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Wann findet die Histonsynthese in Bezug auf die DNA-Replikation statt?

Wann findet die Histonsynthese in Bezug auf die DNA-Replikation statt?


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Müssen Histone synthetisiert werden, bevor die DNA repliziert wird, damit sich die DNA um Histone winden kann?


Ja, sie müssen. Aber das ist nur die halbe Wahrheit.

Die (kanonischen) Histone, die bei der DNA-Replikation verwendet werden, werden zu Beginn der S-Phase synthetisiert und anschließend in den Zellkern transportiert. Studien haben gezeigt, dass neu synthetisierte DNA sofort in Nukleosomen verpackt wird. Daher ist es notwendig, dass diese Strukturen vor (oder zumindest rechtzeitig mit) der Replikation verfügbar sind.

Es gibt jedoch unterschiedliche Modelle, wie die Histone in neue DNA eingefügt werden. Ein Modell geht davon aus, dass nach der Replikationsgabel sowohl alte als auch neue Nukleosomen in neu synthetisierte DNA eingebaut werden. Andere gehen von einem halbkonservativen Ansatz aus, bei dem die alten Histone in ihre Untereinheiten zerlegt und dann mit den neu synthetisierten vermischt werden. Zum Beispiel gibt es ein Modell, das vorschlägt, dass die parentalen H2A/H2B- und die H3/H4-Dimere dissoziieren, während ein anderes auch eine Dissoziation der H3/H4-Dimere annimmt.

Abbildung: Nukleosomensynthesemodelle für die DNA-Replikation

Verweise

ein Angélique Galvani und Christophe Thiriet (2013). Replizieren - DNA in der feuerfesten Chromatinumgebung, Die Mechanismen der DNA-Replikation, Dr. David Stuart (Hrsg.), InTech, DOI: 10.5772/52656. Verfügbar unter: https://www.intechopen.com/books/the-mechanisms-of-dna-replication/replicating-dna-in-the-refractory-chromatin-environment


In der Molekularbiologie der Zelle (Kapitel 4) steht geschrieben, dass

Die Haupthistone werden hauptsächlich während der S-Phase des Zellzyklus synthetisiert und auf den Tochter-DNA-Helices direkt hinter der Replikationsgabel zu Nukleosomen zusammengesetzt (siehe Abbildung 5-32). Im Gegensatz dazu werden die meisten Histonvarianten während der gesamten Interphase synthetisiert. Sie werden oft in bereits gebildetes Chromatin eingefügt, was einen Histonaustauschprozess erfordert, der durch die zuvor diskutierten ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexe katalysiert wird


DNA-Replikationsschritte und -prozess

DNA ist das genetische Material, das jede Zelle definiert. Bevor eine Zelle dupliziert und entweder durch Mitose oder Meiose in neue Tochterzellen geteilt wird, müssen Biomoleküle und Organellen kopiert werden, um sie unter den Zellen zu verteilen. DNA, die sich im Zellkern befindet, muss repliziert werden, um sicherzustellen, dass jede neue Zelle die richtige Anzahl von Chromosomen erhält. Der Vorgang der DNA-Duplikation heißt DNA Replikation. Die Replikation folgt mehreren Schritten, an denen mehrere Proteine ​​beteiligt sind, die als Replikationsenzyme und RNA bezeichnet werden. In eukaryontischen Zellen, wie Tierzellen und Pflanzenzellen, findet die DNA-Replikation in der S-Phase der Interphase während des Zellzyklus statt. Der Prozess der DNA-Replikation ist für das Zellwachstum, die Reparatur und die Reproduktion in Organismen von entscheidender Bedeutung.

Die zentralen Thesen

  • Desoxyribonukleinsäure, allgemein bekannt als DNA, ist eine Nukleinsäure, die aus drei Hauptkomponenten besteht: einem Desoxyribose-Zucker, einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen Base.
  • Da die DNA das genetische Material eines Organismus enthält, ist es wichtig, dass es kopiert wird, wenn sich eine Zelle in Tochterzellen teilt. Der Vorgang, bei dem die DNA kopiert wird, wird als Replikation bezeichnet.
  • Die Replikation beinhaltet die Produktion identischer DNA-Helices aus einem doppelsträngigen DNA-Molekül.
  • Enzyme sind für die DNA-Replikation von entscheidender Bedeutung, da sie sehr wichtige Schritte im Prozess katalysieren.
  • Der gesamte DNA-Replikationsprozess ist sowohl für das Zellwachstum als auch für die Reproduktion in Organismen äußerst wichtig. Es ist auch wichtig für den Zellreparaturprozess.

DNA-Metabolismus: Synthese, Replikation und Abbau

A. Die Initiierung der DNA-Synthese erfordert ein Priming durch eine kurze RNA-Länge (10-200 Nukleotide lang).

B. Dieser Priming-Prozess beinhaltet den nukleophilen Angriff der 3′-Hydroxylgruppe des RNA-Primers auf das α-Phosphat des Desoxynukleosidtriphosphats unter Abspaltung von Pyrophosphat.

C. Die 3′-Hydroxylgruppe des kürzlich gebundenen Desoxyribonukleosidmonophosphats ist dann frei, um einen nukleophilen Angriff auf das nächste eintretende Desoxyribonukleosidtriphosphat an dessen α-Phosphateinheit unter Abspaltung von Pyrophosphat durchzuführen.

D. Die Auswahl des richtigen Desoxyribonukleotids hängt von der richtigen Paarung mit dem anderen Strang (Templat) des DNA-Moleküls ab.

e. Das Templat bestimmt, in welchem ​​dNTP komplementär ist und hält dies durch Hydro­gen-Bindung.

F. Die Polymerisation von Desoxyribonukleotiden erfolgt nach einem solchen Verfahren in einer diskontinuierlichen Phase von etwa 100 Nukleotiden Länge.

g. Dieser neu synthetisierte DNA-Strang an einem RNA-Primer wird als Okazaki-Fragmente bezeichnet.

h. Wenn viele Okazaki-Fragmente erzeugt werden, beginnt der Replikationskomplex, die RNA-Primer durch DNA-Polymer&Shyase I zu entfernen, und die durch ihre Entfernung verbleibenden Lücken werden durch geeignete Basenpaar-Desoxynukleotide aufgefüllt. Das Enzym DNA-Ligase versiegelt die Fragmente der neu synthetisierten DNA.

2. Replikation von DNA:

A. Durch das Aufwickeln der DNA-Doppelhelix fungiert jeder Strang als Matrize für die Bildung eines neuen Strangs. Dieser Vorgang wird als Replikation bezeichnet.

B. Replikationsarten:

(i) Konservative Replikation:

Der Eltern-Shytal-Strang wird nie vollständig getrennt. Nach einer Replikationsrunde enthält ein Tochterduplex also nur Elternstränge und der andere nur Tochterstränge.

(ii) Semikonservative Replikation:

Der Vorgang des Entwindens der doppelhelikalen Tochtermoleküle, von denen jedes aus einem Elternstrang und einem neu synthetisierten Strang aus dem komplementären Strang besteht, wird als semikonservative Repylierung bezeichnet.

B. Replikationsprozess:

(i) Initiierung der DNA-Replikation:

(1) Die Replikation beginnt an einem bestimmten Startpunkt und dies ist eine einzigartige Abfolge von Basen, die Ori genannt wird.

(2) In Ori gibt es zwei Serien von kurzen Wiederholungen, wie beispielsweise drei Wiederholungen einer 13-Basenpaar-Sequenz und vier Wiederholungen einer 9-Basenpaar-Sequenz.

(3) Im Initiationsvorgang binden etwa 20 DNA Ein Proteinmolekül mit jeweils einem gebundenen ATP an die vier Wiederholungen der 9-Basenpaar-Sequenz, DNA wird um den Komplex gewickelt (initial).

(4) Mit Hilfe von ATP und histonähnlichem Protein HU werden die drei 13 Basenpaare umfassenden Rehypeats denaturiert, um einen offenen Comhyplex zu ergeben.

(5) Mit Hilfe des DNA-C-Proteins ATP bindet das DNA-B-Protein an den offenen Komplex, um einen Vorbereitungskomplex zu bilden. Als Ergebnis findet ein Abwickeln der DNA statt und die Priming-Replikation beginnt.

Im Elongationsprozess der Replikation kommen zwei Operationen wie die Leading-Strang-Synthese und die Lagging-Strand-Synthese vor.

(1) Leitstrangsynthese:

(a) Die Leitstrangsynthese beginnt mit der Synthese des RNA-Primers (10 bis 60 Nukleotide) durch das Dna-G-Protein am Replikationsursprung.

(b) Zu diesem Primer werden dann Desoxyribonukleotide durch DNA-Polymerase III hinzugefügt (sie hält mit der Replikationsgabel Schritt).

(c) SSB-Moleküle helfen, den abgetrennten Strang zu stabilisieren.

(d) Helicasen trennen die beiden DNA-Stränge an der Gabelung.

(e) Topoisomerase II (DNA-Gyrase) wirkt, um den durch Helikasen erzeugten Stress abzubauen.

(f) Dieser führende Strang wird kontinuierlich in Richtung 5′ zu 3′ repliziert.

(2) Synthese von verzögerten Strängen:

(a) Der nachlaufende Strang wird diskontinuierlich repliziert und muss in kurzen Fragmenten (Okazaki-Fragmenten) kompiliert werden, die in entgegengesetzter Richtung zur Gabelbewegung synthetisiert werden.

(b) Synthese von Okazaki-Fragmenten:

Der Multi-Protein-Primosom-Komplex reist in die gleiche Richtung wie die Replikationsgabel.

In Intervallen synthetisiert das DNA-G-Protein einen RNA-Primer für ein neues Okazaki-Fragment. Die Synthese verläuft in entgegengesetzter Richtung zur Gabelbewegung. Jeder Primer wird durch DNA-Polymerase III verlängert.

(c) Wenn das neue Okazaki-Fragment vollständig ist, wird der RNA-Primer durch DNA-Polymerase I neu verschoben. Der verbleibende Nick (eine Phosphodiester-Bindung gebrochen, um ein freies 3′ OH und 5′ Phosphat zu hinterlassen) wird durch DNA-Ligase versiegelt.

Über diesen Prozess ist nur sehr wenig bekannt, es wird angenommen, dass DNA-Topoisomerase IV für die endgültige Trennung der beiden abgeschlossenen zirkulären DNA-Moleküle notwendig zu sein scheint.

3. Abbau von DNA:

DNA-Schäden können in 4 Formen eingeteilt werden:

(a) Einzelbasis-Änderung:

Der eine Grundschaden beinhaltet die Hydratation des Cytosinrestes durch ultraviolette Bestrahlung.

(b) Zwei-Basis-Änderung:

Die zwei Basenschäden umfassen die Thymin-Thymin-Dimer-Bildung über eine Cyclobutan-Einheit.

Kettenbrüche können durch Bestrahlung, wie beispielsweise Röntgenbestrahlung, erzeugt werden.

Vernetzungsmittel, die Basen von gegenüberliegenden Strängen verbinden, induzieren auch 2-Basen-Änderungen. Zwischen dem DNA-Molekül und Histonen können auch Cross&Shylinks auftreten.

4. Der DNA-Polymerase-Komplex:

A. Die verschiedenen DNA-Polymerase-Moleküle beteiligen sich an der DNA-Replikation.

Diese sind in drei wichtige Eigenschaften eingebunden:

B. Die Kettenverlängerung zeigt die Geschwindigkeit, mit der die Polymerisation stattfindet. Die Prozessivität ist ein Ausdruck der Anzahl von Nukleotiden, die der entstehenden Kette hinzugefügt werden, bevor sich die Polymerase von der Matrize löst. Die Korrekturlesefunktion erkennt Kopierfehler und korrigiert diese.

C. InE. Coli, Polymerase 111 (Pol 111) funktio- niert an der Replikationsgabel. Es katalysiert die höchste Kettenverlängerungsrate und ist am prozessivsten. Es ist in der Lage, 0,5 Mb DNA während eines Zyklus am Leitstrang zu po­lymerisieren. Es ist das Produkt des DNA-E-Gens in E. Coli.

D. Polymerase 11 (Pol 11) wird hauptsächlich mit Korrekturlesen und DNA-Reparatur beschäftigt.

e. Polymerase 1 (Pol 1) vervollständigt die Kettensynthese zwischen Okazaki-Fragmenten auf dem nacheilenden Strang.

F. In Säugerzellen kann die Polymerase etwa 100 Nukleotide pro Sekunde polymerisieren. Diese reduzierte Rate ist das Ergebnis einer Interferenz durch Nukleosomen.

5. Enzyme reparieren beschädigte DNA:

A. Es wurde gefolgert, dass überlebende Spezies die Mechanismen zur Reparatur von DNA-Schäden besitzen, die als Folge von Replikationsfehlern oder Umwelteinflüssen verursacht wurden.

B. Die Replikation hängt von der spezifischen Paarung und Abspaltung von Nukleotidbasen ab. Die richtige Paarung hängt von der Anwesenheit der bevorzugten Tautomeren der Purin- und Pyrimidinnukleotide ab. Die richtige Basenpaarung kann durch zweimaliges Überwachen der Basenpaarung sichergestellt werden.

Eine solche doppelte Überwachung tritt sowohl in bakteriellen als auch in Säugetiersystemen auf. Diese doppelte Überwachung erzeugt keine Fehlpaarungsfehler aufgrund des Vorhandenseins der nicht bevorzugten Tautomeren.

C. Replikationsfehler führen zur Anhäufung von Mutationen.

D. DNA-Schäden werden durch Fehlpaarungsreparatur, Basenexzisionsreparatur, Nukleotidexzisionsreparatur und Doppelstrangbruchreparatur ersetzt. Der Defekt in einem Strang kann in seine ursprüngliche Form zurückgeführt werden, indem man sich auf die komplementären Informationen verlässt, die im nicht betroffenen Strang gespeichert sind.

Einige Reparaturenzyme sind multifunktional:

ich. Einige Reparaturenzyme werden als Bestandteile des großen TF11H-Komplexes gefunden, der eine zentrale Rolle bei der Gentranskription spielt. Eine weitere Komponente von TF11H ist an der Zellzyklusregulation beteiligt. Einige Reparaturenzyme sind an der normalerweise vorkommenden Genumlagerung beteiligt.

ii. Bei Patienten mit Ataxie-Teleangiektasie, einer beim Menschen autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung, besteht eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Röntgenschäden. Patienten mit Fanconi-Anämie haben eine fehlerhafte Reparatur von Vernetzungs- und Scheuerschäden.

iii. Alle diese klinischen Syndrome sind mit einer erhöhten Krebshäufigkeit verbunden.


Einführung

Die zelluläre DNA wird ständig durch endogene und exogene Faktoren verändert, was täglich zu Zehntausenden von Läsionen in einer menschlichen Zelle führt (Lindahl, 1993). Diese Schäden können je nach Größe in zwei Typen eingeteilt werden: nicht sperrige DNA und sperrige DNA. Nicht sperrige DNA-Läsionen umfassen Basenfehlpaarungen, abasische Stellen und kleine Basenmodifikationen, die im Allgemeinen durch Fehlpaarungsreparatur (MMR), Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidinzisionsreparatur (NIR), direkte Umkehrreparatur (DRR) repariert werden. und Transläsions-DNA-Synthese (TLS) (Gros et al., 2004 Fortini und Dogliotti, 2007 Sharma et al., 2013 Yi und He, 2013 Ignatov et al., 2017). Sperrige DNA-Läsionen umfassen unter anderem: Doppelstrangbrüche, DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und intra- und inter-strang DNA-Crosslinks. Die strukturelle Komplexität bestimmter sperriger DNA-Läsionen erfordert die Verwendung mehrerer koordiniert wirkender DNA-Reparaturwege, darunter homologe Rekombination (HR), nicht-homologe DNA-Endverbindung (NHEJ), Nukleotidexzisionsreparatur (NER), TLS und BER Fanconi-Anämie (FA)-Signalsystem und komplexe proteolytische Maschinerie (Ishchenko et al., 2006 Ho und Schärer, 2010 Duxin et al., 2014 Tretyakova et al., 2015 Martin et al., 2017). Nicht sperrige DNA-Läsionen verursachen begrenzte und lokale DNA-Störungen, während sperrige Läsionen signifikante Verzerrungen in der gesamten DNA-Helixstruktur induzieren (Ide et al., 2011). DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) entstehen, wenn ein Protein kovalent an DNA bindet (Tretyakova et al., 2015). Sie sind aufgrund ihres extrem sperrigen Charakters im Vergleich zu bekannten voluminösen, helixverzerrenden DNA-Läsionen, wie UV-induzierten Pyrimidin-Dimeren, schwer zu reparieren. Diese super-sperrigen Addukte können durch Exposition von Zellen gegenüber endogenen und exogenen Vernetzungsmitteln erzeugt werden (Stingele et al., 2017 Zhang et al., 2020). Das kovalent an DNA gebundene Protein stört stark die DNA-Replikation, Transkription, Reparatur und Chromatin-Remodellierung (Kuo et al., 2007 Klages-Mundt und Li, 2017 Yudkina et al., 2018 Ji et al., 2019). DPCs können je nach Art der kovalenten Verknüpfung im DNA-Protein-Komplex und dem Vorhandensein von DNA-Strangbrüchen in fünf Typen eingeteilt werden (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). Typ 1, der häufigste DPC-Typ, wird gebildet, wenn Proteine ​​kovalent an eine stickstoffhaltige Base in ungestörter DNA binden. Quervernetzungen vom Typ 2-4 treten auf, wenn DNA-spaltende Enzyme in einem kovalenten Zwischenprodukt mit einem DNA-Strang gefangen werden (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). Typ 2 wird gebildet, wenn bifunktionelle DNA-Glykosylasen und Reparaturenzyme mit β-Lyase-Aktivität wie DNA-Polymerase β und Parp1 irreversibel an eine gespaltene Apurin-/Apyrimidin-(AP)-Stelle binden (Ide et al., 2015, 2018 Nakanoet al., 2017). Typ 3 wird während der abgebrochenen DNA-Strangspaltung durch die Topoisomerase 1 (Top1) und die Bildung einer kovalenten Tyrosinylphosphodiester-Bindung zwischen dem Protein und der 3′-terminalen DNA-Phosphateinheit von SSB gebildet (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). Die abortive Wirkung der Topoisomerase 2 (Top2) erzeugt Typ-4-DPC, in dem Tyrosin an die 5′-terminalen Phosphate von Doppelstrangbrüchen (DSB) gebunden ist (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017 ). Kürzlich entstand nach der Entdeckung von HMCES, einem 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC)-bindenden Protein, ein neuer DPC-Typ, der abasische Stellen in einzelsträngiger DNA (ssDNA) erkennen und eine kovalente ssDNA-HMCES-Vernetzung bilden kann, um eine fehleranfällige Transläsionssynthese zu verhindern hinter der Läsion (Mohni et al., 2019). Aufgrund der Unterschiede in Struktur und Zusammensetzung zwischen diesen fünf Gruppen wird jede Art von DPC durch einen eigenen Reparaturmechanismus verarbeitet. Es scheint schwierig zu sein, sehr sperrige Typ-1-DPC in den kanonischen linearen DNA-Exzisionsreparaturwegen zu entfernen, da das Vorhandensein eines Proteinmoleküls den Zugang zur DNA blockiert. Dennoch haben neuere Studien gezeigt, dass Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und homologe Rekombination (HR) bestimmte Arten von DPCs nukleaseabhängig entfernen können (Zhang et al., 2020). Es ist jedoch noch nicht klar, ob diese Reparaturwege mit anderen Arten von DPC umgehen könnten. Stingeleet al. (2017) haben vorgeschlagen, dass jeder Bestandteil von DPC: DNA, Protein und die kovalente Verknüpfung zwischen ihnen durch drei verschiedene Reparaturmechanismen verarbeitet werden könnte. Ein kürzlich erschienenes Papier von Kühbacher und Duxin (2020) bietet einen umfassenden Überblick über die Bildung und Reparatur von DPCs. In diesem Review fassen wir das aktuelle Wissen über die Reparaturmechanismen zusammen, die an der Entfernung von DHCs beteiligt sind, die durch verschiedene genotoxische Wirkstoffe induziert werden. Kovalente Quervernetzung mit DNA tritt häufiger bei DNA-bindenden Proteinen auf, wie Histone, Transkriptionsfaktoren und DNA-metabolisierenden Enzymen, einschließlich Reparaturfaktoren und Topoisomerasen (Klages-Mundt und Li, 2017). Im Zellkern werden Histone zu einem Oktamer zusammengebaut, das den Nukleosomkern mit 147 bp DNA umwickelt und fest daran gebunden bildet (Luger et al., 1997, 2012). Diese grundlegende Chromatinstruktur macht Histone zu primären Zielen von DNA-Vernetzungsmitteln, was zur Bildung von DNA-Histon-Vernetzungen (DHC) führt (Solomon und Varshavsky, 1985). Derzeit begannen sich die Reparaturmechanismen, die durch verschiedene Faktoren erzeugten DHCs entgegenwirken, erst zu enträtseln.

DNA-Histon-Cross-Links (DHCs)

Nukleosomale DNA wird in kompakte Einheiten verpackt, die als Chromosomen bezeichnet werden, in denen Kernnukleosomenpartikel durch Abschnitte von Linker-DNA mit einer Länge von bis zu 80 bp verbunden sind. Ein Nukleosom-Kernpartikel (NCP) besteht aus jeweils zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4. Das Molekulargewicht einzelner Histone reicht von 11 bis 22 KDa, während das Molekulargewicht von Histonoctamer in NCP 210 KDa beträgt (Eickbush und Moudrianakis, 1978 Luger et al., 1997). Die Stabilität des Nukleosoms basiert auf verschiedenen Protein-Protein-Wechselwirkungen und zahlreichen nicht-kovalenten elektrostatischen und Wasserstoffbrücken zwischen Histone und dem DNA-Duplex (Luger et al., 1997, 2012 Davey et al., 2002 Rohs et al., 2009 ). Die Primärstruktur des Chromatins lässt sich als Bead-on-a-String-Organisation einzelner Nukleosomen darstellen, die mit Hilfe von Histonvarianten in bestimmten Nukleosomen und posttranslationalen Modifikationen zu kompakten Sekundär- und Tertiärstrukturen weiter gefaltet werden können ( PTMs), die sich in ungeordneten Histonschwänzen befinden (Woodcock und Dimitrov, 2001, Luger et al., 2012). Die Faltung von Chromatin in Primär-, Sekundär- und Tertiärstrukturen ist entscheidend für die Regulierung der Zugänglichkeit der DNA zu komplexen Multiprotein-Maschinen, die an der DNA-Replikation, Transkription und Reparatur beteiligt sind. Nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen DNA und Histone ermöglichen es der Chromatindynamik, zwischen der geschlossenen und der offenen Konformation zu wechseln.DHCs beeinträchtigen die Chromatinflexibilität, was sich anschließend auf Langstreckeninteraktionen im Chromatin auswirken kann, die indirekt die DNA-Replikation, Transkription und Reparatur innerhalb einer topologisch assoziierenden Domäne (TAD) stören würden (Hinz et al., 2010 Todd und Lippard, 2010 Tretyakova et al. , 2015 Hauer und Gasser, 2017 Nakano et al., 2017). DHCs gehören zum Typ 1, einer nicht-enzymatischen Form von DPC, bei der ein Protein kovalent an eine unzerstörte DNA gebunden ist (Ide et al., 2011). In letzter Zeit wurden mehrere umfassende Studien veröffentlicht, die die Mechanismen der DHC-Bildung beschreiben (Ming et al., 2017 Shang et al., 2019 Yang und Greenberg, 2019), jedoch ist nicht bekannt, ob es spezifische Reparaturmechanismen zur Entfernung von DHCs gibt . In diesem Aufsatz konzentrieren wir uns hauptsächlich auf die Reparaturwege von DHCs und beschreiben kurz ihre Bildung.

Bildung von DHCs

Ein wasserlöslicher kovalenter Komplex aus DNA und Histonen (H2A und H2B) wurde erstmals in einem UV-Crosslinking-Assay identifiziert (Smith, 1966, Sperling und Sperling, 1978). Mit dieser Erkenntnis wurde deutlich, dass neben bekannten Pyrimidindimeren auch DHCs durch UV-Bestrahlung induziert werden können. Es wurde dann entdeckt, dass auch exogene und endogene Aldehyde in Zellen DHCs bilden können (Lam et al., 1985, Kuykendall und Bogdanffy, 1992). Mehr als 10 % der Aminosäurereste in Histonen sind Lysine, während Aldehyde bevorzugt mit ε-Aminogruppen von Lysinseitenketten unter Bildung einer Schiffschen Base reagieren, die weiter mit exocyclischen Aminogruppen von Guanin, Adenin, und Cytosin-DNA-Basen, die eine Methylenbindung erzeugen. Viele Vernetzungsmittel wie Chromat, Metallionen und Cisplatin (cis-Diamindichloroplatinum-II), induzieren ebenfalls DHCs in Zellen (Zhitkovich und Costa, 1992). Platinverbindungen verursachen nicht nur DNA-DNA-Crosslinks, sondern verknüpfen auch DNA-Protein-Komplexe kovalent. Im Fall von Histonen (Abbildung 1A) vernetzen diese Verbindungen ε-Aminogruppen von Lysinen und N 7 -Atome von Guanosinen (Tretyakova et al., 2015 Ming et al., 2017). Querverbindungen zwischen DNA und Methioninresten wurden auch in einer Röntgenstruktur von mit Platinverbindungen behandelten Nukleosomen beobachtet (Wu et al., 2008). Die Exposition von gereinigten Nukleosomen gegenüber bifunktionellen Alkylierungsmitteln (z. B. Stickstoffsenf) vernetzt auch Histone mit Guanosinen in der DNA (Shang et al., 2019). -Verbindungen mit Cysteinen und Histidinen von Nicht-Histon-Proteinen (Loeber et al., 2009).

Abbildung 1. Mechanismen der Bildung von Histon-DNA-Crosslinks. (EIN) Reaktionsmechanismen von DNA-Vernetzungsmitteln. (B) Direkte Vernetzung von Histonen mit modifizierten DNA-Basen. (C) Abbasische Stelle vermittelte Quervernetzung von Histonen mit DNA. NCP-NH2: n-terminales Amin (Lysin) der Histone im Nukleosomkern.

Histone können auch direkt mit 5-Formylcytosin, einer natürlich vorkommenden modifizierten DNA-Base, und 8-Oxoguanin, einem wichtigen oxidativen DNA-Schadensprodukt, reagieren. Lysin-Aminogruppen reagieren mit 5-Formylcytosin (Abbildung 1B) unter Bildung einer reversiblen Schiff-Base (Li et al., 2017 Raiber et al., 2018). Die Reaktion von Lysin-Seitenketten mit 8-Oxoguanosin erzeugte ein stabiles proteinvernetztes Spiroiminodihydantoin (Sp)-Addukt (Xu et al., 2008).

Schließlich werden die meisten DHCs durch eine Reaktion zwischen Histon-Lysinen und einer Aldehydform der 2′-Desoxyribose an apurin/apyrimidinischen (AP)-Stellen (Abbildung 1C) produziert, die entweder direkt bei Beschädigung gebildet werden oder während der Entfernung beschädigter Basen im Reparaturweg der Basenexzision (Solomon und Varshavsky, 1985, Sczepanski et al., 2010). Die resultierende Schiff-Base unterliegt häufig einer strangbrechenden ß-Eliminierung, gefolgt von einer Umkehrung einer Histon-DNA-Vernetzung. Da Histon unverändert aus der Reaktion hervorgeht, wird der gesamte Prozess manchmal als histonkatalysierte Strangspaltung an AP-Stellen bezeichnet (Ren et al., 2019). Es sollte beachtet werden, dass Histon-PTMs und der Chromatinzustand einen signifikanten Einfluss auf die DHC-Bildung an abasischen Stellen und mit DNA-Basen haben könnten (Sczepanski et al., 2010 Bowman und Poirier, 2015).

Mechanismen der Reparatur von DHC

Obwohl DPCs, insbesondere DHCs, häufig in Zellen vorkommen und eine ständige Bedrohung der Genomstabilität darstellen, wird angenommen, dass es mit Ausnahme von Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterasen keinen spezialisierten DNA-Reparaturweg gibt, der diesen extrem sperrigen Herausforderungen gerecht wird. Stattdessen setzt die Zelle mehrere unterschiedliche DNA-Reparatur- und Proteinabbaumechanismen ein, um auf vernetzte DNA und Protein-/Histonkomponenten in einem bestimmten DPC/DHC abzuzielen. Das kovalent gebundene Protein konnte durch die proteolytische Maschinerie der Zelle, wie die spezialisierten Proteasen SPRTN/Wss1, Ddi1 und GCNA1, oder durch das Proteasom, einen ATP-abhängigen Proteasekomplex mit mehreren Untereinheiten, nachgewiesen und zu einem kleinen Peptid abgebaut werden, während die beschädigte DNA Komponente wird in den NER-, BER-, HR-, NHEJ- und FA-Pfad erkannt und repariert.

Proteasom-abhängige Proteolyse von mit DNA vernetzten Histonen

Die Proteasom-vermittelte Proteolyse ist der Hauptweg für den Abbau beschädigter Proteine ​​in einer Zelle. Ein 26S-Proteasom besteht aus einem zylindrischen 20S-Kernpartikel und einem oder zwei 19S-Regulationspartikeln (Ciechanover, 1998, Lecker et al., 2006). Obwohl der 20S-Kern an verschiedene regulatorische Partikel binden kann, verleiht nur das 19S-Partikel die Fähigkeit, ubiquitylierte Proteine ​​abzubauen (Coux et al., 1996 Adams, 2004 Stadtmüller und Hill, 2011). Angesichts der entscheidenden Rolle des Proteasoms beim Abbau von beschädigtem Protein bleibt die Beteiligung von Proteasom und Ubiquitin an der Proteolyse von DHCs oder DPCs ein Diskussionsthema. Hemmung des Proteasoms in Xenopus Eiextrakte stabilisierten die DPCs nicht (Nakano et al., 2007 Duxin et al., 2014). Viele Studien zur Reparatur von DPCs in Säugerzellen deuten jedoch auf eine Beteiligung von Proteasomen hin (Adams, 2004 Baker et al., 2007 Zecevic et al., 2010 Larsen et al., 2019). Die Beteiligung von Proteasomen an der DHC-Entfernung tauchte zum ersten Mal in der Forschung von Quievryn und Zhitkovich (2000) auf, die entdeckten, dass Proteasom-Inhibitoren die Entfernung von DHCs verhindern und menschliche Zellen für niedrigere Formaldehydspiegel sensibilisieren. Eine Studie in Xenopus Eiextrakte fanden heraus, dass DPCs durch die TRAIP E3-Ubiquitin-Ligase ubiquityliert und anschließend vom Proteasom abgebaut werden (Duxin et al., 2014 Larsen et al., 2019). Eine frühere Studie zeigte jedoch deutlich, dass DPCs nicht mit Polyubiquitinketten markiert sind, aber dennoch einem proteasomalen Abbau durch einen nicht gut verstandenen Mechanismus unterliegen (Nakano et al., 2009). Das 26S-Proteasom kann gereinigte nicht-ubiquitylierte Histone abbauen (Kisselev et al., 2006), was die Möglichkeit eines proteasomalen Abbaus nicht-ubiquitylierter beschädigter Histone in Zellen erhöht. Einige Studien haben gezeigt, dass während des durch genotoxische Agenzien induzierten Replikationsstresses Histone hyperacetyliert und dann spezifisch auf Ubiquitin-unabhängige Weise durch einen Komplex aus 20S-Proteasom mit PA200-Proteasom-Aktivator, einem bestimmten regulatorischen Partikel, abgebaut werden (Qian et al., 2013 Mandemaker et al., 2018). Obwohl diese Studien gezeigt haben, dass der Ubiquitin-unabhängige Abbau acetylierter Histone den Replikationsstress lindert, kann die zusätzliche Funktion des PA200-20S-Proteasoms bei der DHC-Reparatur nicht ausgeschlossen werden. Darüber hinaus wurde PA200 in nuklearen Speckles nachgewiesen, und seine Rolle bei der DNA-Reparatur wurde vorgeschlagen (Ustrell et al., 2002). Daher erfordert ein detaillierteres Verständnis der Rolle des Proteasoms bei der DHC-Reparatur weitere Untersuchungen.

Das 20S-Proteasom ist ein hohles, tonnenförmiges Partikel, das aus 28 nicht identischen Untereinheiten besteht, die in vier gestapelten Ringen angeordnet sind. Die aktiven Zentren sind in einem internen Hohlraum eingeschlossen, der durch einen gesteuerten Kanal von den regulatorischen 19S- und PA200-Komplexen getrennt ist. Dieser 13Å-Kanal ist zu eng, als dass ein gefaltetes Protein eindringen könnte (Löwe et al., 1995 Groll et al., 1997). Für den vollständigen Abbau eines DNA-vernetzten Proteins müsste das vernetzte DNA-Nukleotid selbst in die proteolytische Kammer eintreten und einen DNA-Strang hineinziehen. Die DNA-Komponente eines DPC könnte jedoch zu sperrig sein, um in den Kanal einzutreten. Daher kann das Proteasom nur einen Teil eines vernetzten Proteins entfernen und DHC in eine kleinere DNA-Peptid-Vernetzung umwandeln. Alternativ könnten herkömmliche Proteasen, bei denen sich ein aktives Zentrum in einem Spalt auf der Enzymoberfläche befindet, an der Exzision des Großteils der nicht vernetzten Polypeptidkette beteiligt sein, die dann von jeder dieser Proteasen abgebaut und durch das Proteasom.


Archaea haben normalerweise ein einzelnes kreisförmiges Chromosom, dessen Größe bis zu 5.751.492 Basenpaare betragen kann Methanosarcina acetivorans, das das größte bekannte archaische Genom aufweist. Ein Zehntel dieser Größe ist das winzige Genom von 490.885 Basenpaaren von Nanoarchaeum equitans, das das kleinste bekannte archaische Genom besitzt, das schätzungsweise nur 537 proteinkodierende Gene enthält. Kleinere unabhängige DNA-Stücke, sogenannte Plasmide, werden auch in Archaeen gefunden. Plasmide können zwischen Zellen durch physischen Kontakt übertragen werden, in einem Verfahren, das der bakteriellen Konjugation ähnlich sein kann.

Abbildung: Archaeen: Halobakterien-Cluster (Archaea)


Histon-Demethylasen als aufstrebende Akteure bei der Regulation der DNA-Replikation und Zellteilung

Neben der zentralen Rolle, die Histon-Lysin-Demethylasen bei der Genregulation, bei Entscheidungen über das Zellschicksal und bei der Reprogrammierung spielen, hat sich kürzlich herausgestellt, dass diese Enzyme auch an grundlegenden molekularen Prozessen beteiligt sind, die die DNA-Replikation, die Zellzyklusdynamik und die Zellteilung unterstützen (Abb. 3) .

Abbildung 3. Histon-Demethylierung ist ein integrierter Bestandteil des Zellzyklus

Bildung von Ursprüngen und DNA-Replikation

Die Initiierung der DNA-Replikation und das Kopieren genetischer Informationen ist ein stark regulierter und genau kontrollierter Prozess. Das Einrichten der richtigen Chromatinumgebung ist für die richtige Bildung von Replikationsstartpunkten und die Replikation selbst wesentlich 168 169 170 . Interessanterweise haben neuere Studien Histon-Demethylasen mit mehreren Aspekten der DNA-Replikation in Verbindung gebracht. Zum Beispiel scheint die H3K4me3-Demethylase KDM5C eine wichtige Rolle bei der Bildung von Ursprüngen und der Initiierung der Replikation an aktiv transkribierten, früh replizierenden Genen zu spielen 171 . Dies beruht auf einer erhöhten Expression von KDM5C während der frühen S-Phase, in der es dazu dient, H3K4me3 aktiv von Replikationsstartpunkten zu entfernen, die Bildung des Präinitiationskomplexes zu fördern und die Besetzung von PCNA zu fördern. In Abwesenheit von KDM5C oder seiner Demethylaseaktivität verbleibt H3K4me3 an diesen Stellen und frühe Ursprünge können die Replikation nicht effizient initiieren, was zu einem Zellzyklusarrest führt 171 172 . Es ist immer noch unklar, wie die Entfernung von H3K4me3 an diesem Prozess beteiligt ist, jedoch ist bekannt, dass mehrere Proteine ​​im Ursprung des Replikationskomplexes Chromatin-Reader-Domänen kodieren 173 . Möglicherweise reagieren Komponenten des Replikationsursprungskomplexes oder andere replikationsassoziierte Faktoren auf den Modifikationszustand von H3K4.

Sobald die Replikation gestartet wurde, wird der Prozess der laufenden Replikation auch durch die Aktivität von Histon-Demethylasen reguliert. Die Spiegel der H3K9me3-Demethylase KDM4A/JMJD2A/JHDM3A sind in der S-Phase erhöht, gleichzeitig mit dem Verlust von H3K9me3 und einem Anstieg von H3K9me1/2 während der Replikation 174 175 . H3K9me3 in Chromatin wird normalerweise durch das Chromodomäne-enthaltende Protein HP1γ gebunden, das zur Bildung kondensierter heterochromatischer Strukturen beiträgt 176 . Während der S-Phase wirkt die KDM4A-Demethylase-Aktivität der HP1γ-Bindung an heterochromatischen Regionen entgegen, wodurch leichter zugängliches Chromatin erzeugt wird, das für die Passage der DNA-Replikationsmaschinerie erforderlich ist 174 . Dieses System scheint durch den Zellzyklus durch die Regulierung des KDM4A-Proteinspiegels, der für ein genaues Replikationstiming erforderlich ist, streng kontrolliert zu werden 83 174 . KDM4A-abhängige Effekte auf die DNA-Replikation werden in Säugerzellen und dem Modellorganismus beobachtet C. elegans, was darauf hindeutet , dass dies eine evolutionär konservierte Funktion des Enzyms 174 ist . In Übereinstimmung mit einer Rolle der KDM4A-Aktivität bei der Kontrolle der DNA-Replikation führt die Überexpression von KDM4A in einer Demethylase-abhängigen Weise zu genomischer Instabilität, indem sie die Re-Replikation und den ortsspezifischen Kopiengewinn in genomischen Regionen antreibt, die mit Krebs in Verbindung gebracht werden 177 .

Wenn wir beginnen, mehr über die Funktion der Histon-Demethylasen zu verstehen, scheint es wahrscheinlich, dass sie weiter verbreitete, konservierte und sogar kooptierte Funktionen bei der Regulation der DNA-Replikation haben. Dies wird durch Beobachtungen in S. pombe was zeigt, dass KDM1A und KDM1B zu einer programmierten Replikationsgabelpause beitragen, die das Prägen und das Wechseln vom Paarungstyp fördert 178 . Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass Histon-Demethylasen wahrscheinlich eine unterschätzte Rolle bei der Regulierung der Prozesse spielen, die die genaue Replikation des Genoms initiieren und regulieren.

Zellzyklusübergänge und organisierende Chromosomen

Die Kontrolle des Timings und der Dynamik des Zellzyklus ist für eine ordnungsgemäße Zellteilung wesentlich und neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Histon-Demethylasen mehrere verschiedene Rollen bei der Kontrolle der normalen Zellteilung spielen ( 3 ). Dies wird insbesondere durch ihre Fähigkeit erreicht, die Expression von Genen, die für die normale Zellzyklusprogression erforderlich sind, direkt zu regulieren 72 81 179 180 181 182 . Dies wird durch die Demethylase KDM7B veranschaulicht, die an die Promotoren mehrerer wichtiger Zellzyklusregulatoren, einschließlich E2F1-Zielgenen, bindet und für ihre transkriptionelle Aktivierung durch Entfernen des repressiven H3K9me1/2 und H4K20me1 erforderlich ist 179 . Entsprechend dieser Rolle werden KDM7B-Proteinspiegel und seine Bindung an Chromatin während des Zellzyklus stark reguliert, und dies scheint eine wichtige Rolle bei den G1/S- und G2/M-Übergängen zu spielen 81 179 180 . In ähnlicher Weise reguliert KDM1A positiv die Expression von MAD2 und BUBR1, die Teil des mitotischen Checkpoint-Komplexes sind und für die richtige Chromosomensegregation während der Mitose erforderlich sind 181 . Die transkriptionelle Regulierung durch Histon-Demethylasen gewährleistet auch die genomische Stabilität während der Zellteilung 183 184 185 möglicherweise durch Entfernen von Modifikationen, die mit transkriptionell permissiven Chromatinzuständen während der Mitose verbunden sind 184 186 . KDM8/JMJD5 ist beispielsweise an der Repression der Transkription in nicht-kodierenden Satelliten-Repeat-Regionen beteiligt, möglicherweise durch Entfernung von H3K36me2. In Abwesenheit von KDM8-Aktivität führt ein erhöhter H3K36me zu einer fehlerhaften Spindelbildung und verursacht eine abnormale Zellteilung und genomische Instabilität 184 . Der Mechanismus, durch den KDM8 H3K36me reguliert, bleibt jedoch umstritten, da andere Studien die Histon-Demethylase-Aktivität für KDM8 nicht beobachten konnten und stattdessen nahelegen, dass KDM8 als Proteinhydroxylase wirken könnte 187 188 189 .

Interessanterweise können Histon-Demethylasen während Zellzyklusübergängen auch unabhängig von ihren Auswirkungen auf die Gentranskription funktionieren. Wenn Zellen in die Prophase der Mitose eintreten, müssen sie H4K20me1 auf Chromatin ablagern, um Condensin II zu beladen, einen Strukturproteinkomplex, der für die Chromosomenkondensation erforderlich ist 179 190 . Da chromatingebundenes KDM7B normalerweise H4K20me1 demethylieren würde, ist seine Entfernung vom Chromatin erforderlich, um H4K20me1 zu stabilisieren und diesen Übergang zu fördern. Dies erreicht die Zelle durch eine CDK1/Cyclin B-abhängige Phosphorylierung von KDM7B, die dann in der Prophase zur Dissoziation von KDM7B vom Chromatin führt 179 . Obwohl dieses dynamische Engagement zwischen KDM7B und Chromatin seinen Funktionen während des Zellzyklus entspricht, scheinen andere Histon-Demethylasen die normale Chromosomensegregation durch alternative Mechanismen zu unterstützen. KDM4C/JMJD2C/JHDM3C bleibt während der Mitose mit Chromosomen assoziiert und soll niedrige H3K9me-Spiegel aufrechterhalten und die Chromosomensegregation regulieren 183 . Die Deletion von KDM4C in der Maus scheint jedoch die Entwicklung, Physiologie oder Reproduktion nicht offen zu beeinflussen, was darauf hindeutet, dass einige der in Zellkulturen beobachteten Wirkungen möglicherweise nicht vollständig eine wesentliche Anforderung widerspiegeln in vivo 191. Für die Zukunft ist ein besseres Verständnis der Beteiligung von Histon-Demethylasen am Fortschreiten des Zellzyklus und der Zellteilung bei Tieren von entscheidender Bedeutung, da eine Fehlregulation dieser Enzyme eine Rolle bei der Proliferation und Zellteilung bei Krebs zu spielen scheint.


Eine Punktmutation ist ein Single-Letter-Swap – ein Austausch zweier Basen, beispielsweise Adenin zu Cytosin, an einer einzigen Stelle im DNA-Molekül. Da die Buchstabenfolge in einem Gen die Aminosäuresequenz in dem von ihm kodierten Protein bestimmt, kann eine Punktmutation die Aminosäuresequenz des resultierenden Proteins verändern. Manchmal kann eine Änderung der Aminosäuresequenz des Proteins dramatische Folgen haben. Zum Beispiel tritt die Sichelzellenanämie auf, wenn eine einzelne Punktmutation im Gen, das das Hämoglobinmolekül kodiert, zu deformierten roten Blutkörperchen führt.

Manchmal können Kopierfehler zusätzliche Buchstaben des genetischen Codes einfügen oder löschen. Da diese Insertionen und Deletionen, Indels genannt, das vom Gen produzierte Protein viel kürzer oder viel länger machen können, können diese Fehler erhebliche Auswirkungen haben. Indels können einen dramatischen Einfluss auf die Struktur und Funktion des Proteins haben. Die Insertion oder Deletion eines einzelnen Buchstabens kann manchmal eine Frameshift-Mutation verursachen, bei der die gesamte Aminosäuresequenz des resultierenden Proteins verändert wird.


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Fazit und Ausblick

Ein Jahrzehnt nach der ersten Entdeckung der Histon-Lysin-Demethylasen hat sich unser Verständnis der Funktionsweise dieser faszinierenden Enzyme in Zellen immens rasant entwickelt. Während dieser Zeit hat uns das Aufkommen genomweiter Technologien ermöglicht, die Funktion dieser Enzyme auf Chromatin mit beispielloser Breite und Präzision zu untersuchen. Dies hat ein überraschend detailliertes Verständnis der grundlegenden Rollen ermöglicht, die diese Enzyme bei der Kontrolle der Genexpression, der Entscheidungen über das Zellschicksal während der Entwicklung und der Neuprogrammierung von Chromatinzuständen spielen. Darüber hinaus wurden neue Funktionen für Histon-Demethylasen als kritische Regulatoren anderer wichtiger zellulärer Prozesse, einschließlich der DNA-Replikation, der Zellzyklusdynamik und der Reparatur von DNA-Schäden, identifiziert, die eindeutig weitere Untersuchungen erfordern.

Angesichts ihrer Entdeckung als Histon-Demethylasen ist es vielleicht nicht überraschend, dass diese Enzyme und ihre zellulären Funktionen unter dem Deckmantel der Histon-Demethylierung untersucht wurden. Es wird jedoch zunehmend klar, dass diese Proteine ​​auch andere Hydroxylierungsreaktionen katalysieren, die sowohl protein- als auch nukleinsäurebasierte Prozesse regulieren. Eine klare Herausforderung für die Zukunft wird darin bestehen, die primären molekularen Determinanten zu verstehen, die den Phänotypen zugrunde liegen, die aus der Störung von Demethylaseenzymen resultieren. Hängt dies von der Histon-Demethylase-Aktivität, der Protein-Demethylase-Aktivität oder der Hydroxylierung anderer zellulärer Substrate ab? Werden diese Ergebnisse alternativ unabhängig von der enzymatischen Aktivität insgesamt getrieben? Die Beantwortung dieser wichtigen Fragen, insbesondere im Kontext von Entwicklungsübergängen, bei denen diese Proteine ​​von zentraler Bedeutung zu sein scheinen, wird unweigerlich auf die Entwicklung neuer Tiermodelle angewiesen sein, bei denen spezifische Aktivitäten unterbrochen werden können, um die molekularen Prinzipien zu untersuchen und zu definieren, die der Funktion zugrunde liegen dieser faszinierenden Proteine ​​in der normalen Biologie und letztendlich in der Krankheit.


MECHANISMUS DER CAF-1-VERMITTELTEN NUKLEOSOM-BAUGRUPPE

Tetrasomenbildung

Die Bildung des H3-H4-Tetramer-DNA-Komplexes, bekannt als Tetrasom, erfordert keine ATP-Hydrolyse, sondern wird stattdessen durch die hohe Affinität von (H3-H4) angetrieben2 Tetramere für DNA in einem von CAF-1 gesteuerten Mechanismus. Der Befund, dass CAF-1 an ein einzelnes H3-H4-Dimer bindet und kooperativ in längenabhängiger Weise an DNA bindet, legt einen Mechanismus für die Tetrasomenbildung nahe. Ergebnisse von zwei Gruppen legen nahe, dass der Ablagerungsschritt die Assoziation von zwei CAF-1•H3-H4-Komplexen erfordert, die sich auf der DNA zusammenlagern, gefolgt von der konzertierten Ablagerung eines H3-H4-Tetramers (Abbildung 3) ( 55, 58) .

Modell für die CAF-1-vermittelte Nukleosomenanordnung. In Abwesenheit von Histonen ist das C-terminale WHD aufgrund der Sequestrierung durch die ED-Domäne nicht zugänglich. ASF1 überträgt ein einzelnes H3-H4-Dimer auf CAF-1, was zur Freisetzung des WHD führt. Zwei CAF-1•H3-H4-Komplexe assoziieren in unmittelbarer Nähe zueinander, vermittelt durch PCNA-CAF-1- und DNA-CAF-1-Kontakte. Die vorübergehende Assoziation zweier CAF-1•H3-H4-Komplexe auf der DNA ermöglicht die Bildung von H3-H3-Kontakten und die beiden Histon-Chaperon-Komplexe lagern konzertiert einen (H3-H4) ab.2 Tetramer auf die DNA, bevor es von der DNA freigesetzt wird. Während des zweiten Aufbauschritts vermitteln H2A-H2B-Histon-Chaperone die H2A-H2B-Ablagerung auf dem bereits existierenden Tetramer unter Bildung vollständiger Nukleosomen. Details siehe Text.

Modell für die CAF-1-vermittelte Nukleosomenanordnung. In Abwesenheit von Histonen ist das C-terminale WHD aufgrund der Sequestrierung durch die ED-Domäne nicht zugänglich. ASF1 überträgt ein einzelnes H3-H4-Dimer auf CAF-1, was zur Freisetzung des WHD führt. Zwei CAF-1•H3-H4-Komplexe assoziieren in unmittelbarer Nähe zueinander, vermittelt durch PCNA-CAF-1- und DNA-CAF-1-Kontakte. Die vorübergehende Assoziation zweier CAF-1•H3-H4-Komplexe auf der DNA ermöglicht die Bildung von H3-H3-Kontakten und die beiden Histon-Chaperon-Komplexe lagern konzertiert einen (H3-H4) ab.2 Tetramer auf die DNA, bevor es von der DNA freigesetzt wird. Während des zweiten Aufbauschritts vermitteln H2A-H2B-Histon-Chaperone die H2A-H2B-Ablagerung auf dem bereits existierenden Tetramer unter Bildung vollständiger Nukleosomen. Details siehe Text.

Mithilfe von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge konnte das Labor von Luger Zwischenschritte im Mechanismus der CAF-1-vermittelten H3-H4-Ablagerung aufdecken. Vernetzungsstudien in Lösung zeigen, dass die Assoziation zweier CAF-1•H3-H4-Komplexe von der DNA-Bindungskapazität der großen Untereinheit abhängt ( 58). Die WHD spielt eine wichtige Rolle in dem Mechanismus, der die H3-H4-Abscheidung ermöglicht. In Abwesenheit der H3-H4-Fracht greift die positiv geladene DNA-bindende Oberfläche des WHD die saure ED-Domäne ein und hemmt so potenzielle WHD-DNA-Wechselwirkungen automatisch. Durch die Bindung von H3-H4 an die ED-Domäne wird diese Wechselwirkung destabilisiert und das WHD wird für die DNA-Beteiligung verfügbar. Da die WHD DNA kooperativ bindet, wird dadurch die nachfolgende Assoziation von zwei CAF-1•H3-H4-Komplexen stark verbessert, und Mutationen in der WHD, die die DNA-Bindung stören, verhindern die Dimerisierung von CAF-1•H3-H4-Komplexen ( 58 ). Die Tetramerisierung von H3-H4 erfordert die Wechselwirkung von H3-α3-Helices. Bemerkenswerterweise ermöglicht die Mutation der H3-α3-Tetramerisierungsschnittstelle immer noch die H3-H4-Wechselwirkung mit CAF-1 oder DNA, stört aber die konzertierte Ablagerung von H3-H4-Dimeren und die Tetrasomenanordnung ( 55, 58). Dieser Befund, zusammen mit Vernetzungsexperimenten, legt nahe, dass die beiden α3-Helices der H3-H4-Dimere vor der Abscheidung in unmittelbarer Nähe zueinander positioniert sind ( 58). Im letzten Schritt setzt CAF-1 die Histone frei, sobald sich ein Tetrasom erfolgreich gebildet hat.

Regulierte Dimerisierung von Histon-Chaperonen steuert die Nukleosomenanordnung

Die Histon-Chaperon-Dimerisierung ist wahrscheinlich ein Mittel, um den Oligomerisierungszustand von H3-H4 selbst zu kontrollieren: Vermutlich ist die Beibehaltung von H3-H4 als Dimer eine Reaktion auf die Notwendigkeit, die Histon-Tetramerisierungsreaktion während kritischer Aufgaben zu kontrollieren und einzuschränken. Während der DNA-Replikation beeinflusst der Zusammenbau von Chromatin die Geschwindigkeit, mit der die Replikationsgabel fortschreitet ( 13, 98–100). Schnelle Abscheidung von neuem (H3-H4)2 Tetramere ist daher entscheidend, um Replication Fork Stalling und genomische Instabilität zu verhindern. Die konzertierte DNA-vermittelte Assoziation von histongebundenem CAF-1 gewährleistet einen zeitnahen und kontrollierten Mechanismus und reduziert die Möglichkeit unproduktiver Interaktionen.

Thermodynamisch ist die freie Energie, die mit der H3-H4-Tetramerisierung auf DNA verbunden ist, die Summe von Teilreaktionen, die gegensätzlichen Energieaufwand aufweisen: Insgesamt muss die DNA mit hohem Energieaufwand erheblich verformt werden. Dem muss eine günstige Energie aus der Kontaktaufnahme zwischen H3-H4 und DNA, der Bildung des H3-H3-Vierhelix-Bündels und der hydrophoben Wirkung gegenübergestellt werden. Das Vorhandensein all dieser Faktoren wäre erforderlich, um den gesamten Montageweg mit der notwendigen freien Energie zu versorgen, um in einer geordneten Weise fortzufahren. Ähnlich wie ein Enzym fördert CAF-1 eine optimale Mikroumgebung, die die Bildung dieser Kontakte ermöglicht. Darüber hinaus könnten Histon-Tetramerisierung und konzertierte DNA-Ablagerung die Richtung der Reaktion bestimmen und erklären, warum Histon-Chaperone wie CAF-1 keine Nukleosomenzerlegungsreaktionen katalysieren – der Energieaufwand für die Tetrasomenaufspaltung und die DNA-Entwindung ist einfach zu hoch und kann nur mit mit Hilfe von ATP-abhängigen Remodelern oder Helikasen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ausnutzung der gerichteten DNA-Bindungsenergie von H3-H4 durch Histon-Chaperone den Mechanismus unterstützt, der sie unabhängig von der ATP-Hydrolyse macht und dennoch ein hohes Maß an Direktionalität für den H3-H4-Abscheidungsprozess bietet.

Regulation der CAF-1-Rekrutierung durch posttranslationale Modifikationen

Die Histonablagerung durch CAF-1 wird wahrscheinlich nicht nur durch andere Proteine ​​reguliert, sondern auch durch posttranslationale Modifikationen am Histon-Chaperon sowie an den Histonen. Während die Phosphorylierung die Rekrutierung von CAF-1 an die Replikationsgabel zellzyklusabhängig reguliert (siehe Einleitung) ( 40), haben posttranslationale Modifikationen der Histone das Potenzial, den Ablagerungsmechanismus direkt zu beeinflussen. In Hefe werden H3-H4-Dimere, die auf den Einbau an der Replikationsgabel gerichtet sind, durch die Acetyltransferase Rtt109 auf Lysin 56 von H3 (H3K56 ac) acetyliert. Diese Modifikation dient als eine der Markierungen für neu synthetisierte Histone ( 101, 102).Im Gegensatz dazu scheint die Acetylierung von H3K56 beim Menschen nur für den mit der DNA-Reparatur assoziierten Nukleosomenzusammenbau erforderlich zu sein, während Histone, die auf die Replikationsgabel gerichtet sind, wie bei Hefen durch das zytosolische HAT1 auf H4K5 und H4K12 (77, 103–108) und durch . acetyliert werden HAT4 auf H4K91 ( 109). Es wird angenommen, dass CAF-1 die H3K56 ac-Modifikation erkennt, basierend auf biochemischen Studien, die belegen, dass CAF-1 mit höherer Affinität an H3K56 ac -H4 bindet als an unmodifizierte Histone ( 101, 105) und XL-MS zeigt zahlreiche Quervernetzungen zwischen CAF-1 und die H 3 N-Helix, die K56 enthält ( 63). Die N-terminalen Schwänze beider Histone werden für den Nukleosomenaufbau durch CAF-1 nicht benötigt, obwohl sie in einem physiologischen Kontext für die Chromatinbildung essentiell sind (70, 77, 110). Daher ist nicht klar, ob und wie CAF-1 Modifikationen an H4 spezifisch erkennt, und zukünftige Arbeiten sollten sich damit befassen, wie Histonmodifikationen mechanistisch zur CAF-1-Funktion beitragen.

Mechanistische Implikationen für die Ausbreitung der Chromatinstruktur

Während der DNA-Replikation (H3-H4)2 Tetramere werden als intakte Einheiten von der Eltern-DNA zufällig auf einen der beiden Tochterstränge vermehrt (19, 111). Dieser Befund wirft Fragen nach einem möglichen Kopiermechanismus auf, um Chromatinmarkierungen auf neu abgelagerten Histonen wiederherzustellen, wenn sich das Templathiston nicht innerhalb desselben Nukleosoms befindet ( 112–115). Dabei übernehmen die Histon-Chaperone nicht nur den Aufbau von (H3–H4)2 Tetramere auf die neu synthetisierte DNA, könnte aber auch die anfängliche Tetrasomenbildung als Reaktion auf bestimmte Histonmodifikationen regulieren. Mögliche Chaperone, die beim Recycling solcher modifizierten H3-H4 eine Rolle spielen, sind MCM2 und ASF1, wie in der Einleitung beschrieben. Somit sind die hier skizzierten jüngsten Fortschritte mit einem Modell kompatibel, in dem CAF-1 als Akzeptor von modifizierten oder nativen H3-H4-Dimeren für das Histon-Recycling während der Replikation fungiert. Aufgrund des koordinierten Ablagerungsmechanismus könnten die biochemischen Eigenschaften von CAF-1 dazu beitragen, dass gleichzeitig übertragene Histondimere schnell wieder auf der DNA zusammengesetzt werden. In einem solchen Fall könnte CAF-1 eine Doppelrolle erfüllen, nämlich de novo Montage sowie Recycling von Eltern (H3-H4)2 Tetramere.


Wann findet die Histonsynthese in Bezug auf die DNA-Replikation statt? - Biologie

Elongation synthetisiert Prä-mRNA in einer Richtung von 5′ zu 3′ und die Termination erfolgt als Reaktion auf Terminationssequenzen und -signale.

Lernziele

Beschreiben Sie, was während der Transkriptionsverlängerung und -termination passiert

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • RNA-Polymerase II (RNAPII) transkribiert den Großteil der eukaryontischen Gene.
  • Während der Elongation muss die Transkriptionsmaschinerie jedes Mal, wenn sie auf ein Nukleosom trifft, Histone aus dem Weg räumen.
  • Die Transkriptionsverlängerung erfolgt in einer Blase ungewickelter DNA, in der die RNA-Polymerase einen DNA-Strang als Matrize verwendet, um die Synthese eines neuen RNA-Strangs in Richtung 5′ zu 3′ zu katalysieren.
  • RNA-Polymerase I und RNA-Polymerase III beenden die Transkription als Reaktion auf spezifische Terminationssequenzen entweder in der zu transkribierenden DNA (RNA-Polymerase I) oder in der neu synthetisierten RNA (RNA-Polymerase III).
  • RNA-Polymerase II beendet die Transkription an zufälligen Stellen nach dem Ende des zu transkribierenden Gens. Die neu synthetisierte RNA wird an einer sequenzspezifizierten Stelle gespalten und freigesetzt, bevor die Transkription endet.

Schlüsselbegriffe

  • Nukleosom: jede der Untereinheiten, die sich im Chromatin wiederholen, eine DNA-Windel, die einen Histonkern umgibt
  • histon: eines von verschiedenen einfachen wasserlöslichen Proteinen, die reich an den basischen Aminosäuren Lysin und Arginin sind und mit DNA in den Nukleosomen des eukaryontischen Chromatins komplexiert sind
  • Chromatin: ein Komplex aus DNA, RNA und Proteinen im Zellkern, aus dem Chromosomen während der Zellteilung kondensieren

Transkription durch Nukleosomen

Nach der Bildung des Präinitiationskomplexes wird die Polymerase von den anderen Transkriptionsfaktoren freigesetzt, und die Elongation wird mit der Polymerase, die RNA synthetisiert, in Richtung 5′-3′ fortschreiten gelassen. RNA-Polymerase II (RNAPII) transkribiert den Großteil der eukaryotischen Gene, daher wird sich dieser Abschnitt hauptsächlich darauf konzentrieren, wie diese spezifische Polymerase Elongation und Termination bewerkstelligt.

Obwohl der enzymatische Prozess der Elongation bei Eukaryonten und Prokaryonten im Wesentlichen gleich ist, ist die eukaryontische DNA-Matrize komplexer. Wenn sich eukaryotische Zellen nicht teilen, existieren ihre Gene als diffuse, aber immer noch umfangreich verpackte und verdichtete Masse von DNA und Proteinen, die als Chromatin bezeichnet werden. Die DNA wird in wiederholten Intervallen eng um geladene Histonproteine ​​gepackt. Diese DNA-Histon-Komplexe, zusammenfassend Nukleosomen genannt, sind regelmäßig beabstandet und umfassen 146 Nukleotide DNA, die zweimal um die acht Histone in einem Nukleosom gewunden ist, wie ein Faden um eine Spule.

Damit die Polynukleotidsynthese stattfinden kann, muss die Transkriptionsmaschinerie jedes Mal, wenn sie auf ein Nukleosom trifft, Histone aus dem Weg räumen. Dies wird durch ein spezielles Proteindimer namens FACT erreicht, das für “facilitates chromatintranscription steht.” FACT zerlegt teilweise das Nukleosom unmittelbar vor (stromaufwärts) einer transkribierenden RNA-Polymerase II, indem zwei der acht Histone (ein einzelnes Dimer) entfernt werden von H2A- und H2B-Histonen entfernt.) Dies lockert vermutlich die DNA, die um dieses Nukleosom gewickelt ist, ausreichend, so dass die RNA-Polymerase II hindurch transkribieren kann. FACT baut das Nukleosom hinter der RNA-Polymerase II wieder zusammen, indem es die fehlenden Histone dorthin zurückführt. Die RNA-Polymerase II verlängert die neu synthetisierte RNA weiter, bis die Transkription beendet ist.

Das FACT-Proteindimer ermöglicht es der RNA-Polymerase II, durch verpackte DNA zu transkribieren: DNA in Eukaryoten ist in Nukleosomen verpackt, die aus einem Oktomer von 4 verschiedenen Histonproteinen bestehen. Wenn DNA zweimal eng um ein Nukleosom gewunden ist, kann die RNA-Polymerase II nicht darauf zugreifen, um sie zu transkriptionieren. FACT entfernt zwei der Histone aus dem Nukleosom unmittelbar vor der RNA-Polymerase und lockert die Verpackung, damit die RNA-Polymerase II die Transkription fortsetzen kann. FACT baut auch das Nukleosom unmittelbar hinter der RNA-Polymerase wieder zusammen, indem es die fehlenden Histone zurückgibt.

Verlängerung

RNA Polymerase II ist ein Komplex aus 12 Proteinuntereinheiten. Spezifische Untereinheiten innerhalb des Proteins ermöglichen es der RNA-Polymerase II, als ihre eigene Helikase, Gleitklemme, einzelsträngiges DNA-bindendes Protein zu wirken sowie andere Funktionen auszuführen. Folglich benötigt die RNA-Polymerase II nicht so viele akzessorische Proteine, um die Synthese neuer RNA-Stränge während der Transkriptionselongation zu katalysieren, wie die DNA-Polymerase, um die Synthese neuer DNA-Stränge während der Replikationselongation zu katalysieren.

Die RNA-Polymerase II benötigt jedoch eine große Sammlung von akzessorischen Proteinen, um die Transkription an Genpromotoren zu initiieren, aber sobald die doppelsträngige DNA in der Transkriptionsstartregion abgewickelt wurde, wurde die RNA-Polymerase II am +1-Initiationsnukleotid positioniert. und hat begonnen, die Synthese neuer RNA-Strange zu katalysieren, klärt die RNA-Polymerase II die Promotorregion oder „entkommt“ sie und lässt die meisten der Transkriptionsinitiationsproteine ​​zurück.

Alle RNA-Polymerasen wandern entlang des DNA-Matrizenstrangs in Richtung 3′ bis 5′ und katalysieren die Synthese neuer RNA-Stränge in Richtung 5′ bis 3′, indem sie neue Nukleotide am 3′ Ende des Wachstums hinzufügen RNA-Strang.

RNA-Polymerasen wickeln die doppelsträngige DNA vor ihnen ab und lassen die abgewickelte DNA hinter ihnen zurück. Als Ergebnis findet die RNA-Strang-Synthese in einer Transkriptionsblase von etwa 25 ungewickelten DNA-Basebairs statt. Nur etwa 8 Nukleotide der neu synthetisierten RNA verbleiben basengepaart mit der Matrizen-DNA. Der Rest der RNA-Moleküle fällt von der Matrize ab, damit sich die dahinter liegende DNA zurückspulen kann.

RNA-Polymerasen verwenden den darunter liegenden DNA-Strang als Matrize, um zu bestimmen, welches Nukleotid an jedem Punkt der Sequenz an das 3′-Ende des wachsenden RNA-Strangs hinzugefügt werden soll. Die RNA-Polymerase wandert Nukleotid für Nukleotid entlang der Matrizen-DNA. Welches RNA-Nukleotid zur Basenpaarung mit dem Matrizennukleotid unterhalb der RNA-Polymerase fähig ist, ist das nächste Nukleotid, das hinzugefügt wird. Sobald die Addition eines neuen Nukleotids an das 3′ Ende des wachsenden Strangs katalysiert wurde, bewegt sich die RNA-Polymerase zum nächsten DNA-Nukleotid auf der darunter liegenden Matrize. Dieser Prozess wird fortgesetzt, bis die Transkriptionstermination auftritt.

Beendigung

Transkriptionstermination durch RNA-Polymerase II auf einem Protein-kodierenden Gen.: RNA-Polymerase II hat keine spezifischen Signale, die ihre Transkription beenden. Im Fall von Protein-kodierenden Genen bindet ein Proteinkomplex an zwei Stellen auf der wachsenden prä-mRNA, sobald die RNA-Polymerase über das Ende des Gens hinaus transkribiert wurde. CPSF im Komplex bindet eine AAUAAA-Sequenz und CstF im Komplex bindet eine GU-reiche Sequenz (obere Abbildung). CPSF im Komplex spaltet die Prä-mRNA an einer Stelle zwischen den beiden gebundenen Sequenzen, wodurch die Prä-mRNA freigesetzt wird (mittlere Abbildung). Poly(A)-Polymerase ist ein Teil desselben Komplexes und beginnt, der Prä-mRNA einen Poly-A-Schwanz hinzuzufügen. Gleichzeitig greift das Xrn2-Protein, eine Exonuklease, das 5′-Ende des RNA-Strangs an, der noch mit der RNA-Polymerase verbunden ist. Xrn2 beginnt, den nicht freigesetzten Teil der neu synthetisierten RNA zu verdauen, bis Xrn2 die RNA-Polymerase erreicht, wo es hilft, die RNA-Polymerase vom DNA-Matrizenstrang zu verdrängen. Dies beendet die Transkription an einer zufälligen Stelle stromabwärts vom wahren Ende des Gens (untere Abbildung).

Die Transkriptionstermination ist für die drei verschiedenen eukaryontischen RNA-Polymerasen unterschiedlich.

Die von der RNA-Polymerase I transkribierten ribosomalen rRNA-Gene enthalten eine spezifische Sequenz von Basenpaaren (11 bp lang beim Menschen 18 bp bei der Maus), die von einem Terminationsprotein namens TTF-1 (Transcription Termination Factor for RNA Polymerase I) erkannt wird. Dieses Protein bindet die DNA an ihrer Erkennungssequenz und blockiert die weitere Transkription, wodurch sich die RNA-Polymerase I vom DNA-Matrizenstrang löst und ihre neu synthetisierte RNA freisetzt.

Den Protein-kodierenden, strukturellen RNA- und regulatorischen RNA-Genen, die von RNA-Polymerse II transkribiert werden, fehlen jegliche spezifischen Signale oder Sequenzen, die die RNA-Polymerase II anweisen, an bestimmten Stellen zu terminieren. RNA-Polymerase II kann RNA überall von einigen bp bis zu Tausenden von bp nach dem eigentlichen Ende des Gens weiter transkribieren. Das Transkript wird jedoch an einer internen Stelle gespalten, bevor die RNA-Polymerase II die Transkription beendet. Dadurch wird der stromaufwärts gelegene Teil des Transkripts freigesetzt, der vor der weiteren Verarbeitung als anfängliche RNA dient (die Prä-mRNA im Fall von proteinkodierenden Genen). Diese Schnittstelle wird als das “Ende” des Gens betrachtet. Der Rest des Transkripts wird von einer 5′-Exonuklease (beim Menschen Xrn2 genannt) verdaut, während es noch von der RNA-Polymerase II transkribiert wird. Wenn die 5′-Exonulease die RNA-Polymerase II “ einholt, indem sie die gesamte überhängende RNA verdaut, hilft sie dabei, die Polymerase von ihrem DNA-Matrizenstrang zu lösen und beendet schließlich diese Transkriptionsrunde.

Im Fall von Protein-kodierenden Genen liegt die Spaltstelle, die das “-Ende” der entstehenden prä-mRNA bestimmt, zwischen einer stromaufwärts gelegenen AAUAAA-Sequenz und einer stromabwärts gelegenen GU-reichen Sequenz, die durch etwa 40-60 Nukleotide in der entstehenden RNA getrennt sind . Sobald diese beiden Sequenzen transkribiert wurden, bindet ein Protein namens CPSF beim Menschen die AAUAAA-Sequenz und ein Protein namens CstF beim Menschen bindet die GU-reiche Sequenz. Diese beiden Proteine ​​bilden die Basis eines komplizierten Proteinkomplexes, der sich in dieser Region bildet, bevor CPSF die entstehende prä-mRNA an einer Stelle 10-30 Nukleotide stromabwärts von der AAUAAA-Stelle spaltet. Das Poly(A)-Polymerase-Enzym, das die Addition eines 3′ Poly-A-Schwanzes an die Prä-mRNA katalysiert, ist Teil des Komplexes, der sich mit CPSF und CstF bildet.

Die von der RNA-Polymerase III transkribierten tRNA-, 5S-rRNA- und strukturellen RNAs-Gene haben ein nicht vollständig verstandenes Terminationssignal. Die von RNA Polymerase III transkribierten RNAs haben an ihrem 3′ -Ende eine kurze Strecke von vier bis sieben U’s. Dies löst irgendwie die RNA-Polymerase III aus, um sowohl die entstehende RNA freizusetzen als auch sich vom DNA-Matrizenstrang zu lösen.


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Bemerkungen:

  1. Abbud

    Ich bin der Meinung, dass Sie nicht Recht haben. Ich schlage vor, darüber zu diskutieren. Schreib mir per PN, wir reden.

  2. Voodoozil

    Ja wirklich. Es war und mit mir. Wir können zu diesem Thema kommunizieren.

  3. Michon

    Ich glaube, ich mache Fehler. Ich schlage vor, darüber zu diskutieren. Schreiben Sie mir in PM, es spricht mit Ihnen.

  4. Stepan

    Und ich habe nicht darüber nachgedacht. Ich werde es meiner Mutter sagen, sie wird es nicht glauben!



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