschaften Gottes, wie sie in der Bibel offenbart sind! Wenn wir sein Werk untersuchen, gehorchen wir beide seinem Befehl in 1. Mose 1:28, die Arbeit zu tun, die notwendig ist, um „die Erde zu unterwerfen” und wir haben noch mehr Grund, ihn für seine Vorsehung und sein Genie zu loben und zu genießen.

Der 20-Nanometer-Motor (Höhe), ATP-Synthase (ein Nanometer ist ein Tausendmillionstel Meter). Diese Rotationsmotoren in den Membranen der Mitochondrien (die Kraftwerke der Zelle) drehen sich als Reaktion auf den Protonenfluss (einen positiven elektrischen Strom). Die Rotation des Motors wandelt ADP-Moleküle plus Phosphat in den Zellbrennstoff ATP um.

Ergänzende Dateien

Ein neues Genre von Fluoreszenz-Wiederherstellungs-Assays zur Bewertung von polo-ähnlichen Kinase-1-ATP-kompetitiven Inhibitoren

K. Tsuji, D. Hymel und T. R. Burke, Anal. Methoden, 2020, 12, 4418 DOI: 10.1039/D0AY01223H

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ATP für David - Biologie

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Vakuoläre ATPase

V-ATPasen sind komplexe molekulare Maschinen mit vielen beweglichen Teilen, daher haben sie sich als schwierig zu untersuchen erwiesen. Gegenwärtig wurden die vollständigsten Strukturen durch Kryoelektronenmikroskopie erhalten. Der hier gezeigte stammt von Hefe, und die Forscher bestimmten Strukturen für drei verschiedene Rotationszustände des Komplexes (PDB-Einträge 5vox, 5voy & 5voz). Das hier gezeigte Bild betrachtet das Molekül von unten und zeigt die Drehung des Protonenpumpenteils. Um die Rotation des gesamten Moleküls zu sehen, klicken Sie auf das Bild für ein interaktives JSmol.

Themen zur weiteren Diskussion

1. Versuchen Sie, die Anzahl der Untereinheiten im Ring von V-ATPasen, V/A-ATPasen und ATP-Synthase zu vergleichen. Was sagt Ihnen das über die Anzahl der Protonen, die für jedes ATP benötigt werden, das von dem Molekül abgebaut oder aufgebaut wird?
2. Für viele Fragmente von V-ATPasen wurden atomare Strukturen bestimmt, die dann verwendet wurden, um die niedrigaufgelösten Modelle zu erstellen, die aus Kryoelektronenmikroskopie gewonnen wurden. Sie können nach „V-ATPase“ suchen, um sich einige dieser atomaren Strukturen anzusehen.

Verwandte PDB-101-Ressourcen

Verweise

1. 5vox, 5voy, 5voz: J Zhao, K Beyrakhova, Y Liu, CP Alvarez, SA Bueler, L Xu, C Xu, MT Boniecki, V Kanelis, ZQ Luo, M Cygler & JL Rubinstein (2017) Molekulare Basis für die Bindung und Modulation der V-ATPase durch ein bakterielles Effektorprotein. PLoS-Erreger 13, e1006394.
2. 5gar: DG Schep, J Zhao & JL Rubinstein (2017)Modelle für die a-Untereinheiten der Thermus thermophilus V/A-ATPase- und Saccharomyces cerevisiae V-ATPase-Enzyme durch Kryo-EM und evolutionäre Kovarianz. Proceedings of the National Academy of Science USA 113, 3245-3250.
3. 5ara: A Zhou, A Rohou, DG Schep, JV Bason, MG Montgomery, JE Walker, N Grigorieff & JL Rubinstein (2015)Struktur und Konformationszustände der bovinen mitochondrialen ATP-Synthase durch Kryo-EM. Elife 4, e10180.

März 2018, David Goodsell

Über PDB-101

PDB-101 hilft Lehrern, Schülern und der breiten Öffentlichkeit, die 3D-Welt der Proteine ​​und Nukleinsäuren zu erkunden. Das Kennenlernen ihrer vielfältigen Formen und Funktionen hilft, alle Aspekte der Biomedizin und Landwirtschaft zu verstehen, von der Proteinsynthese über Gesundheit und Krankheit bis hin zu biologischer Energie.

Warum PDB-101? Forscher rund um den Globus stellen diese 3D-Strukturen im Archiv der Protein Data Bank (PDB) frei zur Verfügung. PDB-101 erstellt einführende Materialien, um Anfängern den Einstieg in das Thema zu erleichtern ("101", wie in einem Einsteigerkurs) sowie Ressourcen für erweitertes Lernen.

ATP für David - Biologie

Eine weibliche Person Photuris sp. bereit, ein Beutemännchen zu verschlingen. Diese femmes fatales Verwenden Sie Blitzsignale, um Männchen anderer Arten anzulocken, indem Sie die Blitzmuster ihrer Weibchen imitieren.

Warum blinken Glühwürmchen?

Glühwürmchen verlassen sich aus zwei Gründen auf die präzise Kontrolle des Blitzzeitpunkts: Partner finden und Beute anlocken.

In der Gruppe Photinus, Blinken stellt ein sichtbares Balzsignal dar. Innerhalb jeder Art identifizieren Männchen und Weibchen Mitglieder des anderen Geschlechts basierend auf dem Blitz-Timing.

In der Gruppe Photuris, das Blinken dient einem zusätzlichen Zweck. Weiblich Photuris Glühwürmchen sind hochspezialisierte Raubtiere, die fakultativ das Blitzsignal der Weibchen anderer Arten imitieren können. Mit diesem falschen Signal können diese räuberischen Weibchen ahnungslose Photinus-Männchen anlocken und sie dann fressen (siehe Foto oben auf dieser Seite).

Rechts sind die Blitze und Flugbahnen verschiedener Arten zu sehen, wie sie in einer Zeitrafferaufnahme erscheinen würden (Aus: Lloyd, JE (1966). Univ. of Michigan Museum of Zoology, Misc. Pub. 130, 1-93 )

Was ist Stickoxid (NO)?

Stickoxid (NO) ist ein lösliches, hochreaktives Gas, das durch natürliche chemische und physikalische Reaktionen in der Atmosphäre entsteht. Es wird auch von bestimmten tierischen und pflanzlichen Zellen aus der Aminosäure L-Arginin hergestellt. Weil es so klein und diffundierbar ist, passiert NO die Zellmembranen und wird oft als biologisches Signal verwendet.

Bei Säugetieren hilft NO, den Blutdruck durch Erweiterung der Blutgefäße aufrechtzuerhalten, unterstützt das Immunsystem bei der Abtötung von Eindringlingen und ist ein wichtiger Faktor bei der Kontrolle der Peniserektion (Viagra wirkt durch Blockieren eines Enzyms im NO/cGMP-Weg). Im Gehirn spielt NO eine Rolle bei der Entwicklung, bei der Signalübertragung von Neuronen zu Neuronen und trägt wahrscheinlich zur Bildung von Erinnerungen bei.

Die meisten nicht-pathologischen Funktionen von NO werden durch die Aktivierung eines Enzyms, der Guanylylcyclase, oder durch die Nitrosylierung von Proteinen vermittelt. NO kann jedoch auch den Sauerstoffverbrauch durch Mitochondrien hemmen und diese Wirkung wird ausgenutzt, um Glühwürmchen-Lichtblitze zu erzeugen.

Wie sieht eine Glühwürmchen-Laterne aus?

Die Firefly-Laterne befindet sich auf der ventralen Bauchoberfläche (gepunkteter Bereich) unter der durchscheinenden Nagelhaut. Es wird von oktopaminergen Neuronen in den hinteren Ganglien des Nervenstrangs innerviert. Ausbrüche von Aktionspotentialen in diesen Neuronen kontrollieren das normale Blitzmuster.

In jeder lichterzeugenden Einheit sind Photocyten radial in einem Rosettenmuster um einen zentralen zylindrischen Kern herum angeordnet. Der Kern enthält eine lufthaltige Hauptluftröhre, die dorsal entspringt und sich mehrmals in feine Tracheolen teilt, die zwischen den Photozyten auf mehreren dorsal-ventralen Ebenen vorstehen. Jede Luftröhre ist von Luftröhrenzellen und Luftröhrenendzellen umgeben. Die Luciferin-Luciferase-Lichterzeugenden Reaktionen sind auf Peroxisomen beschränkt, die zentral in Photocyten lokalisiert sind. Die Photozyt-Mitochondrien befinden sich im peripheren Zytoplasma, besonders konzentriert an Stellen proximal der Trachea und der Tracheolen

Wenn Glühwürmchen in NO gesetzt werden, beginnen sie sehr schnell zu blinken und die Laterne leuchtet kontinuierlich. Diese Reaktion erfordert Sauerstoff. Glühen wird auch durch Auftragen des Transmitters Octopamin auf die exponierte Laterne hervorgerufen. Octopamin-Glühen wird durch NO-Fänger wie CPTIO gehemmt.

Die hier gezeigte Animation ist eine Zeitlupe Photuris Blitz. Normale Blitze und Reaktionen auf NEIN sind im Filmlink unten zu sehen (dies sind große Dateien (80 MB) oder auf der Wissenschaft Webseite.

Aerobe und anaerobe Glykolyse

In Gegenwart von Sauerstoff führt der Weg durch den Zitronensäurezyklus und die anschließende Atmungskette. Das im Zytosol gebildete 2 NADH wird durch das Malat-Aspartat-Shuttle oder das Glycerin-3-Phosphat-Shuttle in die Mitochondrien gelangen. Dieser Vorgang wird als aerobe Glykolyse bezeichnet.

ichIn Abwesenheit von Sauerstoff muss das 2 NADH oxidiert werden, indem Pyruvat zu Laktat reduziert wird. Was als anaerobe Glykolyse bekannt ist.

Bei der anaeroben Glykose ermöglicht die Oxidation von NADH durch das Enzym Lactatdehydrogenase den Eintritt eines neuen Glucosemoleküls in den Stoffwechselweg. Im Vergleich dazu ist die ATP-Produktion jedoch geringer

Die aerobe Glykolyse produziert 36 ATP am Ende der Atmungskette. Anaerobe Glykolyse produziert nur 2 ATP.

Eines der Hauptprobleme der anaeroben Glykolyse ist die Bildung von Laktat. Was zu einer Laktatazidose führen kann. Daher ist die anaerobe Glykolyse keine praktikable Langzeitoption für Zellen.

Es muss jedoch unbedingt erwähnt werden, dass es Zellen gibt, deren Glykolyse immer im Laktat endet. Das beste Beispiel dafür sind Erythrozyten. Erinnern wir uns daran, dass Erythrozyten Mitochondrien fehlen und dass oxidative Prozesse von Pyruvat in Mitochondrien ablaufen.

Überblick

Der Prozess der Glykolyse ist in zwei Phasen unterteilt. Erstens besteht die Vorbereitungsphase aus fünf verschiedenen Reaktionen. Während dieser Phase wandelt sich das Glucosemolekül in Glyceraldehyd-3-Phosphat um, indem es verschiedene Reaktionen durchläuft. Während dieser Phase werden zwei ATP-Moleküle investiert, während am Ende der Vorbereitungsphase auch zwei neu synthetisierte ATP-Moleküle gefunden werden. Zweitens die Payoff-Phase, in der Glyceraldehyd-3-Phosphat fünf verschiedene biochemische Reaktionen durchläuft und in Pyruvat umgewandelt wird. Die Produktion von ATPs als Energiemoleküle ist ein wichtiger Aspekt der Auszahlungsphase. Jeder Schritt des Prozesses wird nun wie folgt beschrieben

1. Phosphorylierung von Glucose

Dies ist der erste Schritt der Vorbereitungsphase, in der Glucose durch die Beteiligung des Enzyms Hexokinase aktiviert und in Glucose-6-Phosphat umgewandelt wird. Dabei wird ein ATP-Molekül als Phosphatdonor verwendet. Hexokinase benötigt Mg 2+, um die Reaktion zu katalysieren.

2. Umwandlung von Glucose-6-Phosphat in Fructose-6-Phosphat

Phosphohexose isomerisiert (Phosphogulco-Isomerase) katalysiert die Reaktion in Gegenwart von Mg 2+, was zu einer reversiblen Isomerisierung von Glucose-6-Phosphaten (Aldose) zu Fructose-6-Phosphat (Ketos) führt. Diese Isomerisierung spielt eine wichtige Rolle, um den Gesamtweg der Glykolyse zu vervollständigen. Die Umlagerung der Carbonyl- und Hydroxylgruppe an C1 und C2 ist ein entscheidender Schritt, um den Weg weiter voranzutreiben.

3. Phosphorylierung von Fructose-6-Phosphat

In diesem Schritt wird ATP als Phosphatdonor verwendet und mit Hilfe des Enzyms Phosphofructokinase – 1 (PFK-1) (das die Reaktion katalysiert) wird eine Phosphorylgruppe auf Fructose-6-Phosphat übertragen und produziert Fructose-1,6-Bisphosphat . Dies ist eine irreversible Reaktion, die auf zellulärer Ebene stattfindet und auch als der erste entschlossene Schritt in Richtung Glykolyse angesehen wird, da Glucose-6-Phosphat und Fructose-6-Phosphat andere unterschiedliche Beteiligungen haben, während Fructose-1,-6-bis-Phosphat nur für die Glykolyse bestimmt ist.

4. Spaltung von Fructose-1,6-bis-phosphat

Hier wird Fructose-1,6-bisphosphat gespalten und produziert zwei verschiedene Triosephosphate wie Glycerinaldehyd-3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat. Die Aldolkondensationsreaktion ist reversibel und wird durch das Enzym Fructose-1,6-bis-Phosphat-Aldolase (allgemein bekannt als Aldolase) katalysiert.

5. Umwandlung der Triosephosphate

Das im vorherigen Schritt hergestellte Glyceraldehyd-3-Phosphat durchläuft verschiedene biochemische Reaktionen des Stoffwechselwegs. Während Dihydroxyacetonphosphat dagegen durch die Beteiligung des Enzyms Triosephosphat schnell und reversibel in Glycerinaldehyd 3 Phosphat umgewandelt wird, isomerisieren.

6. Oxidation of Glyceraldehyde 3 phosphate to 1,3, Bisphospho glycerate

This is the first step of the payoff phase. The reaction is catalyzed by the enzyme glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase. Along with 1,3 bisphosphoglycerate, NADH+ H + is also produced during this phase. NADH is also an energy molecule.

7. Phosphoryl transfer form 1,3 bisphosphoglycerate to ADP

3 Phosphoglycerate is produced in this step by the involvement of the enzyme phosphoglycerate kinase. The enzyme transfers the high energy phosphoryl group from the carbonyl group of 1,3 bisphosphoglycerate to ADP. It leads to the formation of ATP.

8. Conversion of 3 phosphoglycerates to 2 phosphoglycerate

In this step, the phosphoryl group in 3 phosphoglycerates is shifted to the C-2 position which yields 2 phosphoglycerates. The reaction is catalyzed by the enzyme phosphoglycerate mutase which requires Mg 2+ ion for its activity.

9. Dehydration of 2 phosphoglycerates to Phosphoenolpyruvate

Phosphoenol pyruvate is produced by 2 phosphoglycerates due to the release of water molecules. The reaction is catalyzed by the enzyme enolase.

10. Transfer of the phosphoryl group

Pyruvate kinase catalyzes the last reaction of glycolysis where the phosphoryl group is released from phosphoenolpyruvate and joins with ADP and leads to the production of ATP.

ERGEBNISSE

Enolase Is a Subunit of the CPC1 Complex

We previously found that C. reinhardtii flagella from cpc1 mutants beat at reduced frequency, but that beat frequency was restored to 90% of wild-type frequency when permeabilized cell models or isolated axonemes were reactivated in the presence of 1 mM ATP (Zhang and Mitchell, 2004), suggesting that this mutation reduces flagellar ATP levels. Obwohl die CPC1 gene product contains a sequence domain similar to adenylate kinases, we were unable to demonstrate any deficit in adenylate kinase activity in either detergent-permeabilized whole flagella or in the resulting detergent-insoluble axoneme fraction. Jedoch, cpc1 mutant flagella fail to assemble a 16S complex composed of at least four proteins in addition to the CPC1 gene product (Mitchell and Sale, 1999 Zhang and Mitchell, 2004). To determine whether any of these four proteins is directly linked to ATP production, gel bands corresponding to each protein (Figure 2A) were analyzed by mass spectrometry. Peptides identified and the corresponding genes are listed in Table 1.

Tabelle 1. Proteomic identification of CPC1 complex subunits

a Gene names are those designated by the JGI to label gene models in version 2.0 of the Chlamydomonas genome database ( http://genome.jgi-psf.org/chlamy/). GenBank accession numbers, when available, are shown in parentheses.

The highest molecular weight protein in this CPC1 complex (350 kDa) was identified as C_160167 in the C. reinhardtii genome database v 2.0 ( http://www.genome.jgi-psf.org/chlamy/). Translation of predicted coding regions generates a 2458 amino acid gene product that contains one domain related to adenylate kinases and five domains related to guanylate kinases (Figure 2B). The most N-terminal guanylate kinase-related domain contains most of the highly conserved residues of known enzymatically active guanylate kinases, whereas the remaining four show considerable degeneracy from canonical nucleotide kinase sequences. The second protein in the CPC1 complex (265 kDa) has been previously characterized as the CPC1 gene product (Zhang and Mitchell, 2004). As noted in Figure 2B, it also has a predicted adenylate kinase domain as the only region with homology to proteins of known enzymatic activity. Orthologues of the CPC1 protein are also present in mammalian cilia from airway epithelia (Ostrowski et al.,1999, 2002). As noted above, assays show no apparent reduction in adenylate kinase activity in mutants lacking this complex (Zhang and Mitchell, 2004), thus adenylate kinase loss would not appear to account for the apparent reduction in ATP concentration in cpc1 flagella.

The third CPC1 complex protein (135 kDa) was identified as the product of a putative gene (C_340095) with a predicted amino acid sequence (1092 amino acids, 113 kDa) lacking any region of high-sequence similarity to previously characterized proteins. Structural predictions indicate that this protein is mostly alpha helical database comparisons reveal similarity of two segments to armadillo repeats (Figure 2B).

The CPC1 complex subunit migrating at 79 kDa generated five peptides that all match the sequence of the C. reinhardtii HSP70A heat-shock protein (Muller et al., 1992). Further confirmation that HSP70A is a bona fide subunit of the CPC1 complex relied on antibodies previously characterized as specific for HSP70 and that recognize a single 78-kDa flagellar protein in several species, including sea urchin (Stephens and Lemieux, 1999) and C. reinhardtii (Bloch and Johnson, 1995). Western blots of sucrose gradient fractions of wild-type central pair extracts show that most of the HSP70A antigen in this fraction cosediments at 16S with the CPC1 proteins (Figure 2C), with a second minor peak having a sedimentation value of about 4S. Furthermore, analysis of axonemes from wild-type, central pair assembly mutant (pf18), und cpc1 cells confirm that HSP70A is reduced in cpc1 and absent in pf18 samples (Figure 2D). Immunoblots of gradient fractions show that in cpc1 extracts all the remaining HSP70 is found in the 4S peak (Figure 2E).

Proteomic analysis of the fifth CPC1 complex subunit (56 kDa) identified eight peptides identical to C. reinhardtii enolase, the penultimate enzyme in glycolysis. Western blots using an antibody against a C-terminal peptide of human enolase recognize the 56-kDa CPC1 complex subunit (Figure 2C) and show that this protein is greatly reduced in cpc1 mutant axonemes and essentially absent in axonemes from pf18 cells (Figure 2D). However, only a part of the total enolase extracted from axonemes with 0.2 M KI cosediments in a sucrose gradient with other CPC1 complex proteins. The remainder is more broadly distributed, with a peak at a sedimentation value of ∼6–7S (Figure 2C). Gradients of cpc1 extracts indicate that, as with HSP70, any enolase remaining in cpc1 axonemes is found in this slower-sedimenting peak (Figure 2E).

Figur 2. Identification of CPC1 complex subunits. CPC1 extracted from wild-type axonemes by 0.2 M KI cosediments on a sucrose gradient with four other proteins. (A) Stained gel of sucrose gradient fractions from wild-type KI extracts with CPC1 complex subunits (arrows) labeled by apparent size. The 265-kDa band was previously determined to be CPC1 (Zhang and Mitchell, 2004). (B) Domain structure of CPC1 and the two novel subunits identified by proteomic analysis (see text and Table 1). The 350-kDa protein contains domains with homology to calpain (C), adenylate kinase (AK), and guanylate kinase (GK) CPC1 contains one AK domain the 135-kDa protein contains two armadillo repeat domains (AR). (C) Immunoblots of the sucrose gradient fractions shown in A were probed with the indicated antibodies and reveal the cosedimentation of CPC1, HSP70A, and enolase (fractions 5 and 6). Additional peaks of HSP70A and enolase occur higher in the gradient. (D) Gel and corresponding immunoblots of wild-type (WT), central pairless (pf18), und cpc1 axonemal proteins probed with antibodies to HSP70A (HSP70) or enolase (ENO). Both proteins are missing from pf18 axonemes and greatly reduced in cpc1 axonemes. Gels were 7% acrylamide for A and C and the stained image in D and 10% acrylamide for the immunoblots in D. (E) Immunoblots of sucrose gradient fractions of cpc1 KI extracts were probed with the indicated antibodies and reveal the loss of enolase and HSP70A in fractions 5 and 6. The sizes (in kDa) of molecular mass standards are indicated next to each gel (A and D) and the enolase blot (D). The gel in A and the anti-CPC1 immunoblot in C appeared in a previous publication (Zhang and Mitchell, 2004). (F) Enolase activity in axonemal extracts. Enolase activity was measured in sucrose gradient fractions, similar to those shown in A, prepared with extracts from equal numbers of wild-type (•) or cpc1 (○) axonemes. Data are representative of two independent experiments.

As further confirmation that the 56-kDa protein retained other expected properties of enolase, enzyme assays were performed on sucrose gradient fractions of KI extracts from both wild-type and cpc1 mutant axonemes. As illustrated in Figure 2F, enolase activity occurs in two peaks in the wild-type gradient that coincide with peaks identified antigenically to contain enolase (Figure 2C). Die cpc1 gradient lacks enolase activity corresponding to the wild-type 16S sedimentation peak and has greatly reduced activity associated with the 6–7S peak, which suggests that at least part of the wild-type 6–7S peak represents enolase that has dissociated from the CPC1 complex. Thus both immunoblot and enzyme activity data indicate that much of the enolase in wild-type axonemes is associated with the CPC1 complex (Figure 2, C, E, and F).

To determine the proportion of total flagellar enolase that is associated with the axoneme, immunoblots of whole flagella, and of separated axonemal and membrane + matrix (detergent soluble) flagellar fractions from wild-type, cpc1, und pf18 cells were probed for enolase (Figure 3). After treatment with NP-40 detergent, more than half of the enolase present in wild-type flagella appears in the detergent soluble (Figure 3B, lanes M+M), rather than the axonemal (Figure 3B, lanes AXO) fraction. The amount of enolase protein is reduced in total flagella and axonemes from both cpc1 und pf18 cells (Figure 3B), consistent with the results shown in Figure 2D. Comparison of pf18 with other central pair assembly mutants (pf15, pf19, pf20) shows that flagellar enolase is similarly detergent extractable in all of these mutants (unpublished data), thus the majority of flagellar enolase is in the detergent-soluble compartment. In cpc1 und pf18 flagella the axonemal enolase is reduced or missing, respectively, indicating that all of the enolase that is structurally anchored to the axoneme is present in the central pair complex.

Glycolytic Enzyme Activity in Chlamydomonas Flagella

ATP formation from the breakdown of glucose has been conceptually divided into two parts, a first half that requires phosphorylation by ATP and a second half (Figure 4) that generates excess ATP. The two ATP generating steps of glycolysis are thought to take place in the cytoplasm in C. reinhardtii, whereas earlier steps in glucose degradation occur in the chloroplast (Klein, 1986). Because enolase does not directly catalyze ATP synthesis, we looked for additional glycolytic enzymes in C. reinhardtii flagella and flagellar fractions. For these experiments, flagella were fractionated using two different methods. Treatment with the nonionic detergent NP-40 was used to simultaneously solubilize the bulk of the membrane proteins and release detergent-soluble (matrix) proteins, whereas axonemal microtubules and any microtubule-associated proteins remained in the NP-40-insoluble fraction. Alternatively, freeze-thaw treatment was used to release only matrix proteins (Zhang and Snell, 1995 Cole et al., 1998), whereas the major membrane glycoprotein (Bloodgood and Salomonsky, 1994) remained with axonemes in the insoluble fraction. Activity was measured for each of the five enzymes of the lower half of glycolysis (Figure 4) beginning with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAP). Activities were measured on at least three independent flagellar preparations for each enzyme, with similar results. The results from one preparation are summarized in Table 2. Interestingly, easily measurable activity for only three of these five enzymes was detected in whole flagella. We were unable to detect GAP activity in flagella using either 1,3-bisphosphoglycerate and NADH (or NADPH) as substrates (reverse reaction direction), or using P_ich, glyceraldehyde 3-phosphate, and NAD (or NADP) as substrates (forward reaction direction), under conditions that readily detected the GAP activity of whole cell extracts (Table 2 and unpublished data). Phosphoglycerate kinase (PGK) activity was also readily detected in cytoplasmic extracts, but not in flagella or flagellar extracts. Activities for the last three enzymes in the pathway, phosphoglycerate mutase, enolase, and pyruvate kinase were all detected in flagella (Table 2) and displayed similar activity levels following either NP-40 treatment or freeze-thaw treatment. Collectively, these enzymes could support the second of the two ATP-generating steps of glycolysis, indicating that C. reinhardtii flagella have the capacity to produce one ATP molecule per substrate molecule (i.e., 3-phosphoglycerate) consumed.

Figur 3. Blot analysis of flagellar enolase in wild-type and central pair assembly defective mutants. (A) Stained gel of whole flagella (FLA), and the insoluble axoneme (AXO) and soluble membrane + matrix (M+M) fractions generated by treatment with NP-40 detergent. Samples were prepared from wild-type (W), cpc1 (C), or pf18 (P) cells. (B) Immunoblot of a gel identical to A except that sample loads were reduced 50-fold and the separating gel contained 1 M urea, probed with anti-enolase (C-19). The sizes (in kDa) of molecular mass standards are indicated next to the stained panel.

Figur 4. Diagram summarizing steps of glycolysis known to occur in the cytosol in Chlamydomonas, including the two steps that can contribute to ATP synthesis.

Schau das Video: What is ATP? (Juni 2022).