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Einheit 2: Bakterielle Genetik und chemische Kontrolle von Bakterien - Biologie

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Einheit 2: Bakterielle Genetik und die chemische Kontrolle von Bakterien

Synthetische Biologie erweitert die chemische Kontrolle von Mikroorganismen

Die Werkzeuge der synthetischen Biologie ermöglichen es Forschern, die Art und Weise, wie manipulierte Organismen auf chemische Reize reagieren, zu verändern. Jahrzehntelange Grundlagenforschung in der Biologie und neue Bemühungen im computergestützten Protein- und RNA-Design haben zur Entwicklung von Sensoren für kleine Moleküle geführt, die verwendet werden können, um die Funktion von Organismen zu verändern. Diese neuen Funktionen springen über die natürlichen Neigungen der gentechnisch veränderten Organismen hinaus. Sie können von einfacher Fluoreszenz- oder Wachstumsmeldung bis hin zur Abtötung von Krankheitserregern reichen und können eine metabolische Koordination zwischen mehreren Zellen oder Organismen beinhalten. Hier diskutieren wir, wie die synthetische Biologie die Reaktionen von Mikroorganismen auf chemische Reize verändert, was zur Entwicklung von Mikroben als Toxizitätssensoren, Krankheitsbehandlungen und chemische Fabriken führt.

Copyright © 2015 Elsevier Ltd. Alle Rechte vorbehalten.

Figuren

A) Sensoren (blaue Polygone) sind…

A) Sensoren (blaue Polygone) sind die grundlegenden Funktionseinheiten, die Mikroorganismen verwenden, um…

Verwenden von Sensoren zur Überprüfung auf…

Verwendung von Sensoren zum Screenen auf hohe Ausbeuten einer gewünschten Verbindung. Das Bakterium…

Induzierbare Hemmung von Fettsäure…

Induzierbare Hemmung der Fettsäureverlängerung, um die Produktion von mittelkettigen Fettsäuren zu verbessern.…

Koordinieren des Stoffwechsels mehrerer Mikroben. Mehrere Organismen…

Koordinieren des Stoffwechsels mehrerer Mikroben. Mehrere Organismen können durch chemischen Austausch und Stoffwechsel koordiniert werden…


Tina M. Henkin ist Professorin für Mikrobiologie und Robert W. und Estelle S. Bingham Professorin für biologische Wissenschaften an der Ohio State University, wo sie seit 1995 lehrt. Dr. Henkin promovierte in Genetik an der University of Wisconsin.

Joseph E. Peters ist Professor für Mikrobiologie und Direktor des Graduiertenprogramms für Mikrobiologie an der Cornell University, wo er seit 2002 lehrt. Dr. Peters promovierte in Mikrobiologie an der University of Maryland.


BIO307: Mikrobiologie

Dieser Kurs konzentriert sich auf Bakterien, die am besten untersuchte Art von Mikroorganismen. Wir beginnen diese Einheit, indem wir lernen, wie Bakterienzellen ihre Energie beziehen und wie sie wachsen. Der Stoffwechsel variiert stark zwischen Bakterien, nicht alle haben die gleichen Mechanismen. Während die meisten beispielsweise Sauerstoff zum Überleben benötigen, sterben einige tatsächlich in Gegenwart von Sauerstoff. Da es im Bereich der Mikrobiologie zunehmend um die künstliche Kultivierung von Bakterien geht, ist es wichtig, auch die Methoden und Konzepte ihrer Züchtung und Kultur zu kennen.

Bakterien teilen und vermehren sich mit erstaunlicher Geschwindigkeit. Unter den richtigen Bedingungen können sich die schnellsten Bakterien alle 20 Minuten teilen! Das heißt, wenn Sie vor dem Schlafengehen nur eine einzige Bakterienzelle kultiviert haben, könnten Sie 8 Stunden später mit einem Teller mit mehr als 16 Millionen Bakterien aufwachen! Ein Großteil der bakteriellen Reproduktion ist asexuell und erfolgt durch binäre Spaltung. Bei der binären Spaltung teilt sich eine Zelle buchstäblich in zwei. Wir schließen diese Einheit ab, indem wir etwas über den horizontalen Gentransfer lernen, einen Prozess, bei dem eine Bakterienzelle genetische Veränderungen einer anderen Zelle übernimmt, ohne deren Nachkommen zu sein. Diese einzigartige Eigenschaft hat es Bakterien ermöglicht, sich unter Bedingungen anzupassen und zu wachsen, die sie sonst nicht überleben könnten. Es hat auch zu einer Zunahme von arzneimittelresistenten bakteriellen Infektionen geführt.

Das Abschließen dieser Einheit sollte ungefähr 15 Stunden dauern.


Eukaryotischer Erwerb eines bakteriellen Operons

Operone sind ein Markenzeichen bakterieller Genome, wo sie die konzertierte Expression funktionell verwandter Gene als einzelne polycistronische Transkripte ermöglichen. Sie sind selten in Eukaryoten, wo jedes Gen normalerweise die Expression seiner eigenen unabhängigen Boten-RNAs steuert. Hier berichten wir über den horizontalen Operontransfer eines Siderophor-Biosynthesewegs von Verwandten von Escherichia coli in eine Gruppe knospender Hefetaxa. Wir zeigen weiterhin, dass die kolinear angeordneten Sekundärmetabolismusgene exprimiert werden, eukaryotische Transkriptionsmerkmale aufweisen und die Sequestrierung und Aufnahme von Eisen ermöglichen. Nach dem Transfer traten während der nachfolgenden Evolution mehrere genetische Veränderungen auf, einschließlich der Gewinnung neuer Transkriptionsstartstellen, die manchmal innerhalb von Protein-kodierenden Sequenzen lagen, der Erwerb von Polyadenylierungsstellen, struktureller Neuanordnungen und der Integration eukaryontischer Gene in den Cluster. Wir schließen daraus, dass die Gene wahrscheinlich als Einheit erworben, für die eukaryotische Genexpression modifiziert und durch Selektion erhalten wurden, um sich an die stark kompetitive, eisenbegrenzte Umgebung anzupassen.

Schlüsselwörter: Saccharomycotina Starmerella Wickerhamiella knospende Hefen zentrales Dogma der Biologie Enterobactin Horizontaler Gentransfer Operon Siderophore Biosynthese.

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Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Figuren

Abbildung 1.. Verteilung der Eisenaufnahme…

Abbildung 1. Verteilung der Eisenaufnahme- und -speichersysteme bei Pilzen.

Abbildung 2.. Hefe-Siderophor-Biosynthese stammt aus…

Abbildung 2. Hefe-Siderophor-Biosynthese stammt aus einer Enterobacteriales-Linie.

Abbildung 3. Evolution der Siderophor-Biosynthese…

Abbildung 3. Evolution der Siderophor-Biosynthesegene in Hefen.

(A) ML-Phylogenie rekonstruiert aus…

Abbildung 4.. Transkriptomik der Siderophor-Biosynthese…

Abbildung 4.. Transkriptomik der Siderophor-Biosynthesegene in W. vielseitig .

50% in der Mitte der Gentranskripte und steigen auf 100% an den Transkriptenden an. Somit werden Transkriptgrenzen als Abdeckungstief zwischen zwei Spitzen visualisiert, die sich einem Verhältnis von 100 % nähern. Verhältnisse unter 100 % an den mutmaßlichen 5’- oder 3’-Enden der annotierten Transkripte, gekoppelt mit einer Nicht-Null-Abdeckung ihrer intergenischen Regionen, deuten auf überlappende oder potenziell bicistronische Transkripte hin. Der erwartete 3’ Coverage Bias kann für einzelne Transkripte in den Rohdaten der Coverage beobachtet werden. (E) Ergebnisse von 5′- und 3′-RACE-Experimenten, die die Positionen aller detektierten m 7 G-Caps (grüne vertikale Linien) und poly(A)-Schwänze (rote vertikale Linien) im darstellen entB-entD (links) und entA-entH (rechts) Genpaare in W. vielseitig. Die äußeren und inneren genspezifischen Primer sind durch diagonale schwarze Linien markiert und wurden zusammen mit äußeren und inneren Primern verwendet, die spezifisch für die im Kit enthaltenen 5'- oder 3'-RACE-Adapter sind (siehe Materialien und Methoden), die entweder 5' m 7 G Kappe bzw. der 3' Poly(A) Schwanz. Gestrichelte Linien zeigen Sequenzen an, die nur während des äußeren Nested-RACE-PCR-Schritts amplifiziert wurden, während durchgezogene Linien die Teile der Transkripte anzeigen, die während des inneren Nested-RACE-PCR-Schritts amplifiziert und anschließend für die Sequenzierung kloniert wurden (F) Diagramm der Siderophor-Biosynthesegene wie vorhanden in der E coli Genom maßstabsgetreu gezeichnet. Die Zahlen über dem Diagramm zeigen die Read-Paar-Crossmapping zwischen den Genen (basierend auf Daten von Seo et al., 2014, vollständige Abdeckungskarten in Abbildung S6). Die nachfolgenden Zählungen geben die Größe der intergenischen Regionen zwischen benachbarten Protein-kodierenden Sequenzen in Basenpaaren an (negative Zahlen zeigen Überlappung an). Die F Präfix (fA-fG) zeigt die fepA-fepG Gene. Siehe auch Abbildung S2, Abbildung S3 und Tabelle S3.


Bakterielle Genetik

Das Studium der Genstruktur und -funktion in Bakterien. Die Genetik selbst beschäftigt sich mit der Bestimmung der Anzahl, Lage und Beschaffenheit der Gene eines Organismus. Der klassische Weg zur Untersuchung von Genen besteht darin, zwei Organismen mit unterschiedlichen Genotypen zu paaren und die beobachtbaren Eigenschaften (Phänotypen) der Eltern mit denen der Nachkommen zu vergleichen. Bakterien paaren sich nicht (auf die übliche Weise), daher gibt es keine Möglichkeit, alle Chromosomen zweier verschiedener Bakterien in dieselbe Zelle zu bringen. Es gibt jedoch eine Reihe von Möglichkeiten, wie ein Teil des Chromosoms oder Genoms eines Bakteriums in ein anderes Bakterium eingefügt werden kann, um das Ergebnis zu untersuchen. Sehen Genetik

Alle Organismen sind von einem gemeinsamen Vorfahren-Prokaryoten abgewichen, dessen genaue Position im Evolutionsbaum unklar ist. Dies hat zu drei primären Königreichen geführt, den Archaebakterien, den Eubakterien und den Eukaryoten. Alle Bakterien sind Prokaryoten, d. h. der “nukleus” oder Nukleoid ist ein einzelnes zirkuläres Chromosom ohne Kernmembran. Bakterien fehlen auch andere membranbegrenzte Organellen wie Mitochondrien oder Chloroplasten, aber sie alle besitzen eine zytoplasmatische Membran. Die meisten Bakterien haben eine Zellwand, die die zytoplasmatische Membran umgibt, und einige Bakterien enthalten auch eine äußere Membran, die die Zellwand umgibt. Die Duplikation erfolgt durch einen Prozess der binären Spaltung, bei dem zwei identische Tochterzellen aus einer einzigen Elternzelle entstehen. Jede Zelle in einer homogenen Population von Bakterienzellen behält das Potenzial zur Vervielfältigung. Bakterien besitzen kein Potenzial zur Differenzierung (außer Sporenbildung) oder zur Bildung mehrzelliger Organismen. Sehen Archaebakterien, Bakterien, Ribonukleinsäure (RNA)

Einer der am häufigsten verwendeten Organismen bei der Erforschung der Bakteriengenetik ist der stäbchenförmige Bazillus Escherichia coli, dessen normaler Lebensraum der Dickdarm ist. Bedingungen für den Anbau wurden gefunden E coli im Labor, und es ist bei weitem der am besten verstandene aller Mikroorganismen. Das einzelne zirkuläre Chromosom von E coli enthält etwa 4,5 × 10 6 Basenpaare, was ausreicht, um etwa 4500 Gene mittlerer Größe (jeweils 1000 Basenpaare) herzustellen. In Regionen, in denen Kartierungsstudien einigermaßen abgeschlossen sind, entsteht der Eindruck eines effizient organisierten Genoms. Proteinkodierende Regionen befinden sich neben regulatorischen Regionen. Es gibt keine Hinweise auf signifikante Abschnitte von nichtfunktioneller Desoxyribonukleinsäure (DNA) und es gibt keine Hinweise auf Introns [Regionen, die durch Spleißen der Messenger-RNA (mRNA) entfernt werden, bevor sie in Protein übersetzt wird] in den kodierenden Regionen. Es existiert nur sehr wenig repetitive DNA in der E coli anderes Chromosom als die sieben sequenzbezogenen rRNA-Gene, die an verschiedenen Stellen auf dem Chromosom verteilt sind. Sehen Chromosom, Desoxyribonukleinsäure (DNA), genetischer Code

Der erste Schritt bei der genetischen Forschung an Bakterien besteht darin, Mutanten auszuwählen, die sich in einem oder mehreren Genen von Wildtypzellen unterscheiden. Dann werden Kreuzungen zwischen Mutanten und Wildtypen oder zwischen zwei verschiedenen Mutanten hergestellt, um Dominanz-rezessive Beziehungen, chromosomale Lage und andere Eigenschaften zu bestimmen. Verschiedene genetische Methoden werden verwendet, um Bakterienmutanten, antibiotikaresistente Zellen, Zellen mit spezifischen Wachstumsanforderungen usw. auszuwählen.

Bestimmte Gene, die die Expression anderer Gene modulieren, werden als regulatorische Gene bezeichnet. Es gibt zwei Arten von Mutationen, die die Wirkung von regulatorischen Proteinen beeinflussen: solche, die in den Genen vorkommen, die die regulatorischen Proteine ​​kodieren, und solche, die die genetischen Loci beeinflussen, an denen das regulatorische Protein interagiert, um das Ausmaß der Genexpression zu modulieren. Einige regulatorische Genmutationen verursachen eine Überproduktion und andere eine Unterproduktion von Genprodukten. Dies ist das Kennzeichen einer Mutation, die die Funktion eines regulatorischen Proteins oder einer regulatorischen Faktor-Bindungsstelle beeinflusst. Sie beeinflusst die Quantität, aber nicht die Qualität anderer Genprodukte. Darüber hinaus sind regulatorische Genmutationen häufig pleiotrop, dh sie beeinflussen die Synthesegeschwindigkeit mehrerer Genprodukte gleichzeitig. Sehen Genwirkung, Protein

Genetiker möchten häufig die Zahl oder die Arten von Mutanten erhöhen, die als Ergebnis einer spontanen Mutagenese erhalten werden können. In solchen Fällen behandeln sie eine Bakterienpopulation mit einem mutagenen Mittel, um die Mutationshäufigkeit zu erhöhen. Dies wird als induzierte Mutagenese bezeichnet. Die einfachsten Techniken der induzierten Mutagenese beinhalten die gemessene Exposition der Bakterien gegenüber einem mutagenen Mittel, wie Röntgenstrahlen oder chemischen mutagenen Mitteln. Solche Verfahren wirken sich generell auf die Erhöhung der Mutationsrate aus. Anspruchsvollere Verfahren beinhalten das Isolieren des interessierenden Gens und das Vornehmen einer Änderung an der gewünschten Stelle. Dies wird als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnet. Das Ziel ist in der Regel, die Auswirkungen einer Veränderung an einem bestimmten Genort zu bestimmen. Das betreffende Gen wird isoliert, modifiziert und wieder in den Organismus eingefügt. An jeder DNA in zellfreier Kultur können auf vielfältige Weise diskrete Veränderungen vorgenommen und deren Wirkung anschließend im Organismus getestet werden. Sehen Gentechnik, Mutagene und Karzinogene

Bakterien paaren sich nicht, um echte Zygoten zu bilden, aber sie sind in der Lage, genetische Informationen durch eine Vielzahl von Prozessen auszutauschen, bei denen Teilzygoten (Merozygoten) gebildet werden. Die erste Art des genetischen Austauschs zwischen Bakterien, die beobachtet wurde, war die Transformation. Die natürlich vorkommende Transformation beinhaltet die Aufnahme von DNA. Dieses Phänomen wird nur bei einer begrenzten Anzahl von Bakterienarten beobachtet und ist eine relativ schwierige Technik zur Genmanipulation. 1946 direkter Chromosomenaustausch durch Konjugation zwischen E coli Zellen wurde von J. Lederberg und E. Tatum entdeckt, und 1951 wurde die Transduktion, der Virus-vermittelte Transfer von bakteriellen Genen, entdeckt. Sowohl Konjugation als auch Transduktion stellen einfache, allgemein anwendbare Verfahren bereit, um einen Teil des Bakterienchromosoms von einer Zelle zur anderen zu bewegen. Die Entdeckung bakterieller Transposons (eine Klasse mobiler genetischer Elemente, die häufig in Bakterienpopulationen zu finden sind) in den 1970er Jahren war nützlich, um interessierende Gene zu markieren und zu mobilisieren. Die rein genetischen Ansätze zur Kartierung wurden durch die biochemischen Ansätze der Hybridplasmidkonstruktion und DNA-Sequenzanalyse ergänzt. Sehen Transformation (Bakterien), Transposons

Zu einem bestimmten Zeitpunkt ist nur ein kleiner Prozentsatz der E coli Genom wird aktiv transkribiert. Der Rest des Genoms ist entweder stumm oder wird mit einer sehr geringen Rate transkribiert. Wenn sich die Wachstumsbedingungen ändern, werden einige aktive Gene ausgeschaltet und andere inaktive Gene eingeschaltet. Die Zelle behält immer ihre Totipotenz, so dass innerhalb kurzer Zeit (Sekunden bis Minuten) und unter geeigneten Umständen jedes Gen vollständig eingeschaltet werden kann. Die maximale Aktivität für die Transkription variiert von Gen zu Gen. Zum Beispiel erstellt ein β-Galactosidase-Gen etwa eine Kopie pro Minute und ein vollständig eingeschaltetes Biotin-Synthase-Gen etwa eine Kopie pro 10 Minuten. Im maximal reprimierten Zustand exprimieren diese beiden Gene weniger als ein Transkript pro 10 min. Das Transkriptionsniveau für ein bestimmtes Gen resultiert normalerweise aus einer komplexen Reihe von Kontrollelementen, die in einer Hierarchie organisiert sind, die alle metabolischen Aktivitäten der Zelle koordiniert. Wenn beispielsweise die rRNA-Gene hochaktiv sind, sind es auch die Gene für ribosomale Proteine, und letztere werden so reguliert, dass stöchiometrische Mengen der meisten ribosomalen Proteine ​​produziert werden. Wenn Glukose im Überfluss vorhanden ist, werden die meisten Gene, die an der Verarbeitung komplexerer Kohlenstoffquellen beteiligt sind, in einem Prozess, der als Katabolitrepression bezeichnet wird, ausgeschaltet. Wenn die Glukoseversorgung erschöpft ist und Laktose vorhanden ist, werden die Gene exprimiert, die am Laktoseabbau (Katabolismus) beteiligt sind. In E coli die Produktion der meisten RNAs und Proteine ​​wird ausschließlich auf Transkriptionsebene reguliert, obwohl es bemerkenswerte Ausnahmen gibt.


Talk-Übersicht

Witkin gibt einen historischen Überblick darüber, wie die Arbeit bei Cold Spring Harbor (CSH) ihre wissenschaftliche Karriere geprägt und zur Entdeckung der SOS-DNA-Schadensreaktion bei Bakterien geführt hat. Am CSH arbeitete sie mit den Pionieren der Bakteriengenetik zusammen, zu einer Zeit, als es jede zweite Woche eine große Entdeckung gab. Als Doktorand beobachtete Witkin, dass manche Bakterien auch hohe Dosen von UV-Strahlung überleben. Sie spekulierte, dass diese Bakterien einen Mechanismus haben könnten, um DNA zu reparieren und sie UV-resistent zu machen. Diese revolutionären Ideen führten zur Entdeckung, dass Zellen einen Mechanismus zur Reparatur von DNA-Schäden haben, die SOS-Reaktion.


Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt in Bezug auf gerichtliche Ansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Erweiterte Daten Abb. 1 Nitrogenase-Aktivität im Wildtyp R. sp. IRBG74 und einnif mutierter Stamm, bei dem die native nif Cluster werden gelöscht.

(ein) Die nif Cluster in R. sp. IRBG74. Die von den Suizid-Plasmiden pMR45–46 erzeugten deletierten Regionen sind markiert (Methoden). (B) Übertragung von Muttersprachlern nif konstruiert in R. sp. IRBG74. Die Nitrogenase-Aktivität wurde nur bei der Übertragung der R. sphaeroides nif Cluster in R. sp. IRBG74 MR17hsdR, recA) aber nicht in R. sp. IRBG74 MR19hsdR, recA Δnif). Ausdruck von A. caulinodans nifV auf dem Plasmid pMR49 in R. sp. IRBG74 MR17 wurde durch 0,5 mM IPTG induziert. Die Mitübertragung der kompletten A. caulinodans nif Cluster auf den beiden Plasmiden pMR19 und pMR20 ergab keine Aktivität in R. sp. IRBG74 MR17. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen. Sternchen zeigen an, dass die Ethylenproduktion unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Rsp, R. sphaeroides Aka, A. caulinodans. (C) Plasmidkarten verwendet in (B).

Erweiterte Daten Abb. 2 Ribosomen-Profiling-Daten für die K. oxytoca nif Cluster.

Ribosomen-Profiling-Daten für die K. oxytoca nif Cluster in seinem nativen Wirt (oben) und beim Transfer in verschiedene Stämme werden gezeigt.

Erweiterte Daten Abb. 3 Die Wirkung der NifA-Überexpression auf die nifH Promoter-Aktivität in R. sp. IRBG74.

(ein) Das Design der Reporterkonstrukte zur Messung von nifH Promoteraktivität gezeigt. Die nifH Promotoraktivität wurde analysiert in R. sp. IRBG74 unter Verwendung von Durchflusszytometrie. Überexpression von R. sp. IRBG74 NifA erhöhte die Aktivität des R. sp. IRBG74 nifH Projektträger, aber es versäumt, die Aktivitäten des anderen zu ergänzen oder zu verstärken nifH Promoter einschließlich K. oxytoca, P. stutzeri und A. caulinodans. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen. WT, Wildtyp-Rsp, R. sp. IRBG74 Kox, K. oxytoca M5al Pst, P. stutzeri A1501 Aca, A. caulinodans ORS571 (B) Plasmidkarten, die verwendet werden, um die Wirkung von . zu beurteilen nifA Überexpression in R. sp. IRBG74.

Erweiterte Daten Abb. 4 Nitrogenase-Aktivität, wenn unterschiedlich induzierbar nif Cluster werden übertragen an E coli MG1655.

(ein) Das gleiche universelle Steuerungssystem basierend auf K. oxytoca nifA wurde für alle drei Cluster optimiert und verwendet (Ergänzende Abbildung 15, 17b). Das Kontrollplasmid pMR104 und genetische Teile sind in den ergänzenden Tabellen 3 und 4 aufgeführt. (B) Die nif Cluster aus K. oxytoca, P. stutzeri, und A. vinelandii werden gezeigt. Die deletierten Regionen, die den NifLA-Regulatoren entsprechen, sind markiert und ihre entsprechenden Genomorte sind in der ergänzenden Tabelle 3 angegeben. Die gestrichelten Linien zeigen, dass mehrere Regionen des Genoms kloniert und kombiniert wurden, um die nif Cluster. Die Cluster wurden auf den Plasmiden pMR23–25 getragen (Ergänzungstabelle 3). (C) Die Induktion des nifH Promotoren von jeder Spezies durch den Controller sind gezeigt (+, 50 &mgr;M IPTG). (D) Die Nitrogenase-Aktivitäten des nativen Clusters (intakt nifLA) werden mit den induzierbaren Clustern in Gegenwart und Abwesenheit von 50 μM IPTG verglichen. Die gestrichelten Linien zeigen die Aktivität der nativen Cluster im Wildtyp-Kontext (von oben nach unten, K. oxytoca M5al, P. stutzeri A1501 und A. vinelandii DJ). (e) Regulation der Nitrogenaseaktivität durch Ammonium. Die Ammoniumtoleranz der Nitrogenase aus den nativen (schwarzer Balken) und induzierbaren (grauen Balken) Systemen wurde in Gegenwart von 17,1 mM Ammoniumacetat und 50 μM IPTG (induzierbar) getestet. Sternchen zeigen an, dass die Ethylenproduktion unterhalb der Nachweisgrenze liegt. (F) Regulation der Nitrogenaseaktivität durch Sauerstoff. Der Einheimische nif Cluster wird mit der induzierbaren Version einschließlich des Controller-Plasmids und 50 &mgr;M IPTG verglichen. Die Nitrogenaseaktivitäten wurden nach 3 h Inkubation bei konstanten Sauerstoffkonzentrationen (0 bis 3%) im Headspace gemessen (Methoden). Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.

Extended Data Abb. 5 Übergabe des refactored nif Cluster v3.2 Zoll P.-Proteine Pf-5.

(ein) Controller, deren Ausgabe T7-RNAP ist, integriert im Genom von P.-Proteine Pf-5 beschrieben. Ersetzte genetische Teile für die Regleroptimierung im Vergleich zum Reglermodul pKT249 in E coli MG1655 sind rot markiert. Die Response-Funktionen für die Controller mit dem Reporterplasmid pMR81 wurden im P.-Proteine Pf-5-Controller-Stamm MR7. Der Controller, der die Expression von GFP durch den T7-Promotor steuert, führte zu einer 96-fachen Induktion durch IPTG. (B) Die genetischen Teile, die verwendet wurden, um die umgestaltete v3.2 zu bauen nif Gencluster sind gezeigt (bereitgestellt in ergänzender Tabelle 4). (C) Die Aktivität des umgestalteten nif Cluster v3.2. Die Nitrogenase-Expression wurde durch 1 mM IPTG induziert. (D) Die Funktion der Transkriptionsteile des Clusters v3.2 wurde durch RNA-seq analysiert (ergänzende Abbildung 18). Die Leistung der Promotoren (links) und Terminatoren (rechts) wurde berechnet (Methoden). (e) Die Translationseffizienz des nif Gene v3.2, wie unter Verwendung von Ribosomen-Profiling und RNA-seq. Linien verbinden Punkte, die im gleichen Operon vorkommen. (F) Die Ribosomendichte (RD) wird für das refaktorierte v3.2 . verglichen nif Gene in P.-Proteine Pf-5 im Vergleich zu dem für die gemessenen nif Gene vom Eingeborenen K. oxytoca Cluster in K. oxytoca (→Klebsiella: R 2 = 0,68). Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.

Erweiterte Daten Abb. 6 Kontrolle der Nitrogenase-Fixierung in A. caulinodans ORS571 unter wechselnden Umgebungsbedingungen.

(ein) Die Wirkung der Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 mM Ammoniumchlorid wird gezeigt. Die WT-NifA von A. caulinodans ORS571 wird mit verschiedenen Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen verglichen. Die NifA/RpoN-Expression wird durch 1 mM IPTG (+) für induziert A. caulinodans ΔnifA enthaltend das Kontrollplasmid pMR124–127 (+). Ein Sternchen weist auf eine Ethylenproduktion unterhalb der Nachweisgrenze hin. (B) Die Nitrogenase-Aktivität wird als Funktion der Sauerstoffkonzentration im Headspace (Methoden) gezeigt. Der Einheimische nif Cluster (Wildtyp A. caulinodans ORS571, schwarz) wird mit der induzierbaren Version (grau) einschließlich des Kontrollplasmids und 1 mM IPTG verglichen. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.

Extended Data Abb. 7 Ammoniumrepression des transferierten nif Cluster in E coli MG1655 und P.-Proteine Pf-5.

Die Nitrogenase-Empfindlichkeit gegenüber Ammonium wurde durch einen Acetylen-Reduktionsassay in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von 17,1 mM Ammoniumacetat gemessen. Die Empfindlichkeit des nativen und induzierbaren nif Cluster in E coli MG1655 (ein) und P.-Proteine Pf- 5 (B). Beachten Sie, dass die Daten aus Abb. 4 und der ergänzenden Abbildung 8 stammen. (C) Die spezifischen Nitrogenase-Aktivitäten der nativen A. vinelandii nif Cluster werden mit dem induzierbaren verglichen A. vinelandii Cluster in Gegenwart (+) und Abwesenheit (-) von 17,1 mM Ammoniumacetat in P.-Proteine Pf-5. Die nif Cluster aus der induzierbaren Version wurden durch 50 μM und 0,5 mM IPTG in . induziert E coli MG1655 und P.-Proteine Pf-5 bzw. Sternchen zeigen an, dass die Ethylenproduktion unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.

Erweiterte Daten Abb. 8 Die Wirkung von Sauerstoff auf die Aktivität des nifH Förderer.

Ausdruck aus dem nifH Promotoren wurde analysiert in E coli MG1655, das das Kontrollplasmid pMR104 enthält, P.-Proteine Pf-5 MR10 (für K. oxytoca) und MR9 (für P. stutzeri und A. vinelandii) bei unterschiedlichen anfänglichen Sauerstoffkonzentrationen im Kopfraum. Die Drei nifH Promotoren wurden mit 0,05 mM IPTG und 0,5 mM IPTG in . induziert E coli MG1655 und P.-Proteine Pf-5 und inkubiert bei unterschiedlichen anfänglichen Sauerstoffkonzentrationen. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.

Erweiterte Daten Abb. 9 Die Wirkung der rnf und Fix Komplex auf Nitrogenaseaktivität.

Die modifizierte nif Cluster von A. vinelandii auf den Plasmiden pMR25–28 wurden im Kontrollstamm analysiert P.-Proteine Pf-5 MR9. Die deletierten Regionen aus den Clustern wurden in der ergänzenden Tabelle 3 bereitgestellt. Nitrogenase wurde mit 0,5 mM IPTG induziert. Punkte in der DNA-Linie zeigen an, wo mehrere Regionen aus genomischer DNA kloniert und kombiniert wurden, um ein großes, von Plasmiden getragenes zu bilden nif Cluster. Ein Sternchen weist auf eine Ethylenproduktion unterhalb der Nachweisgrenze hin. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.

Erweiterte Daten Abb. 10 Regulation der Nitrogenase-Aktivität im E coli MG1655 ‘Marionette’-Stamm.

(ein) Kontrollplasmide, die verwendet werden, um die Expression von T7-Promotoren zu steuern. (B) Die Induzierbarkeit des T7-Promotors durch die für T7-RNAP kodierenden Controller-Plasmide unter der Regulation der 12 Sensoren wurde mit einem Reporterplasmid pMR123 (rechts) getestet. (C) Die induzierbare Kontrolle der Nitrogenase-Aktivität als Reaktion auf 12 Induktoren wurde mit jeweils 12 Controller-Plasmiden und dem Plasmid pMR138 (rechts), das das refaktorierte trägt, getestet nif Cluster v2.1 auf pBBR1-Ursprung. Das Cholin-Cl-induzierbare System wurde für den Aktivitätstest weggelassen, da das System nicht induzierbar war. Für das DAPG-, DHBA- und Vanillinsäure-induzierbare System wurde der refaktorierte Cluster v2.1 auf einem Plasmid pMR31 mit niedrigerer Kopienzahl (rechts) getragen, da es keine Koloniebildung aus der Transformation des Plasmids pMR138 gab. Die Induktorkonzentrationen sind: 400 µM Arabinose, 1 mM Cholin-Cl, 500 nM 3OC14HSL, 50 µM Cuminsäure, 25 nM 3OC6HSL, 25 µM DAPG, 500 µM DHBA, 1 mM IPTG, 100 nM aTc, 250 µM Naringenin, 50 µM Vanillinsäure und 250 μM Salicylsäure. Plasmid- und genetische Teile sind in den ergänzenden Tabellen 3 und 4 angegeben. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an verschiedenen Tagen.


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