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Wie kann ich ein Zellpellet resuspendieren, ohne die Bakterien zu schädigen?

Wie kann ich ein Zellpellet resuspendieren, ohne die Bakterien zu schädigen?


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Wenn ich eine Vorkultur mit Ampicillin in meiner Proteinexpression verwende, muss ich das Vorkulturmedium loswerden, um nicht zu viele Beta-Lactamasen zu verschleppen, die das Ampicillin in der Hauptkultur zerstören. Dazu pelletiere ich die Zellen und resuspendiere.

Welche Methoden der Resuspendierung sind am besten geeignet, wenn Sie die Bakterien danach noch lebend benötigen? Ich bin mir nicht sicher, wie viel Kraft ich anwenden kann, ohne die Bakterien zu schädigen, und das sehr sanfte Resuspendieren dauert sehr, sehr lange.

Mit welchen Methoden lassen sich Bakterien lebend resuspendieren und welche sind die schnellsten?


Angenommen, du redest von E coli: Solange Sie die Zellen in einer geeigneten Flüssigkeit resuspendieren, z.B. frisches Medium oder Puffer, dann muss man sich meiner Erfahrung nach nicht viel Sorgen machen - die Zellen sind sehr robust. Ich habe festgestellt, dass unterschiedliche Stämme und Wachstumsbedingungen Pellets mit sehr unterschiedlichen Qualitäten ergeben - einige werden beim Vortexen recht gut resuspendiert. Wenn das Pellet klumpig erscheint, ist das Zerreiben etwas, das ich immer als funktionierend empfunden habe - Pipette auf und ab, bis das Pellet zerfällt.

Wenn Sie eine physiologische Messung mit den resuspendierten Zellen durchführen würden, könnte dies eine Überprüfung erfordern, aber wenn Sie nur beabsichtigen, nachzuwachsen und eine Expression zu induzieren, würde ich sagen, dass Sie den Zellen etwas Zeit geben, um sich im neuen Medium zu erholen (überprüfen Sie das Extinktion nimmt zu), bevor die Expression induziert wird.


Sanftes Auf- und Abpipettieren, je langsamer man pipettiert und je dicker die Spitze, desto schonender, oder LANGSAM vortexen, hohe Vortex-Geschwindigkeiten führen zu Scherbelastungen an der Wand, genau wie schnelles Pipettieren mit kleinen Spitzen

Bakterien können viel aushalten, seien Sie vorsichtiger mit Hefe und noch mehr Sorgfalt mit Säugerzellen


Hilfe zur großtechnischen Plasmidaufreinigung - (05.10.2004 )

heute habe ich Plasmid aus 500ml Kulturmedium gereinigt, ich gebe 10ml Lösung 1 hinzu und mische gleichmäßig bevor ich 20ml Lösung 2 hinzufüge, aber in dieser Zeit kann ich die Flüssigkeit nicht klar machen, und es gibt immer eine Gruppe von E.coli, die gerne von DNA verpackt werden. Ist die Lösung nicht ausreichend oder andere Gründe?

Ich möchte aufgereinigtes Plasmid für einen DNA-Impfstoff. Können Sie mir ein Protokoll geben, um 10-20 mg Plasmid zu erhalten? Danke sehr

Ich habe Qiagens Maxiprep zum Isolieren von BACs verwendet, bei denen es sich um Einzelkopien handelt, ziemlich erfolgreich. Ich habe bis zu 1,5 mg DNA. Ich habe nur 300 ml O/N-Kultur verwendet. Sie können möglicherweise eine bessere Ausbeute erzielen, da Sie mehr Ausgangsmaterial verwenden, und ich vermute, dass Ihr Plasmid aus mehreren Kopien besteht. Sie können die mit dem Kit gelieferten Reagenzien verwenden, aber die Säulen vermeiden und stattdessen die DNA einfach mit Isopropanol ppt, um die Ergebnisse noch zu verbessern.

Wie bei Minipreps sehen Sie nach der Lyse möglicherweise keine klare Lösung, wenn Sie es mit Maxipreps zu tun haben.

1. Lösung I: Ein 500 ml Zellpellet in 10 ml Lösung I ohne Lysozym resuspendieren. Fügen Sie dann 10 ml Lösung I mit 8 mg/ml Lysozym oder Lösung I mit RNase zum resuspendierten Pellet hinzu. Mischen und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Option: Lösung I ohne Lysozym zugeben, Pellets resuspendieren und bis zu 5 Tage bei –20°C lagern. Vortexen Sie das Zellpellet, bis es vollständig resuspendiert ist, oder verwenden Sie eine Plastikpipettenspitze zum Mischen und Resuspendieren. Eine Pipettenspitze ist schonender und kann ein Scheren der chromosomalen DNA verhindern. Einige Stämme von E. coli sind schleimig und resistent gegen Resuspension durch Vortexen. Eine teilweise Lyse der Oberseite des Zellpellet kann die Resuspension des Bodens des Pellets verhindern, daher ist ein Mischen erforderlich.

2. Lösung II: Die Verwendung von eiskalter Lösung II verhindert die Schaumbildung. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, bis die Mischung klar ist, im Allgemeinen 5-7 Mal. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren oder bis die Lösung klar ist. Wenn hohe Zellkonzentrationen oder Plasmid-DNA-Dichte diesen Schritt verlangsamen, reduzieren Sie das Volumen der Zellen, die zur Herstellung des Pellets in Schritt 1 verwendet wurden. Eine leichte Spur von Zelltrübung ist zulässig. Mischen Sie Mischungen, die Lösung II enthalten, nicht vortexen, da dies die chromosomale DNA abschert, die dann die Plasmidpräparation kontaminiert. Einige Autoren erlauben eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur

3. Lösung III: Bei Zugabe von Lösung III bildet sich ein quarkartiger Niederschlag. Wenn das Zellpellet besonders groß war, erhöhen Sie die Inkubationszeit von Lösung III auf 10 Minuten. Die weiße Aufschlämmung besteht hauptsächlich aus dem Kaliumsalz von Dodecylsulfat plus chromosomaler DNA und Zelltrümmern. Plasmid ccc DNA befindet sich im klaren Überstand. Falls erforderlich, kann die Reaktion über 60 Minuten auf Eis verbleiben.

Ich weiß nicht, warum Sie die Flüssigkeit nach Zugabe von Lösung 2 klar machen möchten. An diesem Punkt sollten die Bakterien lysieren und Sie sollten etwas erhalten, das wie eine Schmiere aussieht. schleimig und klebrig.
Ich habe festgestellt, dass es funktioniert, indem Sie Ihre Kultur schleudern und 100 ml Lösung 1 hinzufügen. Das Pellet vollständig resuspendieren und erneut drehen (4000 U / min für 10 Minuten bei 4 ° C). Entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie das gewünschte Volumen von Lösung 1 hinzu (ich verwende 12 ml, passe das Protokoll jedoch an Ihre Bedürfnisse an). Das Pellet erneut VOLLSTÄNDIG resuspendieren. Dann fügen Sie Lösung 2 hinzu (ich füge 16 ml hinzu) und lassen Sie sie einige Minuten auf Ihrer Bank sitzen. Die Lösung 3 hinzufügen (ich gebe 12 ml hinzu) und vorsichtig schwenken und 10 Minuten auf Eis halten.
Nach einer Drehung bei 12000 U/min für 20 Minuten bei 4°C werden alle Zelltrümmer pelletiert, aber nur wenige "Brocken" schwimmen im Überstand.
An diesem Punkt möchten Sie die klare Flüssigkeit. Während Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen gießen, filtrieren Sie ihn durch eine sterile Gaze. Dies wird Ihnen helfen, die meisten dieser hartnäckigen "chunks", die herumschwirren, loszuwerden:)

Im Grunde ist dies eine einfache alkalische Lyse mit zusätzlicher Waschung mit Lösung 1.


Gewinnen von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ohne Verwendung von Kits

Viele molekularbiologische Techniken, wie die vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung, erfordern hochgereinigte und konzentrierte Plasmid-DNA, und bakterielle Plasmide werden weithin als Klonierungsvektoren für die DNA-Rekombination verwendet. Nach der Konstruktion eines neuen Plasmids können dessen Größe und Restriktionsendonukleasespektrum durch Gelelektrophorese bestimmt werden. In diesem Artikel werden zwei effektive Protokolle für die Plasmidextraktion ohne Verwendung von Kits vorgestellt.

  • Denaturierungslösung
  • Renaturierungslösung
  • 100 % Ethanol oder Isopropanol
  • 70% Ethanol
  • TE Puffer oder Wasser

1. Züchte eine Bakterienkultur über Nacht.

2. Zentrifugieren Sie die Kultur, um Bakterien vor der DNA-Präparation auszufällen.

3. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Bakterien in Puffer.

4. Fügen Sie den resuspendierten Bakterien eine Denaturierungslösung hinzu, um eine Lyse der Bakterien zu bewirken und ihren Inhalt freizusetzen.

5. Fügen Sie den denaturierten Bakterien eine Renaturierungslösung hinzu, um Protein und genomische DNA auszufällen und Plasmide frei in Lösung zu lassen.

6. Präzipitieren Sie das Protein und die genomische DNA durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand, der Plasmide enthält.

7. Fügen Sie entweder Ethanol oder Isopropanol hinzu, um die Plasmid-DNA auszufällen.

8. Präzipitieren Sie die DNA mit einer Zentrifuge oder tragen Sie die Lösung auf eine Säule auf, die an die DNA bindet.

9. Waschen Sie das Pellet oder die Säule mit 70 % Ethanol, um überschüssiges Salz zu entfernen.

10. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet oder eluieren Sie die DNA mit Wasser oder einem neutralen Puffer wie TE von der Säule.

Protokoll B: die alkalische Extraktionsmethode

  • Polypropylenröhrchen vom Typ Eppendorf (1,5 ml)
  • Eine Tischzentrifuge, die 8-10.000 xg . erzeugen kann
  • Lösung I: Lysozym-Lösung – 2 mg/ml Lysozym, 50 mM Glucose, 10 mM CDTA, 25 mM Tris-HC1 (pH 8,0)
  • Lösung II: Alkalische SDS-Lösung - 0,2 N NaOH, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
  • Lösung II: Hochsalzlösung-3 M Natriumacetat (pH 4,8)
  • 0,1 M Natriumacetat/0,05 M Tris-HCl (pH 8)
  • Kaltes Ethanol

1. Züchte eine Bakterienkultur über Nacht.

2. Zur Plasmidextraktion 0,5 ml Kultur in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführen.

3. Zentrifugieren Sie die Kultur, um die Bakterien zu pelletieren, bevor Sie mit der DNA-Präparation fortfahren.

4. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 100 ul Lösung I hinzu, resuspendieren Sie das Zellpellet und inkubieren Sie bei 0 °C für 30 Minuten.

5. 200 ul Lösung II zugeben und vorsichtig rotieren. Die Suspension sollte fast klar und leicht viskos werden. Halten Sie das Röhrchen 5 min bei 0 °C.

6. Fügen Sie 150 ul Lösung III hinzu und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig einige Sekunden lang durch Umdrehen, wobei sich während dieser Zeit ein DNA-Gerinnsel bildete. Das Röhrchen wird 60 min bei 0°C gehalten.

7. 5 min zentrifugieren bei 10.000 xg.

8. Überstand entfernen und in ein zweites Zentrifugenröhrchen überführen, 1 ml kaltes Ethanol hinzufügen und das Röhrchen 30 min bei –20°C halten.

9. Sammeln Sie den Niederschlag durch Zentrifugation für 2 min.

10. Entferne den Überstand und löse das Pellet in 100 ul 0,1 M Natriumacetat/0,05 M Tris-HCl (pH 8) auf und präzipitiere es mit 2 Volumina kaltem Ethanol für 10 min bei –20 °C.

11. 5 min bei 10.000 xg zentrifugieren und Pellets in 40 µl Wasser auflösen.

Bei CD Genomics bieten wir eine vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung an, um Ihnen bei der Untersuchung der Evolution von Plasmiden, ihrer modularen Struktur und der Existenz von Hot Spots für die Insertion von akzessorischen Genen zu helfen.

Zusätzliche Lesungen

    1. Bimboim H C, Doly J. Ein schnelles alkalisches Extraktionsverfahren zum Screenen rekombinanter Plasmid-DNA. Nukleinsäureforschung, 1979, 7(6):1513-1523.

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    Anfänger-Laborfrage - was ist in Ordnung, um schnell zu wirbeln / aufzutauen?

    Also habe ich gerade angefangen, in einem Bachelor-Labor zu arbeiten, und ich habe mich gefragt, welche Arten von Materialien nicht gewirbelt werden sollten. Soweit ich weiß, sollten Sie beim Umgang mit Zellpellets immer vorsichtig mit einer Pipette resuspendieren. Gibt es andere Dinge, die ich vom Vortex-Genie fernhalten sollte? Außerdem weiß ich, dass Proteine, wenn sie schnell aufgetaut werden, denaturieren können, während ein schnelles Auftauen von DNA-Ladefarbstoff durch Vortexen / Hände nicht wirklich ein Problem ist. Könnten Sie mich zu einigen davon aufklären?

    Sie können Bakterien (nach dem Auftauen) mit einem Vortex resuspendieren und sie werden jedoch in Ordnung sein.

    E. coli, die zur Transformation fähig gemacht wurden, nicht vortexen. Wenn Sie in einem Bakterienlabor arbeiten, fragen Sie Ihren Mentor, ob er Vortexen toleriert. Manche Bakterien sind schwach.

    Genomische DNA oder lange Fragmente sollten nicht gevortext werden, da sie sonst scheren. Ich würde auch vermeiden, RNA zu verwirbeln.

    Ich taue meine dNTP's und NEB-Puffer immer in einem 37er Wasserbad auf. dNTP's sind unglaublich stabil und halten jahrelang im Labor. Ich habe einmal über Nacht einen in den 65 gelassen und, nur um zu sehen, ob sie noch funktionieren, eine PCR gemacht und sie haben immer noch funktioniert. Ich habe die Röhre danach immer noch geworfen, nur für den Fall, dass ihnen etwas seltsames passiert ist.

    nie etwas mit Reinigungsmittel verwirbeln

    Enzyme mögen es normalerweise nicht, verwirbelt zu werden, noch sollten sie durch Gefrieren und Auftauen gehen. Einige Enzyme sind jedoch robuster als andere, versuchen jedoch im Allgemeinen, sie nicht zu verwirbeln. Wenn Sie sie mischen müssen, pipettieren Sie vorsichtig auf und ab oder schlagen Sie an der Seite des Röhrchens.

    Bakterien sind sehr robust und vertragen heftiges Vortexen ohne großen Schaden. Eine Ausnahme bilden chemisch kompetente Zellen oder Zellen, die kürzlich aufgetaut wurden. Gehen Sie vorsichtig damit um und tauen Sie kompetente Zellen auf Eis auf. Menschliche Gewebekulturzellen sind nicht so robust, können aber sanftes und kurzes Vortexen vertragen. Wenn Sie Gewebekulturzellen aus LN2 entnehmen, tauen Sie sie schnell in einem 37 °C Wasserbad auf und plattieren Sie sie sofort.

    DNA kann tatsächlich durch Vortexen beschädigt werden. Bei großen Plasmen oder BACs empfehle ich kein Vortexen, da dies die DNA scheren kann. Ich taue DNA schnell auf, indem ich sie zwischen meinen Fingern rolle und sie ist in Ordnung. Gleiches gilt für PCR-Puffer, Primer und dNTPs. Wenn es sich um einen Puffer handelt, handelt es sich im Allgemeinen nur um eine Salzmischung und kräftiges Vortexen und schnelles Auftauen ist in Ordnung.

    Eine allgemeine Sache ist, das Protokoll für jedes von Ihnen verwendete Reagenz zu lesen. Die meisten Unternehmen werden in ihrem Protokoll explizit angeben, was gewirbelt werden kann und was nicht.


    Wie kann ich ein Zellpellet resuspendieren, ohne die Bakterien zu schädigen? - Biologie

    Aufreinigung von His-Tag-Fusionsproteinen im kleinen Maßstab unter
    denaturierende Bedingungen

    Hohe Expressionsraten rekombinanter Proteine ​​in einem bakteriellen System können zur Bildung von unlöslichen
    Aggregate, meist als Einschlusskörperchen (IB) bekannt. 6 M Guanidin-HCl (GuHCl), 8 M Harnstoff oder andere starke
    Denaturierungsmittel können verwendet werden, um IB vollständig zu solubilisieren. Da unter denaturierenden Bedingungen das His-Tag vollständig
    exponiert, wird es die Bindung an Ni-Säulen erleichtern. Für die meisten biochemischen Studien muss Protein renaturiert werden und
    zurückgefaltet, und dies kann normalerweise nach der Elution oder manchmal in der Säule selbst vor der Elution erfolgen.
    Wir beschreiben hier zwei Proteinreinigungsverfahren. Verfahren-I, bei dem das Protein aus dem Bakterium extrahiert wird
    Pellet in Gegenwart von Denaturierungsmitteln und gereinigt auf Ni 2+ -Kügelchen oder Verfahren-II, wo das Protein ist
    solubilisiert von teilweise sauberem oder sauberem IB (siehe Entfernung von Kontaminanten aus Einschlusskörpern vor der Solubilisierung)
    vor der Reinigung an
    Ni 2+ Perlen. Das zweite Verfahren ist zwar aufwendiger, kann aber helfen, den Hintergrund zu reduzieren
    von Proteinverunreinigungen im letzten Reinigungsschritt.

    Aliquot des Zellpellets nach der Induktion

    Die Idee ist, Zellen nach der Induktion zu aliquotieren und bei -80ºC genügend Zellpelletproben für die Optimierung im kleinen Maßstab zu halten
    Reinigungsverfahren und weiteres Scale-up. Sobald Sie die besten Aufreinigungsbedingungen im kleinen Maßstab eingestellt haben, können Sie
    das Verfahren skalieren.

    Beispiel:
    1) Züchte 1L Kultur
    2) Induzieren (IPTG, Salzinduktion usw. usw.)
    3) Zellkultur zentrifugieren 10min 8000rpm 4ºC, Überstand entladen
    4) Zellpellet bei 4°C sehr vorsichtig mit 100 ml kaltem PBS-Puffer resuspendieren. Aliquot wie folgt:
    a) 10 Röhrchen (1,5 ml Plastikröhrchen) mit 1 ml Suspension (das bedeutet 10 ml Originalkultur pro Röhrchen)
    b) 4 Röhrchen (15ml Plastikröhrchen) mit 10ml Suspension (das bedeutet 100ml Originalkultur pro Röhrchen)
    c) 1 Tube (50 ml Plastiktube) mit 50 ml Suspension (das bedeutet 500 ml Originalkultur).
    5) Spin 10min 8000rpm 4ºC, Überstand entladen
    6) Halten Sie das Zellpellet bei -80ºC

    Äquilibrierung von Ni-NTA-Agarose

    Platzieren Sie 50 µl Perlen (100 µl Suspension) von Ni-NTA-Agaroseperlen in einem 1,5 ml Plastikröhrchen.

    Waschen mit 2 x 1,5 ml H2O und 2x 1,5 ml Äquilibrierungspuffer (Waschen: Mischen, Schleudern 3 min 3500 U/min, Überstand ablassen).

    Lysepuffer: 50 mM Na2HPO4 pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM PMSF (oder Protease-Inhibitor-Cocktail für Bakterienzellen #P-8849 von Sigma)
    und starkes Vergällungsmittel wie 6 M Guanidin-HCl (GuHCl) oder 6 bis 8 M Harnstoff
    Optionale Zusätze zum Lysepuffer
    a) 1mM PMSF oder Protease-Inhibitor-Cocktail 1:200 (Cocktail für Bakterienzellen #P-8849 von Sigma)
    b) DNAse 100U/ml oder 25-50ug/ml (SIGMA DN-25). Inkubation 10min 4°.C in Gegenwart von 10mMMgCl2
    c) ßME bis 20mM
    Als ein Reduktionsmittel wenn das Protein Cysteine ​​enthält.

    Äquilibrierungspuffer: 6 bis 8 M Harnstoff, 50 mM Na2HPO4 pH 8,0, 0,5 M NaCl

    Waschpuffer: 6 bis 8 M Harnstoff, 50 mM Na2HPO4 pH 8,0, 0,5 M NaCl

    Elutionspuffer: 6 bis 8 M Harnstoff, 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl und geeignete Imidazolkonzentrationen.

    Einschränkungen
    Setzen Sie Ni-Matrizen nicht Reduktionsmitteln wie DTT oder DTE aus (Sie können ßME bis zu 20 mM verwenden) Chelatbildner wie EDTA und
    EGTA NH4 + Puffer und Aminosäuren wie Arg, Glu, Gly oder His.

    Verfahren I: Proteinextraktion aus Bakterienpellet in Gegenwart eines starken
    Vergällungsmittel

    1 Pellet von 10 ml Bakterienkultur (oder 100 ml Bakterienkultur für sehr niedrige Expressionsraten) in 1 ml Lysepuffer resuspendieren

    2 Bereiten Sie einen Lysepuffer vor, der 6 bis 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidin-HCl enthält (versuchen Sie zuerst 8 M Harnstoff, und wenn das Protein löslich ist, titrieren Sie im
    nächste Experimente, bis eine minimale Harnstoffkonzentration für die Proteinsolubilisierung erforderlich ist)

    3 Beschallen auf Eis 3 x 20 Sekunden (abhängig vom Beschallungsgerät)

    4 Schleudern 15min maximale Geschwindigkeit 4°.C

    5 Überstand in ein sauberes Röhrchen überführen: Rohextrakt (40 &mgr;l für PAGE-SDS aufbewahren)

    6 Äquilibrieren Sie 50 & Microl Nil Beads mit Äquilibrierungspuffer (siehe Äquilibrierung von Ni-NTA-Agarose)

    7 Fügen Sie den Rohextrakt zu den Perlen hinzu und inkubieren Sie bei 4°C / 1h (Swirl)

    8 Schleudern 3 Minuten 3500 U/min. Ungebundenes Material entleeren (40µl für PAGE-SDS aufbewahren)

    9 Waschen Sie 3 x 1 ml mit Waschpuffer mit geeigneter Harnstoffkonzentration. Waschen: mischen, 3min 3500rpm schleudern, Überstand ablassen
    (behalten Sie 40 & Mikrol für PAGE-SDS)

    10 2x1ml mit Waschpuffer + 10mM Imidazol waschen (40 &mgr;l für PAGE-SDS aufbewahren)

    11 Eluieren mit 3x100 µl Elutionspuffer + 250 mM Imidazol (40 µl für PAGE-SDS aufbewahren) (Elution: mischen, 3 min bei 4 °C halten, 3 min zentrifugieren
    3500 U/min, Überstand sammeln)

    12 Lauf auf PAGE-SDS-Gel 5 &mgr;l Rohextrakt und ungebundenes Material und 13 &mgr;l der Wasch- und Elutionsfraktionen.

    Verfahren II: Proteinextraktion aus Einschlusskörperchen (IB) in Gegenwart von
    ein starkes Vergällungsmittel

    1 Pellet von 10 ml Bakterienkultur (oder 100 ml Bakterienkultur für sehr niedrige Expressionsraten) in 1 ml Lysepuffer resuspendieren ohne
    Vergällungsmittel wie Harnstoff oder Guanidin-HCl

    2 Beschallen auf Eis 3 x 20 Sekunden (abhängig vom Beschallungsgerät)

    4 Schleudern 15 Min. Höchstgeschwindigkeit 4 °C. Trennen Sie den Überstand vor der Solubilisierung (behalten Sie 40 &mgr;l für PAGE-SDS) vom Pellet (IB).

    5 Resuspendieren Sie IB in 0,5 ml Lysepuffer, der Harnstoff 6 bis 8 M oder Guanidin-HCl 6 M enthält (30 min bei 30°C aufbewahren) oder IB vorher waschen
    Solubilisierung wie in ""Contaminant Removal from Inclusion Bodies Before Solubilization""" vorgeschlagen (dieser Schritt ist zwar mühsamer,
    kann dazu beitragen, den Hintergrund von Proteinverunreinigungen im letzten Reinigungsschritt zu reduzieren). Nach der IB-Solubilisierung max. 15 min schleudern
    Geschwindigkeit 4°.C. Trennen Sie den Überstand nach der Solubilisierung (behalten Sie 40 &mgr;l für PAGE-SDS) vom unlöslich gemachten Pellet (Pellet in 0,5 ml suspendieren)
    Lysepuffer und halten Sie 40 &mgr;l für PAGE-SDS). Überstand in sauberes Röhrchen überführen

    6 Äquilibrieren Sie 50 µl Nil-Beads mit Äquilibrierungspuffer (siehe Äquilibrierung von Ni-NTA-Agarose)

    7 Fügen Sie den letzten Überstandsextrakt zu den Beads hinzu und inkubieren Sie bei 4°C / 1h (Swirl)

    8 Schleudern 3 Minuten 3500 U/min. Ungebundenes Material entleeren (40µl für PAGE-SDS aufbewahren)

    9 3 x 1 ml mit Waschpuffer mit geeigneter Harnstoffkonzentration waschen. Waschen: Mischen, Schleudern 3 min 3500 U/min, Überstand ablassen
    (behalten Sie 40 & Mikrol für PAGE-SDS)

    10 2x1ml mit Waschpuffer + 10mM Imidazol waschen (40 &mgr;l für PAGE-SDS aufbewahren)

    11 Eluieren mit 3x100 µl Elutionspuffer + 250 mM Imidazol (40 µl für PAGE-SDS aufbewahren) (Elution: mischen, 3 min bei 4 °C halten, 3 min zentrifugieren
    3500 U/min, Überstand sammeln)

    12 Durchlauf auf PAGE-SDS-Gel 5 &mgr;l des überstehenden Extrakts vor und nach der Solubilisierung, unlöslich gemachtes Pellet und ungebundenes Material und
    13 &mgr;l der Wasch- und Elutionsfraktionen.

    Die hier beschriebenen Verfahren dienen der Reinigung im geringen Maßstab. Sollen größere Mengen an Proteinen gereinigt werden, empfehlen wir die Verwendung
    von offenen Säulen oder FPLC-Geräten mit Harzen, die bei hohem Druck verwendet werden können: wie Ni-NTA Superflow-Harz von QIAGEN oder
    BD Talon TM Metal Affinity von CLONTECH oder Chelating Sepharose Fast Flow oder Ni Sepharose High Performance von
    AMERSHAM-BIOSCIENCES oder Ni-NTA Hi-Bind oder Metallchelatharze von NOVAGEN-MERCK .
    Der Einsatz von FPLC-Geräten ermöglicht eine größere betriebliche Flexibilität und eine einfache Optimierung:
    1) Gradienten- oder Stufengradientenelutionen
    2) Optimierung von Flussrate, Säulendimension, Waschbedingungen usw.
    3) schneller und bequemer Vergleich der Proteinreinigung durch die Verwendung von Säulen, die mit anderen Metallionen unterschiedlicher Stärke beladen sind
    der Bindung, z.B. Zn 2+ , Co 2+ , Fe 2+ und Cu 2+

    Wenn das Protein nicht an das Ni-NTA-Harz bindet, überprüfen Sie die Integrität des His-Tags durch Western-Blot mit Anti-Polyhistidin-Antikörpern oder
    Führen Sie im Fall von N-terminalen Tags eine N-terminale Sequenzierung durch. Versuchen Sie, die ganze Zeit bei 4°C zu arbeiten, indem Sie während der Lyse Protease-Inhibitoren verwenden.

    Wenn das Zielprotein mit Proteinverunreinigungen eluiert Versuchen Sie, solubilisiertes sauberes IB wie in Verfahren-II angegeben zu laden. Oder probiere die Alternative
    Protokoll mit steigender Imidazol-Konzentration. Oder reduzieren Sie die Menge an Ni-NTA-Harz. Oder probieren Sie Zusatzstoffe wie ß ME, Glycerin, Waschmittel oder
    mehr NaCl in den Wasch-/Elutionspuffern.
    Für die Produktion im großen Maßstab ermöglicht die Verwendung von FPLC-Geräten mit den richtigen Harzen eine einfache und schnelle und bequeme Optimierung.
    Vergleich der Proteinreinigungsbedingungen.

    Wenn eluiertes Protein abgebaut zu sein scheint, versuchen Sie, die ganze Zeit bei 4°C zu arbeiten und verwenden Sie während der Lyse Protease-Inhibitoren.

    Wenn das Protein nicht von der Säule eluiert (Protein ist an die Säule gebunden), verwenden Sie höhere Imidazol-Konzentrationen (bis zu 1 M).

    Alternatives Protokoll, wenn das Zielprotein nicht rein genug ist

    Führen Sie parallele Reinigungsverfahren durch, bei denen Sie 10, 20, 30, 40 oder 50 mM Imidazol in den Lyse-, Bindungs- und Waschpuffer einschließen.

    Eluiere direkt mit 3x100ul Elutionspuffer + 250mM Imidazol.

    Überprüfen Sie die eluierten Proteine ​​auf PAGE-SDS. Erwarten Sie niedrigere Ausbeuten, aber eine höhere Reinigung durch Erhöhung der Imidazol-Konzentration


    Enzymologie an der Membrangrenzfläche: Intramembranproteasen

    B. Cordier, M. K. Lemberg , in Methoden der Enzymologie , 2017

    2.2 Expression und Membranpräparation

    Später wird ein allgemeines Verfahren zur Herstellung der Membranfraktion von . beschrieben E coli Zellen, die Rhomboid-Proteasen von Interesse für die anschließende Solubilisierung und Reinigung exprimieren ( 1 ). Zuerst wird das für das Rhomboid kodierende Gen in den bakteriellen Expressionsvektor pET-25b(+) kloniert ( Fig. 1 A). Das pET-System wird häufig zur Expression rekombinanter Proteine ​​in E coli, das unter der Kontrolle des starken T7-Bakteriophagen-Promotors steht. Bei Transformation in einen BL21 (DE3)-pLysS-Stamm (oder Derivate), der eine chromosomale Kopie der T7-RNA-Polymerase trägt, wird die Expression durch Zugabe von Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zum Kulturmedium induziert. Das pET-25b(+)-Plasmid kodiert für einen Hexa-Histidin-Tag (His6), der an den C-Terminus des Proteins fusioniert ist.

    Abb. 1 . Rhomboid-Expression und Aufreinigungs-Workflow mit E coli Zellen. (EIN) E. coli glpg und menschlich rhbdl2 Gene werden in den Expressionsvektor pET25b(+) kloniert. Kodierte Proteine ​​werden am C-Terminus mit einem His6-Tag fusioniert. (B) Das gesamte Verfahren, von der bakteriellen Transformation bis zur Proteinreinigung, umfasst einen Zeitraum von 4 Tagen, abhängig von der Dauer der Expression. Die Expression von GlpG und RHBDL2 erfolgt 16 h bei 16°C, um die Proteinfaltung zu unterstützen und die Bildung von Einschlusskörperchen zu reduzieren. Zwischenschritte sind nicht dargestellt.

    Als nächstes wird das Konstrukt, das glpG verwandelt sich in die E coli BL21 (DE3)-pLysS-Stamm. Das Plasmid kodiert rhbdl2 wird in den Rosetta™ 2-Stamm umgewandelt. Dieser Stamm wurde entwickelt, um heterologe Proteine ​​zu exprimieren, die den Codon-Bias überwinden, da er ein Plasmid mit tRNA-Genen trägt, die Codons entschlüsseln, die selten in verwendet werden E coli.

    Da es unmöglich ist, das Verhalten eines überexprimierten Membranproteins und seine Toxizität für die Zelle vorherzusagen, können andere Paare von Plasmiden und Bakterienstämmen in Betracht gezogen werden. BL21-Derivatstämme wie C41/C43 (DE3) und neuerdings auch Lemo21 (DE3), auch als „Walker“-Stämme bekannt, sind besser für die Überexpression von Membranproteinen geeignet (Miroux & Walker, 1996 Wagner et al., 2008). Einige überexprimierte Proteine ​​können sich falsch falten und sich in Einschlusskörperchen ansammeln. Daher ist die Verwendung eines Expressionsplasmids mit einem araBAD Promotor (induzierbar mit Arabinose), der schwächer ist als der T7-Promotor, war bei der Untersuchung der Hämophilus-Influenza Rhomboid-Protease GlpG (Lemieux, Fischer, Cherney, Bateman & James, 2007).

    2.2.1 Dauer

    Der gesamte Vorgang, beginnend von der bakteriellen Transformation bis hin zum Affinitätsreinigungsschritt, kann je nach Dauer der Proteinexpression 4 oder 5 Tage dauern (Abb. 1 B).

    2.2.2 Materialien und Ausrüstung

    E coli Stämme: Rosetta™ 2 (Novagen) oder BL21 (DE3)-pLysS (Novagen) (mit einem Chloramphenicol-Resistenzmarker)

    Expressionsplasmide pET25b(+) (Novagen) (mit einem Ampicillin-Resistenzmarker)

    LB-Agarplatten (ergänzt mit geeigneten Antibiotika)

    2 × Laemmli-Probenpuffer (ergänzt mit 5% β-Mercaptoethanol) (2XSB + BME)

    Lysozym (Stammlösung 20 mg/ml)

    Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Stammlösung 100 ml)m)

    n-Dodecyl-β-d-maltosid (DDM) (Anatrace, USA)

    Triton X100 (T-X100) (Applichem, Deutschland)

    Nonidet P-40 (NP-40) (Applichem, Deutschland)

    Cholesterylhemisuccinat Tris-Salz (CHS) (Anatrace, USA)

    Abschätzung der Proteinkonzentration: Bicinchoninsäure (BCA) Assay (ThermoFisher, USA) oder Bradford Protein Assay (Applichem, Deutschland) Kits

    Coomassie-Blau-Färbelösung (Coomassie Brilliant Blue R-250)

    Penta-his-Antikörper (QIAGEN, Deutschland)

    Inkubationsschüttler (mit einstellbarer Temperatur, von 16 bis 37°C)

    Erlenmeyer Zellkulturflaschen (5 L)

    Wasserbad/Eppendorf ThermoMixer®

    Instrument zur Lyse (Hochdruckhomogenisator Emulsiflex/Französische Presse)

    SDS-PAGE-Migrationssysteme und Blot-System

    Imager ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Vereinigtes Königreich)

    2.2.3 Methoden

    Kompetentes BL21 (DE3)-pLysS oder Rosetta™ 2 . auftauen E coli Zellen auf Eis (die kompetenten Zellen können vorab mit dem CaCl2 Methode (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989).

    Fügen Sie 50 μL kompetente hinzu E coli Zellen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.

    Fügen Sie 1–2 μL Expressionsplasmid (50 ng/μL) zu den kompetenten Zellen hinzu und mischen Sie (eine Negativkontrolle ohne Expressionsplasmid kann parallel durchgeführt werden).

    Inkubieren Sie das Röhrchen für 30 Minuten auf Eis.

    Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Wasserbad bei 42 ° C für 1 Minute.

    Inkubieren Sie das Röhrchen für 2 min auf Eis.

    Inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 2 min.

    450 μl LB-Medium hinzufügen und 1 h bei 37 °C in einem Wasserbad oder Thermomixer inkubieren.

    Verteilen Sie 150 ul transformierte Zellen auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 ul/ml-Amp100) und Chloramphenicol (34 ul/ml-Cm34). Über Nacht bei 37 °C wachsen lassen.

    Vorkulturen: Frisch transformierte Kolonien in einen 1-l-Kolben mit 100 ml LB Amp100 Cm34 (1:1000 Verdünnung für jedes Antibiotikum) inokulieren.

    Bei 37 °C in einem Orbitalschüttler inkubieren, bis die Kulturen eine OD . erreichen600 von etwa 0,6 (3–4 h Wachstum).

    Stellen Sie drei 5-l-Kolben mit 1 l LB Amp100, Cm34 (jeweils) auf eine Schüttelplattform in einem 30 °C-Inkubator. Zum Erwärmen und Belüften schütteln.

    Großkulturen: Beimpfen der Kulturen bei OD600 0,02 (vorgewärmt und vorbelüftet).

    Wachsen bei 30°C bis OD600 0.3/0.4.

    Entfernen Sie eine 1-ml-Probe aus der Kultur (Zellen, die das interessierende Protein nicht exprimieren, „-IPTG“). Spin-down (11 krpm, 1 min), Überstand entfernen, 100 μL 2XSB + BME hinzufügen und bei –20°C für weitere Western-Blot-Analysen lagern. OD aufzeichnen600 der Kultur vor der Induktion.

    Fügen Sie IPTG zu 0,6 m . hinzum Endkonzentration (IPTG-Stammlösung 1 m) und züchte die Kulturen für 16 h bei 16°C. Die Induktorkonzentration und die Induktionsdauer sind Parameter, die vor einer groß angelegten Expression optimiert werden können.

    Kulturen zum Abkühlen in Eis legen (ca. 20 min).

    Entnehmen Sie während des Kühlens eine 1-ml-Probe aus der Kultur (Zellen, die das interessierende Protein exprimieren, „+IPTG“). Spin-down (11 krpm, 1 min), Überstand entfernen, 100 μL 2XSB + BME hinzufügen und bei –20°C lagern. OD aufzeichnen600 der Kultur nach Expressionsinduktion.

    Spin 3 L Kultur in einer vorgekühlten Zentrifuge mit einem geeigneten Rotor für 1-L-Flaschen (3,5 krpm für 15 min).

    Pellet in 1/50 des ursprünglichen Volumens mit eiskaltem Lysepuffer A resuspendieren (ein 3-L-Kulturzellpellet wird in 60 ml Lysepuffer A resuspendiert). Das Resuspensionsvolumen kann entsprechend der Zellkulturdichte nach dem Wachstum über Nacht angepasst werden.

    Übertragen Sie suspendierte Zellen in neue vorgekühlte 50-ml-Röhrchen.

    Flash-Freeze resuspendierte Zellen in flüssigem Stickstoff.

    Bei −80°C lagern. Die Zellen können bei −80°C einige Wochen gelagert oder gleich aufgetaut werden. Der Schockgefrierschritt ist wichtig, um die Zelllyse zu verbessern.

    Zellpellets in Eiswasser auftauen.

    600 μl 10 mg/ml Lysozym hinzufügen (100 μg/ml Endkonzentration).

    600 μL 100 ml hinzufügenm PMSF (1 mm Endkonzentration).

    Inkubieren auf Eis für 30 min unter periodischem Vortexen.

    Zellen mit der gewählten Methode lysieren: Hochdruckhomogenisator Emulsiflex oder French Press sind hier bevorzugte Methoden (zur Reinigung der Emulsiflex-Kammer extra Lysepuffer vorbereiten). Der Auszug sollte klarer werden.

    20 μL entfernen und mit 20 μL 2XSB + BME (Zellextrakt) kombinieren.

    Zellextrakt in 50-ml-Zentrifugationsröhrchen übertragen.

    Zellextrakt in einer vorgekühlten Zentrifuge mit entsprechendem Rotor für 50-ml-Röhrchen (3,5 krpm für 15 min) zentrifugieren.

    Pellet in 60 ml eiskaltem Lysepuffer A resuspendieren. 20 ul entfernen und mit 20 ul 2XSB + BME (ungebrochene Zellen und Einschlusskörperchen) kombinieren.

    Lysepuffer A: 20 mm HEPES pH 7,4, 150 mm NaCl, 5 mlm MgCl2, 10% Glycerin, 1 mlm PMSF.

    Übertragen Sie den Überstand in ein eiskaltes Ultrazentrifugenröhrchen.

    Ernten Sie die Membranen, indem Sie den Überstand bei 50.000 × drehen g für 1 Std.

    Entfernen Sie 20 l Überstand und kombinieren Sie mit 20 l 2XSB + BME (lösliche Proteine).

    Entfernen Sie vorsichtig den Rest des Überstands aus dem Ultrazentrifugationsröhrchen. Versuchen Sie, die gesamte Flüssigkeit zu erhalten und lassen Sie das Pellet intakt.

    4,5 mL Solubilisierungspuffer B zum Pellet geben und mit einem Homogenisierstößel verteilen.

    Solubilisierungspuffer B: 50 mm HEPES pH 7,4, 150 mm NaCl, 15% Glycerin, 1 mlm PMSF.

    Das ausgegebene Pellet mit einem homogenisierenden Pistill vollständig homogenisieren.

    Entfernen Sie 20 ul suspendiertes Pellet und kombinieren Sie mit 20 ul 2XSB + BME (Membranen).

    Flash-Gefrieren der Membranen in flüssigem Stickstoff. Die Membranen können bei − 80°C gelagert oder sofort zur Solubilisierung ohne Schockfrosten verwendet werden. Sind bereits geeignete Solubilisierungsbedingungen bekannt, kann die gesamte Membranfraktion solubilisiert oder Aliquots (200 µl) hergestellt werden, um ein Detergenzscreening durchzuführen.

    Alle gesammelten Proben können durch SDS-PAGE, gefolgt von einer Coomassie-Blau-Färbung (wenn das Protein sehr reichlich vorhanden ist) oder Western-Blotting analysiert werden, um eine ordnungsgemäße Produktion und Anwesenheit in der Membranfraktion sicherzustellen (Abb. 2 A).

    Abb. 2 . E coli GlpG- und humanes RHBDL2-Expressions- und Solubilisierungsbedingungen-Screening. (A) Expression von GlpG-His6 und RHBDL2-His6 und Membranpräparation aus E coli Zellen. Expression wird mit 0,6 m . induziertm IPTG in der Bakterienzellkultur und die Zellen werden 16 h bei 16°C gezüchtet. Expression und Anwesenheit von Fusionsproteinen in der Membranfraktion werden durch Western-Blotting mit dem Penta-His-Antikörper (QIAGEN, Endkonzentration 0,2 ng/μL) validiert. Schwarze Pfeilspitzen entsprechen GlpG-His6, und Pfeilspitzen öffnen entsprechen RHBDL2-His6. (B) Reinigungsmittelbedingungsbildschirm, um GlpG und RHBDL2 zu solubilisieren. Die solubilisierte Proteinfraktion (S) wird mit der unlöslichen Fraktion (IS) verglichen, was zeigt, dass CHS die Löslichkeit von RHBDL2 erhöht.


    Teil I: Lyse von Bakterienzellen

    Zuvor wurden Bakterien mit einem rekombinanten Plasmid transformiert, das in der Lage war, gfp zu exprimieren, wenn Zellen induziert wurden. Der Grund, warum die Zellen zur Proteinproduktion angeregt werden können, liegt darin, dass sich innerhalb des Plasmids vor dem Gen für gfp eine spezielle DNA-Sequenz befindet, die reagiert, wenn eine Chemikalie in das Medium gegeben wird. Diese Chemikalie wird Induktor (ind) genannt und signalisiert, dass das Gen „angeschaltet&rdquo und Messenger-RNA aus den DNA-Anweisungen transkribiert und das Protein hergestellt werden sollte. Das Plasmid enthält auch das selektierbare Ampicillin (amp)-Resistenzgen, um sicherzustellen, dass die in Ihrer Kultur wachsenden Zellen Zellen sind, die Ihr Plasmid enthalten.

    Vor dieser Laborperiode wurden die Zellen in Gegenwart von Ampicillin bis spät in die log-Phase gezüchtet. Die Zellen in Kultur teilen sich und jede Zelle enthält viele Kopien des Plasmids. In der späten log-Phase wurde der chemische Induktor dem Medium zugesetzt, um die gfp Gen und die Zellen durften weiter wachsen und gfp produzieren.

    Zuerst sammeln Sie Ihre Zellen und brechen sie auf. Dieser Vorgang wird Zelllyse genannt. Nachdem die Zellen lysiert sind, verwenden Sie Säulenchromatographie, um gfp zu reinigen.

    MATERIALIEN

    • Mikrozentrifugenröhrchengestell mit den folgenden Röhrchen:
      • LB/Amp/Ind-Kultur von E coli Zellen (EC)
      • Elutionspuffer (EB)
      • Lysepuffer (LyB)

      Ausrüstung und Versorgung

      • P-200 Mikropipette
      • Pipettenspitzenbox
      • Permanent-Marker
      • Mikrozentrifuge (gemeinsam mit der Klasse)
      • Vortex-Mischer (gemeinsam mit der Klasse)
      • Langwelliges UV-Licht
      • Flüssigabfallbehälter
      • Behälter für scharfe Gegenstände
      • Biohazard-Beutel für Materialien, die mit . in Kontakt kommen E coli Zellen (mit der Klasse geteilt)

      Sicherheitserinnerungen

      Es sollten jederzeit geeignete Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Diese werden von Ihrem Ausbilder überprüft und finden Sie am Anfang Ihres Laborhandbuchs, das Sie vor Beginn dieses Verfahrens lesen sollten. Bei der Handhabung ist aseptische Technik erforderlich E coli und Materialien, die mit der Bakterienkultur in Kontakt gekommen sind. Denken Sie daran, dass aseptische Techniken die Verfahren sind, die verwendet werden, um Ihre Kultur und Proben vor Kontamination zu schützen, aber auch Sie zu schützen.

      1. Desinfizieren Sie Ihren Arbeitsbereich und waschen Sie Ihre Hände, bevor Sie mit einem Experiment beginnen.
      2. Berühren Sie niemals etwas, das mit dem E coli. Dazu gehören Pipetten, Spreizer und das Innere von Röhrchen. Pipettenspitzen dürfen nichts außer dem zu übertragenden Material berühren. Spreizer und Pipetten sollten nur an dem Ende gehandhabt werden, das keine Bakterien berührt.
      3. Öffnen Sie beim Umgang mit Petrischalen den Deckel nur so weit, dass Sie mit der Agaroberfläche arbeiten können, und schließen Sie den Deckel dann sofort. Dadurch wird eine Kontamination wie Pilzsporen aus der Luft vermieden, die auf Ihrer Agarplatte landen.
      4. Wenn etwas versehentlich kontaminiert wird, wenden Sie sich an Ihren Lehrer, um zu erkundigen, ob ein Ersatz angemessen und verfügbar ist.
      5. Verschütten vermeiden. Wenn einer auftritt, benachrichtigen Sie sofort Ihren Lehrer, um Hilfe bei der ordnungsgemäßen Reinigung zu erhalten.
      6. Kontaminierte Abfälle wie gebrauchte Mikrozentrifugenröhrchen und Zellspreizer werden in den Biohazard-Beutel gegeben. Pipettenspitzen werden in einen Behälter für scharfe Gegenstände gelegt.
      7. Nur auf Anweisung entsorgen Sie Ihre gebrauchten Petrischalen im Biomüll.
      8. Achten Sie darauf, Ihren Arbeitsbereich zu reinigen und Ihre Hände zu waschen, bevor Sie das Labor verlassen.

      Verfahren

      1. Nehmen Sie ein langwelliges UV-Licht und schauen Sie sich die EC-Röhre an, notieren Sie Ihre Beobachtungen.
      2. Wiegen Sie Ihre EC-Röhre. Suchen Sie nach einem anderen Röhrchen mit einem ähnlichen Gewicht +/- 0,1 g oder erstellen Sie ein Ausgleichsröhrchen für die Mikrozentrifuge.
      3. Zentrifugieren Sie das EC-Röhrchen 5 Minuten lang bei 13.000 U/min (oder so hoher Geschwindigkeit wie möglich) in einer Mikrozentrifuge. Achten Sie darauf, die Rohre richtig auszubalancieren.
      4. Nehmen Sie das EC-Röhrchen sehr vorsichtig aus der Mikrozentrifuge. Vermeiden Sie es, das Zellpellet am Boden des Röhrchens zu stören.
      5. Nehmen Sie die Mikropipette P-200, stellen Sie sie auf 200,0 µl ein und holen Sie sich eine Spitze. Drücken Sie bis zum ersten Anschlag, bevor Sie in den Überstand (Flüssigkeitsschicht) gehen, und ziehen Sie das alte flüssige Nährmedium vorsichtig heraus. Dabei das Zellpellet nicht stören.
      6. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in den Abfallbehälter und die Spitze in den Behälter für scharfe Gegenstände.
      7. Bringen Sie Ihr Zellpellet (das EC-Röhrchen) zu Ihrem Lehrer, um 1 ml derselben Kultur in Ihr Röhrchen zu geben.
      8. Wiederholen Sie die Schritte 2-6, zentrifugieren Sie die Zellen also erneut für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Notieren Sie die Farbe des Überstands und des Pellets in diesem Schritt.
      9. Nehmen Sie die Mikropipette P-200 und eine neue Spitze und versuchen Sie vorsichtig, die gesamte Flüssigkeit aus dem Pellet zu entfernen, ohne die Zellen aufzunehmen. Entsorgen Sie die Spitze in scharfen Gegenständen.
      10. Stellen Sie den P-200 auf 150,0 µL und holen Sie sich eine neue Spitze. Gib 150 &mgr;l Elutionspuffer (EB) in das EC-Röhrchen. Entsorgen Sie die Spitze.
      11. Das EC-Röhrchen fest verschließen und das Zellpellet mit einem Vortexer resuspendieren. Wenn keines verfügbar ist, ziehen Sie das Röhrchen schnell über ein leeres Mikrozentrifugenröhrchengestell. Dadurch sollte sich das Zellpellet vom Boden des Röhrchens lösen und der Puffer sollte trüb werden. Wiederholen Sie diese Bewegung, bis das gesamte Pellet verschwunden ist.
      12. Nimm den P-200 und hol dir einen neuen Tipp. Gib 150 &mgr;l Lysepuffer (LyB) in das EC-Röhrchen. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens mit einem Vortexer oder der Mikrozentrifugenröhrchen-Rack-Methode wie zuvor.
      13. Das EC-Röhrchen wird über Nacht bei Raumtemperatur im Lysepuffer inkubiert. Beschriften Sie Ihre Tube mit dem Kurszeitraum und der Gruppennummer und geben Sie Ihrem Lehrer diesen Schritt.
      14. Reinigen Sie Ihren Arbeitsbereich und entsorgen Sie alle kontaminierten Röhrchen und Spitzen in den entsprechenden biogefährlichen Abfall.

      Western Blot von Bakterien - Benötigen Sie einige Ratschläge zur Durchführung eines Western Blots von Bakterien (Mai/06/2008 )

      Hallo, ich bin neu hier und habe ein paar Fragen zur Durchführung eines Western Blots von Bakterien:

      Sobald Antikörper für mich hergestellt sind, werde ich einen Western Blot auf Legionella pneumophila durchführen. Ich habe noch nie in meinem Leben Protein-Arbeit gemacht.

      Während ich auf die Ankunft der Antikörper in etwa einem Monat warte, möchte ich die Bakterien vorbereiten, indem ich sie in Brühe bis zur mittleren späten Log-Phase züchte (klingt das bis jetzt richtig?). Ich möchte dann ein Aliquot der Zellkultur pelletieren (ich gehe von 1-2 ml aus) und dann für die Lyse zu einem späteren Zeitpunkt einfrieren. Meine Frage für jetzt bezieht sich auf die Vorbereitung und das Einfrieren des Bakterienzellpellet (bei -70 ° C), wobei das Wachstumsmedium natürlich entfernt wird.Sollte ich das Pellet in einer Art Puffer resuspendieren? (1x PBS vielleicht) Oder kann ich das Pellet einfach allein einfrieren, ohne bei -70 ° C zu resuspendieren?

      Falls jemand irgendwelche Artikel/Protokolle hat, wäre das eine große Hilfe für mich.

      Vielen Dank für Ihre Zeit an alle, die dazu beitragen.

      Früher habe ich das Pellet direkt in Laemmli-Puffer resuspendiert. Es ist der beste Weg, um die meisten Proteine ​​zu solubilisieren.
      Unter diesen Bedingungen können Sie jedoch keine Proteintitration durchführen.

      Das zweite Ergebnis hat eine Antwort für Sie. Ich denke, es sollte für alle Bakterien gleich sein, kann aber nicht sicher sein.

      Während ich auf die Ankunft der Antikörper in etwa einem Monat warte, möchte ich die Bakterien vorbereiten, indem ich sie in Brühe bis zur mittleren späten Log-Phase züchte (klingt das bis jetzt richtig?). Ich möchte dann ein Aliquot der Zellkultur pelletieren (ich gehe von 1-2 ml aus) und dann für die Lyse zu einem späteren Zeitpunkt einfrieren. Meine Frage für jetzt bezieht sich auf die Vorbereitung und das Einfrieren des Bakterienzellpellet (bei -70 ° C), wobei das Wachstumsmedium natürlich entfernt wird. Sollte ich das Pellet in einer Art Puffer resuspendieren? (1x PBS vielleicht) Oder kann ich das Pellet einfach allein einfrieren, ohne bei -70 ° C zu resuspendieren?

      Wenn jemand irgendwelche Artikel/Protokolle hat, wäre das eine große Hilfe für mich.

      Vielen Dank für Ihre Zeit an alle, die dazu beitragen.
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      Nach meiner Erfahrung können Sie das Pellet aus 1 ml der Kultur bei -20°C oder -70°C lagern, wenn Sie es einen Monat lang lagern möchten, bevor Sie jedes Pellet in Lysepuffer resuspendieren, mit dem Ziel, die lösliche Fraktion von der unlöslichen zu trennen einer. In diesem Fall können Sie die Proteinkonzentration im Lysat mit dem Bradford- oder BCA-Protokoll überprüfen. Wenn Sie jedoch die löslichen Proteine ​​nicht vom gesamten Lysat trennen müssen, sollten Sie es vorziehen, jedes Pellet in Probenpuffer proportional zur OD der Kultur zu resuspendieren. Auf diese Weise ist es einfacher und schneller, Sie müssen die Zelle nicht mit Beschallung oder anderem aufbrechen, einfach zentrifugieren und die Kultur in Probenpuffer resuspendieren, Proben kochen und auf die SDS-Seite für Western Blot laden!


      Praktische Tipps, um Ihr Labor nachhaltiger zu machen

      Wenn Sie in den letzten 10 Jahren in einem zellbiologischen Labor Laborarbeit geleistet haben, haben Sie mit ziemlicher Sicherheit ein Produkt namens Mini-Prep-Kit verwendet, um Plasmid-DNA aus einer Bakterienkultur zu reinigen. Je nachdem, wie viele Samples Sie haben, kann es eine Weile dauern und es ist irgendwie langweilig: pipettieren, drehen, pipettieren, spinnen. Vielleicht weil es langweilig ist, wenn ich Mini-Vorbereitungen mache, wandern meine Gedanken normalerweise ab. Im Laufe der Jahre fing ich an, das Standardprotokoll eher so zu lesen:

      Pelletbakterien in a Plastik Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet in Puffer 1 . resuspendieren mit einer Pipettenspitze aus Kunststoff. Puffer hinzufügen 2 mit einer Pipettenspitze aus Kunststoff. Mischen. Warte ab. Puffer hinzufügen 3 mit einer Pipettenspitze aus Kunststoff. Mischen. Drehen. Überstand hinzufügen zu Plastik Spalte in a Plastik Aufnahmerohr. Drehen. Entsorgen Plastik Mikrozentrifugenröhrchen. Waschpuffer mit a . zugeben Plastik Pipettenspitze. Drehen. Waschpuffer hinzufügen mit einer Pipettenspitze aus Kunststoff. Drehen. Entsorgen Plastik Aufnahmerohr. Spalte in neu platzieren Plastik Mikrozentrifugenröhrchen. Elutionspuffer hinzufügen mit einer Pipettenspitze aus Kunststoff. Warte ab. Drehen.

      Nach dem letzten Dreh bleibt mir immer ein kleiner Berg aus Plastikröhrchen und Pipettenspitzen. Diese Beobachtung lenkte meine Aufmerksamkeit auf die große Menge an verbrauchbaren Einmalartikeln, die wir täglich im Labor verwenden.

      Wie viele Pipettenspitzen gehen Sie durch? Foto von Retama

      Natürlich sind diese Elemente für die Forschung unerlässlich. Sie sind ein Teil dessen, was es uns ermöglicht, mit der Strenge und Sorgfalt zu arbeiten, die für genaue und gut kontrollierte Experimente entscheidend sind. Reagenzien und Experimente müssen rein, definiert und nicht kontaminiert sein, und es ist kostspielig, nützlich und energieeffizient, dies beizubehalten. Trotz dieses Wissens fühle ich mich immer noch schuldig wegen der ökologischen Auswirkungen meiner Forschung und frage mich, ob ich noch mehr tun könnte.

      Vor ungefähr einem Monat habe ich einen Tweet über einen Nachhaltigkeitsgipfel gesehen, der von einer gemeinnützigen Organisation namens My Green Lab abgehalten wird. Ich war aufgeregt! Erstens ist die Tatsache, dass diese Initiative existiert, ein Beweis für das, was ich bereits wusste: Viele Mitglieder der wissenschaftlichen Gemeinschaft denken aktiv darüber nach, wie ihre Arbeit (nicht nur ihre brillanten Entdeckungen) die Welt beeinflusst. Zweitens war mein Zeitplan klar und die Veranstaltung war in der Nähe.

      Ich war am Tag der Veranstaltung nicht in der Lage, wegzukommen, aber das Meeting wurde per Live-Stream übertragen und ich sah von meinem Schreibtisch aus zu. Erika Daley, eine Programmmanagerin von My Green Lab, war die erste Rednerin, die einige Fakten über das Problem darlegte: Laborräume verbrauchen ungefähr das Fünffache der Energie wie Büroräume pro Quadratfuß Fläche und produzieren schätzungsweise 12,1 Milliarden Pfund Plastik Abfall weltweit, ein einziger –80 (oder Ultra-Low-Temperatur, ULT) Gefrierschrank kann so viel Energie pro Tag verbrauchen wie ein Haus, und ein Abzug verbrennt jedes Jahr die äquivalente Energiemenge wie 1.733 Gallonen Benzin.

      Huch! Jedes Labor, in dem ich je gearbeitet habe, hatte mindestens einen –80 und einen Abzug. Ich denke das, als ich hektisch anfing, die Zahlen auf dem Boden des Gebäudes, in dem ich saß, zu zählen.

      Als nächstes sprach sie über die fünf wichtigsten Dinge, die Sie tun können, um Ihr Labor nachhaltiger zu machen. Jawohl! Ich dachte, auf den Punkt gebracht:

      1) Kühlhaus. Da Ultratiefkühlgeräte so viel Energie verbrauchen, kann gezieltes Handeln hier einen großen Unterschied machen. Wenn die Temperatur von -80 um 10 Grad auf -70 erhöht werden kann, kann der Energieverbrauch um 30-40% gesenkt werden. Wenn Sie einen neuen Ultratiefkühlschrank kaufen, achten Sie darauf, einen energieeffizienten zu kaufen, und alle Labore können die Nutzung ihres gesamten Gefrierraums maximieren, indem sie ein durchsuchbares elektronisches Inventar führen (Google Docs, Quartz usw.).

      2) Schalten Sie nicht verwendete Geräte aus. Ziemlich einfach, aber meiner Erfahrung nach nicht unbedingt eine gängige Praxis.

      3) Grüne Chemie. Diese habe ich weniger verstanden (im Gegensatz zu Erika bin ich keine ausgebildete Chemikerin), aber die allgemeine Idee ist, chemische Abfälle mit den sichersten und nachhaltigsten Verfahren zu entsorgen (mehr hier und hier).

      4) Schließen des Flügels des Laborabzugs bei Nichtgebrauch spart Energie, indem die Lüfterdrehzahl und die Abluftmenge gesenkt werden.

      5) Kostengünstige Luftsprudler an Wasserhähnen installieren senkt den Wasserverbrauch. Sie kosten weniger als 5 US-Dollar und können den Wasserverbrauch um 50-70 % senken.

      Einige dieser Praktiken, wie der Kauf eines energieeffizienten Gefrierschranks und die Installation von Belüftern, würden, wenn sie in neuen Labors implementiert würden, einen nachhaltigen Unterschied machen, ohne jemals wieder bemerkt oder daran gedacht zu werden. Andere, wie das Schließen des Laborabzugs und das Praktizieren einer abfallarmen Chemikalienhygiene, erfordern ein verändertes Forscherverhalten.

      Hier kam der zweite Vortrag von Ellen B. Garcia, einer Doktorandin des Department of Biological Sciences an der Virginia Tech, ins Spiel. Ihre Geschichte begann damit, ihr eigenes Verhalten und das Verhalten ihrer Forschungsgruppe zu ändern, und verbreitete sich dann auf andere Labore auf dem Campus. Durch beharrliche Bemühungen an der Basis und kreative Problemlösung organisierte sie eine Green-Lab-Bewegung an der Virginia Tech, die zur Implementierung von Recycling-, Wiederverwendungs- und Niedrigenergienutzungsprogrammen in Laboren auf dem gesamten Campus führte. Sie beschrieb auch Gespräche mit Vertretern von biologischen Versorgungsunternehmen und den Kauf von Produkten, die den festen Abfall ihrer Produkte wiederverwenden und recyceln würden. Ihre Geschichte über ihre persönliche Fürsprache und die Veränderung, die sie verkörperte, war eine inspirierende Erinnerung an die Auswirkungen, die eine einzelne, motivierte Person auf ein scheinbar unüberwindbares Problem haben kann.

      Von Tonya Randell, einer Programmmanagerin bei More Recycling, erfuhr ich, dass Recycling komplexer ist, als ich es mir vorgestellt hatte, und dass das Recycling von Gegenständen, die in der Laborwissenschaft verwendet werden, mit zunehmenden Herausforderungen verbunden ist. Wie Sie sich vorstellen können, sollten Gegenstände, die mit potenziell schädlichen Stoffen verwendet wurden, nicht in einer Form recycelt werden, in der sie möglicherweise Personen schaden könnten, die damit in Kontakt kommen könnten. Einige der Kunststoffe, die wir im Labor verwenden, stellen auch eine Herausforderung für das Recycling dar: Sie können strukturell und chemisch modifiziert werden, um Hitze und Zersetzung zu widerstehen. Viele Artikel, die wir für die Molekularbiologie verwenden (wie die in meinem Berg aus Mini-Prep-Kunststoff) sind für das konventionelle Recycling zu klein, weil der erste Schritt des Prozesses die zu recycelnden Materialien über ein riesiges Netz führt. Das bedeutet, dass Gegenstände wie Pipettenspitzen durch das Netz fallen und auf einer Deponie landen würden. Aber viele Dinge des täglichen Bedarfs in unseren Laboren können recycelt werden: Versandkartons, Druckerpatronen, Styroporkartons und Erdnüsse zum Beispiel.

      Wenn Sie mehr über die Möglichkeiten und die Bemühungen von My Green Lab erfahren möchten, finden Sie auf deren Website viele hilfreiche Informationen. Erkundigen Sie sich auch an Ihrer Universität nach einem bestehenden Nachhaltigkeitsprogramm für Labore. Meine Institution hatte ein Zertifizierungsprogramm, von dem ich zuvor noch nichts gehört hatte. Wenn Sie einen heißen Tipp zu Wiederverwendungs-, Recycling- oder Nachhaltigkeitspraktiken haben, die Sie in Ihrem Labor anwenden, teilen Sie uns dies bitte in den Kommentaren unten mit.

      Es ist leicht, sich hilflos zu fühlen, wenn die globale Umwelt um uns herum zu zerfallen scheint. Diese Woche wurde ich jedoch daran erinnert, dass Wissenschaftler bei der Modellierung von Verhaltensweisen, die Energie sparen und Abfall reduzieren, führend sein sollten. Als Zellbiologen arbeiten wir daran, Geheimnisse der unglaublichen Biologie unserer einzigen Erde zu enthüllen, und es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass wir gleichzeitig danach streben können, sie zu retten.

      Offenlegung: Ich habe keine Verbindung zu My Green Lab. Ich habe eine bescheidene Anmeldegebühr (15 USD) aus eigener Tasche bezahlt, um am Sustainability Summit teilzunehmen, der am 15. Oktober 2018 stattfand.

      Die in diesem Blog geäußerten Ansichten und Meinungen sind die Ansichten der Autoren und stellen nicht die offizielle Politik oder Position von ASCB dar.


      PROTOKOLL:

      1. ALLGEMEINE REAGENZIEN UND MEDIENVORBEREITUNG FÜR DIE MEMBRANEXTRAKTION

      1.1 Bakterielle Wachstumsmedien: Bereiten und sterilisieren Sie 1 l Nährmedium in einem gründlich gereinigten und autoklavierten 2-l-Kolben.

      1.2. Allgemeiner Resuspensionspuffer (1 M Tris-Puffer pH 7,5 50 ml): 6,05 g Trisbase in 30 ml H . auflösen2O. Stelle den pH mit 5 M HCl auf 7,5 ein. Endvolumen mit hochreinem H . auf 50 ml einstellen2Ö.

      1.3. Masterstock der Chelatisierungslösung für zweiwertige Kationen (0,5 M EDTA pH 8 100 ml): 18,6 g Dinatriumethylentetraacetat୲H . hinzufügen2O bis 80 ml H2O. Kräftig rühren und pH mit NaOH auf 8,0 einstellen. Endvolumen mit hochreinem H . auf 100 ml einstellen2Ö.

      Hinweis: Das Dinatriumsalz von EDTA löst sich erst auf, wenn der pH-Wert der Lösung auf . eingestellt ist

      8,0 durch Zugabe von NaOH.

      1.4. Osmotischer Puffer A (0,5 M Saccharose, 10 mM Tris pH 7,5 1 L): 171,15 g Saccharose abwiegen und in einen 1-l-Zylinder überführen. 10 ml 1 M Tris pH 7,5 hinzufügen. Mit hochreinem H . auf ein Endvolumen von 1 L einstellen2O. Bei 4 ଌ lagern.

      1.5. Lysozym (10 mg/ml 5 ml): 50 mg (Hühnereiweiß) Lysozym abwiegen und in 5 ml hochreinem H . auflösen2O. Bei 4 ଌ lagern.

      1.6. Verdünnte Chelatisierungslösung für zweiwertige Kationen (1,5 mM EDTA 500 ml): Fügen Sie 1,5 ml 0,5 M EDTA (Schritt 1.3) zu 497,5 ml hochreinem H . hinzu2O. Bei 4 ଌ lagern.

      1.7. Osmotischer Puffer B (0,2 M Saccharose, 10 mM Tris pH 7,5 2 L): 136,8 g Saccharose abwiegen und in einen 2-Liter-Zylinder überführen. 20 ml 1 M Tris pH 7,5 hinzufügen. Endvolumen mit hochreinem H . auf 2 l einstellen2O. Bei 4 ଌ lagern.

      1.8. Nuclease-Cofaktor (1 M MgCl2 10ml): 2,03 g MgCl . auflösen2୶H2O in 8 ml hochreinem H2O. Stellen Sie das Volumen auf 10 ml ein. Bei Raumtemperatur lagern.

      1.9. Nukleaselösung Cocktail mit RNase- und DNase-Enzymen (siehe Reagenzientabelle). Shop unter � ଌ.

      NameGesellschaftKatalognummerKommentare
      1 L Zentrifugenflaschen, PC/PPCO, super speed, mit Verschlusskappe, NalgeneVWR525�
      1 L Pyrex-Medienaufbewahrungsflasche mit HochtemperaturverschlussVWR10416�
      2.000 ml Erlenmeyerkolben, schmaler MundVWR10545�
      4�% mini PROTEAN Fertigproteingele, 12 VertiefungenBIORAD4561095
      4x Laemmli Probenpuffer 10 mlBIORAD1610747
      50 ml sterile Polypropylen-ZentrifugenröhrchenVWR89049�
      7 ml Dounce-Gewebehomogenisator mit zwei GlasstößelnVWR71000�
      70-ml-Polycarbonat-FlaschenbaugruppeBeckman Coulter Life Sciences355622
      Agar PulverVWRA10752
      B10P pH-Tischmessgerät mit pH-SondeVWR89231�
      Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (Bankversion)ThermoFisher Scientific50136146
      Benzonase-NukleaseMilliporeSigma70746𠄳
      EDTA Dinatriumsalz dehydratisiert 99,0�,0%, Kristalle, ultrareines Bioreagenz Molekularbiologiequalität, J.T. BäckerVWR4040�
      EmulsiFlex-C3Avestin, Inc.
      Fiberlite F13� × 50cy FestwinkelrotorThermoFisher Scientific75006526
      Salzsäure 6,0 NVWRBDH7204
      IBI Scientific Orbitaler PlattformschüttlerFischer Scientific15-453-211
      LB Brühe MillerVWR214906
      Lysozym, Eiweiß, ultrareine QualitätVWRVWRV0063
      Magnesiumchlorid HexahydratSigma AldrichM2670
      NADHSigma Aldrich10107735001
      Optima XPN-80 - IVDBeckman Coulter Life Sciences <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"A99839","term_id":"25392059","term_text":"pir||A99839">> A99839
      Pharmco Products PURE ALKOHOL 200 PROOF GL 4/CSFischer ScientificNC1624582
      Phenollösung, äquilibriert mit 10 mM Tris HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, BioReagenz, für die MolekularbiologieSigma - MilliporeP4557
      Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay-KitThermofischer23238
      Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharid-Gel-Flecken-KitThermofischer <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"P20495","term_id":"138373","term_text":"P20495">> P20495
      Proteacease �, EDTA freiG Biowissenschaften786�
      Proteinase K, molekularbiologischer GradNew England BiolabsP8107S
      Natriumhydroxid 㺙,99%VWRAA45780�
      Sorval RC 6 Plus ZentrifugeThermoFisher Scientific36-101-0816
      SaccharoseMilliporeSigmaSX1075𠄳
      SW 41 Ti AusschwingrotorBeckman Coulter Life Sciences331362
      Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS, Trometamol) �,9 % (getrocknete Basis), ultrareines Bioreagenz Molekularbiologiequalität, J.T. BäckerVWRJT4109𠄶
      Typ 45 Ti Titan-FestwinkelrotorBeckman Coulter Life Sciences339160
      Ultraklares Rohr, 14 × 89mmBeckman Coulter Life Sciences344059
      Vortex-Genie 2VWR102091�

      1.10. Protease-Inhibitor Cocktail (siehe Reagenzientabelle ). Bei 4 ଌ lagern.

      1.11. Isopyknische Saccharose-Gradientenlösung mit niedriger Dichte (20% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 Lösung 100 ml): 20 g Saccharose abwiegen und in einen 200-ml-Zylinder überführen. 100 μL 1 M Tris-Puffer pH 7,5 und 200 μL 0,5 M EDTA pH 8 zugeben. Endvolumen mit ultrareinem H . auf 100 mL einstellen2O. Bei Raumtemperatur lagern.

      1.12. Isopyknische Saccharose-Gradientenlösung mittlerer Dichte (53 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 Lösung 100 ml): 53 g Saccharose abwiegen und in einen 200 ml Messzylinder überführen. 100 μL 1 M Tris-Puffer pH 7,5 und 200 μL 0,5 M EDTA pH 8 zugeben. Endvolumen mit ultrareinem H . auf 100 mL einstellen2O. Bei Raumtemperatur lagern.

      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, diese Lösung in einem Messzylinder herzustellen, um die Genauigkeit aufgrund des hohen Anteils an Saccharose zu gewährleisten. Fügen Sie einen Magnetrührstab hinzu und rühren Sie, bis die Saccharose vollständig in Lösung gelöst ist. Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern.

      1.13. Isopyknische Saccharose-Gradientenlösung mit hoher Dichte (73 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 Lösung 100 ml): 73 g Saccharose abwiegen und in einen 200 ml Messzylinder überführen. 100 μL 1 M Tris-Puffer pH 7,5 und 200 μL 0,5 M EDTA pH 8 zugeben. Endvolumen mit ultrareinem H . auf 100 mL einstellen2O. Bei Raumtemperatur lagern.

      Hinweis: Es ist sehr wichtig, diese Lösung in einem Messzylinder herzustellen, um die Genauigkeit aufgrund des hohen Anteils an Saccharose zu gewährleisten. Fügen Sie einen Magnetrührstab hinzu und rühren Sie, bis die Saccharose vollständig aufgelöst ist. Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern.

      1.14. Isolierte Membran-Lagerpuffer (10 mM Tris Buffer pH 7,5 1 L): 1 ml 1 M Tris-Puffer pH 7,5 in einen 1-l-Kolben geben und das Endvolumen mit ultrareinem H . auf 1 l einstellen2Ö.

      1.15 β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) (10 mg/ml-Lösung). 10 mg . resuspendieren von NADH in hochreinem H2O. Bereiten Sie wöchentlich frische Vorräte vor. Shop unter � ଌ.

      1.16 Phenollösung. Äquilibriert mit 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, für die Molekularbiologie (siehe Reagenzientabelle). Bewahren Sie die Lösung bei 4 ଌ auf.

      1.17 Pro-Q ™ Emerald 300 Lipopolysaccharid Gel Färbekit (siehe Reagenzientabelle ).

      1.18. Bradford-Reagenz (siehe Reagenzientabelle)

      Hinweis: Alle Lösungen und Medien sollten innerhalb einer Woche nach Durchführung des Assays hergestellt werden, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.

      2. VORBEREITUNG VON BAKTERIEN FÜR DIE MEMBRANEXTRAKTION

      2.1. Streichen Sie die Bakterien aus gefrorenen Glycerinbeständen auf frische Agarplatten. Lagern Sie die Platten bei 4 °C, sobald sich Kolonien entwickelt haben. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in ein 5-ml-Röhrchen mit Nährmedium gefüllt und kultivieren Sie die Bakterien wie gewünscht über Nacht.

      2.2. Verdünnen Sie die Bakterienkultur über Nacht in 1 L des bevorzugten Nährmediums und kultivieren Sie die Bakterien, bis die gewünschte optische Dichte erreicht ist.

      Hinweis: Das Beimpfen einer einzelnen Bakterienkolonie in 1 l Nährmedium wird für mutierte Genotypen empfohlen, die dazu neigen, Wachstumsphänotypen zu unterdrücken, aber einige gramnegative Bakterien wachsen einfach langsamer als andere. Wenn es nicht möglich ist, eine ausreichende Kulturdichte durch Einzelkolonie-Inokulation zu erreichen, ist die Rückverdünnung einer Übernachtkultur in 1 L Medium eine Strategie zur Wachstumssynchronisierung. Die Zusammensetzung der Bakterienmembran variiert in Abhängigkeit von der Wachstumsphase der Kultur (logarithmische vs. stationäre Phase) 13 . Wachstumskurven, die die Änderung der optischen Dichte für die Bakterienkulturen als Funktion der Zeit messen, sollten mit allen Stämmen durchgeführt werden, um die Kulturdichte mit der Wachstumsphase zu korrelieren.

      2.3. Stellen Sie die Flaschen mit den Brühenkulturen auf Eis. Lesen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und berechnen Sie das Kulturvolumen, das zwischen 6,0 und 8,0휐 11 Bakterienkolonien bildende Einheiten (KBE) entspricht. Zum S. Typhimurium, dies entspricht 1 L Kultur bei einer OD600 zwischen 0.6𠄰.8, da ein OD600 von 1,0 entspricht ungefähr 1,0휐 9 KBE/ml. Geben Sie dieses Volumen in ein Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass die restlichen Kulturen bis zur Verwendung auf Eis bleiben.

      2.4. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 4 ଌ bei 7.000�.000 × g in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit festem Winkel für 10 Minuten.

      Hinweis: Zentrifugen vorkühlen und auf niedriger Temperatur halten. Halten Sie die Proben während des gesamten Verfahrens auf Eis.

      2.5 Dekantieren und verwerfen Sie den Überstand sorgfältig.

      Hinweis: Das Pellet kann schockgefroren und/oder bei � ଌ gelagert werden, wenn die Membranfraktionen nicht sofort extrahiert werden.Es wird jedoch empfohlen, die Plasmolyse direkt am Tag der Zellernte durchzuführen, und wird insbesondere für nicht-enterobakterielle Spezies empfohlen.

      3. DISOZIATION DER ÄUSSEREN MEMBRANE UND PLASMOLYSE.

      3.1 Tauen Sie die Zellpellets auf Eis auf, wenn sie zuvor bei � ଌ gelagert wurden, und bewahren Sie die Proben für den Rest des Verfahrens auf Eis auf. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet im Zentrifugenröhrchen in 12,5 ml Puffer A. Fügen Sie der Zellsuspension einen Magnetrührstab hinzu.

      3.2. 180 µl 10 mg/ml Lysozym (Endkonzentration 144 µg/ml) zu jeder Zellresuspension hinzufügen. Halten Sie die Proben unter Rühren für 2 min auf Eis.

      3.3. Fügen Sie 12,5 ml 1,5 mM EDTA-Lösung zu jeder Zellresuspension hinzu und rühren Sie weitere 7 Minuten auf Eis weiter.

      3.4. Dekantieren Sie die Suspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 9000 � × g für 10 Minuten bei 4 ଌ.

      3.5. Entsorgen Sie die Überstände in einen Abfallbehälter für biologische Gefahrenstoffe und bewahren Sie die Pellets auf Eis auf.

      3.6. 25 ml Puffer B zum Zellpellet geben

      3.7. 55 μl von 1 M MgCl . hinzufügen2, 1 μl RNase/DNase-Nukleasereagenz (um Viskositätsprobleme im Zusammenhang mit Bakterien zu vermeiden, die vor der Homogenisierung einer Plasmolyse unterzogen werden) und 1 μl Protease-Inhibitor-Cocktail auf das Volumen von Puffer B, der sich auf dem Zellpellet befindet

      3.8. Resuspendieren Sie das Pellet in der Puffer B-Mischung. Pipettieren und vortexen Sie kräftig, bis Sie eine homogene Lösung erhalten.

      Hinweis: Es ist sehr wichtig, eine homogene Lösung zu haben, bevor Sie mit Schritt 4 dieses Protokolls fortfahren. Die resuspendierten Zellen sollten ein viskoses kuchenteigartiges Aussehen und Konsistenz aufweisen.

      3.9. Jede Probe 15 Sekunden vortexen. Bewahren Sie die Pellets auf Eis auf und fahren Sie mit Schritt 4 fort.

      4. DRUCKHOMOGENISIERUNG UND LYSE

      Hinweis: Für die Lyse können mehrere Methoden verwendet werden. Die Beschallung ist aufgrund der Wärmeentwicklung nicht ideal. Osmotische Lyse kann erreicht werden, ist aber oft ineffizient. Daher empfehlen wir die Hochdrucklyse. Die Hochdrucklyse kann mit einer Vielzahl von Instrumenten erreicht werden. Wir empfehlen Homogenisierungsmaschinen wie die French Press oder die Emusliflex. Wir arbeiten mit vielen Arten gramnegativer Bakterien, deren Reaktion auf hochosmolare Saccharoselösungen unterschiedlich ist. Der Hochdruckhomogenisierungsschritt verbessert Effizienz, Reproduzierbarkeit und Ausbeute.

      4.1 Die French-Press-Zelle bei 4 ଌ vorkühlen oder die Metallspirale aus der Emulsiflex-Maschine auf Eis einlegen.

      4.2 Gießen Sie die Probe in die French-Pressure-Zelle oder den Emulsiflex-Probenzylinder und bringen Sie die Zelle unter den gewünschten Homogenisierungsdruck (10.000 psi sollten bei Verwendung einer French Press oder 20.000 psi bei Verwendung einer Emulsiflex ausreichend sein).

      4.3 Stellen Sie die Auslassflussrate auf ungefähr einen Tropfen pro Sekunde ein, während Sie den Druck beibehalten, wenn Sie eine French Press verwenden.

      4.4 Sammeln Sie das Zelllysat in 50 ml konischen Röhrchen, während Sie die Proben auf Eis halten.

      4.5 Wiederholen Sie die Schritte 4.2𠄴.4 drei- bis fünfmal, um eine vollständige Lyse zu erreichen, die normalerweise durch eine allmähliche Erhöhung der Transparenz der Probe angezeigt wird.

      Hinweis: Die Probenkammer sollte zwischen den Proben mit Puffer B gewaschen und äquilibriert werden.

      4.6 Bewahren Sie lysierte Zellen auf Eis auf.

      5. GESAMTMEMBRANFRAKTION

      5.1. Zentrifugieren Sie die lysierten Bakterienproben bei 6169 × g für 10 min bei 4 ଌ, um verbleibendes intaktes Zellmaterial zu pelletieren. (z.B. unlysierte Bakterienzellen)

      5.2. Verteilen Sie den restlichen Teil des Überstands, der jetzt die homogenisierten Membranen enthält, in eine Polycarbonatflasche für die Ultrazentrifugation.

      ACHTUNG: Bei Bedarf können Zellproben durch Verdünnen mit Puffer B ausgeglichen werden.

      5.3. Ultrazentrifugieren Sie die Zelllysate bei 184.500 × g für mindestens 1 h bei 4 ଌ. Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, ohne die Qualität der Membranen zu beeinträchtigen.

      5.4. Den im Ultrazentrifugenröhrchen vorhandenen Überstand verwerfen und die Membranpellets auf Eis aufbewahren. ( Abb. 1 )

      5.5 Resuspendieren Sie die Membranpellets in 1 ml der Isopycnic-Saccharose-Gradientenlösung mit niedriger Dichte mit einem Glass-Dounce-Homogenisator. Verwenden Sie eine Glas-Pasteur-Pipette, um das Probenhomogenat in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen und auf Eis zu halten.

      HINWEIS: Wenn nur die Analyse der Gesamtmembranzusammensetzung gewünscht wird, ersetzen Sie 1 ml Isopyknischer-Saccharose-Gradientenlösung mit niedriger Dichte durch 1 ml Lagerpuffer mit isolierter Membran. Schritt 5.5 ist der Endpunkt der Isolierung, wenn nur Gesamtbakterienmembranproben gewünscht werden. Lagern Sie die Proben bei � ଌ, bis eine weitere nachgeschaltete Analyse erforderlich ist.

      6. ULTRAZENTRIFUGATION MIT DICHTEGRADIENT ZUR TRENNUNG DER DOPPELMEMBRANEN

      6.1 Stellen Sie die geeignete Anzahl von 13-ml-Polypropylen- oder ultraklaren offenen Röhrchen zusammen, die für einen Ausschwingrotor und eine Ultrazentrifuge angegeben sind.

      6.2. Halten Sie das Röhrchen leicht geneigt und bereiten Sie den Saccharosegradienten vor, indem Sie langsam Saccharoselösungen von höherer Dichte zu niedrigerer Dichte in der folgenden Reihenfolge hinzufügen:

      - 2 ml 73 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5

      - 4 ml 53 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5

      - Als nächstes fügen Sie die gesamte Membranfraktion (1 ml) hinzu, die in der 20% w/v Saccharoselösung resuspendiert wurde (Schritt 5.5). Vermischen Sie die Membranfraktion nicht mit der darunter liegenden Saccharoselösung. Zwischen jeder dieser Schichten sollten Unterteilungen sichtbar sein. Füllen Sie schließlich das Röhrchen mit der Isopyknischen-Saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte (ca. 6 mL). Polypropylen- und ultraklare Open-Top-Röhrchen sollten so voll wie möglich (2 oder 3 mm von der Röhrchenoberseite) zur Röhrchenunterstützung gefüllt werden.

      Anpassung für Acinetobacter baumannii 17978

      Ein angepasster Saccharosegradient kann für die Verwendung mit verschiedenen Bakterienproben angepasst werden. Zum A. baumannii, lieferte der folgende Saccharosegradient eine vollständigere Trennung der Membranen ( 2 ).

      - 2 ml 73 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5

      - 4 ml 45 % Gew./Vol. Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5

      - Als nächstes fügen Sie die gesamte Membranfraktion (1 ml) hinzu, die in der 20% w/v Saccharoselösung resuspendiert wurde (Schritt 5.5). Vermischen Sie die Membranfraktion nicht mit der darunter liegenden Saccharoselösung. Zwischen jeder dieser Schichten sollten Unterteilungen sichtbar sein. Füllen Sie schließlich das Röhrchen mit einer Isopyknischen-Saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte (ca. 6 ml). Polypropylen- und ultraklare Open-Top-Röhrchen sollten so voll wie möglich (2 oder 3 mm von der Röhrchenoberseite) zur Röhrchenunterstützung gefüllt werden.

      6.3. Die Proben mit einem Ausschwingrotor bei 288.000 × g und 4 ଌ über Nacht ultrazentrifugieren.

      Hinweis: Für die in den vorherigen Schritten verwendeten Volumina empfehlen wir 16 h < Zentrifugationszeit < 23 h.

      ERNTE UND WASCHEN DER MEMBRANEN ZUM ENTFERNEN DER SACCHAROSE

      6.4. Schneiden Sie das Ende einer P1000-Pipettenspitze etwa 5 mm von der Spitze entfernt ab. Entfernen Sie die obere braune IM-Schicht mit der Pipette. Übertragen Sie die IM-Fraktion in eine Polycarbonatflasche zur Ultrazentrifugation.

      6.5. Lassen Sie etwa 2 ml der Saccharoselösung über der 53� %-Grenzfläche, um sicherzustellen, dass das untere weiße OM nicht mit der IM-Fraktion kreuzkontaminiert wird. Wiederholen Sie den Pipettiervorgang ab Schritt 6.4 für die OM-Fraktion ( Abb. 1 ).

      Hinweis: Die Membranen können auch gesammelt werden, indem die Zentrifugenröhrchen unten mit einer Nadel durchstochen und die Membranen als Fraktionen tropfenweise gesammelt werden.

      6.6. Füllen Sie den verbleibenden Hohlraum des Ultrazentrifugenröhrchens mit Lagerpuffer mit isolierter Membran und mischen Sie durch Umdrehen oder Pipettieren. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.

      6.7. Sammeln Sie die nun gewaschenen und isolierten Membranen durch Ultrazentrifugation bei 184500 × g für 1 h und 4 °C.

      6.8. Den Überstand verwerfen und die Membranen durch Dounce-Homogenisierung resuspendieren. Fügen Sie 500� μl Speicherpuffer hinzu. Sammeln Sie Proben in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.

      6.9. Lagern Sie die Bakterienmembranproben bei � ଌ.

      7. BESTÄTIGEN DER TRENNUNG DER BILAYERS

      Hinweis: Aufgrund technischer Fehler oder der einzigartigen Zusammensetzung der Zellhülle einiger Arten kann es zu einer unvollständigen Trennung der Doppelschichten kommen. Um die Trennung zu bestätigen, empfehlen wir die Verwendung von zwei unabhängigen Assays, um den Grad der Kreuzkontamination zwischen den Doppelschichten zu quantifizieren. Der erste Assay weist die enzymatische Aktivität der NADH-Dehydrogenase nach, die ausschließlich im IM existiert. Der zweite Assay weist das Vorhandensein von LOS oder LPS nach, das überwiegend im OM vorkommt.

      Bestätigung, dass die OMs von den IMs isoliert sind

      NADH-Oxidationsassay

      7.1 Messen Sie die Proteinkonzentration in jeder isolierten Membranfraktion mit einem Bradford-Proteinassay.

      7.2. Geben Sie das Probenvolumen, das zwischen 50 und 500 µg Protein entspricht, in ein leeres 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Konzentration variiert je nach Spezies, aber 50 μg sind in der Regel ausreichend für Enterobacteriaceae. Fügen Sie das entsprechende Volumen von 10 mM Tris-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 990 μl zu erreichen. Übertragen Sie den Inhalt in eine Küvette für die Spektrophotometrie.

      7.3. Geben Sie 10 µl einer 10 mg/ml NADH-Lösung zur Probe und messen Sie die anfängliche Extinktion bei 340 nm.

      7.4. Fahren Sie mit der Messung der Extinktion alle 30 Sekunden für 5 Minuten fort.

      7.5. Kompilieren Sie die Daten und zeichnen Sie die Änderung der Absorption (y-Achse) gegenüber der Änderung der Zeit (x-Achse) für jede Membranfraktion ( 3 ).

      Bestätigung, dass die IMs von den OMs isoliert sind

      LPS/LOS-Extraktion und Visualisierung in einem Gel.

      7.5. Geben Sie das Probenvolumen, das zwischen 50 und 500 µg Protein entspricht, in ein leeres 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Konzentration variiert je nach Bakterienart, aber für Enterobacteriaceae reichen normalerweise 50 μg aus. Mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die im Folgenden als wässrige Phase bezeichnet wird, auf ein Endvolumen von 100 μL auffüllen.

      7.7. 5 μL Proteinase K (Stock 800 U/ml) in die wässrige Phase geben und über Nacht bei 59° C inkubieren.

      7.8. Erwärmen Sie ein 10-ml-Aliquot von Tris-gesättigtem Phenol für 10 Minuten bei 68° C.

      7.9. Die Proben der wässrigen Phase, die mit der Proteinase K behandelt wurden, abzentrifugieren und das “hot” Tris-gesättigte Phenol im Verhältnis 1:1 mit der wässrigen Phase hinzufügen, kräftig vortexen und bei 68° C für 10 Minuten inkubieren.

      7.10. Übertragen Sie die jetzt milchig-weißen Proben von 68° C in ein Eiswasserbad und inkubieren Sie für 10 Minuten.

      7.11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2100 × g für 10 min bei 4° C.

      7.12. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen und lagern Sie das Röhrchen bei �° C, wenn die Probe nicht sofort verwendet werden soll.

      7.13. Verdünnen Sie die Proben in SDS-Ladepuffer und laden Sie die Wells eines 4� % Tris-Glycin-Gradientengels.

      7.14. Elektrophorese für 45 min oder bis sich die Farbstofffront am unteren Rand des Gels befindet.

      7.15. Färben Sie das Gel mit dem PRO-Q Emerald 300 LPS Färbekit gemäß den Anweisungen des Herstellers.


      Wie kann ich ein Zellpellet resuspendieren, ohne die Bakterien zu schädigen? - Biologie

      Es gibt zwei Methoden zur Transformation E coli Zellen mit Plasmid-DNA - chemische Transformation und Elektroporation. Für die chemische Transformation werden die Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, geerntet und mit zweiwertigen Kationen wie CaCl . behandelt2. Auf diese Weise behandelte Zellen werden als kompetent bezeichnet. Um Zellen chemisch zu transformieren, werden kompetente Zellen mit der DNA auf Eis gemischt, gefolgt von einem kurzen Hitzeschock. Dann werden die Zellen mit reichhaltigem Medium inkubiert und das Antibiotikum-Resistenz-Gen 30-60 Minuten vor dem Ausplattieren exprimieren gelassen. Für die Elektroporation werden die Zellen ebenfalls bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, werden dann jedoch ausgiebig mit Wasser gewaschen, um alle Salze zu entfernen. Üblicherweise wird dem Wasser Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 10 % zugesetzt, damit die Zellen eingefroren und für zukünftige Experimente aufbewahrt werden können. Um DNA in Zellen zu elektroporieren, gewaschen E coli werden mit der zu transformierenden DNA vermischt und anschließend in eine Kunststoffküvette mit Elektroden pipettiert. Ein kurzer elektrischer Impuls von etwa 2400 Volt/cm wird an die Zellen angelegt und verursacht kleine Löcher in der Membran, durch die die DNA eindringt. Die Zellen werden dann wie oben vor dem Ausplattieren mit Brühe inkubiert.

      Für die chemische Transformation muss die DNA nicht vorbehandelt werden. Für die Elektroporation muss die DNA frei von allen Salzen sein, daher werden die Ligationen vor der Verwendung zuerst mit Alkohol gefällt.

      Experimentelles Design :

      Um die Effizienz der Transformation zu bestimmen, sollte eine positive Kontrolltransformation unter Verwendung von 1 ng ungeschnittener Plasmid-DNA, z.B. pUC19. Die Transformationseffizienz wird als Anzahl der Transformanten/&mgr;g der Eingangs-DNA berechnet. Es sollte auch eine Negativkontrolle mitgeführt werden, die Zellen ohne hinzugefügte DNA enthält.

      Eine Negativkontrolle nur mit Zellen (ohne Zugabe von DNA) sollte ebenfalls mitgeführt werden.

      Für die meisten Klonierungsanwendungen verwenden wir DH5&alpha-Wirtszellen. Diese Zellen sind kompatibel mit lacZ blaue/weiße Selektionsverfahren, werden leicht transformiert, und Plasmid-DNA von guter Qualität kann aus Transformanten gewonnen werden. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist die Transformation mit Plasmidkonstrukten, die rekombinante Gene unter der Kontrolle der T7-Polymerase enthalten. Diese Konstrukte werden typischerweise für die Klonierungsphase in DH5&alpha transformiert, müssen jedoch in einen anderen Bakterienstamm transformiert werden, BL21(DE3) für die Expression des rekombinanten Proteins (BL21-Stämme tragen das Gen für die Expression der T7-Polymerase).

      Elektroporation von E coli:

      • Sterile Zentrifugenflaschen &ndash 250 ml für GSA Rotor
      • SOB mittel
      • E coli Wirtsstamm wie DH5&alpha
      • WB (10% redestilliertes Glycerin, 90% destilliertes Wasser, v/v) gekühlt auf 4°C&ndash benötigt 500 ml WB pro 250 ml Kultur
      • tRNA (5-10 µg/ml &ndash als Massenträger verwendet, um die Präzipitationseffizienz zu erhöhen)
      • 5 M Ammoniumacetat
      • 100 % Ethanol
      • 70% Ethanol
      • 0,5X TE oder EB (10 mM Tris, pH 8,3)
      • SOC-Medium
      • Transformationsplatten

      I. Vorbereitung von E coli Zellen für die Elektroporation.

      1. Verwenden Sie eine frische Kolonie von DH5&alpha (oder einem anderen geeigneten Wirtsstamm), um 5 ml SOB-Medium (ohne Magnesium) in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen zu inokulieren. Zellen mit kräftiger Belüftung über Nacht bei 37°C wachsen lassen.

      2. Verdünnen Sie 2,5 ml Zellen in 250 ml SOB (ohne Magnesium) in einem 1-Liter-Kolben. 2 bis 3 Stunden unter kräftiger Belüftung bei 37°C wachsen lassen, bis die Zellen eine OD . erreichen550 = 0.8.

      3. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 U/min in einem GSA-Rotor für 10 min in sterilen Zentrifugenflaschen. (Achten Sie darauf, autoklavierte Flaschen zu verwenden!).

      4. Waschen Sie das Zellpellet in 250 ml eiskaltem WB wie folgt. Geben Sie zuerst eine kleine Menge WB in die Zellpelletpipette auf und ab oder wirbeln Sie vorsichtig vor, bis die Zellen resuspendiert sind. Dann Zentrifugenflasche mit eiskaltem WB füllen und vorsichtig mischen. ANMERKUNG - das absolute Volumen der zu diesem Zeitpunkt hinzugefügten WB ist nicht wichtig.

      5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 U/min für 15 min und gießen Sie den Überstand vorsichtig ab, sobald der Rotor stoppt. Zellen, die in WB gewaschen wurden, pelletieren nicht gut. Wenn der Überstand trüb ist, erhöhen Sie die Zentrifugationszeit.

      6. Waschen Sie das Zellpellet ein zweites Mal durch Resuspendieren in 250 ml sterilem eiskaltem WB unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen Technik. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5000 U/min für 15 min.

      7. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und lassen Sie eine kleine Menge WB am Boden der Flasche zurück. Resuspendieren Sie das Zellpellet im WB - es muss kein zusätzliches WB hinzugefügt werden &ndash und das Endvolumen sollte etwa 1 ml betragen. Die Zellen können sofort verwendet oder in 0,2 ml-Aliquots in Gefriervials unter Verwendung eines Trockeneis-Ethanol-Bades eingefroren werden. Lagern Sie gefrorene Zellen bei -70 °C.

      II. DNA für die Elektroporation vorbereiten

      DNA für die Elektroporation muss eine sehr geringe Ionenstärke und einen hohen Widerstand aufweisen. Die DNA kann entweder durch Verdünnung, Präzipitation oder Dialyse gereinigt werden.

      • Für die Transformation gereinigter Plasmid-DNA verdünne DNA in 10 mM Tris pH 8–8,3 auf etwa 1–50 ng/µl (TE nicht verwenden). Verwenden Sie 1 µl für die Transformation.
      • Verwenden Sie für Ligationsreaktionen das folgende Verfahren.

      Reinigung von DNA durch Fällung:

      1. 5 bis 10 µg tRNA zu einer 20 µg Ligationsreaktion in einem 1,5 ml Röhrchen zugeben. Füge 22 &mgr;M Ammoniumacetat (oder ein gleiches Volumen der Ligationsreaktion mit hinzugefügter tRNA) hinzu. Gut mischen.

      2. Zugabe von 100 &mgr;m absolutem Ethanol (oder 2,5 Volumina Ligationsreaktion, tRNA und Salz). Eis 15 Min.

      3. Zentrifugieren Sie bei >12.000 x g für 15 min bei 4°C. Den Überstand vorsichtig dekantieren.

      4. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol. Zentrifugieren Sie bei >12.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand.

      5. Das Pellet an der Luft trocknen (Speed ​​vac in Ordnung, aber nicht zu trocken).

      6. Resuspendieren der DNA in EB-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3) oder 0,5X TE-Puffer [5 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA (pH 7,5)] auf eine Konzentration von 10 ng/ul DNA. Für Ligationsreaktionen ist es zweckmäßig, in 10 &mgr;l zu resuspendieren. 1 &mul pro Transformation von 20 &mul Zellsuspension verwenden.

      III. Elektroporation.

      1. Markieren Sie die erforderliche Anzahl an Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie die erforderliche Anzahl von Mikroelektroporationskammern auf Eis. Füllen Sie das Temperierfach des Chamber Safe mit

      250 ml Eis-Wasser-Slurry und stellen Sie das Chamber Rack in den Chamber Safe.

      2. Tauen Sie ein Aliquot der Zellen, die wie in Abschnitt I hergestellt wurden, auf und aliquotieren Sie 20 &mgr;l Zellen auf die erforderliche Anzahl von Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. 1 &mgr;l der DNA (oder Ligationsreaktion) zugeben, die wie in Abschnitt II hergestellt wurde.

      3. Pipettieren Sie mit einer Mikropipette 20 &mgr;l der Zell-DNA-Mischung zwischen die Vorsprünge in einer Mikroelektroporationskammer. Lassen Sie keine Luftblase im Zelltröpfchen, da der Druck einer Blase zu Lichtbogenbildung und Probenverlust führen kann. Legen Sie die Kammer in einen Schlitz im Kammergestell und notieren Sie ihre Position. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr als eine Probe gepulst werden soll. Bis zu 4 Proben können gleichzeitig im Chamber Rack platziert werden. Behandeln Sie die Kammern vorsichtig, um ein versehentliches Verschieben der Probe zwischen den Vorsprüngen zu vermeiden.

      4. Schließen Sie den Deckel des Kammersafes und sichern Sie ihn mit dem Zugriegel.

      5. Stecken Sie das Impulskabel in die rechte Seite des Kammersafes.

      6. Drehen Sie den Kammerauswahlknopf oben auf dem Chamber Safe, um den elektrischen Impuls an die gewünschte Mikroelektroporationskammer zu richten.

      7. Stellen Sie den Widerstand des Spannungsverstärkers auf 4 k&Omega ein, stellen Sie die Pulse Control-Einheit auf LOW und überprüfen Sie die Anschlüsse auf 330 µ F.

      8. Laden Sie die Pulse Control-Einheit auf, indem Sie den CHARGE ARM-Schalter an der Pulse Control-Einheit auf CHARGE stellen und dann die UP-Spannungskontrolltaste drücken, bis die Spannungsanzeige 5 bis 10 Volt über der gewünschten Entladespannung liegt. Zum E coli, sind die Standardbedingungen 2,4 kV, was bedeutet, dass die Pulse Control-Einheit auf 405 Volt eingestellt wird (400 Volt ist die gewünschte Entladespannung + 5). Der Spannungsbooster verstärkt die Volt um

      6-fach, so dass die Gesamtentladungsspannung 2400 Volt oder 2,4 kV beträgt. Die tatsächliche Spitzenspannung, die an die Probe geliefert wird, wird auf dem Spannungs-Booster-Meter angezeigt nach der Impuls wird abgegeben.

      9. Stellen Sie den Schalter CHARGE/ARM auf die Position ARM. Das grüne Licht zeigt an, dass das Gerät bereit ist, einen DC-Impuls abzugeben. Drücken Sie die Impulsentladungs-TRIGGER-Taste und halten Sie sie 1 Sekunde lang gedrückt.

      HINWEIS: Die DC-Spannungsanzeige an der Pulse Control-Einheit sollte <10 Volt anzeigen, nachdem ein Puls abgegeben wurde. Falls nicht, entladen Sie den Kondensator mit der DOWN-Taste.

      10.Für zusätzliche Proben drehen Sie den Kammerauswahlknopf auf die nächste gewünschte Position und wiederholen Sie die Schritte 8 und 9, bis alle Proben gepulst sind.

      11. Zur Ampicillin-Selektion die Proben in 2 ml SOC-Medium inokulieren und 30 Minuten (für amp), 60 Minuten (für Kan) schütteln, um die Expression des antibiotischen Gens zu ermöglichen. Zellen auf LB-Medium mit einem geeigneten Antibiotikum oder Screening-Reagenz (z. B. 100 &mgr;g/ml Ampicillin und/oder 40 &mgr; 20 mg/ml X-Gal, XP und 40 &mgr;Ml 100 mM IPTG) ausplattieren.

      Diese Webseite wird betreut von Julie B. Wolf, UMBC
      Zuletzt aktualisiert am 02.03.2010

      richtet sich an Studierende, die an einer Karriere in den industriellen und biomedizinischen Wissenschaften interessiert sind.


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