Information

Wie kann man die DNA-Dichte im menschlichen Spermienkopf schätzen?

Wie kann man die DNA-Dichte im menschlichen Spermienkopf schätzen?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich habe eine Schätzung des Spermienkopfvolumens aus dem Internet erhalten. Betrachten Sie es als eine Scheibe der Größenordnung 4-5 µm. Nun wollte ich die DNA-Dichte im Spermienkopf herausfinden. Wie findet man das?


Finden oder berechnen Sie einen Wert für das Volumen des Spermienkopfes.

Finden Sie einen Wert für die Größe des menschlichen Genoms (haploid oder diploid?)

Konvertieren Sie die Genomgröße, die wahrscheinlich in Giga-Basenpaaren liegt, in Masse (ich schlage Picogramme vor).

Masse durch Volumen dividieren, um eine Dichte zu erhalten, pg μm-3

Verfeinerung – nimmt der Spermienkern das gesamte Kopfvolumen ein? Muss man das einkalkulieren?


Mitochondrialer DNA-Gehalt menschlicher Spermatozoen 1

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des spanischen Fondo de Investigaciones Sanitarias (98/1033 und 01/0192) unterstützt.

Carmen Díez-Sánchez, Eduardo Ruiz-Pesini, Ana Cristina Lapeña, Julio Montoya, Acisclo Pérez-Martos, José Antonio Enríquez, Manuel J. López-Pérez, Mitochondrialer DNA-Inhalt menschlicher Spermatozoen, Biologie der Fortpflanzung, Band 68, Ausgabe 1, 1. Januar 2003, Seiten 180–185, https://doi.org/10.1095/biolreprod.102.005140


Inhalt

Die häufigsten Gründe für eine Labor-Samenanalyse beim Menschen sind im Rahmen einer Unfruchtbarkeitsuntersuchung eines Paares und nach einer Vasektomie, um den Erfolg des Verfahrens zu überprüfen. [4] Es wird auch häufig verwendet, um menschliche Spender auf Samenspende zu testen, und bei Tieren wird die Samenanalyse häufig in der Gestütshaltung und in der Nutztierzucht verwendet.

Gelegentlich wird bei einem Mann eine Samenanalyse als Teil eines routinemäßigen Tests vor der Schwangerschaft durchgeführt. Auf Laborebene ist dies selten, da die meisten Gesundheitsdienstleister Sperma und Spermien nicht testen, es sei denn, es wird ausdrücklich angefordert oder es besteht ein starker Verdacht auf eine Pathologie in einem dieser Bereiche, die während der Anamnese oder während der körperlichen Untersuchung festgestellt wird. Solche Tests sind sehr teuer und zeitaufwändig und werden in den USA wahrscheinlich nicht durch eine Versicherung abgedeckt. In anderen Ländern, wie beispielsweise Deutschland, wird die Prüfung von allen Versicherungen übernommen.

Die durch die Samenanalyse gemessenen Eigenschaften sind nur einige der Faktoren für die Samenqualität. Eine Quelle gibt an, dass 30% der Männer mit einer normalen Samenanalyse tatsächlich eine abnormale Spermienfunktion haben. [5] Umgekehrt können Männer mit schlechten Samenanalyseergebnissen Kinder zeugen. [6] In den NICE-Richtlinien leichte männliche Unfruchtbarkeit ist definiert als wenn 2 oder mehr Samenanalysen 1 oder mehr Variablen unterhalb der 5. [7]

Zu den Methoden der Samengewinnung gehören Masturbation, Kondomentnahme und Nebenhodenextraktion. Die Probe sollte niemals durch den Coitus Interruptus entnommen werden, da ein Teil des Ejakulats verloren gehen könnte, eine bakterielle Kontamination auftreten könnte oder der saure vaginale pH-Wert die Beweglichkeit der Spermien beeinträchtigen könnte. Die optimale sexuelle Abstinenz für die Samenentnahme beträgt 2 bis 7 Tage. Die gebräuchlichste Methode zur Gewinnung einer Samenprobe ist die Masturbation und am besten in der Klinik, in der die Analyse stattfindet, um Temperaturschwankungen während des Transports zu vermeiden, die für einige Spermatozoen tödlich sein können. Nach der Entnahme muss die Probe direkt in einen sterilen Kunststoffbehälter (nie in ein konventionelles Konservierungsmittel, da diese chemische Substanzen wie Gleitmittel oder Spermizide enthalten, die die Probe beschädigen könnten) und zur Untersuchung in die Klinik gegeben werden innerhalb einer Stunde.

Es gibt einige Situationen, in denen eine besondere Behandlung erforderlich ist, wie z. B. retrograde Ejakulation, neurologische Verletzung oder psychische Hemmung. Je nach Situation können wir verschiedene Methoden wie spezielle Konservierungsmittel, Elektrostimulation, Vibrostimulation usw. anwenden.

Beispiele für Parameter, die bei einer Samenanalyse gemessen werden, sind: Spermienzahl, Motilität, Morphologie, Volumen, Fruktosegehalt und pH-Wert.

Spermienzahl Bearbeiten

Spermienzahl, oder Spermienkonzentration um Verwechslungen mit zu vermeiden Gesamtzahl der Spermien, misst die Konzentration von Spermien im Ejakulat eines Mannes, unterschieden von Gesamtzahl der Spermien, das ist die Spermienzahl multipliziert mit dem Volumen. Über 15 Millionen Spermien pro Milliliter gelten laut WHO im Jahr 2010 als normal. [8] Ältere Definitionen geben 20 Millionen an. [5] [6] Eine niedrigere Spermienzahl wird als Oligozoospermie bezeichnet. Eine Vasektomie gilt als erfolgreich, wenn die Probe azoospermisch ist (keine Spermien jeglicher Art gefunden). Wenn eine Probe weniger als 100.000 Spermien pro Milliliter enthält, spricht man von Kriptozoospermie. Einige definieren Erfolg als wenn seltene/gelegentliche unbewegliche Spermien beobachtet werden (weniger als 100.000 pro Milliliter). [9] Andere befürworten eine zweite Samenanalyse, um sicherzustellen, dass die Anzahl nicht ansteigt (wie es bei einer Rekanalisation passieren kann), und andere können in dieser Situation immer noch eine erneute Vasektomie durchführen.

Chips für den Heimgebrauch sind im Kommen, die eine genaue Schätzung der Spermienzahl nach drei Proben, die an verschiedenen Tagen entnommen wurden, ermöglichen. Ein solcher Chip kann die Konzentration von Spermien in einer Samenprobe gegen eine mit Polystyrolkügelchen gefüllte Kontrollflüssigkeit messen. [10] [ unzuverlässige medizinische Quelle? ]

Beweglichkeit Bearbeiten

Die Weltgesundheitsorganisation hat einen Wert von 40 [11] % und dieser muss innerhalb von 60 Minuten nach der Sammlung gemessen werden. WHO hat auch einen Parameter von Vitalität, mit einer unteren Referenzgrenze von 60 % lebenden Spermatozoen. [8] Ein Mann kann eine Gesamtzahl von Spermien weit über der Grenze von >15 Millionen Spermien pro Milliliter haben, aber dennoch eine schlechte Qualität haben, weil zu wenige von ihnen beweglich sind. Wenn die Spermienzahl jedoch sehr hoch ist, kann eine geringe Motilität (z. B. weniger als 60%) keine Rolle spielen, da der Anteil immer noch mehr als 8 Millionen pro Milliliter betragen kann. Umgekehrt kann ein Mann eine Spermienzahl von weit weniger als 20 Millionen Spermien pro Milliliter haben und dennoch eine gute Beweglichkeit haben, wenn mehr als 60 % der beobachteten Spermien eine gute Vorwärtsbewegung zeigen - was von Vorteil ist, da die Natur Qualität bevorzugt Anzahl.

Ein genaueres Maß ist Beweglichkeitsgrad, wobei die Gesamtmotilität (PR+NP) und Immotilität [12]

Progressiv beweglich - Spermien, die sich in Vorwärtsrichtung bewegen, sind progressiv beweglich. Nicht progressiv beweglich. Diese Spermien bewegen sich in einer Kreisbewegung.

Samenproben mit mehr als 32% progressiver Motilität gelten als Normozoospermie. Proben unterhalb dieses Wertes werden gemäß den WHO-Kriterien als Asthenozoospermie eingestuft.

Morphologie Bearbeiten

In Bezug auf die Spermienmorphologie besagen die 2010 beschriebenen WHO-Kriterien, dass eine Probe normal ist (Proben von Männern, deren Partner in den letzten 12 Monaten eine Schwangerschaft hatten), wenn 4 % (oder 5. Perzentile) oder mehr der beobachteten Spermien eine normale Morphologie aufweisen. [8] [13] Wenn die Probe weniger als 4% morphologisch normale Spermatozoen enthält, wird sie als Teratozoospermie klassifiziert.

Die normale Spermienmorphologie ist beispielsweise aufgrund mangelnder Objektivität und Variationen in der Interpretation schwer zu klassifizieren. Um Spermatozoen als normal oder abnormal zu klassifizieren, sollten die verschiedenen Teile berücksichtigt werden. Sperma hat einen Kopf, ein Mittelstück und einen Schwanz.

Erstens sollte der Kopf oval geformt, glatt und mit einem regelmäßigen Umriss sein. Darüber hinaus sollte die akrosomale Region 40-70% des Kopfbereichs umfassen, definiert sein und keine großen Vakuolen enthalten. Die Menge an Vakuolen sollte 20 % der Kopffläche nicht überschreiten. Es sollte 4-5μm lang und 2,5-3,5μm breit sein.

Zweitens sollten das Mittelstück und der Hals regelmäßig sein, mit einer maximalen Breite von 1 µm und einer Länge von 7-8 µm. Die Achse des Mittelstücks sollte mit der Hauptachse des Kopfes ausgerichtet sein.

Schließlich sollte der Schwanz dünner als das Mittelstück sein und eine Länge von ungefähr 45 μm und einen konstanten Durchmesser über die gesamte Länge haben. Wichtig ist, dass es nicht aufgerollt ist.

Da Auffälligkeiten häufig gemischt sind, ist der Teratozoospermie-Index (TZI) sehr hilfreich. Dieser Index ist die durchschnittliche Anzahl von Anomalien pro anormalem Sperma. Um es zu berechnen, werden 200 Spermien gezählt (das ist eine gute Zahl). Aus dieser Zahl werden die Anomalien in Kopf, Mittelstück und Schwanz sowie die gesamten anormalen Spermatozoen gezählt. Sobald diese Aufgabe erledigt ist, wird das TZI wie folgt berechnet:

  • x = Anzahl abnormaler Spermatozoen.
  • h = Anzahl der Spermatozoen mit Kopfanomalien.
  • m = Anzahl der Spermatozoen mit Mittelstückanomalien.
  • t = Anzahl der Spermatozoen mit Schwanzanomalien.

Ein weiterer interessanter Index ist der Spermiendeformitätsindex (SDI), der auf die gleiche Weise wie der TZI berechnet wird, jedoch nicht durch die Anzahl der abnormalen Spermien dividiert wird, sondern durch die Gesamtzahl der gezählten Spermien. Das TZI nimmt Werte von 1 (nur eine Anomalie pro Sperma) bis 3 (jedes Sperma weist die drei Arten von Anomalie auf).

Die Morphologie ist ein Prädiktor für den Erfolg bei der Befruchtung von Eizellen während der In-vitro-Fertilisation.

Bis zu 10 % aller Spermatozoen haben beobachtbare Defekte und sind als solche bei der Befruchtung einer Eizelle benachteiligt. [14]

Außerdem weisen Samenzellen mit Schwellungsmustern an der Schwanzspitze im Allgemeinen eine geringere Häufigkeit von Aneuploidien auf. [fünfzehn]

EIN morphologische Untersuchung der beweglichen Spermienorganellen (MSOME) ist eine spezielle morphologische Untersuchung, bei der ein invertiertes Lichtmikroskop mit Hochleistungsoptik und digitaler Bildgebung verwendet wird, um eine Vergrößerung über x6000 zu erreichen, die viel höher ist als die Vergrößerung, die Embryologen gewöhnlich bei der Spermatozoenselektion für intrazytoplasmatische Spermien verwenden Injektion (x200 bis x400). [16] Ein potenzieller Befund bei MSOME ist das Vorhandensein von Spermienvakuolen, die mit der Unreife des Spermienchromatins verbunden sind, insbesondere bei großen Vakuolen. [17]

Lautstärke bearbeiten

Laut einem Labortesthandbuch sind Samenvolumina zwischen 2,0 ml und 5 ml normal [6] Die WHO betrachtet 1,5 ml als untere Referenzgrenze. [8] Geringes Volumen, Hypospermie genannt, kann auf eine teilweise oder vollständige Blockierung der Samenbläschen hinweisen oder darauf, dass der Mann ohne Samenbläschen geboren wurde. [5] In der klinischen Praxis ist ein Volumen von weniger als 0,5 ml bei Unfruchtbarkeit höchstwahrscheinlich auf eine unvollständige Ejakulation oder einen teilweisen Verlust der Probe zurückzuführen. Abgesehen davon sollte der Patient auf Hypoandrogenismus und obstruktive Azoospermie untersucht werden, da er bei mindestens 48 Stunden seit der letzten Ejakulation bis zum Zeitpunkt der Probenentnahme.

Das menschliche Ejakulat besteht hauptsächlich aus Wasser, 96 bis 98% des Samens sind Wasser. Eine Möglichkeit sicherzustellen, dass ein Mann mehr Ejakulat produziert [18], besteht darin, mehr Flüssigkeit zu trinken. Männer produzieren auch nach längerer sexueller Stimulation und Erregung mehr Samenflüssigkeit. Die Reduzierung der Häufigkeit von Sex und Masturbation hilft, das Spermavolumen zu erhöhen. Auch sexuell übertragbare Krankheiten beeinflussen die Samenproduktion. Männer, die mit dem Humanen Immunschwächevirus (HIV) infiziert sind [19], produzieren ein geringeres Spermavolumen.

Das Spermavolumen kann auch erhöht sein, ein Zustand, der als Hyperspermie bekannt ist. Ein Volumen von mehr als 6 ml kann auf eine Prostataentzündung hinweisen. Wenn kein Volumen vorhanden ist, wird die Erkrankung als Aspermie bezeichnet, die durch retrograde Ejakulation, anatomische oder neurologische Erkrankungen oder blutdrucksenkende Medikamente verursacht werden kann.

Farbe bearbeiten

Sperma hat normalerweise eine weißlich-graue Farbe. Es neigt dazu, mit zunehmendem Alter einen gelblichen Farbton zu bekommen. Die Samenfarbe wird auch durch die Nahrung beeinflusst, die wir zu uns nehmen: Nahrungsmittel mit hohem Schwefelgehalt wie Knoblauch können dazu führen, dass ein Mann gelben Samen produziert. [20] Blut im Sperma (Hämatospermie) führt zu einem bräunlich oder rot gefärbten Ejakulat. Hämatospermie ist eine seltene Erkrankung.

Samen, der eine tiefgelbe Farbe hat oder grünlich aussieht, kann auf Medikamente zurückzuführen sein. Braunes Sperma entsteht hauptsächlich durch Infektionen und Entzündungen der Prostata, der Harnröhre, des Nebenhodens und der Samenbläschen. [ Zitat benötigt ] Andere Ursachen für ungewöhnliche Samenfarbe sind sexuell übertragbare Infektionen wie Gonorrhoe und Chlamydien, Genitaloperationen und Verletzungen der männlichen Geschlechtsorgane.

Fruktosespiegel Bearbeiten

Der Fruktosegehalt im Samen kann analysiert werden, um die Energiemenge zu bestimmen, die dem Samen für die Bewegung zur Verfügung steht. [6] Die WHO gibt einen Normalwert von 13 µmol pro Probe an. Das Fehlen von Fructose kann auf ein Problem mit den Samenbläschen hinweisen. [5]

PH-Wert Bearbeiten

Laut einem Labortesthandbuch liegt der normale pH-Bereich bei 7,1–8,0 [6] Die WHO-Kriterien geben als normal 7,2–7,8 an. [5] Saures Ejakulat (niedrigerer pH-Wert) kann darauf hindeuten, dass eines oder beide Samenbläschen blockiert sind. Ein basisches Ejakulat (höherer pH-Wert) kann auf eine Infektion hinweisen. [5] Ein pH-Wert außerhalb des normalen Bereichs ist schädlich für Spermien und kann ihre Fähigkeit, die Eizelle zu durchdringen, beeinträchtigen. [6] Der endgültige pH-Wert ergibt sich aus dem Gleichgewicht zwischen den pH-Werten der Sekrete der akzessorischen Drüsen, der alkalischen vesikulären Samensekretion und der sauren Prostatasekrete. [21]

Verflüssigung Bearbeiten

Die Verflüssigung ist der Vorgang, bei dem das von Proteinen aus den Samenbläschen gebildete Gel aufgebrochen wird und der Samen flüssiger wird. Normalerweise dauert es weniger als 20 Minuten, bis die Probe von einem dicken Gel in eine Flüssigkeit übergeht. In den NICE-Richtlinien gilt eine Verflüssigungszeit innerhalb von 60 Minuten als im Normbereich. [22]

TÜV Bearbeiten

MOT ist ein Maß dafür, wie viele Millionen Spermien pro ml hochbeweglich sind, [23] also ungefähr vom Grad a (>25 Mikrometer pro 5 Sek. bei Raumtemperatur) und Grad b (>25 Mikrometer pro 25 Sek. bei Raumtemperatur) ). Es ist also eine Kombination aus Spermienzahl und Beweglichkeit.

Bei einem Strohhalm [24] oder einem Fläschchenvolumen von 0,5 Milliliter ist die allgemeine Richtlinie, dass für die intrazervikale Insemination (ICI) Trinkhalme oder Fläschchen mit insgesamt 20 Millionen beweglichen Spermatozoen empfohlen werden. Dies entspricht 8 Strohhalmen oder Fläschchen 0,5 ml mit MOT5 oder 2 Strohhalmen oder Fläschchen mit MOT20. Für die intrauterine Insemination (IUI) werden 1–2 MOT5-Strohhalme oder -Fläschchen als ausreichend angesehen. [25] Aus Sicht der WHO wird daher empfohlen, bei der ICI etwa 20 Millionen Spermien der Klasse a+b und bei der IUI 2 Millionen Spermien der Klasse a+b zu verwenden.

DNA-Schaden Bearbeiten

DNA-Schäden in Spermien, die mit Unfruchtbarkeit in Zusammenhang stehen, können durch Analyse der DNA-Anfälligkeit für Denaturierung als Reaktion auf Hitze- oder Säurebehandlung [26] und/oder durch Nachweis von DNA-Fragmentierung, die durch das Vorhandensein von Doppelstrangbrüchen nachgewiesen wird, untersucht werden TUNEL-Assay. [27] [28] Andere Techniken zur Messung der DNA-Fragmentierung sind: SCD (Spermienchromatin-Dispersionstest), ISNT (vor Ort Nick-Translation), SCSA (Sperma-Chromatin-Struktur-Assay) und Comet-Assay.

Total bewegliche Spermien Bearbeiten

Total bewegliche Spermien (TMS) [29] oder Gesamtzahl der beweglichen Spermien (TMSC) [30] ist eine Kombination aus Spermienzahl, Beweglichkeit und Volumen und misst, wie viele Millionen Spermien in einem gesamten Ejakulat beweglich sind.

Die Verwendung von etwa 20 Millionen Spermien mit Motilitätsgrad c oder d bei ICI und 5 Millionen Spermien bei IUI kann eine ungefähre Empfehlung sein.

Andere Bearbeiten

Die Probe kann auch auf weiße Blutkörperchen getestet werden. Ein hoher Gehalt an weißen Blutkörperchen im Sperma wird Leukospermie genannt und kann auf eine Infektion hinweisen. [5] Cutoffs können variieren, aber ein Beispiel Cutoff ist über 1 Million weiße Blutkörperchen pro Milliliter Sperma. [5]

    : Spermienmangel : Spermienmangel : geringes Spermienvolumen : hohes Spermienvolumen : sehr geringe Spermienzahl : schlechte Spermienmotilität : Spermien tragen mehr morphologische Defekte als üblich : alle Spermien im Ejakulat sind tot
  • Leukospermie: ein hoher Gehalt an weißen Blutkörperchen im Samen

Abgesehen von der Samenqualität selbst gibt es verschiedene methodische Faktoren, die die Ergebnisse beeinflussen können, was zu einer Variation zwischen den Methoden führt.

Im Vergleich zu Proben aus der Masturbation weisen Samenproben aus Sammelkondomen eine höhere Gesamtspermazahl, Spermienmotilität und einen höheren Prozentsatz an Spermien mit normaler Morphologie auf [ Zitat benötigt ] . Aus diesem Grund wird angenommen, dass sie genauere Ergebnisse liefern, wenn sie für die Samenanalyse verwendet werden.

Sind die Ergebnisse der ersten Probe eines Mannes subfertil, müssen sie mit mindestens zwei weiteren Analysen verifiziert werden. Zwischen jeder Analyse müssen mindestens 2 bis 4 Wochen liegen. [31] [ medizinisches Zitat erforderlich ] Die Ergebnisse eines einzelnen Mannes können im Laufe der Zeit eine große natürliche Variation aufweisen, was bedeutet, dass eine einzelne Probe möglicherweise nicht repräsentativ für die durchschnittlichen Sameneigenschaften eines Mannes ist. [ medizinisches Zitat erforderlich ] Darüber hinaus glaubt die Spermienphysiologin Joanna Ellington, dass der Stress bei der Herstellung einer Ejakulatprobe für die Untersuchung, oft in einer ungewohnten Umgebung und ohne Schmierung (die meisten Gleitmittel sind für die Spermien etwas schädlich), erklären könnte, warum die ersten Proben von Männern oft schlechte Ergebnisse zeigen, während spätere Proben zeigen normale Ergebnisse. [ medizinisches Zitat erforderlich ]

Ein Mann kann es vorziehen, seine Probe lieber zu Hause als in der Klinik herzustellen. Die Website der Samenentnahme tut nicht die Ergebnisse einer Samenanalyse beeinflussen. [32] Wenn die Probe zu Hause hergestellt wird, sollte die Probe so nah wie möglich an der Körpertemperatur gehalten werden, da Kälte oder Wärme die Beweglichkeit der Spermien beeinträchtigen können

Das Volumen kann durch Messen des Gewichts des Probenbehälters bestimmt werden, wobei die Masse des leeren Behälters bekannt ist. Spermienzahl und Morphologie können durch Mikroskopie berechnet werden. Die Spermienzahl kann auch durch Kits geschätzt werden, die die Menge eines Sperma-assoziierten Proteins messen und für den Heimgebrauch geeignet sind. [33] [ unzuverlässige medizinische Quelle? ]

Computergestützte Samenanalyse (CASA) ist ein Sammelbegriff für automatische oder halbautomatische Samenanalysetechniken. Die meisten Systeme basieren auf einer Bildanalyse, es gibt jedoch auch alternative Methoden, wie das Verfolgen der Zellbewegung auf einem Digitalisiertablett. [34] [35] Computergestützte Techniken werden am häufigsten zur Beurteilung der Spermienkonzentration und der Mobilitätsmerkmale wie Geschwindigkeit und Lineargeschwindigkeit verwendet. Heutzutage gibt es CASA-Systeme, die auf Bildanalyse basieren und neue Techniken verwenden, mit nahezu perfekten Ergebnissen und einer vollständigen Analyse in wenigen Sekunden. Bei einigen Techniken sind die Konzentrations- und Motilitätsmessungen der Spermien mindestens so zuverlässig wie aktuelle manuelle Methoden. [36]

Die Raman-Spektroskopie hat Fortschritte in ihrer Fähigkeit zur Charakterisierung, Identifizierung und Lokalisierung von nuklearen DNA-Schäden von Spermien gemacht. [37]


AP Biologie

Alle Elemente, die der Wissenschaft derzeit bekannt sind – und einige, die vorhergesagt werden, aber noch unentdeckt sind – sind in einer Tabelle namens Periodensystem organisiert. Die Organisation der Elemente ist nicht zufällig Wissenschaftler können die chemischen Eigenschaften von Elementen vorhersagen, basierend darauf, wo sie im Periodensystem liegen.

Jedes Element wird durch ein einzelnes Quadrat dargestellt. Die ein- oder zweibuchstabigen Abkürzungen für jedes Element sind ebenfalls im Quadrat aufgeführt. Darüber hinaus hat jedes Element eine Zahl, die sogenannte Ordnungszahl, die der Anzahl der Protonen im Kern entspricht.

Beachten Sie, dass die Zahlen bei 1 in der oberen linken Ecke der Tabelle beginnen und über die Zeilen von links nach rechts ansteigen. Bei Lücken in der Reihe springen die Zahlen trotzdem direkt über.

Das meiste Quecksilber auf der Erde ist in Gesteinen eingeschlossen und wird auf natürliche Weise durch geologische Prozesse freigesetzt. Durch menschliche Aktivitäten gelangen jedoch große Mengen Quecksilber in die Atmosphäre. Der erhöhte Ausstoß dieser Schadstoffe gefährdet sowohl die Umwelt als auch den Menschen.

1) SEHR SAUER ODER BASISBEDINGUNGEN: - Der stark saure oder stark basische Zustand kann eine Proteinentfaltung induzieren, die seine Struktur verzerrt und zu seiner Denaturierung führt.

2) HOHE SALZKONZENTRATION: - Eine hohe Salzkonzentration kann die Wasserschicht von den Proteinmolekülen ablösen, was zu ihrer Denaturierung führt.

3) HOHE HITZE: - Hohe Hitze schüttelt die Proteinstränge, was zum Bruch des komplexen Proteins führt, und das abgewickelte Protein klebt und bildet eine komplexere Struktur.

Dieses Lipid besteht aus zwei Fettsäureschwänzen, die an eine Phosphatgruppe gebunden sind.
Art des Lipids: Phospholipid.

Dieses Lipid bedeckt viele Pflanzenoberflächen, um Wasserverlust zu verhindern und vor Schädlingen zu schützen.
Art des Lipids: Wachs.

Zellen sind individuell lebendig und sind die grundlegenden strukturellen und funktionellen Einheiten des Lebens.

Art des Membranproteins: Adhäsionsprotein

Funktion des Membranproteins: Bindet an eine bestimmte Substanz außerhalb der Zelle

Art des Membranproteins: Rezeptorprotein

Funktion des Membranproteins: Unterstützt durch aktiven oder passiven Transport spezifische Ionen oder Moleküle durch eine Membran


Diskussion

In dieser Arbeit haben wir ausgehend von veröffentlichten proteomischen Daten die Netzwerke realisiert, die das putative Human Spermatozoa Interactome (HSIN3.0 und HSIN3.0_MC) repräsentieren. Nachdem wir das Netzwerkmodell erhalten hatten, bewerteten wir seine Topologie, um wichtige biologische Informationen abzuleiten. Zunächst einmal zeigt sich, dass HSIN3.0 und HSIN3.0_MC durch eine spezifische Topologie gekennzeichnet sind: Es handelt sich um skalenfreie Netze nach dem Barabasi-Albert (BA)-Modell. Sie zeichnen sich durch eine breite Heterogenität des Knotengrades von Knoten aus. Insbesondere in BA-Netzen koexistiert eine geringe Anzahl von hoch verbundenen Knoten (die „Hubs“) mit einer höheren Anzahl von kaum verbundenen Knoten [18]. Aus dynamischer Sicht wachsen diese Netzwerke im Laufe der Zeit durch das Anhängen neuer Knoten bevorzugt an die Hubs: Je mehr ein Knoten angebunden ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass er einen neuen Knoten anzieht (bevorzugte Anbindung) [19 ]. Somit ist die Wahrscheinlichkeit P ich dass der neue Knoten mit Knoten verbunden ist ich ist:

wo k ich ist der Knotengrad ich und die Summe wird über alle bereits existierenden Knoten gebildet J [19, 20]. Schließlich folgt der Knotengrad der Knoten innerhalb des Netzwerks einer Potenzgesetzverteilung, d. h. der Wahrscheinlichkeit, dass ein Knoten k Links folgt P(k)

k − γ , wobei der Gradexponent γ normalerweise zwischen 2 und 3 liegt. Anders als bei anderen Modellen skalenfreier Netzwerke wie den hierarchischen Netzwerken ist in BA-Netzwerken der Clustering-Koeffizient, C(k), ist unabhängig von k und die durchschnittliche Weglänge folgt l

In diesem Zusammenhang haben wir nach den am stärksten verbundenen Knoten gesucht, um biologisch relevante Moleküle zu identifizieren. Die Analyse von Hubs bietet sehr interessante Informationen und sehr zum Nachdenken anregende Daten. Tatsächlich fanden wir zusammen mit Molekülen, die als ubiquitäre Zellbestandteile (wie im Fall von ATP) oder als Modulatoren der Spermienphysiologie (siehe zum Beispiel Ca 2+ ) bekannt sind, mehrere unerwartete Knoten. Sie stellen Moleküle dar, die spezifisch an Funktionen beteiligt sind, von denen angenommen wird, dass sie in Samenzellen nicht vorhanden oder nicht aktiv sind, wie z. B. die Kontrolle des Zellzyklus, der Proteinsynthese, des Zellkerntransports und der Immunantwort. In all diesen Fällen ist es sehr wichtig, diese Funktionen in Spermatozoen zu untersuchen, um die tatsächliche biologische Bedeutung dieses Ergebnisses zu überprüfen. Wie auch immer, diese Studie könnte zusammen mit anderen proteomischen Studien (siehe Referenz [7]) möglicherweise neue Perspektiven auf das Studium der Spermienbiologie eröffnen.

Bis heute sind sich nicht alle Forscher bei der Definition von Hubs einig und es gibt keine eindeutige Meinung über ihre topologischen und funktionalen Eigenschaften [22]. Wie auch immer, unsere Daten scheinen darauf hinzudeuten, dass es im Spermien-Interactome-Netzwerk möglich sein wird, Hubs zu unterscheiden, die an der Steuerung einer Vielzahl von Funktionen beteiligt sind, und Hubs, die der Steuerung einer bestimmten Funktion gewidmet sind. In Übereinstimmung mit Han et al. [23] analysierten wir die Clustering-Koeffizientenwerte der am stärksten verbundenen Knoten innerhalb des Netzwerks (der Hubs) und führten eine Schätzung der Kerneldichte durch. Als Ergebnis haben wir verschiedene Subpopulationen von Knoten identifiziert (siehe Zusätzliche Datei 3). Der größere zeichnet sich durch sehr niedrige Werte dieses Parameters aus, die von 0 bis etwa 0,17 reichen, während der andere kleiner ist und sein Clusterkoeffizient signifikant höher ist, von 0,83 bis 0,89. Es ist möglich zu spekulieren, dass die unterschiedliche Clusterbildung der Naben mit einer unterschiedlichen funktionellen Bedeutung des entsprechenden Moleküls in der Spermienphysiologie zusammenhängen könnte. Dieser Unterschied scheint mit der Hypothese von Han und Kollegen in Einklang zu stehen, die zwei verschiedene Arten von Hubs definiert haben, „Party-Hubs“, die mit den meisten ihrer Partner gleichzeitig interagieren [und die sich durch niedrigere Werte des Clustering-Koeffizienten auszeichnen], und 'Datum'-Hubs, die ihre verschiedenen Partner zu unterschiedlichen Zeiten oder Orten binden [und die höhere Werte des Clustering-Koeffizienten aufweisen]“ [23].

Der wichtigste (in Bezug auf den Knotengrad) wichtigste Parteiknotenpunkt ist hier beispielsweise ATP, das offensichtlich an unzähligen chemischen Reaktionen zu verschiedenen Zeiten und an subzellulären Orten beteiligt ist und sich somit als allgemeiner Knotenpunkt verhält. Als Energiesubstrat wird ATP in männlichen Keimzellen durch Glykolyse und mitochondriale oxidative Phosphorylierung produziert, die beiden Hauptstoffwechselwege, die in Spermatozoen exprimiert werden und in unterschiedlichen zellulären Unterkompartimenten lokalisiert sind: Die Glykolyse findet hauptsächlich in der Faserhülle des Flagellums statt, wo glykolytische Enzyme fest verankert, während die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien im Spermienmittelstück stattfindet [24]. Die bevorzugte Nutzung eines Weges ist stark speziesspezifisch [25].

Die zweite Subpopulation (Datumshubs) zeichnet sich durch eine geringe Clusterbildung und durch das Vorkommen von Mitgliedern der Interferonfamilie aus. In somatischen Zellen ist bekannt, dass Interferon an der Immunantwort beteiligt ist und in Gegenwart von Krankheitserregern wie Viren, Bakterien und Parasiten freigesetzt wird. Darüber hinaus aktiviert Interferon Immunzellen, wie zum Beispiel natürliche Killerzellen und Makrophagen, und ist in der Lage, die Wirtsabwehr durch Hochregulieren der Antigenpräsentation zu erhöhen. Seine Funktion in Spermatozoen ist wenig erforscht, und es gibt nur wenige Berichte über seine biologische Aktivität in reifen männlichen Keimzellen. Bei der Spermatogenese wurde vermutet, dass INF eine Schlüsselrolle spielen könnte, wie Hibi et al. [26] fanden heraus, dass die Gabe von α-IFN die testikuläre Spermatogenese verbessert und die Spermienkonzentration im Nebenhoden bei der Ratte erhöht. Interessanterweise fanden sie auch heraus, dass die progressive Motilität der Spermien durch die α-IFN-Behandlung nicht beeinflusst wurde, während die Serum-LH-Spiegel verringert und die Serum-Testosteron- und FSH-Spiegel signifikant erhöht waren. In jüngerer Zeit haben Satie et al. [27] verglichen einen für IFN_(Tg10) transgenen Mausstamm und einen Schwesterstamm, dem die IFNAR1-Untereinheit von IFNAR fehlt (Tg10-Ifnar1 _/_ ), beide Stämme exprimieren das Transgen im Hoden. Die Tg10-Mäuse, aber nicht die Doppelmutante Tg10-Ifnar1 _/_ , zeigte eine veränderte Spermatogenese. Die wichtigste IFNAR-abhängige histologische Veränderung war ein höherer Apoptoseindex in allen Keimzellkategorien, der 3 Wochen nach Beginn der IFN-Produktion am 20. reguliert in Tg10-Sertoli-Zellen und in Prepachyten-Keimzellen. Am Tag 60 waren die männlichen Tg10-Männer steril und die Sertoli-Zellen zeigten eine erhöhte Konzentration des Anti-Müller-Hormons und eine verringerte Produktion von Inhibin B. Basierend auf diesen Ergebnissen schlossen sie, dass die Typ-I-Interferon-Signalübertragung an der Ätiopathogenese männlicher idiopathischer Unfruchtbarkeit beteiligt sein könnte, indem sie die Wechselspiel zwischen Keimzellen und Sertolizellen.

Die Unterscheidung zwischen Date- und Party-Hubs könnte für die Entwicklung von Medikamenten oder Diagnosewerkzeugen in der klinischen Andrologie wichtig sein [28].

Eine zweite Klasse von Knoten, die eine starke Kontrolle ausüben, sind Engpässe, die hauptsächlich an der Kontrolle des Informationsflusses innerhalb des Netzwerks beteiligt sind. Bei den Hubs stellen mehrere Moleküle, von denen bekannt ist, dass sie an der Physiologie der Spermien beteiligt sind, die Engpässe dar (siehe Zusätzliche Dateien 1 und 2). Interessanterweise sind in Engpässen im Vergleich zu Hubs weniger Proteine ​​(28 bzw. 59) und stärker repräsentierte Reaktionen (81 bzw Ergebnisse der KO-Mäuse-Analyse).

Um die Zuverlässigkeit unserer theoretischen Daten zu beurteilen, haben wir die Ergebnisse der Analyse der reproduktiven Phänotypen von KO-Mäusen ausgewertet. Mit anderen Worten, wir verglichen die Daten zu HSIN3.0_MC-Hubs und -Engpässen nach Entfernung entsprechender Gene und deren Auswirkungen auf die Fertilität. Es ist sehr interessant, dass wir festgestellt haben, dass sich der Prozentsatz der Häufigkeit von Fruchtbarkeitsphänotypen in Hubs und in Non-Hubs-Knoten nicht signifikant unterschied (P = 0,21991) (siehe Tabelle 3), während die Deletion von Genen, die für das Flaschenhalsprotein kodieren, in 100 % der Fälle zu Unfruchtbarkeit führte.

Dieser Befund lässt uns schlussfolgern, dass in unserem Netzwerk die Engpässe eine wichtigere Rolle spielen als die Hubs. Der Grund für diese unterschiedliche biologische Funktion liegt in der spezifischen Topologie des Netzwerks. Tatsächlich besteht HSIN3.0_MC aus direkten Verbindungen (es ist die Vereinigung mehrerer Pfade), sodass es als Regulierungsnetzwerk betrachtet werden könnte. Wie von Yu et al. [29] In diesem Fall sind die Engpässe wichtiger als Hubs, während in Interaktionsnetzwerken die Hubs der Hauptcontroller der Netzwerke sind.

Offensichtlich hat dieses Experiment aufgrund der geringen Anzahl von Engpässen, der artspezifischen Unterschiede und der Unmöglichkeit, Nicht-Protein-Knoten zu testen, wichtige Einschränkungen. Wie auch immer, dieser Befund könnte unserer Meinung nach wichtige Implikationen haben, da er den Funktionsunterschied zwischen regulatorischen und Interaktionsnetzwerken bestätigt und aus einer allgemeineren Sicht die Erforschung einer komplexen biologischen Funktion mithilfe eines in silico ( Netzwerk)-in vivo (KO-Mäuse) durch Kontrolle ihrer Komplexität [30].

Nachdem wir die Hubs und die Engpässe in HSIN3.0_MC identifiziert hatten, berechneten wir mit der Funktion „Schnittpunkt“ von Advanced Network Merge (im Cytoscape-Tools-Menü) den Schnittpunkt des Netzwerks der meisten Hubs mit dem des Engpasses, die beide mit cytoHubba erhalten wurden. Auf diese Weise erhielten wir das Netzwerk (Human Sperm Interactome Control Network, HSICN, siehe Abb. 3), das das Rückgrat des Kontrollmechanismus darstellt, der an der Physiologie der Spermien beteiligt ist. Seine Analyse hob die Idee hervor, dass einige der Knoten als Controller des gesamten Netzwerks fungieren, was die Ableitung von zwei wichtigen biologischen Implikationen ermöglicht. Als erstes haben wir gezeigt, dass es möglich ist, eine Karte der Kontrollmechanismen der männlichen Gametenfunktion mit enormen Anwendungsmöglichkeiten in der Untersuchung der Physiologie und Pathologie der Spermien zu erstellen. In einigen Fällen handelt es sich bei den Kontrollmolekülen um Moleküle, die in Spermatozoen nur schlecht oder gar nicht untersucht wurden. Dies könnte einerseits die Unfähigkeit einer ätiologischen Diagnose bei einer großen Zahl von Patienten erklären (ungeklärte Unfruchtbarkeit männlichen Ursprungs) und andererseits mehrere neue Ziele für neue Studien vorschlagen.

HSICN. Die Netzwerke wurden mit dem Cytoscape Prefuse Force Directed Layout räumlich dargestellt. Dieses Programm "basiert auf einem "kraftgerichteten" Paradigma. Netzwerkknoten werden wie physikalische Objekte behandelt, die sich gegenseitig abstoßen, wie z. B. Elektronen. Die Verbindungen zwischen den Knoten werden wie Metallfedern behandelt, die an dem Knotenpaar befestigt sind. Diese Federn stoßen oder ziehen ihre Endpunkte gemäß der funktionalen Kraftfunktion an. Der Layoutalgorithmus setzt die Positionen der Knoten so, dass die Summe der Kräfte im Netzwerk minimiert wird "(Cytoscape 3.4.0 User Manual http://manual.cytoscape.org/ de/stable/index.html)). Der Knotendurchmesser ist direkt proportional zum Knotengrad und der Knotenfarbverlauf war abhängig vom Clustering-Koeffizienten, von Rot (höher) bis Grün (niedriger)

Immer noch mit Blick auf die Mechanismen, die in der führenden Spermienphysiologie aktiv sind, sind die Ergebnisse der mit Uniprot durchgeführten Analyse der Proteineigenschaften sehr interessant. Als Suchparameter haben wir Faktoren verwendet, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie an der Physiologie und Biochemie der Spermien beteiligt sind, um die regulatorischen Knoten innerhalb des Netzwerks zu definieren. Wir fanden heraus, dass das in HSIN3.0_MC vorhandene Protein durch Metallbindung (12,3%), Calciumbindung (2,12%), pH (1,29%) und Temperatur (0,32%) reguliert wird (siehe Zusätzliche Dateien 4, 5, 6 und 7 ) (wir haben die von Uniprot angegebenen Prozentsätze gemeldet, die unterschätzt werden).

Metallbindung und Calciumbindung

Es ist bekannt, dass die biochemische Maschinerie der Spermatozoen unter der Kontrolle von Metallionen steht. Hier fanden wir, dass Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ und Fe 2+ Naben von HSIN3.0_MC mit 41, 37, 21 und 14 Gliedern sind. Dieses Datum ist sehr interessant angesichts der Anwesenheit von Metallen im Eileiter (entweder unter physiologischen Bedingungen oder als Reaktion auf neuroendokrine Signale). So ist beispielsweise bekannt, dass die Konzentrationen von Ca 2+ in der Eileiterflüssigkeit von Säugetieren unmittelbar vor dem Eisprung hormonell gesteuert werden und an der Modulation der Homöostase und der Hyperaktivierung der Spermienmotilität beteiligt sind [31], sowie Ca 2+ Schlüsselelement der Spermienkapazität und Akrosomenreaktion [13, 16]. Tatsächlich werden Spermatozoen als erregbare Zellen, wie Neuronen, klassifiziert, d. h. als Zellen, deren biologische Funktion innig von Calcium abhängt.

Darüber hinaus wurde Zink in einer Vielzahl von Experimenten an verschiedenen Säugetier- und Nicht-Säugermodellen untersucht. In der Andrologie des Menschen wurde festgestellt, dass die Zinkkonzentration im Samenplasma negativ mit männlicher Unfruchtbarkeit assoziiert ist [32] und es wurde vorgeschlagen, dass seine vorteilhafte Aktivität auf seine antioxidativen Eigenschaften zurückzuführen ist [33,34,35]. Darüber hinaus ist bekannt, dass dieses Ion mit mehreren Enzymen wie Acrosin interagiert und so deren Funktion moduliert.

pH: ist der intrazelluläre pH-Wert der Spermien ein wichtiger Kontroller der Zellfunktion. Wie es kürzlich überprüft wurde, ist es „wesentlich für die Funktion der Spermien. Bemerkenswerterweise sind mehrere einzigartige Spermien-Ionentransporter und Enzyme, deren Eliminierung Unfruchtbarkeit verursacht, entweder pHi-abhängig oder irgendwie mit pH . verwandtich Regulierung“ [36]. Insbesondere die Moleküle, die an pH . beteiligt sindich Kontrolle sind CatSper, ein Ca 2+ -Kanal Slo, ein K + -Kanal, der spermienspezifische Na + /H + -Austauscher und die lösliche Adenylylcyclase, und sind in grundlegenden Spermienfunktionen wie Motilität, Kapazitation und Akrosomreaktion aktiv.

Temperatur

Die Spermien erfahren während ihrer Reise durch den weiblichen Genitaltrakt ortsspezifische Unterschiede in der Umgebungstemperatur, die einen Temperaturgradienten verursachen. Bisher liegen keine Daten zur Temperatur im menschlichen Eileiter vor, während in Säugetiermodellen (insbesondere bei Kaninchen und Sauen) festgestellt wurde, dass die Befruchtungsstelle im Eileiter 1–2 °C wärmer ist als das Spermienreservoir [37] . Bei Kaninchen wurde gezeigt, dass dieser Temperaturunterschied zeitabhängig ist und von 0,8 ± 0,2 °C vor dem Eisprung auf 1,6 ± 0,1 °C nach dem Eisprung ansteigt [38].

Die an diesem Phänomen beteiligten Mechanismen sind noch nicht vollständig verstanden, es wurden jedoch drei verschiedene Determinanten vorgeschlagen:

Die hormonabhängige Freisetzung eines Makromoleküls, des sauren Schleimglykoproteins, das einer umfangreichen endothermen Hydratation unterliegt [39]

Der Gegenstrom-Wärmeaustausch von Blut: Das kalte Blut aus der Ovarialvene kühlt das Blut, das zum Eileiter geleitet wird (wie es beim Plexus pampiniformis testicularis geschieht) [40]

Die Veränderung der Blutversorgungsquelle: die wärmere Ovarialarterie vor dem Eisprung und die kühlere Uterusarterie nach dem Eisprung [41].

Interessanterweise sind die spezifischen Signalwege, die an der Thermotaxie von Spermatozoen beteiligt sind, bis heute unbekannt, obwohl verstanden wurde, dass dieser Nachweis kapazitationsabhängig ist: Nur kapazitive Spermatozoen sind thermotaktisch ansprechbar [37].


DNA-Fragmentierung in menschlichen Spermien nach magnetisch aktivierter Zellsortierung

Da die Befruchtung mit unselektierten apoptotischen Spermatozoen zu Misserfolgen bei Techniken der assistierten Reproduktion beitragen kann, ist es wichtig geworden, diese Art von Spermien zu entfernen, um die Erfolgsraten zu erhöhen. Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) ist eine Spermienaufbereitungstechnik, die nicht-apoptotische Spermien basierend auf der Expression von Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Spermien isoliert. Daher wollten wir beurteilen, ob es eine signifikante Abnahme der Spermien-DNA-Fragmentierung (sDNAfrag) gab und welches Protokoll am effizientesten war.

Methoden

Hundert Samenproben wurden in fünf verschiedene Gruppen eingeteilt und gemäß einer Kombination von MACS mit Dichtegradientenzentrifugation (DGC) und Swim-up (SU)-Techniken verarbeitet.Die Spermien-DNA-Fragmentierung wurde durch einen terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase-dUTP-Nick-End-Markierungs-(TUNEL)-Assay bewertet.

Ergebnisse

Die Gruppen DGC-SU (73,4 %), DGC-MACS-SU (78,9 %), DGC-SU-MACS (53,8 %) und MACS-SU (73,5 %) zeigten eine signifikante Abnahme von sDNAfrag, aber die höchste Reduktionsrate wurde mit MACS-DGC-SU (83,3 %). Letztere korrelierte auch negativ mit der Vitalität der Spermien, der Membranintegrität und der fortschreitenden Motilität. Darüber hinaus zeigten teratozoospermische Patienten eine Tendenz zu niedrigeren sDNAfrag-Reduktionsraten als asthenozoospermische und asthenoteratozoospermische Patienten.

Schlussfolgerungen

Basierend auf den Ergebnissen zeigte MACS Potenzial zur Optimierung der sDNAfrag-Reduktionsrate bei Anwendung auf Rohsamen vor DGC und SU, insbesondere bei Proben mit niedrigen Werten für progressive Motilität, Vitalität und hypoosmotische Schwellung.


Diskussion

Wir haben zuvor festgestellt, dass Spermien, die für PRM1 oder PRM2 nicht ausreichend sind, keine Nachkommen hervorbringen. DNA wurde aus den Kernen von PRM1- oder PRM2-defizienten Spermien in SDS-Lyse-Puffer in Abwesenheit eines Reduktionsmittels freigesetzt, während die Spaltung der Disulfidbindung notwendig war, um DNA aus den Kernen von Wildtyp-Spermien freizusetzen [2]. Es wird angenommen, dass Protamine das Spermienchromatin stabilisieren, indem sie sich in der kleinen Furche der DNA zu dicht gepackten Anordnungen zusammenfügen, die durch intermolekulare und intramolekulare Disulfidbindungen verbunden sind. Darüber hinaus sind 1) Protaminmangel mit Unfruchtbarkeit bei Männern assoziiert [ 5, 6, 12], 2) die Häufigkeit von menschlichen Spermien mit DNA-Schäden korreliert mit dem Versagen der Embryonalentwicklung nach ICSI [ 7], 3) induzierte Schädigung der Spermien-DNA durch väterliche Cyclophosphamid-Exposition führte bei Ratten zu einem Verlust von mehr als 80 % der periimplantären Nachkommen [ 13] und 4) der Prozentsatz der Blastozysten, die sich aus Mäusespermien entwickelten, die einer zunehmenden Menge an Gammastrahlung ausgesetzt waren, nahm mit zunehmendem Grad der DNA-Schädigung ab [ 14]. Diese Beobachtung führte uns zu der Hypothese, dass das Versagen von Chimären, den 129-Genotyp auf Nachkommen zu übertragen, darauf zurückzuführen ist, dass eine Haploinsuffizienz von Protaminen zu einer Veränderung der Organisation und Integrität der Spermien-DNA führt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stützen diese Hypothese.

Beobachtungen auf lichtmikroskopischer Ebene deuteten darauf hin, dass einige Spermien mit Protaminmangel abnormal geformte Köpfe hatten [2]. Durch die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie fanden wir die Häufigkeit von Spermien mit kleinen oder abnormal geformten Köpfen, die lose von der Plasmamembran umschlossen waren, mit dem Prozentsatz an PRM2-defizienten Spermien korreliert. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass das Chromatin in PRM2-defizienten Spermien weniger kompakt war als das Chromatin in Spermien von Wildtyp-Mäusen und ähnlich dem kondensierenden Chromatin in spätelongierenden Spermatiden. Diese Unterschiede könnten auf strukturelle Veränderungen zurückzuführen sein, die aus dem reduzierten PRM2-Spiegel resultieren, da angenommen wird, dass die positiv geladenen Arginingruppen der Protamine die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA neutralisieren [ 15, 16]. Daher würde eine Verringerung der Protaminmenge nicht nur die Stöchiometrie der Hauptkomponenten des Chromatins ändern, sondern auch die Nettoladung im Spermienkern, wodurch die Chromatinkondensation und -stabilität beeinträchtigt würde.

Zusammen mit anderen Studien betrachtet, geben unsere Ergebnisse Einblicke in den Zusammenhang zwischen PRM2-Mangel und Entwicklungsversagen nach ICSI. Die minimale Voraussetzung für ein funktionsfähiges väterliches Genom zur Teilnahme an der Embryogenese ist bis heute der Spermienkern mit einer strukturell intakten Kernmatrix. Samenkerne, die von zytoplasmatischen Komponenten befreit und für ICSI verwendet wurden, produzierten Embryonen, die sich zu lebenden Nachkommen entwickelten [17]. Die Behandlung mit einer Protease oder einem Disulfidbrücken-reduzierenden Mittel vor der ICSI führte jedoch zu einem Entwicklungsversagen [18]. Wir haben zuvor festgestellt, dass Spermien mit PRM2-Mangel unbeweglich sind [2]. Eine eingeschränkte Spermienmotilität könnte auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Spermien zurückzuführen sein, was zu einer Verschlechterung des Chromatins führt. In der vorliegenden Studie wurden Spermien vor der ICSI mild beschallt, um Kopf und Schwanz zu trennen. Es ist möglich, dass die Beschallung die veränderte Chromatinintegrität von PRM2-defizienten Spermien zusätzlich schädigt. Daher könnte das Entwicklungsversagen einiger Eizellen, in die PRM2-defiziente Spermien injiziert wurden, ein indirekter Effekt aufgrund von Schäden sein, die in toten Spermien vorhanden sind und/oder durch Beschallung induziert werden. Nichtsdestotrotz deuten die abweichende Kernform und die reduzierte Chromatindichte von PRM2-defizienten Spermien stark darauf hin, dass die strukturelle Integrität dieser Kerne beeinträchtigt wurde, was zum Versagen der Embryonalentwicklung führt.

In Spermien von Mäusen mit heterozygoten Mutationen in . wurde eine unvollständige Verarbeitung von PRM2 beobachtet Prm1 und Prm2 [2] und wird häufig bei Veränderungen des PRM1- oder PRM2-Spiegels oder anderer nuklearer Komponenten beobachtet. Dies wurde in Spermien von Mäusen mit Null-Mutationen in . beobachtet Tp1 [ 19], Tp2 [ 20], und Camk4 [ 21, 22] mit Unterdrückung von Prm1 Translation in MSY4 Gain-of-Function-transgenen Mäusen [ 23] mit vorzeitiger Translation von PRM1 in transgenen Mäusen [ 24] und in Spermien unfruchtbarer Männer [ 6, 25]. Obwohl in einigen dieser Studien Unfruchtbarkeit auftrat [23, 24], wurde sie in anderen nicht beobachtet [19–21], was darauf hindeutet, dass eine unvollständige Verarbeitung von PRM-2 keine Hauptursache für ein Entwicklungsversagen nach ICSI mit PRM2-Mangel ist Sperma.

Die bei Mäusen mit heterozygoten Mutationen in beobachteten Defekte in der Kondensation von Spermienchromatin Prm1 und Prm2 [2] trat auch auf, wenn ein Transgen-exprimierendes aviäres Protamin in Spermatiden exprimiert wurde [ 26] in Nullmutationen von Tp1 [ 19], Tp2 [ 20], und Csnk2a2 [ 27] mit Unterdrückung von Prm1 Translation in transgenen MSY4-Gain-of-Function-Mäusen [ 23] und in Spermien einiger unfruchtbarer Männer [ 28]. Da nur in einigen Studien, die eine unvollständige DNA-Kondensation beobachteten, Unfruchtbarkeit beobachtet wurde [ 2, 23], könnte eine fehlerhafte Chromatinkondensation allein nicht ausreichen, um eine Beteiligung des männlichen Genoms an der Entwicklung zu verhindern. Schwerwiegendere Defekte bei der Chromatinkondensation, die eine Zerstörung der Kernmatrix einschließen, könnten jedoch einen Einfluss auf die DNA-Integrität haben.

PRM2 macht 0% bis fast 80% des gesamten Protamins in Spermien verschiedener Säugetierarten aus, was darauf hindeutet, dass PRM1, PRM2 und DNA interagieren, um in verschiedenen Arten Komplexe mit erheblich unterschiedlichen Stöchiometrien zu bilden [1]. Obwohl die DNA von Säugerspermien in toroidale Untereinheiten verpackt ist, die wesentlich größer sind als Nukleosomen [ 29] , interagieren Protamine nicht in konsistenter Weise miteinander und ihre Bindung an DNA ist sequenzunabhängig [ 1]. Für eine bestimmte Spezies weist der Zusammenbau von Protamin und DNA zu Komplexen jedoch wahrscheinlich genaue Stöchiometrien auf. Spermatiden in Mäusen können zwar die Überexpression von PRM1 [ 30] und die Expression von hohen Spiegeln von aviärem Protamin [ 26] kompensieren, sie können jedoch die Verringerung der PRM1- oder PRM2-Menge nicht kompensieren [ 2, 21, 23]. Dies legt nahe, dass die Sollwerte für die Expression von PRM1 und PRM2 nahe dem Minimum liegen, das für die Komplexbildung und den DNA-Schutz erforderlich ist.

PRM2-defiziente Spermien haben eine reduzierte Menge an PRM1, was darauf hindeutet, dass PRM1 die normale Menge an PRM2 benötigt, um in das Spermienchromatin aufgenommen zu werden. Obwohl der Mechanismus, der für die DNA-Schädigung in PRM1/PRM2-defizienten Spermien verantwortlich ist, noch geklärt werden muss, halten wir ein Szenario für wahrscheinlich, dass eine Haploinsuffizienz von PRM2 die Stöchiometrien der Komplexbildung durch die Hauptkomponenten des Chromatins stört. Dies führt zu einer unvollständigen Chromatinkondensation, wodurch die strukturelle Integrität der Kernmatrix beeinträchtigt wird. Dieser Zustand wird durch eine Abnahme der Bildung von Disulfidbindungen aufgrund der reduzierten Menge an PRM1 und PRM2 verschlimmert. Als Ergebnis dieser Veränderungen ist die DNA sehr anfällig für Schäden im Fortpflanzungstrakt durch Bedingungen, die von Spermien mit einem vollständigen Komplement nuklearer Komponenten toleriert werden können, aber nicht von PRM1/PRM2-defizienten Spermien.

Zusammenfassend stellten wir fest, dass 1) der Prozentsatz an Spermien mit beschädigter DNA, der mit dem Comet-Assay beobachtet wurde, 2) die Häufigkeit von Spermien mit anormal geformten Köpfen, die durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurden, 3) und der Prozentsatz der in Metaphase II festgenommenen Mäuseeier, die versagten bis zum Blastozystenstadium nach ICSI zu entwickeln, waren vergleichbar mit dem Prozentsatz an PRM2-defizienten Spermien in den analysierten Proben. Obwohl ähnliche Ergebnisse in anderen Studien einzeln beobachtet wurden, glauben wir, dass dies die erste Studie ist, die ein Tiermodell verwendet, um zu zeigen, dass sie zusammen auftreten. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass eine moderate Verringerung des Protaminspiegels in Spermien zu einer DNA-Schädigung führt, die mit der Übertragung des männlichen Genoms auf die nächste Generation nicht vereinbar ist.


Forscher verwenden Drohnen, um Wale zu wiegen

Durch die Messung der Körperlänge, -breite und -höhe freilebender Südkaper, die von Drohnen fotografiert wurden, konnten die Forscher ein Modell entwickeln, das das Körpervolumen und die Körpermasse der Wale genau berechnete.

Aufgrund ihrer Größe und ihres Lebens im Wasser war es bisher die einzige Möglichkeit, Daten über die Körpermasse von Walen zu erhalten, indem man tote oder gestrandete Individuen wiegte.

Mit der innovativen Methode kann man mehr über die Physiologie und Ökologie von Walen erfahren. „Die Kenntnis der Körpermasse freilebender Wale eröffnet neue Wege der Forschung Ihre Körpermasse nimmt mit der Zeit zu und der Energiebedarf für das Wachstum. Wir werden auch den täglichen Energiebedarf von Walen betrachten und berechnen können, wie viel Beute sie verbrauchen müssen.“ sagte Assistant Professor Fredrik Christiansen vom Aarhus Institute of Advanced Studies in Dänemark und Hauptautor der Studie.

Dr. Michael Moore, Senior Scientist an der Woods Hole Oceanographic Institution und Co-Autor, sagte: „Gewichtsmessungen lebender Wale auf See informieren darüber, wie sich chronische Stressoren auf ihr Überleben und ihre Fruchtbarkeit auswirken und ermöglichen eine genaue Beruhigungsdosierung von Tieren, die in der Fischerei verwickelt sind Ausrüstung, die Entflechtungsversuchen abgeneigt ist."

Das Modell wird bereits verwendet, um die Auswirkungen der Belästigung durch Seetangmöwen auf die Gesundheit und das Überleben von südlichen Glattwalkälbern zu bewerten. Dr. Mariano Sironi und Dr. Marcela Uhart vom Southern Right Whale Health Monitoring Program und Co-Autoren betonten: „Der Einsatz von Drohnen zur Schätzung von Gewicht und Zustand von Walen sowie zur individuellen Verfolgung von Kälbern, während sie neben ihren Müttern wachsen, hat war ein echter Durchbruch in unserer Untersuchung."

"In der Vergangenheit mussten wir uns ausschließlich auf gestrandete Kadaver verlassen, was unsere Studien um alle möglichen Unsicherheiten erweitert hat."

Das Modell ermöglichte es den Forschern auch, mit dem Digital Life Project der University of Massachusetts, USA, zusammenzuarbeiten, um zunächst ein 3D-Netz des Wals nachzubilden, und dann mit dem CG-Künstler Robert Gutierrez zusammenzuarbeiten, um das vollfarbige 3D-Modell des rechten Bildes nachzubilden Wal. Diese Modelle können sowohl für wissenschaftliche Zwecke, wie zum Beispiel Bewegungsstudien, als auch für pädagogische Zwecke verwendet werden.

Durch die Anpassung der Parameter des Modells könnte der Ansatz verwendet werden, um die Größe anderer Meeressäuger zu schätzen, wenn alternative, invasivere Methoden nicht durchführbar oder wünschenswert sind.

Bartenwale, zu denen Arten wie der Blauwal gehören, sind die größten Tiere auf diesem Planeten, wobei die Körpermasse für ihren Erfolg als Tiergruppe von zentraler Bedeutung ist. Daten zu ihrer Größe waren jedoch in der Vergangenheit auf tote Exemplare beschränkt, wobei die meisten Proben aus Walfangaktivitäten, versehentlichem Beifang in der Fischerei oder Strandungen am Strand stammen.

Das Sammeln von Daten über tote Wale hat Einschränkungen, wie z. B. die Unfähigkeit, Längsschnittdaten über die Lebensspanne eines Wals zu sammeln, und Ungenauigkeiten aufgrund der physischen Verformung von Kadavern, die durch Blähungen und Deflation verursacht werden.

Assistenzprofessor Christiansen erklärte: „Die Schwierigkeit, die Körpermasse bei freilebenden Walen zuverlässig zu messen, hat die Einbeziehung der Körpermasse in viele Studien in Ökologie, Physiologie und Bioenergetik verhindert. Dieser neuartige Ansatz wird es nun ermöglichen, diese zentrale Variable endlich einzubeziehen.“ in zukünftige Studien über freilebende Wale."

Um das Körpervolumen und die Masse von Südkapern zu berechnen, machten die Forscher zunächst Luftaufnahmen von 86 Individuen vor der Küste von Península Valdés, Argentinien. Das klare Wasser und die große Anzahl von Walen, die sich hier jeden Winter zum Brüten versammeln, machten es zu einem idealen Ort, um qualitativ hochwertige Bilder sowohl der Rücken- als auch der Seitenwände der Wale zu sammeln. Aus diesen konnten sie Längen-, Breiten- und Höhenmaße erhalten.

Diese Messungen könnten dann verwendet werden, um die Körperform und das Volumen der Wale genau zu modellieren. „Wir haben dieses Modell verwendet, um das Körpervolumen von Walen zu schätzen, die bei wissenschaftlichen Walfangoperationen gefangen wurden, für die Körperumfang und -masse bekannt waren. Aus diesen Schätzungen des Körpervolumens konnten wir dann die Dichte der Wale berechnen, die wir wiederum verwenden konnten um die Masse frei lebender Wale abzuschätzen, die von unseren Drohnen fotografiert werden." sagte Christiansen.

Obwohl das Modell Körpermasseschätzungen mit hoher Genauigkeit lieferte, gab es aufgrund des relativen Anteils unterschiedlicher Gewebe bei Bartenwalen einige Einschränkungen. Christiansen sagte: "Wir mussten von einer konstanten Körperdichte der Wale ausgehen, was nicht realistisch ist, da sich der Anteil verschiedener Körpergewebe (Fett, Muskeln usw.) saisonal ändert, wenn sich die Wale ablagern oder ihre Körperkondition verlieren."


Ergebnisse

Alle Samenproben waren bei der ersten Auswertung (nach 3–4 Tagen Abstinenz) normozoospermisch (Konzentration > 15 x 10 6 Spermien/ml, progressive Motilität > 32 %, Vitalität > 58 % und Normalformen > 4 %).

Wie erwartet wurde das Samenvolumen während der DE-Periode reduziert. In ähnlicher Weise war auch die Gesamtzahl der Spermatozoen pro Ejakulat im Vergleich zur anfänglichen Bewertung reduziert (p <0,05). Diese Beobachtungen zeigten sich bereits an Tag 2. Interessanterweise unterschied sich die Spermienkonzentration, Motilität, progressive Motilität und Morphologie während der gesamten DE-Periode nicht signifikant von der ersten Bewertung, wie in Tabelle 1 zu sehen ist. Es wurde jedoch eine große intraindividuelle Variation beobachtet in jedem dieser Parameter. Bemerkenswert sind die subtilen Veränderungen der Motilität und der Lebensfähigkeit der Spermien, wobei die Zahl der lebensfähigen Spermien am Tag 13 des Experiments im Vergleich zur anfänglichen Bewertung tatsächlich zugenommen hat (69,8 ± 5,6 % vs. 60,2 ± 3,1 %, p < 0,05). Alle diese Basisparameter blieben darüber hinaus während des gesamten DE-Zeitraums über den WHO-Referenzwerten von 2010, mit Ausnahme der Lebensfähigkeit am Tag 4 (53,7 ± 7,4 %), die unter den Referenzwert von 58 % sank (siehe Tabelle 1).

Keiner der funktionellen Parameter wurde durch zwei Wochen DE signifikant beeinflusst. Die Integrität der Spermienplasmamembran (über ≈ 50 % lebensfähige Zellen) und MMP blieben während des gesamten Zeitraums stabil. Der Prozentsatz der DNA-Fragmentierung unterschied sich nicht signifikant von der anfänglichen Messung. DFI blieb innerhalb akzeptabler Werte (<29 %). In Bezug auf die Produktion von intrazellulärem ROS wurde im Laufe der Zeit ein Rückgang beobachtet (statistisch nicht signifikant). Die intra- und interindividuelle Variation sowohl des konventionellen als auch des funktionellen Samenparameters über die DE-Periode sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt. 1 und 2.

Die intra- und interindividuelle Variation der konventionellen Spermienparameter. Verteilung konventioneller Parameter (Samenvolumen, Spermienkonzentration, Motilität und Lebensfähigkeit) während des Auswertungszeitraums der täglichen häufigen Ejakulation. n = 6 Individuen (A-F) für jeden Parameter

Die intra- und interindividuelle Variation der funktionellen Spermienparameter. Verteilung funktioneller Parameter (DNA-Fragmentierungsindex, mitochondriales Membranpotential, Plasmamembranintegrität, reaktive Sauerstoffspezies) während der täglichen Ejakulationsphase. n = 6 Individuen (A-F) für jeden Parameter (DFI: DNA Fragmentation Index, MMP: Mitochondrial Membrane Potential, Membranintegrity Percent, and the production of intracellular ROS: Reactive Oxygen Species)


Kryokonservierung menschlicher Spermien: Update zu Techniken, Auswirkungen auf die DNA-Integrität und Implikationen für ART

Die Kryokonservierung von menschlichen Spermatozoen – eingeführt in den 1960er Jahren – wurde als effizientes Verfahren zur Behandlung der männlichen Fertilität vor der Therapie bösartiger Erkrankungen, Vasektomie oder chirurgischen Unfruchtbarkeitsbehandlungen, zur Aufbewahrung von Spender- und Partnerspermatozoen vor Behandlungen der assistierten Reproduktion und zur Sicherstellung der Wiederherstellung von eine kleine Anzahl von Spermatozoen bei schwerer männlicher Unfruchtbarkeit. Trotz ihrer Nützlichkeit kann die Kryokonservierung zu schädlichen Veränderungen der Spermienstruktur und -funktion führen: Während die Auswirkungen der Kryokonservierung auf Zellen gut dokumentiert sind, gibt es in der Literatur bisher keine Einigkeit darüber, ob die Kryokonservierung die Integrität des Spermienchromatins oder die Verwendung eines einzigartigen und funktionellen Protokolls für das Einfrieren-Auftauen-Verfahren. Daher ist die Kryokonservierung von Spermien ein wichtiger Bestandteil des Fertilitätsmanagements und ein Großteil ihrer erfolgreichen Anwendung scheint das Fortpflanzungsergebnis von Technologien der assistierten Reproduktion (ART) zu beeinflussen: Die angemessene Verwendung von Kryoprotektiva vor und Spermienselektionstechnologien nach der Kryokonservierung scheint den größten Einfluss auf die Prävention zu haben DNA-Fragmentierung, wodurch die Kryo-Überlebensraten von Spermien verbessert werden.

1. Einleitung

Das Verfahren, das es ermöglicht, die Zellen bei kryogenen Temperaturen zu stabilisieren, wird Kryokonservierung genannt, auch bekannt als ein angewandter Aspekt der Kryobiologie oder der Erforschung des Lebens bei niedrigen Temperaturen. Viele Fortschritte in der Kryokonservierungstechnologie haben zur Entwicklung von Methoden geführt, die eine Niedertemperaturhaltung einer Vielzahl von Zelltypen ermöglichen, darunter männliche und weibliche Gameten, kleine mehrzellige Organismen und noch komplexere Organismen wie Embryonen. Die Kryokonservierung menschlicher Spermien – eingeführt in den 1960er Jahren [1] – hat viele räumliche und zeitliche Beschränkungen überwunden und ist heute integraler Bestandteil der assistierten Reproduktionstechnologien (ARTs).

Diese Technik wird besonders wichtig, wenn die männliche Fertilität vor einer Strahlen- oder Chemotherapie erhalten bleibt [2], was zu Hodenversagen oder Ejakulationsstörungen führen kann. Tatsächlich scheint die Kryolagerung des Samens die einzige bewährte Methode zu sein, die diesen Paaren eine Chance auf zukünftige Kinder geben könnte: Eine Krebstherapie könnte tatsächlich zu Schäden führen, die zu Subfertilität oder Sterilität aufgrund von Gonadenentfernung oder dauerhaften Schäden an Keimzellen führen können durch adjuvante Therapie verursacht. Das Therapierisiko hängt insbesondere von mehreren Faktoren ab: dem Alter des Patienten zum Zeitpunkt der Behandlung, der Dosis, dem Ort und der Art der Behandlung [3]. Auch einige nicht bösartige Erkrankungen wie Diabetes und Autoimmunerkrankungen können zu Hodenschäden führen. Auch unter diesen Bedingungen ist eine Kryokonservierung ratsam [4]. In Ländern, in denen eine heterologe Befruchtung gesetzlich erlaubt ist, und in Programmen zur Spenderinsemination ist eine Kryokonservierung notwendig, um genügend Zeit zu haben, um Spender auf Infektionserreger wie Humane Immunschwäche (HIV) und Hepatitis-B-Viren zu untersuchen, bevor der kryokonservierte Samen für die klinische Verwendung verwendet wird Zwecke [5]. Bei azoospermischen Patienten, die sich einer testikulären Spermienextraktion oder einer perkutanen epididymalen Spermienaspiration unterzogen haben, wird auch eine Kryolagerung von Spermien verwendet, um wiederholte Biopsien oder Aspirationen zu vermeiden [6]. Darüber hinaus wird die Kryokonservierung routinemäßig bei Patienten durchgeführt, die – die eine Behandlung der assistierten Reproduktion beginnen müssen – beschließen, die Samenprobe präventiv einzufrieren, um Unannehmlichkeiten aufgrund einer fehlgeschlagenen Ejakulation zu vermeiden, die oft mit „Samenentnahmestress“, bestimmten emotionalen Zuständen oder anderen Verpflichtungen bei der Behandlung verbunden sind Zeitpunkt der Eizellentnahme [7]. Schließlich wird das Einfrieren männlicher Gameten weitgehend empfohlen, um die Fertilität bei Patienten zu erhalten, die – aus dem einen oder anderen Grund – potenziell toxischen Substanzen ausgesetzt sind, die die Gametogenese beeinträchtigen können [7].

2.Techniken für die Kryokonservierung

Bei der Kryokonservierung von Spermien werden hauptsächlich zwei konventionelle Einfriertechniken verwendet: langsames Einfrieren und schnelles Einfrieren

2.1. Langsames Einfrieren

Die von Behrman und Sawada [8] vorgeschlagene Slow-Freezing-Technik besteht aus einer progressiven Spermienkühlung über einen Zeitraum von 2–4 h in zwei oder drei Schritten, entweder manuell oder automatisch mit einem semiprogrammierbaren Gefrierschrank.

Die manuelle Methode wird durchgeführt, indem gleichzeitig die Temperatur des Samens gesenkt wird, während schrittweise ein Kryoprotektivum zugegeben wird und die Proben in flüssigen Stickstoff getaucht werden [9]. Es hat sich gezeigt, dass die optimale anfängliche Abkühlrate der Probe von Raumtemperatur auf 5 °C 0,5–1 °C/min beträgt [10]. Die Probe wird dann von 5 °C auf –80 °C mit einer Geschwindigkeit von 1–10 °C/min eingefroren. Anschließend wird die Probe bei −196°C in flüssigen Stickstoff getaucht [11].

Trotz Berichten über erfolgreiches Einfrieren von Spermien mit manuellen Techniken kann die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens einige Probleme aufwerfen. Aus diesem Grund wurden programmierbare Gefriergeräte untersucht [12]. Die Gefriergeräte verwenden eine Platte, um die Strohhalme zu halten. Diese werden durch flüssigen Stickstoff gekühlt, der in einem Vorratstank unter der Platte aufbewahrt wird. Flüssiger Stickstoff wird in den Tank gegossen, und die Maschine, sobald sie programmiert ist, verwendet die Software-Datenprotokollierung, um eine Abkühlung von 20 °C auf -80 °C mit einer Geschwindigkeit von 1,5 °C/min und dann mit 6 °C/min nach Abschluss zu erreichen des Einfrierens werden die Strohhalme entnommen und in flüssigem Stickstoff bei −196°C gelagert. Dies dauert etwa 40 Minuten [12]. Die Programme sind einfach zu verwenden und ermöglichen eine Kühlkombination, die keine ständigen Eingriffe des Bedieners erfordert und wurden verwendet, um die Reproduzierbarkeit der Gefriervorgänge zu erhöhen [12].

Einige Autoren argumentieren, dass auch konventionelles langsames Einfrieren Handbuch oder automatisiert, verursacht wahrscheinlich durch Eiskristallisation umfangreiche chemisch-physikalische Schäden an den Spermien [13].

2.2. Schnelles Einfrieren

Das schnelle Einfrieren wurde zuerst von Sherman [14] vorgeschlagen. Diese Technik erfordert direkten Kontakt zwischen den Halmen und den Stickstoffdämpfen für 8–10 Minuten und das Eintauchen in flüssigen Stickstoff bei −196°C. Im Inneren von Stickstoffdämpfen gibt es einen thermischen Gradienten als Funktion der Entfernung und des Volumens der darunter liegenden Flüssigkeit. Die Probe wird anfänglich tropfenweise mit einem gleichen Volumen an Kälteschutzmittel gemischt, die Mischung wird in die Halme geladen und 10 Minuten bei 4°C inkubieren gelassen. Die Strohhalme werden dann für 15 min in einem Abstand von 15–20 cm über dem Niveau des flüssigen Stickstoffs (-80°C) platziert, danach werden die Strohhalme in flüssigen Stickstoff getaucht. Während des Abkühlens ist es vorzuziehen, die Strohhalme in horizontaler Position zu platzieren, um den Wärmeunterschied zwischen den beiden Enden zu minimieren. Diese Technik hat einige Nachteile, darunter zum Beispiel eine geringe Reproduzierbarkeit, tatsächlich kann die Temperaturabfallkurve nicht kontrolliert werden und die Gefriertemperaturen können von –70, –80 und –99°C variieren [7].

2.3. Kryokonservierung kleiner Mengen von Spermatozoen

Die oben beschriebenen herkömmlichen Verfahren zur Kryokonservierung von Spermien sind nicht ideal, um eine kleine Anzahl von Zellen, wie Nebenhoden- und Hodenspermatozoen, kryokonservieren zu können. Die effiziente Kryokonservierung von chirurgisch entnommenen Spermatozoen, wie bereits in diesem Kapitel erwähnt, reduziert die Anzahl der chirurgischen Eingriffe und vermeidet das logistische Problem, das mit der Koordination der Eizellenentnahme bei Frauen verbunden ist, sowie das Risiko, dass am Tag der Eizellenentnahme keine Spermien gefunden werden [15] . Daher wurden neue Ansätze zur Kryokonservierung entwickelt, um eine begrenzte Anzahl beweglicher Spermien in einem sehr kleinen Volumen (Tabelle 1). Für die Kryokonservierung geringer Spermienzahlen wurden sowohl biologische als auch nichtbiologische Träger getestet, obwohl bisher keine prospektiven randomisierten Studien durchgeführt wurden, um zu zeigen, dass ein einzelner Träger den anderen überlegen ist [15]. Darüber hinaus werden diese Technologien bisher in den meisten IVF-Programmen nur eingeschränkt eingesetzt. Dies legt nahe, dass eine neue Kryokonservierungstechnologie, die für den Umgang mit kleinen Spermienzahlen entwickelt wurde, weiter erforscht werden muss [15]. Unabhängig von der verwendeten Methode ist es für gute Ergebnisse unerlässlich, alle Schritte vor und nach der Kryokonservierung korrekt durchzuführen: Die Wahl geeigneterer Kryoprotektive und das Auftauverfahren sind besonders wichtig.

2.4. Kryoschutzmittel

Kryoschutzmittel sind niedermolekulare und hochpermeable Chemikalien, die verwendet werden, um Spermatozoen vor Frostschäden durch Eiskristallisation zu schützen. Es gibt vier bekannte Kryoschutzmittel: Glycerin, Ethylenglykol, Dimethylsulfoxid und 1,2-Propandiol. Kryoschutzmittel wirken, indem sie den Gefrierpunkt einer Substanz herabsetzen, die Menge an Salzen und gelösten Stoffen in der flüssigen Phase der Probe verringern und die Eisbildung in den Spermatozoen verringern [16]. Üblicherweise werden die Kryoprotektiva tropfenweise in einem gleichen Spermavolumen zugegeben, bei Raumtemperatur vorsichtig gemischt und dann 10–15 Minuten bei 37 °C gelagert, um eine angemessene Äquilibrierung zwischen den Zellen und dem Medium zu ermöglichen [7]. Es ist notwendig, dass das Medium mit den Zellen interagiert. Tatsächlich ist die Wirksamkeit kryoprotektiver Substanzen auch eine Funktion der Wechselwirkungszeit zwischen den Kryoprotektiva und den Zellen [7]. Glycerin ist das am häufigsten verwendete permeierende Kryoprotektivum für menschliche Spermien. Es wirkt auf: die Membranstruktur, Permeabilität und Stabilität der Lipiddoppelschicht, die Assoziation von Oberflächenproteinen und den Zellstoffwechsel. Sein Einsatz führt zu ungünstigen Ergebnissen bei der Membran- und Akrosomenstruktur, ermöglicht jedoch das Einfrieren von Spermien von schlechter Qualität [7]. Die Studien von Sherman [14] zeigten, dass die Verwendung von Glycerin nur wenige Veränderungen verursachen kann, wie z. Im Anschluss an diese Beobachtungen wurden andere Schutzsubstanzen vorgeschlagen, wie das Dimethylsulfoxid (DMSO), das bei Verwendung bei 4 °C schädliche Auswirkungen auf menschliche Spermien hat, und das 1,2-Propandiol, das bei der Kryokonservierung von Spermien geringfügig verwendet wird [7].

2.5. Auftauverfahren

Das Auftauen ist ein ebenso wichtiger Schritt: Die Zelle muss ihre normalen biologischen Aktivitäten wiedererlangen, um abrupte thermische Veränderungen so weit wie möglich zu vermeiden. Im Allgemeinen verwenden die Kryokonservierungsprotokolle eine Auftautemperatur von 37 °C, selbst wenn höhere Auftautemperaturen ein schnelleres Erhitzen ermöglichen, werden sie aufgrund der mit einer Zellschädigung verbundenen Risiken nicht verwendet.

Gegenwärtig werden verschiedene Auftautechniken verwendet, darunter (i) Auftauen bei Raumtemperatur für 10 Minuten und anschließender Thermostatdurchgang bei 37 °C für weitere 10 Minuten, (ii) Auftauen in einem Thermostat und Wasserbad bei 37 °C °C für 10 min, (iii) Auftauen bei Raumtemperatur für 15 min.

Nach dem Auftauen wird der Samen durch Waschen in Kulturmedium und Zentrifugieren vom Kryokonservierungsmedium getrennt [7].

3. Schädliche Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Spermienintegrität

Im Vergleich zu anderen Zelltypen scheinen Spermatozoen aufgrund der hohen Fluidität der Membran und des geringen Wassergehalts (ca. 50%) weniger empfindlich gegenüber Kryokonservierungsschäden zu sein. Trotzdem kann die Kryokonservierung zu schädlichen Veränderungen der Spermienstruktur und -funktion führen [17]. Es wurde weitgehend berichtet, dass beim Einfrieren und Auftauen menschlicher Spermatozoen mehrere schädigende Prozesse auftreten können, wie z.

Die Hauptursache für Zellschäden während der Kryokonservierung ist die Bildung von intra- oder extrazellulären Eiskristallen. Während des Gefrierprozesses spielt die Abkühlgeschwindigkeit eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Ausmaßes der Kryoverletzung der Spermatozoen [9].

Eine schnelle Abkühlungsrate verursacht eine starke intrazelluläre Eisbildung, da der Wasserausfluss durch die Membran beeinträchtigt wird und somit eine Unterkühlung induziert wird.

Gebildete Eiskristalle durchbrechen die Membranen und beeinträchtigen die Organellenfunktion. Dieser Zustand führt zu einer Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auf der anderen Seite bestimmt eine zu langsame Abkühlgeschwindigkeit den Wasserausfluss von der inneren in die äußere Umgebung, wodurch die Konzentration der gelösten Stoffe und der osmotische Druck erhöht werden. Dieser Zustand führt zu Zellvolumenänderungen, die mit der Bewegung von Wasser, Dehydration und Toxizitätsschäden aufgrund einer hohen Konzentration an gelösten Stoffen verbunden sind [9]. Kryoverletzungen sind nicht auf den Gefrierprozess beschränkt, sondern können auch während des Auftauprozesses auftreten, wenn das Eis schmilzt oder rekristallisiert [9]. Das Phänomen der Rekristallisation von intrazellulärem und extrazellulärem Eis tritt in gefrorenen Proben als kleinere Eiskristalle mit einer Rekristallisationsrate auf, die mit steigender Temperatur zunimmt [13].

Es wurde weitgehend berichtet, dass Kälteschäden die Struktur und Integrität von Plasmamembranen [19, 20] verändern können, die hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterin bestehen [21].

Obwohl hohe Konzentrationen von Cholesterin und mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Membran bei niedrigerer Temperatur mehr Fluidität verleihen [22], verursacht der Kühlprozess während der Kryokonservierung einen Phasenübergang der Membranlipide und beeinträchtigt die Funktion der Membranproteine. Insbesondere die äußere Schicht der Plasmamembran von Spermatozoen besteht aus einer Glykokalyx, einer kohlenhydratreichen Zone, die hauptsächlich Oligosaccharidketten enthält, die an das integrale Protein der Plasmamembran (Glykoproteine) oder Lipide (Glykolipide) binden [23]. Generell kann die Kryokonservierung eine nachteilige Wirkung haben, indem sich die Kohlenhydratzusammensetzung der Glykokalyx verändert, wodurch die Funktion von Membranproteinen, die für den Ionentransport und den Stoffwechsel verantwortlich sind, beeinträchtigt und die Befruchtungsfähigkeit beeinflusst wird [24]: Die Glykokalyx ist an einigen physiologischen Funktionen beteiligt, wie z Immunschutz des weiblichen Genitaltrakts [25], akrosomale Reaktion [26] und frühe Gameteninteraktion.

Die Plasma- und Mitochondrienmembranen weisen die gleiche Anfälligkeit für die Kryokonservierung auf [27]. Mitochondrien werden entlang des Mittelstücks zwischen der Plasmamembran und den neun Fasersäulen platziert, um eine Beschichtung zu bilden, die die für die Beweglichkeit der Spermien notwendige Energie liefert [27]. Die größte Energiemenge wird von ATP-Molekülen bereitgestellt, die entweder durch Glykolyse im Zytoplasma [28] oder durch oxidative Phosphorylierung (Oxphos) in den Mitochondrien synthetisiert werden [10].

Das von Oxphos in der inneren Mitochondrienmembran erzeugte ATP wird auf die Mikrotubuli übertragen, um die Motilität anzutreiben [29]. Daher kann eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Aktivität die Einschränkung der Motilität erklären [27].

Eine Veränderung der mitochondrialen Membranfluidität kann auch zu einer Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials und zur Freisetzung von ROS führen [9]. Die durch eine erhöhte ROS-Konzentration induzierte peroxidative Schädigung ist mit einer Schädigung der Plasmamembran der Spermien und einer Beeinträchtigung der axonemalen Struktur verbunden [30]. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Kryokonservierung die antioxidative Aktivität der Spermatozoen verringert und sie anfälliger für ROS-Schäden macht [31]. Eine hohe Konzentration von ROS und ein Abfall antioxidativer Enzyme führen zur Zellapoptose [32]. Die Apoptosekaskade wird dabei durch die Aktivierung der Proteine ​​der BCL2-Familie vermittelt: Es kommt zu einer Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran durch die Proteine ​​Bax und BAK und die Freisetzung von Cytochrom [33]. Caspase 9 wird wiederum zusammen mit APAF-1 aktiviert, um ein Apoptosom zu bilden [34]. Die Freisetzung von Apoptose-induzierenden Faktoren aus den Mitochondrien führt zur DNA-Fragmentierung [35]. Mehrere Studien untersuchten die Rolle von in vitro antioxidative Ergänzung zum Schutz der Spermien-DNA vor oxidativen Schäden. Genistein [36], Resveratrol [37] und Ascorbinsäure [37] scheinen beispielsweise, wenn sie der Samenflüssigkeit während der Kryokonservierung zugesetzt werden, DNA-Schäden zu reduzieren, im Gegenteil, Vitamin E [38], Ascorbat und Katalase [39] scheinen die Motilität zu verbessern und den ROS-Spiegel zu senken, obwohl sie die Lebensfähigkeit der Spermatozoen nicht verbessern und DNA-Schäden nicht reduzieren. Auf jeden Fall ist die Zahl dieser Studien und die Zahl der darin eingeschlossenen Patienten noch zu begrenzt, um Rückschlüsse auf die Wirksamkeit einer antioxidativen Supplementierung beim Schutz der DNA vor Schäden durch Einfrieren zu ziehen.

3.1. Kryokonservierung und DNA-Schäden

Während die Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Befruchtungsfähigkeit, Motilität, Morphologie und Lebensfähigkeit von Spermatozoen gut dokumentiert sind, ist die Frage nach einer möglichen Veränderung der Spermien-DNA-Integrität nach Einfrier-Auftau-Verfahren noch offen. Es besteht in der Literatur weder Einigkeit darüber, ob die Kryokonservierung DNA-Schäden induziert, noch über die Schadenshöhe. In einigen Studien haben Autoren über signifikante Veränderungen der Spermien-DNA-Integrität nach Kryokonservierung/Auftauen berichtet [6, 40], während andere Studien eine andere Meinung vertreten [41, 42]. Diese Kontroverse zwischen einer Studie und der anderen könnte zunächst dadurch erklärt werden, dass sich die Befunde nicht auf eine beträchtliche Anzahl von Proben beziehen und auch auf die Anwendung (1) unterschiedlicher Einfrierverfahren, (2) unterschiedlicher Tests zu Bewertung der DNA-Integrität und (3) verschiedene Techniken zur Samenvorbereitung vor der Kryokonservierung (dh Swim-up- oder Dichtegradientenzentrifugation). Donnelly und Kollegen [6] untersuchten beispielsweise die DNA-Integrität von Sperma und vorbereiteten Spermaproben vor und nach der Kryokonservierung (Dichtegradientenzentrifugation oder direktes Aufschwimmen) bei 50 Männern. Sie berichteten, dass das Einfrieren von Spermien in Samenplasma die DNA-Integrität nach dem Auftauen verbessert: In Samenflüssigkeit eingefrorene Spermien scheinen widerstandsfähiger gegen Gefrierschäden zu sein als eingefrorene vorbereitete Spermien. Dies kann auf das Vorhandensein von reichlich Antioxidantien im Samenplasma zurückzuführen sein. In Bezug auf die Variabilität im Zusammenhang mit verschiedenen Einfrierverfahren bewerteten die Autoren in der Studie von Petym und Kollegen [43] Kryoschäden am Spermienchromatin, indem sie zwei verschiedene Verfahren verglichen: Flüssigstickstoffdampf versus computergestützter Gefrierprogramm. Sie analysierten 50 Samenproben mit Acridinorange und kamen zu dem Schluss, dass die DNA-Schäden nach dem Einfrieren mit flüssigem Stickstoff signifikant höher waren.

Aus einer detaillierten Analyse der derzeit in der Literatur verfügbaren Literaturstellen ergab sich, dass es grundsätzlich drei unterschiedliche Denkrichtungen zu der Fragestellung gibt: „Verursacht das Einfrieren-Auftauen-Verfahren einen DNA-Schaden der Spermien?”.

Laut mehreren Autoren lautet die Antwort „JAWOHL" (Tabelle 2(a)). Spano und seine Gruppe [44] berichteten, dass sich die Gesamtqualität der Spermien nach dem Einfrieren/Auftauen verschlechtert, einschließlich der Spermien-DNA-Integrität, die durch SCSA in 19 Proben bewertet wurde. Diese Ergebnisse wurden in einer Studie von De Paula und Kollegen [40] an 77 Patienten bestätigt, in der die Autoren den Grad der Spermien-DNA-Fragmentierung durch den TUNEL-Test vor und nach der Kryokonservierung bewerteten: Die Autoren betonten, dass das Einfrieren-Auftauen-Verfahren negativ beeinflusst DNA-Integrität. Darüber hinaus ist aus den in der Literatur veröffentlichten Daten auch klar, dass unter den Autoren, die argumentieren, dass die Kryokonservierung einen DNA-Schaden von Spermien hervorruft, manchmal keine Einigkeit über den Mechanismus besteht, der diesen Schaden tatsächlich verursacht. Trotz der Tatsache, dass ROS häufig eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie von Schäden an menschlichen Spermatozoen, einschließlich der DNA-Fragmentierung, zugeschrieben wurde, stellten Zribi und seine Gruppe [45] fest, dass es keinen Zusammenhang zwischen DNA-Fragmentierung und DNA-Oxidation gibt . Sie schlugen vor, dass die Kryokonservierung die Spermien-DNA-Fragmentierung über andere Wege als oxidativen Stress induziert, wie z. Diese Hypothese wird von Thomson und Kollegen widerlegt [46]: Trotz der Verwendung der gleichen Technik zur Bewertung der DNA-Oxidation, des Fluoreszenztests zum Nachweis von 8-Oxoguanin, berichteten sie, dass die DNA-Fragmentierung von menschlichem Sperma mit einem Anstieg des oxidativen Stresses während der Kryokonservierung verbunden ist , eher als die Aktivierung von Caspase und Apoptose.

Über die Frage „Verursacht das Einfrieren-Auftauen-Verfahren einen DNA-Schaden der Spermien?” einige Autoren folgen einem anderen Gedankengang und antworten “JA, aber mit einigen Bedingungen“ (Tabelle 2(b)). Sie stützen die Hypothese, dass die nach WHO-Kriterien klassifizierten Spermien von fruchtbaren Männern weniger anfällig für Frostschäden sind als die von unfruchtbaren Männern. In der Studie von Donnelly und Kollegen [6] wurden Samenproben von 17 fruchtbaren und 40 unfruchtbaren Männern entnommen und die Spermienintegrität vor und nach der Kryokonservierung mit dem Comet-Assay bewertet. Die Autoren zeigten, dass Sperma von fruchtbaren Männern gegenüber Gefrierschäden resistenter zu sein scheint als Proben von unfruchtbaren Männern, außerdem gab es bei fruchtbaren Männern keine signifikante Abnahme der DNA-Integrität nach der Kryokonservierung. Diese Ergebnisse stützen die Beobachtung, dass Spermatozoen von unfruchtbaren Männern eine höhere Inzidenz einer unregelmäßigen Chromatinorganisation aufweisen und eine signifikant verringerte Resistenz gegenüber thermischer Denaturierung im Vergleich zu Spermatozoen von fruchtbaren Männern aufweisen [47, 48]. Tatsächlich enthalten Spermatozoen von schlechter Qualität als Folge einer verminderten Protaminierung oft teilweise dekondensiertes Chromatin, das zu einer funktionellen Unreife führt [6]. Die Chromatinkondensation ist für Spermatozoen von grundlegender Bedeutung, da die Spermatogenese zum Verwerfen von Zytoplasma führt, wodurch die Spermatozoen nicht in der Lage sind, die DNA-Reparatur durchzuführen. Gemäß dieser Hypothese berichteten Kalthur und Kollegen [49] bei der Untersuchung der Spermienmorphologie und der Spermien-DNA-Schädigung vor und nach der Kryokonservierung, dass die Anfälligkeit morphologisch abnormaler Spermien für DNA-Schäden während des Einfrierprozesses signifikant höher ist als die von Spermien mit normaler Morphologie. Sie stellten die Hypothese auf, dass Spermien mit Kopfanomalien veränderte physikalische Eigenschaften der Membran und dadurch eine veränderte Toleranz gegenüber Kältestress aufweisen könnten. Es gibt jedoch keine Studien, die durchgeführt wurden, um zu beurteilen, ob ein morphologisch abnormales Sperma seine Chromatinintegrität während der Kryokonservierung beibehalten kann oder nicht.

Im Gegensatz zu diesen beiden Antworten auf die obige Frage steht ein dritter Gedankengang: Einige Autoren sagen: „NEIN, das Einfrieren-Auftauen beeinträchtigt nicht die Integrität der Spermien-DNA“ (Tabelle 2(c)). Duru und seine Gruppe [41] untersuchten beispielsweise die Auswirkungen der Kryokonservierung auf die DNA-Fragmentierung und die Membranintegrität bei 21 Patienten unter Verwendung des TUNEL-Assays und Annexin V. Ihre Ergebnisse zeigten, dass die Kryokonservierung die Plasmamembransymmetrie veränderte und mit der Translokation von Phosphatidylserin verbunden war, während Die DNA-Integrität wurde aufrechterhalten. Darüber hinaus fanden Isachenko und Kollegen [42] beim Vergleich der Auswirkungen des langsamen Einfrierens und der Vitrifizierung auf die Integrität der Spermien-DNA in Abwesenheit von Kryoschutzmittel, dass die Integrität der DNA durch die Kryokonservierung nicht beeinträchtigt wird. Die fehlende Wirkung der Kryokonservierung auf die Spermien-DNA wurde auch durch Daten von Paasch und Kollegen bestätigt [50]. Sie zeigten, dass die Kryokonservierung signifikant mit einer Störung des mitochondrialen Membranpotentials sowie der Aktivierung von Caspase 3, 8 und 9 verbunden war, jedoch wurden keine signifikanten Veränderungen bei der DNA-Fragmentierung beobachtet, wie durch den TUNEL-Assay in 84 Proben bewertet.

Auch wenn die Meinungen zum Thema „Kryokonservierung und DNA-Schäden“ noch immer sehr umstritten sind, ist die Bewertung des Einflusses der Kryokonservierung auf das Spermienchromatin von enormer Bedeutung. Ebenso ist die Integrität der Spermien-DNA ein wichtiger Faktor für den Erfolg der ART [51–53].

4. Kryokonservierung und reproduktives Ergebnis

Es ist allgemein bekannt, dass die Kryokonservierung eine beeinträchtigte Spermienmotilität erhöht und die Befruchtungsrate durch schädliche Auswirkungen auf die Membranen, die akrosomale Struktur und die Akrosinaktivität verringert [54]. Das Einfrieren-Auftauen von menschlichen Spermatozoen kann auch die Chromatinstruktur beeinträchtigen [55], was zu einem potentiellen Risiko einer Dekonsation des Spermienkerns nach der Injektion in die Eizelle führt und somit die Befruchtungsrate verringert [56]. Ein kumulativer Effekt der Kryokonservierung auf die Befruchtungskapazität der Spermien ist jedoch nicht eindeutig belegt. In Anbetracht der durch die Kryokonservierung induzierten Abnahme der Spermienbefruchtungskraft ist leicht verständlich, dass die intrauterine und konventionelle Insemination in vitro Befruchtung (IVF) mit gefrorenen-aufgetauten Spermien führen zu geringeren Schwangerschaftsraten im Vergleich zur Insemination mit Frischsperma [1]: Aus diesem Grund wird eine Kryokonservierung von Samenproben vor einer intrauterinen Insemination oder einer konventionellen IVF nicht empfohlen.

Anders sieht es bei der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) aus, da dieses Verfahren für eine erfolgreiche Befruchtung nur eine geringe Anzahl beweglicher Spermien benötigt. Daher stellt sich die aktuelle Frage, ob die Verwendung frischer statt kryokonservierter Samenzellen den gleichen Effekt auf das Fortpflanzungsergebnis bei ICSI hat. Bisher wurden in der Literatur nur wenige groß angelegte Studien zum reproduktiven Outcome von ICSI zum Vergleich von frischen und gefrorenen-aufgetauten menschlichen Ejakulat-, Hoden- oder Nebenhodenspermatozoen berichtet, und die Ergebnisse scheinen sich zwischen den Autoren auch in Abhängigkeit von der Herkunft von zu unterscheiden die eingesetzten Spermatozoen.

4.1. Hoden-Spermatozoen

Friedler und Kollegen [57] berichteten von keinen statistisch signifikanten Unterschieden in allen untersuchten Parametern (Fertilisationsrate, Spaltungsrate, Embryoqualität, Implantationsrate, klinische Schwangerschaftsrate und Rate laufender Schwangerschaften) zwischen ICSI-Zyklen mit frischen oder kryokonservierten Hodenspermatozoen derselben Patientin , wobei alle ICSI-Zyklen mit frischen (25 Zyklen) und aufgetauten (14 Zyklen) Hodenspermatozoen verglichen wurden. Diese Hypothese wird durch die Studie einiger Autoren gestützt: Ben Rhouma und Kollegen [58] führten insgesamt 60 ICSI-Zyklen mit frischen (32 Zyklen) und aufgetauten (28 Zyklen) Hodenspermatozoen durch Habermann und Kollegen [59] führten insgesamt 46 . durch ICSI-Zyklen mit frischen (12 Zyklen) und aufgetauten (34 Zyklen) Hodenspermien Huang und Kollegen [60] führten insgesamt 22 ICSI-Zyklen mit frischen (14 Zyklen) und aufgetauten (8 Zyklen) Hodenspermien durch. Alle Autoren berichteten von den gleichen Ergebnissen: Das Reproduktionsergebnis von ICSI mit gefrorenen und aufgetauten Hodenspermatozoen ist vergleichbar mit dem Reproduktionsergebnis von ICSI mit frischen Hodenspermien. Im Gegensatz dazu stellten De Croo und Kollegen [61] fest, dass die Befruchtungs-, Implantations- und Lebendgeburtsraten pro Embryotransfer nach ICSI mit gefrorenen-aufgetauten (35 Zyklen) signifikant niedriger sind als bei frischen (65 Zyklen) Hodenspermatozoen.

4.2. Nebenhoden-Spermatozoen

Andererseits verglichen einige Gruppen die Ergebnisse der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) mit frischen und gefrorenen/aufgetauten Nebenhodenspermatozoen. Tournaye und Kollegen [62] berichteten beispielsweise, dass die klinische Schwangerschaftsrate in ICSI-Zyklen zwischen frischen (157 Zyklen) und gefrorenen/aufgetauten (118 Zyklen) Nebenhodenspermatozoen vergleichbar war. Sukcharoen und Kollegen [63] führten insgesamt 53 ICSI-Zyklen mit frischen (40 Zyklen) und aufgetauten (13 Zyklen) epididymalen Spermatozoen durch und kamen zu dem gleichen Schluss, auch Cayan und Kollegen [64] unterstützten dieselbe Meinung. Im Gegensatz dazu stellten Shibahara und Kollegen [65] fest, dass es einen signifikanten Unterschied in allen untersuchten Reproduktionsparametern zwischen ICSI-Zyklen mit frischen oder kryokonservierten epididymalen Spermatozoen gab, wobei ICSI-Zyklen mit frischen (5 Zyklen) und aufgetauten (13 Zyklen) Nebenhodenspermatozoen verglichen wurden.

4.3. Ejakulierte Spermatozoen

Die Mehrzahl der Studien zur Kryokonservierung und zum Reproduktionsergebnis von ICSI wurden mit Spermien testikulären oder epididymalen Ursprungs durchgeführt. Nur zwei Hauptgruppen berichteten über Daten zu Befruchtungs- und Schwangerschaftsraten nach dem ICSI-Vergleich von frischen und gefrorenen-aufgetauten menschlichen Ejakulat-Spermien. Zuerst verglichen Kucznynski und Kollegen [66] die Reproduktionsergebnisse von 118 ICSI-Zyklen mit frischen Spermatozoen und 122 ICSI-Zyklen mit gefrorenen-aufgetauten Spermatozoen, alle von oligoasthenoteratozoospermischen Patienten. Die Autoren berichteten nicht über statistisch signifikante Unterschiede in der Befruchtungsrate zwischen den beiden Patientengruppen. Darüber hinaus zeigen diese Daten, dass die Werte von laufenden Schwangerschaften bei ICSI-Patienten signifikant höher sind, wenn menschliche Spermaproben kryokonserviert werden. Laut Ragni und seiner Gruppe [67] deutet dies darauf hin, dass eine richtig durchgeführte Kryokonservierung selektiv eher defekte als normale Spermien betrifft [44]. Diese Beobachtung scheint darauf hinzudeuten, dass eine Kryokonservierung vor ICSI hilfreich sein könnte, um seneszente oder defiziente Spermatozoen zu eliminieren und somit das Fortpflanzungsergebnis zu verbessern [62]. Borges und seine Gruppe [68] untersuchten auch die Auswirkungen der Kryokonservierung von Spermien auf das ICSI-Ergebnis. Der Autor verglich 61 und 79 ICSI-Zyklen, die mit kryokonservierten und frisch ejakulierten Spermatozoen durchgeführt wurden, und untersuchte insbesondere das Reproduktionsergebnis, das mit Samenproben mit verminderter und normaler Motilität erzielt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass (1) bei Samen mit normaler Motilität das Fortpflanzungsergebnis mit frischen oder gefroren-aufgetauten Spermatozoen gleich ist (2) bei Samen mit verminderter Motilität die Befruchtungsrate mit frischem Sperma höher war als mit kryokonserviertem, aber nein Unterschiede wurden bei Implantation und Schwangerschaft festgestellt. Dieser Befund stützt die Hypothese, dass das Einfrieren-Auftauen bei Patienten mit veränderter Samenqualität mehr Schaden anrichtet als bei Patienten mit normalem Samen. Sobald die Eizelle jedoch befruchtet ist, sind die Implantations- und Schwangerschaftsraten bei Patienten mit oder ohne Spermienanomalien ähnlich.

5. Schlussfolgerung

Heutzutage wird die Kryokonservierung von Spermien häufig verwendet, um Spender- und Partnerspermatozoen vor Behandlungen der assistierten Reproduktion aufzubewahren, Spermien vor der Therapie bösartiger Erkrankungen, Vasektomie oder chirurgischer Unfruchtbarkeitsbehandlungen zu konservieren und die Wiederherstellung einer kleinen Anzahl von Spermatozoen bei schwerer männlicher Unfruchtbarkeit sicherzustellen. Daher ist die Kryokonservierung von Spermien ein wichtiger Bestandteil des Fertilitätsmanagements, und ein Großteil ihrer erfolgreichen Anwendung scheint das Fortpflanzungsergebnis der ART zu beeinflussen.

Während die Auswirkungen der Kryokonservierung auf Zellen gut dokumentiert sind, gibt es bis heute keine Übereinstimmung in der Literatur darüber, ob die Kryokonservierung die Chromatinintegrität der Spermien beeinflusst oder nicht, oder über die Verwendung eines einzigartigen und funktionellen Protokolls für das Einfrieren-Auftauen-Verfahren. Dies deutet darauf hin, dass es bisher sinnvoll wäre, eine multizentrische Studie mit einer großen Anzahl von Samenproben durchzuführen, die mit einzigartigen Einfrierprotokollen verarbeitet werden könnten. Obwohl weitere Untersuchungen erforderlich sind, um den tatsächlichen Einfluss der Kryokonservierung auf die Integrität der Spermien-DNA und die Auswirkungen der Verwendung kryokonservierter Spermatozoen auf das Fortpflanzungsergebnis vollständig zu verstehen, sollten technische Maßnahmen ergriffen werden, um den männlichen Gameten maximalen Schutz zu bieten: angemessene Verwendung von Kryoschutzmittel vor und Spermienselektionstechnologien nach der Kryokonservierung scheinen den größten Einfluss auf die Verhinderung der DNA-Fragmentierung zu haben, wodurch die Kryo-Überlebensraten der Spermien verbessert werden.

Verweise

  1. J. K. Sherman, „Synopsis der Verwendung von tiefgefrorenem menschlichem Sperma seit 1964: Stand der Technik der menschlichen Samenbank“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 24, nein. 5, S. 397–412, 1973. Ansicht bei: Google Scholar
  2. W. G. Sanger, J. H. Olson und J. K. Sherman, „Samen-Cryobanking für Männer mit Krebs—Kriterienänderung“ Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 58, Nr. 5, S. 1024–1027, 1992. Ansicht bei: Google Scholar
  3. J. R. Jensen, D. E. Morbeck und C. C. Coddington III, „Erhaltung der Fruchtbarkeit“, Verfahren der Mayo-Klinik, Bd. 86, Nr. 1, S. 45–49, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  4. J. T. Anger, B. R. Gilbert und M. Goldstein, „Kryokonservierung von Spermien: Indikationen, Methoden und Ergebnisse“, Zeitschrift für Urologie, Bd. 170, Nr. 4 I, S. 1079–1084, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  5. G. J. Morris, E. Acton und S. Avery, „Ein neuartiger Ansatz zur Kryokonservierung von Spermien“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 14, Nr. 4, S. 1013–1021, 1999. Ansicht bei: Google Scholar
  6. E. T. Donnelly, N. McClure und S. E. M. Lewis, „Kryokonservierung von menschlichem Sperma und präpariertem Sperma: Auswirkungen auf die Motilitätsparameter und die DNA-Integrität“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 76, Nr. 5, S. 892–900, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  7. R. Fabbri, P. Ciotti, B. Di Tommaso et al., „Tecniche di crioconservazione riproduttiva“, Rivista Italiana di Ostetricia und Ginecologia, Bd. 3, S. 33–41, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  8. S. J. Behrman und Y. Sawada, „Heterologe und homologe Inseminationen mit menschlichem Sperma eingefroren und in einem Flüssigstickstoff-Kühlschrank gelagert“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 17, nein. 4, S. 457–466, 1966. Ansicht bei: Google Scholar
  9. T. M. Said, A. Gaglani und A. Agarwal, „Implikation der Apoptose bei Kryoverletzungen von Spermien“, Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 21, nein. 4, S. 456–462, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  10. M. Mahadevan und A. O. Trounson, „Auswirkung von Kühl-, Einfrier- und Auftauraten und Lagerbedingungen auf die Konservierung menschlicher Spermien“, Andrologie, Bd. 16, nein. 1, S. 52–60, 1984. Ansicht bei: Google Scholar
  11. J. V. Thachil und M. A. S. Jewett, „Konservierungstechniken für menschliches Sperma“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 35, Nr. 5, S. 546–548, 1981. Ansicht bei: Google Scholar
  12. W. V. Holt, „Grundlegende Aspekte der Gefrierlagerung von Sperma“, Wissenschaft der Tierreproduktion, Bd. 62, nein. 1𠄳, S. 3–22, 2000. Ansicht auf: Website des Herausgebers | Google Scholar
  13. P. Mazur, W. F. Rall und N. Rigopoulos, „Relative Beiträge des Anteils von ungefrorenem Wasser und der Salzkonzentration zum Überleben langsam gefrorener menschlicher Erythrozyten“, Biophysikalisches Journal, Bd. 36, nein. 3, S. 653–675, 1981. Ansicht bei: Google Scholar
  14. J. Sherman, „Kryokonservierung von menschlichem Sperma“, in Handbuch der Labordiagnostik und -behandlung der Unfruchtbarkeit, B. Keel und B. W. Webster, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 1990. Ansicht bei: Google Scholar
  15. F. Abdelhafez, M. Bedaiwy, S. A. El-Nashar, E. Sabanegh und N. Desai, „Techniken zur Kryokonservierung einzelner oder kleiner Mengen menschlicher Spermatozoen: eine systematische Überprüfung“, Aktualisierung der menschlichen Reproduktion, Bd. 15, nein. 2, S. 153–164, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  16. D. Royere, C. Barthelemy, S. Hamamah und J. Lansac, „Cryopreservation of spermatozoa: a 1996 review“, Aktualisierung der menschlichen Reproduktion, Bd. 2, nein. 6, S. 553–559, 1996. View at: Publisher Site | Google Scholar
  17. P. F. Watson, „Die Ursachen für eine verminderte Fruchtbarkeit mit kryokonserviertem Sperma“, Wissenschaft der Tierreproduktion, Bd. 60-61, S. 481–492, 2000. Ansicht auf: Website des Herausgebers | Google Scholar
  18. P. Stanic, M. Tandara, Z. Sonicki, V. Simunic, B. Radakovic und E. Suchanek, „Vergleich von Schutzmedien und Einfriertechniken für die Kryokonservierung von menschlichem Sperma“, European Journal of Geburtshilfe Gynäkologie und Reproduktionsbiologie, Bd. 91, Nr. 1, S. 65–70, 2000. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  19. A. Arav, Y. Zeron, S. B. Leslie, E. Behboodi, G. B. Anderson und J. H. Crowe, „Phasenübergangstemperatur und Kälteempfindlichkeit von Rinder-Oozyten“, Kryobiologie, Bd. 33, nein. 6, S. 589–599, 1996. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  20. Y. Zeron, M. Pearl, A. Borochov und A. Arav: „Kinetische und zeitliche Faktoren beeinflussen Kälteschäden an Keimbläschen und reifen Rinder-Oozyten.“ Kryobiologie, Bd. 38, Nr. 1, S. 35–42, 1999. Ansicht bei: Publisher Site | Google Scholar
  21. M. N. Giraud, C. Motta, D. Boucher und G. Grizard: „Die Membranfluidität sagt das Ergebnis der Kryokonservierung von menschlichen Spermatozoen voraus.“ Menschliche Fortpflanzung, Bd. 15, nein. 10, S. 2160–2164, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  22. P. J. Quinn, „Ein Lipidphasen-Trennmodell für Schäden an biologischen Membranen bei niedriger Temperatur“, Kryobiologie, Bd. 22, nein. 2, S. 128–146, 1985. Ansicht bei: Google Scholar
  23. T. Talaei, T. Esmaeepour, F. Aekiyash und S. Bahmanpour, „Auswirkungen der Kryokonservierung auf Plasmamembran-Glykokonjugate von menschlichen Spermatozoen“, Iranisches Journal für Reproduktionsmedizin, Bd. 8, nein. 3, S. 119–124, 2010. Ansicht bei: Google Scholar
  24. S. Benoff, „Kohlenhydrate und Düngung: ein Überblick“, Molekulare menschliche Reproduktion, Bd. 3, nein. 7, S. 599–637, 1997. Ansicht bei: Google Scholar
  25. N. L. Cross und J. W. Overstreet, „Glykokonjugate der menschlichen Spermienoberfläche: Verteilung und Veränderungen, die die Kapazitation in vitro begleiten“, Gametenforschung, Bd. 16, nein. 1, S. 23–35, 1987. Ansicht bei: Google Scholar
  26. B. Lassalle und J. Testart, „Erkennung der menschlichen Zona pellucida im Zusammenhang mit der Entfernung von Sialinsäure von der menschlichen Spermienoberfläche“, Zeitschrift für Fortpflanzung und Fruchtbarkeit, Bd. 101, Nr. 3, S. 703–711, 1994. Ansicht bei: Google Scholar
  27. M. O'Connell, N. McClure und S. E. M. Lewis, "Die Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Morphologie, Motilität und mitochondriale Funktion der Spermien", Menschliche Fortpflanzung, Bd. 17, nein. 3, S. 704–709, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  28. W. C. L. Ford und J. M. Rees, „Die Bioenergetik der Spermienmotilität von Säugetieren“, in Kontrolle der Spermienmotilität: biologische und klinische Aspekte, C. Gagnon, Ed., S. 175–202, CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 1990. Ansicht bei: Google Scholar
  29. L. Zamboni, „Die ultrastrukturelle Pathologie des Spermatozoons als Ursache von Unfruchtbarkeit: Die Rolle der Elektronenmikroskopie bei der Beurteilung der Samenqualität“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 48, nein. 5, S. 711–734, 1987. Ansicht bei: Google Scholar
  30. R. A. Saleh und A. Agarwal, „Oxidativer Stress und männliche Unfruchtbarkeit: von der Forschungsbank zur klinischen Praxis“, Zeitschrift für Andrologie, Bd. 23, nein. 6, S. 737–752, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  31. J. L. Lasso, E. E. Noiles, J. G. Alvarez und B. T. Storey, „Mechanismus des Superoxid-Dismutase-Verlusts aus menschlichen Spermien während der Kryokonservierung“, Zeitschrift für Andrologie, Bd. 15, nein. 3, S. 255–265, 1994. Ansicht bei: Google Scholar
  32. X. Wang, R. K. Sharma, S. C. Sikka, A. J. Thomas, T. Falcone und A. Agarwal: „Oxidativer Stress ist mit erhöhter Apoptose verbunden, die bei Patienten mit männlicher Unfruchtbarkeit zu DNA-Schäden der Spermien führt.“ Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 80, nein. 3, S. 531–535, 2003. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  33. D. S. McClintock, M. T. Santore, V. Y. Lee et al., „Die Mitglieder der Bc1-2-Familie und die funktionelle Elektronentransportkette regulieren den durch Sauerstoffmangel induzierten Zelltod.“ Molekular- und Zellbiologie, Bd. 22, nein. 1, S. 94–104, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  34. D. Arnoult, B. Gaume, M. Karbowski, J. C. Sharpe, F. Cecconi und R. J. Youle, „Die mitochondriale Freisetzung von AIF und EndoG erfordert Caspase-Aktivierung nach der Bax/Bak-vermittelten Permeabilisierung.“ EMBO-Journal, Bd. 22, nein. 17, S. 4385–4399, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  35. G. Martin, N. Cagnon, O. Sabido et al., „Kinetik des Auftretens einiger Merkmale der Apoptose während des Kryokonservierungsprozesses von Rinder-Spermatozoen“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 22, nein. 2, S. 380–388, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  36. J. C. Martinez-Soto, J. De Dioshourcade, A. Gutiérrez-Adán, J. L. Landeras und J. Gadea, „Effect of Genistein Supplementation of Thawing Medium on Characteristics of Frozen Human Spermatozoa“, Asiatisches Journal für Andrologie, Bd. 12, nein. 3, S. 431–441, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  37. C. S. Branco, M. E. Garcez, F. F. Pasqualotto, B. Erdtman und M. Salvador, „Resveratrol und Ascorbinsäure verhindern DNA-Schäden, die durch Kryokonservierung in menschlichem Sperma verursacht werden.“ Kryobiologie, Bd. 60, nein. 2, S. 235–237, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  38. K. Taylor, P. Roberts, K. Sanders und P. Burton, „Wirkung der antioxidativen Ergänzung des Kryokonservierungsmediums auf die Integrität menschlicher Spermien nach dem Auftauen“, Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 18, nein. 2, S. 184–189, 2009. Ansicht bei: Google Scholar
  39. Z. Li, Q. Lin, R. Liu, W. Xiao und W. Liu, „Schutzwirkung von Ascorbat und Katalase auf menschliche Spermien während der Kryokonservierung“, Zeitschrift für Andrologie, Bd. 31, Nr. 5, S. 437–444, 2010. Ansicht auf: Publisher-Site | Google Scholar
  40. T. S. de Paula, R. P. Bertolla, D. M. Spaine, M. A. Cunha, N. Schor und A. P.Cedenho, „Auswirkung der Kryokonservierung auf die apoptotische Desoxyribonukleinsäure-Fragmentierung von Spermien bei Patienten mit Oligozoospermie“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 86, Nr. 3, S. 597–600, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  41. N. K. Duru, M. S. Morshedi, A. Schuffner und S. Oehninger, "Kryokonservierung-Auftauen von fraktionierten menschlichen Spermatozoen ist mit Membran-Phosphatidylserin-Externalisierung und nicht mit DNA-Fragmentierung verbunden." Zeitschrift für Andrologie, Bd. 22, nein. 4, S. 646–651, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  42. E. Isachenko, V. Isachenko, I. I. Katkov et al., „DNA-Integrität und Motilität menschlicher Spermatozoen nach Standard-Slow-Freezing versus Kryoschutzmittel-freie Vitrifikation“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 19, nein. 4, S. 932–939, 2004. View at: Publisher Site | Google Scholar
  43. S. Petyim und R. Choavaratana, „Kryoschäden am Spermienchromatin nach verschiedenen Einfriermethoden, bewertet durch AO-Test“, Zeitschrift der Ärztekammer von Thailand, Bd. 89, Nr. 3, S. 306–313, 2006. Ansicht bei: Google Scholar
  44. M. Spanò, E. Cordelli, G. Leter, F. Lombardo, A. Lenzi und L. Gandini, „Nukleare Chromatinvariationen in humanen Spermatozoen, die einer Swim-up- und Kryokonservierung unterzogen werden, bewertet durch den durchflusszytometrischen Spermienchromatinstruktur-Assay, ” Molekulare menschliche Reproduktion, Bd. 5, nein. 1, S. 29–37, 1999. View at: Publisher Site | Google Scholar
  45. N. Zribi, N. Feki Chakroun, H. El Euch, J. Gargouri, A. Bahloul und L. Ammar Keskes, „Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Integrität der Desoxyribonukleinsäure des menschlichen Spermas“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 93, nein. 1, S. 159–166, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  46. L. K. Thomson, S. D. Fleming, R. J. Aitken, G. N. De Iuliis, J. A. Zieschang und A. M. Clark: „Kryokonservierung-induzierter DNA-Schaden beim Menschen wird überwiegend durch oxidativen Stress und nicht durch Apoptose vermittelt.“ Menschliche Fortpflanzung, Bd. 24, nein. 9, S. 2061–2070, 2009. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  47. D. P. Evenson, Z. Darzynkiewicz und M. R. Melamed, „Vergleich der Chromatinstruktur von menschlichem und Maussperma durch Durchflusszytometrie“, Chromosom, Bd. 78, nein. 2, S. 225–238, 1980. Ansicht bei: Google Scholar
  48. D. P. Evenson und M. R. Melamed, „Schnelle Analyse normaler und abnormaler Zelltypen in menschlichen Samen- und Hodenbiopsien durch Durchflusszytometrie“, Zeitschrift für Histochemie und Zytochemie, Bd. 31, Nr. 1 A, S. 248–253, 1983. Ansicht bei: Google Scholar
  49. G. Kalthur, S. K. Adiga, D. Upadhya, S. Rao und P. Kumar, „Auswirkung der Kryokonservierung auf die Spermien-DNA-Integrität bei Patienten mit Teratospermie“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 89, Nr. 6, S. 1723–1727, 2008. View at: Publisher Site | Google Scholar
  50. U. Paasch, R. K. Sharma, A. K. Gupta et al., „Die Kryokonservierung und das Auftauen ist mit einem unterschiedlichen Ausmaß der Aktivierung der apoptotischen Maschinerie in Untergruppen von ejakulierten menschlichen Spermatozoen verbunden.“ Biologie der Fortpflanzung, Bd. 71, nein. 6, S. 1828–1837, 2004. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  51. R. J. Aitken und G. N. De Iuliis, „Ursprünge und Folgen von DNA-Schäden in männlichen Keimzellen“, Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 14, Nr. 6, S. 727–733, 2007. Ansicht bei: Google Scholar
  52. N. Tarozzi, D. Bizzaro, C. Flamigni und A. Borini, „Klinische Relevanz von Spermien-DNA-Schäden bei der assistierten Reproduktion“, Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 14, Nr. 6, S. 746–757, 2007. Ansicht bei: Google Scholar
  53. A. Zini, J. M. Boman, E. Belzile und A. Ciampi: „DNA-Schäden von Spermien sind mit einem erhöhten Risiko für Schwangerschaftsverlust nach IVF und ICSI verbunden: systematische Überprüfung und Metaanalyse.“ Menschliche Fortpflanzung, Bd. 23, nein. 12, S. 2663–2668, 2008. View at: Publisher Site | Google Scholar
  54. N. L. Cross und S. E. Hanks, „Auswirkungen der Kryokonservierung auf menschliche Spermienakrosomen“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 6, nein. 9, S. 1279–1283, 1991. Ansicht bei: Google Scholar
  55. D. Royere, S. Hamamah, J. C. Nicolle und J. Lansac, „Durch Frost-Tauen induzierte Chromatinveränderungen beeinflussen die Befruchtungsfähigkeit menschlicher Spermien“, Internationale Zeitschrift für Andrologie, Bd. 14, Nr. 5, S. 328–332, 1991. Ansicht bei: Google Scholar
  56. D. Sakkas, F. Urner, P. G. Bianchi et al., „Spermachromatinanomalien können die Dekonsation nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion beeinflussen.“ Menschliche Fortpflanzung, Bd. 11, nein. 4, S. 837–843, 1996. Ansicht bei: Google Scholar
  57. S. Friedler, D. Strassburger, A. Raziel, D. Komarovsky, Y. Soffer und R. Ron-El, „Intrazytoplasmatische Injektion frischer und kryokonservierter Hodenspermatozoen bei Patienten mit nichtobstruktiver Azoospermie𠅎ine Vergleichsstudie“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 68, Nr. 5, S. 892–897, 1997. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  58. K. Ben Rhouma, H. Marrakchi, H. Khouja, K. Attalah, E. Ben Miled und M. Sakly, „Ergebnis der intrazytoplasmatischen Injektion frischer und gefroren-aufgetauter Hodenspermatozoen: eine vergleichende Studie“, Zeitschrift für Reproduktionsmedizin für den Geburtshelfer und Gynäkologen, Bd. 48, nein. 5, S. 349–354, 2003. Ansicht bei: Google Scholar
  59. H. Habermann, R. Seo, J. Cieslak, C. Niederberger, G. S. Prins und L. Ross, „Ergebnisse der In-vitro-Fertilisation nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion mit frischen oder gefrorenen und aufgetauten Hodenspermatozoen“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 73, nein. 5, S. 955–960, 2000. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  60. F. J. Huang, S. Y. Chang, M. Y. Tsai et al., „Klinische Implikationen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit kryokonservierten Hodenspermien von Männern mit Azoospermie“, Zeitschrift für Reproduktionsmedizin für den Geburtshelfer und Gynäkologen, Bd. 45, nein. 4, S. 310–316, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  61. I. D. Croo, J. Van Der Elst, K. Everaert, P. D. Sutter und M. Dhont, „Befruchtungs-, Schwangerschafts- und Embryoimplantationsraten nach ICSI mit frischen oder gefroren-aufgetauten Hodenspermatozoen“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 13, nein. 7, S. 1893–1897, 1998. Ansicht bei: Google Scholar
  62. H. Tournaye, T. Merdad, S. Silber et al., „Keine Unterschiede im Ergebnis nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion mit frischen oder mit gefrorenen/aufgetauten Nebenhoden-Spermien“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 14, Nr. 1, S. 90–95, 1999. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  63. N. Sukcharoen, T. Sithipravej, S. Promviengchai, V. Chinpilas und W. Boonkasemsanti, „Vergleich des Ergebnisses der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit frischen und gefrorenen und aufgetauten Nebenhoden-Spermien, die durch perkutane Nebenhoden-Spermaaspiration gewonnen wurden“, Zeitschrift der Ärztekammer von Thailand, Bd. 84, Nr. 1, S. S331–S337, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  64. S. Cayan, D. Lee, J. Conaghan et al., „Ein Vergleich der ICSI-Ergebnisse mit frischen und kryokonservierten Nebenhodenspermatozoen von denselben Paaren.“ Menschliche Fortpflanzung, Bd. 16, nein. 3, S. 495–499, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  65. H. Shibahara, Y. Hamada, A. Hasegawa et al., „Korrelation zwischen der Motilität von gefroren-aufgetauten Nebenhoden-Spermien und dem Ergebnis einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion“, Internationale Zeitschrift für Andrologie, Bd. 22, nein. 5, S. 324–328, 1999. View at: Publisher Site | Google Scholar
  66. W. Kuczyski, M. Dhont, C. Grygoruk, D. Grochowski, S. Woczyski und M. Szamatowicz, „Das Ergebnis der intrazytoplasmatischen Injektion frischer und kryokonservierter ejakulierter Spermatozoen – eine prospektive randomisierte Studie“. Menschliche Fortpflanzung, Bd. 16, nein. 10, S. 2109–2113, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  67. G. Ragni, A. M. Caccamo, A. Dalla Serra und S. Guercilena, „Computerisiertes langsames Einfrieren von Samen von Männern mit Hodentumoren oder Hodgkin-Krankheit bewahrt die Spermien besser als das herkömmliche Einfrieren von Dampf.“ Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 53, nein. 6, S. 1072–1075, 1990. Ansicht bei: Google Scholar
  68. E. Borges Jr., L. M. Rossi, C. V. Locambo de Freitas et al., „Befruchtung und Schwangerschaftsausgang nach intrazytoplasmatischer Injektion mit frischen oder kryokonservierten ejakulierten Spermatozoen“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 87, nein. 2, S. 316–320, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  69. A. Borini, E. Sereni, M. A. Bonu und C. Flamigni, „Ein paar von TESA gewonnene Hodenspermatozoen einfrieren“, Molekulare und zelluläre Endokrinologie, Bd. 169, Nr. 1-2, S. 27–32, 2000. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  70. J. Cohen, G. J. Garrisi, T. A. Congedo-Ferrara, K. A. Kieck, T. W. Sehimmel und R. T. Scott, „Cryopreservation of single human spermatozoa“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 12, nein. 5, S. 994–1001, 1997. Ansicht bei: Google Scholar
  71. R. Walmsley, J. Cohen, T. Ferrara-Congedo, A. Reing und J. Garrisi, „Die ersten Geburten und laufenden Schwangerschaften im Zusammenhang mit der Kryokonservierung von Spermien in evakuierten Eizonen“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 13, nein. 4, S. 61–70, 1998. Ansicht bei: Google Scholar
  72. M. Montag, K. Rink, U. Dieckmann, G. Delacrétaz und H. Van Der Ven, „Laser-assisted cryokonservation of single human spermatozoa in cell-free zona pellucida“, Andrologie, Bd. 31, Nr. 1, S. 49–53, 1999. View at: Publisher Site | Google Scholar
  73. Y. Y. Hsieh, H. D. Tsai, C. C. Chang und H. Y. Lo, „Kryokonservierung von menschlichen Spermatozoen in der leeren Zona pellucidae von Mensch oder Maus“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 73, nein. 4, S. 694–698, 2000. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  74. J. Liu, X. Z. Zheng, T. A. Baramki, G. Compton, R. A. Yazigi und E. Katz, „Cryopreservation of a small number of fresh human testicular spermatozoa and testicular spermatozoa culture in vitro for 3 days in an empty Zona pellucida“, Zeitschrift für Andrologie, Bd. 21, nein. 3, S. 409–413, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  75. P. E. Levi-Setti, E. Albani, L. Negri, A. Cesana, P. Novara und S. Bianchi, „Kryokonservierung einer kleinen Anzahl von Spermatozoen in dottergefüllten menschlichen Zonae pellucidae“, Archivio Italiano di Urologia e Andrologia, Bd. 75, nein. 4, S. 195–198, 2003. Ansicht bei: Google Scholar
  76. A. Cesana, P. Novara, S. Bianchi et al., „Kryokonservierung von Spermien bei oligoasthenospermischen Patienten“, in Proceedings of the 19. Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology, Madrid, Spanien, Juli 2003. Ansicht bei: Google Scholar
  77. H. Hassa, F. Gurer, A. Yildirim, C. Can, V. Sahinturk und B. Tekin, „Eine neue Schutzlösung zum Einfrieren kleiner Spermienmengen in einer leeren Zona pellucida: Osmangazi-Turk-Lösung.“ Zellkonservierungstechnologie, Bd. 4, nein. 3, S. 199–208, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  78. M. Gil-Salom, J. Romero, C. Rubio, A. Ruiz, J. Remohí und A. Pellicer, „Intrazytoplasmatische Spermieninjektion mit kryokonservierten Hodenspermatozoen“, Molekulare und zelluläre Endokrinologie, Bd. 169, Nr. 1-2, S. 15–19, 2000. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  79. E. Sereni, M. A. Bonu, L. Fava et al., "Einfrieren von Spermatozoen, die durch Hodenfeinnadelaspiration gewonnen wurden: eine neue Technik", Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 16, nein. 1, S. 89–95, 2008. Ansicht bei: Google Scholar
  80. C. Quintans, M. Donaldson, I. Asprea et al., „Entwicklung eines neuartigen Ansatzes zur Kryokonservierung sehr kleiner Spermienzahlen“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 15, s. 99, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  81. N. Bouamama, P. Briot und J. Testart, „Vergleich zweier Methoden zur Kryokonservierung von Spermien in sehr kleinen Mengen“, Gynäkologie Geburtshilfe Fertilite, Bd. 31, Nr. 2, S. 132–135, 2003. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  82. M. Gvakharia und G. Adamson, „Eine Methode zur erfolgreichen Kryokonservierung kleiner Mengen menschlicher Spermatozoen“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 76, s. S101, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  83. J. O. Sohn, S. H. Jun, L. S. Park et al., „Vergleich der Erholung und Lebensfähigkeit von Spermien in einer ICSI-Pipette nach ultraschnellem Einfrieren oder langsamem Einfrieren“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 80, s. S128, 2003. Ansicht bei: Google Scholar
  84. A. Just, I. Gruber, M. Wr, J. Lahodny, A. Obruca und H. Strohmer, „Neue Methode zur Kryokonservierung von Hodensperma und ejakulierten Spermatozoen von Patienten mit schwerer Oligospermie: eine Pilotstudie“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 82, Nr. 2, S. 445–447, 2004. View at: Publisher Site | Google Scholar
  85. A. Herrler, S. Eisner, V. Bach, U. Weissenborn und H. M. Beier, „Kryokonservierung von Spermatozoen in Alginsäurekapseln“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 85, Nr. 1, S. 208–213, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  86. F. Nawroth, V. Isachenko, S. Dessole et al., „Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants“, Kryo-Briefe, Bd. 23, nein. 2, S. 93–102, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  87. T. G. Schuster, L. M. Keller, R. L. Dunn, D. A. Ohl und G. D. Smith, „Ultraschnelles Einfrieren von sehr geringen Spermienzahlen mit Kryoloops“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 18, nein. 4, S. 788–795, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  88. N. Desai, C. Culler und J. Goldfarb, "Kryokonservierung einzelner Spermien aus epidydimalen und testikulären Proben auf Kryoloops: vorläufiger Fallbericht", Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 82, s. S264, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  89. N. N. Desai, H. Blackmon und J. Goldfarb, „Kryokonservierung einzelner Spermien auf Kryoloops: eine Alternative zur Hamsterzona zum Einfrieren einzelner Spermien“, Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 9, nein. 1, S. 47–53, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  90. D. A. Isaev, S. Y. Zaletov und W. Zaeva, „Künstliche Mikrocontainer für die Kryokonservierung von solitären Spermatozoen“, in Proceedings of the 23rd Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology, P. 394, Lyon, Frankreich, Juli 2007. Ansicht bei: Google Scholar
  91. N. Desai, D. Glavan und J. Goldfarb, „Eine praktische Technik zur Kryokonservierung von Mikromengen von Spermien“, Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 70, S. S197–S198, 1998, Ergänzung zum Jahresversammlungsprogramm. Ansehen bei: Google Scholar
  92. V. Isachenko, E. Isachenko, M. Montag et al., „Saubere Technik zur Kryoschutzmittel-freien Vitrifikation von menschlichen Spermatozoen“, Reproduktionsbiomedizin Online, Bd. 10, nein. 3, S. 350–354, 2005. Ansicht bei: Google Scholar
  93. I. Koscinski, C. Wittemer, V. Lefebvre-Khalil, F. Marcelli, A. Defossez und J. M. Rigot, „Optimal management of extreme oligozoospermia by an correct cryokonservation program“, Menschliche Fortpflanzung, Bd. 22, nein. 10, S. 2679–2684, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  94. S. Hamamah, D. Royere, J. C. Nicolle, M. Paquignon und J. Lansac, „Auswirkungen des Einfrierens-Auftauens auf den Spermatozoonkern: eine vergleichende zytophotometrische Chromatinstudie bei Schweinen und Menschen“, Entwicklung der Fortpflanzungsernährung, Bd. 30, nein. 1, S. 59–64, 1990. Ansicht bei: Google Scholar
  95. M. E. Hammadeh, C. Dehn, M. Hippach et al., „Vergleich zwischen computerisierten langsamen und statischen Flüssigstickstoffdampf-Einfriermethoden in Bezug auf die schädliche Wirkung auf das Chromatin und die Morphologie von Spermatozoen von fruchtbaren und subfertilen Männern“, Internationale Zeitschrift für Andrologie, Bd. 24, nein. 2, S. 66–72, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  96. L. Gandini, F. Lombardo, A. Lenzi, M. Spanò und F. Dondero, „Kryokonservierung und Spermien-DNA-Integrität“, Zell- und Gewebebanking, Bd. 7, nein. 2, S. 91–98, 2006. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  97. T. Ngamwuttiwong und S. Kunathikom, „Bewertung der Kryoverletzung von Spermienchromatin nach der Flüssigstickstoff-Dampfmethode (I)“ Zeitschrift der Ärztekammer von Thailand, Bd. 90, nein. 2, S. 224–228, 2007. Ansicht bei: Google Scholar
  98. S. Dejarkom und S. Kunathikom, „Bewertung der Kryoverletzung von Spermienchromatin nach der computergesteuerten Einfriermethode Teil 2“, Zeitschrift der Ärztekammer von Thailand, Bd. 90, nein. 5, S. 852–856, 2007. Ansicht bei: Google Scholar
  99. L. Ahmad, S. Jalali, S. A. Shami, Z. Akram, S. Batool und O. Kalsoom, „Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Spermien-DNA-Integrität bei normospermischen und vier Kategorien unfruchtbarer Männer“, Systembiologie in der Reproduktionsmedizin, Bd. 56, nein. 1, S. 74–83, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  100. E. Høst, S. Lindenberg, J. A. Kahn und F. Christensen, „DNA-Strangbrüche in menschlichen Samenzellen: ein Vergleich zwischen Männern mit normalen und oligozoospermischen Samenproben“ Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, Bd. 78, nein. 4, S. 336–339, 1999. Ansicht bei: Google Scholar
  101. E. K. Steele, N. McClure und S. E. M. Lewis, „Vergleich der Auswirkungen zweier Methoden der Kryokonservierung auf die DNA von Hodensperma“ Fruchtbarkeit und Sterilität, Bd. 74, Nr. 3, S. 450–453, 2000. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar

Urheberrechte ©

Copyright © 2012 Marlea Di Santo et al.Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


Schau das Video: DNA-Replikation kurz erklärt (Kann 2022).