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Kann Cystein allein die Pigmentierung verändern?

Kann Cystein allein die Pigmentierung verändern?


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Laut dieser Grafik (von hier):

Cystein trägt zur Phäomelanogenese bei, und eine ausreichend hohe Cysteinkonzentration bewirkt die Verschiebung zu Phäomelanin anstelle von Eumelanin. Meine Frage ist also: Theoretisch würde ich meinem Hund täglich ein Cystein-Ergänzungsmittel geben, würde sich die Fellfarbe im Laufe der Zeit ändern? Wenn ja, wie und wenn nein, warum nicht? Was fehlt mir in diesem Prozess?

Haftungsausschluss: das ist nur ein beispiel, ich habe natürlich nicht vor, meinem hund überhaupt etwas zu füttern, es ist nur eine hypothese. Was ich wissen möchte ist, dass eine Erhöhung des Cystein-/Glutathionspiegels wirklich zur Phäomelaninproduktion beitragen kann? Ich weiß, dass in Labortests eine höhere Cysteinkonzentration theoretisch eine höhere Phäomelaninproduktion bedeutet, aber ich interessiere mich für echte Lebewesen. Wenn dies möglich ist, kann es ein großer Durchbruch sein. Wenn Sie der Meinung sind, dass Cystein allein keinen Unterschied macht, was dann? Laut der beigefügten Grafik ist das das einzige, was den Unterschied macht.


Überraschenderweise ist es tatsächlich möglich! Tatsache ist jedoch, dass der eigentliche Prozess etwas komplexer ist und möglicherweise mehr Verbindungen zusammen mit Cystein erforderlich ist, um solche Wirkungen bei Lebewesen zu erzielen. Sehen Sie sich zuerst dieses Bild an1:

Wie aus dem Diagramm ersichtlich ist, ist GSH (Glutathion) neben Cystein auch ein Faktor für die Phäomelanin-Produktion. Ein weiterer Faktor, den man vielleicht nicht beachten sollte, ist die Tyrosinase-Proteinexpression. Es wird angenommen, dass eine hohe Menge an L-Cystein die Expression von Tyrosinase in Zellen verringert2 (Aber da ich nur einen Artikel gefunden habe, würde ich vorschlagen, diesem Punkt nicht viel Aufmerksamkeit zu schenken).

Neben der Genexpression beeinflusst Cystein auch die Tyrosinase selbst. Es wurde gezeigt, dass hohe Konzentrationen von Cystein und Glutathion die Tyrosinase in Zellen inaktivieren, und als Ursache wurde die Thiolgruppe von GSH und Cystein vermutet, die irgendwie Sauerstoffradikale erzeugt und Tyrosinase inaktiviert3. Eine Konzentration von 10 mM Cystein reicht aus, um die Tyrosinase-Aktivität in Zellen zu hemmen4. Aufgrund dieser Art von Wirkungen werden GSH und Cystein heute in Kosmetika als Hautaufheller verwendet, da sie in höheren Konzentrationen die Tyrosinaseaktivität und damit die Melaninproduktion in den Hautzellen hemmen5.

Nur um hinzuzufügen, wenn es um die Genregulation geht, scheint Cystein auch noch einige weitere Wirkungen zu haben. Wie von @Chris betont, wird die Eumelaninproduktion in der Haut durch eine Kaskade stimuliert, an der ein Rezeptor beteiligt ist, der als Melanocortin-1-Rezeptor (oder MC1R) bekannt ist. Bei Aktivierung durch eine der Varianten von MSH, typischerweise $alpha$-MSH, initiiert MC1R eine komplexe Signalkaskade, die zur Produktion des braunen oder schwarzen Pigments Eumelanin . führt6. Nun kam eine Studie zu dem Schluss, dass eine Konzentration von 0,07 mg/ml L-Cystein die Expression des MC1R-Gens stark reduziert und somit buchstäblich keinen Weg (nicht wirklich) für die Eumelaninproduktion lässt7!

Kurz gesagt, es ist nicht so einfach wie "Hey, du willst eine rote Hautfarbe? Hier ist etwas Cystein für dich!" Cystein und andere verwandte Verbindungen wie GSH haben eine komplexere Wirkung auf die Melaninproduktion, als nur die Produktion von Phäomelanin gegenüber Eumelanin zu fördern. Sie können sich auch diese Antwort (von @Chris) ansehen, um weitere Informationen zu erhalten.

BEARBEITEN: Um zu erkennen, wo Sie falsch liegen, werde ich zwei Reaktionsflussdiagramme erstellen. Erstens erwarten Sie (IMO) dies als Antwort:

Aber das passiert tatsächlich:

Die rote Linie interessiert uns. Aber wie Sie sehen, ist das Diagramm bereits ziemlich kompliziert (und wird voraussichtlich komplizierter, wenn mehr Faktoren entdeckt werden). Eine einfachere Erklärung als diese zu geben, wäre also sehr unpraktisch oder unmöglich.

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Kann Cystein allein die Pigmentierung verändern? - Biologie

Wir haben bereits etwas über DNA und Mutationen gelernt, jetzt lernen wir, wie diese Mutationen die Evolution vorantreiben können. Diese Art der Evolution fällt unter die Kategorie der Mikroevolution.

Mikroevolution ist die Veränderung der Allelfrequenzen, die im Laufe der Zeit innerhalb einer Population auftritt. Diese Veränderung ist auf fünf verschiedene Prozesse zurückzuführen: Mutation, Selektion (natürlich und künstlich), Genfluss, Genmigration und genetische Drift. Diese Veränderung geschieht über einen relativ kurzen (in evolutionären Begriffen) Zeitraum im Vergleich zu den Veränderungen, die als ‘Makroevolution’ bezeichnet werden, bei denen größere Unterschiede in der Population auftreten.

Populationsgenetik ist der Zweig der Biologie, der die mathematische Struktur für das Studium des Prozesses der Mikroevolution bereitstellt. Die ökologische Genetik beschäftigt sich mit der Beobachtung der Mikroevolution in freier Wildbahn. Typischerweise sind beobachtbare Fälle von Evolution Beispiele für Mikroevolution, zum Beispiel Bakterienstämme, die eine Antibiotikaresistenz aufweisen.

Die Mikroevolution führt im Laufe der Zeit zur Artbildung oder zum Auftreten neuer Strukturen, die manchmal als Makroevolution klassifiziert werden. Makro- und Mikroevolution beschreiben grundsätzlich identische Prozesse auf unterschiedlichen Skalen.

Lernerfolge

  • Den Zusammenhang zwischen Genetik und Evolution verstehen
  • Verstehen Sie, wie sich Umweltveränderungen und Selektionsdruck auf die Verbreitung von Mutationen auswirken und so zum Evolutionsprozess beitragen
  • Beschreiben Sie die verschiedenen Variationsarten in einer Population

Elektronisches Zusatzmaterial ist online verfügbar unter https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4070540.

Herausgegeben von der Royal Society. Alle Rechte vorbehalten.

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I. EINLEITUNG

Arten, die gemäßigte und polare Breiten besetzen, weisen zahlreiche physiologische und lebensgeschichtliche Anpassungen auf, die ihnen helfen, mit harten Wintern und hoher Saisonalität fertig zu werden (Blix, 2016). Zu diesen zirka-jährlichen Merkmalen gehören saisonale Migration, Winterschlaf und Fellfarbenhäutung, und ihr Auftreten und ihre optimale Phänologie sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Fitness (Varpe, 2017). Da jedoch die globale Erwärmung die Temperaturen und die Schneedecke in weiten Teilen der nördlichen Hemisphäre verändert, werden die saisonalen Anpassungen beeinträchtigt (Pauli et al., 2013 Williams, Henry & Sinclair, 2015 Berteaux et al., 2017). Es ist von großem Interesse zu verstehen, ob eine Anpassung dieser Merkmale erfolgen kann (Helm et al., 2013 Williams et al., 2017 ) und erfordert umfassende Kenntnisse der jeweiligen Merkmale.

Ein wichtiges adaptives Merkmal, das durch den Klimawandel zunehmend beeinträchtigt wird, ist die saisonale Fellfarbe (SCC), die sich von dunkel pigmentiertem Fell oder Gefieder im Sommer zu weiß im Winter häutet. Obwohl bei Wirbeltieren Farbveränderungen zu finden sind (Duarte, Flores & Stevens, 2017), sind vollständige SCC-Mauser, die dem Vorhandensein oder Fehlen von Schnee entsprechen, für mehrere Vogel- und Säugetierarten einzigartig. Die halbjährlichen phänotypischen Verschiebungen werden durch komplexe physiologische Mechanismen gesteuert, die durch die Photoperiode mitgerissen und an die lokalen Bedingungen angepasst werden. Da jedoch die saisonale Dauer und das Ausmaß der Schneebedeckung aufgrund des Klimawandels abnehmen (Vaughan et al., 2013 Kunkel et al., 2016), werden SCC-Arten farblich nicht mit ihrer Umgebung übereinstimmen (Mills et al., 2013) (Abb. 1B, C).

Um zu verstehen, wie saisonale Farbwechsel auf abnehmende Schneedecke reagieren können, müssen wir zunächst die ökologische Bedeutung und die zugrunde liegenden Mechanismen dieses hochspezialisierten Merkmals verstehen. Obwohl die Ökologie und Physiologie von SCC-Mausern im letzten Jahrhundert von Naturforschern und Wissenschaftlern erhebliche Aufmerksamkeit erregt hat, wurden Erkenntnisse aus diesen Bereichen nicht fach- und artenübergreifend gesammelt oder mit dem Klimawandel in Verbindung gebracht. Hier fassen wir aktuelle Erkenntnisse zur Funktion und molekularen und physiologischen Kontrolle von SCC-Mausern bei Vögeln und Säugetieren zusammen. Diese interdisziplinäre Synthese und der Vergleich zwischen den Taxa bieten eine Grundlage für die Untersuchung der Auswirkungen des Klimawandels auf KKS-Arten und ihre Fähigkeit, sich in Zukunft daran anzupassen.


Inhalt

Beim Menschen ist Melanin die wichtigste Determinante der Hautfarbe. Es kommt auch in Haaren, dem pigmentierten Gewebe unter der Iris des Auges und der Stria vascularis des Innenohrs vor. Im Gehirn umfassen Gewebe mit Melanin die Medulla und pigmenthaltige Neuronen in Bereichen des Hirnstamms, wie beispielsweise dem Locus coeruleus. Es kommt auch in der Zona reticularis der Nebenniere vor. [5]

Das Melanin in der Haut wird von Melanozyten produziert, die sich in der Basalschicht der Epidermis befinden. Obwohl der Mensch im Allgemeinen eine ähnliche Konzentration an Melanozyten in seiner Haut besitzt, produzieren die Melanozyten bei einigen Individuen und ethnischen Gruppen unterschiedliche Melaninmengen. Manche Menschen haben sehr wenig oder keine Melaninsynthese in ihrem Körper, ein Zustand, der als Albinismus bekannt ist. [6]

Da Melanin ein Aggregat kleinerer Komponentenmoleküle ist, gibt es viele verschiedene Arten von Melanin mit unterschiedlichen Anteilen und Bindungsmustern dieser Komponentenmoleküle. Sowohl Phäomelanin als auch Eumelanin kommen in menschlicher Haut und Haar vor, aber Eumelanin ist das am häufigsten vorkommende Melanin beim Menschen und die Form, die am wahrscheinlichsten einen Albinismus-Mangel aufweist. [7]

Eumelanin Bearbeiten

Es wurde lange angenommen, dass Eumelanin-Polymere zahlreiche vernetzte 5,6-Dihydroxyindol-(DHI)- und 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäure-(DHICA)-Polymere umfassen. [8]

Es gibt zwei Arten von Eumelanin, nämlich braunes und schwarzes Eumelanin. Diese beiden Arten von Eumelanin unterscheiden sich chemisch in ihrem Muster der Polymerbindungen. Eine geringe Menge schwarzes Eumelanin in Abwesenheit anderer Pigmente verursacht graues Haar. Eine geringe Menge an braunem Eumelanin in Abwesenheit anderer Pigmente verursacht gelbes (blondes) Haar. [9]

Phäomelanin Bearbeiten

Phäomelanine (oder Phäomelanine) verleihen eine Reihe von gelblichen bis rötlichen Farben. [10] Phäomelanine sind besonders in den Lippen, Brustwarzen, Eichel und Vagina konzentriert. [11] Wenn eine kleine Menge von braunem Eumelanin im Haar, die sonst blondes Haar verursachen würde, mit rotem Phäomelanin gemischt wird, ist das Ergebnis orangefarbenes Haar, das normalerweise als "rotes" oder "ingwerfarbenes" Haar bezeichnet wird. Phäomelanin ist auch in der Haut vorhanden, und Rothaarige haben daher oft auch einen rosafarbenen Farbton auf ihrer Haut.

In chemischer Hinsicht unterscheiden sich Phäomelanine von Eumelaninen dadurch, dass die Oligomerstruktur Benzothiazin- und Benzothiazol-Einheiten enthält, die anstelle von DHI und DHICA produziert werden, wenn die Aminosäure L-Cystein vorhanden ist.

Trichochrome Bearbeiten

Trichochrome (früher Trichosiderine genannt) sind Pigmente, die auf demselben Stoffwechselweg wie die Eumelanine und Phäomelanine hergestellt werden, aber im Gegensatz zu diesen Molekülen haben sie ein niedriges Molekulargewicht. Sie kommen in einigen roten menschlichen Haaren vor. [13]

Neuromelanin Bearbeiten

Neuromelanin (NM) ist ein dunkles unlösliches Polymerpigment, das in bestimmten Populationen katecholaminerger Neuronen im Gehirn produziert wird. Menschen haben die größte Menge an NM, die bei anderen Primaten in geringeren Mengen vorhanden ist und bei vielen anderen Arten völlig fehlt. [14] Die biologische Funktion bleibt unbekannt, obwohl gezeigt wurde, dass humanes NM Übergangsmetalle wie Eisen sowie andere potenziell toxische Moleküle effizient bindet. Daher könnte es eine entscheidende Rolle bei der Apoptose und der damit verbundenen Parkinson-Krankheit spielen. [fünfzehn]

Melanine haben in verschiedenen Organismen sehr unterschiedliche Rollen und Funktionen. Eine Form von Melanin bildet die Tinte, die von vielen Kopffüßern (siehe Kopffüßer-Tinte) als Abwehrmechanismus gegen Raubtiere verwendet wird. Melanine schützen auch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze vor Stress, der mit Zellschäden wie UV-Strahlung der Sonne und reaktiven Sauerstoffspezies einhergeht. Melanin schützt auch vor Schäden durch hohe Temperaturen, chemische Belastungen (wie Schwermetalle und Oxidationsmittel) und biochemische Bedrohungen (wie Wirtsabwehr gegen eindringende Mikroben). [16] Daher ist bei vielen pathogenen Mikroben (z. B. in Cryptococcus neoformans, ein Pilz) scheinen Melanine eine wichtige Rolle bei der Virulenz und Pathogenität zu spielen, indem sie die Mikrobe vor Immunreaktionen ihres Wirts schützen. Bei Wirbellosen ist Melanin ein wichtiger Aspekt der angeborenen Immunabwehr gegen eindringende Krankheitserreger. Innerhalb von Minuten nach der Infektion ist die Mikrobe in Melanin eingekapselt (Melanisierung), und es wird angenommen, dass die Bildung von Nebenprodukten freier Radikale während der Bildung dieser Kapsel bei deren Abtötung hilft. [17] Einige Arten von Pilzen, die als radiotrophe Pilze bezeichnet werden, scheinen in der Lage zu sein, Melanin als photosynthetisches Pigment zu verwenden, das es ihnen ermöglicht, Gammastrahlen einzufangen [18] und diese Energie für das Wachstum zu nutzen. [19]

Die dunkleren Federn von Vögeln verdanken ihre Farbe Melanin und werden von Bakterien weniger leicht abgebaut als unpigmentierte oder solche mit Carotinoidpigmenten. [20] Federn, die Melanin enthalten, sind auch 39% widerstandsfähiger gegen Abrieb als solche, die dies nicht tun, da Melanin-Granulat dazu beiträgt, den Raum zwischen den Keratinsträngen zu füllen, die die Federn bilden. [21] [22] Die Phäomelaninsynthese bei Vögeln impliziert die Aufnahme von Cystein, einer semiessentiellen Aminosäure, die für die Synthese des Antioxidans Glutathion (GSH) notwendig ist, aber im Überschuss toxisch sein kann. Tatsächlich weisen fleischfressende Vögel, die einen hohen Proteingehalt in ihrer Nahrung haben, eine auf Phäomelanin basierende Färbung auf. [23]

Melanin ist auch für die Pigmentierung von Säugetieren wichtig. [24] Das Fellmuster von Säugetieren wird durch das Agouti-Gen bestimmt, das die Verteilung von Melanin reguliert. [25] [26] Die Mechanismen des Gens wurden ausführlich an Mäusen untersucht, um einen Einblick in die Vielfalt der Fellmuster von Säugetieren zu erhalten. [27]

Es wurde beobachtet, dass Melanin in Arthropoden in Schichten abgelagert wird, wodurch ein Bragg-Reflektor mit wechselndem Brechungsindex erzeugt wird. Wenn die Skala dieses Musters der Wellenlänge des sichtbaren Lichts entspricht, entsteht eine strukturelle Färbung: Sie verleiht einer Reihe von Arten eine schillernde Farbe. [28]

Spinnentiere sind eine der wenigen Gruppen, in denen Melanin nicht leicht nachgewiesen werden konnte, obwohl Forscher Daten fanden, die darauf hindeuten, dass Spinnen tatsächlich Melanin produzieren. [29]

Einige Mottenarten, einschließlich der Waldtigermotte, wandeln Ressourcen in Melanin um, um ihre Thermoregulation zu verbessern. Da die Waldtigermotte Populationen in einem großen Breitenbereich hat, wurde beobachtet, dass nördlichere Populationen höhere Melanisierungsraten aufwiesen. Sowohl beim gelben als auch beim weißen männlichen Phänotyp der Waldtigermotte hatten Individuen mit mehr Melanin eine erhöhte Fähigkeit, Wärme einzufangen, aber eine erhöhte Prädationsrate aufgrund eines schwächeren und weniger wirksamen aposematischen Signals. [30]

Pflanzen Bearbeiten

Von Pflanzen produziertes Melanin wird manchmal als "Katechin-Melanine" bezeichnet, da sie bei der Alkalifusion Katechol ergeben können. Es wird häufig bei der enzymatischen Bräunung von Früchten wie Bananen beobachtet. Kastanienschalenmelanin kann als Antioxidans und Farbstoff verwendet werden. [31] Die Biosynthese umfasst die Oxidation von Indol-5,6-chinon durch die Polyphenoloxidase vom Tyrosinase-Typ aus Tyrosin und Katecholaminen, was zur Bildung von Katecholmelanin führt. Trotzdem enthalten viele Pflanzen Verbindungen, die die Produktion von Melaninen hemmen. [32]

Der erste Schritt des Biosynthesewegs sowohl für Eumelanine als auch für Phäomelanine wird durch Tyrosinase katalysiert. [33]

Dopachinon kann sich mit Cystein auf zwei Wegen zu Benzothiazinen und Phäomelaninen verbinden

Dopachinon + Cystein → 5-S-Cysteinyldopa → Benzothiazin-Zwischenprodukt → Phäomelanin Dopachinon + Cystein → 2-S-Cysteinyldopa → Benzothiazin-Zwischenprodukt → Phäomelanin

Außerdem kann Dopachinon in Leucodopachrom umgewandelt werden und zwei weiteren Wegen zu den Eumelaninen folgen

Dopachinon → Leucodopachrom → Dopachrom → 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäure → Chinon → Eumelanin Dopachinon → Leucodopachrom → Dopachrom → 5,6-Dihydroxyindol → Chinon → Eumelanin

Detaillierte Stoffwechselwege finden Sie in der KEGG-Datenbank (siehe Externe Links).

Melanin ist braun, nicht brechend und feinkörnig mit einzelnen Körnchen mit einem Durchmesser von weniger als 800 Nanometern. Dies unterscheidet Melanin von üblichen Blutabbaupigmenten, die größer, klumpig und lichtbrechend sind und in der Farbe von grün bis gelb oder rotbraun reichen. Bei stark pigmentierten Läsionen können dichte Melaninaggregate histologische Details verschleiern. Eine verdünnte Lösung von Kaliumpermanganat ist ein wirksames Melaninbleichmittel. [34]

Es gibt ungefähr neun Arten von okulokutanem Albinismus, der meistens eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung ist. Bestimmte Ethnien haben eine höhere Inzidenz verschiedener Formen. Zum Beispiel ist der häufigste Typ, genannt okulokutaner Albinismus Typ 2 (OCA2), besonders häufig bei Menschen schwarzafrikanischer Abstammung und weißen Europäern. Menschen mit OCA2 haben normalerweise helle Haut, sind aber oft nicht so blass wie OCA1. Sie haben blassblondes bis goldenes, erdbeerblondes oder sogar braunes Haar und am häufigsten blaue Augen. 98,7-100% der modernen Europäer sind Träger des abgeleiteten Allels SLC24A5, einer bekannten Ursache für nicht-syndromalen okulokutanen Albinismus. Es handelt sich um eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die durch eine angeborene Reduktion oder Abwesenheit von Melaninpigmenten in Haut, Haaren und Augen gekennzeichnet ist. Die geschätzte Häufigkeit von OCA2 bei Afroamerikanern liegt bei 1 zu 10.000, im Gegensatz zu einer Häufigkeit von 1 zu 36.000 bei weißen Amerikanern. [35] In einigen afrikanischen Ländern ist die Häufigkeit der Erkrankung sogar noch höher und reicht von 1 zu 2.000 bis 1 zu 5.000. [36] Eine andere Form des Albinismus, der "gelbe okulokutane Albinismus", scheint bei den Amish, die hauptsächlich schweizerischer und deutscher Abstammung sind, häufiger vorzukommen. Menschen mit dieser IB-Variante der Erkrankung haben bei der Geburt häufig weißes Haar und weiße Haut, entwickeln jedoch im Säuglingsalter schnell eine normale Hautpigmentierung. [36]

Der okuläre Albinismus beeinflusst nicht nur die Augenpigmentierung, sondern auch die Sehschärfe. Menschen mit Albinismus testen normalerweise schlecht, im Bereich von 20/60 bis 20/400. Darüber hinaus sind zwei Formen von Albinismus, wobei etwa 1 von 2700 Menschen puerto-ricanischer Herkunft am häufigsten vorkommen, mit einer Sterblichkeit über die Melanom-bedingten Todesfälle hinaus verbunden.

Der Zusammenhang zwischen Albinismus und Taubheit ist bekannt, wenn auch kaum verstanden. In seiner Abhandlung von 1859 Zur Entstehung der Arten, beobachtete Charles Darwin, dass "Katzen, die ganz weiß sind und blaue Augen haben, im Allgemeinen taub sind". [37] Beim Menschen treten Hypopigmentierung und Taubheit zusammen beim seltenen Waardenburg-Syndrom auf, das hauptsächlich bei den Hopi in Nordamerika beobachtet wird. [38] Die Inzidenz von Albinismus bei Hopi-Indianern wurde auf etwa 1 von 200 Personen geschätzt. Ähnliche Muster von Albinismus und Taubheit wurden bei anderen Säugetieren, einschließlich Hunden und Nagetieren, gefunden. Ein Mangel an Melanin an sich scheint nicht direkt für die mit Hypopigmentierung verbundene Taubheit verantwortlich zu sein, da die meisten Personen, denen die für die Melaninsynthese erforderlichen Enzyme fehlen, eine normale Hörfunktion haben. [39] Stattdessen führt das Fehlen von Melanozyten in der Stria vascularis des Innenohrs zu einer Beeinträchtigung der Cochlea, [40] warum dies jedoch so ist, ist nicht vollständig geklärt.

Bei der Parkinson-Krankheit, einer Störung, die die neuromotorische Funktion beeinträchtigt, ist das Neuromelanin in der Substantia nigra und im Locus coeruleus als Folge eines spezifischen Abfalls von dopaminergen und noradrenergen pigmentierten Neuronen erniedrigt. Dies führt zu einer verminderten Dopamin- und Noradrenalinsynthese. Obwohl keine Korrelation zwischen der Rasse und dem Neuromelaninspiegel in der Substantia nigra berichtet wurde, hat die deutlich geringere Inzidenz von Parkinson bei Schwarzen als bei Weißen "einige dazu veranlasst, darauf hinzuweisen, dass kutanes Melanin irgendwie dazu dienen könnte, das Neuromelanin in Substantia zu schützen". nigra von äußeren Toxinen." [41]

Neben einem Melaninmangel kann das Molekulargewicht des Melaninpolymers durch verschiedene Faktoren wie oxidativer Stress, Lichteinwirkung, Störung der Assoziation mit melanosomalen Matrixproteinen, pH-Änderungen oder lokale Konzentrationen von Metallionen verringert werden. Ein verringertes Molekulargewicht oder eine Verringerung des Polymerisationsgrades von okuläres Melanin wurde vorgeschlagen, das normalerweise antioxidative Polymer in ein Pro-Oxidationsmittel umzuwandeln. In seinem pro-oxidativen Zustand wurde vorgeschlagen, dass Melanin an der Entstehung und dem Fortschreiten von Makuladegeneration und Melanomen beteiligt ist. [42] Rasagilin, ein wichtiges Monotherapie-Medikament bei der Parkinson-Krankheit, hat Melanin-bindende und Melanomtumor reduzierende Eigenschaften. [43]

Höhere Eumelaninwerte können jedoch über eine stärkere Neigung zu Vitamin-D-Mangel hinaus auch ein Nachteil sein. Dunkle Haut ist ein erschwerender Faktor bei der Laserentfernung von Portweinflecken. Bei der Behandlung von weißer Haut sind Laser im Allgemeinen weniger erfolgreich bei der Entfernung von Portweinflecken bei Menschen asiatischer oder afrikanischer Abstammung. Höhere Melaninkonzentrationen bei dunkelhäutigen Personen diffundieren und absorbieren die Laserstrahlung einfach, wodurch die Lichtabsorption durch das Zielgewebe gehemmt wird. In ähnlicher Weise kann Melanin die Laserbehandlung anderer dermatologischer Erkrankungen bei Menschen mit dunklerer Haut erschweren.

Sommersprossen und Muttermale werden dort gebildet, wo eine lokalisierte Konzentration von Melanin in der Haut vorhanden ist. Sie werden stark mit blasser Haut in Verbindung gebracht.

Nikotin hat aufgrund seiner Vorläuferfunktion bei der Melaninsynthese oder seiner irreversiblen Melaninbindung eine Affinität zu melaninhaltigen Geweben. Es wurde vermutet, dass dies der erhöhten Nikotinabhängigkeit und niedrigeren Raucherentwöhnungsraten bei dunkler pigmentierten Personen zugrunde liegt. [44]

Physiologie Bearbeiten

Melanozyten fügen Melaningranulate in spezialisierte zelluläre Vesikel ein, die Melanosomen genannt werden. Diese werden dann in die Keratinozytenzellen der menschlichen Epidermis transferiert. Die Melanosomen in jeder Empfängerzelle sammeln sich auf dem Zellkern an, wo sie die Kern-DNA vor Mutationen schützen, die durch die ionisierende Strahlung der ultravioletten Strahlen der Sonne verursacht werden. Im Allgemeinen haben Menschen, deren Vorfahren lange Zeit in äquatornahen Regionen der Erde lebten, größere Mengen an Eumelanin in ihrer Haut. Dadurch wird ihre Haut braun oder schwarz und schützt sie vor starker Sonneneinstrahlung, die bei hellhäutigen Menschen häufiger zu Melanomen führt. [45]

Nicht alle Effekte der Pigmentierung sind vorteilhaft. Pigmentierung erhöht die Wärmebelastung in heißen Klimazonen und dunkelhäutige Menschen absorbieren 30 % mehr Wärme durch Sonnenlicht als sehr hellhäutige Menschen, obwohl dieser Faktor durch stärkeres Schwitzen ausgeglichen werden kann. In kalten Klimazonen führt dunkle Haut zu mehr Wärmeverlust durch Strahlung. Auch die Pigmentierung behindert die Vitamin-D-Synthese, so dass dunkelhäutige Kinder in Gebieten mit schlechter Ernährung eher an Rachitis erkranken als hellhäutige Kinder. Da die Pigmentierung für das Leben in den Tropen nicht unbedingt vorteilhaft zu sein scheint, wurden andere Hypothesen über ihre biologische Bedeutung aufgestellt, beispielsweise ein sekundäres Phänomen, das durch Anpassung an Parasiten und Tropenkrankheiten hervorgerufen wird. [46]

Evolutionäre Ursprünge Bearbeiten

Die frühen Menschen entwickelten sich vor etwa 1,2 Millionen Jahren zu einer dunklen Hautfarbe, als Anpassung an den Verlust der Körperbehaarung, der die Auswirkungen der UV-Strahlung verstärkte. Vor der Entwicklung der Haarlosigkeit hatten die frühen Menschen eine relativ helle Haut unter ihrem Fell, ähnlich wie bei anderen Primaten.[47] Die neuesten wissenschaftlichen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass sich anatomisch moderne Menschen in Afrika zwischen 200.000 und 100.000 Jahren entwickelt haben, [48] und dann vor 80.000 bis 50.000 Jahren den Rest der Welt durch eine Migration bevölkerten, wobei sich in einigen Gebieten mit bestimmten archaischen menschliche Spezies (Neandertaler, Denisovaner und möglicherweise andere). [49] Es scheint wahrscheinlich, dass die ersten modernen Menschen eine relativ große Anzahl von Eumelanin-produzierenden Melanozyten hatten, die eine dunklere Haut produzierten, ähnlich wie die heutigen Ureinwohner Afrikas. Als einige dieser Ureinwohner in Gebiete Asiens und Europas wanderten und sich dort niederließen, nahm der Selektionsdruck für die Eumelaninproduktion in Klimazonen ab, in denen die Sonnenstrahlung weniger intensiv war. Dies führte schließlich zu der aktuellen Palette der menschlichen Hautfarbe. Von den beiden gängigen Genvarianten, von denen bekannt ist, dass sie mit blasser menschlicher Haut in Verbindung stehen, Mc1r scheint keine positive Selektion durchlaufen zu haben, [50] während SLC24A5 wurde positiv selektiert. [51]

Effekte bearbeiten

Wie bei Völkern, die nach Norden ausgewandert sind, akklimatisieren sich diejenigen mit heller Haut, die in Richtung Äquator wandern, an die viel stärkere Sonnenstrahlung. Die Natur wählt weniger Melanin aus, wenn die ultraviolette Strahlung schwach ist. Die Haut der meisten Menschen verdunkelt sich, wenn sie UV-Licht ausgesetzt wird, was ihnen mehr Schutz bietet, wenn es nötig ist. Dies ist der physiologische Zweck der Sonnenbräune. Dunkelhäutige Menschen, die mehr hautschützendes Eumelanin produzieren, haben einen höheren Schutz vor Sonnenbrand und der Entwicklung von Melanomen, einer potenziell tödlichen Form von Hautkrebs, sowie anderen Gesundheitsproblemen im Zusammenhang mit starker Sonneneinstrahlung, einschließlich der Photodegradation bestimmter Vitamine wie Riboflavine, Carotinoide, Tocopherol und Folsäure. [52] Einige Nordwesteuropäer haben die Fähigkeit, sich zu bräunen, als Ergebnis einer entspannten natürlichen Selektion erheblich verloren. Ihre Haut brennt und schält sich eher, als dass sie sich bräunt. Dies liegt daran, dass sie eine defekte Form des Hautproteins Mc1r (Melanocortin-1-Rezeptor) produzieren, das für die Produktion von Melanin notwendig ist. Sie sind in tropischen und subtropischen Umgebungen deutlich im Nachteil. Sie leiden nicht nur unter dem Unwohlsein, leicht zu brennen, sondern haben auch ein viel höheres Risiko für Hautkrebs, das gleiche gilt für Albinos. [53]

Melanin in den Augen, in der Iris und Aderhaut hilft, sie vor ultraviolettem und hochfrequentem sichtbarem Licht zu schützen. Menschen mit grauen, blauen und grünen Augen haben ein höheres Risiko für sonnenbedingte Augenprobleme. Darüber hinaus vergilbt die Okularlinse mit zunehmendem Alter und bietet zusätzlichen Schutz. Mit zunehmendem Alter wird die Linse jedoch auch steifer und verliert den größten Teil ihrer Akkommodation – die Fähigkeit, die Form zu ändern, um von der Ferne in die Nähe zu fokussieren – ein Nachteil, der wahrscheinlich auf die durch UV-Exposition verursachte Proteinvernetzung zurückzuführen ist.

Neuere Forschungen legen nahe, dass Melanin eine andere Schutzfunktion als den Lichtschutz haben kann. [54] Melanin ist in der Lage, Metallionen durch seine Carboxylat- und phenolischen Hydroxylgruppen effektiv zu chelatisieren, in vielen Fällen viel effizienter als der starke Chelatligand Ethylendiamintetraacetat (EDTA). Somit kann es dazu dienen, potenziell toxische Metallionen zu sequestrieren und den Rest der Zelle zu schützen. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass der bei der Parkinson-Krankheit beobachtete Verlust von Neuromelanin mit einem Anstieg des Eisenspiegels im Gehirn einhergeht.

Es gibt Beweise für ein hochgradig vernetztes Heteropolymer, das kovalent an Matrixgerüst-Melanoproteine ​​gebunden ist. [55] Es wurde vorgeschlagen, dass die Fähigkeit von Melanin, als Antioxidans zu wirken, direkt proportional zu seinem Polymerisationsgrad oder seinem Molekulargewicht ist. [56] Suboptimale Bedingungen für die effektive Polymerisation von Melaninmonomeren können zur Bildung von niedermolekularem, prooxidativem Melanin führen, das mit der Entstehung und dem Fortschreiten von Makuladegeneration und Melanom in Verbindung gebracht wird. [57] Signalwege, die die Melanisierung im retinalen Pigmentepithel (RPE) hochregulieren, können auch an der Herunterregulierung der Phagozytose des äußeren Stäbchensegments durch das RPE beteiligt sein. Dieses Phänomen wurde zum Teil auf die Schonung der Fovea bei der Makuladegeneration zurückgeführt. [58]


Galle Esculin Agar

Dies ist ein Medium, das sowohl selektiv als auch differentiell ist. Es testet die Fähigkeit von Organismen, Esculin in Gegenwart von Galle zu hydrolysieren. Es wird häufig verwendet, um Mitglieder der Gattung zu identifizieren Enterokokken (E fäkalien und E. faecium).

Der erste selektive Inhaltsstoff in diesem Agar ist Galle, die das Wachstum von anderen Gram-positiven als Enterokokken und einigen Streptokokkenarten hemmt. Der zweite selektive Inhaltsstoff ist Natriumazid. Diese Chemikalie hemmt das Wachstum von Gram-negativen.

Der differenzielle Inhaltsstoff ist Esculin. Wenn ein Organismus Esculin in Gegenwart von Galle hydrolysieren kann, wird das Produkt Esculetin gebildet. Esculetin reagiert mit Eisencitrat (im Medium) und bildet einen phenolischen Eisenkomplex, der die gesamte Schräge dunkelbraun bis schwarz färbt. Das Röhrchen ganz rechts wurde geimpft mit E. faecalis (positiv). Das Röhrchen in der Mitte wurde mit einem biliesculin-negativen Organismus beimpft und das Röhrchen links wurde nicht beimpft.


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N-Acetyl-L-Cystein schützt menschliche retinale Pigmentepithelzellen vor oxidativen Schäden: Auswirkungen auf die altersbedingte Makuladegeneration

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) beinhaltet den Verlust des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der Photorezeptoren und ist eine der Hauptursachen für Erblindung bei älteren Menschen. Oxidative Schäden an Proteinen, Lipiden und DNA wurden mit RPE-Dysfunktion und AMD in Verbindung gebracht. In dieser Studie haben wir oxidativen Stress bei AMD und die Wirksamkeit des Antioxidans N-Acetyl-L-Cystein (NAC) beim Schutz von RPE vor oxidativen Schäden untersucht. Um diese Idee zu testen, wurden Primärkulturen von RPE von menschlichen Spendern mit AMD (

) wurden auf die Expression von NADPH-Oxidase(NOX)-Genen, einer Quelle reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), untersucht. Zusätzlich wurden die Zellen 2 Stunden mit NAC vorbehandelt und dann entweder mit Wasserstoffperoxid (H2Ö2) oder tert-Butylhydroperoxid (T-BHP), um die Zelloxidation zu induzieren. 24 Stunden nach der Behandlung wurden die ROS-Produktion, das Zellüberleben, der Gehalt an Glutathion (GSH) und Adenosintriphosphat (ATP) sowie die zelluläre Bioenergetik gemessen. Wir fanden eine erhöhte Expression von p22phox, einem NOX-Regulator, in AMD-Zellen im Vergleich zu Zellen ohne AMD (

). Sowohl bei AMD- als auch bei Zellen ohne AMD reduzierte sich die NAC-Vorbehandlung T-BHP-induzierte ROS-Produktion und geschützt vor H2Ö2-induzierter Zelltod und ATP-Depletion. Ohne Oxidation verbesserte die NAC-Behandlung die mitochondriale Funktion in beiden Gruppen (

). Umgekehrt war die von NAC gezeigte Schutzreaktion für einige Parameter krankheitsabhängig. Ohne Oxidation reduzierte NAC die ROS-Produktion ( ) signifikant und erhöhte den GSH-Gehalt ( ) nur in RPE von AMD-Spendern. Zusätzlich NAC-vermittelter Schutz vor H2Ö2-induzierter GSH-Mangel (

) und mitochondriale Dysfunktion (

) war bei AMD-Zellen stärker ausgeprägt als bei Zellen ohne AMD. Diese Ergebnisse zeigen den therapeutischen Nutzen von NAC durch die Milderung von oxidativen Schäden bei RPE. Darüber hinaus unterstützen die für AMD RPE beobachteten günstigen Ergebnisse die Relevanz von NAC und den potenziellen therapeutischen Wert bei der Behandlung von AMD.

1. Einleitung

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die Hauptursache für fortschreitenden und irreversiblen Sehverlust in der alternden Bevölkerung [1]. Die Makula, ein kleiner zentraler Bereich der Netzhaut, der sich bei AMD verschlechtert, ist für die hohe Sehschärfe und das Farbsehen verantwortlich. Etwa 10 % der AMD-Patienten haben die „feuchte“ Form der Erkrankung, die sich als abnormales Wachstum von Blutgefäßen aus der Choriocapillaris, einem gefensterten Blutgefäßnetzwerk außerhalb des Auges, in die Netzhaut manifestiert [2]. Die Mehrheit der AMD-Patienten hat eine „trockene“ AMD, die durch den Verlust des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der Photorezeptoren ohne abnormales Wachstum der Blutgefäße gekennzeichnet ist. In den letzten zehn Jahren hat sich die Behandlung der feuchten AMD mit der Einführung der Anti-VEGF-Therapie deutlich verbessert [3]. Mehrere neue therapeutische Strategien gegen trockene AMD wurden in experimentellen Studien und klinischen Studien getestet [4], obwohl sich keine als wirksame Behandlung erwiesen hat.

Das RPE ist eine einzelne Schicht postmitotischer pigmentierter Zellen, die sich zwischen den Photorezeptoren und der Choriocapillaris befindet. Diese Zellen haben mehrere Funktionen, die an der Erhaltung der Netzhautgesundheit beteiligt sind, einschließlich Photorezeptor-Phagozytose, Nährstofftransport und Zytokinsekretion. Die Störung der RPE-Zellfunktion ist ein Schlüsselereignis in der Pathogenese der AMD [5]. Frühere Studien legen nahe, dass der pathologische Mechanismus eine mitochondriale Dysfunktion aufgrund von oxidativem Stress und nachfolgender Schädigung von Proteinen, Lipiden und mtDNA beinhaltet [6–8]. Oxidativer Stress ist eine Folge hoher Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die physiologisch als Nebenprodukt von Reaktionen in Mitochondrien und von mehreren Enzymen, einschließlich NADPH-Oxidase (NOX), erzeugt werden. Daher können Strategien, die ROS und anschließend oxidativen Stress reduzieren, eine potenzielle therapeutische Intervention bei AMD sein.

Eine Komplikation bei der Entwicklung von Therapeutika ist das Fehlen eines definierten singulären Mechanismus, der die AMD-Pathologie antreibt. Neben dem Alter sind viele Risikofaktoren an den klinischen Manifestationen der AMD beteiligt, darunter Umwelteinflüsse wie Rauchen und Ernährung [9] sowie genetische Polymorphismen [10, 11]. Beweise aus zahlreichen Studien unterstützen jedoch die Rolle von oxidativem Stress/Schäden bei der AMD-Pathologie. Zum Beispiel haben menschliche Spender mit AMD erhöhte Glykierungsendprodukte und ω-(2-Carboxyethyl)pyrrole, Produkte der Proteinoxidation, in ihrer Netzhaut [12]. Darüber hinaus weisen die RPE von AMD-Spendern erhöhte Spiegel an antioxidativen Enzymen auf, wahrscheinlich eine kompensierende Reaktion auf die oxidative Umgebung der erkrankten Netzhaut [7, 13]. Klinisch unterstützt die Age-Related Eye Disease Study (AREDS) einen Zusammenhang zwischen oxidativem Stress und AMD und zeigt, dass eine Supplementierung mit Antioxidantien plus Zink das Fortschreiten der Krankheit verlangsamt [14].

Basierend auf den positiven Ergebnissen der AREDS sind Antioxidantien ein wirksamer Ansatz zum Schutz der Netzhaut von AMD-Patienten. Die AREDS-Formulierung war jedoch wirksam bei

20 % der Patientenpopulation mit intermediärer AMD, was die Begründung für die Untersuchung zusätzlicher Antioxidantien zur Behandlung oder Vorbeugung des Fortschreitens der AMD liefert. N-Acetyl-L-Cystein (NAC) ist ein schwefelhaltiges Antioxidans, das sowohl als Radikalfänger als auch als Vorläufer von Glutathion (GSH) fungiert, einem Tripeptid, das ein wichtiger Bestandteil des zellulären Abwehrsystems ist. Bisher hat sich gezeigt, dass NAC ein wirksames Antioxidans für Augenerkrankungen sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen ist [15–19]. Allerdings wurde NAC als Behandlung der trockenen AMD nicht gründlich untersucht.

In dieser Studie verwendeten wir altersangepasste Primärkulturen von RPE von menschlichen Spendern mit oder ohne AMD, um die Wirksamkeit von NAC zu bewerten, um die Basalbedingungen zu verbessern und die Zellen vor einem oxidativen Angriff zu schützen, entweder mit Wasserstoffperoxid (H2Ö2) oder tert-Butylhydroperoxid (T-BHP). Wir analysierten auch, ob es ein krankheitsabhängiges Ansprechen auf die NAC-Behandlung gab. Unsere Ergebnisse zeigen, dass NAC vor oxidativen Schäden schützt, indem es eine übermäßige ROS-Produktion, Zelltod, GSH- und ATP-Erschöpfung und eine Beeinträchtigung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung verhindert. Wir beobachteten auch, dass NAC für RPE von AMD-Spendern besonders vorteilhaft war, was auf Relevanz für seinen therapeutischen Wert bei der Behandlung von AMD hindeutet.

2. Materialien und Methoden

2.1. Beschaffung von Augengewebe und Grading für AMD

Deidentifizierte Spenderaugen wurden von Lions Gift of Sight (früher bekannt als Minnesota Lions Eye Bank) in Saint Paul, MN, erhalten. Die Augen wurden mit schriftlicher Zustimmung des Spenders oder der Spenderfamilie zur Verwendung in der medizinischen Forschung gemäß der Deklaration von Helsinki gewonnen. Lions Gift of Sight ist von der Eye Bank Association of America lizenziert (Akkreditierungsnummer 0015204) und von der FDA akkreditiert (FDA Established Identifier 3000718538). Spendergewebe ist vom Genehmigungsverfahren des Institutional Review Board ausgenommen.

Gewebehandhabung, Lagerung und Ausschlusskriterien für Spender sind wie zuvor beschrieben [6, 20]. Die Beurteilung des Vorliegens oder Fehlens von AMD wurde von einer Fachärztin für Augenheilkunde (Sandra R. Montezuma, MD) anhand von stereoskopischen Fundusfotos des RPE anhand der festgelegten Kriterien (RPE-Pigmentveränderungen und Vorhandensein, Größe und Lage von Drusen) bestimmt nach dem Minnesota Grading System (MGS) [13, 21]. Aufzeichnungen von Lions Gift of Sight lieferten demografische Daten (Alter, Geschlecht, Todesursache und Zeit bis zur Gewebeverarbeitung) der Spender, die zur Erzeugung von RPE-Primärkulturen verwendet wurden (Tabelle 1). Siehe ergänzende Tabelle 1 für Informationen zu Spendern, die für jede Figur verwendet wurden.

Informationen von Lions Gift of Sight (St. Paul, MN).

Das Minnesota Grading System (MGS) wurde verwendet, um das Stadium der AMD in Augenbankaugen zu bewerten (Olsen und Feng [21]). Keine AMD: MGS1 AMD: MGS 2, 3 oder 4.

Die Probennummer gibt die Gesamtzahl der Spender mit oder ohne AMD an, die in der aktuellen Studie verwendet wurden.

Das Alter der Spender unterscheidet sich signifikant zwischen den Gruppen ohne AMD und AMD (

Die Zeit vom Tod bis zur Ernte in Stunden.

Die Anzahl der Spender für jede Todesursache ist in Klammern angegeben.

2.2. Zellkultur

RPE-Zellen wurden unter den zuvor beschriebenen Bedingungen kultiviert [7]. Kurz gesagt wurden RPE-Zellen aus menschlichen Spenderaugenmuscheln isoliert, indem Zellen nach einer Inkubation (15 min) mit 0,125% Trypsin, das auf 37°C vorgewärmt war, vorsichtig von der Bruch-Membran abgelöst wurden. Die Zellen wurden in Primaria T25-Flaschen (Corning, Corning, NY) gezüchtet und in MEM-Alpha-Medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA), 1 mM . kultiviert Natriumpyruvat, 1% nichtessentielle Aminosäuren, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. Als die Zellen Konfluenz erreichten (etwa 1 Monat), wurden sie mit Trypsin passagiert und von 1 auf 2 aufgeteilt (Zellen aus einer T25-Flasche wurden in zwei T25-Flaschen aufgeteilt). Zellen in Passage 2 oder 3 wurden für die Analyse verwendet. Die Zellzahl und die Bedingung sind unter jedem Versuchsprotokoll angegeben. Zellproben wurden für die verschiedenen Assays basierend auf ihrer Verfügbarkeit ausgewählt. NAC und H2Ö2, erhalten von Sigma, wurden den RPE-Zellkulturen unter den angegebenen experimentellen Bedingungen zugesetzt. Die Konzentrationen von H2Ö2, die zu 25-50% Zelltod führten, wurden basierend auf Daten aus früheren Studien ausgewählt [7, 22].

2.3. Messung des Zelltods

Zellen/Well) in schwarzwandigen 96-Well-Platten mit klarem Boden und 48 Stunden lang in RPE-Medien, die 1% FBS und kein Natriumpyruvat enthalten, wachsen gelassen. In Vorversuchen zur Bestimmung der optimalen NAC-Konzentration wurden RPE-Zellen mit NAC (100 bis 1000 μM) für 24 Stunden vor der Analyse der Zelllebensfähigkeit. In nachfolgenden Experimenten wurden RPE-Zellen mit NAC (500 μM) für 2 Stunden und dann unterschiedlichen H .-Konzentrationen ausgesetzt2Ö2 (150, 200 und 250 μM) für 24 Std. Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung des CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA) und des Alamar Blue Cell Viability Reagent (Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen jedes Herstellers bestimmt. Der Fluoreszenzwert für die Kontrollgruppe ohne Behandlung wurde als 100% lebensfähige Zellen angesehen. Der Fluoreszenzwert für Zellen, die mit einem Lysepuffer behandelt wurden, wurde als 0% lebensfähige Zellen angesehen. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Synergy 2-Mikroplatten-Lesegeräts (BioTek, Winooski, VT) bestimmt.

2.4. Messung des ATP-Gehalts

RPE-Zellen wurden in alle weißen 96-Well-Platten ausgesät (Zellen/Well) und 48 Stunden lang in RPE-Medien wachsen gelassen, die 1% FBS und kein Natriumpyruvat enthielten. In Vorversuchen zur Bestimmung der optimalen NAC-Konzentration wurden RPE-Zellen mit NAC (100 bis 1000 μM) für 24 Stunden und der Gehalt an ATP wurde bestimmt. In nachfolgenden Experimenten wurden RPE-Zellen mit NAC (500 μM) für 2 Stunden und dann unterschiedlichen H .-Konzentrationen ausgesetzt2Ö2 (150, 200 und 250 μM) für 24 Std. Die Produktion von zellulärem Adenosintriphosphat (ATP) wurde getestet, indem kein Phenolrot-DMEM verwendet wurde, das 1% FBS enthielt, und gemäß dem Protokoll des Herstellers für das ATPlite-Lumineszenz-ATP-Detektionsassaysystem (PerkinElmer, Waltham, MA). Der ATP-Gehalt wurde aus der Lumineszenz von behandelten Zellen relativ zur Lumineszenz von unbehandelten Kontrollzellen abgeschätzt. Die Werte wurden auf die Anzahl lebensfähiger Zellen normalisiert. Die Lumineszenz wurde mit einem Mikroplatten-Reader (BioTek, Synergy 2) nachgewiesen.

2.5. Glutathion (GSH)-Analyse

RPE-Zellen wurden in alle weißen 96-Well-Platten ausgesät (Zellen/Well) und 48 Stunden lang in RPE-Medien wachsen gelassen, die 1% FBS und kein Natriumpyruvat enthielten. RPE-Zellen wurden mit NAC (500 μM) für 2 Stunden und dann unterschiedlichen H .-Konzentrationen ausgesetzt2Ö2 (150, 200 und 250 μM) für 24 Std. Intrazelluläre GSH-Spiegel wurden in Medien gemessen, die kein Phenolrot-DMEM und 1% FBS enthielten. Das Protokoll folgte den Anweisungen des Herstellers für das GSH-Glo Glutathione Assay-Kit (Promega, Madison, WI). Der GSH-Gehalt wurde aus der Änderung der Lumineszenz relativ zu Kontrollen ohne Behandlung abgeschätzt und dann auf die Anzahl lebensfähiger Zellen normalisiert. Die Lumineszenz wurde auf einem Mikroplatten-Lesegerät (BioTek, Synergy 2) gemessen.

2.6. Messung der ROS-Bildung

Zellen/Well) in schwarzen 96-Well-Platten mit klarem Boden und 48 Stunden lang in RPE-Medium mit 1% FBS, kein Natriumpyruvat wachsen gelassen. Die Bildung von intrazellulärem ROS wurde mit dem 2

, 7 - Dichlorfluoresceindiacetat (DCFDA) zelluläres ROS-Nachweis-Assay-Kit (abcam, Cambridge, MA) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Zellen wurden mit DCFDA (25 μM) für 45 min, einmal mit frischem Medium gewaschen und mit NAC (500 μM) für 1 Stunde. Anschließend wurden die Zellen mit 75 . inkubiert μm T-BHP für 3 Stunden. Der ROS-Gehalt wurde basierend auf der Fluoreszenz der behandelten Zellen relativ zur Fluoreszenz der unbehandelten Zellen berechnet.Die Fluoreszenz wurde auf einem Mikroplatten-Lesegerät (BioTek, Synergy 2) abgelesen.

2.7. RNA-Isolierung und qRT-PCR

Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Micro Kit (QIAGEN) hergestellt. RNA (300 ng) wurde verwendet, um cDNA mit dem SuperScript III First-Strand-Synthesesystem (Thermo Fisher) zu synthetisieren. Zur Bestimmung der cDNA-Konzentration wurde eine alkalische Hydrolyse durchgeführt und das RiboGreen™ Assay Kit (Thermo Fisher) verwendet. Für die alkalische Hydrolyse wird eine Mischung aus 7 μL-cDNA, 2 μL·5 mM EDTA und 1 μL·1 M NaOH wurde 20 min bei 70 °C inkubiert, dann 3 μ1 0,5 M Tris-Cl pH 6,4 wurde dem Gemisch zugesetzt. Der RiboGreen™ Assay wurde unter Verwendung der hydrolysierten Proben durchgeführt, um die cDNA zu quantifizieren. Die Expression von NOX-Genen wurde mittels quantitativer reverser Transkriptions-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung eines Bio-Rad iQ5 Multicolor-Echtzeit-PCR-Detektionssystems bestimmt. Dreifache Vertiefungen von 25 μL-Reaktionen enthielten 1 ng cDNA, 0,2 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 13,5 μL Bio-Rad iQ SYBR Grüner Supermix. Zum quantitativen Nachweis von NOX mRNAs wurden die folgenden Primer verwendet: NOX2, vorwärts 5 - AAGATGCGTGGAAACTACCTAAGAT-3 und rückwärts 5 - TCCCTGCTCCCACTAACATCA-3 p22phox, vorwärts 5 - TACTATGTTCGGGCCGTCCT-3 und rückwärts 5 - CACAGCCGCCAGTAGGTA-3 NOX4, vorwärts 5 - TATCCAGTCCTTCCGTTGGTT-3 und rückwärts 5 - TGAGGTACAGCTGGATGTTGA-3 und NOX5, vorwärts 5 - GCAGGAGAAGATGGGGAGAT-3 und rückwärts 5 - CGGAGTCAAATAGGGCAAAG-3 . Zur Bestimmung der Effizienz wurde jedem Gen eine Standardkurve beigefügt.

Der geometrische Mittelwert der Housekeeping-Gene, 60S acidic ribosomal protein P0 (ARBP) und Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), wurde zur Berechnung verwendet

jedes interessierenden Gens. Um die Faltungsänderung relativ zu No AMD zu bestimmen, wurde von jedem AMD-Spender durch Subtrahieren des Mittelwerts von No AMD-Zellen berechnet. Ein modifiziertes Livak-Verfahren wurde verwendet, um die relative Expression unter Verwendung der Effizienz für jeden Primer zu berechnen.

2.8. Messung von Bioenergetik

Die Analyse der Bioenergetik wurde an lebenden Zellen unter Verwendung eines XFe 96 Extracellular Flux Analyzer (Agilent Tech) durchgeführt. Der Analysator ermöglicht Echtzeitmessungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Acidifizierungsrate (ECAR), die Indikatoren für die mitochondriale Atmung bzw. die Glykolyseaktivität von Zellen sind. Kurz gesagt wurden RPE in 1% Serum enthaltendem RPE-Medium ohne Natriumpyruvat ausplattiert und auf XF96-Zellkultur-Mikroplatten, die mit Cell-Tak (Corning) beschichtet waren, ausgesät (Zellen/Vertiefung). Am folgenden Tag wurden RPE-Zellen mit oder ohne NAC (500 μM) für 2 Stunden und behandelt mit H2Ö2 (500 μM) für 24 Std. Das Protokoll des Zell-Mito-Stress-Tests oder des Glykolyse-Stress-Tests wurde gemäß den Angaben des Herstellers (Agilent Tech) und unserer vorherigen Analyse durchgeführt [7].

2.9. Statistische Analyse

Vor der statistischen Analyse wurde der Grubb-Test für jeden Datensatz durchgeführt, um den größten Einzelausreißer zu entfernen. Alle Behandlungsdaten wurden für jeden Spender auf keine Behandlungsbedingung normalisiert (fache Änderung relativ zu keiner Behandlung). Eine statistische Analyse wurde an log-transformierten Faltungsänderungswerten durchgeführt. Eine Probe

- Tests mit einem hypothetischen Wert von Null wurden verwendet, um die NAC-Behandlung oder die Peroxidbehandlung allein mit den Kontrolldaten ohne Behandlung zu vergleichen. Ungepaart – Tests wurden verwendet, um die Peroxidbehandlung mit den Daten der NAC+Peroxidbehandlung zu vergleichen. Ungepaart – Tests wurden auch verwendet, um das Ansprechen auf die NAC-Behandlung bei Zellen ohne AMD mit AMD-Zellen zu vergleichen. Die Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleich von Sidak wurde verwendet, um die Auswirkungen des Krankheitszustands (keine AMD vs. AMD) und der Wasserstoffperoxidkonzentrationen auf die Daten in den Abbildungen 2(c), 3(d) und 4(d) zu vergleichen. Ungepaart – Tests der Werte wurden verwendet, um die NOX-Genexpressionsniveaus zwischen Zellen ohne AMD und AMD in 1(f) zu vergleichen. Eine Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc wurde verwendet, um die Werte zwischen den NOX-Genen in Abbildung 1 (g) zu vergleichen. Die Daten wurden unter Verwendung von Statistiksoftware in GraphPad Prism 7 (GraphPad, La Jolla, CA) analysiert.

galt als statistisch signifikant. Alle Ergebnisse werden als

3. Ergebnisse

3.1. Hintergrund

Klinische Informationen und Demographie der in dieser Studie verwendeten Spender sind in Tabelle 1 aufgeführt. RPE-Kulturen wurden von Spendern ohne AMD (keine AMD, 49-77 Jahre) und Spendern mit AMD (AMD, 49-89 Jahre) erhalten. Das Durchschnittsalter von Spendern mit AMD (

) war 10 % älter als die von Spendern ohne AMD (

) ( ), was mit der hohen Prävalenz dieser Krankheit bei Personen über 65 Jahren übereinstimmt [1]. Die durchschnittliche Zeit vom Tod bis zur RPE-Zellernte war bei Spendern ohne AMD (Stunden) und AMD (Stunden) nicht unterschiedlich ( ).

RPE von mehreren Spendern ohne AMD ( ) wurden verwendet, um die optimale NAC-Konzentration zu bestimmen. In Vorversuchen wurde ein Konzentrationsbereich (100 bis 1000 μM) wurde verwendet, um die Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen und ATP zu bestimmen. Die Daten wurden auf keine Behandlungskontrollen normalisiert. Unter Verwendung von zwei verschiedenen Zelllebensfähigkeitsassays gab es bei allen Konzentrationen von NAC keine Änderung des Zellüberlebens. Es gab jedoch eine

20% Erhöhung des ATP-Gehalts bei 500 μM (Ergänzende Abbildung 1). Bei der höchsten Dosis von NAC (1000 μM) verringerte sich der ATP-Gehalt um 30% ( ), was bedeutet, dass diese Dosis außerhalb des optimalen Bereichs für unser experimentelles System lag. Basierend auf diesen experimentellen Ergebnissen, 500 μFür nachfolgende Experimente wurde M NAC gewählt. Diese Dosis stimmt auch mit einer früheren Studie überein, die berichtet, dass 500 μM NAC wurde im Serum von Patienten nach intravenöser Injektion von NAC gefunden [23].

3.2. NAC dämpft den intrazellulären ROS-Spiegel

Um die antioxidative Wirkung von NAC auf RPE-Zellen zu untersuchen, wurden intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vor und nach Exposition gegenüber . gemessen T-BHP. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit NAC (500 μM) allein hatte keinen Einfluss auf die ROS-Spiegel in Zellen ohne AMD (Abbildung 1(a)), verursachte jedoch eine signifikante Abnahme des basalen ROS-Gehalts (25 %) in AMD ( )-Zellen im Vergleich zu Kontrollen ohne Behandlung (Abbildung 1(b)) . Der ROS-Gehalt unterschied sich jedoch bei der NAC-Behandlung nicht signifikant, wenn Zellen von Spendern mit und ohne AMD verglichen wurden (Abbildung 1(c)). Während der Exposition gegenüber T-BHP erhöhte die ROS-Menge in beiden Gruppen signifikant (für keine AMD und AMD, Abbildungen 1(a) und 1(b)), die Zunahme war signifikant stärker ( ) in Zellen ohne AMD (155%) im Vergleich zu AMD (118 .). %) Zellen (Abbildung 1(d)). Vorbehandlung mit NAC vor T-BHP-Exposition reduzierte die ROS-Spiegel sowohl in Zellen ohne AMD ( ) als auch in AMD ( ) signifikant (Abbildungen 1(a) und 1(b)). ROS wurde in beiden Gruppen von Zellen in ähnlichem Ausmaß reduziert (Abbildung 1(e)). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass NAC die ROS-Produktion in RPE unter Bedingungen der zellulären Oxidation unterdrücken kann.

) Zellen wurde relativ zu Kontrollen ohne Behandlung (gepunktete Linie) berechnet. (c) ROS-Gehalt nach NAC-Behandlung wurde zwischen Zellen ohne AMD und AMD verglichen. (d) Prozentualer Anstieg (T-BHP – keine Behandlung) von ROS in T-BHP-behandelte Zellen und (e) prozentuale Reduktion (T-BHP—NAC+T-BHP) von ROS in NAC-vorbehandelten Zellen wurden zwischen Spendern ohne AMD und AMD verglichen. NA: Keine AMD A: AMD. (f) mRNA-Expression von Genen der NOX-Familie bei No AMD (

) Zellen wurde durch Real-Time-PCR gemessen. Die Ergebnisse sind die fache Änderung der Expression relativ zum Durchschnitt für Proben ohne AMD (gestrichelte Linie). (g) Expression von Genen der NOX-Familie relativ zu Housekeeping-Genen (dCt). Eine Probe

- Tests wurden verwendet, um die NAC-Behandlung zu vergleichen oder T-BHP allein bis keine Behandlung in den Gruppen Keine AMD und AMD (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden zum Vergleich verwendet T-BHP-Behandlung zu NAC + T-BHP-Behandlung in (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um das Ansprechen von Keine AMD und AMD in (c–e) zu vergleichen. Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um die basale Expression von NOX-Genen in (f) zu vergleichen. Eine Einweg-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey wurde verwendet, um die dCt-Werte der NOX-Gene in (g) zu vergleichen. Die Daten sind der Mittelwert (±SEM). † bezeichnet die Signifikanz aus der Kontrolle ohne Behandlung und

bezeichnet Signifikanz zwischen Bedingungen.

waren statistisch signifikant. ǂ bezeichnet die Signifikanz bei der relativen Expression von NOX-Genen zwischen No AMD- und AMD-Gruppen. ∧ und ∨ bezeichnen die Signifikanz zwischen den dCt-Werten der NOX-Gene innerhalb der Gruppen ohne AMD oder AMD.

3.3. Erhöhte Expression von Genen der NOX-Familie in AMD-Zellen

Es gibt Hinweise darauf, dass NOX eine wichtige Rolle bei der ROS-Erzeugung und den Redox-Signalwegen bei RPE spielt [24]. Die Expression der Gene der NOX-Familie, NOX2, p22phox, NOX4 und NOX5, wurde unter basalen Bedingungen in Zellen von Spendern mit oder ohne AMD gemessen. Beim Vergleich der Expression in AMD-Zellen mit der in Zellen ohne AMD war p22phox signifikant höher ( ) ( 1(f)). NOX2, NOX4 und NOX5 waren in AMD-Zellen durchweg höher, jedoch erreichte der Unterschied keine statistische Signifikanz. Unter Verwendung von dCt zum Vergleich der mRNA-Spiegel (niedrigeres dCt zeigt eine höhere Expression an) fanden wir, dass die Expression von NOX4 und p22phox signifikant häufiger war als die von NOX2 und NOX5 in RPE sowohl von Nicht-AMD- als auch von AMD-Spendern (Abbildung 1 (g)). Diese Ergebnisse legen nahe, dass NOX zu den ROS-Spiegeln in RPE-Zellen beitragen kann, insbesondere bei RPE von Spendern mit AMD.

3.4. NAC verhindert durch oxidativen Stress induzierte Zytotoxizität

Um zu bestimmen, ob NAC vor oxidationsinduziertem Zelltod schützen könnte, wurden RPE steigenden Mengen an H . ausgesetzt2Ö2. Bei RPE von Spendern mit und ohne AMD, H2Ö2 verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen in einer dosisabhängigen Weise ( 2(a), 2(b), ). Bei allen drei Konzentrationen von H2Ö2, Vorbehandlung mit NAC schützte signifikant vor Zelltod bei RPE von beiden Keine AMD (bei 150 μM und 250 μM, Abbildung 2(a)) und AMD (bei 150 μM, bei 200 μM und bei 250 μM, Abbildung 2(b)) Donatoren. Bemerkenswert ist, dass es eine dosisabhängige Erhöhung des NAC-Schutzes der Zelllebensfähigkeit gab und die Gesamtwirkung für Zellen ohne AMD signifikant besser war, insbesondere bei 250 μM H2Ö2 ( , Abbildung 2(c)). Dieser höhere Schutzeffekt von NAC ist jedoch auf die verminderte Lebensfähigkeit von Zellen von Spendern ohne AMD nach H . zurückzuführen2Ö2 Behandlung im Vergleich zu AMD-Zellen, bei denen ein bescheidenerer Zelltod beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass NAC in der Lage ist, RPE-Zellen zu schützen, wenn sie oxidativem Stress ausgesetzt sind, der sonst zu 25 bis 80 % Zelltod führen würde.

) Zellen wurde relativ zu der Kontrolle ohne Behandlung berechnet. (c) NAC-Schutz wurde berechnet als NAC+H2Ö2 relativ zu H2Ö2 allein. Eine Probe

- Tests wurden verwendet, um H . zu vergleichen2Ö2 Behandlung bis keine Behandlung in den Gruppen Keine AMD und AMD (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um Peroxid- mit NAC+Peroxid-Behandlungen in (a, b) zu vergleichen. Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-hoc wurde verwendet, um die Wirkung des Krankheitszustands (keine AMD vs. AMD) und H . zu vergleichen2Ö2 Konzentration in (c). Per: Peroxidwirkung Dis: Krankheitswirkung DxP: Wechselwirkung zwischen Krankheitswirkung und Peroxidwirkung. Die Daten sind der Mittelwert (±SEM). † bezeichnet die Signifikanz aus der Kontrolle ohne Behandlung und

bezeichnet Signifikanz zwischen Bedingungen.

waren statistisch signifikant.

3.5. NAC schützt vor GSH-Erschöpfung

NAC kann entweder über sein reaktives Sulfhydryl als direktes Antioxidans oder als Vorläufer für die Synthese von GSH dienen. Um mechanistische Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie NAC vor ROS-induziertem Zelltod schützt, haben wir untersucht, ob NAC den Thiolgehalt in unseren RPE-Zellen bewahrt. Der intrazelluläre GSH-Spiegel wurde nach der Behandlung mit NAC vor und nach H .-Exposition gemessen2Ö2. Die Behandlung mit NAC allein verursachte einen 10 %igen Anstieg des GSH-Gehalts bei keiner AMD ( , Abbildung 3(a)) und einen signifikanten 20 %igen Anstieg des GSH-Gehalts bei AMD ( , Abbildung 3(b))-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Das Ausmaß der GSH-Wiederauffüllung durch NAC unterschied sich jedoch nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen (Abbildung 3(c)). Bei Exposition gegenüber steigenden H .-Spiegeln2Ö2, GSH-Gehalt änderte sich in Zellen von Spendern ohne AMD nicht (Abbildung 3(a)). Im Gegensatz dazu gab es eine signifikante dosisabhängige Abnahme des GSH-Gehalts (25% bis 40%) durch H2Ö2 in AMD-Zellen (Abbildung 3(b)). Die Vorbehandlung mit NAC verhinderte eine GSH-Verarmung in RPE sowohl bei Spendern ohne AMD (Abbildung 3(a)) als auch bei AMD (Abbildung 3(b)) bei allen H .-Konzentrationen2Ö2. Die schützende Wirkung von NAC auf GSH war bei RPE von AMD-Spendern im Vergleich zu RPE von Nicht-AMD-Spendern signifikant größer ( , Abbildung 3(d)). Diese Ergebnisse zeigen die schützende Wirkung von NAC bei der Verhinderung des Abbaus von GSH in RPE-Zellen, die mit H . behandelt wurden2Ö2.

)-Zellen wurden relativ zu der Kontrolle ohne Behandlung (gestrichelte Linie) berechnet. (c) GSH-Gehalt nach NAC-Behandlung wurde zwischen Zellen ohne AMD (NA) und AMD (A)-Zellen verglichen. (d) NAC-Schutz wurde berechnet als NAC+H2Ö2 relativ zu H2Ö2 allein. Eine Probe

- Tests wurden verwendet, um NAC-Behandlung oder H . zu vergleichen2Ö2 allein bis zu keiner Behandlung in den Gruppen Keine AMD und AMD (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um H . zu vergleichen2Ö2 zu NAC+H2Ö2 Behandlungen in (a, b). Ein ungepaarter

- Der Test wurde verwendet, um den GSH-Gehalt in NAC-behandelten Zellen ohne AMD mit NAC-behandelten AMD-Zellen in (c) zu vergleichen. Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-hoc wurde verwendet, um die Wirkung des Krankheitszustands (keine AMD vs. AMD) und H . zu vergleichen2Ö2 Konzentration in (d). Per: Peroxidwirkung Dis: Krankheitswirkung DxP: Wechselwirkung zwischen Krankheitswirkung und Peroxidwirkung. Die Daten sind der Mittelwert (±SEM). † bezeichnet die Signifikanz aus der Kontrolle ohne Behandlung und

bezeichnet Signifikanz zwischen Bedingungen.

waren statistisch signifikant.

3.6. NAC verhindert ATP-Erschöpfung

Eine frühere Arbeit hat gezeigt, dass die NAC-Vorbehandlung RPE vor mitochondrialer Dysfunktion und ATP-Reduktion schützt, nachdem sie den oxidierenden Bedingungen hoher Glukose ausgesetzt war [25]. Um festzustellen, ob NAC einen Einfluss auf die Zellbioenergetik hat, haben wir den ATP-Gehalt vor und nach H . gemessen2Ö2 Behandlung. Die Behandlung mit NAC allein veränderte den ATP-Gehalt in Zellen von Spendern ohne AMD (Fig. 4(a)) oder AMD (Fig. 4(b)) nicht signifikant und unterschied sich nicht zwischen den Gruppen (Fig. 4(c)). In RPE von No AMD-Spendern, H2Ö2 und NAC hatte keine Wirkung auf ATP (Abbildung 4(a)). Die Wirkung von H2Ö2 war bei AMD-Spendern dramatischer Der ATP-Gehalt sank um 23 % und 30 % bei 200 μM ( ) und 250 μM ( ) bzw. (Abbildung 4(b)). NAC vollständig verhindert H2Ö2-induzierte ATP-Erschöpfung bei 200 μM ( ) und 250 μM ( , Abbildung 4(b)). Das Ausmaß des NAC-Schutzes bei ATP-Verarmung war sowohl bei Zellen ohne AMD als auch bei AMD ähnlich ( , Abbildung 4(d)). Diese Ergebnisse zeigen, dass NAC in der Lage ist, vor einer durch H . verursachten ATP-Verarmung zu schützen2Ö2 Behandlung in RPE-Zellen.

) Zellen wurde relativ zu der Kontrolle ohne Behandlung berechnet. (c) Der ATP-Gehalt nach NAC-Behandlung wurde zwischen Zellen ohne AMD (NA) und AMD (A) verglichen. (d) NAC-Rettung wurde berechnet als NAC+H2Ö2 relativ zu H2Ö2 allein. Eine Probe

- Tests wurden verwendet, um NAC-Behandlung oder H . zu vergleichen2Ö2 allein bis zu keiner Behandlung in den Gruppen Keine AMD und AMD (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um H . zu vergleichen2Ö2 zu NAC+H2Ö2 Behandlungen in (a, b). Ein ungepaarter

- Test wurde verwendet, um den ATP-Gehalt in NAC-behandelten Zellen ohne AMD mit NAC-behandelten AMD-Zellen in (c) zu vergleichen. Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-hoc wurde verwendet, um die Wirkung des Krankheitszustands (keine AMD vs. AMD) und H . zu vergleichen2Ö2 Konzentration in (d). Per: Peroxidwirkung Dis: Krankheitswirkung DxP: Wechselwirkung zwischen Krankheitswirkung und Peroxidwirkung. Die Daten sind der Mittelwert (±SEM). † bezeichnet die Signifikanz aus der Kontrolle ohne Behandlung und

bezeichnet Signifikanz zwischen Bedingungen.

war statistisch signifikant.

3.7. NAC schützt vor mitochondrialer Dysfunktion, aber nicht vor Glykolyse

Um eine umfassendere Bewertung der Quelle des verbesserten ATP-Gehalts bereitzustellen, untersuchten wir mit einem extrazellulären Flussanalysator sowohl die Glykolyse als auch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung, zwei Energiewege, die ATP produzieren. Bei der Messung der glykolytischen Funktion hatte die Behandlung mit NAC allein keinen Einfluss auf die glykolytische Kapazität oder glykolytische Reserve sowohl bei Zellen ohne AMD (Abbildung 5(a)) als auch bei AMD (Abbildung 5(b)) und es gab keinen Unterschied in ihrer Reaktion auf NAC ( Abbildung 5(c)). Weiterhin ist in Zellen ohne AMD H2Ö2 deutlich verminderte glykolytische Kapazität (

20%, ) und glykolytische Reserve (

20%, ) im Vergleich zu Kontrollen ohne Behandlung (Fig. 5(a)). Allerdings, H2Ö2 verringerte die glykolytische Kapazität oder Reserve in AMD-Zellen nicht signifikant (Fig. 5(b)). Die Vorbehandlung mit NAC vor der Oxidation verbesserte die glykolytische Kapazität oder die glykolytische Reserve in keiner der Gruppen (Abbildungen 5(a), 5(b) und 5(d)). Diese Ergebnisse legen nahe, dass keine AMD RPE empfindlicher auf H . reagieren2Ö2-induzierte Verringerung der Glykolyse und dass NAC weder die basale Glykolyse noch den Schutz vor H . beeinflusste2Ö2-induzierte glykolytische Inaktivierung.

) Zellen wurden für jeden Spender auf keine Behandlung normalisiert. Die glykolytische Kapazität (GC) und die glykolytische Reserve (GR) wurden für (a) keine AMD- und (b) AMD-Zellen berechnet. (c) Die relative ECAR nach NAC-Behandlung wurde zwischen Zellen ohne AMD (NA) und AMD (A) verglichen. (d) NAC-Schutz wurde berechnet als NAC+H2Ö2 (NAC+ox) relativ zu H2Ö2 (Ochse) allein. Alle Daten sind Mittelwerte (±SEM). Eine Probe

- Tests wurden verwendet, um NAC-Behandlung oder H . zu vergleichen2Ö2 allein bis zu keiner Behandlung in den Gruppen Keine AMD und AMD (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um H . zu vergleichen2Ö2 Behandlung zu NAC+H2Ö2 Behandlung in (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um das Ansprechen von Keine AMD mit AMD in (c, d) zu vergleichen. Die Daten sind der Mittelwert (±SEM). † bezeichnet die Signifikanz von keiner Behandlungskontrolle. Ich

galt als statistisch signifikant.

Um zu untersuchen, ob NAC den ATP-Gehalt nach H . bewahrt2Ö2 Die Exposition war auf den Schutz der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung zurückzuführen, die OCR wurde mit dem Cell Mito Stress Test gemessen. Spuren der durchschnittlichen OCR (normalisiert auf den Ausgangswert) sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Im Vergleich zu keiner Behandlung zeigten NAC-behandelte Zellen einen signifikanten Anstieg der maximalen Atmung (16 %) und der freien Atemkapazität (25 %) bei keiner AMD ( , Abbildung 6(a)) und AMD ( , Abbildung 6(b)) Zellen. Diese Verbesserung der mitochondrialen Funktion war zwischen den Gruppen nicht unterschiedlich (Abbildung 6(c)). Exposition gegenüber H2Ö2 signifikant verringerte maximale Atmung (20 %) und freie Atemkapazität (30 %) bei Zellen ohne AMD und signifikant reduzierte maximale Atmung (20 %) und freie Atemkapazität (25 %) bei AMD-Zellen im Vergleich zu Kontrollen ohne Behandlung (Abbildungen 6(a .) ) und 6(b)). Die NAC-Vorbehandlung hatte keine Wirkung auf Zellen von Spendern ohne AMD (Abbildung 6(a)), verbesserte jedoch signifikant die maximale Atmung ( ) und die freie Atemkapazität ( ) bei AMD-Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit H . behandelt wurden2Ö2 allein (Abbildung 6(b)). Der Schutz der maximalen Atmung oder der freien Atemkapazität durch NAC war zwischen den Gruppen nicht unterschiedlich (Abbildung 6(d)). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Fähigkeit von NAC, die mitochondriale oxidative Phosphorylierung aufrechtzuerhalten, die Erhaltung des ATP-Gehalts unter Bedingungen der zellulären Oxidation teilweise erklären kann.

) Zellen wurden für jeden Spender auf keine Behandlung normalisiert. Maximale Atmung (MR) und freie Atemkapazität (SRC) wurden für (a) keine AMD und (b) AMD-Zellen berechnet. (c) Die relative OCR nach NAC-Behandlung wurde zwischen Zellen ohne AMD (NA) und AMD (A) verglichen. (d) NAC-Schutz wurde berechnet als NAC+H2Ö2 (NAC+ox) relativ zu H2Ö2 (Ochse) allein. Eine Probe

- Tests wurden verwendet, um NAC-Behandlung oder H . zu vergleichen2Ö2 allein bis keine Behandlung (auf 1 gesetzt) ​​in den Gruppen Keine AMD und AMD (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um H . zu vergleichen2Ö2 Behandlung zu NAC+H2Ö2 Behandlung in (a, b). Nicht gekoppelt

- Tests wurden verwendet, um das Ansprechen von Keine AMD mit AMD in (c, d) zu vergleichen. Die Daten sind der Mittelwert (±SEM). † bezeichnet die Signifikanz aus der Kontrolle ohne Behandlung und

bezeichnet Signifikanz zwischen Bedingungen.

waren statistisch signifikant.

4. Diskussion

In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen der NAC-Behandlung auf Primärkulturen von altersangepasstem humanem RPE von Spendern, die auf das Vorliegen (AMD) oder Fehlen (Keine AMD) von AMD bewertet wurden. Wir haben gezeigt, dass NAC vor oxidativem Stress schützt, indem es eine übermäßige ROS-Akkumulation blockiert (Abbildung 1) und sowohl H2Ö2-induzierter Zelltod (Abbildung 2) und GSH-Verarmung (Abbildung 3) bei RPE von Spendern ohne AMD und AMD. NAC verbesserte auch die basale mitochondriale Funktion (Abbildung 6) in beiden Zellgruppen. Mehrere für AMD RPE spezifische vorteilhafte Wirkungen wurden beobachtet, darunter eine Verringerung des basalen ROS (Abbildung 1), eine Erhöhung des basalen GSH-Gehalts und ein größerer NAC-Schutz nach der Oxidation (Abbildung 3). Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung von NAC auf den Schutz von RPE vor einem oxidativen Angriff. Darüber hinaus unterstützen die positiven Ergebnisse, die für RPE von AMD-Spendern beobachtet wurden, die Relevanz und den potenziellen therapeutischen Wert von NAC bei der Behandlung von AMD.

Primärkulturen von RPE von AMD-Spendern waren ein wertvolles Modellsystem zur Untersuchung des Krankheitsmechanismus [7] und zum Testen der Arzneimittelwirksamkeit. Eine Einschränkung unseres Modellsystems besteht darin, dass Zellen in Kultur die Netzhautumgebung nicht vollständig replizieren. Darüber hinaus war aufgrund der Art der Beschaffung von Spendergewebe die Verteilung von Männern und Frauen in jedem Assay nicht immer ausgewogen, was unsere Ergebnisse beeinflusst haben könnte. Andererseits ist eine der größten Stärken dieser Studie die große Zahl der getesteten Einzelspender. Veröffentlichungen, die weit weniger Einzelspender verwenden, könnten ihre Ergebnisse möglicherweise verzerren. Obwohl es Vorbehalte gibt, bietet dieses Modellsystem eine einzigartige Gelegenheit, Aspekte der Krankheit zu replizieren, die für die Entwicklung von Therapien zur Behandlung von AMD unerlässlich sind.

Der oxidationsinduzierte RPE-Zelltod wurde zuvor als kritisches pathologisches Ereignis bei AMD vorgeschlagen [5, 26]. Mehrere einzigartige Umstände setzen RPE im Vergleich zu den meisten anderen Zelltypen einem höheren Risiko für oxidative Schäden aus. RPE grenzen an die Choriocapillaris, die Hauptsauerstoffquelle für die äußere Netzhaut, an und bringen sie in eine stark oxidative Umgebung [26]. Zur oxidierenden Umgebung innerhalb des RPE tragen auch die ROS bei, die als Produkt der Reaktion von Licht mit reichlich vorhandenen Photosensibilisatoren, wie Lipofuscin und Melanin, erzeugt werden. Die tägliche Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente, die leicht oxidierbare mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthalten, erzeugt auch ROS innerhalb des RPE. Daher ist es wichtig, dass RPE über mehrere Systeme zum Schutz vor ROS-induzierten Schäden verfügt. Wenn die oxidative Schädigung eine kritische Schwelle erreicht, kommt es zum RPE-Zelltod [27–29]. Der bei AMD auftretende RPE-Zelltod unterstützt die Vorstellung, dass Therapien zur Reduzierung von ROS eine praktikable Option zur Behandlung von AMD sein könnten.

Mitochondrien sind eine Hauptquelle für ROS, nicht nur in RPE, sondern auch in allen eukaryontischen Zellen. Diese ROS entstehen als Nebenprodukt der Sauerstoffreduktion während der oxidativen Phosphorylierung [30]. Mitochondriale ROS werden durch in Mitochondrien lokalisierte Antioxidantien wie MnSOD und GPX in Schach gehalten. Unter pathologischen Bedingungen kann jedoch eine Überproduktion von ROS auftreten, die zu Schäden an mitochondrialen Lipiden, Proteinen und mitochondrialer DNA (mtDNA) führt, was letztendlich zu einem Verlust der mitochondrialen Funktion führt. Starke experimentelle Beweise unterstützen die Idee, dass mitochondriale Schäden eines der Schlüsselereignisse sind, die die AMD-Pathologie vorantreiben [8]. Mehrere Studien berichteten von erhöhten mtDNA-Schäden und reduzierter mitochondrialer Funktion bei RPE von menschlichen Spendern mit AMD [6, 7, 20, 22, 31]. In der aktuellen Studie beobachteten wir, dass NAC einen positiven Einfluss auf die basale mitochondriale Funktion für RPE von Spendern mit und ohne AMD hatte (Abbildung 6). NAC war auch in der Lage, die mitochondriale Funktion während eines oxidativen Insults bei AMD RPE aufrechtzuerhalten (Abbildung 6). Diese Ergebnisse unterstützen den therapeutischen Wert von NAC angesichts der Bedeutung der Aufrechterhaltung der mitochondrialen RPE-Funktion für die allgemeine Gesundheit der Netzhaut.

ROS kann auch von mehreren Enzymsystemen produziert werden, darunter Xanthinoxidase, ungekoppelte Stickoxidsynthase und NADPH-Oxidasen [32]. NADPH-Oxidase (NOX) ist die bekannteste nichtmitochondriale Quelle von ROS [33]. Nach unserem besten Wissen war unsere Studie die erste, die die NOX-Expression zwischen RPE-Zellen von Nicht-AMD- und AMD-Spendern verglich. Wir fanden die Expression von NOX2, NOX4 und p22phox in menschlichen primären RPE-Zellen, im Einklang mit Ergebnissen aus anderen Studien mit ARPE-19-Zellen [24, 33–35]. p22phox ist eine Untereinheit, die zur Aktivierung und Regulierung von NOX2 und NOX4 benötigt wird [36]. Einzigartig fanden wir auch, dass NOX5 in menschlichen primären RPE-Zellen exprimiert wird, wenn auch in geringer Häufigkeit. Wir fanden eine insgesamt erhöhte Expression von Genen der NOX-Familie in RPE von AMD-Spendern, jedoch erreichte nur die Expression von p22phox statistische Signifikanz. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NOX eine größere Rolle bei der Redox-Signalgebung bei RPE mit AMD spielen könnte. Während ein Übermaß an ROS schädlich sein kann, ist ROS notwendig, um eine Schutzreaktion zu erzeugen, beispielsweise durch die Nrf2-Aktivierung [26]. Daher kann die Hochregulierung von Mitgliedern der NOX-Familie eine schützende Reaktion auf die erkrankte Umgebung der Netzhaut sein.

Unter physiologischen Bedingungen eliminieren endogene antioxidative Enzyme und GSH ROS schnell. Oxidativer Stress tritt auf, wenn ein Ungleichgewicht zwischen dem oxidativen und antioxidativen System besteht, was eine Ansammlung von übermäßigem ROS ermöglicht [37]. Oxidativer Stress kann sich zu Zellschäden entwickeln, wenn überproportionale ROS-Spiegel die endogenen Aasfresser überwältigen, was unter pathophysiologischen Bedingungen auftritt [37]. Zellen verteidigen gegen ROS, indem sie die Expression zahlreicher antioxidativer Enzyme wie Superoxiddismutase (SOD), Katalase und Glutathionperoxidase (GPX) induzieren [38, 39]. Bemerkenswert ist, dass unser Labor festgestellt hat, dass RPE-Gewebe von AMD-Spendern eine erhebliche Hochregulierung von MnSOD und Katalase im Vergleich zu RPE von Spendern ohne AMD aufweist [13]. Darüber hinaus fanden wir eine erhöhte GPX-Expression nach oxidativem Insult in kultivierten RPE von Spendern mit AMD, aber nicht in altersangepassten Kontroll-RPE [7]. Diese kultivierten AMD RPE waren auch resistenter gegen Oxidation, was darauf hindeutet, dass die oxidative Umgebung der erkrankten Netzhaut in vivo stimuliert das RPE zu einer kompensatorischen Reaktion, um oxidative Schäden zu minimieren. Ein möglicher Mechanismus könnte die Verwendung von GSH sein, einem sehr häufig vorkommenden Tripeptid (bestehend aus Glycin, Cystein und Glutaminsäure), das für die Kontrolle des zellulären Redoxstatus verantwortlich ist [40]. In der aktuellen Studie haben wir beobachtet, dass die NAC-Behandlung den basalen ROS signifikant reduziert und den basalen GSH bei AMD RPE erhöht (Abbildungen 1 und 3). Ein akuter H .-Bolus2Ö2 depletiert GSH in den Zellen, die von AMD-Spendern stammten, stärker ab (Abbildung 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei AMD RPE eine stärker oxidative zelluläre Umgebung vorhanden ist. Darüber hinaus kann der Schutz durch GSH einer der wichtigen Wege sein, die von erkranktem RPE genutzt werden, um den Redoxstatus aufrechtzuerhalten und vor oxidativen Schäden zu schützen.

Antioxidantien bieten einen vielversprechenden Weg, um eine übermäßige ROS-Akkumulation im Zusammenhang mit trockener AMD zu lindern [41]. Antioxidantien, auch „Fänger freier Radikale“ genannt, spielen eine schützende Rolle bei sauerstoffbedingten Stressverletzungen. Eine prospektive Kohortenstudie zeigte, dass ein niedriger Gehalt an Antioxidantien und Zink in der Nahrung ein Risikofaktor für die Entwicklung von AMD sein könnte [42]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Antioxidantien wie Neuroligin-3, Eupatilin, 3H-1,2-Dithiol-3-thion und Escin verhinderten oder verringerten oxidativen Stress in ARPE-19, einer immortalisierten RPE-Zelllinie [43–46], was ein Grund für die weitere Suche nach wirksamen antioxidativen Therapeutika ist.

Das in dieser Studie verwendete Antioxidans NAC wurde umfassend als Therapie für eine Vielzahl von Augenerkrankungen untersucht. Unsere Studie ist jedoch die erste, die die Wirksamkeit von NAC in primären RPE-Zellen von Spendern mit oder ohne AMD untersucht. In vitro erhöhte NAC die Lebensfähigkeit der Zellen in ARPE-19-Zellen nach oxidativem Stress [47] und förderte die DNA-Synthese in primären RPE-Zellen, die T-BHP [48]. In einem Mausmodell der photoinduzierten Netzhautdegeneration unterdrückten intraperitoneale Injektionen von NAC oxidativen und ER-Stress, während sie gleichzeitig die ROS-Akkumulation in der Balb/c-Maus-Retina hemmten [15]. In einer Studie zum Trockenen Auge an Mäusen verringerte die Verabreichung von NAC durch Augentropfen die ROS-Spiegel und die Inflammasom-Signalgebung [16]. Diese Studien stimmen mit unseren Ergebnissen überein, die zeigen, dass die NAC-Behandlung die ROS reduziert (Abbildung 1) und die Lebensfähigkeit der Zellen (Abbildung 2) durch die Anwendung eines Oxidationsmittels verbessert.

NAC hat viele Eigenschaften, die es zu einem attraktiven Medikament für AMD-Patienten machen. NAC ist sowohl als von der FDA zugelassenes verschreibungspflichtiges Medikament als auch als rezeptfreies Nahrungsergänzungsmittel im Handel erhältlich, wodurch die Verwendung in der Klinik erleichtert wird. Es hat auch eine lange Geschichte des erfolgreichen Einsatzes bei mehreren Bedingungen, bei denen erhöhte ROS eine Pathologie induzieren. Derzeit ist NAC zur oralen und intravenösen Verabreichung zur Behandlung einer Paracetamol-Überdosierung zugelassen [49–51]. In klinischen Studien wurde NAC als Nahrungsergänzungsmittel zur Behandlung psychiatrischer Erkrankungen verabreicht [52]. In einer randomisierten Studie mit zwanzig Patienten war die topische Gabe von NAC wirksam bei der Behandlung der Meibom-Drüsen-Dysfunktion, einer chronischen Erkrankung der Augenlider [18]. NAC hat die Netzhaut wirksam vor oxidativen Schäden geschützt, wenn es topisch auf das Auge aufgetragen wird, wie bei rd10+/+-Mäusen, einem Modell der Retinitis pigmentosa, gezeigt wurde [17]. Diese Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf die AMD, da sie zeigen, dass NAC bei Anwendung auf die Hornhaut in das hintere Segment eindringen und die Netzhaut schützen konnte.

Als Medikament ist NAC ein ideales Xenobiotikum, da es aufgrund seines eigenen Stoffwechsels direkt in endogene biochemische Prozesse eintreten kann [53]. NAC kontrolliert den Redoxzustand in den Zellen, indem es freie Radikale direkt durch seine Fängeraktivität reduziert, und es reduziert oxidierte Proteine ​​durch seine Thiol-Disulfid-Austauschaktivität [54, 55]. Indirekt reguliert NAC den Redoxzustand durch Umwandlung in Cystein, die Vorstufe von GSH, einem wichtigen Bestandteil des antioxidativen Abwehrsystems [49]. Der Abbau von GSH ist ein kritisches Signal, das die Aktivierung von Zelltodwegen reguliert und einer der Marker für oxidativen Stress ist [56]. GSH ist ein potenter ROS-Fänger, aber seine Spiegel nehmen mit zunehmendem Alter und AMD ab [57–59], was den in dieser Studie berichteten Vorteil einer signifikanten GSH-Wiederauffüllung mit NAC-Behandlung unterstreicht (Abbildung 3).

5. Schlussfolgerungen

Zusammenfassend war unsere Studie die erste, die die Wirkung von NAC auf altersangepasste primäre humane RPE-Zellen untersuchte, die auf das Vorliegen oder Fehlen von AMD bewertet wurden. Durch seine antioxidativen Eigenschaften schützte NAC RPE-Zellen vor oxidativen Schäden, indem es ROS-Ansammlung, GSH- und ATP-Erschöpfung, Zelltod und mitochondriale Dysfunktion verhinderte. Unsere Ergebnisse unterstützen die weitere Bewertung des pharmakologischen Werts von NAC oder anderen thiolhaltigen Verbindungen bei der Verhinderung oder Verzögerung des Fortschreitens des Sehverlusts bei AMD-Patienten.

Abkürzungen

AMD:Altersbedingte Makuladegeneration
ATP:Adenosintriphosphat
GSH:Glutathion
h2Ö2:Wasserstoffperoxid
mtDNA:Mitochondriale DNA
NAK:N-Acetyl-L-Cystein
NOX:Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Oxidase
ROS:Reaktive Sauerstoffspezies
RPE:Pigmentepithel der Netzhaut
T-PS:tert-Butylhydroperoxid.

Datenverfügbarkeit

Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind in diesem Manuskript enthalten.

Offenlegung

Keiner der Fördergeber war am Studiendesign, an der Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten, am Verfassen des Manuskripts oder an der Entscheidung, das Manuskript zur Veröffentlichung einzureichen, beteiligt.

Interessenskonflikte

Alle Autoren erklären, dass mit diesem Manuskript kein Interessenkonflikt verbunden ist.

Danksagung

Die Autoren möchten den Beitrag der Mitarbeiter von Lions Gift of Sight (St. Paul, MN) für ihre Hilfe bei der Beschaffung der Augen sowie Kathy Goode und Sung Lee für das Fotografieren und Bearbeiten von Augengewebe anerkennen. Die Autoren danken auch den Spendern und ihren Familien für ihre wesentlichen Beiträge zur Forschung. Diese Arbeit wurde teilweise von der Foundation Fighting Blindness (Fördernummer TA-NMT-0613-0620-UMN), den National Institutes of Health (NIH)/National Eye Institute (Fördernummern R01EY026012 und R01EY028554 (für DAF)), der NIH/National Institute on Aging (Zuschussnummer T32-AG029796 (für MRT und CRF)), der Elaine und Robert Larson Endowed Vision Research Chair (für DAF), die Lindsay Family Foundation und die Makuladegenerationsforschung (von einem anonymen Wohltäter bereitgestellt) ).

Zusatzmaterialien

Abbildung S1: Charakterisierung von NAC. Abbildung S2: Spuren aus der Cell Mito Stress Test Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate. Ergänzende Tabelle 1: Geschlecht und Alter des Spenders, die in jeder Abbildung verwendet wurden. (Zusatzmaterialien)

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Copyright © 2019 Marcia R. Terluk et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


Inbrija (früher bekannt als CVT-301) ist eine inhalative Pulverformulierung von Levodopa zur intermittierenden Behandlung von Off-Episoden bei Patienten mit Parkinson, die derzeit Carbidopa/Levodopa einnehmen. [9] Es wurde am 21. Dezember 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassen und wird von Acorda Therapeutics vermarktet. [10]

  • Die kurzzeitige Reaktion hängt mit der Halbwertszeit des Arzneimittels zusammen.
  • Die länger anhaltende Reaktion hängt von der Akkumulation von Wirkungen über mindestens zwei Wochen ab, während derer sich ΔFosB in nigrostriatalen Neuronen akkumuliert. Bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit zeigt sich diese Reaktion nur in einer frühen Therapie, da die Unfähigkeit des Gehirns, Dopamin zu speichern, noch kein Problem darstellt.
    , insbesondere wenn die Dosierung zu hoch ist, obwohl diese selten sind, die oft durch Einnahme des Arzneimittels mit Nahrung reduziert wird, obwohl Protein die Arzneimittelaufnahme reduziert.
  • l -DOPA ist eine Aminosäure, also hemmt Protein kompetitiv
  • l -DOPA-Absorption.
  • Magen-Darm-Blutungen
  • Eine gestörte Atmung, die nicht immer schädlich ist und tatsächlich Patienten mit Obstruktion und Verwirrtheit der oberen Atemwege zugute kommen kann
  • Extreme emotionale Zustände, insbesondere Angstzustände, aber auch übermäßige Libido
  • Lebhafte Träume oder Schlaflosigkeit oder visuelle Halluzinationen
  • Auswirkungen auf das Lernen Einige Hinweise deuten darauf hin, dass es das Arbeitsgedächtnis verbessert, während andere komplexe Funktionen und Narkolepsie beeinträchtigt werden
  • Ein Zustand ähnlich der stimulierenden Psychose
  • Verschlechterung der Funktion am Ende der Dosis
  • Ein/Aus-Schwingungen
  • Einfrieren bei Bewegung
  • Dosisversagen (Arzneimittelresistenz) bei Spitzendosis (Levodopa-induzierte Dyskinesie)
  • Mögliche Dopamin-Dysregulation: Die langfristige Einnahme von
  • l-DOPA bei der Parkinson-Krankheit wurde mit dem sogenannten Dopamin-Dysregulationssyndrom in Verbindung gebracht. [18]

Die Langzeitanwendung von L-Dopa erhöht den oxidativen Stress durch Monoaminoxidase-induzierten enzymatischen Abbau von synthetisiertem Dopamin, was zu neuronalen Schäden und Zytotoxizität führt. Der oxidative Stress wird durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (H2Ö2) während des Monoaminoxidase-Stoffwechsels von Dopamin. Es wird weiter durch den Reichtum an Fe 2+ -Ionen im Striatum über die Fenton-Reaktion und die intrazelluläre Autooxidation verewigt. Die erhöhte Oxidation kann aufgrund der Bildung von 8-Oxoguanin, das sich mit Adenosin paaren kann, möglicherweise Mutationen in der DNA verursachen. [19]


Informieren Sie Ihren Arzt über alle Nahrungsergänzungsmittel, die Sie einnehmen, auch wenn sie natürlich sind. Auf diese Weise kann Ihr Arzt mögliche Nebenwirkungen oder Wechselwirkungen mit Medikamenten überprüfen.

Nebenwirkungen. Einige der Nebenwirkungen, die durch NAC verursacht werden können, sind:

Risiken. Wenn Sie Asthma oder Blutungsprobleme haben, wird Ihr Arzt Ihnen möglicherweise empfehlen, NAC zu vermeiden. Sie werden wahrscheinlich aufgefordert, NAC 2 Wochen vor einer elektiven Operation abzusetzen.

Wenn Sie schwanger sind oder stillen, müssen Sie vor der Verwendung von NAC-Ergänzungen einen Arzt konsultieren.

Interaktionen. Wenn Sie regelmäßig Medikamente einnehmen, sprechen Sie mit Ihrem Arzt, bevor Sie mit der Einnahme von NAC-Präparaten beginnen. Sie können mit Nitroglycerin interagieren, einschließlich Blutverdünnern und bestimmten Blutdruckmedikamenten.

Nahrungsergänzungsmittel werden von der FDA nicht so reguliert wie Lebensmittel und Medikamente. Die FDA überprüft diese Nahrungsergänzungsmittel nicht auf Sicherheit oder Wirksamkeit, bevor sie auf den Markt kommen.

Quellen

Website des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center: "Über Kräuter: N-Acetylcystein."