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Was ist ein funktionsauslösender Antikörper?

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Ich lese einen Artikel in einer Zeitschrift über die Wirkung eines neuronalen Zelladhäsionsmoleküls auf die neuronale Entwicklung und in der Zusammenfassung dieses Artikels bin ich auf Folgendes gestoßen:

Die Autophosphorylierung und Aktivität von Pak1 wurden verstärkt, wenn isolierte Wachstumskegel mit NCAM-funktionsauslösenden Antikörpern inkubiert wurden, die die Interaktion zwischen NCAM und seinen extrazellulären Liganden nachahmen.

In dieser Arbeit wird das NCAM-Protein aktiviert, wenn es Antikörpern ausgesetzt wird, die die NCAM-Funktion auslösen. Ich verstehe, dass Antikörper Moleküle sind, die vom Immunsystem produziert werden und an Antigene binden. Ich bin mir jedoch nicht sicher, wie die Inkubation von Wachstumskegeln mit NCAM-auslösenden Antikörpern tatsächlich das NCAM-Protein selbst auslösen/aktivieren würde.

Ist es nicht der Zweck eines Antikörpers, an ein Antigen zu binden, damit es aus dem Körper entfernt werden kann? Ich bin mir nicht sicher, wie die Exposition eines Antigens seinem jeweiligen Antikörper seine Funktion auslösen würde. Ich habe mehrere andere Artikel über neuronale Zelladhäsionsmoleküle gelesen, bei denen Antikörper verwendet wurden, um ihre Funktion zu aktivieren. Ich habe bei Google nach funktionsauslösenden Antikörpern gesucht, aber keine brauchbaren Ergebnisse diesbezüglich gefunden. Alle Einblicke werden geschätzt.


Der Begriff "funktionsauslösende Antikörper" ist nicht üblich, diese sind eher als quervernetzende Antikörper bekannt. Wie Sie vielleicht wissen, hat ein Antikörper mehrere "Arme", wobei die Antigenbindungsregion oder Fab (Fstückchen einntigen Bind) am Ende. IgG-Antikörper haben 2 Arme, IgM können 10 haben. Die Fab Der Anteil ist im Allgemeinen bei allen Armen identisch, obwohl es möglich ist, sie unterschiedlich zu konstruieren. Dadurch kann der Antikörper gleichzeitig an mehrere Antigene binden und sie eng zusammenziehen.

NCAM ist ein homophiles Bindungsprotein mit einer extrazellulären Domäne, die an andere NCAM-Moleküle sowohl auf benachbarten Zellen als auch auf derselben Zelle bindet. Diese Bindung induziert strukturelle Veränderungen in der intrazellulären Domäne, die die Bindung und Aktivierung von Kinasen fördert, Proteinen, die andere Proteine ​​phosphorylieren (und somit aktivieren oder hemmen). Dies startet eine Signalkaskade, die Veränderungen in der Zelle induziert, typischerweise durch die Kontrolle der Aktivität von Transkriptionsfaktoren im Zellkern.

Rezeptoren sind im Allgemeinen nicht gleichmäßig über die Oberfläche der Zelle verteilt, sie existieren oft zusammen in Membranstrukturen, die als Lipid Rafts bekannt sind. Wenn sie nahe genug beieinander gezogen werden, können NCAM-Moleküle ihre Signalkaskaden von selbst beginnen, da Adapterproteine, die an die intrazellulären Domänen gebunden oder rekrutiert werden, aktiviert werden - die Kinasen und ihre Substrate befinden sich ebenfalls in unmittelbarer Nähe. Um diese Art von Signalgebung im Labor zu induzieren, können Zellen mit quervernetzenden Antikörpern behandelt werden, die die Rezeptoren zusammenziehen. Dies löst in der Tat die Funktion der Rezeptoren aus und beginnt ihre nachgelagerte Signalübertragung.

Quelle


Antikörper können als Enzyme fungieren (siehe https://en.wikipedia.org/wiki/Abzyme).

Wenn Sie den richtigen monoklonalen Antikörper verwenden, kann das variable Ende die richtige Form haben, um an die von Ihnen genannte Stelle zu binden.


Physiologie

3. Kontrolle des Ionenflusses durch sekretorische und epitheliale Zellen und Regulierung des Zellvolumens.

Bsp.: spannungsgesteuerte Ionenkanäle - wenn Na die Zellmembran depolarisiert

Ligand-gesteuerte Kanäle
1. geöffnet oder geschlossen durch Hormone
2. Zweite Boten
3. Neurotransmitter

Kohlendioxid, das Nebenprodukt der Zellatmung, ist klein genug, um leicht aus einer Zelle zu diffundieren.

Es ist sättigbar, trägervermittelt, Stereospezifität, Konkurrenz.

schneller als nur Diffusion

2. P - die Partialdruckdifferenz des Gases und ist umgekehrt proportional zur Membrandicke

3. A - Membranoberfläche. Größer ist besser

Flüssigkeit, gelöste gelöste Stoffe werden im Vesikel eingeschlossen, von AUSSEN entnommen

kleiner als Phagozytose
kommt in fast allen Zellen vor
konstitutiver Prozess b/c er tritt kontinuierlich auf
spezifische Reize sind nicht erforderlich
Am Rand der Membran können sich beschichtete Grübchen bilden

wie Transferrin (Eisenträger) von der Zelle aufgenommen werden kann.

Diphtherie-Toxin und einige Viren dringen so ein

sammeln sich in einem Vesikel an.
Ziel wandern zu Lysosomen innerhalb von Zellen. Verdauungsorganellen.
bringen Proteine, endozytische Vesikel und Proteasen in Lysosomen ein, die sie zerkleinern
der Weg, um es selektiv zu machen:

Axonendungen verwenden Exozytose. Estercholin in den Bläschen wartet. Mescalmembran zur Verschmelzung mit Lipiddoppelschicht und Verschmelzung über . löst Muskelkontraktionen aus.

Endokrinologie wie Insulin aus Pankreaszellen. in Vesikel gespeichert.

2. konstitutive Wege - Schleimproteine, die im endoplasmatischen Retikulum hergestellt werden. geht die ganze zeit. brauchen ständig klebrigen Schleim. also geht es einfach immer weiter. Zilienepithelzellen ziehen es an. Atmungszellen sezernieren es.

3. regulierter Stoffwechselweg – Insulin, das aus den Pankreaszellen nach dem Essen einer Mahlzeit freigesetzt wird. oder Neurotransmitter-Freisetzung an Synapsen. gezielt kontrollieren.

Kollagen kommt zum Aufbau der extrazellulären Matrix. fungieren als Anker wie Bindegewebe. aber sie können beschädigt werden. oxidiert. müssen recycelt werden. daher Endozytose.

Fe im Magen-Darm-Trakt absorbieren, muss Fe durch den Blutkreislauf zum Knochenmark transportieren. per Transferrin tragen. und Transferrinrezeptor.

Senden Sie es in Lysosomen und sie haben eine Umgebung mit niedrigem pH-Wert. Transferrin von der Oberfläche und verschmilzt mit Lysosomen und bei niedrigem pH-Wert und ändert die Form des Transferrinmoleküls und setzt Transferrin dort frei, wo die Zelle es verwenden kann.
Bsp.: Immunglobintransport

Brustdrüse - Milch machen. Lumen. Bei der Milchproduktion sind Immunglobine ein Molekül, das in die Milch gelangen kann. wichtig für das Immunsystem. wichtige Antikörper.

2. Regulation durch intrazellulär gesteuerte Liganden. Bsp: zyklische Nukleotid-gesteuerte Kanäle. Wichtig im Herzen. Die "lustigen" Kanäle, die cAMP im Inneren binden.

Körper hat einen "set Point" für die Menge an Ca
mmmol/L ist 1,0 ist (knapp darüber) bis 1,45 (knapp darunter)

Nierensteine, Verkalkung der Auskleidung der Blutgefäße, Verhärtung der Arterien bei zu viel Ca

muss wissen, wie man dies korrigiert und die richtigen Parameter erhält.

Unterstützung des Körpers bei der Ausführung seiner normalen Kontrollfunktionen als ND.

für die meisten Kontrollprozesse - im Raum oder im Körper - kontrolliert Ca - muss ein sensorisches System sein, das es überwachen kann.

Das macht das Thermometer im Klassenzimmer.
Im menschlichen Körper gibt es einen Ca-Rezeptor - sp-Protein - große aa - der auf der Oberfläche einiger unserer Zellen liegt.

Die endokrine Drüse - Nebenschilddrüse - steuert den Ca-Spiegel in unserem Blut. Brauchen Sie einen Rezeptor, der erkennen kann, wie viel Ca überhaupt vorhanden ist. Sitzt auf Zellen in der Nebenschilddrüse und wird ständig überwacht.
Wenn Ca zu sinken beginnt, wird mehr PTH freigesetzt. Imp-Funktionen auf Niere.
reguliert, wie viel Ca täglich Ihren Körper verlässt und mit Ihrem Urin ausgeschieden wird.

Niedrig NIEDRIG CALCIUM in Ihrem Blut (zu niedrig und Sie werden sterben) - Ca-Rezeptor erkennt, dass dieses b/c Ca nicht an Zellen bindet - hat eine Tasche, in die Ca passt - PTH geht durch das Blut und erreicht die Nieren und bildet Nieren halte dich an Ca. Gegenteil, wenn Sie zu viel haben. PTH ist niedrig und die Nieren lassen Ca den Körper mit dem Urin verlassen.

wie der Körper Ca aus Nahrungsquellen aufnimmt.
Calcitonin-Enzym.
Vit D ist wichtig für die Ca-Absorption


Einführung

Das Zelladhäsionsmolekül L1 (auch L1CAM oder CD171 genannt), ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie der Zelladhäsionsmoleküle, spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion. Im Nervensystem [1], [2] ist L1 bevorzugt in Axonen und Wachstumskegeln differenzierender Neuronen lokalisiert, unterstützt die Migration und das Überleben von Nervenzellen und fördert das Neuritenwachstum, die axonale Faszikulation [3]–[9], die Myelinisierung und synaptische Plastizität [10], [11]. Mutationen im X-Chromosom-lokalisierten L1-Gen beeinträchtigen die Funktionen des Nervensystems bei betroffenen Männern erheblich, einschließlich geistiger Behinderungen, Aphasie, schlurfender Gang und adduzierter Daumen (MASA-Syndrom) [12]–[14]. Darüber hinaus wurden Mutationen im L1-Gen auch mit Schizophrenie und Morbus Hirschsprung in Verbindung gebracht [15]. Neben seinen Funktionen im Nervensystem spielt L1 eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression und Metastasierung. L1 wird in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert, die nicht nur gastrointestinale Stromatumoren, Melanome, Neuroblastome, Schwannome, Paragangliome, Phäochromozytome neuroepithelialen und Neuralleisten-Ursprungs umfassen [16], sondern auch in Tumoren nicht-neuralen Ursprungs, wie Granularzelltumoren , Chondrosarkom und Kaposi-Sarkom, kapillares Hämangiom, Lymphoblastom und Krebserkrankungen der Speiseröhre, des Dickdarms und der Eierstöcke [17] [18]. Aufgrund seiner zentralen Bedeutung für die Reparatur des Nervensystems und das metastatische Verhalten von Tumoren suchten wir nach Antikörpern, die durch Reaktion mit verschiedenen Domänen des menschlichen L1-Moleküls einerseits seine vorteilhaften Funktionen auslösen und , andererseits die schädlichen Funktionen des Moleküls hemmen.


1. EINLEITUNG

Das Zelladhäsionsmolekül L1 (L1) spielt wichtige funktionelle Rollen im sich entwickelnden und adulten Nervensystem, wie seine Beteiligung an der neuronalen Migration und dem Überleben, dem Axonwachstum und der Faszikulation, der Myelinisierung, der synaptischen Plastizität, dem Lernen und dem Gedächtnis sowie der Regeneration nach . zeigt Verletzung. 1-5 Beim Menschen wird L1 mit neuralen Störungen in Verbindung gebracht, wie dem L1- und fetalen Alkoholsyndrom, der Hirschsprung-Krankheit, Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit. 1, 6-12

Die vorteilhaften Funktionen von L1 hängen von seiner proteolytischen Spaltung durch verschiedene Proteasen ab, wie Trypsin, 13 Plasmin, 14, 15 Proproteinkonvertase PC5A, 16 Neuropsin, 17 Cathepsin E, 18 Mitglieder der ADAM (ad isintegrin and am etalloprotease) Familie , 19-24 β-Sekretase, 25 γ-Sekretase-Komplex, 23, 24 und die ungewöhnlichen Proteasen Reelin, 26 und das basische Myelinprotein. 5, 27

Das 200 kDa lange L1-Molekül besteht aus extrazellulären Immunglobulin- und Fibronektin-Typ-III-ähnlichen Domänen, einer Transmembrandomäne und einem zytoplasmatischen Schwanz. Myelin-basisches Protein-vermittelte Spaltung in der extrazellulären L1-Domäne bei Arg687 führt zur Erzeugung und zum Kernimport eines sumoylierten 70 kDa-Fragments. 5, 27, 28 Cathepsin E-vermittelte Spaltung in der intrazellulären Domäne bei Asp1167 erzeugt ein sumoyliertes nukleäres 30 kDa-Fragment. 18, 28 Spaltung innerhalb der Transmembrandomäne durch den γ-Sekretase-Komplex ergibt ein nukleäres Fragment von 28 kDa, das an der Regulierung der nuklearen Signalübertragung und der Genexpression beteiligt ist. 23, 24 Nukleares L1 kann auch für die DNA-Reparatur wichtig sein, da die nukleäre Translokation der intrazellulären L1-Domäne die Checkpoint-Reaktionen auf DNA-Schäden und die Strahlenempfindlichkeit von stammzellähnlichen Gliomzellen reguliert. 29

Unter Verwendung der rekombinanten intrazellulären L1-Domäne für die Affinitätschromatographie identifizierten wir potenzielle L1-Bindungspartner in einem Kernextrakt des frühen postnatalen Mausgehirns: Spleißfaktor Prolin/Glutamin-reich (SFPQ auch bekannt als Polypyrimidin-Trakt-Bindungs-Associated-Spleiß-Faktor oder PSF), non -POU-Domäne mit Octamer-bindendem Protein (NonO) (auch bekannt als 54 kDa nukleares RNA- und DNA-bindendes Protein oder p54nrb), Paraspeckle-Komponente 1 (PSPC1), DNA-Topoisomerase I, Importin-β, Methyl-CpG-bindendes Protein 2 (MeCP2), WD-Repeat-Protein 5 (WDR5), die heterogenen nukleären Ribonukleoproteine ​​A1 (hnRNP-A1), A2/B1 (hnRNP-A2/B1) und A3 (hnRNP-A3), Histon H1.4, Nukleoporin 93 kDa (Nup93), Hitzeschock-verwandtes Protein 71 kDa (Hsc70) und Synaptotagmin 1. Wir überprüften die direkte Interaktion zwischen nuklearen L1-Fragmenten und den RNA- und DNA-bindenden Proteinen NonO, SFPQ und PSPC1 der Drosophila Behavior/Human Splicing (DBHS)-Familie und weisen darauf hin, dass nukleäre L1-Fragmente zur RNA-Prozessierung und -Transport, Transkription, Chromatinstruktur und DNA-Reparatur beitragen und dadurch zentrale Kernfunktionen im Nervensystem beeinflussen.


Regulierung des Adenosinspiegels in gesundem vs. bösartigem Gewebe

Extrazelluläres Adenosin, ein Nukleosid und Derivat von ATP, ist an der Regulierung verschiedener physiologischer Prozesse beteiligt, darunter Vasodilatation (4), Wasserrückresorption durch die Niere (5), Schmerzwahrnehmung (6) und Feinabstimmung des Schlaf-Wach-Zyklus (7). Obwohl die Konzentrationen von extrazellulärem Adenosin in gesundem Gewebe vernachlässigbar sind (8�), reichert sich dieses Nukleosid bei einer Verletzung stark im Interstitium an, wo es die Immunantwort stark einschränkt (12) und direkt die Wundheilung fördert (13). Unter homöostatischen Bedingungen in gesundem Gewebe liegt die zytosolische Konzentration von ATP im Bereich von 1 bis 10 mM (14), während die extrazellulären Werte vernachlässigbar sind (15). Dieser scharfe Gradient kann jedoch bei durch Nekrose, Apoptose oder mechanischen Stress induzierten Brüchen der Plasmamembran sowie durch regulierten ATP-Efflux schnell unterbrochen werden. Letzteres, ausgelöst durch eine Vielzahl von Reizen, einschließlich Hypoxie, Ischämie und Entzündungen, tritt nachweislich in großem Umfang auf über Exozytose, Transmembrantransfer durch ATP-bindende Kassette (ABC)-Transporter sowie durch Diffusion durch eine Vielzahl von Anionenkanälen oder nicht-selektive Plasmamembranporen, die von Connexinen, Pannexin-1 oder dem ATP-Rezeptor P2X7R (16�) gebildet werden. Zum Beispiel setzen stimulierte T-Zellen ATP über Pannexin-1-Hemikanäle frei und über Exozytose (19, 20).

Im extrazellulären Raum wird ATP durch Ektonukleotidasen (21, 22) schnell und schrittweise dephosphoryliert, darunter die E-NTPDase CD39, die ATP bzw. ADP in ADP bzw. AMP umwandelt, und die 5′-Nukleotidase CD73, die dephosphoryliert AMP zu Adenosin (18, 23) (Abbildung 1). Weitere Enzyme, deren Ektoaktivität zur extrazellulären Adenosinbildung beiträgt, sind andere E-NTPDases, Mitglieder der Ektophosphodiesterase/Pyrophosphatase (E-NPP) Familie, Nicotinamidadenindinukleotid (NAD + ) Glykohydrolasen, die Prostatasäurephosphatase (PAP) , und die alkalische Phosphatase (ALP) (21) (Abbildung 1). Kurz gesagt, das Coenzym NAD + , eine weitere zelluläre Schlüsselkomponente, deren extrazelluläre Konzentration im verletzten Gewebe signifikant ansteigt (24, 25), wird durch die NAD + Glycohydrolase CD38 in Adenosindiphosphat-Ribose (ADPR) umgewandelt (26), während ADPR sowie ATP vom E-NPP CD203a zu AMP metabolisiert werden (27). Darüber hinaus ist PAP, das überwiegend, aber nicht ausschließlich, im Prostatagewebe exprimiert wird (28), in der Lage, extrazelluläres AMP in Adenosin umzuwandeln (29), während ALP die Hydrolyse von ATP, ADP und AMP zu Adenosin katalysiert (21). Schließlich kann Adenosin auch intrazellulär produziert werden, entweder durch S-Adenosylhomocystein-Hydrolase (SAHH)-ausgeübte Hydrolyse von S-Adenosylhomocystein (SAH), einem Metaboliten des Transmethylierungsweges, oder durch löslichen CD73-vermittelten Katabolismus von AMP, einem Nukleosid, das an multipler zellulärer Prozesse und deren Konzentration innerhalb von Zellen mit geringer Energieladung (30) ansteigt (Abbildung 1). Intrazellulär erzeugtes Adenosin kann diffusionsbegrenzt durch bidirektionale äquilibrative Nukleosidtransporter (ENTs) sezerniert werden (31). Obwohl es jedoch Hinweise darauf gibt, dass Hypoxie die intrazelluläre Adenosinproduktion ankurbeln kann (32, 33), wird der Beitrag dieses Weges zum verletzungsbedingten interstitiellen Aufbau von Adenosin aufgrund der gleichzeitigen Hypoxie-induzierten Herunterregulierung der oben genannten Transporter als gering angesehen (34, 35 ). Aufgrund seiner vielfältigen Wirkungen unterliegt die Präsenz von Adenosin im extrazellulären Raum einer engen räumlich-zeitlichen Kontrolle (12, 13, 36). So wird beispielsweise der extrazellulären Akkumulation von Adenosin durch dessen Einschleusung durch HNO oder konzentrierte, Natriumgradienten-abhängige Symporter (31) sowie durch die Funktion der intra-/extrazellulären Adenosindeaminase (ADA) und der zytosolischen Adenosinkinase (ADK) entgegengewirkt. , die jeweils Adenosin in Inosin oder AMP umwandeln (37) (Abbildung 1).

Abbildung 1. Regulierung des interstitiellen Adenosinspiegels in verletztem Gewebe. Stressinduzierte, extrazelluläre Ansammlung von ATP oder NAD + treibt katabolische Adenosin-erzeugende Wege an, wie den durch CD39 und CD73 vermittelten. Die Aktivität anderer Ektonukleotidasen, einschließlich CD38, CD203a, ALP und PAP, trägt ebenfalls zur extrazellulären Adenosinakkumulation bei. Adenosin kann auch intrazellulär durch SAHH-ausgelöste Hydrolyse von SAH sowie durch löslichen CD73-vermittelten AMP-Katabolismus produziert und diffusionsbegrenzt von HNOs exportiert werden. Auf der anderen Seite begrenzt die Kombination von CD26-gebundener ADA-Aktivität und zellulärer Adenosinaufnahme, entweder durch äquilibrative ENTs oder durch konzentrierte CNTs, die interstitiellen Adenosinspiegel. Intrazellulär kann Adenosin durch seine Umwandlung in SAH durch SAHH, in AMP durch ADK oder in Inosin durch ADA eliminiert werden. SAHH, S-Adenosylhomocystein-Hydrolase SAH, S-Adenosylhomocystein-ENTs, äquilibrative Nukleosidtransporter CNTs, konzentrierte Nukleosidtransporter ADK, Adenosinkinase ADA, Adenosindeaminase.

Im Gegensatz zu homöostatischen Zuständen sind die ATP-Spiegel in der TME als Folge von Nekrose, Apoptose, Hypoxie und anhaltender Entzündung stark erhöht (17, 18) und intratumorale Adenosinspiegel können mikromolare Konzentrationen erreichen (9, 10, 38) . Der ATP-Katabolismus in Tumoren wird hauptsächlich durch CD39 und CD73 vermittelt (39�), und eine hohe Expression dieser Ektonukleotidasen ist stark mit einem schlechten klinischen Ergebnis bei Patienten mit einer Vielzahl von Krebsarten verbunden (3, 42, 43). Insbesondere wurde CD39- und/oder CD73-(Über-)Expression auf der Oberfläche von Tumorzellen (39, 44�), Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) (52�), mesenchymalen Stammzellen und Stromazellen (55& #x0201357), Endothelzellen (ECs) (45, 46, 51), myeloische Suppressorzellen (MDSCs) (58�), tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) (53, 61), Tregs (46, 62�) , NS17 Zellen (65) und von Antigen erfahrenen/erschöpften konventionellen CD4 + und CD8 + T-Zellen (64, 66�). Darüber hinaus tragen CD39/CD73-tragende Exosomen (69, 70), die von Tumorzellen (71), Tregs (72) und MDSCs (57, 73) freigesetzt werden, weiter zur Adenosinbildung bei. Derzeit werden Hypoxie sowie unaufhörliche Entzündungen als Haupttreiber der intratumoralen CD39- und CD73-Überexpression angesehen. Die durch Hypoxie induzierte (74, 75) HIF1α (76�) und Sp1 (80) Aktivität fördert nämlich die Expression dieser Ektonukleotidasen. Analog dazu werden Signalwege, die durch entzündungsassoziierte Moleküle initiiert werden, wie IL-2 (81), IL-6 (66, 82), IL-1β (83), TNFα (83�), Typ I IFNs (86, 87), IL-27 (66, 88), TGFβ (82, 89, 90) sowie durch Induktoren des Wnt (91, 92) oder cAMP (83, 93�) Signalwege erhöhen auch die CD39 (66, 81, 82, 88, 89, 95) und CD73 (81�, 89�) Spiegel.

Obwohl angenommen wird, dass der CD39- und CD73-vermittelte Katabolismus von extrazellulärem ATP für den Großteil der intratumoralen Adenosinerzeugung verantwortlich ist, steigen auch die Expressionsspiegel von Ektoenzymen, die an alternativen Adenosinproduktionswegen beteiligt sind, mit dem Aufkommen von Krebs. CD38 wird beispielsweise in neoplastischen Geweben häufig hochreguliert (26, 96, 97) und sporadische Hinweise deuten darauf hin, dass die CD203a-Spiegel auch auf TME-Komponenten ansteigen (98, 99). In gleicher Weise steigt die Serumkonzentration von PAP während des Fortschreitens des Prostatakrebses (100), während andere darauf hindeuten, dass es auch auf Krebsgewebe hochreguliert wird (28). Schließlich haben mehrere Studien erhöhte ALP-Spiegel auf Krebszellen gezeigt (101, 102) sowie eine Korrelation zwischen den Serum-ALP-Spiegeln und dem Krankheitsstadium (103�). Entscheidend ist, dass der relative Beitrag dieser alternativen Adenosin-produzierenden Wege zum intratumoralen Aufbau dieses Nukleosids noch zu bestimmen ist. Schließlich trägt neben der anomalen Produktion eine fehlerhafte Aufnahme aufgrund der Heruntermodulation äquilibrativer (106, 107) sowie konzentrierter (108�) Nukleosidtransporter, die ebenfalls durch Hypoxie (34, 35, 111) angetrieben werden, weiter zu Adenosin bei Akkumulation im TME.


Resultate und Diskussionen

ILC1 fehlen bei NKp46-defizienten Mäusen

Ein NKp46-Knockout (KO)-Mausmodell – in dem Ncr1, das für NKp46 kodierende Gen, wurde durch das grün fluoreszierende Protein (gfp) ersetzt (Ncr1 gfp/gfp ) [5,7] – wurde in dieser Studie verwendet. Die Entwicklung von ILC-Populationen wurde in verschiedenen Organen und Geweben im Vergleich zum Wildtyp (WT) bewertet (Ncr1 +/-), heterozygot (Ncr1 gfp/+) und KO (Ncr1 gfp/gfp ) Mäuse. Die Gating-Strategie für die durchflusszytometrische ILC1-Analyse ist in 1A gezeigt. Eine klare NK1.1 + NKp46 -Population (mehr als 50%) wurde innerhalb der NK1.1 + -Population in der Leber beobachtet (S1A Abb), in Übereinstimmung mit früheren Studien [8,9]. Die Intensität der CD49a-Oberflächenexpression war in der NK1.1 + NKp46 + CD49b ─ CD49a + ILC1-Population höher als in der NK1.1 + NKp46 ─ CD49b ─ CD49a + -Population, und die letztere Population zeigte einen Phänotyp von CD3 ─/dim (S1 und S2 Abb.). Dadi und Kollegen haben kürzlich eine ILC1-ähnliche Population definiert, die als T-Zell-Rezeptor (TCR)-Linie Typ 1 angeborene T-Zellen (ILTC1) bezeichnet wird, mit einem Phänotyp von NK1.1 + NKp46 ─ CD49a + [10]. Darüber hinaus gilt NKp46 als zuverlässiger Marker für ILC1s und NK-Zellen [9–11]. Daher wurde in der aktuellen Studie die ILC1-Untergruppe definiert als NK1.1 + NKp46 + (oder GFP + für KO-Mäuse)CD49b ─ CD49a + (Abb. 1A), die NK1.1 + NKp46 ─ CD49b ─ CD49a . nicht einschließt + Bevölkerung. Es war überraschend, dass im Vergleich zu Ncr1 +/+ Wurfgeschwister, proportional fehlte die ILC1-Untergruppe (CD49b ─ CD49a + ) in der Leber von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und war in der Leber von Ncr1 gfp/+-Mäuse (Abb. 1A, unteres Feld Abb. 1B, oberes Feld S2 Abb., oberes Feld), während der Prozentsatz der NK1.1 + NKp46 ─ (oder GFP ─ für KO-Mäuse) CD49b ─ CD49a + -Population nicht zu sein scheint anders unter den Ncr1 gfp/gfp , Ncr1 +/gfp , und Ncr1 +/+ Gruppen (S2 Abb, untere Tafel). Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung der ILC1-Untergruppe, dass auch die absolute Zellmenge in der Leber des Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und mäßig reduziert in der Leber von Ncr1 gfp/+ Mäuse im Vergleich zu ihren Ncr1 +/+ Wurfgeschwister (Abb. 1B, untere Tafel). Wir haben auch Marker wie CD62L, Eomesodermin (Eomes) und in T-Zellen exprimierte T-Box (T-bet) verwendet, um unsere Beobachtung bezüglich der Abhängigkeit von NKp46 für die ILC1-Entwicklung durch Vergleiche zu bestätigen Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und/oder Ncr1 +/gfp-Mäuse zu Ncr1 +/- Mäuse (S3 und S4 Fig.). Die Entwicklung von ILC-Populationen wurde auch in anderen Organen und Geweben bewertet, wobei die Leber als Referenzpunkt verwendet und die Ergebnisse in WT verglichen wurden (Ncr1 +/+ ) Mäuse zu Ncr1 gfp/gfp-Mäuse (Fig. 1C und 1D). Die Zellquantifizierung durch Durchflusszytometrie zeigte, dass ILC1s (CD49b ─ CD49a + ) im Knochenmark (BM), Milz und Dünndarm (SI) von . fast vollständig fehlten Ncr1 gfp/gfp-Mäuse (Fig. 1E). Im Gegensatz dazu änderte sich die absolute Zahl der NK-Zellen, die die Hauptpopulation sind, die NKp46 in getesteten Organen oder Geweben exprimiert, nicht signifikant in Ncr1 gfp/gfp-Mäuse im Vergleich zu ihren Ncr1 +/+ Wurfgeschwister, im Einklang mit einem früheren Bericht [7] (Abb. 1E, untere Tafel).

(A) Gating-Strategie für ILC1s. ILC1s wurden auf Lymphozyten gegatet und dann weiter definiert als Lin − NK1.1 + NKp46 + CD49b ─ CD49a + , mit der Ausnahme, dass GFP + verwendet wurde, um NKp46 + zu ersetzen, wenn Ncr1 gfp/+ oder Ncr1 gfp/gfp-Mäuse wurden verwendet. (B) Prozentsätze oder Mengen von ILC1s wurden durch durchflusszytometrische Analyse in der Leber von . bestimmt Ncr1 gfp/gfp , Ncr1 gfp/+ , und Ncr1 +/- Mäuse. (C) NK-Zellen wurden auf Lin NK1.1 + NKp46 + (oder GFP + für Ncr1 gfp/gfp-Mäuse)CD49b + CD49a ─ unter Lymphozyten. ILC1s wurden auf Lin NK1.1 + NKp46 + (oder GFP + für Ncr1 gfp/gfp-Mäuse)CD49b ─ CD49a + unter Lymphozyten. (D) Quantifizierung von ILC1s in verschiedenen Organen oder Geweben in Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und Ncr1 +/+ Wurfgeschwister, d. h. zusammenfassende Daten für (C). Jede Zeile zeigt Prozentsätze von ILC1s für ein Paar Ncr1 gfp/gfp und Ncr1 +/+ Wurfgeschwister. (E) Mengen von NK-Zellen oder ILC1s in verschiedenen Organen von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und ihre Ncr1 +/+ Wurfgeschwister (n = 4). Fehlerbalken, Standardabweichungen ***, P < 0,001 **, P < 0,01 *, P < 0,05. Die numerischen Daten für die Felder B, D und E finden Sie in S1 Data. Lin ─ , CD3 ─ CD19 ─ BM, Knochenmark FSC-A, Forward Scatter Area FSC-H, FSC Höhe FSC-W, FSC Breite GFP, grün fluoreszierendes Protein ILC1, angeborene Lymphoidzelle 1 NK, natürlicher Killer Ncr1, natürlicher Zytotoxizitätsrezeptor 1 SI, Dünndarm SSC-A, seitlicher Streubereich SSC-H, SSC-Höhe SSC-W, SSC-Breite.

Ncr1-gfp/gfp-Mäusen fehlen Tumornekrosefaktor (TNF)-verwandter Apoptose-induzierender Ligand (TRAIL) + ILC1s

Der TNF-verwandte Apoptose-induzierende Ligand (TRAIL) ist ein funktionelles Protein, das selektiv auf der ILC1-Untergruppe exprimiert wird und eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung der Zytotoxizität dieser Population gegen Zielzellen spielt, indem es den Todesrezeptor-transduzierten Signalweg auslöst [12]. Die Expression von TRAIL und das Fehlen von CD49b-Expression können auch verwendet werden, um ILC1s von NK-Zellen zu unterscheiden [13], da ruhende NK-Zellen in WT-Mäusen TRAIL nicht exprimieren, während ILC1s dies tun ( 2A , links). In Übereinstimmung mit den in Abb. 1 gezeigten Daten bezüglich des nahezu vollständigen Fehlens von CD49a + CD49b ILC1s war die TRAIL + CD49b ─ Population von NKp46 + (oder GFP + )NK1.1 + Typ I ILCs in der Leber kaum nachweisbar (Abb 2A und 2B) und andere Organe (Abb. 2C) von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse im Vergleich zu ihren Ncr1 +/- Kontrolle der Wurfgeschwister.

(A) Prozentsätze von TRAIL + ILC1s wurden durch durchflusszytometrische Analyse in der Leber von . analysiert Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und ihre Ncr1 +/+ Wurfgeschwister. ILC1s wurden auf Lin NK1.1 + NKp46 + (oder GFP + für Ncr1 gfp/gfp-Mäuse) TRAIL + CD49b zwischen Lymphozyten. (B) Quantifizierung von TRAIL + ILC1s in der Leber von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und ihre Ncr1 +/+ Wurfgeschwister für (A) (n = 5). (C) Quantifizierung von TRAIL + ILC1s in anderen Organen (Milz, n = 5 BM, n = 5 SI, n = 4) von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und ihre Ncr1 +/+ Wurfgeschwister. **, P < 0,01 *, P < 0,05. Die numerischen Daten für die Felder B und C sind in S1 Data zu finden. Lin ─ , CD3 ─ CD19 ─ BM, Knochenmark GFP, grün fluoreszierendes Protein ILC1, angeborene Lymphoidzelle 1 Ncr1, natürlicher Zytotoxizitätsrezeptor 1 NK, natürlicher Killer SI, Dünndarm-TRAIL, Tumornekrosefaktor-verwandter Apoptose-induzierender Ligand.

NKp46-Mangel hat keine wesentlichen negativen Auswirkungen auf die ILC2- und ILC3-Untergruppen

Aufgrund unserer Beobachtung, dass ein NKp46-Mangel die Entwicklung von ILC1s einschränkte, wollten wir als nächstes testen, ob dieser Effekt auch in anderen ILC-Untergruppen auftrat. Unter Verwendung der Gating-Strategie wie in Abb. 3A beschrieben, beobachteten wir jedoch keinen signifikanten Unterschied in den Mengen oder Frequenzen von Lin ─ CD127 + Gata3 + ILC2s und Lin ─ CD127 + RORγt + ILC3s, wenn Ncr1 gfp/gfp-Mäuse wurden mit ihren Ncr1 +/+ Wurfgeschwisterkontrollen (Fig. 3B und 3C). Es gab eine unzureichende Menge an ILC1-Zellen von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse, um zu untersuchen, wie dieser NKp46-Mangel die ILC1-Funktion(en) beeinflusst, haben wir jedoch beobachtet, dass die Interferon-γ (IFN-γ)-Produktion durch NK-Zellen als Reaktion auf die Co-Stimulation mit IL-12 und IL-18 unverändert blieb zwischen Zellen isoliert von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse im Vergleich zu denen von Ncr1 +/+ Wurfgeschwisterkontrollen (Abb. 3D). Ebenso die IL-22-Produktion durch ILC3-Zellen, die aus . isoliert wurden Ncr1 gfp/gfp-Mäuse im Vergleich zu denen von Ncr1 +/+ Wurfgeschwister-Kontrollen waren nicht signifikant unterschiedlich (Fig. 3E). In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen haben Satoh-Takayama und Kollegen zuvor gezeigt, dass NKp46 nicht erforderlich ist, damit IL-22-vermittelte angeborene Immunzellen des Darms sich gegen IL-22 wehren Citrobacter rodentium [14]. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass NKp46 nicht die Homöostase oder die charakteristische ILC-Zytokinproduktion von ILC2s, NK-Zellen oder ILC3s kontrolliert, sondern selektiv an der Regulation der ILC1-Entwicklung beteiligt ist.

(A) Gating-Strategie für ILC2s und ILC3s. ILC2s wurden auf CD45 + Lin CD127 + Gata3 + gesteuert, und ILC3s wurden auf CD45 + Lin CD127 + RORγt + gesteuert. (B) Prozentsätze von ILC2s oder ILC3s wurden durch Durchflusszytometrie in SI in . analysiert Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und Ncr1 +/+ Wurfgeschwister. ILC2s wurden auf CD45 + Lin CD127 + Gata3 + RORγt Lymphozyten gesteuert. ILC3s wurden auf CD45 + Lin CD127 + RORγt + Gata3 Lymphozyten gesteuert. (C) Mengen von ILC2s oder ILC3s wurden in SI von . bestimmt Ncr1 gfp/gfp-Mäuse und ihre Ncr1 +/+ Wurfgeschwister (n = 4). (D) Lin ─ (oder CD3 ─ CD19 ─ )NK1.1 + NKp46 + (oder GFP + für Ncr1 gfp/gfp-Mäuse)CD49b + NK-Zellen wurden aus der Milz von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse oder Ncr1 +/+ Wurfgeschwister und wurden 16 h lang mit IL-12 (10 ng/ml) und IL-18 (10 ng/ml) kostimuliert, gefolgt von der Messung der IFN-γ-Produktion durch intrazelluläre durchflusszytometrische Analyse (D, linke tafel, n = 3) oder ELISA-Assays (D, rechte Tafel, n =3). Golgi Plug wurde der Kultur 4 h vor der Zellernte in einer Verdünnung von 1:1000 zugesetzt. (E) Homogenisierte SI-Zellen, isoliert aus Ncr1 gfp/gfp-Mäuse oder Ncr1 +/+ Wurfgeschwister wurden mit IL-23 (10 ng/ml) für 4 h stimuliert, gefolgt von der Messung der IL-22 Produktion durch durchflusszytometrische Analyse nach Gating ILC3s auf CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt + . Golgi Plug wurde der Kultur 3 h vor der Zellernte in einer Verdünnung von 1:1000 zugesetzt. Fehlerbalken, Standardabweichungen. Die numerischen Daten für Panel C und D sind in S1 Data zu finden. ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay FSC-A, Forward Scatter Area FSC-H, FSC Height IFN, Interferon IL, Interleukin ILC, angeborene Lymphoidzelle Ncr1, natürlicher Zytotoxizitätsrezeptor 1 NK, natürlicher Killer NS, keine Signifikanz RORγt, Retinsäurerezeptor (RAR) verwandter Orphan-Rezeptor gamma t SI, Dünndarm SSC-A, Seitenstreubereich SSC-H, SSC-Höhe SSC-W, SSC-Breite.

NKp46 steuert die Entwicklung von ILC1 zellintrinsisch

Obwohl NK-Zellen und ILC1 eng verwandt sind, entwickeln sich ILC1 nicht durch Lin ─ CD122 + NK1.1 ─ DX5 ─ NK-Zell-Vorläufer (NKPs), sondern können sich durch Lin ─ c-kit low entwickeln α4β7 + CD127 + CD25 ─ Flt3 ─ gewöhnlicher Helfer angeborene lymphoide Vorläufer (CHILPs). Sowohl NKPs als auch CHILPs werden von einem gemeinsamen lymphoiden Vorläufer (CLP) abgeleitet [15]. Der Anteil beider Arten von Vorläufern ist im BM von . ähnlich Ncr1 gfp/gfp und Ncr1 +/- Mäuse (S5 Abb). Um zu validieren, dass ein NKp46-Mangel zum nahezu vollständigen Fehlen von ILC1s führt, und um zu testen, ob dieses Phänomen zellintrinsisch oder extrinsisch ist, wurde eine KM-Transplantation durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden bestrahlte WT-CD45.1-Empfänger mit Ncr1 gfp/gfp (KO) oder Ncr1 +/+ (WT) CD45.2-Donor-BM-Zellen (Abb. 4A) oder eine 1:1-Mischung von KO und WT (S6 Abb) über eine Schwanzveneninjektion. Zwei Wochen später erfolgte die Quantifizierung verschiedener ILC-Untergruppen durch durchflusszytometrische Analyse. Spenderzellen und Wirtszellen wurden durch Färben der Zellen mit einem Anti-CD45.2-Antikörper unterschieden. Wir stellten fest, dass ILC1s in Leber, Milz und KM von WT-Empfängern fast vollständig fehlten, wenn Ncr1 Als Spenderzellen wurden gfp/gfp-BM-Zellen verwendet. Allerdings war die ILC1-Population in signifikant größeren Mengen vorhanden, wenn Ncr1 +/+ BM-Zellen wurden als Spenderzellen verwendet (Fig. 4B und 4C und S6 Fig.). Im Gegensatz dazu war die Menge an ILC2-Zellen und ILC3-Zellen im SI bei Empfängermäusen, denen . transplantiert wurde, nicht beeinflusst Ncr1 gfp/gfp oder Ncr1 +/+ BM-Donorzellen (Fig. 4D und 4E). Der moderate Anstieg des Anteils an NK-Zellen könnte auf das vollständige Fehlen von ILC1s unter NKp46 + NK1.1 + Typ I ILCs zurückzuführen sein (Abb. 4B oben rechts Abb. 4C unten rechts). Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse weiter, dass die ILC1-Entwicklung von NKp46 abhängt und diese Abhängigkeit zellintrinsisch ist (Abb. 1).

(A) Schema der BM-Transplantation mit BM-Zellen von CD45.2 Ncr1 gfp/gfp-Mäuse oder Ncr1 +/+ Wurfgeschwister-Kontrollen als Spenderzellen zur Injektion in CD45.1-Empfänger über die Schwanzvene. Die Entwicklung von ILC-Untergruppen wurde 2 Wochen nach der Transplantation analysiert. (B) Prozentsätze von CD45.2 + NK-Zellen oder CD45.2 + ILC1s wurden durch durchflusszytometrische Analyse in der Leber von CD45.1-Empfängern analysiert, die mit BM-Zellen von . verpflanzt wurden Ncr1 gfp/gfp-Mäuse (n = 5) oder Ncr1 +/+ Wurfgeschwister (n = 4). (C) Prozentsätze von CD45.2 + NK-Zellen oder CD45.2 + ILC1s wurden in der Milz oder BM von CD45.1-Empfängermäusen analysiert, die mit BM-Zellen von . transplantiert wurden Ncr1 gfp/gfp-Mäuse (n = 5) oder deren Ncr1 +/+ Wurfgeschwister (n = 4). (D und E) Die gezeigten Daten sind repräsentative Punktdiagramme der durchflusszytometrischen Analyse (linkes Feld) und zusammenfassende Daten (rechtes Feld) von CD45.2 + ILC2 (D) oder CD45.2 + ILC3 (E) in SI in CD45.1 Empfänger, die mit BM-Zellen von Ncr1 gfp/gfp-Mäuse (n = 4) oder ihre Ncr1 +/+ Wurfgeschwister (n = 4). Fehlerbalken, Standardabweichungen ***, P < 0,001 **, P < 0,01 *, P < 0,05. Die numerischen Daten für die Felder B, C, D und E finden Sie in S1 Data. Lin ─ , CD3 ─ CD19 ─ BM, Knochenmark ILC, angeborene lymphoide Zellen Ncr1, natürlicher Zytotoxizitätsrezeptor 1 NK, natürlicher Killer RORγt, Retinsäurerezeptor (RAR) verwandter Orphanrezeptor gamma t SI, Dünndarm.

Zusammenfassend liefern unsere Ergebnisse neue Beweise dafür, dass NKp46 eine entscheidende Rolle bei der ILC1-Entwicklung spielt. Frühere Studien in diesem Bereich konzentrierten sich auf die transkriptionelle Kontrolle der ILC-Entwicklung. Es ist bekannt, dass T-bet und Eomes die Entwicklung von NK-Zellen regulieren, Gata3 die Entwicklung von ILC2 kontrolliert und RORγt die ILC3-Abstammung definiert [15]. Es wurde festgestellt, dass mehrere Transkriptionsfaktoren – wie der nukleäre Faktor Interleukin 3 reguliert (Nfil3), der Runt-verwandte Transkriptionsfaktor 3 (Runx3) und T-bet – die ILC1-Entwicklung kontrollieren, diese Faktoren spielen jedoch keine selektive Rolle bei der Bestimmung der ILC1-Entwicklung [fünfzehn]. Das heißt, diese Transkriptionsfaktoren haben einige überlappende Rollen in mehreren Arten von ILCs und können daher das Schicksal der ILC1-Entwicklung nicht einzeln bestimmen. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass T-bet nicht nur bei der ILC1-Entwicklung, sondern auch bei der NK-Zell- und ILC3-Entwicklung eine Rolle spielt [15]. Hier haben wir einen Rezeptor identifiziert, der selektiv das Entwicklungsschicksal von ILC1s bestimmt. Unsere Studie unterstützt auch die Annahme, dass ILC1s und NK-Zellen unterschiedlichen Abstammungslinien angehören, obwohl beide zu ILCs der Gruppe 1 gehören und beide IFN-γ produzieren können, wenn sie aktiviert werden (z. B. durch Zytokine). Das zeigt auch unsere Studie Ncr1 gfp/gfp-Mäuse können als nützliches Tiermodell zur Untersuchung der physiologischen oder pathologischen Funktionen von ILC1 dienen, da sie in verschiedenen Organen nahezu vollständig fehlen, während die Entwicklung und Funktion anderer ILCs mit Ausnahme der damit verbundenen Funktionen nahezu intakt gehalten werden zur Rolle von NKp46 in NK-Zellen [7,16].


Immunologisches Targeting der Krebsstammzelle

Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die fehlende Eradikation der malignen Stammzelle die Grundlage für einen Rückfall und eine Progression von Krebs bildet. In dieser Hinsicht waren die klinischen Erfahrungen bei der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie (CML), einer prototypischen Stammzellerkrankung, aufschlussreich und veranschaulichen die Herausforderungen, denen sich die Behandlung von Krebs gegenübersieht, wenn potente zytoreduktive Wirkstoffe eingesetzt werden, die eine minimale Resterkrankung unvollständig beseitigen. Andererseits haben mehrere Jahrzehnte klinische und Laborerfahrung das kurative Potenzial der allogenen Stammzelltransplantation für CML und andere hämatologische Malignome gezeigt. Wie in diesem Kapitel besprochen, haben diese Studien das kurative Potenzial der immunbasierten Erkennung von Tumorzellen, einschließlich der bösartigen Vorläuferzellpopulation, klar gezeigt. Diese Daten bereiten die Bühne für neuere Ansätze, die sich auf das Immun-Targeting von Antigenen konzentrieren, die auf der Krebsstammzelle vorhanden sind.Ein rationales Immun-Targeting der tumorinitiierenden Population hängt entscheidend davon ab, (1) die einzigartigen Oberflächenmarker dieser Zellen zu identifizieren, damit sie isoliert werden können, und (2) von der Definition von Antigenen, die in den malignen Zellen mit Stammzellen einzigartig oder bevorzugt exprimiert werden. zellähnliche Funktionen im Vergleich zu normalen Zellen. Während die Debatte über die genaue Natur und die definierenden Merkmale der Zellpopulation, die in der Lage ist, den Tumor zu vermehren, und damit der kritischen Tumorzell-Subpopulation, die für das Immun-Targeting erforderlich ist, weiterhin diskutiert wird, werden mehrere vielversprechende Ansätze für die Krebsimmuntherapie untersucht. Letztlich kann eine Kombinationstherapie, die sowohl pharmakologische zytoreduktive Wirkstoffe als auch immunologisches Targeting auf maligne Stammzellpopulationen umfasst, einen wirksamen kurativen Ansatz mit akzeptabler Toxizität für die Behandlung maligner Erkrankungen darstellen.

1. Einleitung

Inzwischen wurde die Existenz von Krebs auslösenden Zellen bei vielen bösartigen Erkrankungen nachgewiesen (Al-Hajj et al., 2003 Bonnet und Dick, 1997 Jamieson et al., 2004 Singh et al., 2003) (Schatton et al., 2008) . Dies sind seltene ruhende Zellpopulationen, die seriell transplantiert werden können, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung besitzen und häufig gegen die zytotoxischen Wirkungen einer Standard-Chemotherapie resistent sind (Clarke et al., 2006). Diese Eigenschaften haben klare Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf und die Ansätze für therapeutische Interventionen. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die fehlende Eradikation der malignen Stammzelle die Grundlage für einen Rückfall und ein Fortschreiten der Krankheit bildet. In dieser Hinsicht waren die klinischen Erfahrungen mit der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie (CML), einer Krankheit, die aus einer transformierten Stammzellpopulation stammt, aufschlussreich (Abschnitt 2) und veranschaulichen die Herausforderungen, denen sich auch die Behandlung solider Tumorerkrankungen gegenübersieht. Diese Studien haben die starke zytoreduktive Fähigkeit kürzlich entwickelter pharmakologischer Therapien gezeigt, aber auch ihre allgemeine Unfähigkeit, Resterkrankungen vollständig auszurotten. Andererseits hat ein umfangreicher klinischer und labortechnischer Erfahrungsschatz der letzten drei Jahrzehnte das kurative Potenzial der allogenen Stammzelltransplantation bei CML und anderen hämatologischen Malignomen gezeigt. Wie in Abschnitt 3 besprochen, haben diese Studien eindeutig gezeigt, dass die Spendertransplantation zu einer immunologischen Erkennung von Tumorzellen führt, einschließlich der bösartigen Vorläuferzellpopulation. Diese Daten bereiten die Bühne für neuere Ansätze, die sich auf das Immun-Targeting von Antigenen konzentrieren, die auf der Krebsstammzelle vorhanden sind. Während die Debatte über die genaue Natur und die definierenden Eigenschaften der Zellpopulation, die in der Lage ist, den Tumor zu vermehren, und damit das Ausmaß der gesamten Tumorzellpopulation, das für das Immun-Targeting erforderlich ist, weiterhin diskutiert wird, werden mehrere vielversprechende Ansätze für die Krebsimmuntherapie untersucht. Diese Ansätze könnten die Immunisierung und das Targeting von Antigenen mit selektiver Expression auf malignen Stammzellen umfassen, gekoppelt mit Reagenzien, die die Stärke des Immunsystems regulieren können (Abschnitt 4). Letztlich kann eine Kombinationstherapie, die sowohl pharmakologische zytoreduktive Wirkstoffe als auch immunologisches Targeting auf maligne Stammzellpopulationen umfasst, einen wirksamen kurativen Ansatz mit akzeptabler Toxizität für die Behandlung maligner Erkrankungen darstellen.

2. Lehren aus CML, einer Erkrankung der hämatopoetischen Stammzelle

Chronische myeloische Leukämie (CML) ist eine myeloproliferative Erkrankung, die mit der T(9 22) chromosomale Translokation, die das onkogene BCR-ABL Fusionsprotein. Dieses chimäre Protein hat Tyrosinkinase-Aktivität und ist für die maligne Transformation und die exzessive myeloische Zellexpansion, die für CML charakteristisch ist, essentiell. Der natürliche Verlauf der CML ist gut charakterisiert. Patienten verbleiben typischerweise mehrere Jahre in der chronischen Phase (CP), verwandeln sich aber unweigerlich in ein aggressiveres klinisches Syndrom (akzelerierte Phase) und schließlich in eine tödliche Blastenkrise (BC) (Faderl et al. , 1999).

Genetische Studien, die vor über 20 Jahren durchgeführt wurden, zeigten, dass der maligne Klon bei CML eine pluripotente hämatopoetische Stammzelle ist, die sich in myeloische Zellen, Monozyten, Erythrozyten und Blutplättchen differenzieren kann (Bernstein et al., 1992 Douer et al., 1981 Fialkow et al ., 1977 Koeffler et al., 1980 Martin et al., 1980 Singer et al., 1980 Singer et al., 1979). Diese Studien zeigten, dass bei Frauen mit CML, die für dieses Gen heterozygot waren, nur einzelne Enzym-Phänotypen des X-chromosomalen G6PD-Isoenzyms in Zellen im gesamten Spektrum hämatopoetischer Abstammungslinien vorhanden waren. Somit wurde festgestellt, dass der maligne Klon aus der frühesten hämatopoetischen Vorläuferzelle stammt. Phänotypische Eigenschaften von humanen hämatopoetischen Stammzellen, Vorläufern und Vorläuferpopulationen wurden identifiziert (Kondo et al., 2003), und im Allgemeinen können diese Subpopulationen basierend auf der CD34+-Expression in Kombination mit der vorhandenen oder fehlenden Expression zusätzlicher immunphänotypischer Marker identifiziert werden. In jüngerer Zeit haben Jamieson et al. haben die Eigenschaft der Selbsterneuerung innerhalb der Stammzellpopulation von CML-Patienten mit chronischer Erkrankung und innerhalb der Stammzell- und myeloischen Vorläuferpopulationen bei Patienten mit Blastenkrise gezeigt, die mit einer erhöhten Aktivität des β-Catenin-Signalwegs verbunden sind (Jamieson® et al., 2004).

Hemmung der ABL Kinase, die bei CML konstitutiv aktiviert wird durch die BCR-ABL Translokation, ist eine erfolgreiche, kürzlich entwickelte Strategie zur Behandlung von CML. Der spezifische Tyrosinkinasehemmer Imatinibmesylat hemmt kompetitiv die Bindung von ATP an die ABL Kinasedomäne (Buchdunger et al., 1996) und hat somit eine spezifische inhibitorische Aktivität für die Tyrosinkinase, die von dem . kodiert wird BCR-ABL Fusionstranskript (Buchdunger et al., 1996 Deininger et al., 1997 Druker et al., 1996). Studien der Phasen I und II haben eine hohe Häufigkeit hämatologischer und zytogenetischer Reaktionen bei Patienten mit akzelerierter Phase oder BC-CML sowie mit neu diagnostizierter CP gezeigt (Druker et al., 2001a Druker et al., 2001b Kantarjian et al., 2002 ). (Kantarjian et al., 2002 Sawyers et al., 2002). Darüber hinaus hat eine randomisierte kontrollierte Phase-III-Studie die Überlegenheit von Imatinib gegenüber der Kombination von IFNα und Cytarabin bei neu diagnostizierten Patienten mit CP-CML gezeigt (IRIS-Studie) (O’Brien et al., 2003). Hämatologische und starke zytogenetische Reaktionen wurden bei 98 % bzw. 84 % der Patienten im Imatinib-Arm beobachtet, und diese Ergebnisse wurden mit geringer Toxizität erzielt. Diese beeindruckenden Ergebnisse führten zu seiner schnellen FDA-Zulassung im Jahr 2001, und Imatinib hat sich als Standard-Front-Line-Therapie für CML entwickelt. In den letzten Jahren, ABL Kinasehemmer mit erhöhter Wirkstärke wurden zur Behandlung von Imatinib-refraktären Erkrankungen entwickelt und umfassen Dasatinib (FDA-Zulassung im Juni 2006) und Nilotinib (FDA-Zulassung im Oktober 2007) (Brave et al., 2008 Cortes et al.) ., 2007 Guilhot et al., 2007 Hochhaus et al., 2008 Hochhaus et al., 2007 Kantarjian et al., 2007a Kantarjian et al., 2007b le Coutre et al., 2008). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung von CML mit ABL Kinasehemmer dienen als Modell für die Erfolge des molekularen Targetings von Signalwegen, die für das Überleben der malignen Zelle lebenswichtig sind. Dieses Modell hat die Entwicklung von Strategien inspiriert, die wesentliche Signalwege in anderen Tumoren unterbrechen, einschließlich bei gastrointestinalen Stromatumoren (Blanke et al., 2008) und bei Lungenkrebs (Giaccone, 2005 Sequist et al., 2007).

Trotz dieser bemerkenswerten klinischen Ergebnisse sind einige Beobachtungen zur Vorsicht angebracht. Erstens sind bei Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung arzneimittelinduzierte Remissionen bei CML-Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung nicht dauerhaft (Druker et al., 2001a) (Ottmann et al., 2002, Sawyers et al., 2002). Untersuchungen zu den Mechanismen der Imatinib-Arzneimittelresistenz haben die Annahmen gestützt, dass: (a) BCR-ABL führt zu einer allgemeinen genomischen Instabilität, die zu sekundären genetischen Veränderungen führen kann (BCR-ABL Genamplifikation, neue inaktivierende Punktmutationen), die zu BCR-ABL unabhängiges Wachstum und/oder Überleben des malignen Klons (Branford et al., 2002 Gorre et al., 2001 Hochhaus et al., 2002 Roche-Lestienne et al., 2002 Roumiantsev et al., 2002 Schindler et al., 2000 Shah et al., 2002) und (b) kann Imatinib bei Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung auf den resistenten Krankheitsklon selektieren, wie durch die Mutationsanalyse des Patienten gestützt (Bumm et al., 2003). Zweitens werden selbst bei Patienten mit weniger fortgeschrittener Erkrankung <5% vollständig PCR-negativ für BCR-ABL trotz des häufigen Erreichens vollständiger zytogenetischer Antworten (CCR) (Hughes et al., 2003). In der IRIS-Studie erreichten von den 68 % der Patienten, die nach einjähriger Therapie eine CCR erreichten, 30 % eine <2 log-Verringerung des medianen BCR-ABL Transkriptionslevel von BCR-ABL qPCR. Dieser geringe Rückgang der BCR-ABL Transkript war mit einer Wahrscheinlichkeit von 5–15% der Krankheitsprogression nach 24 Monaten verbunden. Im Gegensatz dazu blieben Patienten mit einer Log-Reduktion von > 3 nach 24 Monaten zu 100 % progressionsfrei. Neuere Studien haben gezeigt, dass bei längerer Erstlinientherapie die Wahrscheinlichkeit molekularer Remissionen zunimmt, aber 50% der Patienten immer noch eine nachweisbare Resterkrankung haben (Branford et al., 2007).

In Übereinstimmung mit der Persistenz einer molekular nachweisbaren minimalen Resterkrankung nach einer Imatinib-Therapie haben Bhatia et al. identifizierten maligne hämatopoetische Vorläufer bei 15 von 15 untersuchten CML-Patienten, die nach Imatinib eine CCR hatten (Bhatia et al., 2003). Grahamet al. berichteten, dass primitive ruhende Ph+-Vorläuferzellen von CML-Patienten gegenüber Imatinib . unempfindlich sind in vitro (Grahamet al., 2002). Es wurde auch gezeigt, dass Dasatinib und Nilotinib auf das Wachstum von Klonen mit Resistenzmutationen selektieren (Shah et al., 2007) und die Resterkrankung trotz ihrer erhöhten Potenz im Vergleich zu Imatinib. Jianget al. haben kürzlich gezeigt, dass frisch isolierte CML-Stammzellen von unbehandelten Patienten bereits eine hohe Häufigkeit von BCR-ABL Mutationen. Darüber hinaus identifizierten sie mehr als 70 verschiedene BCR-ABL Mutationen in der Nachkommenschaft von Kulturen von CML-Stammzellen. Diese und andere Studien zeigen, dass primäre CML-Stammzellen eine Instabilität des BCR-ABL Fusionsgen, und dass ein Reservoir an malignen Vorläuferzellen bei Patienten besteht, die mit behandelt werden ABL Kinasehemmer, die das Potenzial haben, sich zu einer rezidivierenden Erkrankung zu entwickeln (Jiang et al., 2007). Ruhende arzneimittelresistente Zellsubpopulationen mit klonogenem Ptoential wurden auch bei anderen Krebsarten identifiziert (Abbott, 2003, Challen und Little, 2006, Hadnagy et al., 2006).

3. Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation: eine kurative immunbasierte Therapie, die zur Ausrottung bösartiger Vorläuferzellen führt

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist ein etablierter kurativer Behandlungsansatz für viele hämatologische Malignome. Während die Intensität und Zusammensetzung des Konditionierungsschemas für eine erfolgreiche HSCT wichtig sind, spielt die Rekonstitution von Spenderimmunzellen eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Empfängertumorzellen, einem Vorgang, der als Graft-versus-Leukämie (GvL) bezeichnet wird. Wie in diesem Abschnitt besprochen wird, haben über 30 Jahre klinische und Laborerfahrung einen klaren Beweis dafür geliefert, dass die immunologische gezielte Behandlung von malignen hämatopoetischen Zellpopulationen wirksam dauerhafte kurative Reaktionen hervorrufen kann. Dieser Ansatz wurde sogar bei der Behandlung von soliden Tumoren angewendet. Diese Studien bilden nun den Hintergrund für die Entwicklung von Therapien, die den therapeutischen Nutzen der allogenen Transplantation erhöhen und gleichzeitig die mit der Behandlung verbundenen Risiken und Toxizitäten minimieren.

3.1. Beweise für die Existenz des Graft-versus-Leukämie-Effekts

Mehrere klinische Beweise, die in den letzten 30 Jahren etabliert wurden, haben die Existenz von GvL und seine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Bereitstellung einer dauerhaften immunologischen Abstoßung von malignen Zellen überzeugend gezeigt. Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, begannen diese klinischen Studien in den 1970er und 1980er Jahren, in denen festgestellt wurde, dass das Risiko eines Krankheitsrezidivs nach HSCT stark mit dem immunologischen Status des Empfängers korreliert. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass die Anti-Leukämie-Reaktion (d. h. GvL) stark mit dem Vorliegen einer immunologischen Toxizität einer Transplantation, der Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD), korreliert. Ein Rückfall von Leukämie war bei Empfängern von syngenen Stammzellen 2,5-mal wahrscheinlicher im Vergleich zu HLA-gematchten allogenen Empfängern, die GvHD entwickelten (Weiden et al., 1979). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Patienten, bei denen GvHD aufgetreten war, ein verringertes Risiko für einen Krankheitsrückfall hatten, und dies schien mit dem Ausmaß der HLA-Übereinstimmung zwischen Empfänger und Spender zusammenzuhängen (Fefer et al., 1987 Sullivan et al., 1989 Weiden et al ., 1981) (Butturini et al., 1987 Gale et al., 1994 Jones et al., 1991 Weisdorf et al., 1987). Beispiele für eine Leukämieremission wurden auch in Verbindung mit einer Verschlechterung der GvHD beobachtet (Odom et al., 1978 Tricot et al., 1996) oder nach Absetzen von immunsuppressiven Medikamenten zur Vorbeugung von GvHD (Collins et al., 1992 Libura et al.) ., 1999). Nach Berichten aus einer einzigen Einrichtung, in denen die positive Korrelation zwischen einem verringerten Rückfall und einer akuten und/oder chronischen GvHD beschrieben wurde, wurden anschließend mehrere große konfirmatorische Registerstudien in Nordamerika (Horowitz et al., 1990) und in Europa (Ringden et al., 1996) durchgeführt. . Einige Patienten in diesen retrospektiven Studien hatten Stammzelltransplantate erhalten, bei denen T-Zellen erschöpft waren in vitro GvHD zu verhindern. Eine T-Zell-Depletion verhinderte wirksam schwere GvHD, aber bei diesen Patienten wurden im Vergleich zu Empfängern von nicht-T-Zell-depletierten Stammzellen höhere Rückfallraten beobachtet. Dieser Effekt der T-Zell-Depletion wurde am häufigsten bei Patienten mit CML festgestellt. Zusammengenommen zeigten diese Studien, dass GvHD mit einem hochsignifikanten GvL-Effekt assoziiert war, der durch Spender-T-Zellen in den Stammzellprodukten vermittelt wurde (Champlin et al., 1990 Goldman et al., 1988 Horowitz et al., 1990 Martin et al al., 1988).

Geringere Rezidivrate nach Transplantation allogener Stammzellen im Vergleich zu autologen oder syngenen Stammzellen

Positive Korrelation zwischen GVHD und GVL

Zeitliche Assoziation der Leukämieremission mit Episoden akuter oder chronischer GvHD

Krankheitsremission nach Absetzen immunsuppressiver Medikamente

Verminderter Rückfall im Zusammenhang mit GvHD

Die T-Zell-Depletion des Spender-Stammzelltransplantats ist mit höheren Rückfallraten verbunden

Die Infusion von Spenderlymphozyten induziert eine Remission hämatologischer Malignome

Allogene HSCT nach nicht-myeloablativer Konditionierung induziert eine Remission hämatologischer Malignome und einiger nicht-hämatologischer Malignome

Die Wirksamkeit von GvL-Antworten bei der Tumorelimination wurde in den frühen 1990er Jahren durch die erfolgreiche Erfahrung mit der Verwendung von Infusionen von Spenderlymphozyten (DLI) zur Behandlung von CML-Rezidiven nach HSCT definitiv nachgewiesen (Kolb et al., 1990). Die Beobachtung, dass Spenderlymphozyten allein ohne weitere Chemotherapie oder Bestrahlung eine Krankheitsremission induzieren könnten, zeigte direkt die starke Antitumoraktivität von Spender-abgeleiteten Immuneffektorzellen. Seit diesem ersten Bericht haben multizentrische Erfahrungen in Europa und Nordamerika die Wirksamkeit von DLI zur Induktion von GvL bestätigt (Collins et al., 1997 Kolb et al., 1995). Aus diesen klinischen Studien geht hervor, dass DLI besonders wirksam bei der Behandlung der CML in der stabilen Phase ist, bei der bei 75–80% der Patienten dauerhafte Reaktionen auftreten. Im Gegensatz dazu lagen die Ansprechraten von Patienten mit multiplem Myelom und CLL zwischen 30 und 50 % (Lokhorst et al., 1997 Mandigers et al., 2003 Rondon et al., 1996 Tricot et al., 1996) und von Patienten mit akutem Leukämie, nur 10–15%. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen ist DLI im Allgemeinen bei Patienten mit geringerer Krankheitslast wirksamer (van Rhee et al., 1994). Nur 5–10 % der Patienten mit fortgeschrittener CML (Blastenkrise/beschleunigte Phase) sprechen auf DLI an. Interessanterweise verzögert sich das klinische Ansprechen nach DLI oft erst 2–4 Monate nach einer einzelnen Infusion. Dieses verlängerte Intervall kann die Zeit widerspiegeln, die erforderlich ist, um eine wirksame Reaktion auszulösen, wenn die Häufigkeit naiver T-Zellen, die reaktionsfähig sind, gering ist. Alternativ können verzögerte Antworten die Zeit widerspiegeln, die erforderlich ist, um die Auswirkung der Lyse der Zellen zu zeigen, die den ursprünglichen malignen Klon umfassen. DLI-Antworten sind zumindest bei einigen Krankheiten sehr dauerhaft (Mattei et al., 2001 Shimoni et al., 2001). Porter et al. berichteten, dass die Überlebenswahrscheinlichkeit 1, 2 und 3 Jahre nach der DLI-Therapie 83, 76 bzw. 73 % beträgt (Porter et al., 1999).

Mit dem Nachweis, dass GvL eine wichtige Rolle bei der Elimination von Leukämiezellen nach einer Transplantation spielt, haben viele Studien damit begonnen, die Machbarkeit von weniger intensiven, nicht-myeloablativen Konditionierungsschemata zur Vorbereitung von Patienten auf die allogene HSZT zu untersuchen. Es wurde eine Vielzahl von nicht-myeloablativen Konditionierungsschemata entwickelt und eine Vielzahl von klinischen Studien haben die Wirksamkeit dieses Ansatzes gezeigt, insbesondere bei Patienten, die für eine intensivere Konditionierung nicht geeignet sind (Khouri et al., 1998 McSweeney et al., 2001) (Alyea et al., 2005 Morris et al., 2004). Konditionierungsschemata mit reduzierter Intensität sind mit einer wesentlich geringeren Toxizität verbunden, bieten jedoch dennoch eine ausreichende Immunsuppression des Empfängers, um eine Abstoßung allogener hämatopoetischer Stammzellen zu verhindern. Da nicht-myeloablative Konditionierungsschemata nicht ausreichen, um Leukämiezellen im Empfänger zu eliminieren, hängen Langzeitremissionen hauptsächlich von immunologischen Mechanismen ab, die durch Spenderzellen vermittelt werden. Ähnlich wie beim myeloablativen Setting sind GvL-Antworten nach einer nicht-myeloablativen Transplantation häufig mit GvHD assoziiert (Crawley et al., 2005). Jüngste klinische Studien bei Patienten mit soliden Tumoren deuten darauf hin, dass mit diesem Ansatz zumindest bei einigen dieser Patienten eine Transplantat-gegen-Tumor-Reaktion beobachtet werden kann (Childs et al., 2000 Demirer et al., 2008 Tykodi et al., 2004 Ueno et al ., 2003)

3.2. Präparation der immunologischen Basis von GvL

Viele Laborstudien haben versucht, die immunologischen Mechanismen zu definieren, die zu GvL beitragen. Obwohl Stammzell- und DLI-Produkte eine Vielzahl von mononuklearen Zelltypen enthalten, wird allgemein angenommen, dass T-Zellen die vorherrschenden Effektorzellen in diesen Produkten umfassen. Neuere Studien haben jedoch auch eine Rolle von B- und NK-Antworten bei GvL-Antworten impliziert. In diesem Abschnitt betrachten wir Beweise für die Rolle jeder dieser Zellpopulationen bei GvL.

3.2.1. Spender-T-Zellen als Mediatoren von GvL und deren Zielantigene

In Mausmodellen wurde gezeigt, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellpopulationen zur GVL-Aktivität beitragen in vivo (Truitt und Atasoylu, 1991). Die Entfernung einer dieser T-Zell-Populationen führt zu einer Beeinträchtigung der GvL-Reaktivität, was darauf hinweist, dass sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen zur Erzeugung eines optimalen GvL erforderlich sind.Bei Patienten, die sich einer allogenen HSCT unterzogen haben, wurden auch CD4+- und CD8+-Leukämie-reaktive T-Zellen identifiziert. In den letzten Jahren wurde viel Aktivität auf die genaue Identifizierung der Zielantigene von Spender-T-Zellen nach allogener HSCT gerichtet, da ein besseres Verständnis der genauen Peptidepitope, die von T-Zellen erkannt werden, möglicherweise zur Optimierung von Strategien zur Unterscheidung von GvL und GvHD-Effekte in vivo.

Die meisten Strategien zur Identifizierung von T-Zell-Epitopen beruhten auf der Untersuchung der zytolytischen Aktivität von Spender-abgeleiteten T-Zellen gegen Wirtsantigene, die entweder durch biochemische Ansätze oder durch Testen gegen aus Wirtsgewebe stammende cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert wurden. Unter Verwendung dieser Strategien wurden viele kleinere Histokompatibilitätsantigene (mHAs) identifiziert. mHAs sind Antigene, die als Ergebnis genetischer Polymorphismen auftreten, die im gesamten menschlichen Genom vorkommen (Mullally und Ritz, 2007) und somit die polymorphen Selbstpeptide widerspiegeln, die zwei beliebige Individuen unterscheiden. Die Transplantation von reifen T-Zellen während der allogenen HSCT führt zum Transfer einer großen Anzahl von Zellen, die diese mHA erkennen können.

Wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt, scheinen die klinischen Konsequenzen von mHA vollständig aus ihrer Expression in verschiedenen Zelltypen und der Erkennung dieser Antigene durch Spender-T-Zellen zu resultieren (Akatsuka et al., 2003 Dickinson et al., 2002 Kloosterboer et al. , 2005). Die meisten der bisher identifizierten humanen mHA weisen eine breite Gewebeexpression auf und das Targeting dieser verschiedenen Zelltypen durch Donor-T-Zellen stellt eines der auslösenden Ereignisse der GvHD dar (Dickinson et al., 2002). Eine gut charakterisierte Klasse von breit exprimierten mHA sind beispielsweise Gene auf dem Y-Chromosom. Männer sind gegenüber diesen Y-Chromosom-kodierten Proteinen (H-Y-Antigenen) tolerant, aber mit H-Y-Peptiden reagierende T-Zellen werden bei normalen Frauen nicht deletiert (Foote et al., 1992, Wang et al., 1995). Weibchen sind gegenüber dem exprimierten X-Chromosom-Homolog tolerant und können bei Exposition gegenüber H-Y-Antigenen durch Schwangerschaft oder Bluttransfusion langlebige T-Zell-Antworten auf diese mHA entwickeln (James et al., 2003 Verdijk et al., 2004). In ähnlicher Weise kann die Transplantation weiblicher T-Zellen bei männlichen Empfängern zur Expansion von H-Y-spezifischen Spender-T-Zellen führen (Pierce et al., 1999 Takami et al., 2004 Vogt et al., 2000a). Beweise dafür, dass dies Ziele der vom Spender abgeleiteten Immunität sind, umfassen die Entdeckung einer erhöhten Inzidenz von GvHD bei männlichen Empfängern von Stammzelltransplantaten von weiblichen Spendern (Atkinson et al., 1986 Flowers et al., 1990 Gratwohl et al., 2001 Randolph et al ., 2004). Dies liegt vermutlich an der breiten Gewebe- und Zellexpression von H-Y-Proteinen und der Immunogenität dieser Antigene. Viele der HY-mHA enthalten im Vergleich zu ihren X-Homologen mehrere unterschiedliche Aminosäuren, und diese Peptidepitope werden sowohl von MHC-Klasse-I- als auch von Klasse-II-Molekülen präsentiert (Spierings et al., 2003b Torikai et al., 2004 Vogt et al., 2002). Beide Faktoren tragen wahrscheinlich zu dem hohen Maß an Immunogenität dieser Antigene bei. Nicht-Y-Chromosom-kodierte mHA umfassen autosomale mHA, die auf der Grundlage von Einzelnukleotid-Polymorphismen erzeugt werden, die sich zwischen Spender und Empfänger unterscheiden. Diese genetischen Unterschiede können zur Erzeugung alternativer Transkripte, zu Unterschieden in der proteasomalen Verarbeitung (Brickner et al., 2001 Spierings et al., 2003a) und zu unterschiedlichen posttranslationalen Modifikationen (Meadows et al., 1997) sowie zur einfachen Substitution einzelner . führen Aminosäuren im antigenen Peptid (den Haan et al., 1998 Mommaas et al., 2002 Pierce et al., 2001 Vogt et al., 2000b). Kürzlich beschriebene Gendeletionspolymorphismen können auch eine wichtige Rolle bei der Bildung von mHA spielen (Murata et al., 2003).


Vom Wirt stammende T- und B-Zellen können induziert werden, um tumorassoziierte Antigene zu erkennen, wohingegen vom Spender stammende B- und T-Zellen sowohl tumorassoziierte Antigene als auch Alloantigene erkennen können.

In dem Maße, in dem mHA sowohl von malignen als auch von normalen hämatopoetischen Zellen im Empfänger, jedoch nicht in anderen Geweben, exprimiert wird, trägt das Targeting dieser Antigene zur GvL und zur Umwandlung in eine vollständige Spender-Hämatopoese bei, trägt jedoch nicht zur GvHD bei (Bleakley und Riddell, 2004). Aus diesem Grund wurde das Targeting von mHA mit eingeschränkter hämatopoetischer Expression als wichtiger Mechanismus zur Unterscheidung von GvL von GvHD nach allogener HSCT und DLI vorgeschlagen (Hambach und Goulmy, 2005 Mutis und Goulmy, 2002 Riddell et al., 2003).

Andere Kategorien von GvL-Zielen umfassen tumorspezifische Antigene, viral kodierte Tumorantigene, überexprimierte Eigenantigene, mutierte oder modifizierte Eigenantigene und Krebs-Hoden-Antigene. Für hämatopoetische Malignome gibt es viele potenziell wichtige Antigene in diesen Kategorien, einschließlich chimärer BCR-ABL (Bocchia et al., 1995 Cathcart et al., 2004) und PML/RARa (Bocchia et al., 1995) Proteine, latente EBV-Antigene, Proteinase-3 (Molldrem et al., 2000), WT-1 (Azuma et al.) al., 2002), Survivin (Reker et al., 2004), ML-IAP (Schmollinger et al., 2003) und Krebs-Hoden-Antigene wie SLLP1 (Wang et al., 2004). In diesen Fällen hängt die Immunogenität dieser Targets nicht von genetischen Unterschieden zwischen Empfänger und Spender ab. Da dies keine Ziele der Alloreaktivität sind, stellen diese mögliche Ziele der Immuneffektoren des Wirts dar (Symons et al., 2008). Empfänger mit Leukämie können jedoch gegenüber diesen Antigenen tolerant geworden sein, während normale Spender gegenüber den Antigenen möglicherweise nicht tolerant sind und nach der Transplantation in der Lage bleiben, wirksame Immunantworten zu entwickeln.

3.2.2. Spender-B-Zellen als Mediatoren von GvL und deren Zielantigene

Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass B-Zellen wahrscheinlich auch eine wichtige Rolle bei GvL spielen. Als Teil der adaptiven Immunantwort können B-Zellen die Immunogenität von Tumoren durch Sekretion von Zytokinen und Chemokinen steigern, und Antigen-Antikörper-Immunkomplexe erleichtern die Antigenabgabe an Antigen-präsentierende Zellen und können dadurch die Antigen-spezifische T-Zell-Aktivierung verstärken. Wenn sie gegen Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, antigenspezifische Antikörper, die Tumorzellen durch antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und Komplement-vermittelte Lyse direkt lysieren können.

Bei T-Zellen sind mHA und tumorassoziierte Antigene beide potenzielle Ziele von Spender-B-Zellen, die nach allogener HSCT zu GvL (und GvHD) beitragen können (Abbildung 1). Miklos et al. berichteten, dass das Y-kodierte mHA DBY häufig von Antikörperreaktionen nach weiblicher → männlicher HSCT angegriffen wird (Miklos et al., 2004). Bemerkenswert ist, dass 50 % der männlichen Patienten, die Stammzelltransplantate von weiblichen Spendern erhielten, eine humorale Immunität gegen das rekombinante DBY-Protein entwickelten, verglichen mit 5 % der männlichen Patienten mit männlichen Spendern. Sehr wenige der Patienten entwickelten Antikörper gegen das X-kodierte Homolog, DBX, und die Antikörperreaktionen richteten sich hauptsächlich gegen Bereiche mit Aminosäureunterschieden zwischen DBY und DBX. Als diese Analyse auf ein Panel von 5 rekombinanten HY-kodierten Proteinen (DBY, UTY, ZFY, RPS4Y und EIF1AY) und deren X-Chromosom-Homologen ausgeweitet wurde, entwickelten 89 % der Patienten mit mindestens einem HY-Antikörper eine chronische GVHD im Vergleich zu nur 31 %. von Patienten ohne Antikörper gegen dieses Panel (p < 0,0001). Darüber hinaus erlitten 48% der Patienten ohne H-Y-Antikörper einen Rückfall, verglichen mit 0% der Patienten mit H-Y-Antikörpern (p < 0,0001) (Miklos et al., 2005). Klinische Studien in unserem Zentrum und anderen haben kürzlich darauf hingewiesen, dass Rituximab, eine B-Zell-gerichtete Therapie, einige der klinischen Manifestationen der chronischen GvHD verbessern könnte, und größere Studien zur Bewertung dieses Ansatzes wurden eingeleitet (Ratanatharathorn et al., 2003) (Cutler et al.) ., 2006). Die Hemmung der B-Zell-Antworten kann jedoch auch die GvL-Aktivität reduzieren und dies sollte bei diesen Patienten engmaschig überwacht werden.

Antikörperantworten gegen tumorassoziierte Antigene wurden auch in Verbindung mit der GvL-Aktivität nach allogener HSCT identifiziert (Bellucci et al., 2004 Hishizawa et al., 2005 Wu et al., 2000). In einer Reihe früherer Studien waren wir motiviert, die Zielantigene der DLI-assoziierten B-Zell-Immunantwort zu entdecken, basierend auf dem unerwarteten Befund einer klaren peripheren B-Zell-Lymphozytose und einer Plasmazellmarkinfiltration, die sich zum Zeitpunkt der klinischen Reaktion entwickelte (das war nicht kompliziert durch gleichzeitige GvHD) (Bellucci et al., 2002) bei einer Reihe von Patienten, die in DLI-Studien bei DFCI aufgenommen wurden (Alyea et al., 1998 Bellucci et al., 2002). Diese Studien führten bei einer Reihe von Patienten mit CML zum Nachweis des Vorhandenseins einer starken humoralen Immunität – in einem mit antiviralen Reaktionen vergleichbaren Niveau – die zeitlich mit der klinischen Tumorregression korreliert war (Wu et al., 2000). Wir haben zuerst das Vorhandensein einer humoralen Antitumor-Immunität in Verbindung mit DLI nachgewiesen, als wir Lysate, die aus einer CML-Zelllinie generiert wurden, K562-Zellen gegen Seren eines DLI-behandelten Patienten immungeblottet haben, und wir visualisierten neue Banden, die durch Post-DLI nachgewiesen wurden, aber nicht vor -DLI-Seren, die den Nachweis neuer Antikörperreaktionen auf CML-Zielantigene nach DLI anzeigen. Anschließend wurde durch Antikörper-basierte Expressionsklonierung, bei der Plasma von Respondern der DLI-Therapie als Antikörperquelle verwendet wurde, um eine CML-cDNA-Expressionsbibliothek zu screenen, die wir aus Patientenproben erzeugten, eine Reihe von Kandidaten-Zielantigenen, gegen die Post-DLI, aber nicht Prä-DLI- oder Prä-BMT-Seren wurden als reaktiv identifiziert (Sahin et al., 1997, Wu et al., 2000). Diese kodierten für eine Vielzahl bekannter und neuer Gene, die an verschiedenen zellulären Funktionen beteiligt sind, einschließlich Gentranskription, Zellzyklus und Zellsignalisierung. Es wurde festgestellt, dass eine Untergruppe von Antigenen in einem breiten Spektrum von Tumoren stark exprimiert wird, jedoch nur in einem engen Bereich von normalen Geweben. Zwei der neuartigen CML-assoziierten Antigene in dieser Gruppe, CML66 und CML28, wurden eingehend charakterisiert (Yang et al., 2002 Yang et al., 2001). Antikörperreaktionen auf diese beiden Ziele waren vor der Transplantation oder vor der DLI nicht vorhanden. Hochtitrige Antikörper entwickelten sich 2–3 Monate nach DLI zeitgleich mit dem Erreichen einer zytogenetischen und molekularen Remission der CML. Im Gegensatz zu H-Y-Genen scheint keines dieser Gene Polymorphismen zu kodieren, die die im Transplantatspender und -empfänger exprimierten Allele unterscheiden. Darüber hinaus waren bei Patienten mit chronischer GvHD, bei Patienten mit CML, die sich einer T-Zell-depletierten allogenen HSCT unterzogen, oder bei normalen Spendern keine Antikörper gegen CML66 und CML28 vorhanden. Bemerkenswerterweise waren Antikörper gegen diese beiden Antigene auch bei Patienten mit CML vorhanden, die auf die Behandlung mit Interferon-α angesprochen hatten, jedoch nicht bei Patienten, die mit Hydroxyharnstoff oder Imatinib behandelt wurden. Diese Studien legen nahe, dass die Immunogenität dieser beiden Proteine ​​von ihrer hochgradigen Expression in Leukämiezellen herrührt und nicht, weil sie neue Allo-Antigene darstellen.

Einige Ziele der durch eine Immunbehandlung induzierten humoralen Immunität wurden als oberflächenexprimierte Antigene identifiziert. Bellucci et al. identifizierten BCMA, ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das selektiv auf der Oberfläche von reifen B-Zellen und Myelomzellen exprimiert wird, als DLI-assoziiertes Ziel bei Patienten mit Myelom (Bellucci et al., 2005). Antikörper, die sich entwickelt haben in vivo nachdem festgestellt wurde, dass DLI mit der Zelloberflächendomäne von BCMA reaktiv ist. Beim Testen in funktionellen Assays waren diese IgG-Antikörper im Patientenserum in der Lage, eine Komplement-induzierte Lyse und ADCC von stabil transfizierten BCMA-exprimierenden Zellen oder primären BCMA-exprimierenden Myelomzellen zu vermitteln. Diese Antikörper wurden bei 2 von 9 DLI-Respondern nachgewiesen und blieben über lange Zeiträume nach DLI bestehen. Andere neuere Studien haben gezeigt, dass Antikörper gegen oberflächenexprimierte Antigene spezifische Rezeptor-Liganden-Effekte erzeugen können, die die Tumorzytotoxizität verstärken (Jinushi et al., 2006) (Jinushi et al., 2008). Andererseits handelt es sich bei der großen Mehrheit der durch serologisches Screening identifizierten Antigene um intrazelluläre Proteine. Während diese lediglich die Entwicklung einer Immunantwort auf den extrudierten Inhalt lysierter Tumorzellen darstellen können, können Antikörper gegen intrazelluläre Antigene die Kreuzpräsentation von Zielantigenen über einen FcγR-vermittelten Weg in dendritischen Zellen erleichtern und zur Stimulation von CD8+ . führen T-Zell-Antworten auf Peptidepitope innerhalb des Zielproteins (Amigorena, 2002 Dhodapkar et al., 2002 Kita et al., 2002) (Valmori et al., 2007) Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass B-Zell-Antworten auf Leukämie-assoziierte wahrscheinlich zur GvL-Aktivität beitragen in vivo durch verschiedene Mechanismen.

3.2.3. Natürliche Spenderzellen (NK) als Mediatoren von GvL

Natürliche Killerzellen (NK) sind die ersten Zellen der lymphoiden Abstammungslinie, die sich nach einer allogenen Transplantation rekonstituieren, und eine angemessene Wiederherstellung der NK-Zellzahl in der frühen Zeit nach der Transplantation wurde mit einem verbesserten rückfallfreien Ergebnis in Verbindung gebracht (Jiang et al., 1997). . Das Engagement von NK-Zell-Rezeptoren führt zu einer Stimulation oder Hemmung der NK-Zell-Effektorfunktion, abhängig von der intrazellulären Signalübertragung, die durch den zytoplasmatischen Schwanz oder Adaptermoleküle vermittelt wird, die mit jedem Rezeptor verbunden sind (Chiesa et al., 2005 Moretta und Moretta, 2004). Obwohl die NK-Zellantwort auf ein Ziel von der Nettowirkung der aktivierenden und hemmenden Rezeptoren abhängt, wird sie überwiegend durch KIRs oder MHC-Klasse-I-spezifische Killer-Inhibitor-Rezeptoren (KIR) oder Rezeptoren negativ reguliert. Eine ausreichende Expression geeigneter inhibitorischer NK-Rezeptorliganden schützt gesunde „Selbst“-Zellen vor der NK-Zell-Lyse. In Abwesenheit dieses inhibitorischen Signalwegs werden die Targets jedoch anfällig für die NK-vermittelte Lyse. Im Rahmen der allogenen HSCT hängen die Ergebnisse der NK-Aktivität von der Direktionalität der Lyse ab (Hsu und Dupont, 2005 Ruggeri et al., 2005a). Wenn die NK-Zellen von Spendern stammen und den Empfängerzellen die Expression des zugehörigen KIR-Liganden fehlt, kann die Lyse der Spender-NK-Zellen von Empfänger-Zielzellen in Abhängigkeit vom Gewebeursprung des NK-Ziels zu GvL und/oder GvHD führen. Wenn jedoch die Zielzelle vom Spender stammt und die NK-Effektorzelle vom Empfänger stammt, kann die NK-Zell-Lyse zu einer Transplantatabstoßung führen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die NK-Zell-Effektorkapazität von der Klasse und Menge der inhibitorischen Rezeptoren für Eigen-HLA-B- und HLA-C-Liganden beeinflusst wird. (Pfeiffer et al., 2007 Yu et al., 2007) Es wurde geschätzt, dass NK-Zell-Alloreaktivität bei etwa 50 % der nicht verwandten Spendertransplantate mit einem oder mehreren HLA-Allel-Nichtübereinstimmungen auftreten kann.

Studien, die vor zwei Jahrzehnten durchgeführt wurden, zeigten das Vorliegen einer lytischen NK-Zellaktivität gegen vom Wirt stammende Leukämiezellen nach HSCT (Hauch et al., 1990, Hercend et al., 1986). Überzeugende Studien, die in jüngerer Zeit von Ruggeri et al. haben die Rolle der NK-Zellaktivität bei Patienten untersucht, die T-Zell-depletierte Stammzelltransplantate von HLA-fehlgepaarten Spendern erhielten (Ruggeri et al., 1999 Ruggeri et al., 2002 Ruggeri et al., 2005b). In dieser Einstellung sind KIR auf Spender-NK-Zellen möglicherweise nicht mit ihren inhibierenden HLA-Liganden zusammengehörig und sind in der Lage, Empfänger-Leukämiezellen zu erkennen und abzutöten. Darüber hinaus wurde die NK-Alloreaktivität auf der Grundlage der HLA-B- und HLA-C-Typisierung vorhergesagt, und Donor-Empfänger-Paare wurden in zwei Gruppen eingeteilt: solche mit KIR-Liganden-Inkompatibilität in Donor-gegen-Wirt-Richtung und solche ohne. In einer klinischen Studie, an der 112 Patienten mit akuter Hochrisiko-Leukämie teilnahmen, korrelierte die vorhergesagte NK-Alloreaktivität stark mit dem Transplantationsergebnis bei Patienten mit AML. Bemerkenswerterweise betrug das ereignisfreie Überleben für AML-Patienten in der mit KIR-Liganden inkompatiblen Gruppe 60 %, verglichen mit nur 5 % in der kompatiblen Gruppe. Darüber hinaus bestätigte das Screening von Spender-abgeleiteten NK-Klonen auf Lyse gegen Empfängerzellen, dass die KIR-Liganden-Inkompatibilität eng mit dem Nachweis von Spender-NK-Klonen korrelierte, die Empfängerziele abtöten. Diese und andere Studien haben gezeigt, dass eine KIR-Liganden-Inkompatibilität in der Spender-gegen-Wirt-Richtung Patienten mit AML anscheinend vor Transplantatabstoßung, GVHD und Leukämierezidiven schützt (Hsu et al., 2005 Savani et al., 2007). Die Durchführbarkeit und Sicherheit des adoptiven Transfers von expandierten NK-Zellen zur Behandlung von rezidivierter Leukämie wurde nachgewiesen, und es werden fortlaufende Anstrengungen unternommen, um die Wirksamkeit dieses Ansatzes zu evaluieren (Miller et al., 2005).

3.3. Nachweis, dass GvL . auf bösartige Vorläuferzellen abzielt

Das kurative Potenzial von Stammzelltransplantation und DLI impliziert, dass maligne Vorläuferzellen in den Umfang der von GvL anvisierten Empfängerzellen eingeschlossen sind. In diesem Abschnitt fassen wir Beweise aus Studien zur molekularen Überwachung des Ansprechens von Krankheiten auf eine Therapie und zur Charakterisierung der Zielantigene von T- und B-Zell-Antworten nach HSCT zusammen, die dieses Konzept unterstützen. Repräsentative Beispiele für diese Studien sind in Abbildung 2 dargestellt.


(EIN) Wirksames GvL ist mit einer molekular nicht nachweisbaren Erkrankung verbunden. Ergebnisse des molekularen Monitorings von BCR-ABL Transkript (relativ zum Kontroll-GUS-Transkript) von 50 Patienten, die bei BWH/DFCI mit unbehandelter Erkrankung behandelt wurden, nach Imatinib-Therapie, nach allogener HSCT und von Patienten ohne CML. (B) Effektives GvL ist assoziierte T-Zell-Antworten, die leukämische Vorläufer erkennen (adaptiert von Smit et al. 1998). Der pCILp-Assay misst die Häufigkeit von T-Zell-Vorläufern im peripheren Blut, die in der Lage sind, das Wachstum von CD34+-CML-Vorläuferzellen zu unterdrücken. (C) Effektives GvL ist mit B-Zell-Antworten gegen Antigene verbunden, die auf leukämischen Vorläufern exprimiert werden. Die klinische Reaktion auf DLI bei den Reaktionen eines CML-Patienten ist mit Antikörperreaktionen mit hohem Titer gegen CML66 und CML28 verbunden. Die gestrichelte Linie repräsentiert 250 D über dem Mittelwert von 10 Normalen. (D) CML66 wird in myeloischen Vorläuferzellen stark exprimiert, basierend auf einer immunhistochemischen Markierung des Knochenmarks von Patienten mit AML-Verbindung zu normalem Knochenmark. (E) CML28 und CML66 werden in Myelod-Vorläuferzellen stark exprimiert, basierend auf Studien zur Quantifizierung von RNA-Transkripten. Die relativen Kopienzahlen von CML66- und CML28-Transkripten wurden in Gesamt-RNA gemessen, die aus differenzierten und undifferenzierten normalen und malignen hämatopoetischen Zellen stammte, gemessen durch genspezifische RT-PCR. CML-SP = stabile Phase CML CML-BC = Blastenkrise CML AML = akute myeloische Leukämie.

3.3.1. Wirksames GvL ist mit einer molekular nicht nachweisbaren Krankheit verbunden

Das Vorhandensein der krankheitsspezifischen Translokation BCR-ABL hat die Entwicklung empfindlicher molekularer Assays zum Nachweis der Transkriptexpression dieses Fusionsgenprodukts als Maß für die Krankheitslast erleichtert. Das Erreichen eines molekular nicht nachweisbaren Status im Einklang mit kurativem Ansprechen und Eliminierung maligner selbsterneuernder Populationen wurde bei CML-Patienten nach der Behandlung mit HSCT konsequent nachgewiesen. 2A zeigt die Ergebnisse der molekularen Überwachung einer Gruppe von 50 Patienten, die am Dana-Farber Cancer Institute/Brigham and Women's Hospital, Boston, behandelt wurden (unveröffentlichte Daten). Unser Labor verwendet die GUS (β-Glucuronidase) als Kontrolltranskript, das zuvor validiert wurde (Muller et al., 2008). Wie in dieser Abbildung gezeigt, exprimieren unbehandelte CML-Patienten einenBCR-ABL/GUS Verhältnis zwischen 10–100 % (unsere Standardreferenzbasislinie), während Patienten ohne die BCR-ABL Transkript (d. h. Patienten ohne CML, wie Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL)) haben nicht nachweisbare Transkriptwerte (%BCR-ABL/GUS = <0,001–0,0001%). In Übereinstimmung mit den von anderen Prüfärzten berichteten Ergebnissen wurden Proben von Patienten, die > 1 Jahr mit Imatinib behandelt wurden, BCR-ABL die Transkriptspiegel nahmen variabel über einen Bereich von 5 log ab, wobei viele nach einer Imatinib-Monotherapie eine Transkriptreduzierung von < 2 log gegenüber der Standardreferenzbasislinie erreichten. Im Gegensatz dazu misst unser Assay geringe bis nicht nachweisbare Krankheitsmengen bei Patienten, die eine Immuntherapie (BMT- oder DLI-) induzierte Remission erreicht haben. Darüber hinaus bleiben diese Patienten über Jahre hinweg molekular nicht nachweisbar.

Erfolgreiche Allotransplantate zur Behandlung von chronischer lymphatischer Leukämie und multiplem Myelom haben auch zu molekular nicht nachweisbaren Krankheitsremissionen geführt (Corradini et al., 2003) (Esteve et al., 2001). Die Dauer des klinischen Ansprechens nach DLI scheint mit dem Erreichen einer molekularen Remission verbunden zu sein, was darauf hindeutet, dass die Wirksamkeit von DLI in ähnlicher Weise aus der immunologischen Eliminierung des malignen Stammzellklons resultiert (Dazzi et al., 2000).

3.3.2. GvL-assoziierte T-Zell-Antworten erkennen leukämische Vorläufer

Picertet al. untersuchten die relativen Beiträge des präparativen Transplantationsschemas und der immunologischen Mechanismen nach der Transplantation zur Eliminierung von Leukämiezellen im Empfänger (Pichert et al., 1995). Transplantationen wurden unter Verwendung von T-Zell-depletierten oder unmanipulierten Markprodukten durchgeführt. Von 92 Patienten, die wegen CML mit einer myeloablativen TCD-Transplantation behandelt wurden und die eine Krankheitssuppression ohne klinisch erkennbare GvHD zeigten, zeigten Laborstudien, dass die BCR-ABL positive Zellen, die in diesen Individuen nachgewiesen wurden, repräsentierten frühe Vorläuferzellen, die von dem CML-Klon stammten (Pichert et al., 1994). Die Persistenz dieser CML-Zellen bei der überwiegenden Mehrheit der Patienten, die eine myeloablative Therapie erhielten, deutete daher darauf hin, dass hochdosierte Konditionierungsschemata allein Leukämiezellen nicht effektiv eliminieren konnten. Im Gegensatz dazu schienen immunologische Mechanismen, die durch Spender-T-Zellen vermittelt werden, wichtiger zu sein, um Leukämiezellen nach einer Transplantation zu unterdrücken und einen Leukämierückfall zu verhindern.

Andere Forscher haben die antigenen Spezifitäten von Massen-T-Zelllinien und T-Zell-Klonen untersucht, die von Patienten mit klinischen GvL-Antworten vermehrt wurden, und haben gezeigt, dass die CD34+-Zellpopulation zielgerichtet ist. Wie in 2B gezeigt, haben Smit et al. entdeckten erhöhte Prozentsätze von CTLs, die CML-CD34+-Zellen inhibierten, bei Patienten, die nach einer DLI-Therapie klinisch offensichtliches GvL zeigten (Smit et al., 1998). Falkenburget al. gegen mHA gerichtete isolierte CTL-Klone, die zur antigenspezifischen Lyse frisch gewonnener Leukämiezellen und zur Hemmung leukämischer Vorläuferzellen befähigt sind in vitro (Falkenburget al., 1999). Bonnet al. zeigten, dass humane CTL-Klone, die für mHA spezifisch sind, vorzugsweise auf Leukämie-Stammzellen abzielen können und dass T-Zell-Klone mit dieser Art von Spezifität transplantierte Leukämiezellen in NOD/SCID-Mäusen effektiv eliminieren könnten (Bonnet et al., 1999). Rezvani et al. haben einen Zusammenhang zwischen GvL-Effekten nach der Transplantation und dem Nachweis zytotoxischer CD8+ T-Zellen gegen WT-1 festgestellt, das in malignen hämatopoetischen Vorläuferzellen stark exprimiert wird (Rezvani et al., 2007).

3.3.3. GvL-assoziierte B-Zell-Antworten zielen auf hämatopoetische Vorläuferzellen

Wie in Abbildung 2C–E gezeigt, wurden CML66 und CML28, B-Zell-Targets, die mit GvL-Antworten nach DLI assoziiert sind, in myeloischen Vorläuferzellen stark exprimiert, jedoch nicht in reiferen myeloischen Zellen (Wu et al., 2005). Wir schlagen vor, dass die Kombination von serologischem Immunscreening mit Studien zur Genexpression vielversprechende Antigene für das immunologische Targeting von Stammzellen effizient identifizieren kann. Kürzlich haben wir mit der erweiterten serologiebasierten Antigenentdeckung von GvL-Zielen entdeckt, dass die überwiegende Mehrheit der DLI-assoziierten Antigene auf CD34+-Zellen exprimiert wird. Wir untersuchten zwei komplementäre immunproteomische Plattformen, eine Bakteriophagen-Expressionsbibliothek und einen High-Density-Protein-Microarray, unter Verwendung von Plasma-Immunglobulinen nach der Therapie von sieben CML-Patienten, die nach DLI jeweils eine klinisch offensichtliche GvL ohne Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD) aufwiesen. Insgesamt riefen 62 Antigene eine erhöhte Reaktivität im Post-DLI-Plasma im Vergleich zum Prä-DLI-Plasma hervor. Die Analyse der Genexpression in normalen und malignen myeloischen Zellen unter Verwendung von HG-FOCUS und HG-U133A Affymetrix Microarrays bestätigte, dass >70% der Antigene eine nachweisbare Genexpression in CML CD34+ Zellen aufweisen. Vier Antigene (RAB38, TBCE, DUSP12 und VPS4B) wurden in CML im Vergleich zu normalen CD34+-Zellen in höheren Konzentrationen exprimiert (p < 0,002). Als Sammlung stellen die identifizierten Antigene potenzielle Immunogene oder Reagenzien für das Monitoring von immuntherapeutischen Strategien zur Eliminierung von myeloischen Leukämie-Stammzellen dar (Biernacki et al., 2007).

In analoger Weise haben Spisek et al. beschrieben vor kurzem den Nachweis von Antikörperreaktionen bei Patienten mit der Myelom-Vorläuferstörung, der monoklonalen Gammopathie unbekannter Signifikanz (MGUS), aber nicht mit Myelom gegen SOX2 , ein Gen, das für die Selbsterneuerung in embryonalen Stammzellen benötigt wird. Es wurde festgestellt, dass Sox2 in den Vorläuferzellen, die das klonogene Kompartiment von MGUS markieren, stark exprimiert wird und bei Patienten mit MGUS eine häufige zelluläre Immunität hervorruft. Bemerkenswert ist, dass gegen dieses Antigen erzeugte CTLs das klonogene Wachstum von MGUS . hemmten in vitro. Darüber hinaus war der Nachweis von Antigen-spezifischen CTLs bei MGUS-Patienten mit einer verminderten Progression zu einer malignen Erkrankung und einem verbesserten klinischen Ergebnis verbunden (Spisek et al., 2007).

4. Strategien zum immunologischen Targeting der Stammzellpopulation

In den vorherigen Abschnitten dieser Übersichtsarbeit wurde eine große Menge an Daten zusammengefasst, die die Wirksamkeit des Spenderimmunsystems für die Eliminierung und langfristige Kontrolle bösartiger Zellen belegen. Wie schematisch in den Abbildungen 3A und 3B gezeigt, zeigen die in den vorherigen Abschnitten beschriebenen Studien, dass Immunantworten, die von eingepflanzten, von Spendern stammenden Immunzellen erzeugt werden, zur endgültigen Beseitigung der Resterkrankung beitragen, während präparative myeloablative Transplantationsschemata allein die Krankheitslast reduzieren können. zur Heilung führt. Obwohl HSCT und DLI weiterhin mit einer signifikanten Toxizität verbunden sind und die Krankheitskontrolle nicht bei allen Patienten erreicht wird, stellt die allogene Transplantation ein hervorragendes Beispiel für die klinischen Ergebnisse dar, die durch eine auf immunologischen Mechanismen basierende Therapie erzielt werden können.


Viele Aspekte der GvL nach allogener HSCT sind nicht gut verstanden. Der stetige Fortschritt bei der Charakterisierung der GvL-Targets von T- und B-Zell-Antworten hat jedoch gezeigt, dass klinisch wirksame Immunantworten polyklonal zu sein scheinen, gegen eine Vielzahl von sowohl allo- als auch tumorassoziierten Antigenen gerichtet sind, einschließlich solcher mit Expression auf Vorläuferzellen und beinhalten häufig eine koordinierte zelluläre, humorale und angeborene Immunität. Darüber hinaus werden klinische Reaktionen bei geringer Krankheitslast und langsam proliferierenden Tumorzellen leichter erzeugt, insbesondere wenn weniger intensive Chemotherapie und Strahlentherapie verwendet werden, um Patienten auf die allogene HSZT vorzubereiten. Wie in Fig. 3C gezeigt, können GvL-Wirkungen potentiell verstärkt werden, indem eine aktive Impfung des Empfängers nach der Transplantation von Spenderzellen eingebaut wird, um Antworten auf mHA oder tumorassoziierte Antigene entweder zu induzieren oder zu verstärken. Modellsysteme haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz machbar und potenziell effektiv ist (Anderson et al., 2000 Durakovic et al., 2007 Luznik et al., 2003 Teshima et al., 2002), aber die Auswahl der Impfmethoden sowie der Zeitpunkt und die Die Dosierung von Impfstoffen muss die Fähigkeit des rekonstituierenden Spender-Immunsystems, auf eine Antigen-Challenge zu reagieren, und eine Vielzahl von Patientenfaktoren berücksichtigen.

Oder können, wie in Abbildung 3D angedeutet, die Prinzipien der Graft-versus-Leukämie-Reaktion auf die Entwicklung einer wirksamen tumorspezifischen Immuntherapie im autologen Setting angewendet werden? Können polyvalente zelluläre und humorale Immunantworten insbesondere gegen die maligne Stamm- oder Vorläuferzellpopulation gerichtet werden? Optimalerweise würde dies das Erreichen eines Zustands einer minimalen Resterkrankung erfordern und würde nichtmaligne Zellen verschonen und somit das Risiko für Autoimmunität minimieren. Wie in diesem Abschnitt erörtert, hängt ein rationales Immun-Targeting der tumorinitiierenden Population entscheidend davon ab, (1) die einzigartigen Oberflächenmarker dieser Zellen zu identifizieren, damit sie isoliert werden können, und (2) von der Definition von Antigenen, die eindeutig oder bevorzugt innerhalb von exprimiert werden die bösartigen Zellen mit stammzellähnlichen Funktionen im Vergleich zu normalen Zellen. Das Erreichen dieses Ziels wird jedoch dadurch erschwert, dass der genaue Immunphänotyp der initiierenden Zellen vieler Tumorarten (insbesondere solider Tumoren) derzeit stark umstritten ist (LaBarge und Bissell, 2008). Die Klärung der Identität der tumorinitiierenden Zelle hat wichtige Auswirkungen auf das Ausmaß und die Durchführbarkeit der Verwendung von Immunantworten, um Krebs therapeutisch zu bekämpfen: z.B. ob ein Targeting gegen die gesamte Tumorzellpopulation oder nur eine einzelne oder eine Sammlung von unterschiedlichen Zellsubpopulationen erforderlich ist. Strategien für das Immun-Targeting werden diskutiert.

4.1. Definition der tumorauslösenden Zelle

Um das Ziel des immunologischen Targetings der „Krebsstammzelle“ zu erreichen, ist die Kenntnis des genauen Immunphänotyps dieser Zellpopulation erforderlich, damit die für diese Zellpopulation einzigartigen Antigene identifiziert werden können. Während diese Vorstellung konzeptionell einfach ist und allgemeine Übereinstimmung darüber besteht, dass Tumore zwangsläufig aus einer Zellpopulation entstehen, die sich selbst vermehren und erneuern kann, wird der genaue Ursprung dieser Zelle heftig diskutiert. Wie in Abbildung 4 gezeigt, wurden basierend auf experimentellen Beweisen mindestens zwei verschiedene Modelle für die Tumorausbreitung vorgeschlagen (Adams und Strasser, 2008 Shipitsin und Polyak, 2008). Einerseits basiert das „hierarchische Modell“ oder „Krebs-Stammzell-Hypothese“ auf dem Konzept, dass nur eine seltene Zellpopulation für die sich selbst erneuernden und sich selbst ausbreitenden Eigenschaften von Krebs verantwortlich ist (siehe Abbildung 4A). Diese spezialisierten Zellpopulationen wurden ursprünglich bei myeloischer Leukämie als Zellen mit primitivem hämatopoetischem Vorläufer-Phänotyp (CD34+ CD38-) identifiziert, die bei Injektion in immundefiziente Mäuse dieselbe menschliche Leukämie anwachsen und regenerieren könnten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die resultierende Leukämie seriell in sekundäre Empfänger transplantiert werden konnte, während die Injektion von differenzierteren Leukämiezellen dies nicht konnte (Bonnet und Dick, 1997, Lapidot et al., 1994). Unter Verwendung des gleichen methodischen Ansatzes wurden Zellpopulationen mit diesen Eigenschaften für eine Reihe von soliden Tumoren definiert. Al-Hajj et al. berichteten, dass CD24 –/niedrige /CD44 + -Fraktionen aus metastasierten Pleuraergüssen und einem primären invasiven Brusttumor bei Injektion in das Brustfettpolster weiblicher NOD/SCID-Mäuse ein höheres tumorerzeugendes Potenzial aufwiesen als CD24 + /CD44 +/–-Zellfraktionen (Al- Hajj et al., 2003). Zur Unterstützung des Krebsstammzellmodells bei Brustkrebs haben Liu et al. identifizierten eine deutliche Gensignatur, die mit tumorigenen CD24 –/niedrigen /CD44 + -Zellpopulationen im Vergleich zu normalem Brustepithel assoziiert ist, und beobachteten eine Korrelation zwischen dieser „invasiven“ Gensignatur mit kürzerer Fernmetastasenfreiheit und dem Gesamtüberleben. Diese Studien legen nahe, dass das Vorhandensein und die Häufigkeit dieser Zellpopulation prognostische Relevanz haben (Liu et al., 2007). Andere Forscher haben die Stammzellmarker CD133 oder CD44 verwendet, um mutmaßliche Krebsstammzellen in mehreren Tumorarten zu reinigen (Collins et al., 2005 Li et al., 2007 Zhang et al., 2008). Bemerkenswert ist, dass die Behandlung von Mäusen, denen humane AML-Zellen transplantiert wurden, mit aktivierendem Anti-CD44-Antikörper die leukämische Repopulation deutlich reduzierte, vermutlich aufgrund einer Störung der AML-Stammzelltransplantation und der Repopulationsfähigkeiten (Jin et al., 2006).


(übernommen nach Adams und Strasser 2008 mit Genehmigung).

Alternativ schlagen Befürworter des „stochastischen“ oder „klonalen Evolution“-Modells vor, dass keine seltene Population, sondern die meisten Tumorzellen zur Selbsterneuerung fähig sind und wesentlich zur Tumorerhaltung beitragen können. Wie in Abbildung 4B gezeigt, legen sie nahe, dass der Erwerb genetischer Veränderungen, Mutationen oder bestimmter Reaktionen auf Umweltreize dazu führen kann, dass Zellen stammähnliche Programme und Funktionen erwerben (Kelly et al., 2007). In erster Linie hinterfragen sie, ob eine erfolgreiche Xenotransplantation – der Eckpfeiler des früheren Modells – zutreffend widerspiegelt in vivo menschliche Stammzellbiologie oder einfach definiert eine menschliche Krebszellpopulation, die an die Mikroumgebung der Maus anpassungsfähig ist. Daher argumentieren sie, dass die Verwendung dieser Methodik zur Definition von „Stammheit“ die Anzahl der tumorinitiierenden Zellen unterschätzt. Mehrere Argumentationslinien unterstützen diese alternative Hypothese. Zuerst haben Kelly et al. hat gezeigt, dass in Abwesenheit der Barrieren der Xenotransplantation, wie in Maus-Lymphommodellen und einem PU.1-Knockout-AML-Mausmodell, beide Zellen mit oder ohne stammzellähnlichem Phänotyp Tumore in Empfängermäusen verursachen können (Kelly et al., 2007). Zweitens haben einige Forscher darauf hingewiesen, dass Zellmarker, die zur Definition mutmaßlicher Stammzellen verwendet werden, wie CD133+, bis zu 20 % des Tumors ausmachen können. In ähnlicher Weise haben Shipitsin et al. fanden heraus, dass die mutmaßliche Brustkrebsstammzellpopulation, basierend auf dem Phänotyp von CD24 −/low /CD44 + , ziemlich groß war – 12–60% der Tumorzellen (Shipitsin et al., 2007). Somit legen diese und andere Studien nahe, dass in schlecht differenzierten Tumoren Zellen mit Stammzellfunktionen die Mehrheit der Tumorzellen bilden können. Schließlich besteht weiterhin Verwirrung hinsichtlich der genauen Zelloberflächenmarker, die die Stammzellpopulation definieren. Beieret al. zeigten, dass Glioblastom-Krebsstammzellen je nach analysiertem Tumor entweder CD133+ oder CD133− sein können, was darauf hindeutet, dass Marker für Krebsstammzellen nicht gut etabliert sind oder dass alle Tumorzellen tumorerzeugend sind, jedoch in unterschiedlichem Maße (Beier et al ., 2007). Eine ähnliche Verwechslung von Markern wurde kürzlich im Bereich Dickdarmkrebs berichtet (LaBarge und Bissell, 2008).

Um diese beiden Modelle in Einklang zu bringen, versuchten Adams et al. weisen darauf hin, dass das Verhalten einzelner Krebsarten dem einen oder anderen Modell eher folgen könnte (Adams und Strasser, 2008). Daher kann das Wachstum von hämatopoetischen Krebsarten, deren Zelldifferenzierungswege gut charakterisiert wurden, häufiger ein hierarchisches Muster aufweisen, während das von soliden Tumoren – typischerweise heterogene Krankheiten und stärker abhängig von der unterstützenden Infrastruktur von Endothelzellen und Fibroblasten, die sich bilden intratumorale Blutgefäße und die parakrine Faktoren liefern (die bei einer immundefizienten Maus fehlen würden) – können eher mit einem stochastischen Muster übereinstimmen. Ein weiteres Modell, ebenfalls in Abbildung 4C gezeigt, verschmilzt die beiden Modelle und schlägt vor, dass es eine Krebsstammzelle geben könnte, die aber durch den Erwerb genetischer Veränderungen durch eine sekundäre Krebszelle stammähnlich werden könnte, was dazu führt, dass sie die vorherrschende wird Klon (Adams und Strasser, 2008).

4.2. Immunologisches Targeting von tumorinitiierenden Zellen

Die Implikationen der verschiedenen oben diskutierten Krebsstammzellmodelle sind, dass, während das hierarchische Modell nahelegt, dass das Targeting auf die kleine Stammzellpopulation für die therapeutische Wirksamkeit ausreichend ist, das andere erfordert, dass alle Tumorzellen gezielt werden. Dies liegt daran, dass das letztgenannte Modell nahelegt, dass jede Tumorzelle die Stammzellfunktionen erwerben kann. Daher führt eine enge Fokussierung auf eine kleine phänotypisch definierte Untergruppe zum Entweichen des Tumors. Somit wurden selbst bei CML, die als prototypischer Stammzellkrebs angesehen werden kann, mehrere Wege identifiziert, über die bösartige Zellen Stammzelleigenschaften erwerben können (Passegue et al., 2003). Wie in Abbildung 5 schematisch dargestellt, umfassen diese genetische Veränderungen, die in der frühesten Zelle des Differenzierungsprogramms erworben werden, die zu einem erhöhten Zellüberleben und -proliferation führen können. Alternativ können erworbene genetische Veränderungen stromabwärts der Stammzelle, wie der Vorläuferzelle, zu einer erhöhten Selbsterneuerungsfähigkeit führen. Daher wird die Entwicklung einer Immunität nur gegen HSC-spezifische Zielantigene die Eliminierung von Vorläuferzellen, die sich selbst erneuern, verfehlen.


Im Beispiel der CML kann eine erhöhte Fähigkeit zur malignen Selbsterneuerung aus der Transformation der hämatopoetischen Stammzelle (HSC) zur Entstehung einer CML in der chronischen Phase oder aus differenzierteren Vorläuferzellen zur Entstehung einer CML in der Blastenkrise entstehen. Die Aktivität von leukämischen Stammzellen kann aus einer beeinträchtigten Differenzierung, einem erhöhten Zellüberleben, einer erhöhten Proliferation, einer erhöhten genomischen Instabilität und/oder einer erhöhten Selbsterneuerungskapazität resultieren. Beispiele für Impfstrategien werden bereitgestellt.

Angesichts der Ungewissheit, auf welche Zellen abgezielt werden soll und welche genauen Immunogene zur Tumorelimination führen, besteht der Ansatz mehrerer Gruppen darin, ganze Tumorzellen für die Impfung zu verwenden (siehe Abbildung 5). Dieser Ansatz zielt nicht ausschließlich auf maligne Stammzellen oder Vorläuferzellen ab, aber diese Zellpopulationen gehören zu dem Bereich von Zellen, die für die Auswirkungen der Immunisierung anfällig sind. Dieser „breitere“ Ansatz hat den Vorteil, mit patiententumorspezifischen Antigenen zu immunisieren – einschließlich mutierter und unterschiedlich exprimierter/präsentierter Antigene. Dies wurde erreicht durch Immunisierung mit Zytokin-Gen-transduzierten bestrahlten autologen Tumorzellen (Soiffer et al., 1998, Zhou et al., 2005), Tumorlysaten (Jocham et al., 2004), Hitzeschockproteinen, die an Peptide gebunden sind, die von autologen Tumoren (Srivastava, 2006) oder Fusionshybriden zwischen autologen Tumor- und dendritischen Zellen oder amplifizierter Tumor-abgeleiteter RNA (Su et al., 2003). Bei DFCI beispielsweise zielt die Impfung mit bestrahlten autologen Melanomzellen, die so konstruiert sind, dass sie das starke Zytokin-Adjuvans GM-CSF durch adenoviral-vermittelten Gentransfer sezernieren, wahrscheinlich auf einige Melanom-initiierende Zellen, da 29% der Patienten mit metastasiertem Melanom mindestens überleben Follow-up von 36 Monaten (Soiffer et al., 2003).

Die offensichtliche Einschränkung autologer Ganztumor-Impfstoffe besteht darin, dass ihre Verwendung zwar die Personalisierung der Immunogene gewährleistet, sie aber per Definition auch aus Tausenden von normalen Selbstantigenen bestehen, die in vielen Geweben vorhanden sind. Somit wird erwartet, dass eine starke Antitumorimmunität mit gleichzeitiger und möglicherweise tödlicher Autoimmunität verbunden ist, da die Wirksamkeit von Ganztumorvakzinen bei der Induktion von Immunität erhöht wird. Dies kann als Analogie zur Induktion von GvHD im Transplantationssetting angesehen werden.Frühe Anzeichen dieser Möglichkeit wurden in Studien zu einem neuen Wirkstoff beobachtet, dem CTLA4-Ig-Blockierungsantikörper, der bei gleichzeitiger Verabreichung mit Tumorantigenen eine signifikante Autoimmunität induzieren kann (Atia et al., 2005 Beck et al., 2006 Maker et al.). al., 2006 Phan et al., 2003 Ribas et al., 2005 Sanderson et al., 2005). Andererseits haben jüngste Modifikationen des CTLA4-Ig-Dosierungsschemas zu akzeptableren Entzündungsniveaus geführt (Hodi et al., 2008 Hodi et al., 2003). Insbesondere eine sequentielle Dosierung, bei der auf die Impfung eine CTLA4-Blockade folgte, führte zu einer klinischen Dissoziation von Tumorimmunität und Autoimmunität, obwohl immer noch Toleranzverletzungen beobachtet werden, was durch das häufige Auftreten von vorübergehenden Hautausschlägen, asymptomatischer bilateraler hilärer Lymphoadenopathie und niedriger grad kolitis. Somit bleibt ein signifikantes Risiko für Autoimmunität bei der Immunisierung von Patienten mit großen Mengen weit exprimierter Antigene, insbesondere da Verfahren zur Stimulierung der Immunität effektiver werden.

Angesichts dieser Risiken besteht ein alternativer Ansatz darin, Impfstoffe zu entwickeln, die selektiver auf krebsauslösende Zellen abzielen. Als Beispiel für diesen Ansatz haben Pellegatta et al. verwendeten dendritische Zellen, die mit Neurosphären beladen waren, die für Gliom-Stammzellen angereichert sind, um Mäuse mit Tumoren zu impfen, die aus GL261-Gliomzellen bestanden. Die Impfung mit diesen beladenen DCs führte zu einer Heilung von 80 % der Mäuse mit diesen Tumoren, was darauf hindeutet, dass dies eine hochgradig schützende Strategie ist (Pellegatta et al., 2006).

Andere Forscher haben versucht, definierte Antigen-Impfstoffe zu entwickeln, wobei Immunogene verwendet wurden, die in malignen Vorläuferzellen durchweg überexprimiert werden. Diese Immunogene können als ganzes Protein oder als Peptide zugeführt werden. Im Allgemeinen besteht ein häufig verwendeter methodischer Ansatz zur Identifizierung von Kandidaten für Immuntherapieziele darin, Antigene zu identifizieren, die eine bevorzugte tumorbeschränkte Expression zeigen, und dann Peptide, die von dem Kandidatenantigen abgeleitet sind und an gemeinsame HLA-Allele binden können, bioinformatisch vorherzusagen. Dann wird die zytotoxische T-Zell-Reaktivität gegen Antigen-präsentierende Zellen, die das vorhergesagte Peptid exprimieren, bewertet. Auf diese Weise wurde WT-1 als Antigen mit fast ausschließlicher Expression entweder auf leukämischen CD34+-Stamm- oder Vorläuferzellen gut charakterisiert und in klinischen Studien getestet (Rezvani et al., 2008). Neben einer hohen Expression in Vorläuferzellen ist auch bekannt, dass es Antikörperantworten hervorruft (Elisseeva et al., 2002 Gaiger et al., 2001 Ling et al., 1998). Darüber hinaus können WT1-spezifische CTLs spezifisch töten BCR-ABL + Leukämie-transformierte Stammzellen ohne Schädigung normaler hämatopoetischer Stammzellen in vitro oder in Mäusen in vivo (Gao et al., 2000Oka et al., 2000). Kürzlich wurde eine Phase-I-Studie durchgeführt, in der 26 Patientinnen mit Brust, Lunge, MDS oder AML mit intradermalen Injektionen der HLA-A24 eingeschränkten natürlichen oder modifizierten 9-mer WT1-Peptide geimpft wurden (Oka et al., 2004). Achtzehn von 26 beendeten 3 oder mehr Injektionen und 12 von 20 zeigten klinische Reaktionen wie eine Verringerung der Leukämie-Blastenzellen oder Tumorgrößen und -marker, die eindeutig mit einer Zunahme der Häufigkeit von WT1-spezifischen CTLs nach der Impfung korrelierten. Es wurde keine Schädigung von normalem Gewebe beobachtet. Andere potenzielle Leukämie-assoziierte Antigene dieser Kategorie, die jeweils in klinischen Studien untersucht werden, umfassen die Leukämie-assoziierten Antigene RHAMM, PRAME, Survivin und Proteinase 3 (Greiner und Schmitt, 2008). Dieser allgemeine Ansatz der „reversen Immunologie“ wurde angewendet, um vielversprechende Kandidaten für tumorassoziierte Antigene für die Impfung auch bei soliden Tumoren zu identifizieren (Curigliano et al., 2006 Gnjatic et al., 2006 Purcell et al., 2007).

Eine potenzielle dritte Klasse von Tumorantigenen wurde aufgrund technischer Schwierigkeiten bei ihrer Identifizierung selten in Impfstoffen verwendet (Parmiani et al., 2007, Sensi und Anichini, 2006). Diese Klasse besteht aus Proteinen mit tumorspezifischen Mutationen, die zu veränderten Aminosäuresequenzen führen. Solche mutierten Proteine ​​haben das Potenzial: (a) einen Tumor (relativ zu Nicht-Tumorzellen) eindeutig für die Erkennung und Zerstörung durch das Immunsystem zu markieren (Lennerz et al., 2005) (b) zentrale und manchmal periphere T-Zell-Toleranz zu vermeiden , und werden daher von effektiveren T-Zell-Rezeptoren mit hoher Avidität erkannt (Gotter et al., 2004). Kürzlich haben groß angelegte traditionelle Sequenzierungsbemühungen gezeigt, dass Tumore eine kleine Anzahl von Fahrer- und eine große Anzahl von Beifahrer-Mutationen enthalten und dass ein durchschnittlicher Tumor Dutzende bis Hunderte von nicht-synonymen Mutationen in proteinkodierenden Regionen aufweisen kann (Greenman et al. , 2007 Sjoblom et al., 2006 Thomas et al., 2007). Außerdem, in silico Die Analyse von Sequenzen, die aus Tumor- und normalen Zellen desselben Patienten stammen, legt nahe, dass diese somatischen Mutationen mehrere potenzielle Neoantigene für die Entwicklung von Tumorimpfstoffen liefern, geschätzt auf ∼ 10 neue Epitope pro Tumor, die HLA-A*0201 binden können (Segal et al., 2008 ). Alternative Spleißvarianten von BCR-ABL bei CML-Patienten wurden immunogene identifiziert (Volpe et al., 2007) und legen nahe, dass diese auch potenzielle Immunziele für diese Krankheit sind. Es ist nicht bekannt, auf welcher Stufe der CML-Hierarchie diese Varianten erworben werden. Basierend auf der Analyse von BCR-ABL Mutationen nach Exposition gegenüber ABL Kinasehemmer (Abschnitt 2) werden diese Varianten mit hoher Wahrscheinlichkeit in CML-Stammzellen nachgewiesen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass viele der in den Studien zur CML entdeckten Konzepte allgemein auf die Konzeption analoger therapeutischer Strategien bei Patienten mit anderen Malignomen anwendbar sind. Die kürzliche Identifizierung von malignen Zellen, die ein klonogenes Potential besitzen, legt die Möglichkeit nahe, dass das Targeting spezifischer Zellsubpopulationen zur Generierung kurativer Antworten beitragen kann. Die hervorragende Spezifität der adaptiven Immunantwort bietet die Möglichkeit, diese Zellpopulation ohne Kollateralschäden an anderen nicht-malignen Zellpopulationen gezielt anzugreifen. Die jüngsten Fortschritte bei der Aufklärung wirksamer Adjuvantien und bei der Analyse der Mechanismen, die die negative Immunregulation kontrollieren, erregen die Möglichkeit, wirksame Krebsimpfstoffe zu entwickeln. In Zukunft können wir uns auf Behandlungsstrategien freuen, die diese Informationen zusammen mit einer geeigneten antigenen Stimulation nutzen, um krebsauslösende Zellen zu erreichen, um kurative Therapien mit minimaler Toxizität für Krebs zu entwickeln.

1. Danksagung

CJW dankt dem Claudia Adams Barr Program in Cancer Research, dem NCI (5R21CA115043-2), dem Early Career Physician-Scientist Award des Howard Hughes Medical Institute, der Leukemia and Lymphoma Society und wird von einem Damon-Runyon Clinical Investigator unterstützt (teilweise) von der Damon-Runyon Cancer Research Foundation (CI-38-07).


AUTORENBEITRÄGE

M. Schachner konzipierte die Studie R. Kleene, G. Loers, D. Lutz, M. Schachner und M.K.E. Schäfer gestaltete die Forschung D. Appel, L. Congiu, G. Loers und M.K.E. Schäfer analysierte Daten D. Appel, L. Congiu, R. Kleene, G. Loers, D. Lutz und I. Hermans-Borgmeyer führten Untersuchungen durch G. Loers, M. Schachner und M.K.E. Schäfer hat die Zeitung geschrieben.

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4. Amphibien

7 Monate danach übernimmt IgX als der wichtigste Schleimhaut-Ig-Isotyp [101,102]. Der iberische Molch exprimiert mindestens drei Isotypen der schweren Kette, IgM, IgY und IgP (für Pleurodelen) [101,103] die später als IgD-Orthologe identifiziert wurden [95] wie Amphibien IgM und IgY, IgP schwere Ketten haben 4 konstante Domänen und Transkripte sowohl für membrangebundene als auch für sekretorische Formen wurden gefunden. Die Expression von IgP scheint auf die Milz der Molchlarven beschränkt zu sein und nimmt nach der Metamorphose signifikant ab [103]. Bisher wurde gezeigt, dass chinesische Riesensalamander IgM, IgD und IgY exprimieren, und für jede wurden mehrere Isoformen durch Transkriptanalyse und Western-Blotting identifiziert [95].

10-fach während einer humoralen Reaktion in Xenopus, im Gegensatz zu dem >10.000-fachen Anstieg, der mit dem gleichen Antigen bei Säugern beobachtet wurde. Die Sequenzanalyse von Ig-Schwerketten zeigt, dass, obwohl die Rate somatischer Mutationen zwischen Fröschen und Mäusen nicht sehr unterschiedlich ist, die Mutationen in Xenopus dazu tendierten, bevorzugt an Guanin-Cytosin (GC)-Basenpaaren [110] und dem R/S-Verhältnis in der aufzutreten CDRs war sehr niedrig. Zusammengefasst deutet dies darauf hin, dass, wie bei Knochenfischen, die Selektion von Mutanten in Xenopus suboptimal ist, wiederum aufgrund der einfacheren Organisation ihrer lymphoiden Organe und des Fehlens organisierter Keimzentren [107,109,110]. Trotzdem wurde in Xenopus eine Antikörperreaktion als Reaktion auf den Chytridpilz Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) beobachtet, den Erreger der tödlichen Hautkrankheit Chytridiomykose, die weltweit mit Amphibienabbau in Verbindung gebracht wird, Hautschleim von X. laevis, der zuvor Bd ausgesetzt war signifikante Mengen an erregerspezifischem IgX und in geringerem Maße IgM und IgY. Darüber hinaus induzierte die Immunisierung mit durch Hitze abgetöteten Erregern spezifische IgM- und IgY-Antikörper im Serum [111]. Ob diese Antikörper schützend sind, muss noch festgestellt werden.


(ADCC). Ein Mechanismus, durch den natürliche Killerzellen (NK) auf IgG-beschichtete Zellen gerichtet werden, was zur Lyse der Antikörper-beschichteten Zellen führt. Der Fc-Rezeptor mit niedriger Affinität für IgG (FcγRIII, auch als CD16 bekannt) wird an der Oberfläche von NK-Zellen exprimiert und vermittelt ADCC.

Thalidomid und Lenalidomid

Thalidomid (α-N-Phthalimidoglutarimid) ist ein Derivat der Glutaminsäure. Es wird pharmakologisch als immunmodulatorisches Arzneimittel klassifiziert, da es die Expression verschiedener Zytokine verändern und Immuneffektorzellen einschließlich natürlicher Killerzellen co-stimulieren kann. Lenalidomid ist ein 4-Aminoglutaramid-Analogon von Thalidomid mit verstärkten immunmodulatorischen Wirkungen und einem im Vergleich zu seiner Muttersubstanz günstigen Toxizitätsprofil.

Immunstimulatorische DNA-Komplexe

Synthetische DNA-Oligonukleotide mit unmethylierten CpG-Motiven (CpG-ODN), die dem Immunsystem ein Gefahrensignal geben, indem sie die Aktivität bakterieller DNA nachahmen. CpG-ODN lösen schnelle Reaktionen durch angeborene Immunzellen aus, einschließlich plasmazytoiden dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen.

Ein funktioneller Reifungsprozess von NK-Zellen, der die Erkennung von MHC-Klasse-I-Wirtsmolekülen durch inhibitorische NK-Zell-Rezeptoren beinhaltet. Das Fehlen einer solchen funktionellen Reifung wurde als ein Mechanismus für die Hyporeaktivität von NK-Zellen vorgeschlagen, die keine inhibitorischen Rezeptoren gegenüber Wirts-MHC-Klasse-I-Molekülen exprimieren.

Ein Wachstumsstillstandszustand, der schließlich von Zellen erreicht wird, die eine wiederholte Proliferation durchlaufen haben in vitro oder in vivo, das durch funktionell aktive Zellen gekennzeichnet ist, denen die proliferative Kapazität fehlt oder verringert ist. Seneszente Immunzellen kommen häufiger bei älteren Menschen und bei Patienten mit chronisch entzündlichen Erkrankungen vor.

(TReg Zellen). Eine kleine Population von CD4 + T-Zellen, die den Transkriptionsfaktor Forkhead Box P3 (FOXP3) exprimieren und eine regulatorische (d. Fehlen funktionaler TReg-Zellen ist mit schwerer Autoimmunität verbunden.

Ein DNA-alkylierendes Mittel, das weit verbreitet als Antitumormittel oder Immunsuppressivum verwendet wird. Es wurde gezeigt, dass Cyclophosphamid bevorzugt bestimmte Untergruppen von Lymphozyten zerstört, einschließlich B-Zellen und regulatorischen Zellen.

Ein Purin-Analogon, das als inhibitorisches Substrat für Ribonukleotid-Reduktase, DNA-Polymerasen, DNA-Ligase I und DNA-Primase wirkt. Es beeinflusst die DNA-Synthese und -Transkription. Fludarabin induziert den Zelltod, insbesondere bei leukämischen Zellen, und wird häufig bei der Behandlung von indolenter Leukämie und Lymphomen eingesetzt. Fludarabin wurde auch in präparative Behandlungsschemata mit reduzierter Intensität für die hämatopoetische Stammzelltransplantation integriert.

(siRNA). Kurze doppelsträngige RNAs von 19–23 Nukleotiden, die eine RNA-Interferenz induzieren, einen posttranskriptionellen Prozess, der auf sequenzspezifische Weise zu Gen-Silencing führt.

Dies sind Antikörper, die aus der Rekombination variabler Domänen aus zwei Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten stammen. Bispezifische Antikörper wurden verwendet, um zytotoxische Immunzellen zu Tumorzellen umzuleiten.