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3.7: Testproteinverhalten - Biologie

3.7: Testproteinverhalten - Biologie



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Einführung

Heute erhalten Sie Titrationskurven gegen Calcium für Ihre Wildtyp- und Mutantenproteine ​​mit einem automatisierten Fluoreszenzplatten-Reader. Die Ausgabe ist ein Raster mit bis zu 96 Fluoreszenzwerten für die Zeilen A-G und die Spalten 1-12, das mit einem Programm wie Excel analysiert werden kann.

Um von diesem Hochdurchsatz-Testformat weiter zu profitieren, freunden Sie sich mit der Mehrkanalpipette an, einem rein mechanischen statt digitalen Hilfsmittel für repetitive Experimente. Mit diesem Werkzeug können Sie äquivalente Volumina mehrerer identischer Proben (normalerweise 8-12 gleichzeitig) mit nur einem Hub aufsaugen und ausstoßen. Mit diesem Pipettentyp befüllen Sie jede Reihe einer Mikrotiterplatte mit einer Art Proteinprobe und jede Spalte mit einer anderen Calciumkonzentration. Obwohl eine Mehrkanalpipette für ein typisches Forschungslabor ausreichen kann, sind in Pharmaunternehmen, die täglich Tausende von Proben untersuchen, noch weitere Automatisierungs- und Skalierungsschritte erforderlich, z alle. Der Grad der im Handel erhältlichen oder „intern“ entwickelten Automatisierung in einem bestimmten Labor oder Unternehmen hängt teilweise von der Häufigkeit ab, mit der ein bestimmter Assay verwendet wird. Assays, die von vielen verschiedenen Labors und Unternehmen verwendet werden (wie Fluoreszenz- oder Absorptionsspektrophotometrie) werden wahrscheinlich kommerziell erhältliche Hochdurchsatzmaschinen hervorbringen.

Während das Konzept der Skalierung ein pragmatisches Anliegen ist, ist für uns heute ein vielleicht wichtigeres Thema das Vertrauen in unsere Ergebnisse. Wie Sie wahrscheinlich wissen, ist jede Manipulation und Messung, die Sie im Labor vornehmen, mit einem Fehler verbunden. Betrachten Sie zum Beispiel den allgegenwärtigen P200 Pipetman. Laut einem Pipettenhersteller beträgt die Genauigkeit 1% (etwas schlechter bei den niedrigsten Volumina). Ein Versuch, 100 μl zu pipettieren, würde also allein aufgrund des Fehlers des Instruments zu einem tatsächlichen Volumen von 99-101 μl führen, was beispielsweise durch einen schläfrigen Pipettierer noch verstärkt werden könnte. Die Präzision einer Pipette ist in der Regel besser als ihre Genauigkeit, 0,25% für das obige Beispiel. Präzision bezieht sich auf die Reproduzierbarkeit einer gegebenen Messung, nicht auf ihre absolute Genauigkeit. Dieses einfache Beispiel demonstriert die allgemeinen Prinzipien, die auf andere Fehlerarten anwendbar sind.

Sie werden versuchen, ein Gefühl für den Gesamtfehler des heutigen Experiments zu bekommen, indem Sie Ihre Proteinproben in zweifacher Ausführung durchführen. Das heißt, Sie führen für jede Protein-Calcium-Kombination zwei unabhängige Messungen durch. Diese Messungen können dann gemittelt werden, um Ihre Daten zu glätten und hoffentlich das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern – wobei sich Signal hier auf echte Unterschiede zwischen Proben bezieht, die mit unterschiedlichen Mengen an Kalzium gemischt sind, und Rauschen bedeutet inhärente Schwankungen im System aufgrund von Fehlern. Rauschen in diesem Experiment kann sich auch auf die Hintergrundfluoreszenz des Probenpuffers beziehen. Eine andere Möglichkeit, ein vernünftiges Signal-Rausch-Verhältnis aufrechtzuerhalten, besteht darin, unser Protein ziemlich konzentriert zu halten, so dass die absoluten Fluoreszenzwerte, die wir erhalten, im Vergleich zum Hintergrund hoch sind. Die Abbildung rechts veranschaulicht die obigen Konzepte. Streuung in den Daten (nicht alle Kreise sind auf der gleichen Höhe) ist eine Art von Rauschen. Der Hintergrundpegel ist eine andere Art von Rauschen: Die linken Daten haben ein relativ niedriges Signal und damit ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis, während die rechten Daten ein relativ hohes absolutes Signal und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen.

Protokolle

Heute arbeiten nur 2-3 Gruppen gleichzeitig im Labor. Beim letzten Mal sollten Sie sich für einen einstündigen Block angemeldet haben.

Teil 1: Proteingel-Beobachtung

Wenn Sie möchten, werfen Sie einen Blick auf Ihr Coomassie-gefärbtes Gel aus dem vorheriges Labor.

Tipps für den Erfolg

Seien Sie heute sehr vorsichtig, um das Einbringen von Blasen in Ihre Proben zu begrenzen. Beim Ausstoßen von Flüssigkeit pipettieren langsam während Sie die Pipettenspitze am Boden oder an der Seite der Vertiefung berühren. Wenn Sie die Mehrkanalpipette verwenden, überprüfen Sie immer, ob alle Spitzen gefüllt sind - manchmal ist eine Spitze möglicherweise nicht ganz aufgesetzt und zieht weniger Volumen auf als die anderen. Lassen Sie in diesem Fall die Flüssigkeit ab, passen Sie die Spitze an und versuchen Sie es erneut.

Protokoll

  1. Nehmen Sie eine schwarze 96-Well-Platte und machen Sie sich mit dem Schema rechts vertraut: Die oberen beiden Reihen sind Wildtyp, die nächsten beiden Reihen sind die M124S-Mutante und die letzten beiden sind Ihre eigene Mutante.
    • Die dunklen Seiten der Platte reduzieren "Übersprechen" (d. h. Lichtaustritt) zwischen Proben in benachbarten Vertiefungen, ein weiterer potenzieller Beitrag zum Fehler.
  2. Übertragen Sie ein Aliquot des Wildtyp-Proteins in ein Plastikreservoir. Verwenden Sie die Mehrkanalpipette, um 30 μl Protein (pro Vertiefung) in die oberen beiden Reihen Ihrer Platte zu geben.
  3. Nehmen Sie ein neues Reservoir und wiederholen Sie Schritt 2 für Ihre mutierten Proteine, indem Sie jedes zu den entsprechend gekennzeichneten Reihen hinzufügen.
  4. Fügen Sie schließlich einfachen EB-Puffer (kein Protein) in die siebte Reihe der Platte hinzu, indem Sie das gemeinsame dedizierte Reservoir verwenden. (Warum, glauben Sie, haben wir eine Reihe proteinfreier Lösungen hinzugefügt?)
  5. Verwenden Sie das gemeinsame Reservoir 1 (niedrigste Calciumkonzentration) und fügen Sie 30 μL in die oberen sieben Reihen in der ersten Spalte der Platte hinzu. Entsorgen Sie die Pipettenspitzen.
  6. Arbeiten Sie sich nun von Reservoir 2 bis 12 (höchste Calciumkonzentration) und von der linken zur rechten Spalte auf Ihrem Teller vor. Verwenden Sie immer frische Pipettenspitzen! Wenn Sie eine Lösung verunreinigen, informieren Sie die Lehrkräfte, damit sie eine neue Lösung herausgeben können.
  7. Zum Schluss die Platte mit Parafilm abdecken und in Alufolie einwickeln.

Teil 2: Fluoreszenz-Assay

  1. BPEC (das Biological Process Engineering Center) hat uns freundlicherweise zugestimmt, ihren Plattenleser zu verwenden. Gehen Sie mit einem Mitglied des Lehrpersonals zum BPEC-Instrumentenraum.
  2. Ihnen wird gezeigt, wie Sie die Anregungs- (485 nm) und Emissionswellenlänge (515 nm) am Plattenlesegerät einstellen, um Ihr Protein zu testen.
  3. Ihre Rohdaten werden Ihnen per Post oder E-Mail zugesandt; Alternativ können Sie Ihr eigenes Flash-Laufwerk mitbringen, um die Daten sofort wiederherzustellen.

Für nächstes Mal

  1. Bereiten Sie eine Abbildung und eine Beschriftung für Ihre SDS-PAGE-Ergebnisse vor. Suchen Sie das erwartete Molekulargewicht mithilfe des IPC-Sequenzdokuments und dieses online Molekulargewicht des Proteins Tool (oder ähnliche) Website. Stellen Sie sicher, dass Sie ~ 3 KDa für die Größe des N-Terminus von pRSET (His-Tag usw.) hinzufügen. Wenn du zwei starke Bands siehst, was denkst du ist die zweite? Diese Hausaufgabe wird beim nächsten Mal im Unterricht benotet, damit Sie eventuelle Anmerkungen in Ihren Abschlussbericht aufnehmen können.

Verschiedene technische Anwendungen wurden verwendet, um Moleküle und Verbindungen sowohl in angeborenen als auch in biologischen Umgebungen zu liefern. Im Zusammenhang mit biologischen Anwendungen kann die rechtzeitige Abgabe von Molekülen für die Zell- und Organfunktion entscheidend sein. Als solche haben frühere Studien die Überlegenheit der langfristigen Proteinzufuhr durch Protein-Tethering auf biotechnologisch hergestellten Gerüsten im Vergleich zur herkömmlichen Zufuhr von löslichem Protein gezeigt in vitro und in vivo. Trotz dieser Vorteile existiert nur wenig Wissen über die Stabilität, Freisetzungskinetik, Langlebigkeit, Aktivierung des intrazellulären Weges und Funktionalität dieser Proteine ​​im Laufe der Zeit. Als Beispiel untersuchten wir hier die Stabilität, den Abbau und die Funktionalität eines Proteins, des Glia-derived neurotrophic factor (GDNF), von dem bekannt ist, dass er das neuronale Überleben, die Differenzierung und die Neuritenmorphogenese beeinflusst. Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) zeigten, dass GDNF, kovalent an Polycaprolacton (PCL) elektrogesponnene Nanofasergerüste gebunden, 120 Tage lang auf der Gerüstoberfläche präsent blieb, ohne Anzeichen von Proteinauslaugung oder -abbau. Das angebundene GDNF-Protein blieb funktionsfähig und in der Lage, stromabwärts gelegene Signalkaskaden zu aktivieren, wie seine Fähigkeit zeigt, intrazelluläres Erk in einer neuralen Zelllinie zu phosphorylieren. Darüber hinaus förderte die Immobilisierung des GDNF-Proteins das Zellüberleben und die Differenzierung in Kultur sowohl nach 3 als auch nach 7 Tagen, wodurch die verlängerte Funktionalität des Proteins weiter bestätigt wurde, weit über den Zeitrahmen von Minuten bis Stunden hinaus, der für lösliche Proteine ​​unter den gleichen Kulturbedingungen beobachtet wurde. Diese Studie liefert wichtige Beweise für die Stabilitäts- und Funktionalitätskinetik von angebundenen Molekülen.

Diese Forschung wurde durch Mittel des Australian Research Council, der Bethlehem Griffith Research Foundation und des Australian National University Major Equipment Committee Fund unterstützt.

Beide Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.


Hintergrund

Die Fortbewegung ist für die Lokalisierung von Nahrung und Paaren, die Flucht vor Raubtieren, die Verteidigung des Territoriums und die Reaktion auf Stress erforderlich und ist daher ein integraler Bestandteil der meisten Verhaltensweisen der Tiere. Beim Menschen sind Morbus Parkinson, Chorea Huntington, Aktivitätsstörungen und Depressionen mit Bewegungsdefiziten verbunden. Daher ist das Verständnis der genetischen Architektur des Bewegungsverhaltens aus den zwei Perspektiven der Evolutionsbiologie und der menschlichen Gesundheit wichtig.

Fortbewegung ist ein komplexes Verhalten, dessen Natur auf multiple interagierende quantitative Trait Loci (QTL) mit individuell kleinen Effekten zurückzuführen ist, deren Ausdruck empfindlich auf die Umgebung reagiert [1]. Die Analyse der genetischen Architektur komplexen Verhaltens wird in Modellorganismen, wie z Drosophila melanogaster, wo man die Auswirkungen von Mutationen beurteilen kann, um abzuleiten, welche Gene für die Manifestation des Verhaltens erforderlich sind, und QTL, die die natürlich vorkommende Variation beeinflusst, mit hoher Auflösung kartieren kann [2]. Allgemeine Merkmale der genetischen Architektur komplexer Verhaltensweisen werden wahrscheinlich über verschiedene Taxa hinweg wiederholt. Grundlegende biologische Prozesse, einschließlich der Entwicklung des Nervensystems, sind zwischen Fliegen und Säugetieren evolutionär konserviert [3]. So können Orthologe von Genen, die Drosophila Fortbewegung kann beim Menschen durchaus relevant sein. Zum Beispiel ist die Parkinson-Krankheit mit einer fortschreitenden Degeneration von nigrostriatalen dopaminergen Neuronen verbunden [4, 5], und Dopamin wurde auch mit der Fortbewegung von Mäusen in Verbindung gebracht [6] und Drosophila [1, 7–12].

Mehrere Studien zeigen die zugrunde liegende genetische Komplexität des Bewegungsverhaltens in Drosophila. Die Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin) [13], Octopamin (das wirbellose Homolog von Noradrenalin) [14] und γ-Aminobuttersäure [15] beeinflussen Drosophila Fortbewegung sowie Gene, die für die richtige neuroanatomische Entwicklung der Pilzkörper und Komponenten des zentralen Komplexes erforderlich sind, Gehirnregionen, die für die normale Fortbewegung erforderlich sind [16–21]. Kürzlich haben wir einen Hochdurchsatz-Assay entwickelt, um die 'lokomotorische Reaktivität'-Komponente des lokomotorischen Verhaltens zu quantifizieren (gemessen anhand des Aktivitätsniveaus unmittelbar nach einer mechanischen Störung) und nutzten dies, um die QTL-Trennung zwischen zwei Inzuchtlinien mit signifikant unterschiedlichen Niveaus zu kartieren der lokomotorischen Reaktivität [1]. Wir identifizierten 13 positionelle Kandidatengene, die dem QTL entsprechen. Von drei dieser Gene war bekannt, dass sie die Fortbewegung von Erwachsenen beeinflussen, sechs hatten mutierte Phänotypen, die mit einer Beteiligung an der Regulierung der Fortbewegung übereinstimmen, obwohl die Auswirkungen auf das Bewegungsverhalten zuvor nicht quantifiziert wurden und die verbleibenden vier Gene, die alle RNA-Polymerase-II-Transkriptionsfaktoren kodieren, an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. waren neue Kandidatengene, die das Bewegungsverhalten beeinflussen. Diese Studie unterstreicht die Leistungsfähigkeit der Verwendung natürlicher Allelvarianten zur Untersuchung von komplexem Verhalten [22], beschränkte sich jedoch auf die Identifizierung von Genen, die sich in den beiden verwendeten Elternlinien segregieren, die eine begrenzte Stichprobe von Allelen darstellen, die sich in einer natürlichen Population segregieren.

Eine alternative Strategie zur Entdeckung von Genen, die komplexe Verhaltensweisen beeinflussen, besteht darin, die künstliche Selektion auf divergente Phänotypen mit einem Gesamtgenom-Expressionsprofil zu kombinieren [23–28]. Das Grundprinzip dieses Ansatzes ist, dass Gene, die konsistente Veränderungen in der Expression als eine korrelierte Antwort auf die Selektion aufweisen, Kandidatengene sind, die das ausgewählte Merkmal beeinflussen. Diese Strategie hat zwei Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen QTL-Mapping-Paradigmen und unvoreingenommenen Screenings auf Mutationen, die Verhaltensmerkmale beeinflussen. Erstens stellt die Initiierung einer künstlichen Selektion aus einer großen Basispopulation, die kürzlich aus der Natur abgeleitet wurde, sicher, dass eine größere und repräsentativere Stichprobe von Allelen, die die segregierende Variation im Verhalten beeinflussen, eingeschlossen wird als in QTL-Kartierungsstudien, die zwei Elternlinien verwenden. Zweitens ist die Bewertung der Verhaltenseffekte von Mutationen in Kandidatengenen, deren Expression in den genetisch divergenten Linien co-reguliert ist, effizienter als unvoreingenommene Mutationsscreens zur Identifizierung von Genen, die das interessierende Merkmal beeinflussen [23, 26, 27]. Hier haben wir diese Strategie mit klassischer quantitativer genetischer Analyse kombiniert, um die genetische Architektur der lokomotorischen Reaktivität besser zu verstehen. Wir erstellten künstliche Selektionslinien aus einem genetisch heterogenen Hintergrund und selektierten für 25 Generationen, um Replikationslinien mit erhöhter und verringerter lokomotorischer Reaktivität sowie unselektierte Kontrolllinien abzuleiten. Wir haben auch die lokomotorische Reaktivität in einer Population von 340 Inzuchtlinien gemessen, die aus derselben natürlichen Population stammten. Wir verwendeten dann das Expressionsprofil des gesamten Genoms, um die Reihe von Genen zu quantifizieren, die zwischen den Selektionslinien unterschiedlich exprimiert wurden. Funktionstests von Mutationen in zehn der unterschiedlich exprimierten Gene identifizierten sieben neue Kandidatengene, die das Bewegungsverhalten beeinflussen.


Ergebnisse

SERBP1 ist ein neuer prognostischer Marker bei GBM

Wir untersuchten die Rolle von SERBP1 als onkogener Faktor bei Gliomen/GBM und seinen möglichen Einfluss auf das Überleben der Patienten und das Ansprechen auf die Therapie. In einer mit dem GTEx-Datensatz durchgeführten Multi-Tissue-Transkriptomanalyse [21] zeigten Hirngewebe eine reduzierte SERBP1-mRNA-Expression, während zwei transformierte Zelllinien (LCL und FIBRBLS) die höchsten Werte zeigten (Abb. 1a). Bemerkenswerterweise zeigt SERBP1 eine höhere Expression in GBM (TCGA-Proben) im Vergleich zu normalem Gehirn und LGG (niedriggradiges Gliom, Grad II) (Abb. 1b, c, Zusatzdatei 2: Tabelle S1). Eine hohe SERBP1-Expression war bei Gliompatienten in den TCGA- und CGGA-Kohorten mit einem schlechten Überleben verbunden (Abb. S1A, Zusatzdatei 3: Tabelle S2). Darüber hinaus beobachteten wir, dass SERBP1 bei 25 Tumorarten im Vergleich zu normalem Gewebe erhöhte Expressionsspiegel aufweist (Zusatzdatei 1: Abb. S1B) und Daten in der R2-Datenbank zeigten, dass eine hohe SERBP1-Expression bei Neuroblastomen mit einer schlechten Prognose verbunden ist , Pankreas-Adenokarzinom, Blasen-Urothelkarzinom, zervikales Plattenepithelkarzinom und Sarkome (Zusatzdatei 1: Abb. S1C).

SERBP1-Expression und Einfluss auf das Überleben und die Therapie von Gliomen. ein SERBP1-mRNA-Expression in normalem menschlichem Gewebe basierend auf der GTEx-Datenbank. B Vergleichende Analyse der SERBP1-mRNA-Expression in normalem Gehirn/Kortex (GTEx) und Gliomproben (Grad II, III und IV) des TCGA-Konsortiums. C Immunfärbung von repräsentativen Gliomproben (Grad II, III und IV) aus der Kohorte des Shanghai Hospital, die SERBP1-Proteinexpressionsniveaus zeigt. D Kaplan-Meier-Kurven zeigen das Überleben von 177 Gliompatienten aus der Kohorte des Shanghai Changzheng Hospital mit niedrigen und hohen SERBP1-Werten. eg Kaplan-Meier-Kurven zeigen das Überleben von 118 GBM-Patienten aus der Kohorte des Shanghai Changzheng Hospital mit niedrigen und hohen SERBP1-Werten: E (alle Patienten), F (54 Patienten, die TMZ erhielten) und G (83 Patienten, die bestrahlt wurden)

Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu erweitern, haben wir eine Studie mit einer Gliom-Kohorte des Shanghai Changzheng Hospital durchgeführt. Proben wurden mittels Immunfärbung analysiert SERBP1 wurde bei 21,5% der Proben nicht nachgewiesen, war bei 18,1% leicht positiv, bei 37,3% mäßig positiv und bei 23,2% der Patienten stark positiv. Wir untersuchten weiter, ob die SERBP1-Expression mit Gliom-Graden assoziiert war. SERBP1 war bei 28,6% der Patienten mit Gliomen Grad I, 55,6% der Patienten mit Gliomen Grad II, 83,3% der Patienten mit Gliomen Grad III und 89,0% der Patienten mit Gliomen Grad IV positiv (P < 0,001). Darüber hinaus wiesen 71,2% der Patienten mit Grad IV (GBM) eine stark positive Färbung für SERBP1 auf, signifikant mehr als Grad I (7,1%), Grad II (40,7%) und Grad III (61,1%) Gliome (P < 0,001) (Fig. 1c, zusätzliche Datei 4: Tabelle S3). Die SERBP1-Expression war eng mit dem WHO-Grad des Glioms korreliert (niedriger vs. hoher Grad, Chi-Quadrat-Test, P = 0,002) (Zusätzliche Datei 4: Tabelle S3). Trotz variabler Expression von SERBP1 in Gliomen hatten GBM-Proben eine merklich höhere Expression von SERBP1 im Vergleich zu LGG-Proben. Die mediane Überlebenszeit betrug 13,12 ± 1,12 Monate (95%-Konfidenzintervall [KI] 10,91–15,33) für Patienten mit hoher SERBP1-Expression und 23,73 ± 1,76 (95%-KI 20,23–27,23) Monate für Patienten mit niedriger SERBP1-Expression (P < 0,0001) (Fig. 1d). GBM-Patienten mit niedriger SERBP1-Expression hatten ein deutlich längeres Überleben (17,41 ± 1,93 Monate, 95 %-KI 13,48–21,35) als solche mit hoher SERBP1-Expression (10,52 ± 0,97 Monate, 95 %-KI 8,59–12,46) (P = 0,0006) (Abb. 1e).

Wir untersuchten auch, ob die Überlebenszeit durch eine postoperative adjuvante Therapie (Strahlen- und Chemotherapie) beeinflusst wurde. Wie in (Abb. 1f) gezeigt, hatten unter GBM-Patienten, die eine Chemotherapie (Temozolomid) erhielten, diejenigen mit niedrigen SERBP1-Spiegeln eine signifikant längere Überlebenszeit (20,91 ± 2,52 Monate, 95 %-KI 15,67–26,15) als diejenigen mit hohen SERBP1-Spiegeln (11,11 ± .). 1,22 Monate, 95 %-KI 8,68–13,55) (P = 0,0002). Ebenso profitierten Patienten mit niedrigen SERBP1-Werten hinsichtlich des Überlebens (18,81 ± 2,69 Monate, 95 %-KI 13,09–24,54) stärker von der Strahlentherapie als Patienten mit hohen SERBP1-Werten (9,24 ± 1,15 Monate, 95 %-KI 6,90–11,57) (P < 0,0001) (Fig. 1g). Alle Patientendaten sind in (Zusatzdatei 5: Tabelle S4) aufgelistet.

SERBP1 beeinflusst krebsrelevante Phänotypen

Wir führten mehrere Assays durch, um festzustellen, ob eine hohe Expression von SERBP1 erforderlich ist, um krebsrelevante Phänotypen aufrechtzuerhalten. Alle Experimente wurden mit siRNA-Knockdown durchgeführt, da Versuche zur Herstellung von SERBP1-Knockout-Linien unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Ansatzes nicht erfolgreich waren, was darauf hindeutet, dass zumindest die von uns getesteten GBM-Linien ohne SERBP1-Funktion nicht überleben können.

Der SERBP1-Knockdown hatte einen dramatischen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von U251- und U343-Zellen, wie mittels MTS-Assay nachgewiesen (Abb. 2a, Zusätzliche Datei 1: Abb. S2A, S3A). Expression reduzierte die Fähigkeit von GBM-Zellen, Kolonien zu bilden, dramatisch (Fig. 2b, zusätzliche Datei 1: Fig. S3B). In ähnlicher Weise stellten wir unter Verwendung des Boyden-Kammer-Assays fest, dass die Zellinvasion kompromittiert wurde, wenn SERBP1 zum Schweigen gebracht wurde (Abb. 2c, Zusätzliche Datei 1: Abb. S3C). Als nächstes untersuchten wir, ob der SERBP1-Knockdown die Apoptose beeinflusst. Wir untersuchten die PARP1-Spaltung durch Western-Blot sowie Annexin-V-Färbung mittels Durchflusszytometrie in beiden Szenarien, wir beobachteten einen Anstieg des Produkts in mit siSERBP1 transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontroll-siRNA (Abb. 2d, e). In ähnlicher Weise beobachteten wir eine höhere Caspase-3/7-Aktivität in SERBP1-Knockdown-Zellen im Vergleich zur Kontrolle, was die Rolle von SERBP1 bei der Apoptose bestätigt (Fig. 2f). Schließlich untersuchten wir den Einfluss von SERBP1 auf das Überleben und die Proliferation von Gliom-Stammzellen (GSC). Geltrex wurde verwendet, um GSC-Kulturen als Monolayer wachsen zu lassen. Das Überleben wurde unter Verwendung des MTS-Assays bewertet, während die Zellproliferation im Laufe der Zeit unter Verwendung des Incucyte-Systems verfolgt wurde. Der SERBP1-Knockdown verringerte das Überleben und die Proliferation von sowohl proneuralen als auch mesenchymalen GSCs (Abb. 2g, h Zusätzliche Datei 1: Abb. S2B).

SERBP1 beeinflusst krebsbedingte Phänotypen und das Tumorwachstum. ein Knockdown von SERBP1 in U251-Zellen verringerte die Lebensfähigkeit (MTS-Assay). B SERBP1-Silencing verringerte das klonogene Potenzial, wie durch Koloniebildungsassays gemessen. C Der Boyden-Kammer-Assay wurde verwendet, um den Einfluss von SERBP1 auf die Invasionswerte der Kristallviolettabsorption zu bewerten, und zeigte, dass der Knockdown von SERBP1 das Invasionspotenzial verringerte. DF SERBP1-Silencing erhöhte die Apoptose, wie durch die PARP1-Spaltung angezeigt (D), Annexin-Färbung (e) und Caspase (F). g Die GSC-Vermehrung im Laufe der Zeit wurde mit dem automatisierten Incucyte-System verfolgt. Eine Abnahme des SERBP1-Spiegels beeinträchtigte die Zellproliferation. ich Knockdown von SERBP1 in GSC-Linien verringerte die Lebensfähigkeit (MTS-Assays). Die Daten wurden mit Student's . analysiert T getestet und als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Bonferroni-Korrektur wurde für mehrere Vergleiche verwendet. *P ≤ 0.05 **P ≤ 0.01 ***P ≤ 0.001 ****P ≤ 0.0001. ich Intrakranielle Xenotransplantate wurden unter Verwendung der shSERBP1 3565 GSC-Zelllinie (10 Mäuse pro Gruppe) etabliert. Die experimentelle Gruppe erhielt Dox, um die Expression von shSERBP1 zu induzieren. Kaplan-Meier-Kurven zeigen, dass der SERBP1-Knockdown das Tumorwachstum verringert und das Überleben verlängert. J Repräsentative Ki67-Färbung von der Tumorgrenze für jede Gruppe. Maßstabsbalken = 100 μm

Als nächstes untersuchten wir den Einfluss von SERBP1 auf das Tumorwachstum unter Verwendung von intrakraniellen Xenotransplantaten. Wir wählten die hochaggressive GSC-Linie 3565 [22] aus und stellten eine stabile Linie her, die eine tet-induzierbare SERBP1-shRNA über eine lentivirale Infektion enthält. Die In-vitro-Bewertung dieser Linie zeigte, dass nach der Behandlung mit Doxycyclin ein Knockdown von 80 % erreicht werden kann. Bei der Behandlung mit Doxycyclin wurde eine Verringerung der Neurosphärenbildung und des Überlebens beobachtet, und die Ergebnisse korrelierten mit der Menge des verwendeten Arzneimittels (Zusatzdatei 1: Abb. S2C-F). Sowohl der Kontrollgruppe als auch den experimentellen Gruppen (5 Männer und 5 Frauen/Gruppe) wurden 3565 SERBP1-shRNA-tet-Zellen implantiert. In der experimentellen Gruppe wurden die Zellen vor der Implantation mit Doxycyclin behandelt und den Mäusen wurde erlaubt, Wasser mit Doxycyclin ad libitum zu trinken. Durch die Reduzierung der SERBP1-Expression in der experimentellen Gruppe verlängerten wir das mediane Überleben um 11 Tage gegenüber der Kontrollgruppe (P = 0,0026) (Abb. 2i). Tumoren zeigten auch eine sehr unterschiedliche Morphologie. Wie durch die Immunfärbung mit anti-Ki67 widergespiegelt wird, gibt es einen deutlichen Unterschied in der Anzahl der stark proliferierenden Zellen (Fig. 2j). Das SERBP1-Expressionsprofil, sein Einfluss auf das Überleben von GBM-Patienten, das Ansprechen auf die Therapie, Krebsphänotypen und das Tumorwachstum machen SERBP1 zu einem neuen onkogenen RBP bei GBM.

Charakterisierung des SERBP1-bindenden Motivs und regulatorischer Einfluss

Um SERBP1-RNA-Bindungspräferenzen zu definieren, verwendeten wir RNAcompete [23]. Das rekombinante SERBP1-Protein voller Länge wurde mit einem Pool von

240.000 entworfene (nicht zufällige) RNA-Oligos. Durch SERBP1 selektierte RNAs wurden über Microarray-Hybridisierung identifiziert und eine anschließende Computeranalyse identifizierte ein GC-reiches RNA-Bindungsmotiv für SERBP1 ( 3a ). Wir haben auch SERBP1 als N-terminales His . exprimiert und gereinigt6 Fusionsprotein und verwendet Fluoreszenzpolarisation (FP), um seine Bindungsaffinität an ein RNA-7-mer (5'- GCGCGGG - 3'), identifiziert durch RNAcompete, quantitativ zu messen. Die gemessene Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) der SERBP1-RNA-Interaktion (KD

47 nM) bestätigt seine starke Affinität zu der von RNA Compete identifizierten Sequenz (Fig. 3b). Um zu bestimmen, ob SERBP1 an dieses Motiv in Zellen bindet, führten wir ein RIP-Seq-Experiment durch. Das haben wir beobachtet

40% der mRNAs-Spezies, von denen festgestellt wurde, dass sie von SERBP1 gebunden werden, zeigen das identifizierte GC-reiche Motiv in ihrer 3'-UTR, eine Zahl, die viel höher ist als zufällig erwartet (Abb. 3c). Die vollständigen Ergebnisse der RIP-Seq-Analyse sind in (Zusatzdatei 6: Tabelle S5) aufgeführt. Schließlich haben wir Gene mit mehreren „SERBP1-Bindungsmotiven“ in ihrer 3′-UTR ausgewählt, die auch vom SERBP1-Knockdown betroffen waren (siehe RNA-Seq-Analyse unten), um Luciferase-Assays durchzuführen. Luc-Reporter, die die 3'-UTR dieser Gene enthielten, wurden mit einem SERBP1-Expressionsvektor oder einer Kontrolle co-transfiziert. In allen Fällen erhöhte die transgene SERBP1-Expression die Expression des Luciferase-Reporters ( 3d ), was darauf hindeutet, dass die mRNA-Stabilität und/oder Translation dieser Transkripte gefördert wird.

SERBP1-Bindungsmotiv. ein SERBP1-RNA-Bindungsmotiv, erhalten mit RNACompete. B Fluoreszenzpolarisationsassay zeigt die hohe Affinität von SERBP1 (KD

47 nM) zu einem 7-mer RNA-Oligonukleotid (5'- GCGCGGG - 3'). C

40% der über RIP-Seq als bevorzugt mit SERBP1 assoziierten Transkripte zeigen das identifizierte GC-reiche Motiv in ihrer 3′-UTR, eine Zahl, die viel höher ist als zufällig erwartet. D Ergebnisse des Luciferase-Assays zeigen, dass die Co-Transfektion eines SERBP1-Expressionsvektors die Expression von Reporterkonstrukten erhöht, die die 3'-UTR von Genen enthalten, die mutmaßliche SERBP1-Bindungsmotive zeigen. Als Negativkontrolle wurde GAPDH verwendet

SERBP1 ist ein Regulator des „Krebsstoffwechsels“

Um zu verstehen, wie SERBP1 zu krebsrelevanten Phänotypen beiträgt, führten wir eine RNA-Seq-Analyse in Kontroll- vs. SERBP1-Knockdown-U251-Zellen durch. Der SERBP1-Knockdown verringerte die Expression eines großen Satzes von Genen, die mit dem Stoffwechsel und der Stoffwechselregulation verbunden sind, wie durch die am höchsten angereicherten Gene Ontology-Terme veranschaulicht ( 4a , Zusätzliche Datei 7: Tabelle S6). Die Netzwerkanalyse zeigte, dass dieser Satz von Genen, die mit dem Stoffwechsel verbunden sind, stark miteinander verbunden ist (Abb. 4b). In ähnlicher Weise stellte die RIP-Seq-Analyse fest, dass mehrere von SERBP1 gebundene Transkripte (Gene) am Stoffwechsel beteiligt sind (Zusatzdatei 7: Tabelle S6). Insbesondere zwei miteinander verbundene Stoffwechselwege, die Serinbiosynthese und der Ein-Kohlenstoff-(1C)-Zyklus, werden stark vom SERBP1-Knockdown beeinflusst (Abb. 4c). Die veränderte Expression von Genen, die mit diesen Signalwegen verbunden sind, wurde durch qRT-PCR und Western Blot validiert (Abb. 4d, e). Die Immunfärbung von Xenotransplantaten zeigte auch, dass der SERBP1-Knockdown auch eine dramatische Abnahme der PHGDH-Expression in Tumoren hervorrief ( 4f ).

SERBP1 reguliert den Stoffwechsel. ein Enriched Gene Ontology (GO)-Begriffe, die sich auf Gene beziehen, die auf SERBP1 in U251-Zellen herunterreguliert werden. Das Genset wurde mit Panther [24] analysiert und die GO-Begriffe wurden mit Revigo zusammengestellt [25]. Die meisten repräsentativen Begriffe im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel sind aufgelistet. B Netzwerkanalyse von Genen, die am Stoffwechsel beteiligt sind, der durch den SERBP1-Knockdown beeinflusst wird. Das Netzwerk wurde unter Verwendung von String [26] unter Berücksichtigung der Interaktion (experimentelle Beweise), des Text-Mining und des gleichzeitigen Auftretens aufgebaut. Zur Kennzeichnung von Clustern wurden verschiedene Farben verwendet. C Schematische Darstellung des Ein-Kohlenstoff-Zyklus, die Gene zeigt, die vom SERBP1-Knockdown betroffen sind. D, e qRT-PCR und Western-Blot-Analyse in U251- und U343-Zellen bestätigten den Einfluss von SERBP1 auf die Expression kritischer Gene, die am Stoffwechsel beteiligt sind. F Repräsentative PHGDH-Immunfärbung von Tumoren aus der Xenograft-Studie für jede Gruppe. Maßstabsbalken = 60 μm

Der Ein-Kohlenstoff-(1C)-Stoffwechsel ist ein universeller Folat-abhängiger Stoffwechselweg, der 1C-Einheiten produziert, die für die De-novo-Purin- und Thymidylat-Synthese, die Umwandlung mehrerer Aminosäuren, die Produktion universeller Methyl-Donoren und die Regeneration von Redox-Kofaktoren verwendet werden, die alle dem Krebs zugute kommen Überleben [27]. Das Targeting einiger 1C-Enzyme wurde bereits als therapeutische Strategie untersucht [27,28,29]. Relevante 1C-Gene umfassen PHGDH (3-Phospho-Glycerat-Dehydrogenase), SHMT2 (Serin-Hydroxymethyl-Transferase 2), MTHFD2 (Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase 2) und PSAT1 (Phosphoserin-Aminotransferase 1) (Fig. 4b). In Krebszellen wird 3-Phosphoglycerat als Teil eines wachstumsfördernden Mechanismus verwendet, um Serin und Glycin zu synthetisieren und NADPH zu erzeugen. Die Hälfte des von Glucose abgeleiteten Kohlenstoffs wird in der Serinbiosynthese verwendet und PHGDH fungiert als limitierendes Enzym in diesem Prozess [30]. PHGDH wird bei Gliomen überexprimiert und beeinflusst die Invasion und Angiogenese [31]. SHMT2 ist ein kritisches Enzym im 1C-Zyklus [32] und kontrolliert einen kritischen Punkt im Krebsstoffwechsel – die Richtung der Serin/Glycin-Umwandlung. Eine Verarmung an Serin hemmt die Proliferation von Krebszellen und senkt die Purinspiegel, ein ähnlicher Effekt wird nach dem SHMT2-Knockdown beobachtet [27]. MTHFD2 ist ein NAD+-abhängiges Enzym mit Dehydrogenase- und Cyclohydrolase-Aktivität, das am mitochondrialen 1C-Folat-Stoffwechsel beteiligt ist und es ist eines der am häufigsten in Tumoren überexprimierten Stoffwechselenzyme [33]. PSAT1 ist ein kritisches Enzym im Unterweg, das L-Serin aus 3-Phospho-D-Glycerat synthetisiert. Eine hohe PSAT1-Expression korreliert mit einer schlechten Prognose bei vielen Tumoren, einschließlich Brustkrebs, kolorektalen, nasopharyngealen und ösophagealen Karzinomen und ist mit einer Arzneimittelresistenz verbunden [34,35,36,37].

Wir haben eine Stoffwechselstudie durchgeführt, um die Ergebnisse unserer RNA-Seq-Analyse zu bestätigen. Da der SERBP1-siRNA-Knockdown die Lebensfähigkeit und Apoptose deutlich beeinflusste, entschieden wir uns für die Verwendung einer stabilen U251-Linie mit einer tet-induzierbaren shRNA. Die an den Metabolomics-Daten durchgeführte Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigt eine deutliche Trennung zwischen der Kontroll- und der SERBP1-Knockdown-Gruppe (Zusatzdatei 1: Abb. S4A-B). Die Daten des Vulkanplots zeigen eine signifikante Erschöpfung der Zwischenprodukte des Methylzyklus (S-Adenosylhomocystein und Methionin) und die Akkumulation der Zwischenprodukte des 5-Methylthioadenosin (MTA)-Zyklus (Putrescin und N-Acetylputrescin) (Zusatzdatei 1: Abb. S4C). Metabolische Analysen bestätigten, dass SERPB1 den Serinmetabolismus moduliert und den Transfer der Ein-Kohlenstoff-Einheit (C1) vom Folat-Zyklus in den Methyl-Zyklus stört. Diese Veränderung könnte die DNA/Histon-Methylierung, die Regeneration von Redox-Cofaktoren und die Nukleotid-Biosynthese verändern [27, 38, 39]. Der Effekt ist aus der signifikanten Verarmung von Methionin und S-Adenosylhomocystein (SAH) ersichtlich, dem Nebenprodukt der Methylierung, das Methionin durch den Beitrag einer Methylgruppe aus dem 1C-Zyklus-Zwischenprodukt Methyltetrahydrofolat (Methyl-THF) recycelt (Abb. 5a, c .). und zusätzliche Datei 1: Abb. S4). Hohe Methioninspiegel in der Zelle sowie eine methioninreiche Ernährung wurden mit der Tumorprogression in Verbindung gebracht [40, 41]. Andererseits deutet eine signifikante Hochregulierung der Polyaminvorläufer Putrescin und N-Acetylputrescin auf die Nichtverfügbarkeit von Methionin und seinem Metaboliten S-Adenosylmethionin (SAM) hin. SAM liefert Putrescin die Aminopropylgruppe für die Polyaminsynthese über den MTA-Zyklus [ 42]. Darüber hinaus ist die Verarmung an Cystein mit der Herunterregulierung der Cystathionin-β-Synthase (CBS) verbunden, die die Biosynthese von Cystein aus SAH katalysiert, mit Homocystein und Cystathionin als Zwischenstufen [38].

Auswirkungen von SERBP1 auf Ein-Kohlenstoff- und Methyl-Zyklen und potenzielle nachgeschaltete Effekte. ein Die metabolische Analyse zeigt, dass die Stilllegung von SERBP1 die Produktion von Metaboliten beeinflusst, die mit Ein-Kohlenstoff-, Methyl- und MTA-Zyklen verbunden sind. B Intrazelluläre Glutathionspiegel nach SERBP1-Silencing. C Modell für den Einfluss von SERBP1 auf den Stoffwechsel und funktionelle Downstream-Effekte

Eine Abnahme der Gesamtspiegel von Glutathion wurde durch einen auf Lumineszenz basierenden Assay bestimmt (Fig. 5b). Da Cystein eine Vorstufe von Glutathion (GSH), einem redoxregulierenden Metaboliten, ist, könnte sein Abbau das Redoxgleichgewicht in SERPB1-Knockdown-Zellen beeinflussen (Abb. 5c). Ebenso signifikante Erschöpfung von Coenzym Q10 (KoQ10h2) oder ein hohes CoQ10/KoQ10h2 Verhältnis in der Knockdown-Gruppe deutet auf eine Fehlregulation der mitochondrialen Atmungskette (mETC), eine Hemmung der oxidativen Phosphorylierung und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) hin, die letztendlich die Apoptose auslösen [43]. CoQ10 is a lipophilic redox cofactor that functions as an electron carrier in the mETC and generates the proton gradient that drives ATP synthesis through oxidative phosphorylation [44] (Fig. 5a, c). In summary, the results of the metabolic analysis support the changes observed in the genomic study, establishing SERBP1 as a novel regulator of metabolic pathways. Full results of the metabolic analysis are shown in (Additional File 8: Table S7).

SERBP1 impact on neuronal differentiation, “stemness,” and epigenetic regulation

Genes upregulated after SERBP1 knockdown are preferentially associated with nervous system development, neurogenesis, and synaptogenesis according to GO analysis (Fig. 6a, b Additional File 1: Fig. S5, Additional File 7: Table S6). This data suggests that SERBP1 could function as a “repressor” of neuronal differentiation. In fact, according to our previous analysis [46], most of these genes show an increase in expression during neurogenesis (Fig. 6c). SERBP1 shows the opposite pattern NSCs and GSCs display high levels of SERBP1 while decreased expression occurs when cells are induced to differentiate (Fig. 6d, Additional File 1: Fig. S6A-B). Next, we performed gene expression correlation analyses with R2 using TCGA GBM and brain samples. Genes showing strong negative correlation with SERBP1 are found in many GO-enriched categories previously identified in analyses of genes upregulated upon SERBP1 knockdown (e.g., synapse organization, nervous system development, and neurogenesis) (Additional File 9: Table S8, Additional File 10: Table S9). Overall, these results suggest that SERBP1 represses neuronal differentiation. We then evaluated whether increased SERBP1 expression can disrupt neuronal differentiation using the neuroblastoma BE-(2)-C cell line. Cells were infected with either SERBP1 expressing or control lentivirus and treated with or without retinoic acid (RA) to induce differentiation. After 4 days, we used an Incucyte system to measure neurite outgrowth as an indicator of differentiation. RA treatment effectively induced neurite formation but SERBP1 overexpression diminished the effect (Additional File 1: Fig. S6C-E).

SERBP1 knockdown increased expression of genes linked to neurogenesis and nervous system development. ein Enriched Gene Ontology terms related to genes upregulated upon SERBP1 knockdown in U251 cells. Gene set was analyzed using Panther [24] and GO terms were compiled using [25]. Most representative terms associated with nervous system development and function are listed. B Network analysis of genes implicated in neuronal differentiation affected by SERBP1 knockdown. The network was built using String [26] considering interaction (experimental evidence), text mining, and co-occurrence. Different colors were used to indicate clusters. C Heatmap shows that genes upregulated upon SERBP1 knockdown cells display increased expression during murine neurogenesis—0 day/stem vs. 4 days/differentiated cells. D qRT-PCR shows SERBP1 and β-III Tubulin expression in neuronal stem cells (NSCs) and differentiated cells. e Genes upregulated upon SERBP1 knockdown showing decreased expression in GBM in reference to LGG are labeled in blue, genes that show reduced expression in GBM in reference to normal brain (cortex) are labeled in green and genes that are methylated (H3K27me3) in GBM cells [45] are labeled in orange. F Western blot showing that SERBP1 knockdown leads to a decrease in H3K27me3 in GBM cells

The effect of SERBP1 on methionine production could ultimately influence histone and/or DNA methylation. Therefore, SERBP1 could function as an epigenetic modulator, indirectly repressing the expression of genes implicated in neuronal differentiation. Gene set enrichment analysis (GSEA) identified strong similarities between the list of upregulated genes in SERBP1 knockdown cells and binding profiles of H3K27me3 and EZH2 and SUZ12, two members of PRC2 which trimethylate histone H3 on lysine 27 (Additional File 11: Table S10). Analysis of H3K27me3 profiles in GBM cells [45] confirmed that several genes “repressed” by SERBP1 show H3K27me3 sites (Fig. 6e, Additional File 12: Table S11). Consistent with these results, levels of expression for most of these genes are decreased in GBM samples in comparison to brain (cortex) and LGG (Fig. 6e, Additional File 13: Table S12. Corroborating the association between SERBP1 and H3K27me3, we determined by Western analysis that SERBP1 knockdown in GBM cells reduced H3K27me3 levels (Fig. 6f).

We then tested if a reduction in SERBP1 levels could increase GBM cell sensitivity to PRC2 inhibition. EED226 is a potent and selective PRC2 inhibitor that directly binds to the H3K27me3 binding pocket of EED. Control and SERBP1 knockdown cells were treated with 20 or 40 μM of EED226 and cell proliferation was followed over time with an Incucyte. Since the impact of SERBP1 on cell proliferation is very strong, we decided to use a partial SERBP1 knockdown (40–50% reduction in proliferation) to appreciate the effect of combined treatment. While control cells showed almost no response to EED226 treatment, SERBP1 knockdown cells showed decreased proliferation in response to treatment (Additional File 1: Fig. S7A,S7C). To better illustrate the differences between siRNA control and SERBP1 knockdown cells, we show proliferation at the terminal time point, comparing EED226-treated cells to its respective untreated control (Additional File 1: Fig. S7B, S7D).

In line with these findings, we observed that SERBP1 knockdown decreased expression of several genes associated with PI3K/AKT signaling (Additional File 1: Fig. S8A, Additional File 7: Table S6) which has been shown to modulate the cancer epigenome through methylation [47]. Corroborating the connection between SERBP1 and the PI3K/AKT pathway, knockdown of SERBP1 reduced levels of AKT and p-AKT in U251 and U343 cells as observed by Western blot (Additional File 1: Fig. S8B). Finally, using the glioma cohort from the Shanghai Changzheng, we determined that AKT1 and SERBP1 display good expression correlation based on immunostaining (Additional File 1: Fig. S8C).

Finally, we examined whether increased expression of SERBP1 could contribute to stem cell features. We generated, via lentiviral infection, a U343 line that overexpresses SERBP1 (SERBP1 OE) (Additional File 1: Fig. S2G-H). Control (empty vector) and SERBP1 OE cells were grown as neuro-spheroids in stem cell media. SERBP1 OE cells were more efficient in forming spheres than controls and the difference increased in higher passages (Additional File 1: Fig. S9A-B). SERBP1 OE cells also showed increased expression of stem cell markers by qRT-PCR (Additional File 1: Fig. S9C). Increased metabolism and radio-resistance are characteristics of “cancer stem cells” [48]. We observed that SERBP1 OE cells also had increased mitochondrial respiration and ATP production compared to controls (Additional File 1: Fig. S9D-E). Consistent with the finding that that high SERBP1 expression influences response to radiation in GBM patients (Fig. 1G), SERBP1 OE cells were more resistant to radiation than controls as shown in a colony formation assay (Additional File 1: Fig. S9F).

Overall, our results indicate that SERBP1 contributes to GBM poorly differentiated state and glioma stem cell phenotypes by repressing genes implicated in neuronal differentiation and neuronal function. SERBP1 could influence epigenetic regulation by controlling methionine production via the one-carbon and methyl cycles and the AKT pathway.


Abstrakt

Fatty acid, polyketide, and nonribosomal peptide biosynthetic enzymes perform structural modifications upon small molecules that remain tethered to a carrier protein. This manuscript details the design and analysis of cross-linking substrates that are selective for acyl carrier proteins and their cognate condensing enzymes. These inactivators are engineered through a covalent linkage to fatty acid acyl carrier protein über post-translational modification to contain a reactive probe that traps the active site cysteine residue of ketosynthase domains. These proteomic tools are applied to Escherichia coli fatty acid synthase enzymes, where KASI and KASII selectively cross-link ACP-bound epoxide and chloroacrylate moieties. These mechanism-based, protein–protein fusion reagents also demonstrated cross-linking of KASI to type II polyketide ACPs, while nonribosomal peptide carrier proteins showed no reactivity. Similar investigations into protein–protein interactions, proximity effects, and substrate specificities will be required to complete the mechanistic understanding of these pathways.


Diskussion

IL-1β is a pro-inflammatory cytokine involved in various liver diseases [6]. In this study we report that pre-treatment of hepatocytes with IL-1β enhances FasL-induced caspase-3/-7 activity, but astonishingly diminishes FasL-induced apoptosis. In the literature, contrary effects of IL-1β on cell viability are described. An in vivo study demonstrated that a pre-treatment of mice with IL-1β protected the animals from subsequent liver injury by Fas-dependent apoptosis. These mice showed decreased liver enzyme serum concentrations, reduced caspase-3/-7 activity levels and prolonged survival [3]. On the other hand, in pancreatic MIA PaCa-2 cells IL-1β mediated cell death by triggering the phosphorylation of JNK due to ER stress [30].

Our results demonstrate that treatment of hepatocytes with IL-1β alone resulted in a time-dependent phosphorylation of JNK1/2, which was previously described in mouse embryonic fibroblasts and in the rabbit liver [31], [32]. This JNK1/2 activation was essential for the crosstalk of IL-1β in the presence of FasL as its inhibition, but not that of p38 MAPK, abolished the increase in caspase-3/-7 activity that was mediated by IL-1β pre-treatment. JNK is known to be crucial for modulating the activity of pro-apoptotic BH3-only proteins. In vitro und in vivo (thymus) studies showed that Bim and Bmf were phosphorylated by JNK in response to UV or during thymic selection [23]. Similarly, we recently reported that gliotoxin, a fungal toxin of Aspergillus fumigatus, induced apoptosis via JNK1/2-mediated phosphorylation of Bim at three sites (S100, T112 and S114) [24]. Bim phosphorylation by JNK1/2 was shown to increase its binding affinity to Bcl-2-like survival factors which translated into a better activation of Bax/Bak with subsequent cytochrome c release and caspase-3/-7 activation [23], [24]. In agreement with this, we could observe increased caspase-3/-7 levels after stimulation with IL-1β + FasL, and this response was abrogated in Bim -/- hepatocytes as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. In addition to Bim, we showed that Bid was crucial for the increased caspase-3/-7 activity. Bid -/- hepatocytes were unable to increase caspase-3/-7 activity upon IL1β + FasL treatment, thus preserving cell viability.

Our experimental observations are supported by a mathematical model, which was established to confirm that our network structure covers the observed effects in all scenarios and explains the underlying mechanism. The model indicates that the sensitizing is due to a depletion of free anti-apoptotic Bcl-2 proteins after tBid and Bim were formed and/or activated in response to IL-1β and FasL treatment. FasL contributes to apoptosis by cleaving full-length Bid into the pro-apoptotic tBid form, whereas IL-1β enhances the pro-apoptotic activity of Bim by JNK1/2-mediated phosphorylation (pBim). tBid and pBim bind to anti-apoptotic Bcl-2 proteins with high affinities. Hence, when cells are treated with FasL or IL-1β alone, either one of the BH3-only proteins is fully sequestered by Bcl-2 proteins. However, if both stimuli are present, the Bcl-2 protein buffer is insufficient to block tBid and pBim simultaneously leading to free amounts of the BH3-only proteins which can then directly activate Bax/Bak and trigger MOMP, cytochrome c release and increased caspase-3 activation. Thus, IL-1β sensitizes hepatocytes to FasL-induced caspase-3/-7 activation by shifting the balance from anti- to pro-apoptotic Bcl-2 proteins. The crucial role of Bid, Bim and JNK1/2 was further emphasized by simulating the knockout and inhibition scenarios. MOMP was ablated in both Bid -/- and Bim -/- knockout cells as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. While in Bid -/- cells, blockage of MOMP was because FasL could not trigger tBid formation, in Bim -/- cells and wt hepatocytes treated with SP600125 IL-1β was unable to favour MOMP via Bim phosphorylation. However, the question remained how IL-1β could increase FasL-induced caspase-3/-7 activation but at the same time attenuate FasL-induced cell death.

The threshold for MOMP-activation may significantly vary in individual cells within a population [33]–[35]. The intracellular ratio of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins determines the susceptibility of individual cells to apoptotic stimuli [36], [37]. Furthermore, Kallenberger et al. described heterogeneous caspase-8 activation in individual cells following FasL stimulation that critically depended on the quantity of FasL - Fas interaction and DISC formation [29]. We observed that only a fraction of hepatocytes died after 3 h of FasL treatment, whereas others appeared resistant to the stimulus. Our mathematical simulations showed that this heterogeneity may be explained by the dependence of caspase-3 activation and thus cell fate on different initial protein levels of Fas and Bcl-2. Accordingly, IL-1β pre-treatment favors MOMP-mediated apoptosis by influencing the Bcl-2 balance and thus promotes increased caspase-3 activity, but only in those cells which are susceptible to FasL-induced cell death anyway. Thereby, IL-1β pre-incubation leads to higher average caspase-3 levels but not to increased cell death. Our model predicts that pre-incubation with IL-1β changes the ratio of survivors, type I cells and type II cells. This could be verified by monitoring single cell responses to FasL and IL-1β + FasL stimulation distinguishing between type I and type II cells. So far the missing increase of PARP cleavage, the downstream event of caspase-3/-7 activation, supports our hypothesis.

We observed an enhancement of NF-㮫 DNA binding activity and induction of the NF-㮫 target gene A20 after treatment with IL-1β + FasL, whereas NF-㮫 DNA binding activity and A20 mRNA induction was reduced when IL-1β was substituted by TNFα ( Figs. 8 and ​ and9A). 9A ). Enhanced expression of A20 could be confirmed on the protein level ( Fig. 9 B-D ). This might explain increased cell viability of IL-1β + FasL treated hepatocytes. A20 is an inhibitor of caspase-8 activation and thereby can mediate a protective effect on FasL-induced apoptosis [28]. In our mathematical model, expression of the protective protein X that could be A20 can explain decreased caspase-3 activity in Bid -/- hepatocytes treated with IL-1β + FasL as well as increased cell viability in wt cells after treatment with IL-1β and FasL ( Fig. 13B ).

In addition to NF-㮫 activation and increased expression of A20 other survival signaling such as the PI3K/Akt pathway might be crucial for IL-1β-mediated protection. For example, active caspase-3 may trigger Akt activation and protection from apoptosis by proteolytic cleavage of RasGAP to a N-terminal fragment [38]. Furthermore, proteins that directly associate with active caspases and block their proteolytic activity such as the HGF-receptor domain, survivin or XIAP may suppress cell death induced by FasL [12], [39], [40]. Our results with XIAP - / - hepatocytes did not reveal any implication of XIAP in the IL-1β–mediated survival response. Whether Akt or other cellular caspase inhibitors are involved in the protective effect remains to be elucidated.

Altogether, we characterized the IL-1β-mediated sensitizing effect on FasL-induced caspase-3/-7 activation via comprehensive studies. Based on our experiments and according to our mathematical model it can be assumed that IL-1β exerts two distinct effects on FasL-induced apoptosis. On one hand it shifts the balance of Bcl-2 proteins to favoring MOMP and increasing the average caspase-3/-7 activity. On the other hand this pro-apoptotic effect is minimized by elevating A20 levels, which may reduce caspase-8 activation and further caspase-3 activation. Therefore, cells that show only a weak response to FasL stimulation and low caspase-8 levels could be rescued by a pre-incubation with IL-1β resulting in elevated cell viability. Moreover, we hypothesize that the seemingly contradictory results of increased caspase-3/-7 activity but decreased cell death do not represent the situation in a single cell but the average of a cell population.


THE EFFECTS OF PROTEIN BINDING ON THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF THE MEMBRANES

Proteins have a limited number of interaction partners and often display their functions through bimolecular interactions. However, biological membranes display physical properties that cannot be explained at the single-molecule level. For example, membranes display trans-bilayer coupling, phase behavior, and elasticity. The chemical composition of the bilayer affects its mechanical properties and, conversely, membranes adapt their compositions such that the physical properties are maintained when external conditions change (Janmey and Kinnunen, 2006). Peripheral membrane proteins can cause changes in the physicochemical properties of the membranes, such as alterations in membrane fluidity and phase behavior, and can induce formation of lipid microdomains.

Protein-induced lipid clustering can be studied by fluorescence spectroscopy using an acyl chain–labeled lipid molecule such as BODIPY-PI(4,5)P2 (Gambhir et al., 2004). This fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. If protein binding induces the formation of PI(4,5)P2 microdomains, BODIPY-PI(4,5)P2 molecules are clustered together, resulting in intramolecular self-quenching (Figure 4). In addition to BODIPY-labeled lipids, pyrene-labeled phospholipids can be applied to study lipid microdomain formation upon protein binding (Pap et al., 1995 Kinnunen and Holopainen, 2000). It is important to note that fluorometric lipid-clustering assays are very sensitive to small environmental changes for example, divalent cations induce phosphoinositide clustering in model membranes (Wang et al., 2012). Thus such assays should always be carried out with proper controls and special attention should be paid to ensure no changes in the buffer conditions occur during the assay.

FIGURE 4: Detection of PI(4,5)P2 microdomain formation by a fluorometric assay using BODIPY-PI(4,5)P2.Interaction of a protein in a multivalent manner with specific lipids (e.g., PI(4,5)P2) may induce lipid clustering. Furthermore, oligomerization of membrane-binding proteins may induce clustering of specific lipid molecules. The BODIPY fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. Upon lipid clustering, BODIPY-labeled lipids (e.g., PI(4,5)P2) form excimers, which results in intramolecular self-quenching of the BODIPY fluorescence. This change in BODIPY fluorescence can be applied for studying the effects of a protein on clustering of specific BODIPY-conjugated lipid species.

Other lipid probes, such as laurdan, prodan, and pyrene, are extensively used in studies concerning structural and dynamical properties of membranes (e.g., phase behavior, lipid order, membrane fusion). These probes can be incorporated into the lipid bilayer either alone or covalently linked to fatty acids. They locate at different depths in the bilayer and display distinct photophysical properties. Pyrene-labeled phospholipids are commonly used for studying lateral diffusion and segregation of lipids, as well as for membrane fusion assays (Kinnunen and Holopainen, 2000). Laurdan and prodan probes are sensitive to the physical state of the surrounding lipids, and are thus applied to study changes in lipid order and membrane-phase behavior (Parasassi et al., 1998 Krasnowska et al., 1998 Kaiser et al., 2009).


Methoden

Sequence alignment and family tree construction

Amino acid sequence alignments and family tree construction were performed by Genstruct, Inc. (Cambridge, MA, USA). Amino acid sequences were obtained from annotated protein sequence files obtained from the NCBI reference proteins database, RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) or from Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot/) ( 14 ). Rigorous identification of family member sequences was accomplished using position-specific iterated basic local alignment search tool ( psi-blast ) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Multiple sequence alignments for each family group were generated using the clustalw 2 software (http://www.clustal.org). Visualization and manual editing of alignments were performed using GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/). Interfamily sequence alignment was accomplished using a ‘sparse alignment’ approach [S. Smith (2009), personal communication] that aligns representative members of each family using clustalw 2 to define appropriate anchor points for the interfamily alignments. The final alignments were generated by manually adding additional proteins to the alignment, ensuring alignment of key anchor points identified in the sparse alignments. The final multiple sequence alignments used for the phylogenetic analysis are illustrated in the supplemental materials as Figures S1 and S2 for the PKMTs and the PRMTs (plus DOT1L), respectively.

The phylogenetic analysis of the aligned sequences was accomplished using the phylip package developed at the University of Washington (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). To facilitate bootstrap analysis of the data, the seqboot program was used to create 250 randomized data representations of the input alignment for analysis. The protdist program was used to calculate pairwise distance measures between the sequences within the alignments using the blosum 45 matrix, and the program neighbor was used to construct phylogenetic trees from the distance data using the neighbor joining method. Consensus trees were built using the consense utility and uprooted trees were drawn using the drawtree program.

Determination of PMT enzymatic activity

Recombinant protein production and activity assays were performed for the 11 PMTs as described elsewhere ( 15 S. R. Daigle, E. J. Olhava, C. A. Therkelsen, C. R. Majer, C. J. Sneeringer, J. Song, D. Johnston, M. Porter Scott, J. J. Smith, Y. Xiao, L. Jin, K. W. Kuntz, R. Chesworth, M. P. Moyer, K. M. Bernt, S. A. Armstrong, R. A. Copeland, V. M. Richon, R. M. Pollock, unpublished data).

Determination of inhibitor IC50 Werte

NS50 values for enzymes in the protein methyltransferase panel were determined under balanced assay conditions with both SAM and protein/peptide substrate present at concentrations equal to their respective Km Werte. Where a peptide was used as methyl-accepting substrate, the peptide is referred to here by the histone and amino acid residue numbers that it represents. For example, peptide H3:16–30 refers to a peptide representing histone H3 amino acid residues 16 through 30. Flag and his-tagged CARM1 (2–585) purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 0.25 n m against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:16–30 (R26-Me1). E. coli-expressed EHMT2 (913–1193) was assayed at a final concentration of 0.1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Full-length EZH1 and EZH2 were expressed as four-component complexes in insect cells and purified as described elsewhere ( 15 ). EZH1 (4 n m ) and EZH2 (4 n m ) four-component complexes were assayed against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:21–44. Insect expressed full-length PRMT1 was assayed at a final concentration of 0.75 n m against biotinylated peptide corresponding to H4:36–50. Flag-tagged full-length PRMT5 purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:1–15. E coli-expressed full-length PRMT8 was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:31–45. Full-length SETD7 purified from E coli was assayed at a final concentration of 1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Flag and his-tagged full-length WHSC1 was purified from 293 Zellen and assayed at a final concentration of 2.5 n m against avian oligonucleosomes.

Determination of METTL11A enzymatic activity

Histone H3 and Histone H4 (NEB, Ipswich, MA, USA) were diluted separately in assay buffer (20 m m Tris, pH 8.0, 0.002% Tween20, 0.005% bovine skin gelatin, and 0.5 m m DTT) to a final concentration of 200 n m in a 96-well plate (25 μL each well). To monitor the reaction, 300 n m S-[methyl- 3 H]-adenosyl- l -methionine (80 Ci/mmol, from ARC) together with 200 n m cold SAM (total SAM concentration = 500 n m ) was used in each reaction. For initial determination of activity, METTL11A (Sino Biologics, Beijing, China) was added to initiate the reaction (25 μL each well for final concentration of 50 n m ). The reaction was incubated at room temperature and quenched with 10 μL per well of 300 μ m unlabeled S-adenosyl- l -methionine (Sigma, St. Louis, MO, USA) at various time-points. For detection, 50 μL of reaction was transferred to a filter plate [Millipore (Billerica, MA, USA) Multiscreen HTS FB 1.0/0.65 μm], washed three times with 10% trichloroacetic acid, washed once with 95% ethanol, and read on the Top Count (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) after the addition of 30 μL scintillant. Having established histone H4 as the preferred substrate, the enzyme concentration was titrated from 5 to 40 n m , and the reaction progress over time was determined at each enzyme concentration as described previously.

Structure determination of DOT1L with SAH or SAM bound

DOT1L-1-416 was produced in E coli as either a GST or hexa-histidine N-terminal fusion protein. The GST-DOT1L-1-416 was cloned into the pGEX-KG vector and expressed in BL21 (DE3) cells (Novagen, Madison, WI, USA) with coexpression of chaperone plasmid pGTf2 (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) with 0.2 m m isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG), at 18 °C for 16 h. Cell pellets were suspended in buffer containing 50 m m Na2HPO4/NaH2Bestellung4, pH 7.5, 200 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. Cells were lysed by sonication. The supernatant was loaded onto a column of glutathione-sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA). Protein was eluted with buffer containing 10 m m reduced glutathione. The GST-tag was cleaved from DOT1L-1-416 by thrombin and removed by a second run on a glutathione-sepharose column. The tag-free protein was purified further by SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chromatography and eluted with 25 m m Tris–HCl, pH 8.0, 675 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. The protein was further purified by Superdex75 (GE Healthcare) chromatography in buffer containing 20 m m Tris–HCl, pH 8.0, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, and 1 m m dithiothreitol. Fractions of pure protein were pooled and concentrated to 40 mg/mL for crystallization work. The His-DOT1L-1-416 was cloned into pET30a vector with N-terminal His tag and expressed in BL21-Gold (DE3) (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA). The culture was incubated at 37 °C until OD600 reached 0.3 and continued at 25 °C until OD600 reached 0.7. Expression was induced by adding 0.2 m m IPTG, and cells were harvested after 4 h. Cell pellet was suspended in buffer A (20 m m Tris–HCl, 500 m m NaCl, 10 m m imidazole, 10% glycerol, 5 m m β-mercaptoethanol, pH 7.8) with 1 mg/mL lysozyme and incubated on ice for 30 min. The cells were sonicated and centrifuged. The supernatant was loaded onto Ni-NTA column (Qiagen, Valencia, CA, USA) that preequilibrated with buffer A and washed with the same buffer. Protein was eluted with 200 m m imidazole in the buffer A and then dialyzed against 20 m m HEPES, 50 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.5. The sample was loaded on a SP Sepharose Fast Flow column (GE Healthcare) and eluted with a linear gradient of 0–1 m NaCl. The target protein was concentrated and further purified by Superdex200 column (GE Healthcare) with 20 m m HEPES, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.8. Fractions of pure protein were pooled.

SAH or SAM (Sigma-Aldrich) was dissolved in the final DOT1L protein buffer to 100 m m . The DOT1L–SAH or DOT1L–SAM binary complex was prepared at a final concentration of DOT1L of 20 mg/mL (0.4 m m ) and SAH or SAM of 2 m m . Crystals were obtained in 1.94 m ammonium sulfate, 0.1 m sodium acetate, pH 5.3, and 2 m m TCEP by the hanging-drop method at 18 °C. The crystals were cryoprotected in 30% glucose and flash-frozen in liquid nitrogen. The diffraction data set for DOT1L–SAH was collected at beamline 17 U at Shanghai Synchrotron Radiation Facility and the data set for DOT1L–SAM was collected at beamline 21-ID-F at Advanced Photon Source in Argonne National Laboratory. All data were processed by HKL2000 ( 16 ). The SAH-bound crystal diffracted to 2.3 Å and the SAM-bound crystal diffracted to 2.1 Å, in the space group of P65 with one protein molecule in the asymmetric unit. The structures were solved by molecular replacement (Molrep) ( 17 ) using the published DOT1L–SAM structure (PDB ID: 1NW3) as a search model ( 18 ). Refinement was carried out by Refmac5 ( 19 ), and the model building was carried out by COOT ( 20 ). Detailed information on the diffraction data, refinement, and structure statistics is provided in Table S1.

The enzyme thus purified was tested for enzymatic activity in a radiometric assay of 3 H-CH3 transfer from labeled SAM (Perkin-Elmer) to purified nucleosomes from chicken erythrocytes according to the method of Fang et al. ( 21 ). The DOT1L used for crystallographic studies was found to have reproducible activity as a histone methyltransferase and displayed the following steady state kinetic parameters: kKatze = 0.3 per minute, = 0.67 μ m , = 8.6 n m , = 0.26 μ m . A more complete description of the enzymatic mechanism of DOT1L will be reported separately (A. Basavapathruni, C. R. Majer, R. A. Copeland and M. Porter Scott, manuscript in preparation).


Parallel single-cell analysis of active caspase-3/7 in apoptotic and non-apoptotic cells

Analysing the chemical content of individual cells has already been proven to reveal unique information on various biological processes. Single-cell analysis provides more accurate and reliable results for biology and medicine than analyses of extracts from cell populations, where a natural heterogeneity is averaged. To meet the requirements in the research of important biologically active molecules, such as caspases, we have developed a miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells. A stainless steel body with a carousel holder enables high-sensitivity parallel detections in eight microvials. The holder is mounted in front of a photomultiplier tube with cooled photocathode working in photon counting mode. The detection of active caspase-3/7, central effector caspases in apoptosis, in single cells is based on the bioluminescence chemistry commercially available as Caspase-Glo ® 3/7 reagent developed by Promega. Individual cells were captured from a culture medium under microscope and transferred by micromanipulator into detection microvial filled with the reagent. As a result of testing, the limits of detection and quantification were determined to be 0.27/0.86 of active caspase-3/7 content in an average apoptotic cell and 0.46/2.92 for non-apoptotic cells. Application potential of this technology in laboratory diagnostics and related medical research is discussed.

Miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells

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Neurotransmitter Function Presynaptic Neurotransmission: Alterations in Exocytotic/Secretory Machinery and Glutamate Signaling in Kindling☆

Asymmetric Accumulation of SNARE Complexes (7SC)

We have examined the state of the SNARE proteins and several of the SNARE regulators in hippocampi from kindled animals. Initial studies showed an asymmetric accumulation of 7SCs in ipsilateral hippocampal synaptosomes prepared from animals kindled by entorhinal stimulation ( Matveeva et al., 2003 ). Control experiments suggest that this ispsilateral buildup of 7SCs is a marker of some basic biochemical change occurring during kindling and is indicative of epileptogenesis. Asymmetric accumulation cannot be induced by electroconvulsive shock nor is it seen in synaptosomes prepared from tissues outside of the limbic system, eg, cerebellum or occipital cortex. It can be induced by stimulating at several different sites including entorhinal cortex, septal region and amygdala it develops in the ipsilateral hippocampus regardless of whether the right or left hemisphere is stimulated ( Matveeva et al., 2007 ). As with kindling, asymmetric 7SC accumulation is not simply a shock burst response, but requires time to evolve and stimulation within a frequency range that promotes kindling. The accumulation occurs gradually during kindling, mirroring the progression of Racine behavioral stages ( Fig. 1 A), but it is persistent and can still be detected up to 1 year after attaining a minimally kindled state defined as two successive Stage 5 seizures ( Matveeva et al., 2008 ). It appears that a certain minimal level of kindling induction is necessary to induce permanence of the 7SCs asymmetry. In animals advancing up to but not beyond Stage 3, the asymmetry begins to develop. If they receive no further stimuli, by 1 month after the last stimulation hippocampal 7SCs symmetry is regained ( Fig. 1 B). Further, we have shown that kindling and 7SC asymmetric accumulation is associated with an increase in the amplitude of spontaneous glutamate release in the ipsilateral DG, a decrease in amplitude in the ipsilateral CA3, and no changes in signaling in the ipsilateral CA1 of the rat hippocampus ( Matveeva et al., 2012a ). Interestingly, the frequency of glutamate release in the ipsilateral DG is smaller than that seen in the ipsilateral CA1. Thus, kindling seems to alter glutamatergic signaling in multiple areas of the hippocampus and which change occurs is location specific (ie, an increase in release quanta versus an increase in the frequency of release events).

Abbildung 1 . Asymmetric SNARE Complex (7SC) Accumulation Correlates with Kindling Stage. A) Animals were electrically kindled by amygdalar (open squares) or entorhinal cortical (closed squares) stimulation until they exhibited behavior consistent with the indicated Racine Stages. The next day, hippocampi were harvested from each animal and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured. One set of animals was fully kindled and hippocampi were harvest after 1 month (30 days). (B) Four cohorts of animals were held as naïve (no stimulation), kindled to Stage 2 by amygdalar (open bars), or kindled to Stage 4 by either amygdalar (hatched bars) or entorhinal cortical (solid bars) stimulation. Hippocampi were harvested from the animals either 1 day post stimulation or 1 month post stimulation and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured.

Once attained, the asymmetric accumulation of 7SCs is the most stable biochemical marker of kindling-induced epileptogenesis that we have been able to find in the literature ( Matveeva et al., 2008 ) It is not clear whether trans- oder cis-7SCs accumulate. Wenn sie sind trans-7SCs, it represents an increase in engagement of the membrane fusion machinery and our observations might be consistent with a focal enhancement of NT release. Wenn cis-7SCs accumulate, it might signal defective recycling machinery, although this would not be entirely consistent with the observed increases in NT release, particularly glutamate, measured in hippocampi from patients undergoing epilepsy surgery, in several reported seizure models, and the studies reported here.

At this stage of our investigations it is unclear whether the accumulation of 7SCs is merely an association or is part of a cause-effect relationship, either a driver of the kindled state or a sequela of the process. The control experiments described above demonstrate the tight correlation between kindling and asymmetric complex accumulation, but as discussed below, at least one anti-epilpetic drug can separate accumulation from kindling behavior. Further analysis with transgenic mice expressing reduced SNARE levels or defective SNARE regulation may prove to be a useful strategy to lower the availability of SNAREs and thus decrease the formation of 7SCs. Determining whether these conditions affect kindling progression might at least address whether complex accumulation is causative, responsive, or simply correlative. Either of the first two situations would indicate a locus for modification with agents useful to arrest epileptogenesis or quell epilepsy.


Schau das Video: Proteinbestimmung (August 2022).