Information

Was ist der Unterschied zwischen durchschnittlichen Spermien-Epimutationen und Schnitt-Spermien-Epimutationen im Zusammenhang mit dem beigefügten Artikel?

Was ist der Unterschied zwischen durchschnittlichen Spermien-Epimutationen und Schnitt-Spermien-Epimutationen im Zusammenhang mit dem beigefügten Artikel?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die interessante Veröffentlichung ist Manikkam et al. (2014).

Bei Recherchen für ein naturwissenschaftliches Schulprojekt der 10. Klasse bin ich auf diesen Artikel und die folgenden zwei Grafiken gestoßen. Ich verstehe den Unterschied zwischen den beiden Grafiken im Kontext des Artikels nicht ganz: Was ist der Unterschied zwischen durchschnittlichen und Insertions-Epimutationen? Und was bedeuten die MB entlang der x-Achse? Ist es ein Hinweis auf die Größe der genetischen Information, wie Megabyte? Und wie bezieht es sich auf die Orte der epigenetischen Veränderungen? Ich möchte diese Grafik interpretieren und erklären können, also könnte jemand eine Analyse und Erklärung dieser Grafiken liefern.


Was ist der Unterschied zwischen durchschnittlichen Spermien-Epimutationen und Schnitt-Spermien-Epimutationen im Zusammenhang mit dem beigefügten Artikel? - Biologie

Ungünstige Umgebungen zu Beginn des Lebens programmieren die Gehirnentwicklung mit potenziell lebenslangen Folgen neu.

Die Grundlage für ein erfolgreiches Altern wird früh im Leben oder sogar in früheren Generationen festgelegt.

Nachkommen, die in Stresslinien geboren wurden, können einem beschleunigten Altern und altersbedingten Krankheiten ausgesetzt sein.

Epigenetische Mechanismen sind von zentraler Bedeutung für eine beeinträchtigte Zellfunktion, die zu einem beschleunigten Altern beiträgt.

Unerwünschte Folgen des Stresses der Vorfahren können durch positive Erfahrungen ausgeglichen werden.


Hintergrund

Das Klinefelter-Syndrom (KS) ist die häufigste Form der geschlechtschromosomalen Aneuploidie bei Männern mit einer Prävalenz von 0,1–0,2 % in der männlichen Bevölkerung [1]. Die Mehrzahl der Patienten mit KS weist einen nicht-mosaischen 47,XXY-Karyotyp auf, jedoch wurden auch 48,XXXY und 48,XXYY beschrieben und sind mit einem breiten phänotypischen Spektrum assoziiert [2]. Das gemeinsame phänotypische Merkmal von Personen mit zusätzlichen X-Chromosomen sind kleine Hoden, die in den meisten Fällen von einem Fehlen von Spermien im Ejakulat (Azoospermie) und endokrinen Veränderungen (hohe Gonadotropine, niedrige bis normale Testosteron-Serumspiegel) begleitet werden [3]. Histologische Analysen ergaben, dass die geringe Spermienzahl im adulten Hoden auf einen Keimzellverlust in der frühen Entwicklungsphase zurückzuführen ist. Tatsächlich ist die Anzahl der Spermatogonien in Hodengeweben präpubertärer [4] sowie peripubertärer Jungen [5] bereits stark vermindert. Nichtsdestotrotz behalten Subpopulationen von Restspermatogonien die Fähigkeit zur Differenzierung in Spermien bei, wie Studien zur Untersuchung der testikulären Spermienextraktion (TESE) bei Klinefelter-Individuen unterschiedlichen Alters zeigen. Die Erfolgsraten sind bei jungen Männern (15-19 Jahre) am höchsten mit einer 45-prozentigen Chance, Spermien zu isolieren [6]. Analysen von insgesamt 977 Spermien von Klinefelter-Männern (n = 10) durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsanalyse zeigte, dass 94,7 % der Zellen euploid waren, verglichen mit 99,4 % in Kontrollproben [7]. Wichtig ist, dass diese Aneuploidieraten bei Klinefelter-Spermien denen von Patienten mit nichtobstruktiver Azoospermie ähnlich waren [7]. Die Analyse von Kindern, die von Männern mit nicht-mosaischer KS nach testikulärer Spermienextraktion und intrazytoplasmatischer Spermieninjektion geboren wurden, ergab normale Karyotypen in Kohorten von 16 bzw. 17 Kindern [8, 9]. Diese euploiden Spermien stammen wahrscheinlich aus fokalen Populationen von euploiden Spermatogonien inmitten von XXY-Sertoli-Zellen [10]. Die verfügbaren Daten lassen daher vermuten, dass das Risiko der Übertragung einer chromosomalen Aneuploidie über die Keimbahn eher gering ist.

Es werden jedoch verschiedene molekulare Mechanismen untersucht, um die spezifischen biologischen Konsequenzen der überzähligen Geschlechtschromosomen auf den Phänotyp von Klinefelter-Patienten aufzuklären, wie z. Die Inaktivierung des X-Chromosoms sorgt für eine Kompensation der Dosis des X-chromosomalen Gens zwischen den Geschlechtern und wird durch die Expression der X-kodierten langen nicht-kodierenden RNA XIST (X-inaktiv-spezifisches Transkript) kontrolliert, die bei der Expression das X-Chromosom umhüllt und dadurch zu Stummschaltung der meisten Gene [12, 13]. XIST Expression scheint durch Methylierung einer CpG-Insel reguliert zu werden [14, 15]. Lymphozyten, die von euploiden 46,XY-Männern gewonnen wurden, zeigen 100% Methylierungsgrad ausgewählter CpG-Stellen, während der Methylierungsgrad bei 46,XX-Frauen bei etwa 50% lag [16]. Dies steht im Einklang mit der erwarteten Repression gegen XIST in 46,XY-Zellen bzw. die monoallelische Expression in 46,XX-Zellen. In Übereinstimmung damit wurde festgestellt, dass XIST im Hoden von Klinefelter-Patienten im Vergleich zu Kontrollen mit entsprechender Zellularität hochreguliert war [17]. Darüber hinaus zeigten Lymphozyten von Klinefelter-Patienten XIST Methylierungsniveaus vergleichbar mit weiblichen, was mit dem Vorhandensein von mehr als einem X-Chromosom übereinstimmt [16]. Darüber hinaus wurden bei Klinefelter-Patienten globale Veränderungen der Methylierungssignatur von Leukozyten beschrieben [18,19,20], was darauf hindeutet, dass auch genomweite Veränderungen der DNA-Methylierung einen Mechanismus darstellen können, der Klinefelter-Phänotypen beeinflusst.

Ob die Spermien von Klinefelter-Männern in ähnlicher Weise von den Veränderungen der DNA-Methylierung betroffen sind, ist bislang unbekannt, da die Zahl der Spermien, die von diesen Männern gewonnen werden können, für solche Analysen meist zu gering ist. Wichtig ist jedoch, dass eine Reihe von Studien einen Zusammenhang zwischen männlicher Unfruchtbarkeit und abweichender Spermien-DNA-Methylierung für die genomisch geprägten Regionen berichtet haben H19, MEST, und SNRPN [21]. Diese Ergebnisse sind von klinischer Relevanz, da angenommen wurde, dass die Verwendung von Spermien mit abweichenden Methylierungsprofilen zu bestimmten Krankheiten bei den Nachkommen beiträgt, die bei Kindern, die durch assistierte Reproduktionstechnologien gezeugt wurden, häufiger auftreten [22, 23].

Entsprechend wurden im Rahmen des Internationalen Workshops zum Klinefelter-Syndrom Plädoyers für die weitere Erforschung der Rolle „spezifischer Gene und der Epigenetik“ formuliert [24]. Dieser Bedarf an Analysen von Klinefelter-Keimzellen ist weiter gewachsen, da spezialisierte Zentren routinemäßig TESE mit anschließender Kryokonservierung von Spermien pubertären und erwachsenen Klinefelter-Patienten als Mittel zur Fertilitätserhaltung anbieten. Untersuchungen an Keimzellen von Klinefelter-Männern wurden bisher durch die Knappheit des Gewebes und die äußerst begrenzte Anzahl von Keimzellen, die in den Hoden von KS-Männern verbleiben, behindert. Daher zielten wir darauf ab, die DNA-Methylierungsprofile mit Einzelallel-Auflösungsanalysen zu untersuchen, die sich auf geprägte Gene, Keimzellmarkergene und XIST und die Transkriptionsprofile von Keimzellen bei Klinefelter-Männern mit Einzelzellanalysen.


Abstrakt

Zellen des frühen Säugetierembryos, einschließlich pluripotenter embryonaler Stammzellen (ES) und Urkeimzellen (PGCs), sind epigenetisch dynamisch und heterogen. Während der frühen Entwicklung ist diese Heterogenität epigenetischer Zustände mit der stochastischen Expression von Abstammungs-bestimmenden Transkriptionsfaktoren verbunden, die ein enges Crosstalk mit epigenetischen Modifikatoren herstellen. Abstammungsspezifische epigenetische Modifikation wichtiger Transkriptionsfaktor-Loci (z. B. Methylierung des Elf5 Promotor) führt zur Einschränkung von Transkriptionskreisläufen und zur Fixierung des Abstammungsschicksals. Der Schnittpunkt wichtiger epigenetischer Reprogrammierungs- und Programmierungsereignisse im frühen Embryo erzeugt Plastizität, gefolgt von einem Engagement für die Hauptzelllinien des frühen Konzeptus.


Untersuchung der genetischen und epigenetischen Grundlagen großer biologischer Fragestellungen mit dem parthenogenetischen Marmorkrebs: Ein Rückblick und Perspektiven

In den letzten 15 Jahren wurden erhebliche Versuche unternommen, die obligat parthenogenetischen Marmorkrebse zu entwickeln Procambarus virginalis als neues Modell in der Biologie. Sein Hauptvorteil ist die Produktion einer großen Anzahl von Nachkommen, die genetisch identisch mit der Mutter sind, wodurch sich dieses Krebstier besonders für die epigenetische Forschung eignet. Jetzt sind ein Entwurf des Genoms, des Transkriptoms und des genomweiten Methyloms verfügbar, das neue Fenster für die Forschung öffnet. In diesem Artikel fasse ich die biologischen Vorteile sowie die genomischen und epigenetischen Eigenschaften von Marmorkrebsen zusammen und diskutiere anhand erster vielversprechender Daten, was dieses neue Modell zur Beantwortung „großer“ biologischer Fragen beitragen könnte. Es wird erwartet, dass der Genom-Mining neue Erkenntnisse über die genetischen Besonderheiten von Dekapodenkrebsen, die genetischen Grundlagen der Reproduktion von Gliederfüßern, Mauser und Immunität sowie allgemeinere Themen wie die genetische Untermauerung der Anpassung an Süßwasser, Allesfresser, Biomineralisierung, sexuelle Systemveränderung, Verhaltensvariation, klonale Genomentwicklung und Krebsresistenz. Epigenetische Untersuchungen am Marmorkrebs können helfen, die Rolle epigenetischer Mechanismen bei der Genregulation, Gewebespezifikation, Regulation adulter Stammzellen, Zellalterung, Organregeneration und Krankheitsanfälligkeit zu klären. Marmorkrebse eignen sich außerdem, um den Zusammenhang zwischen genetischer und epigenetischer Variation, der transgenerationalen Vererbung epigenetischer Signaturen und dem Beitrag der epigenetischen Phänotypvariation zur Etablierung sozialer Hierarchien, Umweltanpassung und Artbildung aufzuklären. Diese Fragen können durch Experimente mit hochstandardisierten Laborlinien, den Vergleich unterschiedlich angepasster Wildpopulationen und die Generierung genetisch und epigenetisch bearbeiteter Stämme angegangen werden.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Veröffentlichungen

CRISPR/Cas9-Screens sind ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung wichtiger Regulatoren biologischer Prozesse. Durch die Kombination von gepooltem CRISPR/Cas9-Screening mit Einzelzell-RNA-Sequenzierungs-Auslesung können einzelne Störungen sowohl umfassend als auch in großem Maßstab parallel bewertet werden. Wichtig ist, dass dies eine unvoreingenommene Untersuchung der Genfunktion und -regulation auf zellulärer Ebene ermöglicht. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Durchführung von gepoolten CRISPR-Aktivierungsscreens in embryonalen Stammzellen der Maus mit 10× Genomics scRNA-seq als Auslesung. Vollständige Informationen zur Erstellung und Verwendung dieses Protokolls finden Sie bei Alda-Catalinas et al. (2020).

STAR-Protokolle, 2, 2, , 18. Juni 2021

Korrektur des Herausgebers: LifeTime und Verbesserung der europäischen Gesundheitsversorgung durch zellbasierte interzeptive Medizin.
Rajewsky N, Almouzni G, Gorski SA, Aerts S, Amit I, Bertero MG, Bock C, Bredenoord AL, Cavalli G, Chiocca S, Clevers H, De Strooper B, Eggert A, Ellenberg J, Fernández XM, Figlerowicz M, Gasser SM, Hubner N, Kjems J, Knoblich JA, Krabbe G, Lichter P, Linnarsson S, Marine JC, Marioni JC, Marti-Renom MA, Netea MG, Nickel D, Nollmann M, Novak HR, Parkinson H, Piccolo S, Pinheiro I, Pombo A, Popp C, Reik W, Roman-Roman S, Rosenstiel P, Schultze JL, Stegle O, Tanay A, Testa G, Thanos D, Theis FJ, Torres-Padilla ME, Valencia A, Vallot C, van Oudenaarden A, Vidal M, Voet T,

Die Chromatinkonfiguration beeinflusst die Genexpression in Eukaryoten auf mehreren Ebenen, von einzelnen Nukleosomen bis hin zu Chromatindomänen mit einer Länge von mehreren Mb. Posttranslationale Modifikationen (PTM) von Kernhistonen scheinen an Strukturübergängen des Chromatins beteiligt zu sein, aber wie bleibt unklar. Um dies zu untersuchen, verwendeten wir ChIP-seq und zwei Zelltypen, HeLa und Lymphoblastoid (LCL), um zu definieren, wie Veränderungen der Chromatinverpackung während des Zellzyklus die Verteilung von drei Transkriptions-assoziierten Histonmodifikationen, H3K9ac, H3K4me3 und H3K27me3, beeinflussen. Wir zeigen, dass Chromosomenregionen (Banden) von 10-50 Mb, nachweisbar durch Immunfluoreszenzmikroskopie von Metaphase (M)-Chromosomen, auch in G und G vorhanden sind. Sie umfassen 1-5 Mb Subbanden, die sich zwischen HeLa und LCL unterscheiden, aber bleiben durch den Zellzyklus konstant. Die gleichen Subbänder werden durch H3K9ac und H3K4me3 definiert, während sich H3K27me3 weiter verbreitet. Wir fanden kaum Veränderungen zwischen den Zellzyklusphasen, egal ob im Vergleich mit 5-Kb-Rolling-Fenstern oder wenn die Analyse auf funktionelle Elemente wie Transkriptionsstartstellen und topologisch assoziierende Domänen beschränkt war. Nur eine kleine Anzahl von Genen zeigte Veränderungen im Zusammenhang mit dem Zellzyklus: Bei Genen, die Proteine ​​kodieren, die an der Mitose beteiligt sind, wurde H3K9 in GM stark acetyliert, möglicherweise aufgrund der laufenden Transkription. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die modifizierten Histon-Isoformen H3K9ac, H3K4me3 und H3K27me3 eine charakteristische genomische Verteilung bei Auflösungen von 1 Mb und darunter aufweisen, die sich zwischen HeLa- und lymphoblastoiden Zellen unterscheidet, aber während des Zellzyklus bemerkenswert konsistent bleibt. Wir vermuten, dass dieser zelltypspezifische chromosomale Strichcode Teil eines homöostatischen Mechanismus ist, durch den Zellen ihre charakteristischen Genexpressionsmuster und damit ihre Identität über mehrere Mitosen hinweg beibehalten.

Wissenschaftliche Berichte, 11, 1, , 04. Februar 2021

Die Skelettmuskulatur von Erwachsenen wird während der Homöostase aufrechterhalten und bei Verletzung durch Muskelstammzellen (MuSCs) regeneriert. Für MuSCs wurde aufgrund ihrer anatomischen Lage eine Heterogenität in den Selbsterneuerungs-, Differenzierungs- und Regenerationseigenschaften berichtet. Obwohl MuSCs aus extraokularen Muskeln (EOM) eine höhere Regenerationsfähigkeit aufweisen als solche aus Extremitätenmuskeln, bleiben die molekularen Determinanten, die diese Unterschiede bestimmen, undefiniert. Hier zeigen wir, dass EOM- und Extremitäten-MusCs unterschiedliche DNA-Methylierungssignaturen aufweisen, die mit Enhancern ortsspezifischer Gene verbunden sind, und dass das EOM-Transkriptom nach der Transplantation in eine Extremitätenmuskelumgebung umprogrammiert wird. Bemerkenswerterweise exprimierten EOM MuSCs wirtsstellenspezifische positionelle Hox-Codes nach dem Anwachsen und der Selbsterneuerung innerhalb des Wirtsmuskels. Etwa 10 % der EOM-spezifischen Gene zeigten jedoch eine engraftmentresistente Expression, was auf zellintrinsische molekulare Determinanten des höheren Engraftment-Potentials von EOM-MuSCs hindeutet. Unsere Ergebnisse unterstreichen die molekulare Diversität verschiedener MuSC-Populationen und definieren molekular ihre Plastizität als Reaktion auf mikroumweltbezogene Hinweise. Diese Erkenntnisse geben Aufschluss über Strategien zur Verbesserung der Funktionsfähigkeit von MuSCs im Kontext der regenerativen Medizin.

PLoS-Genetik, 16., 10., 30. Okt. 2020

Die DNA-Methylierung ist eine Schlüsselebene der epigenetischen Regulation. Die Ablagerung von Methylierungsmarkierungen beruht auf der katalytischen Aktivität von DNA-Methyltransferasen (DNMTs), und ihre aktive Entfernung beruht auf der Aktivität von TET-Enzymen (Ten-Eleven Translokation). Paradoxerweise werden diese antagonistischen Faktoren in wichtigen biologischen Kontexten co-exprimiert und zielen auf überlappende genomische Regionen ab. Die anschließende zyklische Biochemie der Cytosin-Modifikationen führt zu einem kontinuierlichen, außerthermischen Gleichgewichtsübergang durch verschiedene Methylierungszustände. Aber was ist der Zweck dieses faszinierenden Umsatzes der DNA-Methylierung? Jüngste Beweise zeigen, dass der Methylierungsumsatz an den Gen-distalen regulatorischen Elementen, einschließlich Enhancern, angereichert ist und zu groß angelegten oszillatorischen Dynamiken führen kann. Wir diskutieren dieses Phänomen und schlagen vor, dass der DNA-Methylierungsumsatz wichtige Abstammungsentscheidungen erleichtern könnte.

Natur Bewertungen. Genetik, 1, 1, , 06 Okt 2020

LifeTime und Verbesserung der europäischen Gesundheitsversorgung durch zellbasierte interzeptive Medizin.
Rajewsky N, Almouzni G, Gorski SA, Aerts S, Amit I, Bertero MG, Bock C, Bredenoord AL, Cavalli G, Chiocca S, Clevers H, De Strooper B, Eggert A, Ellenberg J, Fernández XM, Figlerowicz M, Gasser SM, Hubner N, Kjems J, Knoblich JA, Krabbe G, Lichter P, Linnarsson S, Marine JC, Marioni J, Marti-Renom MA, Netea MG, Nickel D, Nollmann M, Novak HR, Parkinson H, Piccolo S, Pinheiro I, Pombo A, Popp C, Reik W, Roman-Roman S, Rosenstiel P, Schultze JL, Stegle O, Tanay A, Testa G, Thanos D, Theis FJ, Torres-Padilla ME, Valencia A, Vallot C, van Oudenaarden A, Vidal M, Voet T,

LifeTime zielt darauf ab, menschliche Zellen während des Auftretens und Fortschreitens komplexer Krankheiten und ihres Ansprechens auf die Therapie mit Einzelzellauflösung zu verfolgen, zu verstehen und gezielt anzusprechen. Diese Mission wird durch die Entwicklung und Integration von Einzelzell-Multi-Omics und Bildgebung, künstlicher Intelligenz und von Patienten abgeleiteten experimentellen Krankheitsmodellen während des Fortschreitens von Gesundheit zu Krankheit umgesetzt. Die Analyse solch großer molekularer und klinischer Datensätze wird molekulare Mechanismen aufdecken, prädiktive Computermodelle des Krankheitsverlaufs erstellen und neue Wirkstoffziele und Therapien aufdecken. Die rechtzeitige Erkennung und das Abfangen von Krankheiten, eingebettet in eine ethische und patientenorientierte Vision, werden durch Interaktionen zwischen Hochschulen, Krankenhäusern, Patientenverbänden, Gesundheitsdatenmanagementsystemen und der Industrie erreicht. Die Anwendung dieser Strategie auf die wichtigsten medizinischen Herausforderungen bei Krebs, neurologischen, infektiösen, chronisch-entzündlichen und kardiovaskulären Erkrankungen auf Einzelzellebene wird im nächsten Jahrzehnt die zellbasierte interzeptive Medizin in Europa einführen.

DNA-Methylierung stößt die Bindung von Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren ab, um die Tumorimmuntoleranz aufrechtzuerhalten.
D'Anna F, Van Dyck L, Xiong J, Zhao H, Berrens RV, Qian J, Bieniasz-Krzywiec P, Chandra V, Schoonjans L, Matthews J, De Smedt J, Minnoye L, Amorim R, Khorasanizadeh S, Yu Q , Zhao L, De Borre M, Savvides SN, Simon MC, Carmeliet P, Reik W, Rastinejad F, Mazzone M, Thienpont B, Lambrechts D

Hypoxie ist bei Krebs und anderen Krankheiten weit verbreitet. Zellen erkennen und passen sich Hypoxie an, indem sie Hypoxie-induzierbare Transkriptionsfaktoren (HIFs) aktivieren, aber es ist immer noch eine offene Frage, warum sich Zelltypen in ihrer transkriptionellen Reaktion auf Hypoxie unterscheiden.

Genombiologie, 21, 1, , 27. Juli 2020

Die zygotische Genomaktivierung (ZGA) ist ein wesentliches transkriptionelles Ereignis in der Embryonalentwicklung, das mit einer umfassenden epigenetischen Reprogrammierung zusammenfällt. Komplexe Manipulationstechniken und mütterliche Proteinspeicher verhindern groß angelegte funktionelle Screenings auf ZGA-Regulatoren in frühen Embryonen. Hier kombinierten wir gepoolte CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) mit Einzelzell-Transkriptomik, um Regulatoren der ZGA-ähnlichen Transkription in embryonalen Stammzellen der Maus zu identifizieren, die als handhabbare, in vitro-Proxy für frühe Mausembryonen dienen. Mittels Multi-Omics-Faktor-Analyse (MOFA+) auf ∼200.000 Einzelzelltranskriptome mit 230 CRISPRa-Störungen haben wir die molekularen Signaturen von ZGA charakterisiert und 24 Faktoren aufgedeckt, die eine ZGA-ähnliche Reaktion fördern. Follow-up-Assays validierten Top-Screen-Hits, darunter das DNA-bindende Protein Dppa2, den Chromatin-Remodeler Smarca5 und den Transkriptionsfaktor Patz1, und funktionelle Experimente zeigten, dass die Regulation der ZGA-ähnlichen Transkription durch Smarca5 von Dppa2 abhängt. Zusammen bietet unser Einzelzell-Transkriptom-Profiling von CRISPRa-gestörten Zellen sowohl auf Systemebene als auch molekulare Einblicke in die Mechanismen, die ZGA orchestrieren.

Zellsysteme, 1, 1, , 29 Jun 2020

Epigenetisches Priming durch Dppa2 und 4 bei Pluripotenz erleichtert das Engagement für mehrere Linien.
Eckersley-Maslin MA, Parry A, Blotenburg M, Krueger C, Ito Y, Franklin VNR, Narita M, D'Santos CS, Reik W

Wie die epigenetische Landschaft in der Entwicklung etabliert wird, wird noch aufgeklärt. Hier entdecken wir die entwicklungsbedingte Pluripotenz 2 und 4 (DPPA2/4) als epigenetische Priming-Faktoren, die eine permissive epigenetische Landschaft an einer Untergruppe von entwicklungsrelevanten bivalenten Promotoren aufbauen, die durch geringe Expression und ausgeglichene RNA-Polymerase gekennzeichnet sind. Differenzierungsassays zeigen, dass embryonale Stammzellen von Dppa2/4-Doppel-Knockout-Maus die Pluripotenz nicht verlassen und sich nicht effizient differenzieren. DPPA2/4 binden sowohl H3K4me3-markierte als auch bivalente Genpromotoren und assoziieren mit COMPASS- und Polycomb-gebundenem Chromatin. Beim Vergleich von Knockout- und induzierbaren Knockdown-Systemen stellen wir fest, dass eine akute Depletion von DPPA2/4 zu einem schnellen Verlust von H3K4me3 aus wichtigen bivalenten Genen führt, während H3K27me3 anfänglich stabiler ist, aber nach längerer Kultur verloren geht. Folglich gewinnen diese Promotoren bei DPPA2/4-Verarmung an DNA-Methylierung und können bei der Differenzierung nicht aktiviert werden. Unsere Ergebnisse decken einen neuartigen epigenetischen Priming-Mechanismus an Entwicklungspromotoren auf und bereiten sie auf eine zukünftige linienspezifische Aktivierung vor.

Naturstruktur- und Molekularbiologie, 1, 1, , 22 Jun 2020

Niedrige Mutationsraten in humanen pluripotenten Stammzellen klinischer Qualität unter verschiedenen Kulturbedingungen.
Thompson O, von Meyenn F, Hewitt Z, Alexander J, Wood A, Weightman R, Gregory S, Krueger F, Andrews S, Barbaric I, Gokhale PJ, Moore HD, Reik W, Milo M, Nik-Zainal S, Yusa K , Andrews PW

Das Auftreten von repetitiven genomischen Veränderungen, die einen selektiven Wachstumsvorteil in pluripotenten Stammzellen bieten, ist für ihre klinische Anwendung von Bedeutung. Der Einfluss unterschiedlicher Kulturbedingungen auf die zugrunde liegende Mutationsrate ist jedoch unbekannt. Hier zeigen wir, dass die Mutationsrate in zwei humanen embryonalen Stammzelllinien, die für die klinische Anwendung gewonnen und gespeichert wurden, gering ist und durch die Kultur mit Rho-Kinase-Inhibitor, der üblicherweise in ihrer routinemäßigen Pflege verwendet wird, nicht wesentlich beeinflusst wird. Allerdings ist die Mutationsrate in Zellen, die unter 5% Sauerstoff kultiviert wurden, um >50% reduziert, wenn wir auch Veränderungen in der Imprint-Methylierung und reversiblen DNA-Hypomethylierung fanden. Mutationen sind gleichmäßig über die Chromosomen verteilt, mit Ausnahme eines leichten Anstiegs auf dem X-Chromosom und einer Erhöhung in den intergenischen Regionen, was darauf hindeutet, dass die Chromatinstruktur die Mutationsrate beeinflussen kann. Insgesamt legen die Ergebnisse nahe, dass pluripotente Stammzellen keinen ungewöhnlich hohen Raten an genetischen oder epigenetischen Veränderungen unterliegen.

Naturkommunikation, 11, 1, , 23 Mär 2020

PMID:32251294
DOI: 10.1038/s41467-020-15271-3

Die Tet3-Ablation in adulten Gehirnneuronen erhöht angstähnliches Verhalten und reguliert die kognitive Funktion bei Mäusen.
Antunes C, Da Silva JD, Guerra-Gomes S, Alves ND, Ferreira F, Loureiro-Campos E, Branco MR, Sousa N, Reik W, Pinto L, Marques CJ

TET3 ist ein Mitglied der Ten-Eleven-Translokations-(TET)-Familie von Enzymen, die 5-Methylcytosin (5mC) zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) oxidieren. Tet3 wird im Gehirn stark exprimiert, wo die 5hmC-Werte am häufigsten vorkommen. Bei erwachsenen Mäusen beobachteten wir, dass TET3 in reifen Neuronen und Oligodendrozyten vorhanden ist, aber in Astrozyten fehlt. Um die Funktion von TET3 in adulten postmitotischen Neuronen zu untersuchen, kreuzten wir Tet3-Fluxed-Mäuse mit einer neuronalen Cre-exprimierenden Mauslinie, Camk2a-CreERT2, um eine Tet3-konditionale KO (cKO)-Mauslinie zu erhalten. Die Ablation von Tet3 in erwachsenen reifen Neuronen führte zu einem verstärkten angstähnlichen Verhalten mit gleichzeitigem Hyperkortikalismus und einer beeinträchtigten Hippocampus-abhängigen räumlichen Orientierung. Transkriptom- und genspezifische Expressionsanalysen des Hippocampus zeigten eine Fehlregulation von Genen, die am Glukokortikoid-Signalweg (HPA-Achse) im ventralen Hippocampus beteiligt sind, während eine Hochregulation von unmittelbar frühen Genen sowohl im dorsalen als auch im ventralen Hippocampusbereich beobachtet wurde. Darüber hinaus weisen Tet3-cKO-Mäuse eine erhöhte Reifung der dendritischen Wirbelsäule in der ventralen CA1-Hippocampus-Subregion auf. Basierend auf diesen Beobachtungen schlagen wir vor, dass TET3 an molekularen Veränderungen beteiligt ist, die Hippocampus-abhängige Funktionen steuern. Diese Ergebnisse zeigen eine entscheidende Rolle epigenetischer Modifikationen bei der Modulation von Gehirnfunktionen und eröffnen neue Einblicke in die molekularen Grundlagen neurologischer Erkrankungen.

Molekulare Psychiatrie, 1, 1, , 26. Feb. 2020

PMID: 32103150
DOI: 10.1038/s41380-020-0695-7

Multi-Omics-Profiling der Mausgastrulation bei Einzelzellauflösung.
Argelaguet R, Clark SJ, Mohammed H, Stapel LC, Krueger C, Kapourani CA, Imaz-Rosshandler I, Lohoff T, Xiang Y, Hanna CW, Smallwood S, Ibarra-Soria X, Büttner F, Sanguinetti G, Xie W, Krueger F, Göttgens B, Rugg-Gunn PJ, Kelsey G, Dean W, Nichols J, Stegle O, Marioni JC, Reik W

Die Bildung der drei primären Keimblätter während der Gastrulation ist ein wesentlicher Schritt bei der Etablierung des Körperplans der Wirbeltiere und ist mit erheblichen Transkriptionsänderungen verbunden. Globale epigenetische Reprogrammierung begleitet diese Veränderungen, aber die Rolle des Epigenoms bei der Regulierung der frühen Entscheidung über das Zellschicksal bleibt ungeklärt, und die Koordination zwischen verschiedenen molekularen Schichten ist unklar. Hier beschreiben wir eine Einzelzell-Multi-Omics-Karte der Zugänglichkeit von Chromatin, DNA-Methylierung und RNA-Expression während des Einsetzens der Gastrulation in Mausembryonen. Der anfängliche Ausstieg aus der Pluripotenz fällt mit der Etablierung einer globalen repressiven epigenetischen Landschaft zusammen, gefolgt von der Entstehung linienspezifischer epigenetischer Muster während der Gastrulation. Bemerkenswerterweise durchlaufen Zellen, die an Mesoderm und Endoderm gebunden sind, weit verbreitete koordinierte epigenetische Umlagerungen an Enhancer-Markierungen, angetrieben durch eine durch die Zehn-Eleven-Translokation (TET) vermittelte Demethylierung und eine gleichzeitige Erhöhung der Zugänglichkeit. Im Gegensatz dazu ist die Methylierungs- und Zugänglichkeitslandschaft ektodermaler Zellen bereits im frühen Epiblast etabliert. Daher werden regulatorische Elemente, die mit jedem Keimblatt assoziiert sind, entweder epigenetisch präpariert oder vor Entscheidungen über das Zellschicksal neu modelliert, was den molekularen Rahmen für eine hierarchische Entstehung der primären Keimblätter liefert.

PMID: 31827285
DOI: 10.1038/s41586-019-1825-8

DNA-Methylierungs-Alterungsuhren: Herausforderungen und Empfehlungen.
Bell CG, Lowe R, Adams PD, Baccarelli AA, Beck S, Bell JT, Christensen BC, Gladyshev VN, Heijmans BT, Horvath S, Ideker T, Issa JJ, Kelsey KT, Marioni RE, Reik W, Relton CL, Schalkwyk LC , Teschendorff AE, Wagner W, Zhang K, Rakyan VK

Epigenetische Uhren umfassen eine Reihe von CpG-Stellen, deren DNA-Methylierungsniveaus das Alter des Subjekts messen. Diese Uhren gelten als hochgenaues molekulares Korrelat des chronologischen Alters bei Menschen und anderen Wirbeltieren. Umfangreiche Forschungen zielen auch auf ihr Potenzial ab, biologische Alterungsraten zu quantifizieren und Langlebigkeit oder verjüngende Interventionen zu testen. Hier diskutieren wir die wichtigsten Herausforderungen, um Uhrmechanismen und den Nutzen von Biomarkern zu verstehen. Dies erfordert die Analyse der Treiber und Regulatoren altersbedingter Veränderungen in Einzelzell-, Gewebe- und krankheitsspezifischen Modellen sowie die Erforschung anderer epigenomischer Merkmale, Längsschnitt- und Diversitätsstudien an der Bevölkerung und nicht-humanen Modellen. Wir beleuchten auch wichtige ethische Fragen bei der forensischen Altersbestimmung und der Vorhersage des Verlaufs des biologischen Alterns eines Individuums.

Genombiologie, 20, 1, , 25 11 2019

PMID: 31767039
DOI: 10.1186/s13059-019-1824-y

Tet3 reguliert die zelluläre Identität und DNA-Methylierung in neuralen Vorläuferzellen.
Santiago M, Antunes C, Guedes M, Iacovino M, Kyba M, Reik W, Sousa N, Pinto L, Branco MR, Marques CJ

TET-Enzyme oxidieren 5-Methylcytosin (5mC) zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), ein Prozess, von dem man annimmt, dass er bei einem aktiven DNA-Demethylierungsmechanismus als Vermittler fungiert. Bemerkenswert ist, dass 5hmC im Gehirn und in neuronalen Zellen sehr reichlich vorhanden ist. Hier haben wir die Funktion von Tet3 in neuralen Vorläuferzellen (NPCs) unter Verwendung eines stabilen und induzierbaren Knockdown-Systems und eines neuronalen Differenzierungsprotokolls in vitro untersucht. Wir zeigen, dass Tet3 während der neuronalen Differenzierung hochreguliert wird, während Tet1 herunterreguliert wird. Überraschenderweise führte der Tet3-Knockdown zu einer Derepression von Pluripotenz-assoziierten Genen wie Oct4, Nanog oder Tcl1, mit gleichzeitiger Hypomethylierung. Darüber hinaus beobachteten wir in Tet3-Knockdown-NPCs das Auftreten von OCT4-positiven Zellen, die zelluläre Aggregate bildeten, was auf eine Dedifferenzierung der Zellen hindeutet. Bemerkenswerterweise führte Tet3 KD zu einem genomischen Verlust der DNA-Methylierung und Hypermethylierung einer kleineren Anzahl von CpGs, die sich in Neurogenese-bezogenen Genen und in Imprinting-Kontrollregionen (ICRs) von Peg10-, Zrsr1- und Mcts2-Imprinting-Genen befinden. Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass TET3 notwendig ist, um die Stilllegung von Pluripotenzgenen und folglich die Identität der neuralen Stammzellen aufrechtzuerhalten, möglicherweise durch Regulierung des DNA-Methylierungsniveaus in neuralen Vorläuferzellen.

Zelluläre und molekulare Biowissenschaften : CMLS, 1, 1420-9071, , 2019

Stimmen in der Methodenentwicklung.
Anikeeva P, Boyden E, Brangwynne C, Cissé II, Fiehn O, Fromme P, Gingras AC, Greene CS, Heard E, Hell SW, Hillman E, Jensen GJ, Karchin R, Kiessling LL, Kleinstiver BP, Knight R, Kukura P , Lancaster MA, Loman N, Looger L, Lundberg E, Luo Q, Miyawaki A, Myers EW, Nolan GP, ​​Picotti P, Reik W, Sauer M, Shalek AK, Shendure J, Slavov N, Tanay A, Troyanskaya O, van Valen D, Wang HW, Yi C, Yin P, Zernicka-Goetz M, Zhuang X

Naturmethoden, 16, 1548-7105, , 2019

Altersbedingte Gewebeveränderungen wurden mit einer Abnahme der Stammzellzahl und -funktion in Verbindung gebracht. Obwohl eine erhöhte Variabilität von Zelle zu Zelle bei der Transkription oder epigenetischen Markierungen als Hauptmerkmal des Alterns vorgeschlagen wurde, ist wenig über die molekulare Vielfalt von Stammzellen während des Alterns bekannt. Hier präsentieren wir eine Einzelzell-Multi-Omics-Studie an Muskelstammzellen der Maus, die Einzelzelltranskriptom- und DNA-Methylom-Profiling kombiniert. Gealterte Zellen zeigen eine globale Zunahme unkoordinierter Transkriptionsheterogenität, die auf Gene ausgerichtet ist, die Zell-Nischen-Interaktionen regulieren. Wir finden kontextabhängige Veränderungen der DNA-Methylierung in gealterten Stammzellen. Wichtig ist, dass Promotoren mit erhöhter Methylierungsheterogenität mit einer erhöhten Transkriptionsheterogenität der Gene, die sie steuern, verbunden sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass epigenetische Drift durch Akkumulation von stochastischen DNA-Methylierungsänderungen in Promotoren mit dem Abbau kohärenter Transkriptionsnetzwerke während der Stammzellalterung verbunden ist. Darüber hinaus geben unsere Beobachtungen Aufschluss über die Mechanismen, die der DNA-Methylierungsuhr zugrunde liegen.

Naturkommunikation, 10, 2041-1723, , 2019

Ausgeprägte molekulare Trajektorien konvergieren, um naive Pluripotenz zu induzieren.
Stuart HT, Stirparo GG, Lohoff T, Bates LE, Kinoshita M, Lim CY, Sousa EJ, Maskalenka K, Radzisheuskaya A, Malcolm AA, Alves MRP, Lloyd RL, Nestorowa S, Humphreys P, Mansfield W, Reik W, Bertone P , Nichols J, Göttgens B, Silva JCR

Zu verstehen, wie Zellidentitätsübergänge auftreten und ob es mehrere Pfade zwischen denselben Anfangs- und Endzuständen gibt, sind Fragen von großem Interesse. Hier zeigen wir, dass der Erwerb naiver Pluripotenz transkriptionell und mechanistisch unterschiedlichen Wegen folgen kann. Ausgehend von Post-Implantations-Epiblasten-Stammzellen (EpiSCs) durchläuft eine Route einen mesodermalen Zustand vor der naiven Pluripotenz-Induktion, während eine andere vorübergehend der frühen inneren Zellmasse ähnelt und entsprechend eine größere Entwicklungspotenz gewinnt. Diese Routen verwenden unterschiedliche Signalnetzwerke und Transkriptionsfaktoren, konvergieren jedoch anschließend am gleichen naiven Endpunkt, was eine überraschende Flexibilität der Mechanismen zeigt, die Identitätsübergängen zugrunde liegen, und darauf hindeutet, dass die naive Pluripotenz ein mehrdimensionaler Attraktorzustand ist. Diese Routenunterschiede werden durch die präzise Expression von Oct4 als einem einigenden, wesentlichen und ausreichenden Merkmal ausgeglichen. Wir schlagen vor, dass eine fein abgestimmte Regulierung dieses "Übergangsfaktors" den multidimensionalen Zugang zu naiver Pluripotenz untermauert und einen konzeptionellen Rahmen für das Verständnis von Zellidentitätsübergängen bietet.

Zellstammzelle, , 1875-9777, , 2019

Ein Screening auf Gene, die die epigenetische Alterungsuhr beim Menschen beschleunigen, zeigt eine Rolle für die H3K36-Methyltransferase NSD1.
Martin-Herranz DE, Aref-Eshghi E, Bonder MJ, Stubbs TM, Choufani S, Weksberg R, Stegle O, Sadikovic B, Reik W, Thornton JM

Epigenetische Uhren sind mathematische Modelle, die das biologische Alter eines Individuums anhand von DNA-Methylierungsdaten vorhersagen und sich in den letzten Jahren als die genauesten Biomarker des Alterungsprozesses herausgestellt haben. Über die molekularen Mechanismen, die die Geschwindigkeit solcher Uhren steuern, ist jedoch wenig bekannt. Hier haben wir die menschliche epigenetische Uhr bei Patienten mit einer Vielzahl von Entwicklungsstörungen untersucht, die Mutationen in Proteinen der epigenetischen Maschinerie aufweisen.

Genombiologie, 20, 1474-760X, , 2019

Etablierung von erweiterten potentiellen Stammzellen vom Schwein und vom Menschen.
Gao X, Nowak-Imialek M, Chen X, Chen D, Herrmann D, Ruan D, Chen ACH, Eckersley-Maslin MA, Ahmad S, Lee YL, Kobayashi T, Ryan D, Zhong J, Zhu J, Wu J, Lan G, Petkov S, Yang J, Antunes L, Campos LS, Fu B, Wang S, Yong Y, Wang X, Xue SG, Ge L, Liu Z, Huang Y, Nie T, Li P, Wu D, Pei D, Zhang Y, Lu L, Yang F, Kimber SJ, Reik W, Zou X, Shang Z, Lai L, Surani A, Tam PPL, Ahmed A, Yeung WSB, Teichmann SA, Niemann H, Liu P

Wir haben kürzlich expandierte potentielle Stammzellen (EPSCs) von Mäusen aus einzelnen Blastomeren abgeleitet, indem wir die kritischen molekularen Wege, die ihre Differenzierung prädisponieren, hemmen. EPSCs hatten angereicherte molekulare Signaturen von Blastomeren und besaßen Entwicklungspotential für alle embryonalen und extraembryonalen Zelllinien. Hier berichten wir über die Ableitung von porcinen EPSCs, die wichtige Pluripotenzgene exprimieren, genetisch stabil sind, Genome Editing ermöglichen, in Chimären zu Derivaten der drei Keimblätter differenzieren und in vitro primordiale keimzellähnliche Zellen produzieren. Unter ähnlichen Bedingungen können humane embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen in EPSCs umgewandelt oder somatische Zellen direkt umprogrammiert werden, die die molekularen und funktionellen Eigenschaften aufweisen, die an Schweine-EPSCs erinnern. Es ist wichtig, dass Trophoblast-Stammzellen-ähnliche Zellen sowohl aus menschlichen als auch aus porcinen EPSCs erzeugt werden können. Unser Paradigma der Pathway-Hemmung eröffnet somit einen Weg zur Erzeugung pluripotenter Säugerstammzellen, und EPSCs stellen eine einzigartige zelluläre Plattform für die translationale Forschung in der Biotechnologie und regenerativen Medizin dar.

Naturzellbiologie, 21, 1476-4679, , 2019

Ten-Eleven-Translokations-(TET)-Proteine ​​katalysieren die DNA-Hydroxylierung und spielen eine wichtige Rolle bei der Demethylierung von DNA in Säugetieren. Bemerkenswerterweise ist die potenzielle Rolle von TET-Proteinen bei der Neurogenese bei Erwachsenen unbekannt, obwohl die Hydroxymethylierungsspiegel im Gehirn von Mäusen hoch sind. Wir zeigen hier, dass eine nicht-katalytische Wirkung von TET3 im Wesentlichen für die Aufrechterhaltung des neuralen Stammzellpools (NSC) in der Nische der subventrikulären Zone (SVZ) des Erwachsenen erforderlich ist, indem eine vorzeitige Differenzierung von NSCs in nicht-neurogene Astrozyten verhindert wird. Dies geschieht durch die direkte Bindung von TET3 an das väterliche transkribierte Allel des geprägten Gens Kleines nukleäres Ribonukleoprotein-assoziiertes Polypeptid N (Snrpn), das zur transkriptionellen Repression des Gens beiträgt. Die Studie identifiziert auch BMP2 als einen Effektor der durch SNRPN vermittelten astrocytischen terminalen Differenzierung. Unsere Arbeit beschreibt einen neuartigen Kontrollmechanismus eines geprägten Gens in der Regulation der adulten Neurogenese durch eine unkonventionelle Rolle von TET3.

Naturkommunikation, 10, 2041-1723, , 2019

Nach der Veröffentlichung des Originalartikels [1] wurde berichtet, dass die falsche "Additional file 3" veröffentlicht wurde. Die richtige zusätzliche Datei ist unten angegeben.

Genombiologie, 20, 1474-760X, , 2019

Eine einzellige molekulare Karte der Mausgastrulation und der frühen Organogenese.
Pijuan-Sala B, Griffiths JA, Guibentif C, Hiscock TW, Jawaid W, Calero-Nieto FJ, Mulas C, Ibarra-Soria X, Tyser RCV, Ho DLL, Reik W, Srinivas S, Simons BD, Nichols J, Marioni JC , Götgens B

Im gesamten Tierreich stellt die Gastrulation ein wichtiges Entwicklungsereignis dar, bei dem sich embryonale pluripotente Zellen in linienspezifische Vorläufer diversifizieren, die den erwachsenen Organismus hervorbringen. Hier berichten wir über die Transkriptionsprofile von 116.312 Einzelzellen aus Mausembryonen, die zu neun aufeinander folgenden Zeitpunkten zwischen 6,5 und 8,5 Tagen nach der Befruchtung gesammelt wurden. Wir konstruieren eine molekulare Karte der zellulären Differenzierung von der Pluripotenz zu allen wichtigen embryonalen Abstammungslinien und untersuchen die komplexen Ereignisse, die an der Konvergenz von viszeralem und primitivem Streak-abgeleitetem Endoderm beteiligt sind. Darüber hinaus verwenden wir Einzelzell-Profiling, um zu zeigen, dass chimäre Tal1-Embryonen Defekte in der frühen Mesodermdiversifikation aufweisen, und zeigen so, wie die Kombination von zeitlicher und transkriptionaler Information die Genfunktion beleuchten kann. Zusammengenommen stellt diese umfassende Darstellung der Differenzierungstrajektorien von Säugetierzellen in vivo eine Grundlage für das Verständnis der Auswirkungen von Genmutationen während der Entwicklung sowie einen Fahrplan für die Optimierung von In-vitro-Differenzierungsprotokollen für die regenerative Medizin dar.

Ein kombiniertes Einzelzell-Profiling von Expression und DNA-Methylierung zeigt Spleißregulation und Heterogenität.
Linker SM, Urban L, Clark SJ, Chhatriwala M, Amatya S, McCarthy DJ, Ebersberger I, Vallier L, Reik W, Stegle O, Bonder MJ

Alternatives Spleißen ist ein wichtiger Regulationsmechanismus in eukaryontischen Zellen und erhöht die effektive Anzahl funktionell unterschiedlicher Genprodukte. Unter Verwendung von Massen-RNA-Sequenzierung wurde die Spleißvariation in menschlichem Gewebe und in genetisch unterschiedlichen Populationen untersucht. Dies hat krankheitsrelevante Spleißereignisse sowie Assoziationen zwischen Spleißen und genomischen Merkmalen, einschließlich Sequenzzusammensetzung und Konservierung, identifiziert. Die Variabilität beim Spleißen zwischen einzelnen Zellen aus demselben Gewebe oder Zelltyp und seinen Determinanten ist jedoch noch wenig verstanden.

Genombiologie, 20, 1474-760X, , 2019

Die molekulare Regulation der zygotischen Genomaktivierung (ZGA) bei Säugetieren bleibt ein spannendes Forschungsgebiet. Geprimte embryonale Stammzellen der Maus enthalten eine seltene Untergruppe von "2C-ähnlichen" Zellen, die epigenetisch und transkriptionell dem zweizelligen Embryo ähnlich sind und somit eine in vitro-Annäherung zum Studium der ZGA-Transkriptionsregulation darstellen. Kürzlich wurde beschrieben, dass der Transkriptionsfaktor Dux, der in der Nebenwelle von ZGA exprimiert wird, viele nachgeschaltete ZGA-Transkripte aktiviert. Es bleibt jedoch unbekannt, welche vorgelagerten maternalen Faktoren ZGA entweder auf Dux-abhängige oder Dux-unabhängige Weise auslösen. Hier führten wir ein Kandidaten-basiertes Überexpressions-Screening durch und identifizierten unter anderem entwicklungsbedingtes Pluripotenz-assoziiertes 2 (Dppa2) und Dppa4 als positive Regulatoren von 2C-ähnlichen Zellen und die Transkription von ZGA-Genen.In der Keimbahn fällt die Demethylierung der Promotor-DNA mit der Expression von Dppa2 und Dppa4 zusammen, die bis zum Embryonaltag 7.5 (E7.5) exprimiert bleiben, wenn ihre Promotoren remethyliert werden. Darüber hinaus werden Dppa2 und Dppa4 auch während der induzierten Reprogrammierung pluripotenter Stammzellen (iPSC) zu dem Zeitpunkt exprimiert, zu dem die 2C-ähnliche Transkription vorübergehend ihren Höhepunkt erreicht. Durch eine Kombination von Überexpressions-, Knockdown-, Knockout- und Rescue-Experimenten zusammen mit Transkriptionsanalysen zeigen wir, dass Dppa2 und Dppa4 die 2C-ähnliche Zellpopulation und zugehörige Transkripte, einschließlich Dux und dem Zscan4-Cluster, direkt regulieren. Wichtig ist, dass wir die molekulare Hierarchie auseinandergenommen haben, in der das 2C-ähnliche Transkriptionsprogramm initiiert und stabilisiert wird. Dppa2 und Dppa4 benötigen Dux, um eine 2C-ähnliche Transkription zu initiieren, was darauf hindeutet, dass sie stromaufwärts wirken, indem sie Dux direkt regulieren. Dies untermauert die Analyse von ChIP-seq (Chromatin Immunopräzipitation [ChIP] kombiniert mit Hochdurchsatz-Sequenzierung), dass Dppa2 und Dppa4 an den Dux-Promotor und Genkörper binden und dessen Expression vorantreiben. Zscan4c ist auch in der Lage, 2C-ähnliche Zellen in Wildtypzellen zu induzieren, kann dies jedoch im Gegensatz zu Dux in Dppa2/4-Double-Knockout-Zellen nicht mehr, was darauf hindeutet, dass es das Transkriptionsnetzwerk eher stabilisieren als treiben könnte. Unsere Ergebnisse legen ein Modell nahe, in dem die Dppa2/4-Bindung an den Dux-Promotor zu einer Dux-Hochregulierung und Aktivierung des 2C-ähnlichen Transkriptionsprogramms führt, das anschließend durch Zscan4c verstärkt wird.

Gene & Entwicklung, 33, 1549-5477, , 2019

Herkömmliche humane embryonale Stammzellen gelten als geprimt pluripotent, können jedoch in einen naiven Zustand gebracht werden. Die transkriptionellen Merkmale, die mit naiver und geprimter Pluripotenz verbunden sind, sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Hier verwendeten wir Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um die Unterschiede zwischen diesen Bedingungen zu charakterisieren. Wir beobachteten, dass sowohl naive als auch geprimte Populationen größtenteils homogen waren und keine klare linienbezogene Struktur hatten, und identifizierten eine Zwischensubpopulation naiver Zellen mit geprimter-ähnlicher Expression. Wir fanden heraus, dass die naiv geprimte Pluripotenzachse speziesübergreifend erhalten bleibt, obwohl der Zeitpunkt des Übergangs in einen geprimten Zustand speziesspezifisch ist. Wir identifizierten auch Marker zur Unterscheidung von humaner naiver und geprimter Pluripotenz sowie starke co-regulatorische Beziehungen zwischen Lineage-Markern und epigenetischen Regulatoren, die ausschließlich naiven Zellen vorbehalten waren. Unsere Daten liefern wertvolle Einblicke in die transkriptionelle Landschaft der menschlichen Pluripotenz mit einer zellulären und genomweiten Auflösung.

Zellenberichte, 26, 2211-1247, , 2019

Das nicht-kanonische SMC-Protein SmcHD1 wirkt der TAD-Bildung und Kompartimentierung auf dem inaktiven X-Chromosom entgegen.
Gdula MR, Nesterova TB, Pintacuda G, Godwin J, Zhan Y, Ozadam H, McClellan M, Moralli D, Krueger F, Green CM, Reik W, Kriaucionis S, Heard E, Dekker J, Brockdorff N

Das inaktive X-Chromosom (Xi) bei weiblichen Säugetieren nimmt eine atypische Chromatinstruktur höherer Ordnung an, die sich als globaler Verlust lokaler topologisch assoziierter Domänen (TADs), A/B-Kompartimente und Bildung von zwei Megadomänen manifestiert. Hier zeigen wir, dass das nicht-kanonische Protein der SMC-Familie, SmcHD1, das für die Gen-Silencing auf Xi wichtig ist, zu dieser einzigartigen Chromosomenarchitektur beiträgt. Insbesondere zeigt die allelische Kartierung des Transkriptoms und Epigenoms in mutierten SmcHD1-Zellen das Auftreten von Sub-Megabasen-Domänen, die durch Genaktivierung, CpG-Hypermethylierung und Depletion von Polycomb-vermitteltem H3K27me3 definiert sind. Diese Domänen, die mit SmcHD1-Anreicherungsstellen auf Xi in Wildtyp-Zellen korrelieren, übernehmen zusätzlich Merkmale der Chromosomenarchitektur höherer Ordnung des aktiven X-Chromosoms, einschließlich A/B-Kompartimenten und teilweise Wiederherstellung der TAD-Grenzen. Änderungen der Xi-Chromosomarchitektur traten auch nach dem SmcHD1-Knockout in einem somatischen Zellmodell auf, in diesem Fall jedoch unabhängig von der Xi-Gen-Derepression. Wir schließen daraus, dass SmcHD1 ein Schlüsselfaktor bei der Definition der einzigartigen Chromosomenarchitektur von Xi ist.

Naturkommunikation, 10, 2041-1723, , 2019

Diätetische, pharmakologische und genetische Interventionen können die Gesundheit und Lebensdauer verschiedener Säugetierarten verlängern. DNA-Methylierung wurde mit der Vermittlung der positiven Auswirkungen dieser Interventionen in Verbindung gebracht. Methylierungsmuster verschlechtern sich während des Alterns, und dies wird durch lebensdauerverlängernde Interventionen verhindert. Ob diese Interventionen jedoch auch das Epigenom aktiv mitgestalten und ob eine solche epigenetische Reprogrammierung zu einer verbesserten Gesundheit im Alter beiträgt, bleibt jedoch noch zu wenig erforscht. Wir analysierten veröffentlichte Gesamtgenom-BS-seq-Datensätze aus der Mausleber, um DNA-Methylierungsmuster bei alten Mäusen als Reaktion auf drei lebensdauerverlängernde Interventionen zu untersuchen: diätetische Einschränkung (DR), reduzierte TOR-Signalübertragung (Rapamycin) und reduziertes Wachstum ( Ames-Zwergmäuse). Zwergmäuse zeigen eine verstärkte DNA-Hypermethylierung im Körper von Schlüsselgenen der Lipidbiosynthese, der Zellproliferation und der somatotropen Signalübertragung, die stark mit dem Muster der Transkriptionsrepression korreliert. Bemerkenswerterweise verursacht DR eine ähnliche Hypermethylierung in Lipidbiosynthesegenen, während die Behandlung mit Rapamycin die Methylierungssignaturen in Genen erhöht, die für Wachstumsfaktor- und Wachstumshormonrezeptoren kodieren. Gemeinsame Veränderungen der DNA-Methylierung waren auf hypermethylierte Regionen beschränkt und waren nicht nur eine Folge einer verlangsamten Alterung, was auf einen aktiven Mechanismus hindeutet, der ihre Bildung antreibt. Durch den Vergleich der Überlappung altersunabhängiger hypermethylierter Muster zwischen allen drei Interventionen identifizierten wir vier Regionen, die unabhängig von genetischem Hintergrund oder Geschlecht als neuartige Biomarker für langlebigere Interventionen dienen können. Zusammenfassend identifizierten wir die Hypermethylierung des Genkörpers als eine neue und teilweise konservierte Signatur lebensdauerverlängernder Interventionen bei Mäusen, was die epigenetische Reprogrammierung als mögliche Intervention zur Verbesserung der Gesundheit im Alter hervorhebt.

PLoS-Genetik, 14, 1553-7404, , 2018

Der Mausembryo ist das kanonische Modell für die Präimplantationsentwicklung von Säugetieren. Jüngste Fortschritte beim Einzelzell-Profiling ermöglichen eine detaillierte Analyse der Embryogenese anderer Euther-Arten, einschließlich des Menschen, um konservierte von abweichenden regulatorischen Programmen und Signalwegen im Nagetierparadigma zu unterscheiden. Hier identifizieren und vergleichen wir transkriptionelle Merkmale von Embryonen von Mensch, Weißbüschelaffe und Maus anhand einzelner Zell-RNA-seq. Die Aktivierung des zygotischen Genoms korreliert mit dem Vorhandensein von repressiven Polycomb-Komplexen in allen drei Spezies, während die Ribosomen-Biogenese als vorherrschendes Merkmal in Primatenembryonen auftaucht, was eine verlängerte Translation maternal abgelagerter RNAs unterstützt. Wir stellen fest, dass die Expressionssignaturen von transponierbaren Elementen spezies-, stadien- und linienspezifisch sind. Dem Pluripotenznetzwerk im Primaten-Epiblast fehlen bestimmte Regulatoren, die in der Maus wirksam sind, umfasst jedoch WNT-Komponenten und Gene, die mit der Trophoblasten-Spezifikation assoziiert sind. Die sequentielle Aktivierung der Marker GATA6, SOX17 und GATA4 der primitiven Endodermidentität ist in Primaten konserviert. Unerwarteterweise ist OTX2 auch mit der primitiven Endoderm-Spezifikation in menschlichen und nicht-menschlichen Primaten-Blastozysten verbunden. Unsere artenübergreifende Analyse grenzt sowohl konservierte als auch primatenspezifische Merkmale der Präimplantationsentwicklung ab und unterstreicht die molekulare Anpassungsfähigkeit der frühen Säugetierembryogenese.

Entwicklung (Cambridge, England), 145, 1477-9129, , 2018

5-Formylcytosin organisiert Nukleosomen und bildet Schiff-Base-Wechselwirkungen mit Histonen in embryonalen Stammzellen der Maus.
Raiber EA, Portella G, Martínez Cuesta S, Hardisty R, Murat P, Li Z, Iurlaro M, Dean W, Spindel J, Beraldi D, Liu Z, Dawson MA, Reik W, Balasubramanian S

Nukleosomen sind die Grundeinheit des Chromatins, die bei der Verpackung von genetischem Material helfen und gleichzeitig den Zugang zur genetischen Information kontrollieren. Die zugrunde liegende DNA-Sequenz, zusammen mit Transkriptions-assoziierten Proteinen und Chromatin-Remodeling-Komplexen, sind wichtige Faktoren, die die Organisation von Nukleosomen beeinflussen. Hier zeigen wir, dass die natürlich vorkommende DNA-Modifikation 5-Formylcytosin (5fC) mit der gewebespezifischen Nukleosomenorganisation verbunden ist. Unsere Studie zeigt, dass 5fC in vitro und in vivo mit einer erhöhten Nukleosomenbelegung verbunden ist. Wir zeigen, dass 5fC-assoziierte Nukleosomen an Enhancern im Hinterhirn und im Herzen von Säugetieren mit einer erhöhten Genexpression verbunden sind. Unsere Studie zeigt auch die Bildung einer reversiblen kovalenten Schiff-Base-Verknüpfung zwischen Lysinen von Histonproteinen und 5fC innerhalb von Nukleosomen in einer zellulären Umgebung. Wir definieren ihre spezifischen genomischen Loci in embryonalen Stammzellen der Maus und untersuchen die biologischen Konsequenzen dieser DNA-Histon-Schiff-Basen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass 5fC eine Determinante der Nukleosomenorganisation ist und eine Rolle bei der Etablierung unterschiedlicher regulatorischer Regionen spielt, die die Transkription kontrollieren.

Naturchemie, , 1755-4349, , 2018

Mütterliche Überernährung wurde mit einer erhöhten Anfälligkeit für die Entwicklung von Fettleibigkeit und neurologischen Störungen im späteren Leben in Verbindung gebracht. Die meisten epidemiologischen und experimentellen Studien konzentrierten sich auf die metabolischen Folgen über Generationen hinweg nach einer frühen entwicklungsbedingten Ernährungsstörung. Kürzlich wurde gezeigt, dass die mütterliche fettreiche Ernährung (HFD) die Körpermasse der dritten Generation über die väterliche Abstammung beeinflusst. Wir haben hier gezeigt, dass die Nachkommen von HFD-Vorfahren süchtig machende Verhaltensweisen sowie Fettleibigkeit und Insulinresistenz bis zur dritten Generation zeigten, wenn keine weitere HFD-Exposition vorliegt. Diese Ergebnisse implizieren, dass die männliche Keimbahn eine wichtige Rolle bei der Übertragung phänotypischer Merkmale spielt. Diese Verhaltens- und physiologischen Veränderungen gingen einher mit reduzierten striatalen Dopaminspiegeln und einer erhöhten Dopamin-2-Rezeptordichte. Interessanterweise zeigte sich in der dritten Generation eine klare Geschlechtertrennung, bei der Weibchen suchterzeugende Verhaltensweisen zeigten, während männliche HFD-Nachkommen einen adipogenen Phänotyp zeigten. Das Methylom-Profiling von F1- und F2-Spermien zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Nachkommengruppen, was darauf hindeutet, dass das Spermien-Methylom möglicherweise nicht der Hauptträger für die Übertragung der in unserem Mausmodell beobachteten Phänotypen ist. Zusammen zeigt unsere Studie zum ersten Mal, dass die mütterliche HFD-Beleidigung anhaltende Veränderungen des mesolimbischen dopaminergen Systems verursacht, was auf eine Veranlagung hindeutet, über mehrere Generationen hinweg Fettleibigkeit und suchterzeugende Verhaltensweisen zu entwickeln.

Translationale Psychiatrie, 8, 2158-3188, , 2018

Genomskala-Oszillationen bei der DNA-Methylierung während des Ausstiegs aus der Pluripotenz.
Rulands S, Lee HJ, Clark SJ, Angermueller C, Smallwood SA, Krueger F, Mohammed H, Dean W, Nichols J, Rugg-Gunn P, Kelsey G, Stegle O, Simons BD, Reik W

Pluripotenz wird von der Löschung des epigenetischen Gedächtnisses der Eltern begleitet, wobei naive pluripotente Zellen sowohl in vitro als auch in vivo eine globale DNA-Hypomethylierung aufweisen. Der Ausstieg aus der Pluripotenz und das Priming zur Differenzierung in somatische Abstammungslinien ist mit einer genomweiten de novo DNA-Methylierung verbunden. Wir zeigen, dass während dieser Phase die Co-Expression von Enzymen, die für den DNA-Methylierungsumsatz erforderlich sind, DNMT3s und TETs, die Variabilität von Zelle zu Zelle in dieser epigenetischen Markierung fördert. Mit einer Kombination aus Einzelzellsequenzierung und quantitativer biophysikalischer Modellierung zeigen wir, dass diese Variabilität mit kohärenten, genomischen Oszillationen bei der DNA-Methylierung mit einer von der CpG-Dichte abhängigen Amplitude verbunden ist. Die Analyse paralleler transkriptionaler und epigenetischer Profilerstellung einzelner Zellen liefert Beweise für die oszillatorische Dynamik sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Beobachtungen liefern Einblicke in die Entstehung epigenetischer Heterogenität während der frühen Embryonalentwicklung, was darauf hindeutet, dass dynamische Veränderungen der DNA-Methylierung frühe Entscheidungen über das Zellschicksal beeinflussen könnten.

Zellsysteme, , 2405-4712, , 2018

Kälteinduzierte epigenetische Programmierung der Spermien erhöht die Aktivität des braunen Fettgewebes bei den Nachkommen.
Sun W, Dong H, Becker AS, Dapito DH, Modica S, Grandl G, Opitz L, Efthymiou V, Straub LG, Sarker G, Balaz M, Balazova L, Perdikari A, Kiehlmann E, Bacanovic S, Zellweger C, Peleg- Raibstein D, Pelczar P, Reik W, Burger IA, von Meyenn F, Wolfrum C

Neuere Forschungen haben sich auf Umwelteinflüsse konzentriert, die die Gewebefunktionalität und den systemischen Stoffwechsel steuern. Ob solche Stimuli jedoch die menschliche Thermogenese und den Body-Mass-Index (BMI) beeinflussen, wurde nicht untersucht. Hier zeigen wir retrospektiv, dass das Vorhandensein von braunem Fettgewebe (BAT) und die Jahreszeit der Empfängnis beim Menschen mit dem BMI verbunden sind. Bei Mäusen zeigen wir, dass die Kälteexposition (CE) von Männchen, aber nicht von Weibchen, vor der Paarung zu einem verbesserten systemischen Stoffwechsel und einem Schutz vor ernährungsbedingter Fettleibigkeit der männlichen Nachkommen führt. Integrierte Analysen des DNA-Methyloms und der RNA-Sequenzierung der Spermien männlicher Mäuse zeigten mehrere Cluster von koregulierten differentiell methylierten Regionen (DMRs) und differentiell exprimierten Genen (DEGs), was darauf hindeutet, dass die verbesserte metabolische Gesundheit der Nachkommen auf verbesserte BAT . zurückzuführen ist Bildung und gesteigerte Neurogenese. Die Schlussfolgerungen werden durch zellautonome Studien an den Nachkommen gestützt, die eine verbesserte Fähigkeit zur Bildung reifer aktiver brauner Adipozyten, eine verbesserte neuronale Dichte und eine stärkere Freisetzung von Noradrenalin in BAT als Reaktion auf Kältestimulation zeigen. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse, dass bei Menschen und bei Mäusen saisonale oder experimentelle CE eine epigenetische Programmierung der Spermien induziert, sodass die Nachkommen hyperaktive BAT und eine verbesserte Anpassung an Überernährung und Hypothermie beherbergen.

Naturmedizin, , 1546-170X, , 2018

Eine defekte Keimbahn-Reprogrammierung bei Piwil4 (Miwi2)- und Dnmt3l-defizienten Mäusen führt dazu, dass die Transposon-Stummschaltung, Meiose-Arrest und fortschreitender Verlust von Spermatogonien nicht wiederhergestellt werden können. Hier versuchten wir, die molekularen Grundlagen für diese spermatogoniale Dysfunktion zu verstehen. Durch eine Kombination aus Bildgebung, konditionaler Genetik und Transkriptomanalyse zeigen wir, dass die Keimzellelimination in den jeweiligen Mutanten durch eine defekte de novo Genommethylierung während der Reprogrammierung und nicht durch eine Funktion der entsprechenden Faktoren innerhalb der Spermatogonien zustande kommt. Sowohl in Miwi2- als auch in Dnmt3l-Spermatogonien ist die intrazisternale A-Partikel-(IAP)-Familie endogener Retroviren dereprimiert, aber im Gegensatz zu meiotischen Zellen wird keine DNA-Schädigung beobachtet. Stattdessen stellen wir fest, dass unmethylierte IAP-Promotoren das spermatogoniale Transkriptom neu verdrahten, indem sie die Expression benachbarter Gene vorantreiben. Schließlich sind Spermatogonienzahl, Proliferation und Differenzierung bei Miwi2- und Dnmt31-Mäusen verändert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine fehlerhafte Reprogrammierung das spermatogoniale Transkriptom dereguliert und der spermatogonialen Dysfunktion zugrunde liegen kann.

Naturstruktur- und Molekularbiologie, 25, 1545-9985, , 2018

Kurz nach der Befruchtung findet ein bemerkenswerter epigenetischer Umbauprozess statt, der die Totipotenz der Zygote wiederherstellt. Dies beinhaltet globale DNA-Demethylierung, Chromatin-Remodelling, räumliche Reorganisation des Genoms und erhebliche transkriptionelle Veränderungen. Der Schlüssel zu diesen Veränderungen ist der Übergang von der mütterlichen Umgebung der Eizelle zu einem von Embryonen getriebenen Entwicklungsprogramm, ein Prozess, der als Übergang von der Mutter zur Zygote (MZT) bezeichnet wird. Die Aktivierung des zygotischen Genoms erfolgt überwiegend im Zweizellstadium bei Mäusen und im Achtzellstadium beim Menschen, doch die Dynamik seiner Kontrolle ist noch weitgehend unklar. In den letzten Jahren hat sich unser Verständnis der epigenetischen und Chromatinlandschaft der Präimplantationsentwicklung, teilweise aufgrund von epigenomischen Studien mit Einzelzellen und geringer Zellzahl, erheblich verbessert. In diesem Aufsatz diskutieren wir die neuesten Fortschritte bei der Untersuchung des MZT, wobei wir uns auf DNA-Methylierung, posttranslationale Histonmodifikationen, lokale Chromatinstruktur und Genomorganisation höherer Ordnung konzentrieren. Wir diskutieren auch wichtige mechanistische Studien, die die Wirkungsweise von Chromatin-Regulatoren, Transkriptionsfaktoren und nicht-kodierenden RNAs während der Präimplantationsentwicklung untersuchen. Schließlich heben wir Bereiche hervor, die zusätzliche Forschung erfordern, sowie neue technologische Fortschritte, die dazu beitragen könnten, unser Verständnis des MZT schließlich zu vervollständigen.

Natur Bewertungen. Molekulare Zellbiologie, , 1471-0080, , 2018

Korrektur: Epigenetische Zurücksetzung der menschlichen Pluripotenz (doi:10.1242/dev.146811).
Guo G, von Meyenn F, Rostovskaya M, Clarke J, Dietmann S, Baker D, Sahakyan A, Myers S, Bertone P, Reik W, Plath K, Smith A

Entwicklung (Cambridge, England), 145, 1477-9129, , 2018

Die Whole-Genom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS) wird zu einer immer zugänglicheren Technik, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der krankheitsorientierten Forschung weit verbreitet ist. Methoden zur Bibliotheksvorbereitung profitieren von einer Vielzahl verfügbarer Kits, Polymerasen und Bisulfit-Umwandlungsprotokollen. Obwohl bekannt ist, dass einige Schritte des Verfahrens, wie die PCR-Amplifikation, Verzerrungen einführen, fehlt eine systematische Bewertung von Verzerrungen in WGBS-Strategien.

Genombiologie, 19, 1474-760X, , 2018

scNMT-seq ermöglicht ein gemeinsames Profiling der DNA-Methylierung und Transkription der Chromatinzugänglichkeit in Einzelzellen.
Clark SJ, Argelaguet R, Kapourani CA, Stubbs TM, Lee HJ, Alda-Catalinas C, Krueger F, Sanguinetti G, Kelsey G, Marioni JC, Stegle O, Reik W

Parallele Einzelzell-Sequenzierungsprotokolle stellen leistungsfähige Methoden zur Untersuchung regulatorischer Beziehungen dar, einschließlich Epigenom-Transkriptom-Interaktionen. Hier berichten wir über eine Einzelzellmethode für parallele Chromatinzugänglichkeit, DNA-Methylierung und Transkriptom-Profiling. scNMT-seq (single-cell nucleosom, methylation andtranscription sequencing) verwendet eine GpC-Methyltransferase, um offenes Chromatin zu markieren, gefolgt von Bisulfit- und RNA-Sequenzierung. Wir validieren scNMT-seq, indem wir es auf die Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus anwenden, Verbindungen zwischen allen drei molekularen Schichten finden und die dynamische Kopplung zwischen epigenomischen Schichten während der Differenzierung aufdecken.

Naturkommunikation, 9, 2041-1723, , 2018

Wissenschaftsforum: Der Atlas der menschlichen Zellen.
Regev A, Teichmann SA, Lander ES, Amit I, Benoist C, Birney E, Bodenmiller B, Campbell PJ, Carninci P, Clatworthy M, Clevers H, Deplancke B, Dunham I, Eberwine J, Eils R, Enard W, Farmer A , Fugger L, Göttgens B, Hacohen N, Haniffa M, Hemberg M, Kim SK, Klenerman P, Kriegstein A, Lein E, Linnarsson S, Lundberg E, Lundeberg J, Majumder P, Marioni JC, Merad M, Mhlanga M, Nawijn M, Netea M, Nolan G, Pe'er D, Phillipakis A, Ponting CP, Quake SR, Reik W, Rozenblatt-Rosen O, Sanes JR, Satija R, Schumacher TN, Shalek AK, Shapiro E, Sharma P, Shin JW , Stegle O, Stratton MR, Stubbington MJT, Theis FJ, Uhlen M, van Oudenaarden A, Wagner A, Watt FM, Weissman JS, Wold BJ, Xavier RJ, Yosef N,

Das jüngste Aufkommen von Methoden für das Hochdurchsatz-Molekülprofilieren einzelner Zellen hat in der wissenschaftlichen Gemeinschaft ein wachsendes Bewusstsein ausgelöst, dass die Zeit reif ist, die 150 Jahre alten Bemühungen zur Identifizierung aller Zelltypen im menschlichen Körper abzuschließen. Das Human Cell Atlas Project ist ein internationales Gemeinschaftsprojekt, das darauf abzielt, alle menschlichen Zelltypen in Bezug auf charakteristische molekulare Profile (wie Genexpressionsprofile) zu definieren und diese Informationen mit klassischen zellulären Beschreibungen (wie Ort und Morphologie) zu verbinden. Eine offene umfassende Referenzkarte des molekularen Zustands von Zellen in gesunden menschlichen Geweben würde die systematische Untersuchung von physiologischen Zuständen, Entwicklungsverläufen, regulatorischen Schaltkreisen und Interaktionen von Zellen vorantreiben und auch einen Rahmen für das Verständnis der zellulären Dysregulation bei menschlichen Krankheiten bieten. Hier beschreiben wir die Idee, ihren potenziellen Nutzen, frühe Machbarkeitsnachweise und einige Designüberlegungen für den Human Cell Atlas, einschließlich der Verpflichtung zu offenen Daten, Code und Gemeinschaft.

Die Kopplung von shRNA-Screenings mit Einzelzell-RNA-seq identifiziert eine doppelte Rolle für mTOR bei der durch Reprogrammierung induzierten Seneszenz.
Aarts M, Georgilis A, Beniazza M, Beolchi P, Banito A, Carroll T, Kulisic M, Kaemena DF, Dharmalingam G, Martin N, Reik W, Zuber J, Kaji K, Chandra T, Gil J

Die Expression der Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und cMYC (OSKM) reprogrammiert somatische Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Die Reprogrammierung ist ein langsamer und ineffizienter Prozess, was auf das Vorhandensein von Schutzmechanismen hindeutet, die der Umwandlung des Zellschicksals entgegenwirken. Ein solcher Mechanismus ist die Seneszenz. Um Modulatoren der durch Reprogrammierung induzierten Seneszenz zu identifizieren, führten wir einen genomweiten shRNA-Screen in primären humanen Fibroblasten durch, die OSKM exprimieren. Im Screening identifizierten wir neue Mediatoren der OSKM-induzierten Seneszenz und validierten zuvor beteiligte Gene wie CDKN1A Wir entwickelten einen innovativen Ansatz, der die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) in den shRNA-Screen integriert, um den Wirkmechanismus der identifizierten Kandidaten. Unsere Daten enthüllten die Regulierung der Seneszenz als einen neuen Weg, mit dem das mechanistische Ziel von Rapamycin (mTOR) die Reprogrammierung beeinflusst. Einerseits schwächt die mTOR-Hemmung die Induktion von Cyclin-abhängigen Kinase-(CDK)-Inhibitoren (CDKIs), einschließlich p16(INK4a), p21(CIP1) und p15(INK4b), und verhindert so die OSKM-induzierte Seneszenz. Andererseits stumpft die Hemmung von mTOR den Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) ab, der selbst die Reprogrammierung begünstigt. Diese gegensätzlichen Aktionen tragen dazu bei, den komplexen Effekt zu erklären, den mTOR auf die Neuprogrammierung hat. Insgesamt unterstreicht unsere Studie den Vorteil der Kombination von funktionellen Screens mit scRNA-seq, um die Entdeckung von Signalwegen zu beschleunigen, die komplexe Phänotypen kontrollieren.

Gene & Entwicklung, , 1549-5477, , 2017

Das Löschen von DNA-Methylierung und repressiven Chromatinmarkierungen in der Keimbahn von Säugern führt zum Risiko einer transkriptionalen Aktivierung von transponierbaren Elementen (TEs). Hier verwendeten wir embryonale Stammzellen (ESCs) der Maus, um einen EndosiRNA-basierten Mechanismus zu identifizieren, der an der Unterdrückung der TE-Transkription beteiligt ist. In ESCs mit DNA-Demethylierung, die durch akute Deletion von Dnmt1 induziert wurde, sahen wir eine Zunahme der Sense-Transkription bei TEs, was zu einer Fülle von Sense/Antisense-Transkripten führte, was zu hohen Mengen an ARGONAUTE2 (AGO2)-gebundenen kleinen RNAs führte. Die Hemmung der Dicer- oder Ago2-Expression zeigte, dass kleine RNAs an einer unmittelbaren Reaktion auf die durch Demethylierung induzierte Transposon-Aktivierung beteiligt sind, während die Ablagerung repressiver Histonmarkierungen als chronische Reaktion folgt. In vivo fanden wir auch TE-spezifische EndosiRNAs, die während der primordialen Keimzellentwicklung vorhanden sind. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Antisense-TE-Transkription eine "Falle" ist, die eine EndosiRNA-Antwort hervorruft, um die akute Transposon-Aktivität während der epigenetischen Reprogrammierung in der Säugerkeimbahn einzuschränken.

Zellstammzelle, 21, 1875-9777, , 2017

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation bei vielen Arten, die für die Entwicklung entscheidend ist und mit dem Altern und vielen komplexen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht wird. Viele kosteneffektive genomweite Analysen von DNA-Modifikationen beruhen auf Restriktionsenzymen, die in der Lage sind, genomische DNA an definierten Sequenzmotiven zu verdauen. Es gibt Hunderte von Restriktionsenzymfamilien, aber bis heute werden nur wenige verwendet, da kein Werkzeug für die systematische Bewertung von Restriktionsenzymkombinationen zur Verfügung steht, die bestimmte interessierende Stellen in einem Genom anreichern können. Hier stellen wir die angepasste Reduced Representation Bisulfit Sequencing (cuRRBS) vor, eine neuartige und einfach anzuwendende Berechnungsmethode, die dieses Problem löst. Durch die Berechnung der optimalen enzymatischen Verdauungs- und Größenauswahlschritte verallgemeinert cuRRBS das traditionelle MspI-basierte Protokoll der reduzierten Repräsentationsbisulfit-Sequenzierung (RRBS) auf alle Restriktionsenzymkombinationen. Darüber hinaus schätzt cuRRBS die Reduzierung der Sequenzierungskosten und liefert einen Robustheitswert für das personalisierte RRBS-Protokoll, sodass Benutzer das Protokoll an ihre experimentellen Anforderungen anpassen können. Darüber hinaus zeigen wir in silico, dass cuRRBS-definierte Restriktionsenzyme den MspI-Verdau in vielen biologischen Systemen unter Berücksichtigung sowohl des CpG- als auch des CHG-Kontexts durchweg übertreffen. Schließlich haben wir die Genauigkeit der cuRRBS-Vorhersagen für einzelne und doppelte Enzymverdauungen mit zwei unabhängigen experimentellen Datensätzen validiert.

Nukleinsäureforschung, , 1362-4962, , 2017

Etablierung von Maus-expandierten potentiellen Stammzellen.
Yang J, Ryan DJ, Wang W, Tsang JC, Lan G, Masaki H, Gao X, Antunes L, Yu Y, Zhu Z, Wang J, Kolodziejczyk AA, Campos LS, Wang C, Yang F, Zhong Z, Fu B , Eckersley-Maslin MA, Woods M, Tanaka Y, Chen X, Wilkinson AC, Bussell J, White J, Ramirez-Solis R, Reik W, Göttgens B, Teichmann SA, Tam PPL, Nakauchi H, Zou X, Lu L, Liu P

Embryonale Stammzellen der Maus, die aus dem Epiblast stammen, tragen zu den somatischen Linien und der Keimbahn bei, werden jedoch von den extraembryonalen Geweben ausgeschlossen, die aus dem Trophektoderm und dem primitiven Endoderm nach Wiedereinführung in die Blastozyste stammen. Hier berichten wir, dass Kulturen von expandierten potentiellen Stammzellen aus einzelnen achtzelligen Blastomeren und durch direkte Umwandlung von embryonalen Stammzellen der Maus und induzierten pluripotenten Stammzellen hergestellt werden können. Bemerkenswerterweise kann eine einzelne expandierte potentielle Stammzelle in einem Chimären-Assay sowohl zum eigentlichen Embryo als auch zu den Trophektoderm-Linien beitragen. Bona-fide-Trophoblasten-Stammzelllinien und extraembryonale Endoderm-Stammzellen können direkt aus expandierten potentiellen Stammzellen in vitro gewonnen werden. Molekulare Analysen des Epigenoms und des Einzelzelltranskriptoms zeigen eine Anreicherung der Blastomer-spezifischen Signatur und ein dynamisches DNA-Methylom in expandierten potentiellen Stammzellen. Die Erzeugung von erweiterten potentiellen Stammzellen von Mäusen unterstreicht die Machbarkeit der Etablierung von erweiterten potentiellen Stammzellen für andere Säugetierarten.

Single-Cell-Multi-Omics hat sich in jüngster Zeit als leistungsstarke Technologie herausgestellt, mit der verschiedene Ebenen des genomischen Outputs – und damit die Zellidentität und -funktion – gleichzeitig aufgezeichnet werden können. Die Integration verschiedener Komponenten des Epigenoms in Multi-Omics-Messungen ermöglicht es, die zelluläre Heterogenität auf verschiedenen Zeitskalen zu untersuchen und neue Schichten molekularer Konnektivität zwischen dem Genom und seinem funktionellen Output zu entdecken. Zunehmend verfügbare Messungen reichen von solchen, die die Besetzung von Transkriptionsfaktoren und die Initiation der Transkription identifizieren, bis hin zu lang anhaltenden und vererbbaren epigenetischen Markierungen wie DNA-Methylierung. Zusammen mit Techniken, mit denen die Zelllinie aufgezeichnet wird, werden diese vielschichtigen Informationen Einblicke in die Vergangenheit einer Zelle und ihr zukünftiges Potenzial geben. Dies wird neue Ebenen des Verständnisses von Zellschicksalsentscheidungen, -identität und -funktion in der normalen Entwicklung, Physiologie und Krankheit ermöglichen.

Wissenschaft (New York, N.Y.), 358, 1095-9203, , 2017

Zurücksetzen des Transkriptionsfaktor-Steuerschaltkreises auf die Pluripotenz des Grundzustands beim Menschen.
Takashima Y, Guo G, Loos R, Nichols J, Ficz G, Krueger F, Oxley D, Santos F, Clarke J, Mansfield W, Reik W, Bertone P, Smith A

Einzelzelllandschaft der transkriptionellen Heterogenität und Zellschicksalsentscheidungen während der frühen Gastrulation von Mäusen.
Mohammed H, Hernando-Herraez I, Savino A, Scialdone A, Macaulay I, Mulas C, Chandra T, Voet T, Dean W, Nichols J, Marioni JC, Reik W

Die innere Zellmasse (ICM) der Maus segregiert in die Epiblast- und Primitiv-Endoderm-(PrE)-Linien, die mit der Implantation des Embryos zusammenfallen. Der Epiblast erfährt anschließend vor der Gastrulation eine beträchtliche Zunahme der Zellzahlen. Um die zugrunde liegenden regulatorischen Prinzipien zu untersuchen, führten wir eine systematische Einzelzell-RNA-Sequenzierung (seq) von Conceptuses von E3.5 bis E6.5 durch. Der Epiblast zeigt eine Reaktivierung und anschließende Inaktivierung des X-Chromosoms, wobei die Zfp57-Expression mit Reaktivierung und Inaktivierung zusammen mit anderen Kandidaten-Regulatoren verbunden ist. Bei E6.5 ist der Übergang vom Epiblast zum Primitiv Streak mit einer verminderten Expression von Polycomb-Untereinheiten verbunden, was auf eine wichtige regulatorische Rolle hindeutet. Bemerkenswerterweise deuten unsere Analysen auf ein erhöhtes Transkriptionsrauschen bei E3.5 und innerhalb des nicht gebundenen Epiblasts bei E6.5 hin, das mit dem Ausstieg aus der Pluripotenz zusammenfällt. Im Gegensatz dazu wurden E6.5-Primitive-Streak-Zellen hochgradig synchronisiert und zeigen eine verkürzte G1-Zellzyklusphase, die mit einer beschleunigten Proliferation übereinstimmt. Unsere Studie zeichnet systematisch Transkriptionsrauschen auf und deckt molekulare Prozesse auf, die mit frühen Abstammungsentscheidungen verbunden sind.

Zellberichte, 20, 2211-1247, , 2017

Epigenetische Zurücksetzung der menschlichen Pluripotenz.
Guo G, von Meyenn F, Rostovskaya M, Clarke J, Dietmann S, Baker D, Sahakyan A, Myers S, Bertone P, Reik W, Plath K, Smith A

Viel Aufmerksamkeit hat sich auf die Umwandlung von humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) in einen naiven Entwicklungsstatus konzentriert. Hier stellen wir eine Methode zum Zurücksetzen über vorübergehende Histon-Deacetylase-Hemmung zur Verfügung. Das Protokoll ist über mehrere PSC-Linien hinweg wirksam und kann ohne Änderung des Karyotyps durchgeführt werden. Resetzellen können ohne Feeder mit einer Verdopplungszeit von ca. 24 h erweitert werden. Die WNT-Hemmung stabilisiert den Rücksetzprozess. Das Transkriptom von Reset-Zellen weicht deutlich von dem von geprimten PSCs ab und teilt Merkmale mit der menschlichen inneren Zellmasse (ICM). Reset-Zellen aktivieren die Expression von Primaten-spezifischen transponierbaren Elementen. Die DNA-Methylierung wird global auf ein Niveau reduziert, das dem in der ICM äquivalent ist, und ist nicht zufällig, wobei die Methylierung an bestimmten Loci zunimmt. Methylierungsabdrücke gehen jedoch meist verloren. Reset-Zellen können erneut geprimt werden, um eine Tri-Lineage-Differenzierung und Keimbahnspezifikation zu durchlaufen. In weiblichen Reset-Zellen weist das Auftreten einer biallelischen X-chromosomalen Gentranskription auf eine Reaktivierung des stummgeschalteten X-Chromosoms hin. Bei der Rekonversion in den geprimten Status stellt das XIST-induzierte Silencing die monoallelische Genexpression wieder her. Die einfache und robuste Konvertierungsroutine mit begleitenden Datenressourcen wird eine weit verbreitete Nutzung, Abfrage und Verfeinerung von naiven Kandidatenzellen ermöglichen.

Entwicklung (Cambridge, England), 144, 1477-9129, , 2017

Proliferation treibt altersbedingten funktionellen Rückgang in einer Subpopulation des hämatopoetischen Stammzellkompartiments an.
Kirschner K, Chandra T, Kiselev V, Flores-Santa Cruz D, Macaulay IC, Park HJ, Li J, Kent DG, Kumar R, Pask DC, Hamilton TL, Hemberg M, Reik W, Green AR

Das Altern des Kompartiments hämatopoetischer Stammzellen (HSC) ist durch Lineage-Bias und reduzierte Stammzellfunktion gekennzeichnet, deren molekulare Grundlage weitgehend unbekannt ist. Mit Einzelzell-Transkriptomik identifizierten wir eine unterschiedliche Subpopulation alter HSCs, die eine p53-Signatur trugen, die neben dem proproliferativen JAK/STAT-Signalweg auf den Rückgang der Stammzellen hinweist. Um die Beziehung zwischen JAK/STAT und p53-Signalgebung zu untersuchen, haben wir HSCs mit einer konstitutiv aktiven Form von JAK2 (V617F) herausgefordert und eine Expansion der p53-positiven Subpopulation bei alten Mäusen beobachtet. Unsere Ergebnisse zeigen zelluläre Heterogenität beim Einsetzen der HSC-Alterung und implizieren eine Rolle für die JAK2V617F-getriebene Proliferation beim p53-vermittelten funktionellen Rückgang alter HSCs.

Zellberichte, 19, 2211-1247, , 2017

Bei Mäusen ist der Weg mit PIWI und PIWI-interagierender RNA (PIWI-piRNA) essentiell, um die Transposon-Stummschaltung während der Reprogrammierung der männlichen Keimbahn wiederherzustellen. Das zytoplasmatische PIWI-Protein MILI vermittelt die piRNA-gesteuerte Transposon-RNA-Spaltung sowie die piRNA-Amplifikation. Es wird vermutet, dass die Bindung von MIWI2 an piRNA und ihre Kernlokalisation von der MILI-Funktion abhängt. Hier zeigen wir die Existenz eines piRNA-Biogeneseweges, der die teilweise MIWI2-Funktion und die Reprogrammierungsaktivität in Abwesenheit von MILI aufrechterhält.

Naturstruktur- und Molekularbiologie, , 1545-9985, , 2017

Multigewebe-DNA-Methylierungs-Altersprädiktor bei der Maus.
Stubbs TM, Bonder MJ, Stark AK, Krueger F, Bolland D, Butcher G, Chandra T, Clark SJ, Corcoran A, Eckersley-Maslin M, Field L, Frising UC, Gilbert C, Guedes J, Hernando-Herraez I, Houseley J, Kemp F, MacQueen A, Okkenhaug K, Rhoades M, Santbergen MJC, Stebegg M, von Meyenn F, Stegle O, Reik W

Veränderungen der DNA-Methylierung an einem diskreten Satz von Stellen im menschlichen Genom sind prädiktiv für das chronologische und biologische Alter. Es ist jedoch nicht bekannt, ob diese Veränderungen ursächlich oder eine Folge eines zugrunde liegenden Alterungsprozesses sind. Es wurde auch nicht gezeigt, ob diese epigenetische Uhr beim Menschen einzigartig ist oder bei der experimentell besser steuerbaren Maus konserviert ist.

Genombiologie, 18, 1474-760X, , 2017

Jüngste technologische Fortschritte haben es ermöglicht, die DNA-Methylierung mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Aktuelle Protokolle sind jedoch durch eine unvollständige CpG-Abdeckung begrenzt, und daher sind Methoden zur Vorhersage fehlender Methylierungszustände entscheidend, um genomweite Analysen zu ermöglichen. Wir berichten über DeepCpG, einen rechnergestützten Ansatz basierend auf tiefen neuronalen Netzen zur Vorhersage von Methylierungszuständen in einzelnen Zellen. Wir bewerten DeepCpG anhand von Einzelzell-Methylierungsdaten von fünf Zelltypen, die mit alternativen Sequenzierungsprotokollen generiert wurden. DeepCpG liefert wesentlich genauere Vorhersagen als bisherige Methoden. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Modellparameter interpretiert werden können und geben dadurch Einblicke in den Einfluss der Sequenzzusammensetzung auf die Methylierungsvariabilität.

Genombiologie, 18, 1474-760X, , 2017

Eine Ernährungseinschränkung schützt vor altersbedingter DNA-Methylierung und induziert eine epigenetische Reprogrammierung des Lipidstoffwechsels.
Hahn O, Grönke S, Stubbs TM, Ficz G, Hendrich O, Krueger F, Andrews S, Zhang Q, Wakelam MJ, Beyer A, Reik W, Partridge L

Diätrestriktion (DR), eine Reduzierung der Nahrungsaufnahme ohne Unterernährung, verbessert die meisten Aspekte der Gesundheit während des Alterns und verlängert die Lebensdauer bei verschiedenen Arten, einschließlich Nagetieren. Die Mechanismen, durch die DR mit dem Alterungsprozess interagiert, um die Gesundheit im Alter zu verbessern, sind jedoch kaum verstanden. DNA-Methylierung könnte eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Auswirkungen von DR spielen, da sie empfindlich auf die Auswirkungen der Ernährung reagiert und das Genexpressionsgedächtnis im Laufe der Zeit beeinträchtigen kann.

Genombiologie, 18, 1474-760X, , 2017

SC3: Konsensus-Clustering von Einzelzell-RNA-seq-Daten.
Kiselev VY, Kirschner K, Schaub MT, Andrews T, Yiu A, Chandra T, Natarajan KN, Reik W, Barahona M, Green AR, Hemberg M

Einzelzell-RNA-seq ermöglicht die quantitative Charakterisierung von Zelltypen basierend auf globalen Transkriptomprofilen. Wir präsentieren Single-Cell-Consensus-Clustering (SC3), ein benutzerfreundliches Tool für unüberwachtes Clustering, das eine hohe Genauigkeit und Robustheit durch die Kombination mehrerer Clustering-Lösungen durch einen Konsensus-Ansatz erreicht (http://bioconductor.org/packages/SC3). Wir zeigen, dass SC3 in der Lage ist, Subklone aus den Transkriptomen neoplastischer Zellen von Patienten zu identifizieren.

Naturmethoden, , 1548-7105, , 2017

Die molekularen Wege, die den Gewinn und Verlust von DNA-Methylierung während der Entwicklung von Säugetieren regulieren, müssen eng ausbalanciert sein, um ein physiologisches Gleichgewicht aufrechtzuerhalten. Hier untersuchen wir die relativen Beiträge der verschiedenen Wege und enzymatischen Aktivitäten, die an der Methylierungshomöostase im Kontext der genomweiten und locusspezifischen epigenetischen Reprogrammierung bei Säugetieren beteiligt sind. Eine anpassungsfähige epigenetische Maschinerie ermöglicht eine globale epigenetische Reprogrammierung in Übereinstimmung mit der lokalen Aufrechterhaltung des kritischen epigenetischen Gedächtnisses im Genom und scheint das Tempo der globalen Reprogrammierung in verschiedenen Zelllinien und Spezies zu regulieren.

Aktuelle Meinung zu Genetik und Entwicklung, 43, 1879-0380, , 2017

Das alternde Gehirn: Auswirkungen auf die DNA-Reparatur und DNA-Methylierung bei Mäusen.
Langie SA, Cameron KM, Ficz G, Oxley D, Tomaszewski B, Gorniak JP, Maas LM, Godschalk RW, van Schooten FJ, Reik W, von Zglinicki T, Mathers JC

Die Basenexzisionsreparatur (BER) kann mit zunehmendem Alter weniger effektiv sein, was zu einer Akkumulation von DNA-Läsionen, Genominstabilität und veränderter Genexpression führt, die zu altersbedingten degenerativen Erkrankungen beitragen. Das Gehirn ist besonders anfällig für die Ansammlung von DNA-Läsionen, daher ist das ordnungsgemäße Funktionieren der DNA-Reparaturmechanismen für das neuronale Überleben wichtig. Obwohl der Mechanismus der altersbedingten Abnahme der DNA-Reparaturkapazität unbekannt ist, deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass epigenetische Ereignisse (z. B. DNA-Methylierung) zum Alterungsprozess beitragen und durch die Regulation der Expression von DNA-Reparaturgenen funktionell wichtig sein können. Wir vermuten, dass epigenetische Mechanismen an der Vermittlung des altersbedingten Rückgangs der BER im Gehirn beteiligt sind. Gehirne von männlichen Mäusen wurden im Alter von 3 bis 32 Monaten isoliert. Pyrosequenzierungsanalysen zeigten eine signifikant erhöhte Ogg1-Methylierung mit dem Altern, die invers mit der Ogg1-Expression korrelierte. Die reduzierte Ogg1-Expression korrelierte mit einer verstärkten Expression des Methyl-CpG-Bindungsproteins 2 und des Zehn-Elf-Translokationsenzyms 2. Eine signifikante inverse Korrelation zwischen der Neil1-Methylierung an der CpG-Stelle2 und der Expression wurde ebenfalls beobachtet. Die BER-Aktivität war signifikant reduziert und mit erhöhten 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosinspiegeln verbunden. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Expression von Ogg1 und Neil1 epigenetisch reguliert werden kann, was die Auswirkungen des Alterns auf die DNA-Reparatur im Gehirn vermitteln könnte.

DNA-Methylierung (DNAme) ist eine wichtige epigenetische Markierung bei verschiedenen Arten. Unser derzeitiges Verständnis von DNAme basiert auf Messungen aus Massenzellproben, die interzelluläre Unterschiede verschleiern und Analysen seltener Zelltypen verhindern. Somit hat die Fähigkeit, DNAme in einzelnen Zellen zu messen, das Potenzial, wichtige Beiträge zum Verständnis mehrerer biologischer Schlüsselprozesse wie der Embryonalentwicklung, des Krankheitsverlaufs und des Alterns zu leisten.Wir haben kürzlich über eine Methode zur Generierung genomweiter DNAme-Karten aus einzelnen Zellen berichtet, die eine Einzelzell-Bisulfit-Sequenzierung (scBS-seq) verwendet, die die quantitative Messung von DNAme bei bis zu 50% der CpG-Dinukleotide im gesamten Mausgenom ermöglicht. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für scBS-seq, das unsere neuesten Entwicklungen zur Optimierung der CpG-Wiedergewinnung, der Mapping-Effizienz und der Erfolgsrate umfasst, um die praktische Zeit zu reduzieren und den Probendurchsatz mit der Option der Verwendung eines automatisierten Liquid-Handlers zu erhöhen. Wir bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für jede Stufe der Methode, einschließlich Zelllyse und Bisulfit (BS)-Umwandlung, Präamplifikation und Adapter-Tagging, Bibliotheks-Amplifikation, Sequenzierung und schließlich Alignment- und Methylierungs-Calling. Eine Person mit relevanter molekularbiologischer Expertise kann die Bibliotheksvorbereitung innerhalb von 3 Tagen abschließen. Nachfolgende Rechenschritte benötigen 1-3 d für jemanden mit Bioinformatik-Kenntnissen.

Naturprotokolle, 12, 1750-2799, , 2017

Verfolgung des embryonalen Stammzellübergangs von der Pluripotenz im Grundzustand.
Kalkan T, Olova N, Roode M, Mulas C, Lee HJ, Nett I, Marks H, Walker R, Stunnenberg HG, Lilley KS, Nichols J, Reik W, Bertone P, Smith A

Embryonale Stammzellen (ES) der Maus werden durch Abschirmung vor induktiven Signalen in die Selbsterneuerung eingeschlossen. Die Freisetzung aus diesem Grundzustand unter minimalen Bedingungen bietet ein System zur Abgrenzung der Entwicklungsprogression von naiver Pluripotenz. Hier haben wir den anfänglichen Übergangsprozess untersucht. Die ES-Zellpopulation verhält sich asynchron. Wir nutzten daher einen Rex1::GFP-Reporter mit kurzer Halbwertszeit, um Zellen auf beiden Seiten des Austritts aus dem naiven Status zu isolieren. Das Aussterben der ES-Zellidentität in Einzelzellen ist akut. Sie tritt erst nach nahezu vollständiger Eliminierung naiver Pluripotenzfaktoren auf, geht aber dem Auftreten von Markern der Abstammungsspezifikation voraus. Zellen, die neu vom ES-Zellzustand abgewichen sind, weisen Merkmale eines frühen Epiblasten nach der Implantation auf und unterscheiden sich von geprimten Epiblasten. Sie weisen auch eine genomweite Zunahme der DNA-Methylierung auf, die zwischen frühem und spätem Epiblast liegt. Diese Ergebnisse stimmen mit der Annahme überein, dass naive Zellen in eine ausgeprägte formative Phase der Pluripotenz übergehen, die das Lineage-Priming vorbereiten.

Entwicklung (Cambridge, England), , 1477-9129, , 2017

Geschlechtsunterschiede bei der globalen, aber nicht gezielten Demethylierung bei der iPSC-Reprogrammierung.
Milagre I, Stubbs TM, King MR, Spindel J, Santos F, Krueger F, Bachman M, Segonds-Pichon A, Balasubramanian S, Andrews SR, Dean W, Reik W

Die globale DNA-Demethylierung ist ein integraler Bestandteil von Reprogrammierungsprozessen in vivo und in vitro, aber ob sie bei der Gewinnung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auftritt, ist nicht bekannt. Hier zeigen wir, dass die iPSC-Reprogrammierung sowohl eine globale als auch eine gezielte Demethylierung beinhaltet, die mechanistisch und durch ihre biologischen Ergebnisse trennbar sind. Zellen in mittleren bis späten Stadien der Reprogrammierung unterliegen einer vorübergehenden genomweiten Demethylierung, die bei weiblichen Zellen stärker ausgeprägt ist. Die globale Demethylierung erfordert eine aktivierungsinduzierte Cytidindeaminase (AID)-vermittelte Herunterregulierung des UHRF1-Proteins, und die Abschaffung der Demethylierung hinterlässt Tausende von hypermethylierten Regionen im iPSC-Genom. Unabhängig von AID und globaler Demethylierung werden regulatorische Regionen, insbesondere ESC-Enhancer und Super-Enhancer, spezifisch für die Hypomethylierung in Verbindung mit der Transkription des Pluripotenznetzwerks anvisiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass globale und gezielte DNA-Demethylierung konservierte und unterschiedliche Reprogrammierungsprozesse sind, vermutlich aufgrund ihrer jeweiligen Rolle bei der epigenetischen Gedächtnislöschung und bei der Etablierung der Zellidentität.

Zellenberichte, 18, 2211-1247, , 2017

Eine in Hox eingebettete lange, nicht kodierende RNA: Ist alles heiße Luft?
Selleri L, Bartolomei MS, Bickmore WA, He L, Stubbs L, Reik W, Barsh GS

PLoS-Genetik, 12, 1553-7404, , 2016

Effiziente gezielte DNA-Methylierung mit chimärer dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L-Methyltransferase.
Stepper P, Kungulovski G, Jurkowska RZ, Chandra T, Krueger F, Reinhardt R, Reik W, Jeltsch A, Jurkowski TP

DNA-Methylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation und Aufrechterhaltung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen. Targeted Epigenome Editing ist eine aufkommende Technologie, um die zelluläre Genexpression spezifisch zu regulieren, um Zellphänotypen zu modulieren oder die epigenetischen Mechanismen zu analysieren, die an ihrer Kontrolle beteiligt sind. In dieser Arbeit verwendeten wir ein DNA-Methyltransferase-Konstrukt Dnmt3a-Dnmt3L, das mit der Nuklease-inaktivierten dCas9-programmierbaren Targeting-Domäne fusioniert ist, um DNA-Methylierung in das menschliche Genom spezifisch an den EpCAM-, CXCR4- und TFRC-Genpromotoren einzuführen. Wir zeigen, dass das Targeting dieser Loci mit einzelnen gRNAs zu einer effizienten und weit verbreiteten Methylierung der Promotoren führt. Das Multiplexen mehrerer Leit-RNAs erhöht die Effizienz der Methylierung nicht. Peaks der gezielten Methylierung wurden etwa 25 bp stromaufwärts und 40 bp stromabwärts der PAM-Stelle beobachtet, während 20-30 bp der Bindungsstelle selbst gegen Methylierung geschützt sind. Eine starke Methylierung hängt von der Multimerisierung von Dnmt3a/Dnmt3L-Komplexen auf der DNA ab. Darüber hinaus verursacht die eingeführte Methylierung eine transkriptionale Repression der Zielgene. Diese neuen programmierbaren epigenetischen Editoren ermöglichen eine beispiellose Kontrolle des DNA-Methylierungsstatus in Zellen und werden zu weiteren Fortschritten im Verständnis der epigenetischen Signalübertragung führen.

Nukleinsäureforschung, , 1362-4962, , 2016

Die H3K9-Dimethyltransferasen EHMT1/2 schützen vor pathologischer Herzhypertrophie.
Thienpont B, Aronsen JM, Robinson EL, Okkenhaug H, Loche E, Ferrini A, Brien P, Alkass K, Tomasso A, Agrawal A, Bergmann O, Sjaastad I, Reik W, Roderick HL

Herzhypertrophes Wachstum als Reaktion auf pathologische Hinweise ist mit der Reexpression fetaler Gene und einer verminderten Herzfunktion verbunden und ist oft ein Vorläufer einer Herzinsuffizienz. Im Gegensatz dazu ist die physiologisch induzierte Hypertrophie adaptiv, was zu einer verbesserten Herzfunktion führt. Die Prozesse, die diese hypertrophen Zustände selektiv induzieren, sind kaum verstanden. Hier haben wir 2 repressive epigenetische Markierungen, H3K9me2 und H3K27me3, profiliert, die an einer stabilen zellulären Differenzierung beteiligt sind, insbesondere in Kardiomyozyten aus physiologisch und pathologisch hypertrophierten Rattenherzen, und diese Markierungen mit ihren zugehörigen Transkriptomen korreliert. Diese Analyse zeigte den weit verbreiteten Verlust von euchromatischem H3K9me2 als konserviertes Merkmal der pathologischen Hypertrophie, die mit der Reexpression fetaler Gene verbunden war. Bei Hypertrophie wurde H3K9me2 nach einer miR-217-vermittelten Abnahme der Expression der H3K9-Dimethyltransferasen EHMT1 und EHMT2 (EHMT1/2) reduziert. Die miR-217-vermittelte, genetische oder pharmakologische Inaktivierung von EHMT1/2 war ausreichend, um die pathologische Hypertrophie und die fetale Genreexpression zu fördern, während die Suppression dieses Signalwegs sowohl in vitro als auch bei Mäusen vor pathologischer Hypertrophie schützte. Somit haben wir einen konservierten Mechanismus etabliert, der eine Abkehr des Kardiomyozyten-Epigenoms von seiner adulten zellulären Identität in einen reprogrammierten Zustand beinhaltet, der von einer Reexpression fötaler Gene und pathologischer Hypertrophie begleitet wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die gezielte Ausrichtung auf miR-217 und EHMT1/2, um den Verlust der H3K9-Methylierung zu verhindern, ein praktikabler therapeutischer Ansatz für die Behandlung von Herzerkrankungen ist.

The Journal of Clinical Investigation, , 1558-8238, , 2016

Das epigenetische Gedächtnis, insbesondere die DNA-Methylierung, wird während der Entwicklung in sich differenzierenden Zellen aufgebaut und muss gelöscht werden, um naive (induzierte) pluripotente Stammzellen zu erzeugen. Die Enzyme der Zehn-Eleven-Translokation (TET) können die Oxidation von 5-Methylcytosin (5mC) zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) und weiteren oxidierten Derivaten katalysieren, wodurch dieses Gedächtnis aktiv beseitigt wird. Der Mechanismus, durch den die TET-Enzyme reguliert werden, und das Ausmaß, in dem sie manipuliert werden können, sind jedoch noch wenig verstanden. Hier berichten wir, dass Retinsäure (RA) oder Retinol (Vitamin A) und Ascorbat (Vitamin C) als Modulatoren der TET-Spiegel und -Aktivität wirken. RA oder Retinol steigert die 5hmC-Produktion in naiven embryonalen Stammzellen durch Aktivierung der TET2- und TET3-Transkription, während Ascorbat die TET-Aktivität und die 5hmC-Produktion durch verstärktes Fe(2+)-Recycling und nicht als Cofaktor, wie zuvor berichtet, verstärkt. Wir stellen fest, dass sowohl Ascorbat als auch RA oder Retinol die Gewinnung von induzierten pluripotenten Stammzellen synergistisch fördern und die Löschung des epigenetischen Gedächtnisses verstärken. Diese mechanistische Erkenntnis hat Bedeutung für die Entwicklung von Zellbehandlungen für die regenerative Medizin und verbessert unser Verständnis davon, wie intrinsische und extrinsische Signale das Epigenom formen.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, , 1091-6490, , 2016

Die Entwicklung von Primordialen Keimzellen (PGC) ist durch globales epigenetisches Remodeling gekennzeichnet, das das genomische Potenzial zurücksetzt und einen epigenetischen Grundzustand etabliert. Hier rekapitulieren wir die PGC-Spezifikation in vitro aus naiven embryonalen Stammzellen und charakterisieren die frühen Ereignisse der epigenetischen Reprogrammierung während der Bildung der Keimbahn von Mensch und Maus. Nach einer schnellen de novo-DNA-Methylierung während des Primings zu Epiblasten-ähnlichen Zellen wird die Methylierung in PGC-ähnlichen Zellen global gelöscht. Repressive Chromatinmarkierungen (H3K9me2/3) und transponierbare Elemente sind in demethylierungsresistenten Regionen angereichert, während aktive Chromatinmarkierungen (H3K4me3 oder H3K27ac) in Regionen, die schneller demethylieren, stärker ausgeprägt sind. Die Dynamik der Spezifikation und der epigenetischen Reprogrammierung zeigt speziesspezifische Unterschiede, insbesondere deutlich langsamere Reprogrammierungskinetiken in der menschlichen Keimbahn. Unterschiede in der Entwicklungskinetik können durch unterschiedliche Regulation epigenetischer Modifikatoren erklärt werden. Unsere Arbeit etabliert ein robustes und zuverlässiges experimentelles System der frühen Ereignisse der epigenetischen Reprogrammierung und Regulation in der Keimbahn.

Entwicklungszelle, 39, 1878-1551, , 2016

MERVL/Zscan4-Netzwerkaktivierung führt zu transienter genomweiter DNA-Demethylierung von mESCs.
Eckersley-Maslin MA, Svensson V, Krueger C, Stubbs TM, Giehr P, Krueger F, Miragaia RJ, Kyriakopoulos C, Berrens RV, Milagre I, Walter J, Teichmann SA, Reik W

Embryonale Stammzellen der Maus sind dynamisch und heterogen. Seltene Zellen durchlaufen beispielsweise einen Zustand, der durch dekondensiertes Chromatin und die Expression von Transkripten gekennzeichnet ist, einschließlich des Zscan4-Clusters und des endogenen MERVL-Retrovirus, die normalerweise auf Präimplantationsembryonen beschränkt sind. Hier charakterisieren wir weiter die Dynamik und Konsequenzen dieses transienten Zellzustands. Einzelzell-Transkriptomik identifizierte die frühesten hochregulierten Transkripte, wenn Zellen in den MERVL/Zscan4-Zustand eintreten. Das Transkriptionsnetzwerk MERVL/Zscan4 wurde auch während der induzierten pluripotenten Stammzellreprogrammierung hochreguliert. Genomweite DNA-Methylierungs- und Chromatin-Analysen zeigten eine globale DNA-Hypomethylierung, die mit einer erhöhten Chromatin-Zugänglichkeit einherging. Diese vorübergehende DNA-Demethylierung wurde durch einen Verlust von DNA-Methyltransferase-Proteinen in den Zellen angetrieben und trat genomweit auf. Während die Methylierungsniveaus wiederhergestellt wurden, sobald die Zellen diesen Zustand verlassen hatten, blieben die genomischen Prägungen hypomethyliert, was einen möglichen globalen und dauerhaften Einfluss der endogenen retroviralen Aktivierung auf das Epigenom zeigt.

Zellenberichte, 17, 2211-1247, , 2016

In-vivo-Genom-weites Profiling zeigt eine gewebespezifische Rolle für 5-Formylcytosin.
Iurlaro M, McInroy GR, Burgess HE, Dean W, Raiber EA, Bachman M, Beraldi D, Balasubramanian S, Reik W

Die genomweite Methylierung von Cytosin kann in Gegenwart von TET und Thymin-DNA-Glycosylase (TDG)-Enzymen moduliert werden. TET ist in der Lage, 5-Methylcytosin (5mC) zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC) und 5-Carboxylcytosin (5caC) zu oxidieren. TDG kann die oxidativen Produkte 5fC und 5caC ausschneiden und damit die Basenexzisionsreparatur einleiten. Diese modifizierten Basen sind stabil und im Genom nachweisbar, was darauf hindeutet, dass sie selbst epigenetische Funktionen haben könnten. Die funktionelle Untersuchung der genomweiten Verteilung von 5fC war jedoch auf zellkulturbasierte Systeme beschränkt, während sein in-vivo-Profil unbekannt bleibt.

Genombiologie, 17, 1474-760X, , 2016

Die Beeinträchtigung der Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung ist die Hauptursache für die globale Demethylierung in naiven embryonalen Stammzellen.
von Meyenn F, Iurlaro M, Habibi E, Liu NQ, Salehzadeh-Yazdi A, Santos F, Petrini E, Milagre I, Yu M, Xie Z, Kroeze LI, Nesterova TB, Jansen JH, Xie H, He C, Reik W , Stunnenberg HG

Molekulare Zelle, 62, 1097-4164, , 2016

Die Beeinträchtigung der Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung ist die Hauptursache für die globale Demethylierung in naiven embryonalen Stammzellen.
von Meyenn F, Iurlaro M, Habibi E, Liu NQ, Salehzadeh-Yazdi A, Santos F, Petrini E, Milagre I, Yu M, Xie Z, Kroeze LI, Nesterova TB, Jansen JH, Xie H, He C, Reik W , Stunnenberg HG

Die globale Demethylierung ist Teil eines konservierten Programms der epigenetischen Umprogrammierung zur naiven Pluripotenz. Der Übergang von geprimten hypermethylierten embryonalen Stammzellen (ESCs) zu naiven hypomethylierten (Serum-to-2i) ist ein wertvolles Modellsystem für die epigenetische Reprogrammierung. Wir präsentieren ein mathematisches Modell, das die globale Kinetik der DNA-Demethylierung genau vorhersagt. Experimentell zeigen wir, dass die Haupttreiber der globalen Demethylierung weder aktive Mechanismen (Aicda, Tdg und Tet1-3) noch die Reduktion der De-novo-Methylierung sind. Das UHRF1-Protein, der wesentliche Targeting-Faktor für DNMT1, wird beim Übergang zu 2i reduziert, ebenso wie die Rekrutierung der Erhaltungsmethylierungsmaschinerie an Replikationsherde. Gleichzeitig kommt es zu einem globalen Verlust von H3K9me2, das für die Chromatinbindung von UHRF1 benötigt wird. Diese Mechanismen erzwingen synergistisch eine replikationsgekoppelte globale DNA-Hypomethylierung. Unsere Beobachtungen begründen den molekularen Mechanismus für die globale Demethylierung in naiven ESCs, der wichtige Parallelen zu denen aufweist, die in primordialen Keimzellen und frühen Embryonen operieren.

Molekulare Zelle, , 1097-4164, , 2016

Es werden neue epigenomische Einzelzellmethoden entwickelt, die das aufregende Potenzial haben, unser Wissen über die Genregulation zu transformieren. Hier überprüfen wir verfügbare Techniken und zukünftige Möglichkeiten und argumentieren, dass das volle Potenzial epigenetischer Einzelzellstudien durch parallele Profilerstellung von genomischen, transkriptionellen und epigenetischen Informationen ausgeschöpft wird.

Genombiologie, 17, 1474-760X, , 2016

Die konventionelle Generierung von Stammzellen aus menschlichen Blastozysten erzeugt ein entwicklungsmäßig fortgeschrittenes oder vorbereitetes Stadium der Pluripotenz. In-vitro-Reset zu einem naiveren Phänotyp wurde berichtet. Ob die Kulturbedingungen der selektiven Kinasehemmung das Einfangen naiver Epiblastzellen direkt aus dem Embryo ermöglichen können, wurde jedoch nicht bestimmt. Hier zeigen wir, dass unter diesen spezifischen Bedingungen einzelne Zellen der inneren Zellmasse zu Kolonien wachsen, die dann über mehrere Passagen expandiert werden können, während ein diploider Karyotyp und naive Eigenschaften beibehalten werden. Die Zellen exprimieren charakteristische naive Pluripotenzfaktoren und weisen zusätzlich Merkmale der mitochondrialen Atmung, der globalen Genexpression und der genomweiten Hypomethylierung auf, die sich von geprimten Zellen unterscheiden. Sie gehen durch Primed Pluripotenz in somatische Abstammungsdifferenzierung über. Zusammengenommen legen diese Attribute eine Klassifizierung als humane naive embryonale Stammzellen nahe. Humane Gegenstücke zu kanonischen embryonalen Stammzellen der Maus würden für die Konservierung bei der schrittweisen Progression der Pluripotenz bei Säugetieren plädieren.

Stammzellberichte, , 2213-6711, , 2016

Mütterliche DNA-Methylierung reguliert die frühe Trophoblastenentwicklung.
Branco MR, King M, Perez-Garcia V, Bogutz AB, Caley M, Fineberg E, Lefebvre L, Cook SJ, Dean W, Hemberger M, Reik W

Kritische Rollen für die DNA-Methylierung in der Embryonalentwicklung sind gut bekannt, aber über ihre Rolle während der Trophoblastenentwicklung, der extraembryonalen Abstammungslinie, die zur Plazenta führt, ist weniger bekannt. Wir analysierten die Rolle der DNA-Methylierung bei der Entwicklung von Trophoblasten, indem wir ein mRNA- und DNA-Methylierungsprofil von Dnmt3a/3b-Mutanten durchführten. Wir stellen fest, dass die Methylierung aus Eizellen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Trophoblastenentwicklung spielt, dass jedoch die Prägung des wichtigsten Plazentaregulators Ascl2 für diese Effekte nur teilweise verantwortlich ist. Wir haben mehrere methylierungsregulierte Gene identifiziert, die mit der Trophoblastendifferenzierung assoziiert sind und an der Zelladhäsion und -migration beteiligt sind und möglicherweise die Trophoblasteninvasion beeinflussen. Insbesondere ist die trophoblastenspezifische DNA-Methylierung mit der Stummschaltung von Scml2 verbunden, einem Protein des Polycomb Repressive Complex 1, das den Verlust der Zelladhäsion bei methylierungsdefizienten Trophoblasten fördert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die mütterliche DNA-Methylierung mehrere differenzierungsbezogene und physiologische Prozesse in Trophoblasten sowohl über imprinting-abhängige als auch -unabhängige Mechanismen steuert.

Entwicklungszelle, 36, 1878-1551, , 2016

Die parallele Einzelzellsequenzierung verbindet transkriptionelle und epigenetische Heterogenität.
Angermueller C, Clark SJ, Lee HJ, Macaulay IC, Teng MJ, Hu TX, Krueger F, Smallwood SA, Ponting CP, Voet T, Kelsey G, Stegle O, Reik W

Wir berichten über scM&T-seq, eine Methode zur parallelen Methylom- und Transkriptomsequenzierung einzelner Zellen, die es ermöglicht, Assoziationen zwischen transkriptionaler und epigenetischer Variation aufzudecken. Profiling von 61 embryonalen Stammzellen der Maus bestätigte bekannte Verbindungen zwischen DNA-Methylierung und Transkription. Bemerkenswert ist, dass die Methode bisher nicht erkannte Assoziationen zwischen heterogen methylierten distalen regulatorischen Elementen und der Transkription wichtiger Pluripotenzgene aufgedeckt hat.

Naturmethoden, , 1548-7105, , 2016

Molekulare Signaturen plastischer Phänotypen in zwei eusozialen Insektenarten mit einfachen Gesellschaften.
Patalano S, Vlasova A, Wyatt C, Ewels P, Camara F, Ferreira PG, Asher CL, Jurkowski TP, Segonds-Pichon A, Bachman M, González-Navarrete I, Minoche AE, Krueger F, Lowy E, Marcet-Houben M , Rodriguez-Ales JL, Nascimento FS, Balasubramanian S, Gabaldon T, Tarver JE, Andrews S, Himmelbauer H, Hughes WO, Guigó R, Reik W, Sumner S

Die phänotypische Plastizität ist wichtig für die Anpassung und prägt die Evolution von Organismen. Wir wissen jedoch wenig darüber, welche Aspekte des Genoms für die Ermöglichung der Plastizität wichtig sind. Eusoziale Insektengesellschaften produzieren plastische Phänotypen aus demselben Genom, als reproduktive (Königinnen) und nicht reproduktive (Arbeiterinnen). Die größte Plastizität findet sich in den einfachen eusozialen Insektengesellschaften, in denen Individuen als Erwachsene die Fähigkeit behalten, zwischen reproduktiven und nichtreproduktiven Phänotypen zu wechseln. Uns fehlen umfassende Daten zur molekularen Grundlage plastischer Phänotypen. Hier sequenzierten wir Genome, microRNAs (miRNAs) und multiple Transkriptome und Methylome aus einzelnen Gehirnen einer Wespe (Polistes canadensis) und einer Ameise (Dinoponera quadriceps), die in einfachen eusozialen Gesellschaften leben.Bei beiden Arten fanden wir wenige Unterschiede zwischen den Phänotypen auf Transkriptionsebene mit geringer funktioneller Spezialisierung und keine Hinweise darauf, dass die phänotypspezifische Genexpression durch DNA-Methylierung oder miRNAs angetrieben wird. Stattdessen wurde die phänotypische Differenzierung subtiler durch nicht-zufällige transkriptionelle Netzwerkorganisation definiert, mit Rollen in diesen Netzwerken sowohl für konservierte als auch taxon-beschränkte Gene. Das generelle Fehlen von hochmethylierten Regionen oder Methylommustern bei beiden Spezies kann ein wichtiger Mechanismus sein, um Phänotypen im Erwachsenenalter plastisch zu gestalten. Diese Ergebnisse definieren bisher nicht identifizierte Hypothesen zu den genomischen Prozessen, die Plastizität ermöglichen, und legen nahe, dass sich die molekularen Kennzeichen des Sozialverhaltens wahrscheinlich mit dem Grad der sozialen Komplexität unterscheiden.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, , 1091-6490, , 2015

5-Formylcytosin kann bei Säugetieren eine stabile DNA-Modifikation sein.
Bachman M, Uribe-Lewis S, Yang X, Burgess HE, Iurlaro M, Reik W, Murrell A, Balasubramanian S

5-Formylcytosin (5fC) ist eine seltene Base, die in Säugetier-DNA vorkommt und vermutlich an der aktiven DNA-Demethylierung beteiligt ist. Hier zeigen wir, dass sich die Entwicklungsdynamik von 5fC-Spiegeln in Maus-DNA von denen von 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) unterscheidet, und unter Verwendung einer stabilen Isotopenmarkierung in vivo zeigen wir, dass 5fC eine stabile DNA-Modifikation sein kann. Diese Ergebnisse legen nahe, dass 5fC funktionelle Rollen in der DNA hat, die über die Rolle eines Demethylierungszwischenprodukts hinausgehen.

Chemische Biologie der Natur, 11, 1552-4469, , 2015

Die epigenetische Reprogrammierung in der Keimbahn setzt das genomische Potenzial zurück und löscht das epigenetische Gedächtnis. Drei Studien von Gkountela et al., Guo et al. und Tang et al. analysieren die transkriptionelle und epigenetische Landschaft menschlicher Urkeimzellen und enthüllen ein einzigartiges Transkriptionsnetzwerk und eine fortschreitende und konservierte globale Löschung der DNA-Methylierung.

Datenressourcenprofil: Zugängliche Ressource für integrierte epigenomische Studien (ARIES).
Relton CL, Gaunt T, McArdle W, Ho K, Duggirala A, Shihab H, Woodward G, Lyttleton O, Evans DM, Reik W, Paul YL, Ficz G, Ozanne SE, Wipat A, Flanagan K, Lister A, Heijmans BT , Ring SM, Davey Smith G

Internationale Zeitschrift für Epidemiologie, 44, 1464-3685, , 2015

Das EMBO-Journal, 34, 1460-2075, , 2015

Globale Reorganisation der Nuklearlandschaft in seneszenten Zellen.
Chandra T, Ewels PA, Schoenfelder S, Furlan-Magaril M, Winget SW, Kirschner K, Thuret JY, Andrews S, Fraser P, Reik W

Die zelluläre Seneszenz wurde mit der Tumorsuppression, -entwicklung und -alterung in Verbindung gebracht und wird von großflächigen Chromatin-Umlagerungen begleitet, die seneszenzassoziierte heterochromatische Herde (SAHF) bilden. Wie das Chromatin während der SAHF-Bildung reorganisiert wird, ist jedoch kaum bekannt. Darüber hinaus scheint die Heterochromatinbildung in der Seneszenz mit dem Verlust von Heterochromatin bei Hutchinson-Gilford-Progerie zu kontrastieren. Wir kartierten architektonische Veränderungen in der Genomorganisation in der zellulären Seneszenz mit Hi-C. Unerwarteterweise finden wir bei Heterochromatin einen dramatischen sequenz- und laminabhängigen Verlust lokaler Wechselwirkungen. Diese Veränderung der lokalen Konnektivität löst das Paradoxon gegensätzlicher Chromatinveränderungen in Seneszenz und Progerie auf. Darüber hinaus beobachten wir eine seneszenzspezifische räumliche Anhäufung heterochromatischer Regionen, was auf einen einzigartigen zweiten Schritt hindeutet, der für die SAHF-Bildung erforderlich ist. Der Vergleich von embryonalen Stammzellen (ESCs), somatischen Zellen und seneszenten Zellen zeigt einen unidirektionalen Verlust der lokalen Chromatinkonnektivität, was darauf hindeutet, dass die Seneszenz ein Endpunkt des kontinuierlichen Kernumbauprozesses während der Differenzierung ist.

Zellberichte, , 2211-1247, , 2015

DNA-Methylome werden während der Präimplantation der Maus und der frühen Keimzellentwicklung umfassend umprogrammiert. Das Hauptmerkmal dieser Umprogrammierung ist eine genomweite Abnahme von 5-Methylcytosin (5mC). Standardmäßige hochauflösende einzelsträngige Bisulfit-Sequenzierungstechniken erlauben keine Unterscheidung der zugrunde liegenden passiven (replikationsabhängigen) oder aktiven enzymatischen Mechanismen des 5mC-Verlusts. Wir gingen dieses Problem an, indem wir hochauflösende DHBS-Karten (Deep Hairpin Bisulfit Sequencing) erstellten, die es uns ermöglichten, die Muster der symmetrischen DNA-Methylierung an CpGs-Dyaden auf beiden DNA-Strängen über Einzelreplikationen zu verfolgen.

Epigenetik und Chromatin, 8, 1756-8935, , 2015

Die Befruchtung löst die globale Löschung des väterlichen 5-Methylcytosins als Teil der epigenetischen Reprogrammierung während des Übergangs von der gametischen Spezialisierung zur Totipotenz aus. Dies beinhaltet die Oxidation durch TET3, aber unser Verständnis seiner Ziele und des weiteren Kontexts der Demethylierung ist auf einen kleinen Bruchteil des Genoms beschränkt. Wir verwendeten eine optimierte Bisulfit-Strategie, um genomweite Methylierungsprofile von Kontrollzygoten und TET3-defizienten Zygoten zu generieren, indem wir SNPs für den Zugang zu väterlichen Allelen verwenden. Dies zeigte, dass Genkörper zusätzlich zur durchdringenden Entfernung aus intergenen Sequenzen und den meisten Retrotransposons ein Hauptziel der zygotischen Demethylierung darstellen. Methylierungsverlust ist mit der Aktivierung des zygotischen Genoms und an Genkörpern auch mit erhöhtem Transkriptionsrauschen in der frühen Entwicklung verbunden. Unsere Daten kartieren den primären Beitrag der oxidativen Demethylierung zu einer Untergruppe von Genkörpern und intergenen Sequenzen und implizieren redundante Wege an vielen Loci. Unerwarteterweise zeigen wir, dass die TET3-Aktivität auch bestimmte CpG-Inseln vor Methylierungsaufbau schützt.

Zellenberichte, 9, 2211-1247, , 2014

Redundante Mechanismen zur Bildung von stillem Chromatin in perizentromeren Regionen beruhen auf BEND3 und DNA-Methylierung.
Saksouk N, Barth TK, Ziegler-Birling C, Olova N, Nowak A, Rey E, Mateos-Langerak J, Urbach S, Reik W, Torres-Padilla ME, Imhof A, Déjardin J

Konstitutives Heterochromatin wird typischerweise durch eine hohe DNA-Methylierung und H3-Lysin-9-Trimethylierung (H3K9Me3) definiert, während fakultatives Heterochromatin eine DNA-Hypomethylierung und eine hohe H3-Lysin-27-Trimethylierung (H3K27Me3) aufweist. Die beiden Chromatintypen koexistieren im Allgemeinen nicht an denselben Loci, was auf eine gegenseitige Exklusivität schließen lässt. Während der Entwicklung oder bei Krebs können perizentromere Regionen beide epigenetischen Zustände annehmen, aber der Schaltmechanismus ist unbekannt. Wir verwendeten eine quantitative Locus-Reinigungsmethode, um Veränderungen in perizentromeren Chromatin-assoziierten Proteinen in embryonalen Stammzellen der Maus zu charakterisieren, denen entweder die für die DNA-Methylierung erforderlichen Methyltransferasen oder H3K9Me3 fehlten. Die DNA-Methylierung kontrolliert die Heterochromatin-Architektur und hemmt die Polycomb-Rekrutierung. BEND3, ein Protein, das in Abwesenheit von DNA-Methylierung oder H3K9Me3 an pericentromerischem Chromatin angereichert ist, ermöglicht die Rekrutierung von Polycomb und H3K27Me3, was zu einem redundanten Weg führt, um repressives Chromatin zu erzeugen. Dies legt nahe, dass BEND3 ein Schlüsselfaktor bei der Vermittlung eines Wechsels von konstitutivem zu fakultativem Heterochromatin ist.

Molekulare Zelle, 56, 1097-4164, , 2014

Zurücksetzen der Transkriptionsfaktor-Steuerungsschaltung in Richtung Pluripotenz im Grundzustand beim Menschen.
Takashima Y, Guo G, Loos R, Nichols J, Ficz G, Krueger F, Oxley D, Santos F, Clarke J, Mansfield W, Reik W, Bertone P, Smith A

Aktuellen menschlichen pluripotenten Stammzellen fehlt die Transkriptionsfaktorschaltung, die den Grundzustand von embryonalen Stammzellen (ESC) der Maus steuert. Hier berichten wir, dass die kurzfristige Expression von zwei Komponenten, NANOG und KLF2, ausreicht, um andere Elemente des Netzwerks zu entzünden und den menschlichen pluripotenten Zustand zurückzusetzen. Die Hemmung von ERK und Proteinkinase C erhält einen Transgen-unabhängigen neuverdrahteten Zustand. Reset-Zellen erneuern sich selbst kontinuierlich ohne ERK-Signalisierung, sind phänotypisch stabil und karyotypisch intakt. Sie differenzieren in vitro und bilden in vivo Teratome. Der Stoffwechsel wird mit Aktivierung der mitochondrialen Atmung wie bei ESC umprogrammiert. Die DNA-Methylierung wird drastisch reduziert und der Transkriptomzustand wird global über mehrere Zelllinien hinweg neu ausgerichtet. Die Erschöpfung der Transkriptionsfaktoren des Grundzustands, TFCP2L1 oder KLF4, hat einen geringfügigen Einfluss auf konventionelle menschliche pluripotente Stammzellen, lässt jedoch den Reset-Zustand kollabieren. Diese Ergebnisse demonstrieren die Durchführbarkeit der Installation und Verbreitung funktioneller Steuerschaltungen für die Pluripotenz im Grundzustand in menschlichen Zellen.


Diskussion

Die intragenerationale und intergenerationale Plastizität physiologischer und molekularer Merkmale als Reaktion auf den globalen Wandel ist in vielen marinen Systemen gut charakterisiert (Marshall, 2008 Munday, 2014 Donelson et al., 2017), einschließlich in S. purpuratus (Wong et al., 2018, 2019 Hoshijima und Hofmann, 2019 Strader et al., 2019). Molekulare Wege, die der phänotypischen Plastizität als Reaktion auf den globalen Wandel zugrunde liegen, sind jedoch nicht gut verstanden. Wir stellten die Hypothese auf, dass umweltbedingte Veränderungen der DNA-Methylierungsvariation eine Rolle bei der Transkriptionsänderung als Reaktion auf die Umwelt spielen könnten, und dass dies Veränderungen in einem bekannten phänotypisch plastischen Merkmal, der Spiculalänge, entsprechen würde (Byrne, 2011 Byrne et al., 2013). . Insgesamt ergab diese Studie, dass Umweltunterschiede die Plastizität des Transkriptoms und des Methyloms beeinflussten, jedoch über verschiedene Zeitskalen hinweg, und dass DNA-Methylierungsvariationen innerhalb von Genkörpern die Transkription wahrscheinlich nicht direkt modulieren, trotz Ähnlichkeiten in breiten funktionellen Kategorien zwischen DEGs und Genen mit DMCpGs. Um die Bedeutung dieser Muster weiter zu untersuchen, diskutieren wir im Folgenden: (1) Unterschiede im Timing von Veränderungen und der Beziehung zwischen DNA-Methylierung und dem Transkriptom, (2) mütterliche Auswirkungen auf Genexpression und DNA-Methylierung, (3) wie Bedingungen während der Entwicklung Phänotyp und Genexpression beeinflussen, und (4) mögliche Konsequenzen epigenetischer Mechanismen auf die intergenerationelle Plastizität.

Unterschiede in der Reaktionszeitskala zwischen GE und DMCpGs

Das Transkriptom ist hochsensibel gegenüber Umweltunterschieden und verändert letztendlich Organismenmerkmale von der molekularen Ebene bis hin zu übergeordneten Prozessen wie dem Verhalten. Umwelteinflüsse können innerhalb kurzer Zeiträume (im Minutenbereich) erhebliche Veränderungen im Transkriptom hervorrufen. Diese schnellen Reaktionszeiten sind notwendig, um die zelluläre Maschinerie als Reaktion auf Veränderungen zu verändern. Andererseits ist die DNA-Methylierung relativ stabil und kann sich zwar als Reaktion auf die Umwelt ändern, tut dies jedoch in einem geringeren Ausmaß als die Genexpression und über längere Zeiträume. Daher sehen wir im Kontext unseres experimentellen Designs die größten Unterschiede in der CpG-Methylierung der Larven, wenn die Mütter 4 Monate lang in verschiedenen Umgebungen konditioniert wurden, während die Entwicklungsbehandlung nur � h dauerte. Aufgrund der Stabilität und der vorgeschlagenen Funktionen der DNA-Methylierung in Genregionen ist die Modulation der CpG-Methylierung in Zeiten kurzfristiger Umweltunterschiede wahrscheinlich keine evolutionär begünstigte Reaktion, da kurzfristiger Stress möglicherweise kein Hinweis auf anhaltende Umweltveränderungen ist. Längerfristige chronische Umweltunterschiede, wie die mütterliche Konditionierung im aktuellen Experiment, können die zukünftige Umwelt besser vorhersagen, so dass die Modulation der DNA-Methylierung als Reaktion darauf eine adaptive Reaktion sein kann, die über längere Zeiträume und Generationen hinweg auftritt.

In diesem Experiment wählten wir Bedingungen, die für Auftrieb repräsentativ sind, der im Santa Barbara Channel variabel und periodisch ist. Dieses verwendete Design wurde absichtlich von der vor Ort Umweltbedingungen in einem Versuch, das Potenzial für umweltinduzierte Methylierungs- und Genexpressionsänderungen zu identifizieren und jede mechanistische Beziehung zwischen Methylierungsänderungen, die durch die mütterliche und Entwicklungsumgebung getrieben werden, und jede entsprechende Änderung in der Transkription zu hinterfragen. Durch Feldversuche wissen wir, dass selbst variable vor Ort Bedingungen können Auswirkungen auf die Mutter haben (Hoshijima und Hofmann, 2019). Daher wird es in Zukunft wichtig sein zu untersuchen, ob die DNA-Methylierungsmuster der Nachkommen als Reaktion auf eine nicht-statische mütterliche Konditionierung moduliert werden oder ob die Induktion von Methylierungsänderungen von der Vorhersagbarkeit der Umweltänderungen abhängt (Burgess und Marshall, 2014).

Beziehung zwischen DNA-Methylierung und dem Transkriptom

Mechanismen, die DNA-Methylierung mit Transkription verbinden, sind bei Wirbellosen mit spärlich methylierten Genomen weniger gut verstanden als bei Wirbeltiersystemen, bei denen die Promotormethylierung die Transkription und nachgelagerte Phänotypen direkt verändern kann (Übersicht in Li und Zhang, 2014). Im Allgemeinen korreliert die Methylierung des Genkörpers positiv mit dem Genexpressionsniveau in wirbellosen Taxa (Zemach et al., 2010), einschließlich Muscheln (Gavery und Roberts, 2013, Wang et al., 2014), Aszidien (Suzuki et al., 2007), und soziale Insekten (Bonasio et al., 2012 Sarda et al., 2012 Wang et al., 2013 Patalano et al., 2015). Insbesondere bei Korallen wurde vorgeschlagen, dass die DNA-Methylierung die Genexpression als Reaktion auf Umweltveränderungen durch eine Reduzierung der falschen Transkription (Li et al., 2017 Liew et al., 2018) feinjustiert, das genomweite Gleichgewicht der Genexpression (Dixon et al.) al., 2018) und durch die Gestaltung der Codon-Nutzung über evolutionäre Zeitskalen (Dixon et al., 2016). Ähnliche Studien wurden auch in Austern gezeigt (Gavery und Roberts, 2010 Roberts und Gavery, 2012 Wang et al., 2014 Jiang et al., 2015 Saint-Carlier und Riviere, 2015). Obwohl sich diese Funktionen nicht gegenseitig ausschließen, besteht bei vielen wirbellosen Systemen kein Konsens darüber, wie aktiv die DNA-Methylierung die Transkription als Reaktion auf Umweltveränderungen reguliert. Abgesehen davon deuten unsere Daten darauf hin, dass Veränderungen der DNA-Methylierung in Genen trotz breiter genomweiter Muster selten der Genexpression auf Gen-für-Gen-Ebene entsprechen: ähnlich angereicherte GO-Terme werden zwischen DEGs und Genen mit DMCpGs gefunden, die mit unterschiedlichen mütterlichen Umgebungen assoziiert sind , werden hochmethylierte Gene eher hoch transkribiert, und Gene mit DMCpGs sind immer hochmethyliert.

Es besteht Streit darüber, ob die Genexpression oder DNA-Methylierung dem anderen die Kontrolle verleiht. Obwohl das Gesamtausmaß der Genexpressionsreaktionen auf Umweltbedingungen größer ist, gab es einen stärkeren Einfluss der mütterlichen Konditionierung auf die DNA-Methylierung als der abiotischen Bedingungen, unter denen sich die Embryonen entwickelten. Dies könnte darauf hindeuten, dass mütterlich vermittelte Veränderungen der DNA-Methylierung zu einer unterschiedlichen Expression bei den Nachkommen führen können. Wir fanden jedoch eine minimale Überlappung zwischen mütterlich bedingten Unterschieden in der DNA-Methylierung und Transkription dieser Gene bei ihren Nachkommen, die Mehrheit der Gene mit DMCpGs durch mütterliche Bedingungen wurde nicht unterschiedlich exprimiert. Gene mit DMCpGs zeigten jedoch eine funktionelle Anreicherung von DNA-Stoffwechselprozessen und DNA-Integration (Ergänzungstabelle 3), ähnlich wie in Modulen angereicherte Begriffe, die eine starke Korrelation mit mütterlichen Bedingungen zeigen (Abbildung 3 und Ergänzungstabelle 4). Dies ist ein Beweis dafür, dass es zwar umweltbedingte Veränderungen sowohl bei der CpG-Methylierung als auch bei der Genexpression gibt, diese jedoch nur breit verknüpft zu sein scheinen. Dies deutet darauf hin, dass umweltbedingte Veränderungen der DNA-Methylierung auf zellulärer Ebene eine andere funktionelle Rolle spielen können als die direkte Transkription, wie sie in Wirbeltiersystemen beobachtet wird, möglicherweise durch die Kontrolle der falschen Transkription. Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Ansatz der reduzierten Repräsentation unsere Fähigkeit zur Untersuchung von Methylierungsmustern in allen Genen einschränkt und ein vollständiges genomisches Bild, das Transkription und DNA-Methylierung verbindet, gewährleistet ist.

Während der Schwerpunkt unserer Studie darauf lag, die Rolle der DNA-Methylierung als Reaktion auf Umweltbedingungen zu untersuchen, ist es erwähnenswert, dass die DNA-Methylierung auch als notwendig erachtet wird, um eine erfolgreiche Entwicklung bei Wirbellosen sicherzustellen (Regev und Lamb, 1998 Riviere et al., 2013). Indirekte Beweise dafür bei Seeigeln umfassen Beobachtungen, dass die DNA-Methylierung breiter funktioneller Gruppen und entwicklungsregulierter Gene je nach Lebensgeschichte variieren S. purpuratus (Fronk et al., 1992 Strader et al., 2019). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sich die DNA-Methyltransferase-Aktivität während der frühen Entwicklung des Seeigels dramatisch ändert Sphaerechinus granularis (Tosi et al., 1995). Die Behandlung mit 5-Azacytidin, einem nuklearen Methylierungshemmer, in jedem Stadium vor der Blastula hemmt die Entwicklung über das Blastulastadium hinaus bei Seeigelembryonen. Paracentrotus lividus und Sphaerechinus granularis, wodurch Embryonen im Blastula-Stadium zum Stillstand gebracht werden, obwohl einige weiterhin Spiculae ohne weitere morphologische Veränderungen entwickeln (Crkvenjakov et al., 1970 Maharajan et al., 1986). Obwohl im Allgemeinen keine Details zur spezifischen Rolle der DNA-Methylierung bei der Entwicklung von Seeigeln vorliegen, gibt es Hinweise darauf, dass sie für die Entwicklung anderer wirbelloser Tiere wie der Auster, Crassostrea gigas (Riviere et al., 2013), die Wespe, Nasonia vitripennis (Zwier et al., 2012) und die Ascidian, Phallusia manzmilata (Maharajanet al., 1986). Damit die Entwicklung erfolgreich fortschreiten kann, können wir daher gewisse Einschränkungen erwarten, wie stark sich die DNA-Methylierung in sich entwickelnden Embryonen und Larven ändern kann. Unsere bisherige Arbeit zeigte minimale differentielle Methylierung in S. purpuratus als Funktion der Entwicklungsbedingungen (Strader et al., 2019), obwohl das Experiment Entwicklungsumgebungen umfasste, die nur um PCO2 Niveau. In dieser Studie werden die kombinierte Temperatur und PCO2 Niveaus unserer nicht aufsteigenden im Vergleich zu aufsteigenden Entwicklungsbehandlungen führten zu einer unterschiedlichen Methylierung, jedoch in geringerem Maße als die Auswirkungen der mütterlichen Umgebung auf die unterschiedliche Methylierung. Daher können einige Veränderungen der DNA-Methylierung als Reaktion auf externe Faktoren auftreten, trotz potenzieller Einschränkungen der Methylierung während der frühen Entwicklung, obwohl dies wahrscheinlich von der Menge und Intensität des/der Umweltstressoren(s) abhängt.

Mütterliche Auswirkungen auf die Genexpression und CpG-Methylierung

Das blaue Modul zeigt eine Hochregulierung von Genen, die mit Wasserstoffionen-Transmembrantransportern und dem Wasserstofftransport verbunden sind, wenn Larven Mütter hatten, die unter Auftriebsbedingungen aufgezogen wurden. Dies deutet darauf hin, dass diese Gene einen starken maternalen Effekt haben, der diese Larven möglicherweise dazu bringt, mehr H + -Transporter im High zu exprimieren PCO2 Umgebung, die mit der Auftriebsbehandlung verbunden ist. Während extrazelluläres Gewebe in Larvenseeigeln den pH-Wert der Umgebung aufrechterhält, gibt es eine interne Kontrolle des pH-Werts innerhalb der intrazellulären Kompartimente, einschließlich derjenigen, die die wichtigsten kalzifizierenden Zellen umgeben. Diese interne Kontrolle wird durch Transporter vermittelt, die die Konzentrationen von H + und HCO 3 – auf beiden Seiten der Membran regulieren (Evans et al., 2013).Mehrere Studien zu Genexpressionsreaktionen auf hohe PCO2 in Seeigellarven und anderen marinen Wirbellosen finden entweder keine differentielle Expression oder Herunterregulierung von Wasserstoffionentransportern (Todgham und Hofmann, 2009 Moya et al., 2012 Evans und Watson-Wynn, 2014). Diese Studien wurden jedoch alle durchgeführt, indem die frühen Phasen der Lebensgeschichte verschiedenen PCO2 Umgebungen, ähnlich der Entwicklungsbehandlung in der vorliegenden Studie, die keine unterschiedliche Expression von H + -Transportern als Reaktion auf ansteigende Entwicklungsbedingungen fand (Abbildung 2 und ergänzende Tabelle 5). Dies legt nahe, dass die Modulation von H + -Transportern wahrscheinlich keine schnelle Reaktion auf Umweltveränderungen ist, wie im Verlauf der Embryonal- und Larvenentwicklung. Eine längerfristige Exposition von erwachsenen Seeigeln gegenüber hohen PCO2 und niedrige Temperaturen (Upwelling) können eine Hochregulierung dieser Gene bewirken, die für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen H + und HCO 3 – -Ionen bei den Nachkommen wichtig sind. Die Hochregulation dieser Gene scheint jedoch keinen Vorteil für die Larven zu bringen, wenn sie selbst Auftriebsbedingungen in Bezug auf die Länge der Larven-Spicula (Ergänzende Abbildung 4) und die Expression von zellulären Stressreaktionsgenen (Abbildung 2) ausgesetzt sind.

Schwarze und Cyan-Module zeigten eine Anreicherung von Genen, die mit DNA-Stoffwechselprozessen, Makromolekül-Biosyntheseprozessen und DNA-Integration verbunden sind, was auf eine insgesamt unterschiedliche Regulierung dieser Prozesse hindeutet, wenn Mütter unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt sind. Die funktionelle Anreicherung von Genen mit DMCpGs, von denen die meisten in Bezug auf die mütterliche Umgebung unterschiedlich methyliert sind, zeigt unter anderem auch eine Anreicherung der DNA-Integration, Makromolekül-Biosyntheseprozesse und DNA-Stoffwechselprozesse (Ergänzungstabelle 3). Trotz Ähnlichkeiten in Bezug auf GO enthielten mütterliche Module nicht mehr Gene mit DMCpGs als Entwicklungsmodule (Ergänzende Abbildung 5) und es gab nur sehr wenige Gene, die sowohl DMCpGs als auch DEGs nach mütterlichem Zustand aufwiesen (12 Gene, ergänzende Tabelle 5). Das Ergebnis, dass mütterliche Reaktionen auf den Auftrieb eine unterschiedliche Methylierung und Expression in Genen mit ähnlicher Funktionalität bewirkten, legt nahe, dass die Modulation der Aktivität dieser Gene eine kritische Langzeitreaktion auf Auftriebsbedingungen sein könnte. Es gibt zwar Vorbehalte bei der Extrapolation von GO-Kategorien aus nur einer Teilmenge von Genen mit sequenzierten CpGs, in Aiptasie Seeanemonen, ähnliche GO-Kategorien sind mit DM-Genen angereichert, einschließlich 𠇍NA-abhängige DNA-Replikation” und 𠇍NA-Integration” (Li et al., 2017), dieselbe Top-GO-Kategorie, angereichert für Gene mit DMCpGs in diesem Datensatz (Ergänzungstabelle 3). DNA-Integration ist der Vorgang, bei dem ein DNA-Segment in ein anderes eingefügt wird, ein Beispiel sind transponierbare Elemente. Epigenetische und transponierbare Elemente interagieren stark miteinander und beide können als Reaktion auf Stress zu Veränderungen des Phänotyps und Genotyps führen (Rey et al., 2016). Epigenetische Komponenten sind zum Beispiel der Schlüssel zur Unterdrückung der Aktivität transponierbarer Elemente. Daher ist es möglich, dass Interaktionen zwischen DNA-Methylierung und transponierbaren Elementen schnelle Veränderungen der Phänotypen als Reaktion auf globale Veränderungen über kurze Zeitskalen in anderen Taxa als Wirbeltieren und Pflanzen bewirken können (Rey et al., 2016). Unsere Ergebnisse sowie andere, die über eine unterschiedliche Methylierung von Genen im Zusammenhang mit der DNA-Integration berichten, zeigen, dass in marinen Systemen, die einem globalen Wandel-Multi-Stressor-Szenario ausgesetzt sind, mehr Forschung zu möglichen Auswirkungen transponierbarer Elemente auf schnelle phänotypische Veränderungen erforderlich ist. Darüber hinaus kann die DNA-Methylierung Phänotypen beeinflussen, indem sie die Mutabilität von Gensequenzen verändert, was vermutlich die Evolution der Codon-Bias beeinflusst (Dixon et al., 2016). Diese Mechanismen könnten besser repräsentative für Downstream-Effekte umweltbedingter Veränderungen der DNA-Methylierung sein als die direkte Veränderung der Transkription bei wirbellosen Tieren mit spärlich methylierten Genomen.

Embryonale Entwicklung bei Auftriebszuständen vermittelt phänotypische und transkriptomische Signaturen von abiotischem Stress

Die Entwicklungsumgebung hatte während der Gametogenese einen stärkeren Einfluss auf die Spiculalänge und das Transkriptom als die adulte Umgebung (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 4). Dies steht im Gegensatz zu einer früheren Studie in S. purpuratus bei denen die Umweltbedingungen der Mutter einen größeren Einfluss auf den Phänotyp und das Transkriptom der Nachkommen zu haben schienen als die Bedingungen während der Entwicklung (Wong et al., 2018). Diese Unähnlichkeit könnte teilweise auf Unterschiede im Entwicklungsstadium zurückzuführen sein, da gezeigt wurde, dass die Reaktionen von Organismen auf die Umwelt je nach Entwicklungsstadium stark variieren (Kurihara, 2008 Ross et al., 2011 Byrne, 2012). Wonget al. (2018) untersuchten die Körpergröße und die transkriptomischen Muster des Gastrulastadiums, während dessen wichtige Entwicklungslandmarken dieses von späteren Larvenstadien unterscheiden. Eine weitere bemerkenswerte Unterscheidung ist die in Wong et al. (2018) wurden die Embryonen unter zwei verschiedenen Bedingungen aufgezogen, die sich nur durch einen einzigen abiotischen Faktor unterschieden: PCO2 Niveau. In der hier vorgestellten Studie wurden Kombinationen aus Temperatur und PCO2, die ökologisch relevante Auftriebs- oder Nichtauftriebszustände widerspiegeln sollten, wurden während der frühen Entwicklung manipuliert, um ähnliche oder wechselseitige Behandlungen zu erzeugen, wie sie die Erwachsenen erlebten. So kann die Dominanz der phänotypischen und transkriptomischen Plastizität als Ergebnis der Entwicklungsbedingungen auf die Einbeziehung der Temperatur als Faktor während der Entwicklung oder auf die Multi-Stressor-Natur der Einbeziehung von Kombinationen unterschiedlicher Temperatur- und PCO2 Ebenen.

Nachkommen, die unter Auftriebsbedingungen aufgezogen wurden, zeigten phänotypische und transkriptomische Muster, die mit einer Stressreaktion verbunden sind (Abbildung 2 und ergänzende Tabelle 4). Im Einklang mit dieser Stressreaktion kam es zu einer Hochregulierung zahlreicher RNA-Modifikationsprozesse sowie von Prozessen, die an der Translation und möglicherweise posttranslationalen Modifikationen (Proteinpolymerisation) beteiligt sind. Zum Beispiel ist bekannt, dass ein Gen im türkisfarbenen Modul, ebenfalls mit einem signifikant unterschiedlich methylierten CpG (Fig. 5B), Sp.Dusp6.7.9, an der Proteindephosphorylierung beteiligt ist. Schließlich gab es auch eine Hochregulierung von Genen, die am Kohlenhydrat- und Lipidtransport beteiligt sind. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Larven, die unter Auftriebsbedingungen aufgezogen wurden, eine Stressreaktion und eine potenzielle Neuverteilung von Energieressourcen zeigen, die meist die Verkalkung und das Wachstum aufrechterhalten. Larven, die unter Auftriebsbedingungen aufgezogen wurden, zeigen auch eine signifikante Verringerung der Spiculalänge im Vergleich zu solchen, die unter nicht aufsteigenden Bedingungen aufgezogen wurden (Ergänzende Abbildung 4). Unterschiede in den RNA-Stoffwechsel- und Verarbeitungswegen legen einen Versuch nahe, zelluläre Funktionen als Reaktion auf aufsteigenden Stress zu modulieren. Darüber hinaus war die Mehrheit der DMCpGs im aufsteigenden Zustand im Vergleich zum nicht aufsteigenden Zustand hypermethyliert, was eine ähnliche Reaktion auf andere Organismen ist, die pH-Stress ausgesetzt sind (Liew et al., 2018). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse klare Kompensationsmechanismen als Reaktion auf aufsteigenden Stress.

Stress als Folge der Entwicklung unter der simulierten Auftriebsbehandlung könnte auf einen niedrigen pH-Wert, eine niedrige Temperatur oder die Kombination von beidem zurückzuführen sein. In Bezug auf Umgebungen mit niedrigem pH-Wert wurde allgemein gezeigt, dass Seeigelarten ein reduziertes Skelettwachstum und eine reduzierte Verkalkung aufweisen (Kurihara und Shirayama, 2004 Clark et al., 2009 Dupont et al., 2010 Byrne und Przeslawski, 2013), ähnlich wie wir in dieser Studie gefunden. Die erhöhte Expression von Genen im Zusammenhang mit der Kalziumhomöostase wurde als ein Mittel vorgeschlagen, mit dem sich entwickelnde Seeigellarven in der Lage sind, die Skelettogenese in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert zu bewältigen und aufrechtzuerhalten (Evans et al., 2013 Evans und Watson-Wynn, 2014). Somit könnte das Versäumnis, Calcium-bezogene Gene hochzuregulieren, zu einer verminderten Skelettogenese führen. Tatsächlich zeigten die Larven in dieser Studie eine relative Herunterregulation von Calciumionen-bindenden Genen, ein ähnliches Muster wie das von Todgham und Hofmann (2009) in . beobachtete S. purpuratus Larven aufgezogen unter erhöhten PCO2 Ebenen. In Bezug auf Temperatureffekte zeigen Seeigellarven in einer Vielzahl von Arten und Breitengraden im Allgemeinen ein größeres Wachstum und eine stärkere Verkalkung, wenn sie bei wärmeren Temperaturen aufgezogen werden, was gelegentlich eine kompensierende Wirkung hat, die hilft, die negativen Auswirkungen eines niedrigen pH-Werts auszugleichen (Sheppard Brennand et al., 2010 Byrne, 2012 Byrne und Przeslawski, 2013 Wangensteen et al., 2013). Bei Auftriebsereignissen ist jedoch kein solcher kompensatorischer Effekt zu erwarten, da neben höheren PCO2, kalte Temperaturen sind mit aufsteigendem Meerwasser verbunden. Daher stimmen die Herunterregulierung von Calciumionen-bindenden Genen und die signifikante Reduzierung der Spiculalänge unter Auftriebsbedingungen mit unseren Erwartungen überein, dass sich Larven unter niedrigen pH- und/oder niedrigen Temperaturbedingungen entwickeln.

Folgen epigenetischer Vererbung auf die intergenerationelle Plastizität

Die epigenetische Vererbung, bei der epigenetische Merkmale über die Keimbahn intergenerationell weitergegeben werden, ist eine wichtige Studienfrage im Bereich der Umweltepigenetik (Verhoeven et al., 2016 Eirin-Lopez und Putnam, 2019), da sie zu einer schnellen Akklimatisierung und Belastbarkeit beitragen kann an sich verändernde Umgebungen und beeinflusst dadurch die Fitnesslandschaft und die daraus resultierenden Evolutionsprozesse (Bonduriansky und Day, 2009 Bonduriansky et al., 2012). Obwohl diese Studie keinen direkten Beweis dafür liefert, unterstützt das Muster, bei dem die mütterlichen Bedingungen einen größeren Einfluss auf die unterschiedliche Methylierung zwischen den Larven hatten als die Entwicklungsbedingungen, das Potenzial für epigenetische Vererbung. In diesem Fall können epigenetische Markierungen in Form von DMCpGs von den Müttern in ihre Eier eingebaut worden sein, die dann trotz unterschiedlicher Umweltbedingungen, unter denen die Embryonen und Larven aufgezogen wurden, während der frühen Entwicklung bei ihren Nachkommen erhalten blieben. Während weitere Studien erforderlich sind, um festzustellen, ob diese epigenetischen Veränderungen wirklich in die Keimbahn integriert sind und über Generationen hinweg bestehen bleiben können, unterstützt diese Studie das Potenzial der epigenetischen Vererbung in diesem System.


Abstrakt

Methylquecksilber (MeHg) ist ein weit verbreitetes und allgegenwärtiges Umwelt-Neurotoxisches in aquatischen Ökosystemen, von dem bekannt ist, dass es das Verhalten von Fischen und anderen Wirbeltieren verändert. Diese Studie zielte darauf ab, die Verhaltenseffekte einer entwicklungsbedingten MeHg-Exposition auf Larven von Gelbbarsch (Perca flavescens) – eine nicht modellhafte Fischart, die in den Großen Seen beheimatet ist. Embryonen wurden 20 h MeHg (0, 30, 100, 300 und 1000 nM) ausgesetzt und dann 25 Tage nach der Befruchtung (dpf) aufgezogen, um spontanes Schwimmen, visuelle motorische Reaktion (VMR) und Nahrungssuche-Effizienz zu analysieren. MeHg-Expositionen führten zu Gesamtquecksilber (THg)-Körperbelastungen von 0,02, 0,21, 0,95, 3,14 und 14,93 µg/g (Nassgewicht). Organismen, die 1000 nM ausgesetzt waren, wiesen eine hohe Sterblichkeit auf, daher wurden sie von nachgeschalteten Verhaltensanalysen ausgeschlossen. Alle getesteten MeHg-Expositionen waren mit einer Verringerung des spontanen Schwimmens bei 17 und 25 dpf verbunden. Die Exposition gegenüber 30 und 100 nM MeHg verursachte während des VMR-Assays bei 21 dpf eine veränderte lokomotorische Leistung, während die Exposition gegenüber 100 nM MeHg mit einer verringerten Effizienz bei der Nahrungssuche bei 25 dpf einherging. Zu Vergleichszwecken ergab die hier getestete zweitniedrigste Exposition eine THG-Belastung, die den zulässigen Gehalt an verzehrbarem Fisch in den Vereinigten Staaten darstellt. Darüber hinaus wird diese Dosis nach Angaben der Food and Drug Administration bei etwa zwei Dritteln der in den Vereinigten Staaten überwachten konsumierbaren Fischarten gemeldet. Obwohl die hier berichteten THg-Körperbelastungen in der Umwelt höher waren als erwartet, analysiert unsere Studie erstmals die Auswirkungen einer MeHg-Exposition auf das grundlegende Überlebensverhalten von Gelbbarschlarven und Fortschritte bei der Erforschung der ökologischen Relevanz von Verhaltensendpunkten.


Donnerstag, 23. Mai 2019

Die positiven Auswirkungen von 12 Wochen Probiotika und Vitamin D bei chronischer Schizophrenie?

medium.jpg" />Die Ergebnisse von Amir Ghaderi und Kollegen [1] (Open-Access) liefern heute das Blogging-Futter, und die Ergebnisse einer Studie, die sich mit einem "neuartige Kombination von Vitamin D und Probiotika auf metabolische und klinische Symptome bei chronischer Schizophrenie." Diese probiotische Formulierung enthielt "Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus reuteri und Lactobacillus fermentum (jeweils 2 ×󈎎 9 )" und wurde über einen Zeitraum von 12 Wochen zusammen mit einer Vitamin-D-Ergänzung geliefert - "50.000 IU Vitamin D3 alle 2 Wochen" - Verwendung eines "randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Studie"Design. Uns wird auch gesagt, dass das Versuchsprotokoll "rückwirkend registriert."

Die Ghaderi-Studie konzentrierte sich nicht nur darauf, was ihre kombinierte Intervention bei den "klinischen Symptomen" der Schizophrenie bewirken könnte, obwohl dies ein wichtiger Teil der erzielten Ergebnisse ist. Sie wollten auch Dinge untersuchen wie "Biomarker für oxidativen Stress und kardiometabolisches Risiko bei chronischer Schizophrenie." Dies geschah unter anderem durch die Messung von Markerverbindungen, die für die Ermittlung der gesamten antioxidativen Kapazität, des gesamten Glutathionspiegels und des hochempfindlichen C-reaktiven Proteins (hs-CRP) relevant sind.

Ergebnisse: Das Wichtigste zuerst: Die Vitamin-D-Supplementierung erhöhte den Vitamin-D-Spiegel bei denjenigen, die das probiotische Vitamin D + -Präparat erhielten. Nicht gerade ein unerwartetes Ergebnis, das ich Ihnen zugestehen kann, aber wichtig aus der Sicht, dass alle nachfolgenden Ergebnisse mit diesem Anstieg des Vitamin-D-Spiegels * in Verbindung gebracht werden könnten. Weiter: "Vitamin D und probiotische Co-Supplementierung waren mit einer signifikanten Verbesserung des Allgemeinzustandes verbunden. und Gesamt-PANSS-Scores."PANSS steht für die Positive and Negative Syndrome Scale und hat einige wichtige Verwendungen im Zusammenhang mit Schizophrenie und der Darstellung von positiven und negativen Symptomen. Abgesehen davon erwähnen die Autoren auch, dass ihre Supplementationskombination scheinbar keine Auswirkungen auf die Werte anderer hatte in die Studie aufgenommene Maßnahme - die Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS) - die irgendwie zeigt, dass Vitamin D + Probiotika nicht ein Allheilmittel für jeden Aspekt der Schizophrenie sind.

Die Forscher berichten auch darüber, wie ihr kombiniertes Nahrungsergänzungsmittel auch mit einigen Veränderungen der für die Studie eingeschlossenen oxidativen Stress- und kardiometabolischen Risikomaße im Einklang mit anderen Studienergebnissen *korreliert* (siehe hier). Es gibt ziemlich viele Daten, daher werde ich keine Details angeben. Es genügt zu sagen, dass einige von ihnen für die gesundheitlichen Ungleichheiten, die auf eine Schizophrenie-Diagnose zu folgen scheinen, „positiv“ wichtig sein könnten (siehe hier).

Was sonst? Nun, ich kann im Ghaderi-Papier nicht allzu viele Details zu Nebenwirkungen finden, daher gehe ich davon aus, dass dies kein wesentliches Problem war. Die Tatsache, dass die Teilnehmer der Studie „während des Eingriffs ins Krankenhaus eingeliefert werden" bedeutet, dass sie, wie ich vermute, mit größerer Sorgfalt überwacht wurden als beispielsweise in der Gemeinschaft, einschließlich der Suche nach möglichen Nebenwirkungen.

Und damit, und der Voraussetzung für ein weiteres Studium (siehe hier und siehe hier), sage ich nichts mehr.

[1] Ghaderi A. et al. Klinische und metabolische Reaktion auf Vitamin D plus Probiotika bei Schizophreniepatienten. BMC Psychiatrie. 2019 19:77.


Erweiterte Daten Abb. 1 Deskriptive Analyse des Multi-Omic-Gewebeatlas.

ein, Paarweise globale Pearson-Expressionskorrelationsanalyse aller 30 Gewebe (n = 1 Messung pro Gewebe) auf Transkriptomebene (unteres Dreieck) und Proteomebene (oberes Dreieck) unter Verwendung aller identifizierten Genloci. Proteine ​​korrelieren stärker zwischen Geweben als Transkripte. Türkisfarbene Quadrate markieren Beispiele für morphologisch sehr ähnliche Gewebe. Die Gewebe sind wie in Abb. 1 gefärbt. B, Streudiagramme mit hoch reproduzierbaren Häufigkeitsmessungen für Transkript (oben) und Protein (unten) in morphologisch ähnlichen Geweben, die in markiert wurden ein nämlich Knoten (ND) versus Internodien (IND), Blatt distal (LFD) versus Blatt proximal (LFP) und Wurzel (RT) versus Wurzeloberzone (RTUZ). R bezeichnet den Korrelationskoeffizienten nach Pearson n bezeichnet die Anzahl der Transkripte oder Proteine. C, Prozentsatz der von einem bestimmten Chromosom kodierten Gene, die auf Transkriptom-, Proteom- oder Phosphoproteom-Ebene identifiziert wurden. D, Prozentsatz der Swiss-Prot- und TrEMBL-Proteindatenbankeinträge sowie Proteinnachweiskategorien von UniProt, die auf Transkriptom-, Proteom- oder Phosphoproteom-Ebene identifiziert wurden. Evidenzgrad: (1) Proteinnachweis (2) Transkriptnachweis (3) Homologie (4) vorhergesagt und (5) unsicher. e, Vergleich von Proteinidentifikationen zwischen einem früheren Arabidopsis Proteomstudie 7 anhand von 12 Geweben, dieser Studie (30 Gewebe) und der Anzahl der proteinkodierenden Gene in Araport11. F, iBAQ-Intensitätsverteilung der in dieser Studie identifizierten Proteine. Proteine, die auch in einer früheren Studie 7 identifiziert wurden, werden in das gleiche Diagramm projiziert. gLinks, Anteil der identifizierten P-Stellen an S-, T- oder Y-Resten mit sehr sicherer Lokalisierung der Phosphorylierungsstelle innerhalb der identifizierten Peptidsequenz (als Klasse I P-Stellen bezeichnet, wenn der Lokalisierungs-Score größer als 0,75 ist). Rechts Verteilung von Proteinen, für die phosphorylierte S-, T- oder Y-Reste identifiziert wurden. h, Links, Venn-Diagramm zum Vergleich von Phosphoprotein-Datensätzen aus einer früheren Veröffentlichung 8, PhosPhAT4.0 und dieser Studie. Rechts, Venn-Diagramm zum Vergleich der Lokalisierungskonfidenz von P-Stellen zwischen Klasse-I-Stellen, die in dieser Studie identifiziert wurden, und den Datensätzen mit niedriger und hoher Konfidenz, die in einer früheren Veröffentlichung berichtet wurden 8 .

Erweiterte Daten Abb. 2 Proteogenomik und dynamischer Bereich der Transkript- und Proteinexpression.

ein, Anzahl der identifizierten N-terminalen (NT) oder C-terminalen (CT) Peptide von Proteinen in entweder unmodifizierter oder phosphorylierter Form. B, Häufigkeit von Aminosäuren nach dem Initiator-Methionin in N-terminalen Peptiden mit (–X) oder ohne (M–X) Abspaltung des Initiator-Methionins. X bezeichnet die Aminosäure nach dem Startcodon. C, Häufigkeit der Protein-N-terminalen Acetylierung für Aminosäuren in B. Da Trypsin für den Proteinverdau verwendet wurde, konnten die Häufigkeiten für Arg- und Lys-Reste nicht bestimmt werden (n.d.). D, Verteilung der peptidbasierten Sequenzabdeckung von Proteinen in einzelnen Geweben und für den kombinierten Datensatz (Gewebeabkürzungen wie in Abb. 1). Boxen enthalten 50 % der Daten und zeigen den Median als schwarze Linie an. Der obere und untere Quartilbereich werden als Whisker angezeigt.Die Anzahl der Proteine ​​ist für jedes Gewebe angegeben. e, Tortendiagramme, die den Prozentsatz der Proteine ​​zeigen, die durch <3, 3–10 oder >10 Peptide identifiziert werden, die entweder gemeinsame (Rasier-)Peptide zulassen oder nur auf einzigartige Peptide beschränkt sind. F, Links, Anzahl der auf Transkript- und Proteinebene nachgewiesenen Proteinisoformen im Vergleich zur Anzahl aller annotierten Isoformen in Araport11. Rechts, Anzahl multipler Isoformen desselben Gens, die auf Peptidebene unterschieden werden. g, Validierung der Proteinisoform- und sORF-Identifizierung durch Vergleich der Tandem-Massenspektren aus dem Gewebeatlas mit denen von synthetischen Peptidreferenzstandards. Als Ähnlichkeitsmaß (Methoden) wurde der normalisierte spektrale Kontrastwinkel (SA) verwendet. Kandidaten-Isoformen und sORFs wurden als gültig angesehen, wenn der spektrale Kontrastwinkel der Spektren >0,7 betrug. Diese Daten sind in den Zusatzdaten 3 aufgeführt. h, Aminosäuresequenz und Spiegeldiagramme von Tandem-Massenspektren für zwei Peptide des sORF BIP138_4. Die nach oben zeigenden Spektren wurden von Gewebeaufschlüssen gesammelt, die nach unten zeigenden wurden von synthetischen Peptiden gesammelt. Der normalisierte spektrale Kontrastwinkel und der Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) wurden als Ähnlichkeitsmetriken (Methoden) verwendet und weisen darauf hin, dass beide hochbewerteten Spektren (n = 1 aufgenommene Spektren) sind nahezu identisch, was die Identifizierung dieses sORF als exprimiertes Protein bestätigt. ich, Dynamikbereich der Transkripthäufigkeit (grau) und Anteil der Transkripte, die auch auf Proteinebene identifiziert wurden, projiziert in dieses Diagramm (blau). OM, Größenordnungen. Beachten Sie, dass für Transkripte mit geringerer Häufigkeit weniger Proteine ​​nachgewiesen wurden. J, Dynamischer Bereich der Proteinhäufigkeit und des Proteinanteils mit Phosphorylierungsnachweis. Die Proteinhäufigkeit umfasst sechs Größenordnungen, während die Transkripthäufigkeit nur vier umfasst (ich). Beachten Sie außerdem, dass Phosphorylierung über den gesamten Proteinhäufigkeitsbereich nachgewiesen wurde. k, Prozentsatz aller annotierten Kinasen (K), Phosphatasen (P), Transkriptionsfaktoren (TF) und Transkriptionsregulatoren (TR), die auf Transkript-, Protein- oder Phosphoprotein-Ebene nachgewiesen wurden. Zahlen unter dem x Achse die Anzahl der Gene für diese Proteinklassen in der A. thaliana Genom.

Erweiterte Daten Abb. 3 Deskriptive Analyse der Transkript- und Proteinexpression in Geweben.

ein, Verteilung der Expressionsspezifitätskategorien für Protein- und Transkriptidentifikationen. Siehe Methoden für die Definition dieser Kategorien. Kurz gesagt, es gibt nur sehr wenige Transkripte und Proteine, die nur in einem einzigen Gewebe exprimiert werden. Die Mengen der gemeinsam genutzten Transkripte oder Proteine ​​können sich zwischen Geweben stark unterscheiden (B). B, Links, Proteinidentifikationen zwischen Blüten (FL) und Blütenorganen, die eine fast vollständige qualitative Überlappung der Proteine ​​zeigen. Kelchblatt (SP), Blütenblatt (PT), Staubblatt (ST), Fruchtblatt (CP). Richtig, Clustering von z-bewertete Proteinintensitäten, die deutliche quantitative Expressionsunterschiede zwischen Blütenorganen zeigen. C, Expressionsanalyse von Blütenorganidentitätsmarkern auf Protein- und Transkriptebene. PISTILLATA (PI, grün), APETALA3 (AP3, rot), APETALA1 (AP1, orange), AGAMOUS (AG, blau). Die Expression dieser Marker entspricht dem Modell der Blütenorganidentität (AP1-Expression markiert Kelchblatt, AP1, AP3, PI-Markierung Blütenblatt, AG, AP3, PI-Markierung Staubblatt und AG-Markierung Fruchtblatt). D, Gesamtzahl der Transkripte aufgetragen gegen die Gesamtzahl der in jedem einzelnen Gewebe nachgewiesenen Proteine ​​(n = 30 Gewebe), die zeigt, dass je mehr Gene als mRNAs exprimiert werden, desto mehr Proteine ​​können in einem Gewebe nachgewiesen werden (Pearson-Korrelation R = 0,79). Die Gewebe sind nach Gewebegruppen wie in Abb. 1 gefärbt. e, Diagramme der kumulativen Häufigkeit von intensitätsgeordneten Identifizierungen von Transkripten und Proteinen für fünf repräsentative Gewebe. Die fünf am häufigsten vorkommenden Transkripte und Proteine ​​sind für jedes Gewebe in absteigender Reihenfolge aufgelistet. Diese sind im Allgemeinen nicht gleich. Beachten Sie außerdem, dass die Eigenschaften der Plots nicht für alle Gewebe gleich sind. In Blüte steigt die Proteinlinie schneller als die Transkriptlinie. Bei Pollen ist das Gegenteil der Fall und bei Samen wird eine gleichmäßigere Charakteristik beobachtet. F, Verteilung gemeinsamer und eindeutiger Identifizierungen unter den 100 häufigsten Transkripten und Proteinen in jedem Gewebe. Auf der Liste der 100 häufigsten Transkripte und Proteine ​​finden sich relativ wenige Proteine ​​und Transkripte zusammen. Dies zeigt, dass die quantitativen Unterschiede in der Transkript- und Proteinexpression bei der Definition eines Gewebes wichtiger sind als die qualitative Expression von Transkripten oder Proteinen. g, Liste von 11 Proteinen, die als das am häufigsten vorkommende Protein (in mindestens einem Gewebe) gefunden wurden, und ihr Anteil an der gesamten iBAQ-Intensität in jedem Gewebe. Einzelne Proteine ​​können bis zu 9 % des Gesamtproteins in einem bestimmten Gewebe ausmachen. h, Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Kerngewebeproteome und -transkriptome (d. h. der Proteine ​​und Transkripte, die in jedem Gewebe identifiziert wurden) unter Verwendung von z-bewertete Fülle. Nur etwa 30% aller Proteine ​​und 20% aller mRNAs wurden in jedem der 30 Gewebe nachgewiesen, obwohl alle Gewebe sowohl auf Protein- als auch auf Transkriptebene tief profiliert waren. Dies zeigt, dass zwischen Geweben starke qualitative und quantitative Expressionsunterschiede bestehen. Das PCA trennt Gewebe in photosynthetisch aktive versus inaktive Gewebe (Komponente 1) und trennt Pollen von allen anderen Geweben (Komponente 2), was darauf hinweist, dass sich die molekulare Zusammensetzung von Pollen von allen anderen Geweben besonders unterscheidet. ich, Anteil der gesamten summierten Proteinintensität für Gene mit spezifischer subzellulärer Kompartimentannotation (aus SUBA 77 Methods) in den verschiedenen Gewebegruppen. Der Vergleich von photosynthetisch aktiven und inaktiven Geweben zeigt, dass der größte Teil des Proteingehalts in photosynthetisch aktiven Geweben in den Plastiden enthalten ist, während das meiste Protein bei photosynthetisch inaktiven Geweben im Zytosol zu finden ist. Proteine ​​mit nur einer einzigen subzellulären Kompartiment-Annotation wurden für den Plot ausgewählt und der Anteil ihrer iBAQ-Intensitäten für jede Gewebegruppe gemittelt. Kern (n = 1.393), endoplasmatisches Retikulum (n = 58), Golgi (n = 68), Peroxisom (n = 67), Plastiden (n = 525), Mitochondrium (n = 317), Vakuole (n = 71), Zytosol (n = 385), Zytoskelett (n = 1), Plasmamembran (n = 268), extrazellulär (n = 351).

Erweiterte Daten Abb. 4 Beziehungen zwischen Transkript- und Proteinspiegeln.

ein, Pearson-Korrelation (R) der Transkriptom- und Proteom-Expression (Kerndatensätze n = 5.043) für jedes Gewebe. B, Pearsons Korrelation zwischen gemessenen und vorhergesagten Proteinabundanzniveaus in allen Geweben. Vorhergesagte Proteinabundanzniveaus wurden aus dem am besten passenden Merkmalsauswahlmodell für jedes Gewebe (Methoden) erhalten. Die Anzahl der Gene, die für die Korrelationsanalyse verwendet wurden, ist für jedes Gewebe angegeben. C, Violin-Plots, die die Verteilung des relativen Beitrags ausgewählter Merkmale zur Vorhersage der Proteinhäufigkeit auf Genebene in Geweben zeigen (n = 30 Gewebe) nach unserem Modell. Violinformen zeigen die Kerndichteschätzung der Datenverteilung und den Median als weißer Punkt. Dicke schwarze Balken kennzeichnen den Interquartilsabstand. D, Spezifische Nukleotidsequenzmotive in 5' UTRs von mRNAs tragen zur Vorhersage von Proteinspiegeln in einer Untergruppe von Geweben bei. Das Clustern von Geweben basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von detektierten 5'-UTR-Motiven zeigt, dass mehrere Merkmale wiederholt für die Aufnahme in das Modell ausgewählt werden, während andere gewebespezifischer zu sein scheinen. e, Aufgrund der Beobachtung, dass die Dn/DS Verhältnis zwischen orthologen von A. thaliana und A. lyrata trug zur Vorhersage des Proteingehalts bei (C) haben wir diese Funktion genauer analysiert. Links, Verteilung der Dn/DS Verhältnis für orthologe Gene in A. thaliana und A. lyrata. Die Verteilung ist für das Beispiel „Blatt distal“ aufgetragen (n = 6.447 Gene). Um evolutionär konservierte Gene zu vergleichen (definiert durch niedrige Dn/DS Verhältnisse) und Gene, die sich neutral entwickeln oder unter positiver Selektion stehen (hohe Dn/DS -Verhältnisse) haben wir die unteren 5 % und die oberen 5 % der Dn/DS Verhältnisverteilung bzw. Rechts, evolutionär konservierte Gene (niedrig Dn/DS Verhältnis) zeigen eine 10–20-mal höhere Proteinhäufigkeit als Gene unter evolutionärem Druck. Boxen enthalten 50 % der Daten und zeigen den Median als schwarze Linie an. Schnurrhaare bezeichnen das 1,5-fache des Interquartilabstands. Ausreißer wurden der Übersichtlichkeit halber weggelassen. F, Zeitverlaufsanalyse der medianen Proteinabundanzänderungen nach Behandlung mit CHX (Translationsblock) oder MG132 (Proteasomblock) im Vergleich zu zeitlich abgestimmten DMSO-Kontrollproben (Methoden). Boxen enthalten 50 % der Daten und zeigen Mediane als schwarze Linien. Schnurrhaare bezeichnen das 1,5-fache des Interquartilabstands. Ausreißer wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit aus dem Diagramm weggelassen, wurden jedoch in die statistischen Tests unten einbezogen. Alle Proteine ​​im Experiment (n = 8.920, grau), Proteine ​​mit einer hohen PTR in Samen (n = 425, rot) oder eine niedrige PTR im Saatgut (n = 254, blau) (definiert wie in Fig. 3d) dargestellt. Unterschiede zwischen den Zeitpunkten wurden auf Signifikanz innerhalb jeder Untergruppe (alle hohe PTR niedrige PTR) unter Verwendung von Einweg-ANOVA und dem Post-hoc-Tukey-HSD-Test getestet. ***P < 0,001 (alle_CHX8–CHX16: P < 1 × 10 -7 alle_CHX8–CHX24: P < 1 × 10 -7 alle_CHX16–CHX24: P = 0,0002 highPTR_CHX8–CHX24: P = 0,0003 lowPTR_CHX8–CHX16: P = 0.0000004 lowPTR_CHX8–CHX24: P < 1 × 10 -7 lowPTR_CHX16–CHX24: P < 1 × 10 –7 ). g, Repräsentative Aufnahmen von Samen nach 4 Tagen Inkubation mit CHX, MG132 oder DMSO Kontrollmedium (n = 1). Die Keimung wurde durch CHX vollständig und durch MG132 teilweise gehemmt, was zeigt, dass die medikamentösen Behandlungen wirksam waren.

Erweiterte Daten Abb. 5 Korrelationen zwischen Transkriptomen, Proteomen und Phosphoproteomen.

ein, Mediane PTRs über Gewebe, aufgetragen gegen die Intergewebevariation dieser PTRs (ausgedrückt als MAD-Proteine ​​und Transkripte mussten in mindestens 10 übereinstimmenden Geweben nachgewiesen werden, um in die Analyse eingeschlossen zu werden). Pfeile bezeichnen Beispiele für Gene mit hohen PTRs (rbcL und petA) und niedrige PTRs (IAA8 und IAA13). Das Balkendiagramm zeigt den MAD-Bereich unterteilt in fünf Quantile, die jeweils die gleiche Anzahl von Genen enthalten (farbige Balken und gestrichelte Linien). Die meisten Gene haben gewebeübergreifend einigermaßen stabile PTRs. B, Wie in ein (Datensatz n = 14.069), jedoch für Transkript- (links) und Protein- (rechts) Messungen. Es gibt mehr Variationen der Proteinspiegel über Gewebe hinweg als die mRNA-Variationen (80% aller Transkripte zeigen einen MAD von <1 80% aller Proteine ​​zeigen einen MAD von 1,2). Es gibt auch größere Unterschiede in den Proteinspiegeln zwischen den Geweben für Proteine ​​in geringer Menge. Dies kann teilweise auf technische Einschränkungen zurückzuführen sein, da Proteine ​​mit geringer Häufigkeit im Allgemeinen weniger genau quantifiziert werden können. C, Wie in ein aber für das Verhältnis von Phosphorylierungsstelle zu Proteinhäufigkeit. P-Stellen und Proteine ​​mussten in mindestens 10 passenden Geweben nachgewiesen werden, um in die Analyse einbezogen zu werden (n = 13,793). D, Wie in B (Datensatz n = 13,793), jedoch für die Häufigkeit von P-Stellen. Die Häufigkeit von P-Stellen zeigt größere Unterschiede zwischen Geweben als die Häufigkeit von Proteinen (60% aller P-Stellen zeigen MAD <1 im Vergleich zu 80% aller Proteine ​​siehe B). Dies kann wiederum teilweise auf technische Einschränkungen zurückzuführen sein, da die Quantifizierung der P-Stelle auf Peptidebene durchgeführt wird und nicht von der Aggregation mehrerer Peptidquantifizierungen zu einem Wert für die Proteinquantifizierung profitiert.

Erweiterte Daten Abb. 6 Rückschluss auf redundante Genfunktion und physikalische Interaktionen aus der Co-Expressionsanalyse.

ein, Streudiagramm der Korrelationskoeffizienten nach Pearson (R) als Maß für die gewebeübergreifende Koexpression für alle Proteinpaare (x Achse) und alle Transkriptpaare (ja Achse) (nur Kerndatensatz, n = 5.043) zusammen mit ihren Randhistogrammen. Farben kennzeichnen das Protokoll10-normalisierte STRING-Scores einzelner Genpaare als Maß für bekannte oder vorhergesagte direkte (physikalische) oder indirekte (funktionelle) Assoziationen. Eine starke Koexpression von Transkripten oder Proteinen oder beidem ist stärker verwandt (physikalisch oder funktionell) als Transkripte und Proteine, die dies nicht sind. B, Co-Expressionsanalyse von duplizierten Genen (Paare mussten in mindestens 10 übereinstimmenden Geweben nachgewiesen werden, um in die Analyse eingeschlossen zu werden). Die Dichtediagramme zeigen die Verteilung der Korrelationskoeffizienten nach Pearson (R) koexprimierter Transkripte (grau) oder Proteine ​​(blau) für Gene, die durch Whole-Genom-Duplications (WGD), lokale Duplikationen oder Transposon-vermittelte Duplikationen entstanden sind. Als Kontrolle sind zufällig ausgewählte Genpaare gezeigt. Mediane werden angegeben und als gepunktete Linien angezeigt. Es gibt eine beträchtliche Co-Expression von duplizierten Genen, was darauf hindeutet, dass diese Gene wahrscheinlich redundante Funktionen haben. C, Links, Protein-Level Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) Werte (von B) für alle doppelten Genpaare (WGD, lokal, transponiert), aufgetragen gegen das Proteinabundanzverhältnis jedes Paares (Durchschnitt über 30 Gewebe) (Methoden). Blaue Pfeile bezeichnen ein Beispiel für ein hohes oder niedriges Verhältnis der Proteinproduktion für die duplizierten Gene. Rechts, Beispiel für gewebeaufgelöste Proteinintensitätsanteile (top-3) (Methoden) für das Duplikatpaar MAC5A und MAC5B. Unabhängig vom Gewebe, MAC5A ist immer viel höher ausgedrückt als MAC5B. Die Gewebe sind wie in Abb. 1 gefärbt. D, Top, geordnetes Proteinabundanzverhältnis für ausgewählte Duplikatpaare (Mittelwert ± Standardabweichung). n = 30) und annotiert für phänotypische Effekte (unten) in der Funktionsverlustmutante für entweder Duplikat 1 oder Duplikat 2 (+). Minussymbole bedeuten das Fehlen eines phänotypischen Effekts. Die asymmetrische Proteinproduktion innerhalb von Duplikatpaaren kann mit dem Auftreten eines Phänotyps in der Funktionsverlustmutante des höher exprimierten Duplikatproteins in Verbindung gebracht werden, was auf eine dominante funktionelle Rolle des stärker exprimierten Proteins hinweist. Blaue Pfeile markieren MAC5A–MAC5B und PHB3–PHB4 als Beispiele. e, Rückschluss auf physikalische Protein-Protein-Wechselwirkungen aus Co-Expressionsdaten. Verteilung der paarweisen Pearson-Korrelationskoeffizienten (R) von koexprimierten Proteinen über (mindestens 10) Gewebe, die Untereinheiten ausgewählter Proteinkomplexe sind. R > 0,5 (grau schattiert) wurde als Cut-off für die Auswahl von Proteinen für die nachfolgende Analyse gewählt, um sicherzustellen, dass Proteine, die in gut charakterisierten Proteinkomplexen vorhanden sind, zurückgehalten werden. KONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS9 SIGNALOSOM (CSN), CELLULOSE-SYNTHASE (CESA). F, Wiederherstellung annotierter Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Co-Expressionsanalyse. Verteilung der Korrelationskoeffizienten nach Pearson (R) von Paaren von Transkripten (grau) oder Proteinen (blau), die in der AtPIN-Datenbank 33 zur physikalischen Interaktion annotiert sind (Paare mussten in mindestens 10 übereinstimmenden Geweben nachgewiesen werden, um in die Analyse aufgenommen zu werden). Teilmengen der AtPIN-Datenbank, nämlich Wechselwirkungen, die durch die Hefe-Zwei-Hybrid-(Y2H)-Methode, durch Affinitätsaufreinigung–Massenspektrometrie (AP–MS) oder beides nachgewiesen wurden. R > 0,5 sind blau schattiert (Protein). Gepunktete Linien bezeichnen Medianwerte. Die Co-Expression stellt nur eine Minderheit der annotierten physikalischen Interaktionen wieder her, und Interaktionen, die durch mehr als eine Zeile experimenteller Beweise gestützt werden, neigen auch dazu, eine stärkere Co-Expression zu zeigen.

Erweiterte Daten Abb. 7 Ableitung von Proteinkomplexen und Untereinheiten-Stöchiometrie aus Proteom-Korrelationsprofilen mit SEC-MS.

ein, Molekulargewicht (MW) von monomeren Proteinen (aus Sequenz bestimmt) aufgetragen gegen die Masse, die aus dem Apex des Elutionsprofils für Proteine ​​bestimmt wurde, die durch SEC-MS-Fraktionen von Blütengewebe (sFL) identifiziert wurden. Einschub zeigt die Molekulargewichtskalibrierung der SEC-Säule unter Verwendung eines Proteinkalibrierungsstandards (Masse zwischen 44 und 690 kDa). Oben ist die Verteilung der in Araport11 annotierten Proteine ​​dargestellt. Viele Proteine ​​weisen eine viel höhere scheinbare Molekülmasse auf, als man von ihren Sequenzen erwarten würde (Datenpunkte über dem x = ja Leitung). Dies legt nahe, dass diese Proteine ​​physikalische Proteinwechselwirkungen eingehen, die während der SEC-Trennung ausreichend stabil sind. B, SEC-Spuren von Proteinen aus fünf gut charakterisierten Proteinkomplexen für Blüten-, Blatt- und Wurzelgewebe. Obwohl die Auflösung der SEC-Trennungen nicht sehr hoch ist, zeigen die komplexen Untereinheiten ein sehr starkes Co-Elutionsverhalten und die SEC-Trennungen der fünf Komplexe sind zwischen Geweben reproduzierbar. CoA-Carboxylase n = 4 Proteine ​​CDC48 n = 3 Proteine ​​RubisCO n = 4 Proteine ​​vorgefaltet n = 6 Proteine ​​SCS n = 3 Proteine. C, Intensitätsnormalisiertes SEC-Elutionsprofil von Proteinen für Blütengewebe. Proteine ​​werden basierend auf der SEC-Fraktion geordnet, in der ihre Intensitätspeaks und die Daten als Heatmap angezeigt werden (n = 2.485 Proteinspuren). Koeluierende Proteine ​​wurden in „Spurenmodule“ (Methoden) gruppiert. Proteine ​​in Spurenmodulen können Mitglieder von Proteinkomplexen darstellen und somit als Kandidaten für eine weitere experimentelle Validierung dienen. D, Um zu quantifizieren, wie gut Proteinkomplexe durch Koexpressionsanalyse aus Daten im Gewebeatlas (TA) oder durch SEC-MS nachgewiesen werden können, wurde eine zusammenfassende Statistik namens „Komplexindex“ berechnet (Methoden). Der Komplexindex ist 1, wenn alle Untereinheiten eines Komplexes im gleichen Modul identifiziert sind und keine anderen Proteine ​​im Modul enthalten sind. Balkendiagramme zeigen Beispiele für komplexe Indizes, die aus den verschiedenen Datensätzen erhalten wurden und sind in große (>4 Untereinheiten) und kleine (≤4 Untereinheiten) Proteinkomplexe (nach UniProt) unterteilt. Co-Expression allein erzeugt viele Kandidaten von Interaktoren, aber die Kombination von Co-Expression und SEC-MS-Analyse ist ein effizienter Weg, um Kandidaten für Folgeexperimente zu priorisieren. e, Heterogenität der Untereinheit innerhalb des Coatomerkomplexes. Der Coatomerkomplex besteht aus sieben Untereinheiten, von denen fünf (α, β, β′, ε und ζ) durch zwölf Paraloge dieser fünf Gene bereitgestellt werden können. Plots zeigen die Proteinanteile dieser Paraloge in allen 30 Geweben (Daten aus Gewebeatlas).Der Coatomerkomplex hat in den meisten Geweben eine ähnliche Zusammensetzung. Eine bemerkenswerte Ausnahme sind Samengewebe, in denen die Produktion der Untereinheit ζ-1 gegenüber den beiden anderen paralogen Proteinen dominiert, was darauf hindeutet, dass der Coatomerkomplex in Samengewebe auch bevorzugt die ζ-1-Untereinheit enthält. Die Gewebe sind wie in Abb. 1 gefärbt. F, Absolute SEC-Intensitätsspuren einzelner komplexer Untereinheiten zur Bestimmung der Untereinheitsstöchiometrie. Beispiele von links nach rechts: der Chaperonin-Komplex (Blüte, 8 Proteine, Verhältnis aller Untereinheiten: 1:1), der 26S-Proteasomkern und -Deckel (Blüte, 14+17 Proteine, Verhältnis aller Untereinheiten: 1:1), die COP9-Signalosom (Blüte, CSN-8-Proteine, Verhältnis aller Untereinheiten: 1:1) und der CESA1-CESA3-CESA6-Komplex (Wurzel, 3 Proteine, Verhältnis aller Untereinheiten: 1:1). CSN3 und CSN5 wurden sowohl als Teil des CSN-Komplexes als auch in monomerer Form nachgewiesen. g, Oben, Gesamtintensität der Proteinkomplex-Untereinheiten über alle Gewebe für die in gezeigten Komplexe F (Untereinheitsintensitäten aus dem Gewebeatlas). Mittlerer, relativer Anteil (Mittelwert ± s.d. n = 30 Gewebe) von Untereinheiten über Gewebe (Methoden). Für den CESA-Komplex wurden Verhältnisse für die Untereinheitskombinationen CESA1–CESA3–CESA6 und CESA4–CESA7–CESA8 berechnet. Die aus den Gewebeexpressionsdaten bestimmten Stöchiometrien stimmen im Allgemeinen gut mit dem erwarteten 1:1-Verhältnis der Untereinheiten in diesen Komplexen überein. Wie in erwähnt F, wurde in der SEC-Analyse eine erhebliche Menge an CSN5 als Monomer nachgewiesen, und der Gewebeexpressionsatlas zeigt auch eine höhere relative Expression dieses Proteins im Vergleich zu allen anderen Komplexpartnern. Dies legt nahe, dass das Protein im Überschuss produziert wird, was für den COP9-Komplex erforderlich ist (wie zuvor beobachtet 123) und kann daher auf eine zusätzliche Funktion innerhalb der Zelle hinweisen.

Erweiterte Daten Abb. 8 Kinasen, Phosphatasen und Phosphorylierungsmotive.

ein, Prozentsatz der annotierten Kinasen und Phosphatasen-Familienmitglieder, die auf Protein- oder Phosphoprotein-Ebene nachgewiesen wurden. Klammern bezeichnen die Anzahl der Gene in jeder Familie im Arabidopsis Genom. B, Gewebe-aufgelöste kombinierte Intensität (d. h. Proteinhäufigkeit) von Familien von Kinasen (links) und Phosphatasen (rechts). Die Gewebe sind wie in Abb. 1 gefärbt. Mehrere Gewebe (insbesondere Pollen) zeichnen sich durch die Expression von Kinasen und Phosphatasen aus, was darauf hinweist, dass diese Gewebe bei der phosphorylierungsvermittelten dynamischen Signalübertragung besonders aktiv sind. C, Oben, Kreisdiagramm der Spezifitätskategorien für Kinasen und Phosphatasen (Definition siehe Methoden). Unten, Verteilung von gewebeverstärkten Kinasen und Phosphatasen über die 30 Gewebe. Einige Gewebe (wie Pollen) zeichnen sich durch die Expression bestimmter Kinasen und Phosphatasen aus, was auf eine gewebespezifische Signalgebung hinweist. D, Tortendiagramme, die den Anteil von Prolin-gerichteten, sauren, basischen und anderen Motivkategorien für phosphorylierte Ser (pS), Thr (pT) und Tyr (pY) Reste zeigen. In dieser Analyse wurden nur P-Stellen der Klasse I (Lokalisationsbewertung > 0,75 Methoden) berücksichtigt. e, Beispielmotiv-Logo-Plots für Motive wie Prolin-gerichtet, sauer und basisch. P-Stellen-Motive wurden unter Verwendung des Motiv-X-Algorithmus identifiziert (siehe ergänzende Tabelle 2 für alle 266 Motive). n bezeichnet die Anzahl der Phosphorylierungsstellen, die das jeweilige Motiv enthalten, „fc“ bezeichnet die Faltungsänderung (d. h. Anreicherung) des Motivs in phosphorylierten gegenüber unmodifizierten Peptiden (Methoden). F, Anreicherung von prolingerichteten (gelb), sauren (rot), basischen (blau) und anderen (grau) Sequenzmotiven (Kreise) im Serin-P-Stellen-Datensatz im Vergleich zu den gleichen Motiven, die im Hintergrunddatensatz von unmodifizierten Peptiden nachgewiesen wurden (Methoden ). Motive sind für zwei, drei und vier feste Aminosäurepositionen gezeigt. Die P-Stelle in jedem Motivbeispiel ist unterstrichen. „X“ bezeichnet eine beliebige Aminosäure. g, Anzahl der identifizierten P-Stellen für ein gegebenes Protein, aufgetragen gegen die Sequenzlängen desselben Proteins. LEA-Proteine ​​sind gezeigt. h, Schema der LEA-Proteinsequenzen (schwarze Balken). Pink bezeichnet phosphorylierte und Blau bezeichnet unphosphorylierte STY-Reste. Fast alle STY-Reste in LEA-Proteinen können phosphoryliert werden. ich, Schema der Sequenzen und Domänentopologie der rezeptorähnlichen Kinasen SRF4, FER und CERK1. P-Stellen treten häufig bevorzugt in spezifischen Domänen auf, insbesondere in der Juxtamembran-Domäne. Proteinsequenzbereiche, die von identifizierten Peptiden bedeckt sind, sind blau markiert und P-Stellen sind rosa markiert.