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Wie schlecht ist Ethidiumbromid in Ihrem Plasmid für nachgelagerte Anwendungen?

Wie schlecht ist Ethidiumbromid in Ihrem Plasmid für nachgelagerte Anwendungen?


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Ich möchte Stammzellen aus Fettgewebe mit einem eigenen Klon transfizieren. Mein Problem ist, dass ich viele Kontaminationen bekomme (nicht nur genomisch, sondern aufgrund der Natur der Technik bekomme ich unerwünschte Produkte, die ich nicht loswerden konnte).

Also dachte ich darüber nach, ein Gel mit meinen Plasmid-DNA-Proben laufen zu lassen und meine gewünschten Banden durch Gel zu reinigen. Ich weiß jedoch nicht, ob eine Ethidiumbromid-Kontamination in meiner Probe ein Problem darstellen würde oder ob sie mit einem regulären Gelextraktionskit beseitigt wird.


Die Reinigung und Isolierung von DNA-Banden durch Ausschneiden aus Agarosegel ist alltäglich (Lee et al., 2012). Der Reinigungsschritt nach dem Ausschneiden der Bande entfernt die meisten EtBr und andere Verunreinigungen. Siehe zum Beispiel die Websites von Isogen und Sigma-Aldrich.

Referenz
- Lee et al. J Vis Exp (2012); 62: e3923


2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse One Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Haben eukaryotische Zellen Restriktionsendonukleasen? Rechtfertige deine Antwort.
Antworten:
Die eukaryontischen Zellen besitzen keine Restriktionsendonukleasen. Die eukaryotischen Zellen haben einige andere Abwehrmittel, d. h. das Immunsystem) gegen eine Virusinfektion.

Frage 2.
Welche Wirtszellen werden in der Gentechnik am häufigsten verwendet?
Antworten:
E coli.

Frage 3.
Welches sind die üblichen Vektoren, die zum Klonen von Genen in Pflanzen verwendet werden?
Antworten:
In Agrobacterium tumefaciens vorhandenes Tiplasmid.

Frage 4.
Wer hat die PCR-Technik entdeckt?
Antworten:
Kary Mullis.

Frage 5.
Was ist ein Bioreaktor?
Antworten:
Es handelt sich um einen technischen Aufbau zur Durchführung biologischer Reaktionen unter aseptischen Bedingungen.

Frage 6.
Nennen Sie die Technik, mit der DNA-Fragmente getrennt werden können?
Antworten:
Gelelektrophorese.

Frage 7.
Nennen Sie die Quelle der Taq-Polymerase?
Antworten:
Thermus aquaticus.

Frage 8.
Was sind rekombinante Proteine?
Antworten:
Proteine, die aus einer rekombinanten DNA oder einem transgenen Organismus hergestellt werden, sind rekombinante Proteine.

Frage 9.
Nennen Sie den am häufigsten verwendeten Vektor für die Transformation in Pflanzenzellen?
Antworten:
Agrobacterium tumefacien.

Frage 10.
Wer hat das Restriktionsenzym zum ersten Mal isoliert?
Antworten:
Warner Arber und Hamilton Smith.

Frage 11.
Ein Patent definieren?
Antworten:
Patent ist der staatliche Schutz des Erfinders von biologischem Material und sichert ihm für eine bestimmte Zeit das ausschließliche Recht, eine Erfindung herzustellen, zu verwerten, zu nutzen und zu verkaufen.

Frage 12.
Definieren Sie den Begriff Plasmid.
Antworten:
Autonom replizierende zirkuläre extrachromosomale DNA (oder) Eine zirkuläre doppelsträngige, extrachromosomale DNA, die im Zytoplasma von Bakterien vorhanden ist.

Frage 13.
Biotechnologie definieren.
Antworten:
Die Integration von Naturwissenschaften und Organismen, Zellen, Teilen davon und molekularen Analoga in Produkte und Dienstleistungen wird als Biotechnologie bezeichnet.

Frage 14.
Nennen Sie die Verbindung, die zur Visualisierung von DNA unter UV-Strahlung verwendet wird.
Antworten:
Ethidiumbromid.

2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Zwei-Mark-Fragen und Antworten

Frage 1.
Beschreiben Sie kurz Folgendes:
(a) Ursprung der Replikation
(b) Bioreaktoren
(c) Nachgelagerte Verarbeitung.
Antworten:
(a) Replikationsursprung: Dies ist die Sequenz im DNA-Molekül, von der aus die Replikation beginnt und jedes DNA-Stück, wenn es mit dieser Sequenz verbunden ist, dazu gebracht werden kann, sich innerhalb der Wirtszelle zu replizieren.

(b) Bioreaktoren: Dies sind Kulturgefäße, in denen ein großes Kulturvolumen (100-1000 Liter) verarbeitet werden kann, um eine große Menge eines Produkts im kommerziellen Maßstab zu erhalten.

(c) Downstream Processing: Nach der Bildung durchläuft ein Produkt einige Prozesse, bevor ein fertiges Produkt zur Vermarktung bereit ist. Diese Prozesse umfassen Trennung und Reinigung, die zusammen als Downstream Processing bezeichnet werden.

Frage 2.
Kurz erklären:
(a) PCR
(b) Restriktionsenzyme und DNA
(c) Chitinase
Antworten:
(a) PCR: PCR steht für Polymerase-Kettenreaktion. Bei dieser Reaktion werden mehrere Kopien des interessierenden Gens (oder DNA) in vitro synthetisiert, wobei Primersätze und das Enzym Taq DNA-Polymerase verwendet werden.

(b) Restriktionsenzyme und DNA: Dies sind die Enzyme, die das Wachstum von Bakteriophagen einschränken. Diese Enzyme sind in vielen Bakterien vorhanden, wo sie als Teil ihres Abwehrmechanismus, dem sogenannten Restriktionsmodifikationssystem, fungieren. Es gibt zwei Arten von Restriktionsenzymen:
(a) Restriktionsendonuklease schneidet DNA in Stücke.
(b) Das Modifikationsenzym fügt der DNA eine Methylgruppe hinzu.

(c) Chitinase: Es ist ein Enzym, das die in der Wand von Pilzen vorhandene Chitinsubstanz abbaut.

Frage 3.
Besprechen Sie mit Ihrem Lehrer und finden Sie heraus, wie Sie zwischen den folgenden Punkten unterscheiden können:
(a) Plasmid-DNA und chromosomale DNA
(b) RNA und DNA
(c) Exonuklease und Endonuklease.
Antworten:
(a) Plasmid-DNA und chromosomale DNA: Plasmid-DNA ist eine kleine doppelsträngige zirkuläre DNA, die in einigen Bakterien vorhanden ist. Sie tragen Gene für Arzneimittelresistenz, N2-Fixierung und Fruchtbarkeit. Die chromosomale DNA ist viel größer und trägt Gene für andere Merkmale der Zelle.

(b) RNA und DNA: RNA ist ein einzelsträngiges Polymer von Ribonukleotiden, die Ribose-Zucker und Adenin, Guanin-Cytosin und Uracil-Stickstoffbasen enthalten, während DNA ein doppelsträngiges Polymer von Desoxyribo-Nukleotiden ist, das Desoxyribose-Zucker und Adenin, Guanin, Cytosin enthält und Thymin-Stickstoffbasen.

(c) Exonuklease und Endonuklease: Exonukleasen entfernen Nukleotide von den Enden der DNA, während Endonukleasen Schnitte an spezifischen Positionen innerhalb der DNA vornehmen.

Frage 4.
Erwähnen Sie die Werkzeuge, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden.
Antworten:
Gewünschtes Gen, Vektor-DNA, Enzyme, Wirtszelle und Bioreaktor.

Frage 5.
Was sind palindromische Sequenzen? Gib ein Beispiel.
Antworten:
Wenn in einem doppelsträngigen DNA-Molekül die beiden Stränge in einer Region sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung identisch sind, werden sie als palindromische Sequenzen bezeichnet.

Frage 6.
Wie werden Restriktionsendonukleasen benannt?
Antworten:
Die Benennung der Restriktionsendonuklease basiert auf folgenden Regeln:

  • Der erste Buchstabe des REN bezieht sich auf den Gattungsnamen der Bakterien, von denen er abgeleitet ist, und wird in Großbuchstaben geschrieben.
  • Der zweite und der dritte Buchstabe beziehen sich auf den Artnamen des Bakteriums, von dem es abstammt und wird als Kleinbuchstabe geschrieben.
  • Wenn ein vierter Buchstabe vorhanden ist, steht er für den Namen des Bakterienstamms oder der Unterart.
  • Die römische Zahl gibt die verschiedenen RENs an, die von demselben Organismus stammen.
    Bsp.: Hind III.

Frage 7.
Was sind Molekularscheren? Erklären Sie ihre Rolle.
Antworten:
Die nuklearen Enzyme, die DNA an bestimmten Stellen brechen, werden als Restriktionsendonukleasen [REN] bezeichnet. Die RENs sind im Volksmund als biomolekulare Scheren bekannt. REN kann beide Stränge einer DNA an der gleichen Position oder an unterschiedlichen Positionen schneiden,
B.: Eco RI, Hind III, Sal I, Bam I.

Frage 8.
Zeichnen Sie ein ordentlich beschriftetes Diagramm von Plasmid pBR322
Antworten:

Frage 9.
Schreiben Sie die Anwendungen der PCR-Technik.
Antworten:

  • Zur Amplifikation von DNA- und RNA-Strängen.
  • Um die Orientierung und Lage von Restriktionsfragmenten relativ zueinander zu untersuchen.
  • Nachweis von Mutationen/Vorhandensein mutierter Gene in den Chromosomen.
  • Um DNA-Fingerabdrücke zu identifizieren.

Frage 10.
Was sind Nukleasen? Unterscheiden Sie zwischen Exonukleasen und Endonukleasen.
Antworten:
Restriktionsenzyme sind die Nukleasen. Es gibt zwei Arten, nämlich Exonukleasen und
Endonukleasen.

Exonukleasen entfernen Nukleotide von den Enden der DNA und Endonukleasen können an bestimmten Stellen innerhalb der DNA selbst schneiden

Frage 11.
Zeichnen Sie ein ordentlich beschriftetes Diagramm des Rührtank-Bioreaktors.
Antworten:

Frage 12.
Was sind „selektierbare Marker“? Welchen Nutzen haben sie in der Gentechnik?
Antworten:
Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, das bei der Selektion jener Wirtszellen, die den Vektor enthalten, und bei der Eliminierung der Nicht-Transformanten, z.B. Antibiotikaresistenz codierende Gene sind nützliche selektierbare Marker, da sie nur ein selektives Wachstum von Transformanten ermöglichen.

Frage 13.
Was ist „Insertionsinaktivierung“?
Antworten:
Wird eine rekombinante DNA in die kodierende Sequenz des Enzyms B – Galactosidase eingefügt, führt dies zur Inaktivierung des Enzyms, die als „Insertionsinaktivierung“ bezeichnet wird. Das Vorhandensein von chromogenem Substrat führt zu blau gefärbten Kolonien, wenn das Plasmid in den Bakterien kein Insert aufweist. Das Vorhandensein von Insert führt zur Inaktivierung der Insertion und die Kolonien produzieren keine Farbe.

Frage 14.
Zeichnen Sie ein ordentlich beschriftetes Diagramm des besprühten Rührtank-Bioreaktors.
Antworten:

Frage 15.
Was sind Bioreaktoren? Nennen Sie den am häufigsten verwendeten Bioreaktor in der Gentechnik.
Antworten:
Es handelt sich um einen technischen Aufbau zur Durchführung biologischer Reaktionen unter aseptischen Bedingungen.

2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Drei Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Was sind die beiden grundlegenden Techniken der modernen Biotechnologie?
Antworten:
Die zwei grundlegenden Techniken der modernen Biotechnologie sind:
(a) Gentechnik, bei der die Natur des genetischen Materials verändert oder in einen anderen Wirtsorganismus eingebracht wird, um seinen Phänotyp zu ändern.

(b) Techniken, um das Wachstum und die Vermehrung nur der gewünschten Mikroben oder Zellen in großer Zahl unter sterilen Bedingungen für die Herstellung zu erleichtern.

Frage 2.
Was sind gentechnisch veränderte Organismen? Nennen Sie zwei Faktoren, von denen ihr Verhalten abhängt?
Antworten:
Als gentechnisch veränderte Organismen oder transgene Organismen werden solche Organismen bezeichnet, deren Gene durch Manipulation verändert wurden. Die beiden Faktoren, von denen ihr Verhalten abhängt, sind:

  • richtige Insertion des interessierenden Gens.
  • die richtige Ernte von genetisch veränderten Organismen, um das gewünschte Produkt herzustellen.

Frage 3.
Was meinen Sie mit „Biopiraterie“ Geben Sie ein Beispiel?
Antworten:
Biopiraterie bezieht sich auf die Nutzung von Bioressourcen durch multinationale Unternehmen und andere Organisationen ohne entsprechende Genehmigungen der betroffenen Länder und Personen, z. Basmati-Reis, der in Indien angebaut wird, zeichnet sich durch seinen einzigartigen Geschmack und sein Aroma aus, aber ein amerikanisches Unternehmen hat durch ein US-Patent Patentrechte an Basmati erhalten.

2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Fünf Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Erklären Sie den Prozess der rekombinanten DNA-Technologie.
Antworten:
Verfahren der Gentechnik:
(a) Isolierung von genetischem Material (DNA): Bei der rekombinanten DNA-Technologie ist es wichtig, DNA in reiner Form frei von anderen Makromolekülen zu isolieren. Da das DNA-Molekül mit der Membran in der Zelle eingeschlossen ist, müssen wir die Zelle aufbrechen, um DNA zusammen mit anderen Makromolekülen wie RNA, Proteinen, Polysacchariden und Lipiden freizusetzen. Dies geschieht in Bakterienzellen, Pflanzen- und Tierzellen mit bestimmten Enzymen.

Die anderen Makromoleküle können durch geeignete Behandlung mit spezifischen Enzymen entfernt werden. Schließlich werden die gereinigten DNA-Moleküle nach Zugabe von gekühltem Ethanol ausgefällt, was als Ansammlung feiner Fäden in der Suspension zu sehen ist.

(b) Schneiden von DNA an bestimmten Stellen: Das isolierte gereinigte DNA-Molekül wird mit Hilfe eines geeigneten Enzyms namens Restriktionsendonuklease in Segmente mit klebrigen Enden geschnitten (gespalten).

(c) Gelelektrophorese: Die geschnittenen DNA-Fragmente werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von Agarosegel getrennt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül, daher bewegt es sich in Richtung der positiven Elektrode (Anode).

(d) Amplifikation des interessierenden Gens mittels PCR: Die Amplifikation eines Gens ist „ein Prozess, bei dem viele Kopien eines Gens hergestellt werden“. Dies wird durch eine Technik namens Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erreicht.

Verfahren der PCR:
1. Die DNA aus dem gewünschten zu amplifizierenden Segment, ein Überschuss der beiden Primermoleküle, der vier Desoxyribosetriphosphate und DNA-Polymerase werden in einem Reaktionsgemisch in einem Eppendorf-Röhrchen mit ausreichenden Mengen Mg ++ zusammengemischt. Das Eppendorf-Röhrchen wird in die PCR-Einheit gestellt und die folgenden Vorgänge werden nacheinander ausgeführt.

2. Denaturierung: Das Reaktionsgemisch wird zunächst einer Temperatur zwischen 90 – 98 °C (üblicherweise 94 °C) ausgesetzt. Es führt zur Trennung von zwei DNA-Strängen aufgrund des Aufbrechens von Wasserstoffbrücken. Dies wird Denaturierung genannt. Jeder DNA-Strang fungiert als Template-Strang für die DNA-Synthese. Die Dauer dieses Schrittes im ersten PCR-Zyklus beträgt normalerweise 2 Minuten bei 94 °C.

3. Glühen (anneal=verbinden): Die Mischung wird nun auf eine niedrige Temperatur (40-60°C) abgekühlt. Während dieses Schrittes hybridisieren (hybridisieren) zwei Oligonukleotidprimer, die zu einer DNA-Region komplementär sind, einen an jedes 3 Ende des DNA-Strangs. Die Dauer des Annealing-Schritts beträgt in der Regel eine Minute während des ersten sowie der nachfolgenden PCR-Zyklen.

4. Primerverlängerung: Während dieses Schrittes verlängert das Enzym taq DNA Polymerase die Primer unter Verwendung von Nukleotiden und DNA-Matrizen. Die beiden Primer erstrecken sich aufeinander zu, um zwei neue DNA-Stränge (an 5) zu enden. Die Dauer der Primerverlängerung beträgt normalerweise 2 Minuten bei 72 °C. Das amplifizierte Fragment kann nun bei Bedarf zum Ligieren mit Vector zur weiteren Klonierung verwendet werden. Die taq-DNA-Polymerase bleibt während der Hochtemperatur-induzierten Denaturierung von doppelsträngiger DNA aktiv.

(e) Insertion rekombinanter DNA in den Wirt:
1. Elektroporation: Die Bakterienzelle wird in eine Lösung mit kaltem CaCl . gelegt2 Lösung, gefolgt von einer intermittierenden Lagerung bei 42 °C. Dies führt zur Bildung von Poren in der Zellmembran. Nun wandert das rekombinante Plasmid in die Wirtszelle und die Bakterienzelle wird transformiert.

2. Mikroinjektion: Es ist die direkte Injektion eines gewünschten Gens in den Zellkern einer tierischen Zelle durch eine Mikrospritze.

3. Biolistik: Hier wird eine geeignete Pflanzenzelle mit Hochgeschwindigkeits-Mikropartikeln (2-2 mm) aus Gold oder Wolfram, die mit DNA beschichtet sind, beschossen, um die DNA in die Zelle einzubringen.

(f) Erhalten des fremden Genprodukts:

  • Das Transgen exprimiert sich selbst in Form von Protein(en) unter geeigneten Bedingungen.
  • Das/die Produkt(e) kann/können durch Anwendung eines geeigneten Verfahrens aus dem Medium extrahiert werden.
  • Die transgenen Zellen können im Labor kultiviert werden, um das transgene Produkt in kleinem Maßstab zu erhalten.
  • Die transgenen Zellen können auch in einem kontinuierlichen Kultursystem kultiviert/vermehrt werden, bei dem das gebrauchte Medium von einer Seite abgelassen und von der anderen Seite frisches Medium zur Produktion größerer Biomasse und des gewünschten Produkts zugegeben wird.
  • Bioreaktoren werden verwendet, um große Kulturvolumina zu verarbeiten, um das interessierende Produkt in ausreichenden Mengen im kommerziellen Maßstab zu erhalten.

(g) Downstream Processing: Die in einem Bioreaktor gebildeten Produkte müssen einer Reihe von Prozessen unterzogen werden, bevor sie als Fertigprodukt vermarktet werden können.
Die verschiedenen Verfahren zur Gewinnung von Wertprodukten werden zusammenfassend als Downstream Processing bezeichnet. Die Prozesse umfassen die Trennung und Reinigung des Produkts, die Zugabe geeigneter Konservierungsstoffe und eine strenge Qualitätskontrolle usw. Solche Formulierungen müssen wie bei Arzneimitteln strengen klinischen Prüfungen unterzogen werden. Diese Qualitätskontrolltests und klinischen Studien variieren von Produkt zu Produkt.

Frage 2.
Erklären Sie mit Hilfe des Diagramms das Plasmid pBR322.
Antworten:

pBR-322 ist ein natürliches Plasmid und F + -Plasmid. Es ist etwa 4,3 kb groß. Es ist ein Plasmid mit einer ori-Stelle (Replikationsursprung), zwei Antibiotika-Resistenzstellen, selektierbaren Markern für Amphicillin-Resistenz (Ampr) und Tetracyclin-Resistenz (Tetr). Es hat dreizehn einzigartige Stätten in verschiedenen Regionen, von denen sieben wichtig sind. Eine einzigartige Stelle ist eine Erkennungsstelle für spezifische Restriktionsenzyme (REN), die ECORI genannt wird.

Vektoren zum Klonen von Genen in Pflanzen und Tieren sind Ti-Plasmid, das aus Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen isoliert wurde, und Retroviren werden nun nicht pathogen gemacht und werden verwendet, um das Gen in Tierzellen zu transportieren.

Hinweis: Insertionsinaktivierung: Wenn ein Gen oder eine rekombinante DNA in die kodierende Sequenz eines Vektors eingefügt wird, wird die kodierende Sequenz, die für ein Enzym oder ein bestimmtes Zeichen verantwortlich ist, inaktiviert. Dies wird als Insertionsinaktivierung bezeichnet.

Frage 3.
a) Was ist Gelelektrophorese? Erklären Sie, wie DNA-Fragmente mit dieser Technik getrennt und nachgewiesen werden.
b) Was sind Plasmide? Nennen Sie zwei beliebige Merkmale eines idealen Plasmids.
Antworten:
(a) Das Schneiden von DNA durch Restriktionsendonukleasen führt zu den DNA-Fragmenten. Diese Fragmente können durch eine als Gelelektrophorese bekannte Technik getrennt werden. Da DNA-Fragmente negativ geladene Moleküle sind, können sie getrennt werden, indem sie gezwungen werden, sich unter einem elektrischen Feld durch ein Medium/eine Matrix zur Anode zu bewegen.

Heutzutage ist die am häufigsten verwendete Matrix Agarose, ein natürliches Polymer, das aus Meeresalgen gewonnen wird. Durch den Siebeffekt des Agarosegels werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt (aufgelöst). Je kleiner also die Fragmentgröße ist, desto weiter bewegt es sich.

Die getrennten DNA-Fragmente können nur sichtbar gemacht werden, nachdem die DNA mit einer als Ethidiumbromid bekannten Verbindung gefärbt und anschließend UV-Strahlung ausgesetzt wurde (im sichtbaren Licht und ohne Färbung sind reine DNA-Fragmente nicht zu sehen). Sie können leuchtend orangefarbene DNA-Banden in einem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel sehen, das UV-Licht ausgesetzt wurde.

Die getrennten DNA-Banden werden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aus dem Gelstück extrahiert. Dieser Schritt wird als Elution bezeichnet. Die auf diese Weise gereinigten DNA-Fragmente werden zur Konstruktion rekombinanter DNA verwendet, indem sie mit Klonierungsvektoren verbunden werden.

(b) Die kleinen kreisförmigen und extrachromosomalen doppelsträngigen DNA-Moleküle, die im Zytoplasma von Bakterien vorhanden sind, werden als Plasmide bezeichnet. Sie zeigen Selbstreplikation. Sie enthalten 2 to. 8 Tausend Stickstoffbasenpaare. Sie enthalten auch einige Gene, wie antibiotikaresistente Gene und Gene zur Expression einiger Merkmale. Sie können mit Restriktionsenzymen an spezifischen Stellen geschnitten werden und gewünschte Gene können in diese Plasmide eingefügt werden.


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Entfernung von Ethidiumbromid und alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm mit dem Wizard® SV Gel- und PCR-Reinigungssystem

Ethidiumbromid und alkalische Phosphatase aus Kälberdarm wurden mit dem Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up System effektiv aus DNA-Proben entfernt. Ethidiumbromid hatte keinen Einfluss auf die Ausbeute.

Einführung

Viele gebräuchliche Laborreagenzien, wie alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) und Ethidiumbromid, können schädliche Auswirkungen auf nachgeschaltete DNA-Anwendungen haben oder potenzielle Gesundheitsgefahren darstellen. Das Enzym CIAP wird häufig verwendet, um Vektor-DNA-Fragmente zu dephosphorylieren, um eine Religation zu verhindern. Das Versäumnis, CIAP vor der Ligation zu entfernen, kann jedoch die Effizienz aufgrund der Entfernung der 5-Phosphatgruppe aus der Insert-DNA verringern. Da eine erfolgreiche Ligation erfordert, dass mindestens eines der DNA-Fragmente eine 5´ Phosphatgruppe besitzt, kann dephosphorylierte Insert-DNA nicht mehr an den dephosphorylierten Vektor ligieren und wird funktionell aus der Reaktion entfernt. Wie bei CIAP kann der DNA-Färbungsstoff Ethidiumbromid mit nachgeschalteten Anwendungen interferieren (1) . Ethidiumbromid ist ebenfalls ein bekanntes Mutagen und erfordert spezielle Handhabungs- und Entsorgungsverfahren. Diese Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob CIAP und Ethidiumbromid die DNA-Reinigung unter Verwendung des Wizard® SV Gel- und PCR-Reinigungssystems stören würden und ob diese Reagenzien effektiv entfernt wurden.

Methoden

Entfernung der alkalischen Phosphatase des Kälberdarms: Eine Einheit alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (Kat.-Nr. M1821) wurde zu 50 &mgr;l eines 500 bp-PCR-Produkts gegeben. Wiederholungsproben des PCR-Produkts mit oder ohne CIAP wurden unter Verwendung des Wizard® SV Gel- und PCR-Reinigungssystems oder durch Phenol/Chloroform-Extraktion gefolgt von Ethanolfällung gereinigt. Für das Wizard®-System wurde die DNA mit 50 &mgr;l Nuclease-Free Water (Kat.-Nr. P1193) eluiert. Für die Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wurde das DNA-Pellet in 50 &mgr;l nukleasefreiem Wasser resuspendiert. Das ungereinigte PCR-Produkt ohne CIAP, ungereinigtes PCR-Produkt mit CIAP oder gereinigte PCR-Produkte wurden dann in den pGEM®-T Easy Vector unter Verwendung des pGEM®-T Easy Vector Systems (Cat.# A1360) ligiert. Die Ligation von gereinigten PCR-Produkten wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt, wie in der Beschreibung beschrieben pGEM®-T Easy Vector System Technisches Handbuch #TM042. Chemisch kompetente JM109-Zellen wurden mit 2 µl der Ligationsreaktion transformiert und auf LB-Platten ausplattiert, die IPTG, X-gal und 125 µg/ml Ampicillin enthielten. Nach Wachstum über Nacht bei 37°C wurden die Kolonien gezählt. Hellblaue Kolonien wurden als weiße Kolonien gezählt, da bestimmt wurde, dass beide Typen Insert-DNA aufwiesen.

Entfernung von Ethidiumbromid: In einem separaten Experiment wurden 5 µl Ethidiumbromid (Kat.-Nr. H5041) und 20 µl Wasser zu 25 µl der 1-kb-DNA-Leiter (Kat.-Nr. G5711) gegeben. Zwei Replikate von jeweils 50 &mgr;m wurden mit dem Wizard ® SV Gel und PCR Clean-Up System wie in der Beschreibung beschrieben gereinigt Wizard ® SV Gel und PCR Clean-Up System Technisches Handbuch #TB308. Äquivalente Volumina der 1-kb-DNA-Leiter vor und nach der Reinigung wurden auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt und auf einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht. Fotografien wurden vor und nach der Ethidiumbromid-Färbung des Gels aufgenommen.

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, die entworfen wurden, um die Wirksamkeit der CIAP-Entfernung zu untersuchen. Gereinigte oder ungereinigte PCR-Produkte wurden in den pGEM®-T Easy Vector ligiert. Als Negativkontrolle wurde eine Ligation mit Vektor aber ohne PCR-Produkt durchgeführt, und die mit dem pGEM®-T Easy Vector System gelieferte Kontrollinsert-DNA wurde als Positivkontrolle für die Ligation verwendet. Die Zahl der weißen Kolonien, die Plasmid-DNA mit Insert darstellen, ist bei den ungereinigten PCR-Produkten im Vergleich zu denen bei gereinigten PCR-Produkten unabhängig von der Aufreinigungsmethode dramatisch geringer. Die Ligation von PCR-Produkten, die mit Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up gereinigt wurden, führte zu mehr Kolonien als die Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation, lieferte jedoch vergleichbare Ergebnisse für den Prozentsatz der Kolonien, die Insert enthalten. Ähnliche Ergebnisse wurden mit DNA erhalten, die unter Verwendung des Wizard® SV 96 PCR Clean-Up Systems (Kat.-Nr. A9340, Daten nicht gezeigt) gereinigt wurde.

Tabelle 1. Ligationsergebnisse von ungereinigten oder gereinigten PCR-Produkten.

Um die Ethidiumbromid-Entfernung zu überwachen, wurden gereinigte und ungereinigte 1-kb-DNA-Leiter auf einem Agarosegel vor und nach der Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Vor der Färbung sind auf dem Gel für die gereinigte 1-kb-DNA-Leiter keine DNA-Banden sichtbar, was auf die Entfernung des Ethidiumbromids hinweist (siehe Abbildung 1, Tafel A). Um das Vorhandensein von DNA zu bestätigen, wurde das Gel dann mit Ethidiumbromid gefärbt und erneut sichtbar gemacht. DNA-Fragmente sind deutlich sichtbar (siehe Abbildung 1, Tafel B). Die Färbeintensitäten sind für DNA-Proben vor und nach der Reinigung äquivalent, was auf eine effiziente DNA-Gewinnung aus Ethidiumbromid-haltigen Lösungen hinweist.

Abbildung 1. Gelbild gereinigter und ungereinigter PCR-Produkte.

Ethidiumbromid wurde der 1-kb-DNA-Leiter zugesetzt, die dann mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System gereinigt wurde. Platte A. Äquivalente Volumina von ungereinigter Leiter (–) und gereinigter Leiter (+) wurden in jede Spur geladen. Das Gel wurde vor der Ethidiumbromid-Färbung mit einer Belichtungszeit von 5 Sekunden fotografiert. Tafel B. Das in Tafel A gezeigte Agarosegel wurde dann mit Ethidiumbromid gefärbt und mit einer Belichtungszeit von 1/8 Sekunde fotografiert.

Abschluss

Das Wizard® SV Gel- und PCR-Reinigungssystem entfernt effektiv sowohl die alkalische Phosphatase des Kälberdarms als auch das Ethidiumbromid aus DNA-Lösungen. Mit diesem System gereinigte DNA ergab eine vergleichbare Ligationseffizienz wie DNA, die durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt wurde. Das Wizard® SV Gel- und PCR-Reinigungssystem erfordert im Gegensatz zur Phenol-/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung keine gefährlichen Chemikalien.


DNA-Relaxations- und Spaltungsassays zur Untersuchung von Topoisomerase-I-Inhibitoren

Die Geschichte des Topoisomerase I-Enzyms ist eng mit der des Pflanzenalkaloids Camptothecin (CPT) verwoben. Dieses Antitumor-Medikament trug wesentlich zur Aufklärung der DNA-spaltenden Eigenschaften des Enzyms und eines Großteils seiner Biochemie bei. Die Identifizierung spezifischer Inhibitoren basiert im Wesentlichen auf ihrer Fähigkeit, diesen kovalenten Komplex zu stabilisieren. In Abwesenheit eines Inhibitors ist der kovalente Komplex hoch labil und dissoziiert frei, um das aktive Enzym und das religierte DNA-Molekül mit intakten Doppelsträngen zu regenerieren. Dieser katalytische Zyklus ist für die Linderung des DNA-Torsionsstresses bei allen Manipulationen der DNA in Zellen, einschließlich der Replikation und Transkription, unerlässlich. Mehrere experimentelle Ansätze wurden verwendet, um diese Inhibitoren zu identifizieren und ihren Wirkungsmechanismus zu charakterisieren. In den meisten Fällen wurden In-vitro-Assays unter Verwendung von gereinigter Topoisomerase I und einem radioaktiv markierten DNA-Substrat verwendet, um die vergiftende Wirkung dieser Medikamente nachzuweisen. Dieses Kapitel konzentriert sich auf zwei häufig verwendete experimentelle Ansätze zur Charakterisierung von Topoisomerase-I-Inhibitoren. Diese Verfahren werden hauptsächlich mit Beispielen aus unserer eigenen Arbeit zu Topoisomerase I-gerichteten Arzneimitteln veranschaulicht.


Wie schlecht ist Ethidiumbromid in Ihrem Plasmid für nachgelagerte Anwendungen? - Biologie

Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode zur Trennung und Analyse von DNA-Fragmenten. Dieses Verfahren kann noch einen Schritt weiter gehen, die Fragmente können aus dem Gel zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt werden. Hochwertige DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (70 bp 10 kb) können mit dem Perfectprep Gel Cleanup Kit von Eppendorf mit Wiederfindungsraten von bis zu 96 % aus Agarosegelen gereinigt werden. Es ist wichtig, dass die isolierte DNA von hoher Qualität ist, da die meisten Anwendungen empfindlich auf Inhibitoren reagieren. Das Klonen ist eine übliche nachgeschaltete Anwendung, bei der ein gelgereinigtes DNA-Fragment verwendet werden kann, und ein erfolgreiches Klonen ist ein guter Hinweis auf die Reinheit des Fragments. Diese Anmeldung demonstriert die Verwendung von gelgereinigter DNA in einer glatten Endligation.

Ein 3,49-kb-PCR-Fragment von Lambda-DNA wurde mit EcoRV verdaut, um ein 1,68-kb-DNA-Fragment mit glatten Enden herzustellen. Der Klonierungsvektor pUC19 wurde mit SmaI verdaut, was zu einem linearisierten Vektor mit glatten Enden führte. Nach Verdau der DNA und Auftrennung auf einem Agarosegel wurde das Perfectprep Gel Cleanup Kit verwendet, um das Fragment und den linearisierten Vektor zu reinigen. Diese wurden anschließend als Insert und Vektor in Klonierungsreaktionen mit glatten Enden verwendet, die dreifach durchgeführt wurden. Aufgrund der Salzempfindlichkeit ist das Klonen mit stumpfen Enden schwieriger, und dieses Schema ist ein strenger Test der Klonierungsfähigkeit von gelgereinigten DNA-Fragmenten.

pUC19 enthält das lacZ-Gen, das ein Blau/Weiß-Kolonie-Screening als anfängliches Maß für den Klonierungserfolg ermöglicht. Weiße Kolonien zeigen an, dass das lacZ-Gen zerstört wurde und die Klonierung erfolgreich war. Basierend auf der Anzahl der in diesem Experiment produzierten weißen Kolonien erwies sich die Klonierung mit DNA, die mit dem Eppendorf-Kit gereinigt wurde, als sehr effizient. Nachfolgende Restriktionsverdaus von Plasmid-DNA, die aus weißen Kolonien isoliert wurde, bestätigten, dass die Kolonien tatsächlich das korrekt ligierte Insert und den Vektor enthielten (Daten nicht gezeigt). Dies weist darauf hin, dass DNA, die aus Agarosegelen unter Verwendung von erhalten wurde, in sensitiven Klonierungsexperimenten verwendet werden kann.

Perfectprep Gel-Reinigungskit (Eppendorf)
Eppendorf PCR-Reagenzien
Taq DNA-Polymerase

Ein 3,49-kb-Fragment von Lambda-DNA wurde unter Verwendung der folgenden PCR-Komponenten amplifiziert. Die Zahlen in Klammern repräsentieren die Endkonzentration oder Menge der Komponente in jeder Reaktion.

10x Taq DNA-Polymerase-Puffer (1x)
25 mM MgCl2 (0,5 mm)
10 mM dNTP-Mix (0,2 mM)
Taq-DNA-Polymerase (0,05 U/l)
Template-DNA (50 ng)

Primer: 10 M JMF1 5-AAA-AAC-GTC-CGA-GAC-GAA-TG-3 (0,1 M) 10 M JMrev3.6 5-TCA-GCA-TCT-AGC-ATG-CAA-CC-3 (0,1 M) (Integrated DNA Technologies) Die Lambda-DNA wurde mit einem Eppendorf Mastercycler-Gradienten unter folgenden Zyklenbedingungen amplifiziert:

35 Zyklen:
94C für 45 Sekunden
70 °C für 20 Sekunden
72C für 2 Minuten

72 °C für 5 Minuten
10C für immer halten

20 ml des 3,49 kb PCR-Produkts wurden bei 37 °C für zwei Stunden mit 20 Einheiten EcoRV in einer 30-l-Reaktion inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 l 10x Gel Loading Buffer gestoppt und dann auf ein Gel geladen. Mehrere dieser Reaktionen wurden durchgeführt, um genügend Insert-DNA für die Klonierung zu erhalten.

10 g des Vektors pUC19 wurden mit 40 Einheiten SmaI in einer 40-l-Reaktion zwei Stunden bei 25°C linearisiert.

Das gesamte Reaktionsvolumen (30 l) jedes der EcoRV-Restriktionsverdaus wurde auf einem 100 ml 0,8% SeaKem LE-Agarose-Gel, das 2 l 10 mg/ml Ethidiumbromid enthielt, laufen gelassen. Das Gel wurde in 1x TBE bei 120 V zwei Stunden lang laufen gelassen.

Eine Hälfte des linearisierten Vektors (20 l) wurde auf einem 100 ml 0,8% SeaKem LE-Agarose-Gel, das 2 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid enthielt, laufen gelassen. Das Gel wurde in 1x TBE bei 120 V 1,5 Stunden lang laufen gelassen.

Die EcoRV-Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung des . Alle Proben wurden in 30 l eluiert, wie im Herstellerprotokoll beschrieben. DNA-Konzentrationen wurden durch A260-Messungen bestimmt.

Die linearisierte Vektor-DNA-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem Eppendorf Gel Cleanup Kit gereinigt und in 30 l eluiert. Die DNA-Konzentration wurde durch A260-Ablesungen bestimmt.

Behandlung mit alkalischer Phosphatase von Garnelen:

Der linearisierte Vektor wurde mit SAP behandelt, um eine erneute Ligation der Vektorenden zu verhindern. 3 l der Vektor-DNA-Probe wurden bei 37 °C für eine Stunde mit zwei Einheiten SAP, 1x SAP-Reaktionspuffer und Wasser in Molekularbiologie-Qualität in einer 30-l-Reaktion, wie im Protokoll des Herstellers beschrieben, inkubiert. Das Enzym wurde dann durch Inkubieren der Reaktion bei 65°C für 15 Minuten inaktiviert.

Die Ligationsreaktionen wurden basierend auf einem Molverhältnis von Insert zu Vektor von 3:1 durchgeführt. Dieses Verhältnis basiert auf der folgenden Gleichung:

(Länge des Inserts) (ng des verdauten Plasmids) = ng Insert zur Verwendung bei der Ligationslänge des Plasmids 1:1 Molverhältnis = ng Insert : ng Plasmid
3:1 Molverhältnis = 3 (ng Insert) : 1 (ng Plasmid)

Drei Reaktionen wurden unter Verwendung von Insert- und Vektor-DNA durchgeführt, die mit dem Eppendorf Gel Cleanup Kit gereinigt wurde. 25-l-Reaktionen, die 800 kohäsive Endeinheiten (etwa 6 Weiss-Einheiten) von T4-DNA-Ligase und 5% PEG 8000 enthielten, wurden über Nacht (15 Stunden) bei 14 °C inkubiert. Anschließend wurde die Ligase durch 15-minütiges Inkubieren der Proben bei 65°C inaktiviert.

2 l jeder Ligationsreaktion wurden zu 50 l der TOP 10 kompetenten Zellen gegeben und vorsichtig gemischt. Diese Zellen wurden dreißig Minuten auf Eis gehalten und dann genau dreißig Sekunden bei 42ºC inkubiert und wieder auf Eis gelegt. 250 l SOD-Medium wurden zu jedem Fläschchen mit Zellen zugegeben und die Fläschchen wurden dann eine Stunde lang bei 37 °C bei 225 U/min horizontal inkubiert.

10 l und 30 l jeder Transformation wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 40 l 40 mg/ml X-Gal und 100 g/ml Ampicillin enthielten. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert und morgens auf weiße Kolonien überprüft.

Abb. 1: Blau-Weiß-Screening von Kolonien, die durch Klonieren eines 1,68 kb langen Lambda-DNA-Fragments mit glatten Enden in pUC19 hergestellt wurden. 10 l transformierter kompetenter Zellen wurden ausplattiert. Das Insert und der Vektor in dieser Ligation wurden aus Agarose unter Verwendung des . Die Mehrheit der Kolonien auf dieser Platte ist weiß, ein vorläufiger Hinweis darauf, dass die Vektoren in diesen Kolonien das Insert enthalten. Diskussion

Insert- und Vektor-DNA, die mit dem Eppendorf Perfectprep Gel Cleanup Kit isoliert wurde, kann bei der Blunt-End-Klonierung verwendet werden, einer schwierigen Klonierungsstrategie. In diesem Experiment führten alle drei Versuche zu einem hohen Prozentsatz weißer Kolonien, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit der Kolonien das rekombinante Plasmid enthält. Plasmid-DNA von vier dieser Kolonien wurde unter Verwendung des Eppendorf Perfectprep Plasmid Min i Kit gereinigt, und nachfolgende Restriktionsverdauungen dieser DNA bestätigten, dass alle vier Kolonien das Plasmid mit dem richtigen Insert enthielten (Daten nicht gezeigt). Die mit dem Eppendorf Gel Cleanup Kit gereinigte DNA hat sich in einem sensiblen Klonierungsverfahren gut bewährt, und es wird davon ausgegangen, dass die Leistung bei weniger schwierigen Klonierungen, wie z. B. bei denen mit kohäsiven Enden, noch besser ist.

  1. Die Verwendung des Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahrens zur Amplifikation von Nukleinsäuren ist durch die US-Patente Nr. 4683105 und 4683202 im Besitz von Roche Molecular abgedeckt und erfordert eine Lizenz.

Quelle:


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Bakterielles Lipopolysaccharid wird zusammen mit Plasmid-DNA gereinigt: Implikationen für Tiermodelle und die menschliche Gentherapie

Im Rahmen von Gentherapie-Experimenten an Nagetieren wurden intramuskuläre Injektionen von Plasmid-DNA aus Escherichia coli, stellten wir eine dosisabhängige Toxizität fest. Diese Beobachtung veranlasste eine Suche nach möglichen Kontaminanten von DNA-Proben. Wir verwendeten den hochspezifischen und sensitiven Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assay (LAL), um die Bioaktivität von Endotoxinen in DNA-Proben zu überwachen, und fanden Plasmid-DNA, die von Standard- E coli Bakterienstämme unter Verwendung traditioneller DNA-Isolierungsprotokolle stark mit Endotoxin oder Lipopolysaccharid (LPA) kontaminiert werden. Standard-DNA-Isolierungsverfahren führen zur gemeinsamen Reinigung von bis zu 500 µg/ml LPS. LPS ist ein starker Induktor von Zytokinen und anderen Entzündungsmediatoren und kann die Verwendung von nackter DNA in der Gentherapie erschweren. Die gemeinsame Reinigung von Endotoxin mit Plasmid-DNA hat auch wichtige Auswirkungen auf in vitro Transfektionsstudien und Mikroinjektion von DNA in Embryonen. Ein einfaches und effizientes Protokoll zur Reduzierung der LPS-Kontamination von Plasmid-DNA wurde entwickelt. Die Umwandlung intakter Bakterien in Sphäroplasten vor der Isolierung von Plasmid-DNA, Inkubation mit Lysozym, Behandlung mit dem Detergens n-Octyl-β-d-Thioglucopyranosid (OSPG) und Polymyxin-B (PMB) Chromatographie ermöglichte die Isolierung von Plasmid-DNA, die weniger als 50 ng/ml LPS enthielt. Dies stellt eine 10.000-fache Reduzierung der LPS-Kontamination im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA dar, vermeidet potenziell toxische Reagenzien wie Ethidiumbromid und erzeugt eine höhere Ausbeute an Plasmid-DNA.

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Methode zur Probenvorbereitung für Nukleinsäuren

DNA und RNA sind Nukleinsäuremoleküle, die verwendet werden, um genetische Informationen innerhalb einer Zelle zu speichern und zu übertragen. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie besagt, dass DNA in RNA transkribiert wird, die dann in Protein übersetzt wird. Dies ist zwar ein vereinfachter Blick auf die Gen- und Proteinexpression, zeigt aber, dass DNA und RNA wichtige Informationen über Genomik, Genexpression und zelluläre Regulation für eine interessierende Probe liefern können. Um DNA- und RNA-Analysen durchzuführen, ist es oft notwendig, diese Moleküle zunächst aus Zellen oder Geweben zu extrahieren.

Zentrales Dogma der Molekularbiologie.

Es gibt mehrere gut etablierte Verfahren zum Extrahieren, Reinigen und Konzentrieren von Nukleinsäuren. Die Auswahl des am besten geeigneten Nukleinsäure-Isolierungsverfahrens hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich des Ausgangsprobenmaterials, der Menge, Größe und Stabilität der Zielnukleinsäure und der nachgeschalteten Anwendung für die interessierende Nukleinsäure. Nach dem Reinigungsschritt ist es oft notwendig, die Nukleinsäurekonzentration, Reinheit und Integrität zu bestimmen, bevor mit nachgeschalteten Anwendungen fortgefahren wird.

Gängige Methoden zur Probenvorbereitung für Nukleinsäuren

Cäsiumchlorid-Gradienten Filtersäulenreinigung Gelextraktion Guadinidiumisothiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion - Ethanolfällung Ionenaustauscherharz Phenol-Chloroform-Extraktion - Ethanol-Fällung Größenausschluss
Empfohlen für Plasmid-DNA DNA und RNA > 200bp DNA RNA DNA RNA DNA und RNA
Vorteile Hochreine DNA Schnell und einfach Schnell und einfach Skalierbar nach Volumen: hochreine RNA Skalierbar nach Volumen Skalierbar nach Volumen: hochreine RNA Schnell und einfach
Nachteile Erfordert teure Instrumente und die Entfernung von Ethidiumbromid und Cäsiumchlorid aus isoliertem Plasmid Kann Moleküle <200 bp . nicht wiedergewinnen Eine Agarose-Kontamination mit potenziell geringer Ausbeute kann nachgeschaltete Reaktionen hemmen Phenol ist gefährlich Harzreste können Folgereaktionen hemmen Phenol ist gefährlich Potenziell niedrige Ausbeute, unvollkommene Größentrennung


DNA-Isolierung

DNA-Filtrationssäule
Die Filtersäulenreinigung kann verwendet werden, um DNA aus Säugerzellkulturen, Bakterien und Hefe sowie Pflanzen- und Tiergewebe zu reinigen. Durch Einstellen des pH-Werts und des Salzes der Lösung kann die interessierende DNA von Zelltrümmern oder anderen unerwünschten Verunreinigungen getrennt werden, indem die DNA an eine Silikamembran gebunden wird, die sich am Boden einer Filtersäule befindet. Dies ist eine beliebte Methode zur Reinigung von genomischer und Plasmid-DNA. Vakuum- und Zentrifugationsprotokolle sind verfügbar. Nachdem die DNA an die Membran gebunden ist, wird sie einem Waschgang mit niedriger und hoher Stringenz unterzogen, um Verunreinigungen wie RNA, Proteine ​​und Lipide zu entfernen. Die gereinigte DNA wird mit einem Elutionspuffer von der Membran in ein Sammelröhrchen eluiert. Das Volumen des verwendeten Elutionspuffers kann in Abhängigkeit von der gewünschten Endkonzentration an Plasmid oder DNA variiert werden. Wiedergewonnene DNA ist für die Verwendung mit PCR und Southern-Blot-Analyse geeignet.

Traditionell wurden Cäsiumchlorid-Gradienten verwendet, um Plasmid-DNA von genomischer DNA zu reinigen. Obwohl dieses Verfahren hochreine DNA liefert, ist es zeitaufwendig und erfordert die Entfernung von Ethidiumbromid und Cäsiumchlorid aus dem gewonnenen Plasmid. Plasmid-Reinigungskits bieten ein schnelleres und effizienteres Mittel zur Reinigung und Konzentration von DNA > 200 Basenpaaren. DNA wird auf der Silica-basierten Membran adsorbiert und RNA, Protein und andere zelluläre Komponenten werden weggewaschen. Die gereinigte DNA wird dann unter Verwendung von Elutionspuffer eluiert und in einer Form gewonnen, die sofort für die Fluoreszenzsequenzierung, Zelltransfektion, Elektroporation und enzymatische Restriktion und Modifikation verfügbar ist. Plasmid-Reinigungskits sind von Bio-Rad für eine Vielzahl von Ausgangsprobentypen erhältlich.

Auswahlleitfaden für die Plasmid-DNA-Aufreinigung

Bausatz DNA
Ertrag
Vorbereitung
Zeit
Bakterienkultur
Dichte oder Volumen
Reinigung
Format
Bindung
Matrix
Wachstum
Medien
Aurum&trade Plasmid mini >20 &becher 10 Minuten Bis zu 12 OD
&Stier ml*
Vakuum**
und spinnen
Kieselsäure
Membran
Standard
Quantum Prep ® Miniprep >20 &becher 15 Minuten 1&ndash10 ml Drehen Kieselgur
Erde
Angereichert
oder Standard

* (OD600 der unverdünnten Kultur) x (Kulturvolumen in ml) = #von OD & Bull ml. 1 OD600 entspricht ungefähr 8 x 10 8 Zellen/ml.
** Verwendung des Aurum-Vakuumverteilers.

Ionenaustauscherharz
Als Alternative zur Filtersäulenreinigung oder Phenol/Chloroform-Extraktion kann ein gepuffertes Ionenaustauscherharz zur Entfernung von PCR-Verunreinigungen aus Blut, kultivierten Zellen und Bakterien verwendet werden. InstaGene&trade Matrix ist ein Chelex-Harz, das vor der PCR-Amplifikation PCR-Inhibitoren aus einer Probe entfernt. Ein einzelner Zelllyseschritt durch Kochen in Gegenwart der Matrix ist ausreichend. Dies ist möglich, da die Matrix Zelllyseprodukte effizient absorbiert, die den PCR-Amplifikationsprozess stören. Anschließend kann die Matrix durch Zentrifugation auspelliert und der Überstand für die nachgeschaltete PCR-Amplifikation verwendet werden.

Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung
Eine traditionelle DNA-Reinigungsmethode, die verwendet werden kann, um hochreine DNA zu erhalten, ist die Phenol/Chloroform-Extraktion gefolgt von einer Ethanolfällung. Dieses Verfahren ist für die Extraktion von DNA aus tierischen und pflanzlichen Geweben, kultivierten Säugerzellen, Bakterien und Hefezellen in weniger als einer Stunde vorgesehen. Die wässrige Nukleinsäureprobe wird mit einem gleichen Volumen einer Phenol:Chloroform-Mischung kombiniert. Phenol dissoziiert an DNA gebundene Proteine, während Chloroform Proteine ​​und Lipide denaturiert. Es bilden sich drei unterschiedliche Phasen: die wässrige Phase, die Zwischenphase und die organische Phase. Von diesen enthält die wässrige Phase die DNA, während die Proteine ​​und Lipide in den anderen beiden Phasen verbleiben. Die wässrige Phase kann dann mit Ethanol behandelt werden, um die DNA auszufällen. Die präzipitierte DNA kann dann durch Zentrifugation pelletiert und in einem Puffer der Wahl zur Verwendung in nachgeschalteten Reaktionen gelöst werden. DNA, die unter Verwendung des Phenol/Chloroform-Extraktions- und Ethanolpräzipitationsverfahrens gereinigt wurde, ist typischerweise reiner als DNA, die durch Filtersäulenreinigung gewonnen wurde. Die gewonnene DNA ist zur Verwendung in der PCR und Southern-Blot-Analyse geeignet.


Kerala Plus Two Botany Chapter Wise Questions and Answers Chapter 4 Biotechnology Principles and Processes

Plus zwei Botanik-Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse One Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
In der Gentechnik verwendete Ti-Plasmide werden erhalten aus
(a) Bacillus thuringiensis
(b) Agrobacterium tumefaciens
(c) Pseudomonas tumefaciens
(d) Bacillus subtilis
Antworten:
(b) Agrobacterium tumefaciens

Frage 2.
Welche gilt als molekulare Schere in der Biotechnologie?
(a) Reverse Transkriptase
(b) Restriktionsendonuklease
(c) Taq-Polymerase
(d) Topoisomerase
Antworten:
(b) Restriktionsendonuklease

Frage 3.
Benennen Sie den Farbstoff, der verwendet wird, um DNA-Banden in der Gelelektrophorese zu identifizieren
Antworten:
Ethidiumbromid

Frage 4.
Bei der rDNA-Technologie werden die Alein-DNA und der Klonierungsvektor durch das gleiche Restriktionsendonuklease-Enzym geschnitten. Einen Grund geben.
Antworten:
Das gleiche Restriktionsenzym muss verwendet werden, um die fremde und fremde DNA zu schneiden, wobei die klebrigen Enden vergessen werden.

Frage 5.
Nennen Sie die gebräuchlichste Technik, die verwendet wird, um DNA in Pflanzen zu übertragen.
Antworten:
Biolistik oder Genkanone

Frage 6.
Das Plasmid von Agrobacterium ist
(a) Ti-Plasmid
(b) F1-Plasmid
(c) T-Plasmid
(d) Spalte E1
Antworten:
(a)Ti-Plasmid

Frage 7.
Welche der folgenden ist keine Restriktionsendonuklease?
(a) EcoRI
(b) Hind III
(c) pst I
(d) DNAse I
Antworten:
(d) DNAse I

Frage 8.
Die gewünschte DNA kann durch eine wichtige Technik auf 1 Milliarde Kopien amplifiziert werden. Nennen Sie es.
Antworten:
Polymerace-Kettenreaktion

Frage 9.
Restriktion im Restriktionsenzym bezieht sich auf:
(a) Spaltung der Phosphodiesterbindung in DNA durch das Enzym
(b) Schneiden von DNA nur an einer bestimmten Position
(c) Verhinderung der Vermehrung von Bakteriophagen in Bakterien
(d. Alles das oben Genannte
Antworten:
(c) Verhinderung der Vermehrung von Bakteriophagen in Bakterien

Frage 10.
Bei der PCR-Technik fügen Nukleotide mit Hilfe des Polymerace-Enzyms nacheinander an den Matrizenstrang an. Von welchem ​​Organismus es isoliert ist.
Antworten:
Thermus aquaticus

Frage 11.
Ein rekombinantes DNA-Molekül kann in Abwesenheit von Folgendem hergestellt werden:
(a) Restriktionsendonuklease
(b) DNA-Ligase
(c) DNA-Fragmente
(d) E. coli
Antworten:
(d) E. coli

Frage 12.
Bei der Agarosegelelektrophorese werden DNA-Moleküle auf der Grundlage ihrer:
(a) Nur aufladen
(b) Nur Größe
(c) Verhältnis von Ladung zu Größe
(d. Alles das oben Genannte
Antworten:
(b) Nur Größe

Frage 13.
Welches der folgenden Bakterium ist keine Quelle für Restriktionsendonuklease?
(a) Haemophilus influenzae
(b) Esherichia coli
(c) Agrobacterium tumefaciens
(d) Bacillius amyloli
Antworten:
(a) Haemophilus influenzae

Frage 14.
Welche der folgenden Schritte werden in einer PCR-Reaktion durch die Taq-Polymerase katalysiert?
(a) Denaturierung der Template-DNA
(b) Annealing von Primern an Template-DNA
(c) Verlängerung des Primerendes auf der Template-DNA
(d. Alles das oben Genannte.
Antworten:
(c) Verlängerung des Primerendes auf der Template-DNA

Frage 15.
Ein Enzym, das die Entfernung von Nukleotiden von den Enden der DNA katalysiert, ist:
(a) Endonuklease
(b) Exonuklease
(c) DNA-Ligase
(d) Hind-ll
Antworten:
(b) Exonuklease

Frage 16.
Polymerase-Kettenreaktion hilft bei
(a) DNA-Synthese
(b) DNA-Amplifikation
(c) Proteinsynthese
(d) Aminosäuresynthese
Antworten:
DNA-Synthese

Frage 17.
Ausgehend von doppelsträngiger DNA schlagen Sie eine Strategie vor, um große Mengen an reiner einzelsträngiger DNA für Sequenzierungszwecke zu erhalten.
Antworten:
PCR (POLYMERASE-KETTENREAKTION)

Frage 18.
Das Schneiden von DNA an bestimmten Stellen wurde durch die Entdeckung von Ensymen möglich, die als „molekulare Schere“ bezeichnet werden. Identifizieren Sie dieses Enzym.
Antworten:
Restriktionsenzyme/Restriktionsendonukleasen

Frage 19.
Welche der folgenden ist die erste entdeckte Restriktionsendonuklease?
(a) Hindi I
(b) Hindi II
(c) EcoR I
(d) EcoR II
Antworten:
(b) Hinde II

Frage 20.
Beachten Sie die folgende Abbildung und ermitteln Sie die Enzyme, die mit A und B bezeichnet werden.
Antworten:

Frage 21.
Schreiben Sie die Technik zur Trennung von DNA-Fragmenten auf.
Antworten:
Gelelektrophorese

Frage 22.
Letzter Schritt der Gelelektrophorese von DNA-Molekülen aus dem Gel. Wie heißt dieser Vorgang?
Antworten:
Elution

Frage 23.
Eine der angegebenen Optionen bezieht sich nicht auf die PCR. Finde es.
(a) Denaturierung
(b) Spulen
(c) Verlängerung
(d) Glühen
Antworten:
Spulen

Frage 24.
Welche der folgenden Methoden ist keine Gentransfermethode?
(a) Mikroinjektion
(b) Entwaffnete Krankheitserregervektoren
(c) Genwaffe
(d) Elution
Antworten:
(d) Elution

Frage 25.
Der für den Gentransfer in Pflanzen geeignete Klonierungsvektor ist
(a) Ti-Plasmid
(b) Bakteriophagen
(c) Viren
(d) Transposons
Antworten:
(a) Ti-Plasmid

Frage 26.
Welche unter den folgenden sind die selektierbaren Marker von PBR-322.
(a) amp R , kan R
(b) tet R , kan R
(c) ampR, tetR
(d) chl R , tet R
Antworten:
ampR, tetR

Frage 27.
Restriktionsendonukleasen schneiden DNA an bestimmten Stellen, indem sie_______
(a) Zucker-Phosphat-Bindungen
(b) Zucker-Stickstoff-Basisbindungen
(c) Wasserstoffbrücken
(d) Disulfidbindungen
Antworten:
Zucker-Phosphat-Bindung

Frage 28.
Downstream Processing ist der letzte Schritt im Prozess der rekombinanten DNA-Technologie. Was verstehen Sie unter „Downstream-Processing“?
Antworten:
Trennung und Reinigung des Genprodukts.

Frage 29.
Ti-Plasmid ist ein geeigneter Klonierungsvektor für Pflanzen. Es ist das Plasmid eines Bakteriums namens _______.
Antworten:
Agrobacterium tumifaziens.

Plus Two Botanik Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Zwei Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Die Elution ist ein wichtiger Schritt der Elektrophorese.

  1. Getrennte DNA-Banden werden aus Agarosegelstücken ausgeschnitten und extrahiert.
  2. Unter UV-Licht werden DNA-Banden als orange Farbe beobachtet.

Frage 2.
Gentechnik ist die Genmanipulationstechnik, die hilft, einen neuen Organismus mit der gewünschten genetischen Ausstattung zu schaffen

  1. Nennen Sie den Beitrag von Stanley Cohen und Herbert Boyer zur Gentechnik.
  2. Nennen Sie das Enzym, das verwendet wird, um den DNA-Strang zu schneiden?
  1. Herbert Boyer und Stanley Cohen konstruierten 1972 die erste rekombinante DNA, indem sie ein Gen, das für Antibiotikaresistenz kodiert, mit einem nativen Plasmid von Salmonella typhimurium verknüpften.
  2. Restriktionsendonuklease

Frage 3.
Mücken gelten als Vektoren, die den Malariaparasiten in den menschlichen Körper übertragen. Plasmide gelten in der Biotechnologie als Vektoren. Rechtfertigen.
Antworten:
Vektoren sind Mittel, die Materialien von einem Organismus auf einen anderen übertragen. Plasmide sind zusätzliche chromosomale DNA, die in Bakterien zu sehen ist und die die Fähigkeit zur unabhängigen Replikation besitzt.

Im Bereich der Biotechnologie werden Plasmide als Vektoren verwendet, da sie sich nach Integration einer fremden DNA schnell replizieren. Somit kann das fremde Gen durch das Plasmid in einen anderen Organismus eingeführt werden.

Frage 4.
Eco R I ist das aus E. coli-Bakterien gewonnene Restriktionsendonuklease-Enzym, das ihnen hilft, das Viruswachstum einzuschränken. Was sind die Kriterien für die Benennung von Endonukleasen?
Antworten:
EcoRI kommt vom Namen des Bakteriums Escherechia coli Ry 13. E steht für die Gattung, co steht für die Spezies, „R“ leitet sich vom Namen des Stammes ab und I ist die Reihenfolge, in der das Enzym isoliert wird.

Frage 5.
Die Trennung und Isolierung von DNA-Fragmenten kann durch eine als Gelelektrophorese bekannte Technik erfolgen

  1. Was ist das Verfahren verwendet getrennte DNA-Fragmente?
  2. Benennen Sie den Organismus, aus dem Agarosegel isoliert wird

Antworten:
1. Negativ veränderte DNA-Fragmente werden getrennt, indem sie gezwungen werden, sich unter einem elektrischen Feld durch eine Agarose-Matrix zur Anode zu bewegen.

Die DNA-Fragmente werden nach ihrer Größe im Agarosegel getrennt. Je kleiner die Fragmentgröße ist, bewegt sich also weiter. Dann wird es durch Elution aus dem Agarosegel ausgeschnitten.

Frage 6.
PCR ist zum Herstellen von Mehrfachkopien des interessierenden Gens gedacht.

  1. Geben Sie den Hauptschritt der PCR an.
  2. Nennen Sie das thermostabile DNA-Polymerase-Enzym, das bei dieser Technik verwendet wird. Wieso den?

Antworten:
1. Der wichtigste Schritt bei der PCR:

  • Denaturierung – Es beinhaltet die Trennung von DNA-Strängen
  • Annealing – Die Doppelstränge werden aus freien Nukleotiden durch die Wirkung der DNA-Polymerase synthetisiert.
  • Extension – Die Länge der Stränge wird durch die Zugabe von immer mehr Nukleotiden erhöht. So amplifizierte DNA bis zu 1 Milliarde Kopien.

2. Taq-Polymarase
PCR-Zylinder arbeitet bei hoher Temperatur. Daher wird thermostabiles Enzym verwendet.

Frage 7.
Bei der r DNA-Technologie wird rekombinante DNA direkt in die Pflanzenzelle injiziert

  1. Biolispics oder Gene Gun.
  2. Dazu werden sie mit Calciumionen behandelt und die Zellen und rekombinante DNA auf Eis inkubiert und anschließend bei 42 °C gelagert. Dann legen Sie sie wieder auf Eis. Dies hilft den Bakterien, die rekombinante DNA aufzunehmen.

Frage 8.
Bei Verwendung von RNA werden Protease, Cellulase etc. bei der Isolierung von genetischem Material nicht verwendet.

  1. Finden Sie heraus, welche Schwierigkeiten während des Prozesses der rDNA-Technologie auftreten.
  2. Was ist Spulen?
  1. Wenn die oben genannten Enzyme nicht verwendet werden, ist es schwierig, DNA für die Isolierung von Fremdgenen in reiner Form zu erhalten.
  2. Feiner DNA-Faden aus gekühltem Alkohol abgetrennt.

Frage 9.
Wie unterscheidet sich die Wirkung der Exonuklease von der der Endonuklease?
Antworten:
Exonuklease entfernt die Nukleotide von den Enden von DNA-Molekülen, während Endonuklease an einer bestimmten Position innerhalb eines DNA-Moleküls geschnitten wird.

Frage 10.
Spooling ist eine der wichtigsten Methoden, die in der r-DNA-Technologie verwendet werden.

  1. Nennen Sie das Medium, in dem die DNA als feine Fäden erscheint.
  2. Was ist das Ziel der Verwendung von Lysozym zur Isolierung von genetischem Material?

Frage 11.
Sticky Ends sind ungepaarte DNA-Stränge, die durch die Verwendung von Restriktionsendonuklease-Enzym erhalten werden.
Stimmst du zu?.Gib einen Grund an
Antworten:
Jawohl. Das gleiche Restriktionsenzym wird verwendet, um sowohl Vektor-DNA als auch Fremd-DNA zu schneiden, um klebrige Enden zu erhalten, die die Wirkung der DNA-Ligase erleichtern.

Frage 12.
Im Biotechnologie-Labor interessierte sich Ramu für die Konstruktion von r-DNA, dafür verwendete er Werkzeuge der r-DNA-Technologie.

  1. Was passiert, wenn das DNA-Polymerase-Enzym nicht verwendet wird?
  2. Nennen Sie die DNA-Sequenz, die der Wirkung des Restriktionsenzyms ausgesetzt ist

Frage 13.
3′ Ende des Template-Strangs ist sehr wichtig bei der Polymerase-Kettenreaktion

  1. Benennen Sie den komplementären Strang, der die Matrizensequenz des 3′ Endes anhängt
  2. Finden Sie heraus, welche Art von Nukleotiden in dieser Technik bereitgestellt werden

Frage 14.
Bei der r DNA-Technologie wird rekombinante DNA direkt in die Pflanzenzelle injiziert

2. Methoden zum Gentransfer:

A. Das Bakterium wird mit einem zweiwertigen Kation wie Calcium behandelt, das die Bakterienzelle kompetent macht, DNA aufzunehmen (die Poren der Bakterienzelle werden erweitert).

Die rekombinante DNA wird in die Zelle hineingedrückt, indem Zellen mit rekombinierter DNA auf Eis inkubiert werden, gefolgt von einem Hitzeschock (42YC) und dann zurück auf Eis. Dies hilft den Bakterien, rekombinierte DNA aufzunehmen.

B. Hochgeschwindigkeits-Mikropartikel aus Gold oder Wolfram werden mit DNA beschichtet und in die Zelle beschossen. Diese Methode wird Biolistik oder Genkanone genannt.

Frage 15.
Ein Forscher der Biotechnologie muss im Rahmen seiner Studie Insulin in großen Mengen herstellen.

  1. Welches Instrument wird er dafür wählen?
  2. Welche Ausstattung bietet das Instrument?

2. Ein Bioreaktor verwendet gewöhnlich einen Rührtyp. Es besteht aus einem zylindrischen Tank mit Rührer, der das Mischen des Reaktorinhalts erleichtert. Es erleichtert auch die Sauerstoffverfügbarkeit.

In einem Bioreaktor sind ein Rührsystem, ein Sauerstoffzufuhrsystem, ein Temperaturkontrollsystem, ein pH-Kontrollsystem vorhanden. Kleine Mengen der Produkte werden periodisch durch Probenahmeöffnungen entnommen.

Frage 16.
In der DNA-Technologie ist die Amplifikation von genetischem Material wichtig. In einem solchen Gerät

  1. Der Betrieb des programmierten Zylinders für die PCR erfordert eine hohe Temperatur. Daher wird thermostabile DNA-Polymerase verwendet
  2. Taq-Polymerase

Frage 17.
Es ist schwierig, anstelle von Agrobacterium andere Bakterien für den Transfer des gewünschten Gens in Pflanzen zu verwenden. Sind Sie einverstanden? Gib Gründe.
Antworten:
Jawohl. Agrobacterium besitzt Ti-Plasmid, es hat die Fähigkeit, das Gen durch Infektion in zweikeimblättrige Pflanzen zu übertragen. Daher wird es häufig beim Gentransfer verwendet.

Frage 18.
Wenn chromogenes Substrat zu dem Medium hinzugefügt wird, das Bakterienkolonien enthält, die einer Insertionsinaktivierung unterzogen werden, erscheinen einige als blau gefärbte und andere als weiß gefärbte Kolonien. Gib Gründe.
Antworten:
Die Kolonien erscheinen als blau gefärbte besitzen keine Eigengene, sie werden als nicht-rekombinant bezeichnet, während die Kolonien mit weißer Färbung ein Fremdgen-Insert aufweisen, sie werden als Rekombinanten bezeichnet.

Die Bildung blauer Farbe ist auf die Reaktion zwischen dem Beta-Galactosidase-Enzym und dem chromogenen Substrat zurückzuführen, während die weiß gefärbten Kolonien kein Enzym zur Reaktion mit dem Substrat aufweisen.

Frage 19.
Obwohl Salmonellen, Ecoli etc. Plasmide enthalten, wird PBR 322 in der Gentechnik weit verbreitet verwendet. Wieso den?
Antworten:
Das Plasmid PBR 322 ist ein künstlicher Klonierungsvektor, er besitzt mehrere Merkmale wie Replikationsursprung, selektierbarer Marker, Klonierungsstellen usw. Einige Merkmale des künstlichen Klonierungsvektors werden in natürlichen Plasmiden nicht gefunden. Daher wird PBR 322 häufig in der Gentechnik verwendet.

Frage 20.
Was meinst du mit auswählbarer Markierung? Nennen Sie 2 Beispiele.
Antworten:
Der selektierbare Marker ist ein antibiotikaresistentes Gen. Beispiele sind das Ampicilin-resistente und das Tetracyclin-resistente Gen.

Frage 21.
Wenn RNAase, Protease, Cellulaseeetc nicht zur Isolierung von genetischem Material verwendet werden. Finden Sie heraus, welche Schwierigkeiten während des Prozesses der rDNA-Technologie auftreten.
Antworten:
Wenn die oben genannten Enzyme nicht verwendet werden, ist es schwierig, DNA für die Isolierung von Fremdgenen in reiner Form zu erhalten.

Frage 22.
DNA ist ein hydrophiles Molekül, das die Zellmembran nicht passieren kann. Wie kann DNA in eine Bakterienzelle eingefügt werden?
Antworten:
Bakterienzellen müssen kompetent sein, um DNA aufzunehmen. Dies geschieht durch Behandlung mit Calciumionen und Inkubation der Zellen und rekombinanter DNA auf Eis, gefolgt von einer Platzierung bei 42 ° CÖC Dann legen Sie sie wieder auf Eis. Dies hilft den Bakterien, die rekombinante DNA aufzunehmen.

Frage 23.
Nennen Sie das der Gelelektrophorese zugrunde liegende Prinzip und erwähnen Sie zwei Anwendungen dieser Technik in der Biotechnologie.
Antworten:
Die molekulare Trennung bei der Gelelektrophorese basiert auf der Gelfiltration sowie auf der elektrophoretischen Beweglichkeit der zu trennenden Moleküle. Es ist eines der leistungsstärksten und dennoch am bequemsten verwendeten Verfahren zur makromolekularen Trennung.

Frage 24.
Wie wurde Agrobacterium tumifaciens geeignet modifiziert, um als Klonierungsvektor zu fungieren?
Antworten:
Gene werden von Bakterien oder Viren auf eukaryotische Zellen übertragen und diese Gene zwingen die transformierte Zelle, nach ihrem Willen zu arbeiten, zB: Agrobacterium-vermittelter Gentransfer.

Frage 25.
Wie unterscheidet sich die Wirkung der Exonuklease von der der Endonuklease?
Antworten:
Exonuklease entfernt die Nukleotide von den Enden von DNA-Molekülen, während Endonuklease an einer bestimmten Position innerhalb eines DNA-Moleküls geschnitten wird.

Frage 26.
Je nach Größe und Ladung der DNA-Sequenz, die sich in einem Agarosegel bewegt, wird das kleinere Fragment zum Klonen ausgewählt

  1. Nennen Sie die Technik, die verwendet wird, um verdaute und unverdaute Fragmente zu trennen
  2. Welche Methode wird verwendet, um reines DNA-Fragment aus Agarosegel zu erhalten?

Frage 27.
Warum wird das Enzym Zellulose zur Isolierung von genetischem Material aus Pflanzenzellen verwendet, nicht aber bei tierischen Zellen?
Antworten:
Aufgrund des Vorhandenseins von Zellwänden in Pflanzen wird Cellulose verwendet, während die tierische Zelle keine Zellwand aufweist.

Frage 28.
Es folgt die Nukleotidsequenz in zwei DNA-Strängen. Beobachten Sie die Stränge und beantworten Sie die vorherigen Fragen
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’

  1. Nennen Sie den speziellen Begriff, der für eine solche Anordnung von Nukleotiden verwendet wird
  2. Nennen Sie die spezielle Art von Enzym, die an diesen spezifischen Punkten arbeitet/funktioniert
  3. Nennen Sie das Enzym, das die DNA zwischen der GA-Sequenz schneidet.
  4. Benennen Sie die Einzelstränge, die nach der Einwirkung des Enzyms entstehen.

Frage 29.
DNA-schneidende Enzyme werden hauptsächlich aus Prokaryonten isoliert

  1. Nein.
  2. Sie besitzen keine Restriktionsendonukleasen. Die eukaryotischen Zellen haben einige andere Abwehrmittel gegen Virusinfektionen, d. h. das Immunsystem.

Frage 30.
Nennen Sie ein Beispiel für Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur Transformation haben.
Antworten:
Ein Bakterium Agrobacterium tumefactions hat T-DNA in seinem Ti-Plasmid, das normale Pflanzenzellen in Tumorzellen umwandeln und in Pflanzen Krähengallentumore verursachen kann.

Frage 31.
„Eine der Einschränkungen der traditionellen Hybridisierung besteht darin, dass sie zur Aufnahme und Vermehrung unerwünschter Gene zusammen mit den gewünschten Genen führt.“ Wie hilft die Gentechnik, diese Einschränkungen zu überwinden?
Antworten:
Bei diesem Verfahren können erwünschte Gene/fremde Gene geschnitten und in ein Plasmid eingebaut werden, und so wird rekombinante DNA hergestellt. Dann in den Zielorganismus eingebracht.

Frage 32.
In-Gel-Elektrophorese können wir im sichtbaren Licht und ohne Färbung keine reinen DNA-Fragmente sehen. Erklären Sie, wie es möglich ist, die DNA-Fragmente sichtbar zu machen?
Antworten:
Färben der DNA mit Ethidiumbromid, gefolgt von UV-Strahlung.

Frage 33.
Die untenstehende Abbildung ist eine wichtige Technik, die in der Gentechnik verwendet wird.

Frage 34.
Ordne die folgenden Spalten A und B passend zu

EIN B
ich. Gelelektrophorese A. Kontinuierliche Kultur von Mikroorganismen
ii. Mikroinjektion B. Amplifikation von Genen
iii. Polymerase Kettenreaktion C. Trennung von DNA-Fragmenten
NS. Bioreaktor D. Ausfällung von DNA-Fragmenten
e. Direkte Gentransfermethode

EIN B
(ich) (C)
(ii) (e)
(iii) (B)
(NS) (ein)

Frage 35.
Unten ist das Diagramm eines Klonierungsvektors angegeben.

Frage 36.
Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische palindromische Nukleotidsequenz in der DNA.

  1. Palindrom ist eine Sequenz von Basenpaaren, die auf zwei Strängen eines DNA-Moleküls gleich lautet
  2. 5′ GAATTC 3′
  3. 3′ CTTAAG 5′

Frage 37.
Im Folgenden sind einige Enzyme aufgeführt, die für die Freisetzung von DNA-Molekülen aus verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Lysozym, Chitinase, Cellulose. Ordnen Sie diese entsprechend in den unten angegebenen Spalten an.

Antworten:

Pflanzenzellen Cellulase
Bakterienzellen Lysozym
Pilzzellen Chitinase

Frage 38.
Ausgewählte Marker helfen uns bei der Identifizierung und Eliminierung nicht transformierter Zellen während der Genklonierung. Erklären Sie, wie das Gen für das Beta-Galactosidase-Enzym als selektierbarer Marker funktioniert.
Antworten:
Wenn rekombinante DNA in die kodierende Sequenz des Enzyms Beta-Galactosidase eingefügt wird, wird das Gen für die Enzymproduktion entfernt, nachdem diese Kolonien in ein Wachstumsmedium mit chromogenem Substrat überführt wurden, zeigen nicht transformierte Kolonien eine blaue Farbe, transformierte Kolonien jedoch keine Farbe aufgrund von Insertionsinaktivierung.

Frage 39.
Um Bakterien zur Aufnahme des Plasmids zu zwingen, müssen die Bakterienzellen zunächst „kompetent“ gemacht werden, DNA aufzunehmen. Schlagen Sie eine Methode vor, um Bakterienzellen für die Aufnahme von DNA kompetent zu machen.
Antworten:
Behandeln Sie die Zelle zunächst mit einem zweiwertigen Kation wie Kalzium, das die Effizienz erhöht, mit der DNA durch Poren in der Zellwand in das Bakterium eindringt. Dann inkubieren Sie die Zellen mit rDNA auf Eis und legen Sie sie kurz bei 42 °C und dann wieder auf Eis.

Frage 40.
Mehrere Kopien des interessierenden Gens werden in vitro unter Verwendung des DNA-Polymerase-Enzyms synthetisiert.

  1. Welches sind die drei Schritte des obigen Prozesses?
  2. Finden Sie hier das verwendete DNA-Polymerase-Enzym heraus.

1. Drei Schritte des obigen Prozesses:

2. Thermostabile DNA-Polymerase/Taq-Polymerase.

Frage 41.
Bioreaktoren helfen bei der großtechnischen Produktion rekombinanter Proteine.

  1. Welches sind die beiden am häufigsten verwendeten Bioreaktoren?
  2. Was ist der Zweck des Rührmechanismus in einem Bioreaktor?

Der Rührer erleichtert das Mischen von Inhalt und2 Verfügbarkeit.

Frage 42.
Unten ist das Diagramm eines Klonierungsvektors angegeben. Betrachten Sie das Diagramm und beantworten Sie die folgenden Fragen.

  1. Nennen Sie das Bakterium, aus dem dieser Vektor besteht?
  2. Welche Bedeutungen haben „ori“ und „rop“ im Bild?
  1. E coli
  2. „ori“-Ursprung der Replikation ist der Punkt, von dem aus die Replikation beginnt. „rop“- kodiert für Proteine, die an der Replikation des Plasmids beteiligt sind.

Frage 43.
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die für das Schneiden von DNA-Molekülen verantwortlich sind. Eco Rl wird abgeleitet.

Antworten:
1. Erster Buchstabe der Gattung und die zweiten beiden Buchstaben des Artnamens Der Buchstabe „R“ leitet sich vom Stammtyp ab. Die römische Zahl I gibt die Entdeckungsreihenfolge an.

Plus zwei Botanik-Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Drei-Mark-Fragen und -Antworten

Frage 1.
Schreiben Sie drei beliebige Verwendungen des Klonens von Genen.
Antworten:

  1. Gene von Interesse können in Tiere eingefügt werden, um bessere Nutztiere zu produzieren.
  2. Gewünschte Proteine ​​wie Insulin, Hormone, Interferone, Vitamine können industriell in Bakterien hergestellt werden.
  3. Rekombinante Impfstoffe, verbesserte Antibiotika können durch Genklonierung hergestellt werden.

Frage 2.

    1. Identifizieren Sie den Prozess.
    2. Identifizieren Sie die Enzyme, die an den Schritten (ii) und (iii) beteiligt sind
    1. Schreiben Sie die von EcoRI . erkannten Basensequenzen

    Antworten:
    1. Rekombinante DNA-Technologie.

    2. Enzyme, die an Schritten beteiligt sind:

    3. von EcoRI erkannte Sequenzen:

    Frage 3.
    Vehikel, die verwendet werden, um ein Gen von einer Zelle in eine andere zu übertragen, werden Klonierungsvektoren genannt. PBR 322 ist ein weit verbreiteter Klonierungsvektor.

    1. Nennen Sie 2 wichtige Eigenschaften, die ein Klonierungsvektor besitzen sollte.
    2. Welche Bedeutung hat Ori?
    1. Replikationsursprung selektierbarer Marker
    2. Ursprung der Replikation Der Punkt, an dem die Replikation beginnt.

    Frage 4.
    Stanley Cohen und Hebert Boyer konstruierten r-DNA unter Verwendung eines Plasmids und eines antibiotikaresistenten Gens.

    1. Nennen Sie das verwendete Slicing- und Spleißenzym.
    2. Welche Bedeutung hat das Slicing-Enzym in der rDNA-Technologie?

    Antworten:
    1. Slicing-Enzym – Restriktionsendonuklease Splicing-Enzym-DNA-Ligase

    2. Bedeutung des Slicing-Enzyms in der rDNA-Technologie:

    • Es wird verwendet, um innerhalb der DNA-Sequenz zu schneiden.
    • Das gleiche Restriktionsenzym wird verwendet, um sowohl Vektor-DNA als auch Fremd-DNA zu schneiden.

    Frage 5.
    Ordnen Sie die Elemente in Spalte A den Elementen in Spalte B zu.

    EIN B
    Palindromische Nukleotidsequenz Trennung von DNA-Fragmenten
    Restriktionsendonuklease Genprodukt synthetisieren
    Gelelektrophorese Werkzeug der rekombinanten Technologie
    Bioreaktor 5′ – GAATTC- 3′, 3′ – CTTAAG- 5′
    Biolistik Klonierungsvektor
    pBR322 Methode, um fremde DNA in den Wirt einzuführen

    EIN B
    Palindromische Nukleotidsequenz 5′ – GAATTC- 3′, 3′ – CTTAAG- 5‘
    Restriktionsendonuklease Werkzeug der rekombinanten Technologie
    Gelelektrophorese Trennung von DNA-Fragmenten
    Bioreaktor Genprodukt synthetisieren
    Biolistik Methode, um fremde DNA in den Wirt einzuführen
    PBR322 Klonierungsvektor

    Frage 6.
    Es folgt die Nukleotidsequenz in zwei DNA-Strängen. Beobachte die Stränge und beantworte die vorhergehenden Fragen
    5’ GAATTC 3’
    3’ CTTAAG 5’

    1. Nennen Sie den speziellen Begriff, der für eine solche Anordnung von Nukleotiden verwendet wird
    2. Nennen Sie das Enzym, das die DNA zwischen der GA-Sequenz schneidet.
    3. Benennen Sie die Einzelstränge, die nach der Einwirkung des Enzyms entstehen.

    Frage 7.
    Es folgen die verschiedenen Schritte der rekombinanten DNA-Technologie. Ordne sie in der richtigen Reihenfolge an.

    i) Gewinnung des fremden Genprodukts
    ii) Amplifikation des interessierenden Gens unter Verwendung von PCR
    iii) Schneiden von DNA an bestimmten Stellen
    iv) Nachgelagerte Verarbeitung
    v) Insertion rekombinanter DNA in die Wirtszelle/den Wirtsorganismus
    vi) Isolierung von genetischem Material
    Antworten:
    vi) Isolierung von genetischem Material
    iii) Schneiden von DNA an bestimmten Stellen
    ii) Amplifikation des interessierenden Gens mittels PCR Insertion rekombinanter DNA in den Wirtszellorganismus
    i) Gewinnung des fremden Genprodukts
    iv) Nachgelagerte Verarbeitung

    Plus zwei Botanik-Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse NCERT-Fragen und -Antworten

    Frage 1.
    Können Sie aus dem, was Sie gelernt haben, sagen, ob Enzyme größer sind oder DNA eine größere Molekülgröße hat? Woher wusstest du das?
    Antworten:
    DNA-Moleküle haben eine größere Molekülgröße im Vergleich zur Molekülgröße von Enzymen. Dies liegt daran, dass ein Enzym (Protein) aus dem DNA-Segment namens Gen synthetisiert wird.

    Frage 2.
    Wie hoch wäre die molare Konzentration menschlicher DNA in einer menschlichen Zelle?
    Antworten:
    Beim Menschen beträgt die DNA-Konzentration 0,4%. Es enthält 6,6 × 10 9 bp.

    Frage 3.
    Welchen weiteren Vorteil haben Rührkessel-Bioreaktoren neben besseren Belüftungs- und Mischeigenschaften gegenüber Schüttelkolben?
    Antworten:
    Schüttelkolben werden verwendet, um Mikroben zu züchten und die gewünschten Materialien in kleinem Maßstab im Labor zu mischen. Aber die Produktion des gewünschten biotechnologischen Produkts im großen Maßstab erfordert große Rührtank-Bioreaktoren. Neben besseren Belüftungs- und Mischeigenschaften haben die Bioreaktoren folgende Vorteile –

    1. Es verfügt über ein Sauerstoffversorgungssystem.
    2. Es hat Schaumkontrolle, Temperatur und P^ Kontrollsystem.
    3. Kleine Kulturmengen können periodisch entnommen werden.

    Frage 4.
    Haben eukaryotische Zellen Restriktionsendonukleasen? Rechtfertige deine Antwort.
    Antworten:
    Nein. Sie haben keine Restriktionsendonukleasen. Die eukaryotischen Zellen haben einige andere Abwehrmittel gegen Virusinfektionen, dh das Immunsystem.

    Frage 5.
    Können Sie sich an die Meiose erinnern und angeben, in welchem ​​Stadium eine rekombinante DNA hergestellt wird?
    Antworten:
    Pachytene-Stadium der Prophase I durch Crossing-Over.

    Frage 6.
    Können Sie sich vorstellen und beantworten, wie ein Reporterenzym verwendet werden kann, um die Transformation von Wirtszellen durch fremde DNA zusätzlich zu einem selektierbaren Marker zu überwachen?
    Antworten:
    Reporterenzyme können Rekombinanten von Nicht-Rekombinanten auf der Grundlage ihrer Fähigkeit unterscheiden, in Gegenwart eines chromogenen Substrats eine spezifische Farbe zu erzeugen. ArDNA wird in die kodierende Sequenz des Enzyms Galactosidase eingefügt.

    Dies führt zu einer Inaktivierung des Enzyms, die als Insertionsinaktivierung bezeichnet wird. Das Vorhandensein eines chromogenen Substrats führt zu blau gefärbten Kolonien, wenn das Plasmid in den Bakterien kein Insert enthält.

    Das Vorhandensein von Insert führt zu einer Insertionsinaktivierung der Galactosidase und die Kolonien produzieren keine Farbe. Diese werden als rekombinante Kolonien identifiziert.

    Plus zwei Botanik-Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Multiple-Choice-Fragen und -Antworten

    Frage 1.
    Die Verknüpfung des Antibiotikaresistenzgens mit dem Plasmidvektor wurde mit
    (a) DNA-Ligase
    (b) Endonukleasen
    (c) DNA-Polymerase
    (d) Exonukleasen
    Antworten:
    (a) DNA-Ligase

    Frage 2.
    Die Konstruktion der ersten rekombinanten DNA erfolgte unter Verwendung des nativen Plasmids von
    (a) E. coli
    (b) Salmonella typhimurium
    (c) Bacillus thuringiensis
    (d) Hefe
    Antworten:
    (b) Salmonella typhimurium

    Frage 3.
    Welcher der folgenden wird als bester genetischer Vektor in Pflanzen verwendet?
    (a) Bacillus thuringiensis
    (b) Agrobacterium tumefaciens
    (c) Pseudomonas putida
    (D. Nichts des oben Genannten
    Antworten:
    (b) Agrobacterium tumefaciens

    Frage 4.
    Einer der Schlüsselfaktoren, der das Plasmid zum Vektor in der Gentechnik macht?
    (a) Es ist resistent gegen Antibiotika
    (b) Es ist resistent gegen Restriktionsenzyme
    (c) Es hat die Fähigkeit, ein fremdes Gen zu tragen
    (d) Es hat die Fähigkeit, eine Infektion im Wirt zu verursachen
    Antworten:
    (c) Es hat die Fähigkeit, ein fremdes Gen zu tragen

    Frage 5.
    Ein Klon ist
    (a) Heterozygote, die asexuell gewonnen wurde
    (b) asexuell erhaltener Homozygot
    (c) durch sexuelle Methoden hergestellte Heterozygote
    (d) durch sexuelle Methoden hergestellte Homozygote
    Antworten:
    (b) asexuell erhaltener Homozygot

    Frage 6.
    In der rekombinanten DNA-Technik bezieht sich der Begriff Vektor auf
    (a) Spender-DNA wird identifiziert und durch Elektrophorese aufgenommen
    (b) Plasmid, überträgt DNA in lebende Zellen
    (c) Sammlung des gesamten Genoms in Form eines Plasmids
    (d) Enzym, schneidet die DNA an bestimmten Stellen
    Antworten:
    (b) Plasmid, überträgt DNA in lebende Zellen

    Frage 7.
    Das zur Amplifikation von DNA während der PCR eingesetzte Enzym wird kommerziell von
    (a) Streptococcus pyogenes
    (b) Bacillus licheniformis
    (c) Trichodermapallidum
    (d) Thermusaquaticus
    Antworten:
    (d) Thermusaquaticus

    Frage 8.
    Das zum Annealing der geschnittenen DNA-Segmente verwendete Enzym ist
    (a) DNA-Ligase
    (b) Helikase
    (c) Topoisomerase
    (d) Polymerase
    Antworten:
    (d) Polymerase

    Frage 9.
    Wie dient die PCR der Früherkennung?
    (a) Durch den Nachweis sehr geringer DNA-Mengen durch Amplifikation
    (b) Es ist eine leistungsfähige Technik, um genetische Störungen des Menschen zu identifizieren
    (c) Mutationen zu erkennen sind Gene bei Krebspatienten
    (d) Alle oben genannten
    Antworten:
    (d) Alle oben genannten

    Frage 10.
    Enzym, das bei der Addition von Nukleotiden bei der DNA-Replikation verwendet wird, ist
    (a) Katalase
    (b) DNA-Polymerase
    (c) Nuklease
    (d) RNA-Polymerase
    Antworten:
    (b) DNA-Polymerase

    Frage 11.
    Die Bedeutung des Restriktionsendonuklease-Enzyms ist es,
    (a) RNA-Stränge an einer bestimmten Stelle
    (b) DNA-Stränge an einer bestimmten Stelle
    (c) Enden von DNA-Strängen
    (D. Nichts des oben Genannten
    Antworten:
    (b) DNA-Stränge an einer bestimmten Stelle

    Frage 12.
    Eine große Menge an rekombinantem Protein wird produziert in
    (a) Gewebekultur
    (b) Bioreaktor
    (c) somatische Hybridisierung
    (d) Gentechnik
    Antworten:
    (b) Bioreaktor

    Frage 13.
    Polymerase-Enzym im Replikationsprozess zur Herstellung von 1 Milliarde Kopien der DNA ist
    (a) RNA-Polymerase 1
    (b) DNA-Polymerase 1
    (c) DNA-Polymerase 11
    (d) taq-Polymerase
    Antworten:
    (d) taq-Polymerase

    Frage 14.
    Verdaute und unverdaute DNA-Fragmente können bei der Elektrophorese beobachtet werden durch
    (a) Ethidiumbromid
    (b) FCKW
    (c) Ethidiumchlorid
    (d) Acetylchlorid
    Antworten:
    (a) Ethidiumbromid

    Frage 15.
    In welchem ​​Schritt der DNA-Amplifikation erfolgt die DNA-Hybridisierung
    (a) Denaturierung
    (b) Erweiterung
    (c) Glühen
    (d) Dehnung
    Antworten:
    (c) Glühen

    Frage 16.
    Das Plasimid von Agrobacterium ist
    (a) Ti-Plasmid
    (b) F1-Plasmid
    (c) T-Plasmid
    (d) Spalte E1
    Antworten:
    (a) Ti-Plasmid

    Frage 17.
    Der ori des Klonierungsvektors zeigt an
    (a) Klonierungsstelle
    (b) Restriktionsstelle
    (c) Replikationsstelle
    (d) selektierbare Markerstelle
    Antworten:
    (c) Replikationsstelle

    Frage 18.
    Der selektierbare Marker des Klonierungsvektors spielt eine wichtige Rolle bei
    (a) Identifizierung von Rekombinanten
    (b) Identifizierung von Nicht-Rekombinanten
    (c) Identifizierung von Rekombinanten von Nicht-Rekombinanten
    (D. Nichts des oben Genannten
    Antworten:
    (c) Identifizierung von Rekombinanten von Nicht-Rekombinanten

    Frage 19.
    Die Beschichtung von Gold- oder Wolframpartikeln mit DNA wird verwendet in
    (a) direkter Gentransfer
    (b) indirekter Gentransfer
    (c) sowohl direkter als auch indirekter Gentransfer
    (D. Nichts des oben Genannten
    Antworten:
    (a) direkter Gentransfer

    Wir hoffen, dass das Kerala Plus Two Botany Chapter Wise Questions and Answers Chapter 4 Biotechnology Principles and Processes Ihnen hilft. Wenn Sie Fragen zu Kerala Plus Two Botany Chapter Wise Questions and Answers Chapter 4 Biotechnology Principles and Processes haben, schreiben Sie unten einen Kommentar und wir werden uns so schnell wie möglich bei Ihnen melden.


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