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Wie fügt DNA-Polymerase I dNTPs ohne 3'-OH hinzu, nachdem der Primer vom Leitstrang entfernt wurde?

Wie fügt DNA-Polymerase I dNTPs ohne 3'-OH hinzu, nachdem der Primer vom Leitstrang entfernt wurde?


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Ich habe eine Frage zur Replikation bei Prokaryoten. Das habe ich in der Schule gelernt:

  1. DNA-Polymerase benötigt 3'-OH, um ein dNTP hinzuzufügen.
  2. Die Chromosomen von Prokaryoten sind normalerweise kreisförmig.
  3. Der Primer im führenden Strang (natürlich auch die Primer im nachlaufenden Strang) wird durch die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I entfernt.

Es ist sinnvoll, dass auf dem nacheilenden Strang die Primer entfernt und dann durch neue dNTPs ersetzt werden, wobei das 3'-OH des vorherigen Okazaki-Fragments verwendet wird. Für den Primer auf dem Leitstrang gibt es jedoch kein Okazaki-Fragment stromaufwärts und somit kein 3'OH, das die DNA-Polymerase zur Polymerisation verwenden kann.

Wie wird der Primer durch neue dNTPs am Leitstrang ersetzt?


Der führende Strang nach der Initiation

Betrachten Sie zuerst die DNA-Replikationsgabel, nachdem die Initiation stattgefunden hat.

Der 3'-OH-Primer auf dem Leitstrang ist das 3'-Ende des DNA-Strangs, der in 5' nach 3'-Richtung synthetisiert wird (in der Abbildung unten eingekreist, modifiziert von Berg, Biochemie). Es wird nicht entfernt weil das nicht nötig ist. (Der Primer auf dem nacheilenden Strang wird nur entfernt, weil es sich um RNA handelt.) Das in der Frage gestellte Problem tritt also nicht auf.

Denken Sie daran, dass der Grund für Okazaki-Fragmente darin besteht, dass es keinen DNA-3'-OH-Primer für die . gibt zurückgeblieben Strang, sodass stattdessen ein temporärer RNA 3'-OH-Primer erzeugt wird, kann die RNA-Polymerase - im Gegensatz zur DNA-Polymerase - DNA ohne Primer kopieren. Es gibt kein solches Problem für die führend Strand.

Der führende Strang am Replikationsursprung

Wie @canadianer in einem Kommentar darauf hinweist, tun die obigen Bemerkungen nicht gelten für die Initiierung der DNA-Replikation, den einzigen Fall, in dem der führende Strang einen RNA-Primer aufweisen muss. Bei Prokaryonten wie Escherichia coli Replikation geht weiter in beide Richtungen so dass man kurze Zeit nach der Initiation eine Replikationsblase hat, wie in der Abbildung unten gezeigt (nach Russel, iGenetik) :

Es ist zu erkennen, dass am Ursprung das 3'-OH der DNA vom nacheilenden Strang der anderen Replikationsrichtung (rot eingerahmt) kann als Primer für die DNA-Synthesefunktion der DNA-Polymerase I fungieren, nachdem seine Exonuklease-Aktivität ein Nukleotid vom Anfang des RNA-Primers auf dem . entfernt hat Leitstrang.

Verweise

Berg et al. Ch.27

Die Zelle, CH. 5

Sandwalk: Blog-Seite

Fußnote

In der ursprünglichen Frage gab es einen Tippfehler, der zu Verwirrung führte, um welchen Strang sich das Poster bezog. Diese Antwort geht davon aus, dass führend Strand.


Abschnittszusammenfassung

Die Replikation in Prokaryoten beginnt mit einer Sequenz auf dem Chromosom, die als Replikationsursprung bezeichnet wird – dem Punkt, an dem sich die DNA öffnet. Helicase öffnet die DNA-Doppelhelix, was zur Bildung der Replikationsgabel führt. Einzelsträngige Bindungsproteine ​​binden an die einzelsträngige DNA in der Nähe der Replikationsgabel, um die Gabel offen zu halten. Primase synthetisiert einen RNA-Primer, um die Synthese durch DNA-Polymerase zu initiieren, die Nukleotide nur in der Richtung 5′ bis 3′ hinzufügen kann. Ein Strang wird kontinuierlich in Richtung der Replikationsgabel synthetisiert, dies wird als führender Strang bezeichnet. Der andere Strang wird in einer Richtung weg von der Replikationsgabel synthetisiert, in kurzen DNA-Abschnitten, die als Okazaki-Fragmente bekannt sind. Dieser Strang wird als nacheilender Strang bezeichnet. Sobald die Replikation abgeschlossen ist, werden die RNA-Primer durch DNA-Nukleotide ersetzt und die DNA mit DNA-Ligase versiegelt, wodurch Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3′-OH eines Endes und dem 5′ Phosphat des anderen Strangs hergestellt werden.


Quantensprünge in der Biochemie

Anil Day, Joanna Poulton, in Grundlagen der modernen Biochemie, 1996

Mitochondrien-Import-RNA

Die Entdeckung, dass der RNA-Primer, der verwendet wurde, um die DNA-Synthese in Säugetier-Mitochondrien zu initiieren, aus dem Kern importiert wurde, zerstreute den Glauben, dass nur Proteine, aber nicht RNA Organellenmembranen durchqueren könnten (Chang und Clayton, 1987). Der Nachweis, dass tRNAs aus dem Zytosol in Mitochondrien importiert werden, wird durch die Aufklärung der Kodierungskapazität der mitochondrialen DNA und auch durch die Charakterisierung von tRNAs in isolierten Mitochondrien abgeleitet. Mitochondrien von Säugetieren verwenden 22 ungewöhnliche tRNAs, um die 61 Sense-Codons zu entschlüsseln. Das lineare 15,8-kb-Genom von C. reinhardtii kodiert nur drei tRNAs (Michaelis et al., 1990). Obwohl die mitochondriale Lebermoos-DNA für 27 tRNA-Spezies kodiert, fehlen zwei Spezies, die zum Lesen von Leucin- und Threonin-Codons erforderlich sind. C. reinhardtii, Pflanzen- und Trypanosomen-Mitochondrien scheinen Kern-kodierte tRNAs zu importieren, um einen vollständigen Satz für die Proteinsynthese zu bilden. Elf der 31 tRNA-Spezies, die in Kartoffelmitochondrien vorhanden sind, werden durch nukleäre DNA kodiert und aus dem Zytosol importiert (Dietrich et al., 1992). Das Plastidengenom von Epifagus virginiana, einem nicht-photosynthetischen Parasiten der Buche, fehlen 13 tRNA-Gene, die in grünen Plastiden vorkommen. Dies legt nahe, dass ein tRNA-Import auch in Plastiden auftreten kann (Wolfe et al., 1992).


DNA Replikation

Wenn die Zelle im Zellzyklus in die S-Phase (Synthese) eintritt, muss die gesamte chromosomale DNA repliziert werden. DNA-Polymerasen synthetisieren neue Stränge durch Hinzufügen von Nukleotiden zu der 3'-OH-Gruppe, die auf dem vorherigen Nukleotid vorhanden ist, unter Verwendung der getrennten DNA-Einzelstränge als Matrizen. Dieser Prozess erzeugt aus einer Doppelhelix zwei neue doppelsträngige Moleküle, sogenannte Schwesterchromatiden. Aber wie verteilen sich die neuen und alten Stränge? Die Antwort auf diese Frage wurde durch klassische Experimente von Meselson und Stahl aufgeklärt.

Experiment, das die semikonservative DNA-Replikation demonstrierte

Einen Überblick über das Experiment finden Sie unter:

Hören Sie sich nun die folgende Geschichte über diese klassischen Experimente von einem der beteiligten Wissenschaftler an:

Die Mechanismen der Replikation

Wie viele molekulare Ereignisse, die wir untersuchen werden, kann die Replikation in drei Phasen unterteilt werden: Initiation, Elongation und Termination.

Einleitung

DNA-Polymerase beginnt nicht an zufälligen Stellen auf Chromosomen. Die DNA-Replikation sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten beginnt bei einem Ursprung der Replikation (Ori), das sind spezifische Sequenzen an bestimmten Positionen auf Chromosomen. In E coli, das OriC Herkunft ist

245 bp groß. Die Chromosomenreplikation beginnt mit der Bindung eines Initiatorproteins (DnaA) an eine AT-reiche Sequenz (zum Beispiel TTATCCACA in E coli) in dem OriC und schmilzt (unterbricht die Wasserstoffbindung zwischen) die beiden Stränge. Helicase Enzyme werden hinzugefügt, um ab diesem Punkt zusätzliche DNA zu entwinden.

Bei Prokaryoten mit einem kleinen, einfachen, kreisförmigen Chromosom wird nur ein Replikationsstartpunkt benötigt, um das gesamte Genom zu replizieren. Zum Beispiel, E coli hat ein

4,5 Mb Genom (Chromosom), das dupliziert werden kann in

40 Minuten unter Annahme eines einzigen Ursprungs, bidirektionaler Replikation und einer Geschwindigkeit von

1000 Basen/Sekunde/Gabel für die Polymerase. Bis heute wurden mindestens fünf prokaryontische DNA-Polymerasen entdeckt, wobei DNA-Polymerase III (Pol III) die primäre Polymerase für die Replikation ist. Pol I wird hauptsächlich verwendet, um Lücken zu füllen, die während der Synthese des verzögerten Strangs (unten beschrieben) oder durch Fehlerkorrekturmechanismen erzeugt wurden. DNA-Polymerase II, IV und V werden verwendet, um DNA zu synthetisieren, wenn zu anderen Zeiten im zellulären Lebenszyklus bestimmte Arten von Reparaturen benötigt werden.

Warum sollte eine Initiatorprotein-Bindungsstelle im OriC eine AT-reiche Region sein?

Hinweis: Denken Sie an die Anzahl der Wasserstoffbrücken zwischen AT- und GC-Basenpaaren.

Bei Eukaryoten mit mehreren linearen Chromosomen ist mehr als ein Replikationsursprung pro Chromosom erforderlich, um den gesamten Chromosomensatz in den 8 Stunden der S-Phase des Zellzyklus zu duplizieren. Zum Beispiel hat das menschliche diploide Genom 46 Chromosomen (6 x 10 9 Basenpaare). Selbst die kürzesten Chromosomen sind

50 Mbp lang und konnte daher unmöglich von einem Ursprung repliziert werden. Außerdem ist die Geschwindigkeit der Replikationsgabel langsamer als bei Prokaryoten, nur

100 Basis/Sekunde. Eukaryoten enthalten daher mehrere Replikationsursprünge, die über die Länge jedes Chromosoms verteilt sind, um die Duplikation jedes Chromosoms innerhalb der S-Phase zu ermöglichen.

Abbildung (PageIndex<1>): Schema eines Eukaryoten-Chromosoms mit mehreren Replikationsstartpunkten (1, 2, 3), die jeweils ein Replikon definieren (1, 2, 3). Die Replikation kann zu unterschiedlichen Zeiten in der S-Phase beginnen. Hier beginnen #1 und #2 zuerst dann #3. Da die Replikationsgabeln bidirektional fortschreiten, erzeugen sie „Replikationsblasen&rdquo, die sich treffen und größere Blasen bilden. Das Endergebnis sind zwei halbkonservativ replizierte Duplex-DNA-Stränge, wobei die Elternstränge schwarz und die neu synthetisierten Stränge rot sind. (Original-Locke-CC:AN)

Verlängerung

Während die DNA-Polymerase entlang der Matrize fortschreitet, wird das Nukleotid, das mit jeder Base auf der Matrize eine Basenpaarung bildet, kovalent an das 3'-Ende des wachsenden Strangs gebunden. Beachten Sie, dass die Energie durch das Nukleotidtriphosphat selbst bereitgestellt wird, zwei Phosphate freigesetzt werden und ein Phosphat als Teil der Phosphodiesterbindung verbleibt.

Beendigung

Bei Prokaryoten verläuft die Elongation bidirektional, bis sich die Replikationsgabeln treffen. RNA-Primer werden von einer spezialisierten DNA-Polymerase entfernt und dann wird DNA an ihrer Stelle synthetisiert. Die resultierenden DNA-Fragmente werden dann zusammen mit DNA-Ligase "versiegelt", einem Enzym, das kovalente Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden bildet.

Bei Eukaryoten verläuft die Replikation ebenfalls bidirektional, bis sich benachbarte Gabeln treffen oder die Gabel auf das Ende des Chromosoms trifft.

Auswirkungen und Einschränkungen der 5'-zu-3'-Aktivität der DNA-Polymerase

Denken Sie daran, dass Enzyme spezifisch für ihre Substrate sind. Im Fall der DNA-Polymerase erlaubt die Struktur nur, Nukleotide an das 3'-Ende bestehender DNA hinzuzufügen, was einige Fragen aufwirft:

1. Wenn das Enzym nur Nukleotide an vorhandene DNA anfügen kann, wie wird es dann beginnen?

2. Da DNA doppelsträngig ist, muss jeder Strang als Matrize verwendet werden, aber diese Stränge sind antiparallel. Wie kann ein Komplex neue DNA in entgegengesetzte Richtungen herstellen?

3. Wie wird das 3'-Ende repliziert, wenn auf dem komplementären Strang kein Platz mehr für einen Primer ist?

Hindernis Nr. 1: Wie fange ich an

Wenn oriC geöffnet wurde und sich die Helikasen an den beiden Seiten der Replikationsgabel befestigt haben, kann die Replikationsmaschine, auch bekannt als das Replisom, beginnen, sich zu bilden. Bevor die DNA-Polymerasen jedoch Positionen einnehmen, müssen sie geprimt werden. DNA-Polymerasen sind nicht in der Lage, zwei einzelne freie Nukleotide miteinander zu verbinden, um mit der Bildung einer Nukleinsäure zu beginnen, die sie nur an einen bereits bestehenden Strang von mindestens zwei Nukleotiden anfügen können. Daher ist eine spezialisierte RNA-Polymerase (RNAP&rsquos haben diese Einschränkung nicht) bekannt als primas ist ein Teil des Replisoms, und reads erzeugt einen kurzen RNA-Strang, der als bezeichnet wird Grundierung für die DNA-Polymerase zu addieren. Obwohl nur wenige Nukleotide benötigt werden, können die prokaryontischen Primer je nach Spezies bis zu 60 nt lang sein. Die Helikase wird weiterhin vor der Gabelung wandern, um neue DNA abzuwickeln und es Primase zu ermöglichen, bei Bedarf neue Primer hinzuzufügen.

Hindernis Nr. 2: Machen Sie gleichzeitig zwei Stränge in entgegengesetzte Richtungen

Da die DNA in Richtung der Gabelbewegung abgewickelt wird, müssen beide Stränge gleichzeitig im abgewickelten Bereich synthetisiert werden. Die beiden Untereinheiten der DNA-Polymerase, die Nukleotide hinzufügen, sind tatsächlich miteinander verbunden, sodass sie sich nicht in entgegengesetzte Richtungen bewegen können.

Helicase öffnet die doppelsträngige DNA und führt den Rest der Replikationsmaschine weiter. Da Nukleinsäuren polymerisiert werden, indem das 5&supmin;-Phosphat eines neuen Nukleotids an das 3&supmin;&sup6; Leitstrang, wird in die gleiche Richtung synthetisiert, in die sich die Replikationsmaschine bewegt. Kein Problem da.

Der andere Strang ist problematisch: Linear betrachtet würde der neu synthetisierte Strang 3 bis 5 in Richtung der Helikasebewegung gehen, aber DNA-Polymerasen können keine Nukleotide an das 5 &mgr;-Ende hinzufügen (denken Sie daran, dass er das Phosphat hat, kein Hydroxyl). Wie lösen Zellen dieses Problem? Im aktuellen Modell besteht die Replikationsmaschine aus der Helikase, Primasen und zwei DNA-Polymerase-III-Holoenzymen, die sich in die gleiche physikalische Richtung bewegen (der Helikase folgend). Tatsächlich sind die Pol III-Komplexe physikalisch durch &tau-Untereinheiten verbunden (Abbildung (PageIndex<3>).

Abbildung (PageIndex<3>): DNA-Replikation in Prokaryonten. DNA-Polymerase III ist ein Holoenzym mit mehreren Untereinheiten. Der blaue Ring stellt die &beta-Untereinheit (auch bekannt als &beta-Klemme) dar, ein Dimer aus halbkreisförmigen Untereinheiten mit einem zentralen Loch, durch das die DNA gefädelt wird. Die Kern-Polymerase wird über eine &alpha-&beta-Wechselwirkung an diese &beta-Klemme gebunden, so dass sie länger auf der DNA verbleibt, wodurch die Prozessivität von Pol III auf über 5000 nt erhöht wird.

Damit der andere Strang repliziert werden kann, muss der Strang rückwärts in die Polymerase eingespeist werden, indem die DNA herumgeschlungen wird. Hinter der DNA-Helikase synthetisiert Primase schnell einen kurzen Primer, bevor er mit dem Replisom voranschreiten und erneut synthetisieren muss, wobei intermittierende Primer zurückbleiben. So ist Pol III gezwungen, jeweils nur kurze Fragmente des Chromosoms zu synthetisieren, die nach ihren Entdeckern Reiji und Tsuneko Okazaki Okazaki-Fragmente genannt werden. Pol III beginnt mit der Synthese, indem er Nukleotide an das 3'-Ende eines Primers anfügt und fährt fort, bis es das 5'-Ende des nächsten Primers erreicht. Pol III nicht (und kann nicht) verbinden den zu synthetisierenden Strang mit dem 3&rsquo-Ende des RNA-Primers.

Die DNA-Replikation wird als halbdiskontinuierlicher Prozess bezeichnet, da während der führende Strang kontinuierlich synthetisiert wird, der nachlaufende Strang in Fragmenten synthetisiert wird. Dies führt zu zwei großen Problemen: Erstens bleiben kleine RNA-Stücke in den neu hergestellten Strängen zurück (nur am 5&rsquo-Ende für den führenden Strang, an vielen Stellen für den nacheilenden Strang) und zweitens kann Pol III nur freie Nukleotide hinzufügen mit einem Fragment einzelsträngiger DNA kann es kein anderes Fragment verbinden. Daher ist der neue &ldquostrand&rdquo nicht ganz, sondern gespickt mit fehlenden Phosphodiester-Bindungen.

Das erste Problem wird durch DNA-Polymerase I gelöst. Im Gegensatz zu Pol III ist Pol I ein monomeres Protein und wirkt allein, ohne zusätzliche Proteine. Es gibt auch 10-20 mal so viele Pol I-Moleküle wie Pol III-Moleküle, weil sie für so viele Okazaki-Fragmente benötigt werden. DNA-Polymerase I hat drei Aktivitäten:

  1. wie Pol III kann es einen DNA-Strang basierend auf einer DNA-Matrize synthetisieren,
  2. auch wie Pol III ist es eine 3&rsquo-5&rsquo-Korrektur-Exonuklease, aber im Gegensatz zu Pol III,
  3. es ist auch eine 5&rsquo-3&rsquo-Exonuklease. Die 5&rsquo-3&rsquo-Exonuklease-Aktivität ist entscheidend für die Entfernung des RNA-Primers. Die 5&rsquo-3&rsquo-Exonuklease bindet an doppelsträngige DNA, die einen Einzelstrangbruch im Phosphodiester-Rückgrat aufweist, wie es nach der Synthese von Okazaki-Fragmenten von einem Primer zum nächsten passiert, aber nicht verbunden werden kann. Diese 5&rsquo-3&rsquo-Exonuklease entfernt dann den RNA-Primer. Die Polymerase-Aktivität fügt dann dem stromaufwärts gelegenen Okazaki-Fragment neue DNA-Nukleotide hinzu und füllt die Lücke, die durch die Entfernung des RNA-Primers entstanden ist. Die Korrekturlese-Exonuklease verhält sich genau wie bei Pol III und entfernt sofort ein neu eingebautes falsches Nukleotid. Nach dem Korrekturlesen beträgt die Gesamtfehlerrate beim Einbau von Nukleotiden etwa 1 zu 10 7 .

Obwohl die RNA durch DNA ersetzt wurde, hinterlässt dies immer noch einen fragmentierten Strang. Der letzte große Akteur in der Geschichte der DNA-Replikation erscheint endlich: DNA-Ligase. Dieses Enzym hat eine einfache, aber entscheidende Aufgabe: Es katalysiert den Angriff des 3&rsquo-OH eines Fragments auf das 5&rsquo-Phosphat des nächsten Fragments und erzeugt eine Phosphodiesterbindung.

Sehen Sie den gesamten Komplex in dieser Animation in Aktion:

Hindernis #3: Wie kopiert man das Ende?

Die Enden von linearen Chromosomen stellen ein Problem dar &ndash an jedem Ende kann ein Strang nicht vollständig repliziert werden, da kein Primer zum Verlängern vorhanden ist. Obwohl der Verlust einer so kleinen Sequenz kein Problem darstellen würde, würden die fortgesetzten Replikationsrunden zu einem fortgesetzten Verlust der Sequenz vom Chromosomenende bis zu einem Punkt führen, an dem es beginnen würde, essentielle Gensequenzen zu verlieren. Daher muss diese DNA repliziert werden. Die meisten Eukaryoten lösen dieses Problem mit einer spezialisierten DNA-Polymerase namens Telomerase, in Kombination mit einer regulären Polymerase. Telomerasen sind RNA-gerichtete DNA-Polymerasen. Sie sind ein Riboprotein, da sie sowohl aus Protein als auch aus RNA bestehen. Diese Enzyme enthalten ein kleines Stück RNA, das als tragbare und wiederverwendbare Vorlage dient, aus der die komplementäre DNA synthetisiert wird. Die RNA in menschlichen Telomerasen verwendet die Sequenz 3'-AAUCCC-5' als Matrize, und somit hat unsere telomere DNA die komplementäre Sequenz 5'-TTAGGG-3', die tausendfach wiederholt wird. Nachdem die Telomerase den ersten Strang gebildet hat, synthetisiert eine Primase einen RNA-Primer und eine DNA-Polymerase stellt dann ein Komplement der verlängerten Sequenz her.

Telomerase = nicht-kodierende RNA + Reverse-Transkriptase-Protein

Beim Menschen heißt das Gen für die Telomerase-RNA TERC (teLomerase RN / A Component) und befindet sich auf Chromosom 3. Dieses Gen kodiert also ein Produkt (eine RNA), aber kein Protein!

Das Gen für das Protein heißt TERT (teLomerase Rumgekehrt TRanscriptase) und befindet sich auf Chromosom 5.

Diese unabhängig kodierten und unabhängig produzierten Genprodukte müssen sich zusammenfügen, um ihre Funktion zu erfüllen.

Beachten Sie, dass die Anzahl der Wiederholungen und damit die Größe des Telomers nicht festgelegt ist, sondern nach jeder Runde des Zellzyklus schwanken kann. Da es am Ende viele Wiederholungen gibt, behält diese Fluktuation einen Längenpuffer bei &ndash, manchmal ist er länger, manchmal kürzer &ndash, aber die durchschnittliche Länge wird über die Generationen der Zellreplikation beibehalten.

Abbildung (PageIndex<4>): Telomer-Replikation, die die Vervollständigung des führenden Strangs und die unvollständige Replikation des nacheilenden Strangs zeigt. Die Lücke wird durch die Verlängerung des 3&rsquo-Endes durch Telomerase repliziert und dann durch Verlängerung von einem RNA-Primer aufgefüllt. (Original-Locke-CC:AN)

In Abwesenheit von Telomerase, wie dies bei menschlichen Körperzellen der Fall ist, führt eine wiederholte Zellteilung zu einer Verkürzung der Telomere. Wird eine kritische Grenze erreicht, treten die Zellen in eine Seneszenzphase ohne Wachstum ein. Die Aktivierung der Telomerase-Expression, die häufig in Krebszellen auftritt, ermöglicht es einer Zelle und ihren Nachkommen, unsterblich zu werden, da ihre Telomere die kritische Grenze nicht erreichen. Zellen, die in Kultur gezüchtet werden können, wie z HeLa-Zellen dass überexprimierte Telomerase im Wesentlichen unbegrenzt vermehrt werden kann. HeLa-Zellen, die ursprünglich ohne ihre Zustimmung von einer afroamerikanischen Krebspatientin, Henrietta Lacks, isoliert wurden, werden seit 1951 in Kultur gehalten.

Korrekturlesen der DNA-Polymerase

DNA-Polymerase baut die richtigen Nukleotide in jeden neuen Strang ein, basierend auf der günstigen Wasserstoffbrückenbindung, die zwischen Basen auftritt, die nach den Regeln der Basenpaarung (A-T und G-C) binden. Wird eine falsche Base eingebaut, wird die Struktur der Doppelhelix verzerrt und oft vom Enzym erkannt, wenn sie nicht zu weit nach unten vorgedrungen ist. DNA-Polymerase hat 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität, um Nukleotide durch die Fehlpaarung zu entfernen und dann die Synthese dieser Region des Strangs mit den richtigen Nukleotiden zu wiederholen. Aufgrund dieser Korrekturlesefähigkeit weisen DNA-Polymerasen sehr geringe Fehlerraten auf, wodurch Organismen erfolgreich genetische Informationen von Zelle zu Zelle und von Generation zu Generation weitergeben können.


Inhalt

RNA-Primer werden von lebenden Organismen bei der Einleitung der Synthese eines DNA-Strangs verwendet. Eine Klasse von Enzymen, die Primasen genannt werden, fügt der Lesevorlage einen komplementären RNA-Primer hinzu de novo sowohl auf den führenden als auch auf den nacheilenden Strängen. Ausgehend vom freien 3’-OH des Primers, dem sogenannten Primer-Terminus, kann eine DNA-Polymerase einen neu synthetisierten Strang verlängern. Der führende Strang bei der DNA-Replikation wird in einem kontinuierlichen Stück synthetisiert, das sich mit der Replikationsgabel bewegt, und erfordert nur einen anfänglichen RNA-Primer, um die Synthese zu beginnen. Im nacheilenden Strang verläuft die Matrizen-DNA in 5′→3′-Richtung. Da die DNA-Polymerase keine Basen in der 3′→5′-Richtung komplementär zum Matrizenstrang hinzufügen kann, wird die DNA in kurzen Fragmenten, die sich von der Replikationsgabel wegbewegen, die als Okazaki-Fragmente bekannt sind, „rückwärts“ synthetisiert. Im Gegensatz zum Leitstrang führt diese Methode zum wiederholten Starten und Stoppen der DNA-Synthese, was mehrere RNA-Primer erfordert. Entlang der DNA-Matrize streut Primase RNA-Primer ein, die die DNA-Polymerase verwendet, um DNA in 5'→3'-Richtung zu synthetisieren. [1]

Ein weiteres Beispiel für Primer, die verwendet werden, um die DNA-Synthese zu ermöglichen, ist die reverse Transkription. Reverse Transkriptase ist ein Enzym, das einen RNA-Matrizenstrang verwendet, um einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Die DNA-Polymerase-Komponente der reversen Transkriptase erfordert ein vorhandenes 3'-Ende, um mit der Synthese zu beginnen. [1]

Primer entfernen Bearbeiten

Nach der Insertion von Okazaki-Fragmenten werden die RNA-Primer entfernt (der Mechanismus der Entfernung unterscheidet sich zwischen Prokaryoten und Eukaryoten) und durch neue Desoxyribonukleotide ersetzt, die die Lücken füllen, in denen die RNA vorhanden war. DNA-Ligase verbindet dann die fragmentierten Stränge miteinander und vervollständigt die Synthese des nacheilenden Strangs. [1]

In Prokaryoten synthetisiert DNA-Polymerase I das Okazaki-Fragment, bis es den vorherigen RNA-Primer erreicht. Dann fungiert das Enzym gleichzeitig als 5'→3'-Exonuklease, entfernt Primer-Ribonukleotide vorne und fügt Desoxyribonukleotide hinten hinzu, bis die Region durch DNA ersetzt ist, wobei eine kleine Lücke im DNA-Rückgrat zwischen Okazaki-Fragmenten verbleibt, die durch DNA-Ligase versiegelt wird.

Bei der eukaryotischen Primerentfernung verlängert die DNA-Polymerase δ das Okazaki-Fragment in 5′→3′-Richtung, und beim Auftreffen auf den RNA-Primer des vorherigen Okazaki-Fragments verdrängt sie das 5′-Ende des Primers in einen einzelsträngigen RNA-Flap, der wird durch Nukleasespaltung entfernt. Die Spaltung der RNA-Lappen beinhaltet entweder die Spaltung von kurzen Lappen durch Lappenstruktur-spezifische Endonuklease 1 (FEN1) oder die Beschichtung langer Lappen durch das einzelsträngige DNA-Bindungsprotein-Replikationsprotein A (RPA) und die sequentielle Spaltung durch Dna2-Nuklease und FEN1. [2]

Synthetische Primer sind chemisch synthetisierte Oligonukleotide, normalerweise aus DNA, die so angepasst werden können, dass sie an eine spezifische Stelle der Matrizen-DNA anlagern. In Lösung hybridisiert der Primer spontan mit der Matrize durch Watson-Crick-Basenpaarung, bevor er durch DNA-Polymerase verlängert wird. Die Fähigkeit, synthetische Primer zu erstellen und anzupassen, hat sich als unschätzbares Werkzeug für eine Vielzahl molekularbiologischer Ansätze zur Analyse von DNA erwiesen. Sowohl die Sanger-Kettenabbruchmethode als auch die „Next-Gen“-Methode der DNA-Sequenzierung benötigen Primer, um die Reaktion auszulösen. [1]

PCR-Primer-Design Bearbeiten

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet ein Paar benutzerdefinierter Primer, um die DNA-Elongation an gegenüberliegenden Enden der zu amplifizierenden Sequenz aufeinander zu lenken. Diese Primer sind typischerweise zwischen 18 und 24 Basen lang und dürfen nur für die spezifischen stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Stellen der zu amplifizierenden Sequenz kodieren. Ein Primer, der an mehrere Regionen entlang der DNA binden kann, amplifiziert sie alle, wodurch der Zweck der PCR entfällt. [1]

Beim Design eines Paares von PCR-Primern müssen einige Kriterien berücksichtigt werden. Primerpaare sollten ähnliche Schmelztemperaturen aufweisen, da das Annealing während der PCR für beide Stränge gleichzeitig erfolgt, und diese gemeinsame Schmelztemperatur darf weder zu viel höher noch niedriger als die Annealing-Temperatur der Reaktion sein. Eine Grundierung mit a Tm (Schmelztemperatur) zu viel höher als die Annealing-Temperatur der Reaktion kann mishybridisieren und sich an einer falschen Stelle entlang der DNA-Sequenz ausdehnen. EIN Tm deutlich niedriger als die Glühtemperatur kann nicht geglüht werden und sich überhaupt ausdehnen.

Außerdem müssen Primersequenzen ausgewählt werden, um eindeutig auf eine DNA-Region zu selektieren, wodurch die Möglichkeit einer Hybridisierung an eine ähnliche Sequenz in der Nähe vermieden wird. Ein häufig verwendetes Verfahren zum Auswählen einer Primerstelle ist die BLAST-Suche, wobei alle möglichen Regionen, an die ein Primer binden kann, gesehen werden können. Sowohl die Nukleotidsequenz als auch der Primer selbst können mit BLAST durchsucht werden. Das kostenlose NCBI-Tool Primer-BLAST integriert Primer-Design und BLAST-Suche in einer Anwendung, [3] ebenso wie kommerzielle Softwareprodukte wie ePrime und Beacon Designer. Computersimulationen theoretischer PCR-Ergebnisse (elektronische PCR) können durchgeführt werden, um das Primer-Design zu unterstützen, indem Schmelz- und Annealing-Temperaturen usw. angegeben werden. [4]

Seit 2014 sind viele Online-Tools für das Primer-Design frei verfügbar, von denen einige sich auf spezifische Anwendungen der PCR konzentrieren. Primer mit hoher Spezifität für eine Untergruppe von DNA-Matrizen in Gegenwart vieler ähnlicher Varianten können mit DECIPHER [ Zitat benötigt ] .

Die Auswahl einer spezifischen DNA-Region für die Primerbindung erfordert einige zusätzliche Überlegungen. Regionen mit hohem Mononukleotid- und Dinukleotid-Repeat sollten vermieden werden, da Schleifenbildung auftreten und zur Fehlhybridisierung beitragen kann. Primer sollten sich nicht leicht mit anderen Primern in der Mischung verbinden. Dieses Phänomen kann zur Bildung von „Primer-Dimer“-Produkten führen, die die Endlösung verunreinigen. Primer sollten auch nicht stark an sich selbst anlagern, da interne Haarnadeln und Schleifen das Annealing mit der Template-DNA behindern könnten.

Beim Entwerfen von Primern können zusätzliche Nukleotidbasen an die hinteren Enden jedes Primers hinzugefügt werden, was zu einer kundenspezifischen Cap-Sequenz an jedem Ende der amplifizierten Region führt. Eine Anwendung für diese Praxis ist die Verwendung bei der TA-Klonierung, einer speziellen Subklonierungstechnik ähnlich der PCR, bei der die Effizienz durch Hinzufügen von AG-Schwänzen an den 5'- und 3'-Enden erhöht werden kann. [5]

Degenerierte Primer Bearbeiten

In einigen Situationen kann die Verwendung von erforderlich sein degenerierte Primer. Dies sind Mischungen von Primern, die ähnlich, aber nicht identisch sind. Diese können praktisch sein, wenn das gleiche Gen aus verschiedenen Organismen amplifiziert wird, da die Sequenzen wahrscheinlich ähnlich, aber nicht identisch sind. Diese Technik ist nützlich, da der genetische Code selbst degeneriert ist, was bedeutet, dass mehrere verschiedene Codons für dieselbe Aminosäure codieren können. Dies ermöglicht es verschiedenen Organismen, eine signifikant unterschiedliche genetische Sequenz zu haben, die für ein sehr ähnliches Protein kodiert. Aus diesem Grund werden degenerierte Primer auch dann verwendet, wenn das Primerdesign auf der Proteinsequenz basiert, da die spezifische Sequenz der Codons nicht bekannt ist. Daher könnte die der Aminosäure Isoleucin entsprechende Primersequenz "ATH" sein, wobei A für Adenin, T für Thymin und H für Adenin, Thymin oder Cytosin steht, gemäß dem genetischen Code für jedes Codon unter Verwendung der IUPAC-Symbole für entartete Basen. Degenerierte Primer hybridisieren möglicherweise nicht perfekt mit einer Zielsequenz, was die Spezifität der PCR-Amplifikation stark reduzieren kann.

Degenerierte Primer sind im Bereich der mikrobiellen Ökologie weit verbreitet und äußerst nützlich. Sie ermöglichen die Amplifikation von Genen bisher nicht kultivierter Mikroorganismen oder die Gewinnung von Genen aus Organismen, für die keine Genominformationen verfügbar sind. Normalerweise werden degenerierte Primer durch Abgleichen der in GenBank gefundenen Gensequenzierung entworfen. Unterschiede zwischen den Sequenzen werden durch die Verwendung von IUPAC-Degenerationen für einzelne Basen berücksichtigt. PCR-Primer werden dann als eine Mischung von Primern synthetisiert, die allen Permutationen der Codonsequenz entsprechen.


2. Größentrennung durch Gelelektrophorese

Im zweiten Schritt werden die kettenterminierten Oligonukleotide mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt. Bei der Gelelektrophorese werden DNA-Proben in ein Ende einer Gelmatrix geladen und ein elektrischer Strom angelegt. DNA wird negativ geladen, so dass die Oligonukleotide zur positiven Elektrode auf der gegenüberliegenden Seite des Gels gezogen werden. Da alle DNA-Fragmente die gleiche Ladung pro Masseneinheit haben, wird die Geschwindigkeit, mit der sich die Oligonukleotide bewegen, nur durch die Größe bestimmt. Je kleiner ein Fragment ist, desto weniger Reibung erfährt es, wenn es sich durch das Gel bewegt, und desto schneller bewegt es sich. Als Ergebnis werden die Oligonukleotide vom kleinsten zum größten angeordnet, wobei das Gel von unten nach oben gelesen wird.

In Handbuch Bei der Sanger-Sequenzierung werden die Oligonukleotide aus jeder der vier PCR-Reaktionen in vier separaten Gelspuren laufen gelassen. Dadurch kann der Benutzer wissen, welche Oligonukleotide jedem ddNTP entsprechen.

In automatisiert Sanger-Sequenzierung, alle Oligonukleotide werden in einer einzigen Kapillar-Gelelektrophorese innerhalb der Sequenziermaschine laufen gelassen.


Abschnittszusammenfassung

Die Replikation in Prokaryoten beginnt mit einer Sequenz auf dem Chromosom, die als Replikationsursprung bezeichnet wird – dem Punkt, an dem sich die DNA öffnet. Helicase öffnet die DNA-Doppelhelix, was zur Bildung der Replikationsgabel führt. Einzelsträngige Bindungsproteine ​​binden an die einzelsträngige DNA in der Nähe der Replikationsgabel, um die Gabel offen zu halten. Primase synthetisiert einen RNA-Primer, um die Synthese durch DNA-Polymerase zu initiieren, die Nukleotide nur in der Richtung 5′ bis 3′ hinzufügen kann. Ein Strang wird kontinuierlich in Richtung der Replikationsgabel synthetisiert, dies wird als führender Strang bezeichnet. Der andere Strang wird in einer Richtung weg von der Replikationsgabel synthetisiert, in kurzen DNA-Abschnitten, die als Okazaki-Fragmente bekannt sind. Dieser Strang wird als nacheilender Strang bezeichnet. Sobald die Replikation abgeschlossen ist, werden die RNA-Primer durch DNA-Nukleotide ersetzt und die DNA wird mit DNA-Ligase versiegelt, wodurch Phosphodiester-Bindungen zwischen dem 3′-OH eines Endes und dem 5′-Phosphat des anderen Strangs hergestellt werden.


Wie fügt DNA-Polymerase I dNTPs ohne 3'-OH hinzu, nachdem der Primer vom Leitstrang entfernt wurde? - Biologie

Am Ende dieses Abschnitts können Sie Folgendes tun:

  • Erklären Sie den Prozess der DNA-Replikation in Prokaryoten
  • Besprechen Sie die Rolle verschiedener Enzyme und Proteine ​​bei der Unterstützung dieses Prozesses

Die DNA-Replikation wurde in Prokaryoten hauptsächlich wegen der geringen Größe des Genoms und wegen der großen Vielfalt an verfügbaren Mutanten gut untersucht. E coli hat 4,6 Millionen Basenpaare in einem einzigen kreisförmigen Chromosom und alles wird in ungefähr 42 Minuten repliziert, beginnend an einer einzigen Stelle entlang des Chromosoms und um den Kreis in beide Richtungen fortschreitend. Dies bedeutet, dass pro Sekunde ungefähr 1000 Nukleotide hinzugefügt werden. Somit ist der Prozess recht schnell und erfolgt ohne viele Fehler.

Die DNA-Replikation verwendet eine große Anzahl von Strukturproteinen und Enzymen, von denen jedes eine entscheidende Rolle während des Prozesses spielt. Einer der Hauptakteure ist das Enzym DNA-Polymerase, auch bekannt als DNA pol, das Nukleotide nacheinander an die wachsende DNA-Kette anfügt, die komplementär zum Matrizenstrang ist. Die Addition von Nukleotiden erfordert Energie, diese Energie wird aus den Nukleosidtriphosphaten ATP, GTP, TTP und CTP gewonnen. Wie ATP, das andere NTPs (Nukleosidtriphosphate) sind hochenergetische Moleküle, die sowohl als Quelle für DNA-Nukleotide als auch als Energiequelle zum Antrieb der Polymerisation dienen können. Wenn die Bindung zwischen den Phosphaten „aufgebrochen“ ist, wird die freigesetzte Energie verwendet, um die Phosphodiesterbindung zwischen dem ankommenden Nukleotid und der wachsenden Kette zu bilden. In Prokaryonten sind drei Haupttypen von Polymerasen bekannt: DNA-Pol I, DNA-Pol II und DNA-Pol III. It is now known that DNA pol III is the enzyme required for DNA synthesis DNA pol I is an important accessory enzyme in DNA replication, and along with DNA pol II, is primarily required for repair.

How does the replication machinery know where to begin? It turns out that there are specific nucleotide sequences called origins of replication where replication begins. In E coli, which has a single origin of replication on its one chromosome (as do most prokaryotes), this origin of replication is approximately 245 base pairs long and is rich in AT sequences. The origin of replication is recognized by certain proteins that bind to this site. An enzyme called Helikase unwinds the DNA by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous base pairs. ATP hydrolysis is required for this process. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks are formed at the origin of replication and these get extended bi-directionally as replication proceeds. Single-strand binding proteins coat the single strands of DNA near the replication fork to prevent the single-stranded DNA from winding back into a double helix.

DNA polymerase has two important restrictions: it is able to add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction (a new DNA strand can be only extended in this direction). It also requires a free 3′-OH group to which it can add nucleotides by forming a phosphodiester bond between the 3′-OH end and the 5′ phosphate of the next nucleotide. This essentially means that it cannot add nucleotides if a free 3′-OH group is not available. Then how does it add the first nucleotide? The problem is solved with the help of a primer that provides the free 3′-OH end. Another enzyme, RNA primase, synthesizes an RNA segment that is about five to ten nucleotides long and complementary to the template DNA. Because this sequence primes the DNA synthesis, it is appropriately called the primer. DNA polymerase can now extend this RNA primer, adding nucleotides one-by-one that are complementary to the template strand ((Figure)).

Kunstverbindung

Abbildung 1. A replication fork is formed when helicase separates the DNA strands at the origin of replication. The DNA tends to become more highly coiled ahead of the replication fork. Topoisomerase breaks and reforms DNA’s phosphate backbone ahead of the replication fork, thereby relieving the pressure that results from this “supercoiling.” Single-strand binding proteins bind to the single-stranded DNA to prevent the helix from re-forming. Primase synthesizes an RNA primer. DNA polymerase III uses this primer to synthesize the daughter DNA strand. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. DNA polymerase I replaces the RNA primer with DNA. DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments, joining the fragments into a single DNA molecule. (Kredit: Änderung der Arbeit von Mariana Ruiz Villareal)

Question: You isolate a cell strain in which the joining of Okazaki fragments is impaired and suspect that a mutation has occurred in an enzyme found at the replication fork. Which enzyme is most likely to be mutated?

The replication fork moves at the rate of 1000 nucleotides per second. Topoisomerase prevents the over-winding of the DNA double helix ahead of the replication fork as the DNA is opening up it does so by causing temporary nicks in the DNA helix and then resealing it. Because DNA polymerase can only extend in the 5′ to 3′ direction, and because the DNA double helix is antiparallel, there is a slight problem at the replication fork. The two template DNA strands have opposing orientations: one strand is in the 5′ to 3′ direction and the other is oriented in the 3′ to 5′ direction. Only one new DNA strand, the one that is complementary to the 3′ to 5′ parental DNA strand, can be synthesized continuously towards the replication fork. This continuously synthesized strand is known as the leading strand. The other strand, complementary to the 5′ to 3′ parental DNA, is extended away from the replication fork, in small fragments known as Okazaki fragments, each requiring a primer to start the synthesis. New primer segments are laid down in the direction of the replication fork, but each pointing away from it. (Okazaki fragments are named after the Japanese scientist who first discovered them. The strand with the Okazaki fragments is known as the lagging strand.)

The leading strand can be extended from a single primer, whereas the lagging strand needs a new primer for each of the short Okazaki fragments. The overall direction of the lagging strand will be 3′ to 5′, and that of the leading strand 5′ to 3′. A protein called the sliding clamp holds the DNA polymerase in place as it continues to add nucleotides. The sliding clamp is a ring-shaped protein that binds to the DNA and holds the polymerase in place. As synthesis proceeds, the RNA primers are replaced by DNA. The primers are removed by the exonuclease activity of DNA pol I, which uses DNA behind the RNA as its own primer and fills in the gaps left by removal of the RNA nucleotides by the addition of DNA nucleotides. The nicks that remain between the newly synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase, which catalyzes the formation of phosphodiester linkages between the 3′-OH end of one nucleotide and the 5′ phosphate end of the other fragment.

Once the chromosome has been completely replicated, the two DNA copies move into two different cells during cell division.

The process of DNA replication can be summarized as follows:

  1. DNA unwinds at the origin of replication.
  2. Helicase opens up the DNA-forming replication forks these are extended bidirectionally.
  3. Single-strand binding proteins coat the DNA around the replication fork to prevent rewinding of the DNA.
  4. Topoisomerase binds at the region ahead of the replication fork to prevent supercoiling.
  5. Primase synthesizes RNA primers complementary to the DNA strand.
  6. DNA polymerase III starts adding nucleotides to the 3′-OH end of the primer.
  7. Elongation of both the lagging and the leading strand continues.
  8. RNA primers are removed by exonuclease activity.
  9. Gaps are filled by DNA pol I by adding dNTPs.
  10. The gap between the two DNA fragments is sealed by DNA ligase, which helps in the formation of phosphodiester bonds.

(Figure) summarizes the enzymes involved in prokaryotic DNA replication and the functions of each.

Prokaryotic DNA Replication: Enzymes and Their Function
Enzyme/protein Specific Function
DNA-Pol I Removes RNA primer and replaces it with newly synthesized DNA
DNA pol III Main enzyme that adds nucleotides in the 5′-3′ direction
Helicase Opens the DNA helix by breaking hydrogen bonds between the nitrogenous bases
Ligase Seals the gaps between the Okazaki fragments to create one continuous DNA strand
Primase Synthesizes RNA primers needed to start replication
Sliding Clamp Helps to hold the DNA polymerase in place when nucleotides are being added
Topoisomerase Helps relieve the strain on DNA when unwinding by causing breaks, and then resealing the DNA
Single-strand binding proteins (SSB) Binds to single-stranded DNA to prevent DNA from rewinding back.

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Review the full process of DNA replication here.

Abschnittszusammenfassung

Replication in prokaryotes starts from a sequence found on the chromosome called the origin of replication—the point at which the DNA opens up. Helicase opens up the DNA double helix, resulting in the formation of the replication fork. Single-strand binding proteins bind to the single-stranded DNA near the replication fork to keep the fork open. Primase synthesizes an RNA primer to initiate synthesis by DNA polymerase, which can add nucleotides only to the 3′ end of a previously synthesized primer strand. Both new DNA strands grow according to their respective 5′-3′ directions. One strand is synthesized continuously in the direction of the replication fork this is called the leading strand. The other strand is synthesized in a direction away from the replication fork, in short stretches of DNA known as Okazaki fragments. This strand is known as the lagging strand. Once replication is completed, the RNA primers are replaced by DNA nucleotides and the DNA is sealed with DNA ligase, which creates phosphodiester bonds between the 3′-OH of one end and the 5′ phosphate of the other strand.

Kunstverbindungen

(Figure) You isolate a cell strain in which the joining of Okazaki fragments is impaired and suspect that a mutation has occurred in an enzyme found at the replication fork. Which enzyme is most likely to be mutated?


Inhalt

The classical chain-termination method requires a single-stranded DNA template, a DNA primer, a DNA polymerase, normal deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and modified di-deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), the latter of which terminate DNA strand elongation. These chain-terminating nucleotides lack a 3'-OH group required for the formation of a phosphodiester bond between two nucleotides, causing DNA polymerase to cease extension of DNA when a modified ddNTP is incorporated. The ddNTPs may be radioactively or fluorescently labelled for detection in automated sequencing machines.

The DNA sample is divided into four separate sequencing reactions, containing all four of the standard deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) and the DNA polymerase. To each reaction is added only one of the four dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP), while the other added nucleotides are ordinary ones. The deoxynucleotide concentration should be approximately 100-fold higher than that of the corresponding dideoxynucleotide (e.g. 0.5mM dTTP : 0.005mM ddTTP) to allow enough fragments to be produced while still transcribing the complete sequence (but the concentration of ddNTP also depends on the desired length of sequence). [2] Putting it in a more sensible order, four separate reactions are needed in this process to test all four ddNTPs. Following rounds of template DNA extension from the bound primer, the resulting DNA fragments are heat denatured and separated by size using gel electrophoresis. In the original publication of 1977, [2] the formation of base-paired loops of ssDNA was a cause of serious difficulty in resolving bands at some locations. This is frequently performed using a denaturing polyacrylamide-urea gel with each of the four reactions run in one of four individual lanes (lanes A, T, G, C). The DNA bands may then be visualized by autoradiography or UV light and the DNA sequence can be directly read off the X-ray film or gel image.

In the image on the right, X-ray film was exposed to the gel, and the dark bands correspond to DNA fragments of different lengths. A dark band in a lane indicates a DNA fragment that is the result of chain termination after incorporation of a dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). The relative positions of the different bands among the four lanes, from bottom to top, are then used to read the DNA sequence.

Technical variations of chain-termination sequencing include tagging with nucleotides containing radioactive phosphorus for radiolabelling, or using a primer labeled at the 5' end with a fluorescent dye. Dye-primer sequencing facilitates reading in an optical system for faster and more economical analysis and automation. The later development by Leroy Hood and coworkers [4] [5] of fluorescently labeled ddNTPs and primers set the stage for automated, high-throughput DNA sequencing.

Chain-termination methods have greatly simplified DNA sequencing. For example, chain-termination-based kits are commercially available that contain the reagents needed for sequencing, pre-aliquoted and ready to use. Limitations include non-specific binding of the primer to the DNA, affecting accurate read-out of the DNA sequence, and DNA secondary structures affecting the fidelity of the sequence.

Dye-terminator sequencing Edit

Dye-terminator sequencing utilizes labelling of the chain terminator ddNTPs, which permits sequencing in a single reaction, rather than four reactions as in the labelled-primer method. In dye-terminator sequencing, each of the four dideoxynucleotide chain terminators is labelled with fluorescent dyes, each of which emit light at different wavelengths.

Owing to its greater expediency and speed, dye-terminator sequencing is now the mainstay in automated sequencing. Its limitations include dye effects due to differences in the incorporation of the dye-labelled chain terminators into the DNA fragment, resulting in unequal peak heights and shapes in the electronic DNA sequence trace chromatogram after capillary electrophoresis (see figure to the left).

This problem has been addressed with the use of modified DNA polymerase enzyme systems and dyes that minimize incorporation variability, as well as methods for eliminating "dye blobs". The dye-terminator sequencing method, along with automated high-throughput DNA sequence analyzers, was used for the vast majority of sequencing projects until the introduction of next generation sequencing.

Automation and sample preparation Edit

Automated DNA-sequencing instruments (DNA sequencers) can sequence up to 384 DNA samples in a single batch. Batch runs may occur up to 24 times a day. DNA sequencers separate strands by size (or length) using capillary electrophoresis, they detect and record dye fluorescence, and output data as fluorescent peak trace chromatograms. Sequencing reactions (thermocycling and labelling), cleanup and re-suspension of samples in a buffer solution are performed separately, before loading samples onto the sequencer. A number of commercial and non-commercial software packages can trim low-quality DNA traces automatically. These programs score the quality of each peak and remove low-quality base peaks (which are generally located at the ends of the sequence). The accuracy of such algorithms is inferior to visual examination by a human operator, but is adequate for automated processing of large sequence data sets.

Challenges Edit

Common challenges of DNA sequencing with the Sanger method include poor quality in the first 15-40 bases of the sequence due to primer binding and deteriorating quality of sequencing traces after 700-900 bases. Base calling software such as Phred typically provides an estimate of quality to aid in trimming of low-quality regions of sequences. [6] [7]

In cases where DNA fragments are cloned before sequencing, the resulting sequence may contain parts of the cloning vector. In contrast, PCR-based cloning and next-generation sequencing technologies based on pyrosequencing often avoid using cloning vectors. Recently, one-step Sanger sequencing (combined amplification and sequencing) methods such as Ampliseq and SeqSharp have been developed that allow rapid sequencing of target genes without cloning or prior amplification. [8] [9]

Current methods can directly sequence only relatively short (300-1000 nucleotides long) DNA fragments in a single reaction. The main obstacle to sequencing DNA fragments above this size limit is insufficient power of separation for resolving large DNA fragments that differ in length by only one nucleotide.

Microfluidic Sanger sequencing is a lab-on-a-chip application for DNA sequencing, in which the Sanger sequencing steps (thermal cycling, sample purification, and capillary electrophoresis) are integrated on a wafer-scale chip using nanoliter-scale sample volumes. This technology generates long and accurate sequence reads, while obviating many of the significant shortcomings of the conventional Sanger method (e.g. high consumption of expensive reagents, reliance on expensive equipment, personnel-intensive manipulations, etc.) by integrating and automating the Sanger sequencing steps.

In its modern inception, high-throughput genome sequencing involves fragmenting the genome into small single-stranded pieces, followed by amplification of the fragments by polymerase chain reaction (PCR). Adopting the Sanger method, each DNA fragment is irreversibly terminated with the incorporation of a fluorescently labeled dideoxy chain-terminating nucleotide, thereby producing a DNA “ladder” of fragments that each differ in length by one base and bear a base-specific fluorescent label at the terminal base. Amplified base ladders are then separated by capillary array electrophoresis (CAE) with automated, vor Ort “finish-line” detection of the fluorescently labeled ssDNA fragments, which provides an ordered sequence of the fragments. These sequence reads are then computer assembled into overlapping or contiguous sequences (termed "contigs") which resemble the full genomic sequence once fully assembled. [10]

Sanger methods achieve read lengths of approximately 800bp (typically 500-600bp with non-enriched DNA). The longer read lengths in Sanger methods display significant advantages over other sequencing methods especially in terms of sequencing repetitive regions of the genome. A challenge of short-read sequence data is particularly an issue in sequencing new genomes (de novo) and in sequencing highly rearranged genome segments, typically those seen of cancer genomes or in regions of chromosomes that exhibit structural variation. [11]

Applications of microfluidic sequencing technologies Edit

Other useful applications of DNA sequencing include single nucleotide polymorphism (SNP) detection, single-strand conformation polymorphism (SSCP) heteroduplex analysis, and short tandem repeat (STR) analysis. Resolving DNA fragments according to differences in size and/or conformation is the most critical step in studying these features of the genome. [10]

Device design Edit

The sequencing chip has a four-layer construction, consisting of three 100-mm-diameter glass wafers (on which device elements are microfabricated) and a polydimethylsiloxane (PDMS) membrane. Reaction chambers and capillary electrophoresis channels are etched between the top two glass wafers, which are thermally bonded. Three-dimensional channel interconnections and microvalves are formed by the PDMS and bottom manifold glass wafer.

The device consists of three functional units, each corresponding to the Sanger sequencing steps. The thermal cycling (TC) unit is a 250-nanoliter reaction chamber with integrated resistive temperature detector, microvalves, and a surface heater. Movement of reagent between the top all-glass layer and the lower glass-PDMS layer occurs through 500-μm-diameter via-holes. After thermal-cycling, the reaction mixture undergoes purification in the capture/purification chamber, and then is injected into the capillary electrophoresis (CE) chamber. The CE unit consists of a 30-cm capillary which is folded into a compact switchback pattern via 65-μm-wide turns.

Sequencing chemistry Edit

Platforms Edit

The Apollo 100 platform (Microchip Biotechnologies Inc., Dublin, CA) [12] integrates the first two Sanger sequencing steps (thermal cycling and purification) in a fully automated system. The manufacturer claims that samples are ready for capillary electrophoresis within three hours of the sample and reagents being loaded into the system. The Apollo 100 platform requires sub-microliter volumes of reagents.

Comparisons to other sequencing techniques Edit

Performance values for genome sequencing technologies including Sanger methods and next-generation methods [11] [13] [14]
Technologie Number of lanes Injection volume (nL) Analysis time Average read length Throughput (including analysis Mb/h) Gel pouring Lane tracking
Slab gel 96 500–1000 6–8 hours 700 bp 0.0672 Jawohl Jawohl
Capillary array electrophoresis 96 1–5 1–3 hours 700 bp 0.166 Nein Nein
Microchip 96 0.1–0.5 6–30 minutes 430 bp 0.660 Nein Nein
454/Roche FLX (2008) < 0,001 4 Stunden 200–300 bp 20–30
Illumina/Solexa (2008) 2–3 days 30–100 bp 20
ABI/SOLiD (2008) 8 days 35 bp 5–15
Illumina MiSeq (2019) 1–3 days 2x75–2x300 bp 170–250
Illumina NovaSeq (2019) 1–2 days 2x50–2x150 bp 22,000–67,000
Ion Torrent Ion 530 (2019) 2.5–4 hours 200–600 bp 110–920
BGI MGISEQ-T7 (2019) 1 Tag 2x150 bp 250,000
Pacific Biosciences SMRT (2019) 10–20 hours 10–30 kb 1,300
Oxford Nanopore MinIon (2019) 3 days 13–20 kb [15] 700

The ultimate goal of high-throughput sequencing is to develop systems that are low-cost, and extremely efficient at obtaining extended (longer) read lengths. Longer read lengths of each single electrophoretic separation, substantially reduces the cost associated with de novo DNA sequencing and the number of templates needed to sequence DNA contigs at a given redundancy. Microfluidics may allow for faster, cheaper and easier sequence assembly. [10]



Bemerkungen:

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