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Fehlen Zentriolen in menschlichen Neuronen wirklich?

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Eine Broschüre (herausgegeben von meiner Schule) behauptet,

Zentriolen, von denen früher angenommen wurde, dass sie in Neuronen fehlen, wurden in Neuronen beschrieben und können mit der Produktion und Aufrechterhaltung von Neuro(mikro)tubuli in ihnen in Verbindung gebracht werden.

Ich hatte den Eindruck, dass reife menschliche Neuronen total leer von Zentriolen.

Da es an einer Schule in Umlauf ist, fehlen ihm Feinheiten wie Zitate/Referenzen. Ich habe ein bisschen gegoogelt, aber das hat nichts ergeben, was die Behauptung in der Broschüre bestätigt.


Q- Gemäß den neuesten Studien/Infos. besitzen (reife) menschliche Neuronen wirklich Zentriolen?


Du hast nach gefragt "neueste Studien/Infos"… Lustigerweise wurden reife Neuronen mit Zentriolen 1911 von Cajal (der keiner Einführung bedarf) beschrieben.

Wenn Sie eine modernere Quelle wünschen, können Sie sich Jacobson (1978) ansehen:

Mikrotubuli, die mit den Zilien und dem Zentriol assoziiert sind, sind in allen jungen Neuronen und vielen vorhanden reifen Neuronen und Glia. In silberimprägnierten Schnitten nach der Nauta-Methode (H. A. Dahl, 1963) lassen sich neuronale Zilien und Zentriolen sehr gut lichtmikroskopisch erkennen. Zentriolen können auch durch Lichtmikroskopie in Neuronen gezeigt werden, die mit anderen histologischen Methoden gefärbt wurden. (Hervorhebung von mir)


Quellen:

  • CAJAL, S. RAMON Y. (1911). Histologie du système nerveux de l'Homme et des Vertébrés (übers. L. Azoulay, 1952), vol. ich. Madrid: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas.
  • Jacobson, M. (1978). Entwicklungsneurobiologie. Boston, MA: Springer USA.

Centriolen sind Organellen, die zwei kritische Funktionen haben. In sich teilenden Zellen rekrutieren sie eine Sammlung von Proteinen (bekannt als perizentrioläres Material), um größere Organellen zu bilden, die Zentrosomen genannt werden, die Mikrotubuli nukleieren und die Spindelpole während der Zellteilung organisieren (Fu et al., 2015 Abbildung 1A) In sich nicht teilenden Zellen Zentriolen sind an der Produktion von Zilien beteiligt, den winzigen haarähnlichen Vorsprüngen, die Zellen zum Signalisieren, Erfassen und Bewegen extrazellulärer Flüssigkeit verwenden (Drummond, 2012).

Wie Zentriolen duplizieren C. elegans.

(EIN). Das perizentrioläre Material, das vom Mutterzentriol rekrutiert wird, bildet Mikrotubuli und organisiert den Pol der mitotischen Spindel. (B) Die Schritte beim Aufbau und der Reifung des Tochterzentriols werden zusammen mit den für jeden Schritt benötigten Proteinen dargestellt. Schemata auf der Unterseite zeigen eine Querschnittsansicht der Tochter. Die Montage beginnt, wenn sich im rechten Winkel zum Mutterzentriol ein Rad (grau) bildet. Im zweiten Schritt bildet sich um das Wagenrad eine Außenwand aus neun symmetrisch angeordneten Mikrotubuli (grau). Die Montage des Schaufelrads (ein Satz von Vorsprüngen, die entlang der Länge jedes Mikrotubulus rot verlaufen) und der Erwerb der Reproduktionsfähigkeit erfordert SAS-7. (C) Die beobachteten Phänotypen, wenn eine Samenzelle, die ein Wildtyp-Zentriolpaar enthält, eine Wildtyp-Eizelle (linke Spalte), eine Eizelle, der eine für die Tochter-Zentriol-Bildung essentielle Komponente fehlt (mittlere Spalte), oder eine Eizelle ohne a . befruchtet Komponente, die für Tochterzentriolen erforderlich ist, um die Fähigkeit zur Fortpflanzung zu erlangen (rechte Spalte).

Ein einzelnes Zentriol besteht aus einer zentralen Nabe, dem Wagenrad, umgeben von einer Außenwand, die eine neunfach symmetrische Anordnung stabilisierter Mikrotubuli enthält (Abbildung 1B Fu et al., 2015 Gönczy, 2012). Wenn eine Zelle geboren wird, enthält sie zwei reife Zentriolen. Gleichzeitig mit der DNA-Replikation beginnen die Zentriolen auch, sich zu duplizieren, wobei jede Zentriole eine neue Tochter hervorbringt, die sich im rechten Winkel zur Außenwand ihrer Mutter bildet (Abbildung 1B). Durch die Metaphase hat die neue Tochterzentriole ein Rad und eine Außenwand. Während es jedoch an seine Mutter gebunden bleibt, ist das Tochterzentriol unreif, da es nicht in der Lage ist, sein eigenes perizentrioläres Material zu rekrutieren und seine eigene Tochter zu zeugen. Da sich die Zelle in zwei Tochterzellen teilt, erwirbt die neue Tochterzentriole diese Fähigkeiten, wenn sie sich von ihrer Mutter trennt (Abbildung 1B).

Bei Wirbeltieren und Insekten wurde ein Weg für die Zentriolreifung identifiziert, der ein spezifisches Protein namens Cep295/Ana1 erfordert (Fu et al., 2016 Izquierdo et al., 2014 Tsuchiya et al., 2016). Nematoden haben jedoch kein Cep295/Ana1-Homolog, was die Frage aufwirft, wie Zentriolen in diesen Organismen reifen. Jetzt berichten Bruce Bowerman und Kollegen – darunter Kenji Sugioka von der University of Oregon und Danielle Hamill von der Ohio Wesleyan University als gemeinsame Erstautoren – in eLife über die Ergebnisse von Experimenten an dem Modell-Nematoden C. elegans die diese Frage beantworten (Sugioka et al., 2017). Insbesondere haben sie a C. elegans Protein namens SAS-7, das für Zentriolen benötigt wird, um die Fähigkeit zur Reproduktion zu erlangen.

Der Kern-Centriol-Assembly-Weg wurde entdeckt in C. elegans weil die Verarmung von Proteinen, die für den Zentriolaufbau aus Eizellen erforderlich sind, zu einem charakteristischen Phänotyp führt (Abbildung 1C). Während der Befruchtung bringt die Samenzelle ein Paar Zentriolen in die Eizelle, der die Zentriolen fehlen. Diese Spermienzentriolen duplizieren sich, sodass das Zentrosom an jedem Pol der mitotischen Spindel ein Mutter-Tochter-Zentriolpaar enthält. Nach der ersten Zellteilungsrunde erbt jede Zelle des zweizelligen Embryos zwei reife Zentriolen, eine Mutter und eine neu reife Tochter aus dem ersten Zellzyklus, die beide die Fähigkeit haben, sich zu vermehren und perizentrioläres Material zu rekrutieren, um Zentrosomen zu bilden (Abbildung 1C, linke Spalte). Im Gegensatz dazu bringt das Wildtyp-Sperma, wenn ein für die Tochterzentriol-Bildung benötigtes Protein im Ei fehlt, immer noch ein Paar Zentriolen ein, aber während des ersten Zellzyklus bilden sich keine neuen Tochter-Zentriolen, so dass jede Zelle der zwei- Zellembryo erbt ein einzelnes reifes Zentriol und nicht das normale Paar von Zentriolen. Folglich bauen beide Zellen Spindeln zusammen, die nur einen Pol anstelle der normalen zwei haben (Abbildung 1C, mittlere Spalte).

Bildschirme in C. elegans identifizierten vier Proteine, deren Hemmung zu monopolaren Spindeln in Embryonen im Zweizellstadium führt, was darauf hinweist, dass sie für die Bildung von Tochterzentriolen essentiell sind (Abbildung 1B): eine Kinase namens Plk4 oder ZYG-1, die den Zentriolaufbau initiiert (O'Connell et al ., 2001) SAS-5 und SAS-6, die benötigt werden, um das Rad zu bilden (Dammermann et al., 2004 Delattre et al., 2004 Leidel et al., 2005) und SAS-4, die eine strukturelle Komponente von die äußere Wand des Zentriols (Kirkham et al., 2003 Leidel und Gönczy, 2003). Eine fünfte wesentliche Komponente, SPD-2, hat zwei Funktionen: Es wird für Zentriolen benötigt, um perizentrioläres Material zu rekrutieren, um Zentrosomen zu bilden, und auch für die Bildung von Tochter-Zentriolen (Kemp et al., 2004 Pelletier et al., 2004). SPD-2 ist die am weitesten stromaufwärts liegende Komponente im Zusammenbauweg, da es die Plk4-Kinase an das Mutterzentriol rekrutiert, um die Bildung des Tochterzentrums zu initiieren (Delattre et al., 2006 Pelletier et al., 2006). Alle diese Proteine ​​sind in Vertebraten konserviert und werden intensiv untersucht, um ihre Rolle bei der Zentriol-Zusammensetzung zu verstehen.

Sugiokaet al. Studieren Sie Zentriolen in C. elegans Embryonen mit einer Mutation im Gen, das für SAS-7 kodiert. Während die Entfernung von Proteinen, die für den Zentriolaufbau in Eizellen essentiell sind, bei zweizelligen Embryonen zu monopolaren Spindeln führt, wurden monopolare Spindeln erst im Vierzellstadium in beobachtet sas-7 mutierte Embryonen, die mit Wildtyp-Spermien befruchtet wurden. Dieser neue Phänotyp entsteht, weil sich Tochterzentriolen während des ersten Zellzyklus bilden können. Die neuen Tochterzentriolen trennen sich von ihren Müttern, wenn die erste Teilung abgeschlossen ist und rekrutieren perizentrioläres Material, um Zentrosomen zu bilden. Somit haben beide Zellen des zweizelligen Embryos normale bipolare Spindeln. Den im ersten Zellzyklus neu gebildeten Zentriolen fehlt jedoch die Fähigkeit, sich zu vermehren und keine Töchter zu bilden. Folglich bauen im vierzelligen Embryo die beiden Zellen, die die Spermienzentriolen und ihre Töchter erben, normale bipolare Spindeln zusammen, während die beiden Zellen, die die Zentriolen erben, die während des ersten Zellzyklus im Embryo zusammengebaut wurden, monopolare Spindeln haben (Abbildung 1C, rechts). Säule). Es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu beurteilen, ob die Hemmung anderer Proteine ​​einen ähnlichen Phänotyp verursachen kann (was darauf hindeuten würde, dass sie eine Rolle beim Erwerb der Fortpflanzungsfähigkeit von Tochterzentriolen spielen), was auf eine Rolle beim Erwerb der Fortpflanzungsfähigkeit durch Tochterzentriolen hinweist , da der genomweite RNAi-Screen, der den Großteil des Zentriol-Assemblys identifizierte, nur ein- und zweizellige Embryonen überwachte (Sönnichsen et al., 2005).

Sugiokaet al. verwendet auch Transmissionselektronenmikroskopie, um Zentriolen von Wildtyp- und mutierten Embryonen sichtbar zu machen. Sie fanden heraus, dass die Wildtyp-Zentriolen eine "Schaufelrad" -Struktur hatten, die bei den Zentriolen fehlte, die in der sas-7 Mutante (Abbildung 1B). Ihre Ergebnisse legen nahe, dass SAS-7 für die Bildung dieser Struktur erforderlich ist.

Sugiokaet al. zeigen weiter, dass SAS-7 an Zentriolen lokalisiert und unabhängig von SPD-2 an diese rekrutiert wird. SAS-7 interagiert mit SPD-2 über eine kleine C-terminale Region, die im mutierten Protein fehlt, und die Rekrutierung von SPD-2 zu Zentriolen während der Interphase, wenn sich die Tochterzentriolen bilden, ist im sas-7 Mutant. Interessanterweise ist der Aufbau von perizentriolärem Material bei der Mitose, die auch SPD-2 erfordert, relativ normal, was erklärt, warum sich normale Spindeln in zweizelligen Zellen bilden sas-7 mutierte Embryonen (Abbildung 1C).

Die Ergebnisse von Sugioka et al. weisen darauf hin, dass die Reifung von Tochterzentriolen zwei Ereignisse beinhaltet: (1) Erwerb eines Schaufelrades und die Fähigkeit, SPD-2 während der Interphase zu rekrutieren, was dem Zentriol die Fähigkeit zur Reproduktion verleiht (2) Erwerb der Fähigkeit, SPD-2 zu rekrutieren und während der Mitose perizentrioläres Material zusammenbauen, um ein Zentrosom zu bilden, das den Spindelpol organisieren kann. Für das erste Ereignis ist SAS-7 essentiell, für das zweite jedoch nicht, weshalb Mutationen im Gen für SAS-7 die Duplizierungsfähigkeit der Zentriolen beeinträchtigen, ohne die Bildung des Spindelpols zu verhindern.

SAS-7 scheint das funktionelle Analogon von Cep295 in Vertebraten zu sein. Wie SAS-7 rekrutiert Cep295 das SPD-2-Homolog Cep192 während ihrer Reifung durch eine direkte Interaktion mit seinem C-Terminus an Tochterzentriolen (Tsuchiya et al., 2016). Obwohl Sugioka et al. berichten über keine Sequenzhomologie mit Cep295, sie berichten über eine begrenzte Homologie zwischen SAS-7, a Drosophila Protein namens Chibby und ein menschliches Protein namens Cby2. Chibby und ein Paralog von Cby2 (Cby1) sind an der Umwandlung von Zentriolen in Basalkörperchen beteiligt (Enjolras et al., 2012 Lee et al., 2014), einem Prozess, der eine zentrale Rolle bei der Bildung von Zilien spielt. Diese Ähnlichkeit legt die Möglichkeit nahe, dass die Reifung von Tochterzentriolen und die Beteiligung von Zentriolen an der Zilienbildung ähnliche mechanistische Grundlagen haben könnten.


Was sind Zentriolen?

Die Zelle besteht aus vielen verschiedenen Organellen. Um diese Konzepte besser zu verstehen, stellen Sie sich die Zelle wie den menschlichen Körper vor, und die Organellen sind wie die Organe. Wie jedes Organ in uns haben auch die in Zellen vorhandenen Organellen ihre eigenen einzigartigen Funktionen und Eigenschaften. Diese Mikroeinheiten sind hochspezialisiert und ihr Aufbau entspricht direkt den von ihnen ausgeführten Aufgaben.

Centrioles (Foto: Aldona Griskeviciene/Shutterstock)

Centriolen sind eine der vielen Organellen, die in einer eukaryotischen Tierzelle vorhanden sind. Sie haben eine zylindrische Form mit Rippen auf ihrer gesamten Oberfläche. Sie bestehen hauptsächlich aus einem globulären Protein namens Tubulin, das zwei Hauptkomponenten enthält &ndash&alpha- und &beta-Tubuline.

Diese beiden Arten von Proteinen bündeln sich umeinander und polymerisieren auf spezifische Weise zu Mikrotubuli, die im Wesentlichen Zentriolen darstellen. Mikrotubuli sind, wie der Name schon sagt, kleine Röhren, die sich gruppieren und Zentriolen bilden. In jeder Zentriole befinden sich insgesamt neun Mikrotubuli-Paare und wie bei jeder anderen Zellorganelle ist die Struktur der Zentriolen eng mit ihrer Funktion verbunden. Wir werden in Kürze mehr darüber besprechen.

Jede Zelle hat zwei Zentriolen, kurz bevor die Zellteilung beginnt. Diese stehen immer im rechten Winkel zueinander. Sobald sich die Zelle teilt, nimmt jede Zentriole den Raum innerhalb einer der neuen Zellen ein und teilt sich später, um wieder ein Paar zu bilden.

Dieser Kreislauf setzt sich während des gesamten Lebens des Organismus fort. Zentriolen gelten als Teil einer größeren Organelle, die als Zentrosomen bezeichnet wird. Das Zentrosom ist das wichtigste Organisationszentrum der Mikrotubuli und reguliert den Zellteilungszyklus.


Einführung

Neuronale Polarität wird durch eine Reihe hoch koordinierter Prozesse hergestellt, beginnend mit der Bildung des zukünftigen Axons. Während der Axonspezifikation, dem ersten Schritt der Axonbildung, zeigt einer der mehreren unpolarisierten Neuriten eines Neurons ein starkes Wachstum. Axonales Wachstum hängt entscheidend von der lokalen Reorganisation des Zytoskeletts und der Dynamik der Wachstumskegel ab (Dotti et al., 1988 Witte et al., 2008). Als nächstes durchläuft das neu entwickelte Axon während seiner Reifung eine signifikante Reorganisation, wodurch axonspezifische Kennzeichen angenommen werden, die für seine Funktion erforderlich sind. Ein wesentlicher Bestandteil reifer Axone ist das Axon Initial Segment (AIS), ein spezialisiertes Kompartiment an der Basis des Axons, in dem sich spezifische Proteine ​​(zB AnkG-Gerüste, Mikrotubuli-organisierendes Protein Trim46 und spannungsgesteuerte Natrium- und Kaliumkanäle) ansammeln eine hochorganisierte Art und Weise (Leterrier, 2018 Freal et al., 2019). Das AIS ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität und die Erzeugung von Aktionspotentialen (APs). Die charakteristische Formung und anschließende Ausbreitung von APs wird durch die lokale Clusterung von spannungsgesteuerten Kanälen am AIS (Kole et al., 2008). Ein weiterer besonders wichtiger Aspekt reifer Axone ist ihre einzigartige Mikrotubuli-Organisation. In wachsenden Axonen erfährt das Mikrotubuli-Netzwerk eine umfassende Umgestaltung, da es sich von einer gemischten Mikrotubulus-Polarität zu einer einheitlichen Plus-End-Out-Mikrotubuli-Organisation verschiebt (Yau et al., 2016). Trim46-Proteine, die auf das AIS gerichtet sind, wirken als Regulatoren dieser axonalen Mikrotubuli-Umlagerungen, indem sie parallele Mikrotubuli-Bündel in proximalen Axonen bilden (van Beuningen et al., 2015). Im Gegensatz dazu enthalten Dendriten eine Mikrotubuli-Organisation mit gemischten Polaritäten und gewinnen während der Entwicklung zusätzliche Mikrotubuli am Minus-Ende. Dieser markante Unterschied in der Mikrotubuli-Organisation zwischen Axonen und Dendriten ist für die neuronale Entwicklung und Funktion von wesentlicher Bedeutung, da er zum polarisierten Ladungstransport und der charakteristischen neuronalen Morphologie beiträgt (Baas et al., 1988 Yau et al., 2016). Während jedoch die Mikrotubuli-Remodellierung in wachsenden Axonen für die Axonspezifikation und -entwicklung wichtig ist, bleiben die Mechanismen, die diese Mikrotubulus-Zytoskelett-Umordnungen antreiben, weitgehend ungeklärt.

Zentrosomen, das wichtigste Mikrotubuli-organisierende Zentrum (MTOC) in den meisten tierischen Zellen, sind für die Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks in unpolarisierten Neuronen essentiell (Tsai & Gleeson, 2005 Stiess et al., 2010 et al., 2020). Diese kleinen, membranlosen und zentral lokalisierten Organellen bestehen aus zwei Zentriolen, die von perizentriolärem Material (PCM) umgeben sind (Moritz et al., 2000). Die meisten Mikrotubuli werden typischerweise aus γ-Tubulin-Ringkomplexen (γTuRCs) gebildet, die in das PCM eingebettet sind (Moritz et al., 2000). Während der neuronalen Entwicklung verlieren Zentrosomen nach und nach ihre Funktion als MTOC, während Zilien, die wichtigsten Signalknoten in polarisierten Zellen, gebildet werden (Stiess et al., 2010 Ishikawa & Marshall, 2011). In dissoziierten Nagetierneuronen wurde berichtet, dass dieser Prozess während der Axonentwicklung stattfindet, aber die genaue zeitliche Beziehung zwischen der Axonspezifikation und der abnehmenden MTOC-Funktion der Zentrosomen ist unklar (Stiess et al., 2010). Die Bedeutung der Zentrosomfunktion für die frühe neurologische Entwicklung wird durch die zunehmende Anzahl identifizierter Mutationen in zentrosomalen Proteinen veranschaulicht, die Mikrozephalie und andere neurologische Entwicklungsstörungen verursachen (Nano & Basto, 2017). Die genaue Funktion von Zentrosomen als MTOC für verschiedene Prozesse der frühen Axonentwicklung wird jedoch noch diskutiert.

Fortschritte beim Verständnis der Rolle von Zentrosomen während der Axonspezifikation wurden aufgrund einer Reihe technischer Herausforderungen behindert. Insbesondere wurde festgestellt, dass Zentrosomen unterschiedliche Funktionen in der neuronalen Entwicklung bei verschiedenen Spezies aufweisen, was zu widersprüchlichen Ergebnissen führt. Dies wird vor allem durch die schlechte Rekapitulation menschlicher neurologischer Entwicklungsstörungen veranschaulicht, die durch Zentrosom-Dysfunktion in verursacht werden Drosophila und Mäusen, während Frettchen diese Krankheiten robust modellieren (Basto et al., 2006 Castellanos et al., 2008 Pulver et al., 2010 Johnson et al., 2018). Das Axonwachstum kann auch durch Zentrosomen unterschiedlich beeinflusst werden, da dieser Prozess bei Mäusen und peripheren Axonen von Zebrafischen durch Zentrosomendysfunktion gestört wird, nicht jedoch bei dissoziierten Nagetierneuronen und zentralen Axonen von Zebrafischen (de Anda et al., 2010 Stiess et al., 2010 Andersen & Halloran, 2012). Die molekularen Mechanismen, die den beobachteten speziesspezifischen Unterschieden zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt. Eine weitere technische Herausforderung stellen dissoziierte Nagetierneuronen in Kultur dar, die klassischerweise zur Untersuchung von Axonentwicklungsprozessen verwendet werden, da sie nach der Polarisierung wahrscheinlich einer Repolarisation unterliegen in vivo eher, als de novo Polarisierung (Barnes & Polleux, 2009). Zusammen unterstreicht dies die Bedeutung der Untersuchung der Rolle von Zentrosomen in de novo Polarisation mit menschlichen Neuronen. Die Entwicklung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) ermöglicht nun die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die den Übergang einer unpolarisierten humanen neuronalen Stammzelle zu einem polarisierten humanen Neuron (Lancaster et al., 2013). Ein weiteres wichtiges Merkmal menschlicher Neuronen ist ihre deutlich protrahierte Entwicklung, die eine genauere Untersuchung der zeitlichen Prozesse ermöglicht, die der neuronalen Polarität zugrunde liegen (Otani et al., 2016 Linaro et al., 2019). Um dies zu veranschaulichen, erfolgt die Neurogenese nach

1 Woche bei Nagetieren, wobei dies ca. dauert

3 Monate beim Menschen, beides in vivo und in vitro (Schi et al., 2012 Espuny-Camacho et al., 2013 et al., 2016 Sousa et al., 2017). Diese tiefgreifend langsamere Entwicklung von menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen erhöht die zeitliche Auflösung, um axonale Prozesse zu untersuchen, was kürzlich zur Identifizierung eines zusätzlichen Axon-Entwicklungsstadiums in menschlichen Neuronen geführt hat (Espuny-Camacho et al., 2013 Lindhou et al., 2020 et al., 2016 Linaro, 2019 #9). Insgesamt unterstreicht dies die Bedeutung der Untersuchung von Zentrosomenfunktionen während der Axonentwicklung in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen als Modellsystem.

In dieser Studie verwendeten wir einen multidisziplinären Ansatz, indem wir humane iPSC-abgeleitete Neuronenkulturen mit Live-Cell-Imaging, Elektrophysiologie und Massenspektrometrie-Analyse kombinierten, um die Rolle von Zentrosomen während der frühen Axonentwicklung zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Zentrosomen während der Axonspezifikation Mikrotubuli-organisierende Funktionen aufweisen, ähnlich wie nicht-menschliche Neuronen, und diese Funktion geht während der weiteren Axonentwicklung allmählich verloren. Insbesondere in menschlichen Neuronen verschiebt sich die Trim46-Lokalisierung während der Neuronenentwicklung von einer perizentriolären Region zum AIS, was mit dem entwicklungsbedingten Rückgang der zentrosomalen Mikrotubuli-organisierenden Funktionen zusammenfällt. Die Differenzierung von Zentriol-depletierten neuronalen Stammzellen (NSCs) führt zu verschiedenen axonalen Entwicklungsdefekten in menschlichen Neuronen, einschließlich unausgereifter Aktionspotentialauslösung, Fehllokalisierung von Trim46-Proteinen, Wachstumskegelstörungen und beeinträchtigter axonaler Mikrotubuli-Remodellierung. Zusammen implizieren diese Daten, dass Zentrosomen während der Axonspezifikation in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen die Mikrotubuli-Remodellierung vermitteln, die für die korrekte Axonbildung während der weiteren Entwicklung notwendig ist.


Ergebnisse

Zentrosomen zeigen Mikrotubuli-organisierende Funktionen während der Axonspezifikation

Das Zentrosom ist der primäre Ort für die Mikrotubuli-Nukleation und -Verankerung während der frühen Neuroentwicklung, und diese Funktion nimmt allmählich ab, wenn die Neuronen reifen (Abb. 1A) (Stiess et al., 2010). Um die Rolle von Zentrosomen während der frühen Axonentwicklung in menschlichen Neuronen zu verstehen, haben wir untersucht, ob Zentrosomen während dieses Entwicklungsprozesses in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen Mikrotubuli-organisierende Funktionen aufweisen. Um dies anzugehen, haben wir die Mikrotubuli-Keimbildungskapazität von Zentrosomen während der Entwicklung getestet, indem wir die endogenen Spiegel von lokalem γ-Tubulin, einem essentiellen Mikrotubuli-Keimbildungsprotein, in verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen haben. Die neurologischen Entwicklungsstadien wurden wie folgt definiert: Stadium 1 (Tag 0) als Ki67-positive NSCs Stadium 2 (Tag 7) als differenzierte unpolarisierte MAP2-positive Neuronen mit Trim46-negativen Fortsätzen Stadium 3 (Tag 12) als differenziert polarisierte MAP2-positive Neuronen mit einem Trim46-positiven Axon (Abb. 1B). Wir identifizierten Zentrosomen mit dem Zentriol-Marker Centrin und quantifizierten die Intensitätsniveaus von γ-Tubulin, die sich mit Centrin kolokalisieren (Abb. 1B). Die γ-Tubulin-Spiegel an den Zentrosomen waren in den Neuronen der Stufe 1 und 2 konstant hoch und um . deutlich reduziert

50 % in Neuronen der Stufe 3, im Einklang mit früheren Befunden in dissoziierten Rattenneuronen (Abb. 1B und C) (Stiess et al., 2010). Um diese Ergebnisse zu verifizieren, führten wir als nächstes eine hochauflösende 3D-STED-Bildgebung durch, um das dichte neuronale Mikrotubulus-Netzwerk aufzulösen, und beobachteten, dass sich das Mikrotubulus-Netzwerk während der anfänglichen Neuroentwicklung von einer radialen Organisation in eine nicht-radiale Organisation verwandelte (Abb. 1D). Dieser Übergang markiert den Rückgang der Mikrotubuli-organisierenden Funktionen der Zentrosomen und korreliert mit dem Beginn der Axonentwicklung. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Zentrosomen Mikrotubuli-organisierende Funktionen während der frühen Entwicklungsstadien von menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen aufweisen, die den Prozess der Axonspezifikation einschließen, jedoch nicht in späteren Stadien.

Abbildung 1. Zentrosomen zeigen die MTOC-Funktion und das Trim46-Erscheinungsbild während der Axonspezifikation

  • A. Schematische Darstellung der zentrosomalen MTOC-Funktion in den neuronalen Entwicklungsstadien 1, 2 und 3 in humanen iPSC-abgeleiteten NSCs/Neuronen.
  • B. Typische Beispiele für Stadium 1 (Tag 0), Stadium 2 (Tag 7) und Stadium 3 (Tag 12) von humanen iPSC-abgeleiteten NSCs/Neuronen, die für -Tubulin und Centrin immungefärbt sind, markiert durch Pfeile. Die Zellen wurden mit Ki67 und DAPI (Tag 0) oder Trim46 und MAP2 (Tag 7 und 12) koimmungefärbt, um ihre neuronalen Stadien zu definieren. Pfeilspitzen markieren das AIS. Maßstabsbalken = 10 µm im Überblick, 2 µm im Zoom.
  • C. Quantifizierungen normalisierter -Tubulin-Fluoreszenzintensitäten an Zentrosomen in Stufe 1, 2 und 3 von humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen. n = 46–51 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • D. 3D-STED-Bildgebung von α-Tubulin in Stadium 1 (Tag 0), Stadium 2 (Tag 7) und Stadium 3 (Tag 13) von hiPSC-abgeleiteten Neuronen. Maßstabsbalken = 5 µm im Überblick, 1 µm im Zoom.
  • E. Humane iPSC-abgeleitete NSCs (Tag 0) immungefärbt für Trim46, γ-Tubulin und Centrin. Zoom repräsentiert die Zentrosomenstruktur. Maßstabsbalken = 5 µm im Überblick, 2 µm im Zoom.
  • F. Typische Beispiele für Zentrosomen von humanen iPSC-abgeleiteten NSCs (Tag 0) mit STED-Bildgebung von Trim46- und Centrin-Immunfärbung und konfokaler Bildgebung von γ-Tubulin-Immunfärbung. Maßstabsbalken = 1 µm.
  • G. Typische Beispiele von humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen der Stufe 2 und 3, die für Trim46 und MAP2 immungefärbt wurden. Inserts repräsentieren Zentrosomen. Die Zooms auf der rechten Seite repräsentieren einen nicht polarisierten Neurit oder ein sich entwickelndes Axon in Neuronen der Stufe 2 bzw. Stufe 3. Maßstabsbalken = 20 µm im Überblick, 1 µm im Insert, 10 µm im Zoom.

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Einweg-ANOVA einschließlich post hoc Analyse mit Bonferroni-Korrektur (C). ***P < 0,001, ns P ≥ 0.05.

Zentrosom-assoziierte Lokalisation des AIS-Proteins Trim46 in menschlichen Neuronen im Frühstadium

Ein wichtiges Kennzeichen der Axonentwicklung ist die Montage des AIS im proximalen Axon, die nach dem entwicklungsbedingten Rückgang der Mikrotubuli-organisierenden Funktion von Zentrosomen in dissoziierten Hippocampusneuronen der Ratte auftritt (Stiess et al., 2010). In menschlichen Neuronen beobachteten wir, dass das AIS-Protein Trim46 während der frühen Neuroentwicklung (Stadium 1–2) an Zentrosomen lokalisiert war, wie durch die Co-Lokalisierung von Trim46 mit den Zentrosomenmarkern Centrin und γ-Tubulin in hiPSC-abgeleiteten NSCs gezeigt wird (Abb. 1E ). In ähnlicher Weise wurde eine Zentrosom-assoziierte Lokalisierung von Trim46 in menschlichen HeLa-Zellen beobachtet, jedoch nicht in dissoziierten Hippocampus-Neuronen der Ratte oder IMCD3-Zellen der Maus (Fig. EV1A). Die humanspezifische Anreicherung von Trim46 an Zentrosomen wird durch zwei zusätzliche Antikörper bestätigt, die Trim46 an Zentrosomen in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen, aber nicht in primären Rattenneuronen nachweisten (Abb. EV1B). Frühere Studien zeigten, dass Trim46 ein Mikrotubuli-bindendes Protein ist, eine mögliche Assoziation mit zentrosomalen Proteinen oder Strukturen wurde jedoch nicht berichtet (van Beuningen et al., 2015). Wir versuchten herauszufinden, welche Centrosom-Substruktur mit zentrosomalen Trim46-Strukturen übereinstimmt. Lokalisierungsexperimente durch konfokale Mikroskopie zeigten, dass Trim46 als ovale Struktur erschien, die sich nur teilweise mit den durch Centrin bzw. γ-Tubulin markierten zentriolären und perizentriolären Strukturen überlappte (Abb. 1E). Um tiefere strukturelle Einblicke zu gewinnen, lösten wir zentrosomale Trim46-Strukturen durch STED-Mikroskopie und beobachteten, dass Trim46 als Wolke von Puncta erschien, die γ-Tubulin-Strukturen umgab, aber nicht mit diesen überlappte (Abb. 1F). In allen Zellen beobachteten wir eine konsistente Anordnung von Trim46 punctae, die γ-Tubulin umgaben, die wiederum Centrin punctae umgaben, die den Zentriolkern darstellen. Die γ-Tubulin-Strukturen markieren die äußere Schicht des perizentriolären Materials sowie die Nukleationsstellen der Mikrotubuli am Minus-Ende, was darauf hindeutet, dass Trim46 sich in der Nähe der Startpunkte zentrosomaler Mikrotubuli (Mennella et al., 2012). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass Trim46 speziell in menschlichen Zellen an Zentrosomen-assoziierten Strukturen lokalisiert ist.

Abbildung EV1. Die Trim46-Lokalisierung verschiebt sich von Zentrosomen zu axonalen und peripheren Mikrotubuli in menschlichen Neuronen bzw. Gliazellen

  • A. Typische Beispiele für humane iPSC-abgeleitete NSCs (Tag 0), HeLa-Zellen, primäre dissoziierte Rattenneuronen (Tag 0) und Maus-IMCD3-Zellen, die für Trim46 und Centrin immungefärbt und gegebenenfalls mit Nestin oder α-Tubulin koimmungefärbt wurden. Inserts repräsentieren Zentrosomen. Maßstabsbalken = 10 µm in der Übersicht, 2 µm in den Einsätzen.
  • B. Typische Beispiele für Trim46-Antikörper SySy337003 (#03) und SySy337005 (#05) in hiPSC-abgeleiteten Neuronen (Tag 7) und primären Rattenneuronen (Tag 7). Inserts repräsentieren Zentrosomen. Maßstabsbalken = 20 µm in der Übersicht, 1 µm in den Einsätzen.
  • C. Typische Beispiele für verschiedene Reifungsstadien von menschlichen iPSC-abgeleiteten Gliazellen (Tag 17), die für Trim46, Centrin und &agr;-Tubulin immungefärbt wurden. Zooms repräsentieren Zentrosomen. Maßstabsbalken = 20 µm im Überblick, 1 µm im Zoom.

Die Trim46-Lokalisierung verschiebt sich während der Entwicklung von Zentrosomen zu axonalen Mikrotubuli

Die Untersuchung der Lokalisation von Trim46 im Laufe der Zeit in menschlichen Neuronen ergab einen deutlichen Rückgang der Trim46-Färbung in der perizentriolären Region, während die Intensität der axonalen Trim46-Spiegel während der Entwicklung zunahm. Genauer gesagt blieben die perizentriolären Trim46-Spiegel in Neuronen des Stadiums 2 hoch und waren in Neuronen des Stadiums 3 deutlich erniedrigt, dem gleichen Trend folgend, der bei γ-Tubulin gefunden wurde ( 1G ). Konsequenterweise beobachteten wir eine ähnliche Verschiebung der Trim46-Färbung von Zentrosomen zu dichten peripheren Mikrotubuli-Arrays in reifenden humanen iPSC-abgeleiteten Gliazellen, die in geringen Mengen in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronenkulturen vorhanden sind (Abb. EV1C). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass sich die Trim46-Lokalisierung während der Neuroentwicklung von der perizentriolären Region zu peripheren axonalen Mikrotubuli-Arrays verschiebt.

Centrinon-B-Behandlung erschöpft Zentriolen in neuronalen Stammzellen

Um die Wirkung der Zentrosomdysfunktion auf die Axonspezifikation zu untersuchen, wollten wir als nächstes Zentriolen in humanen iPSC-abgeleiteten NSCs unter Verwendung des pharmakologischen PLK4-Inhibitors Centrinone-B entfernen. Der effiziente und robuste Zentriolverlust durch Centrinon-B-Behandlung wurde zuvor in verschiedenen anderen Zelltypen (Wong et al., 2015). Durch die Hemmung von PLK4 blockiert Centrinon-B die Zentriol-Duplikation während der Zellteilung in proliferierenden Zellen, wodurch eine gemischte Population von Zellen erzeugt wird, die 0, 1 oder 2 Zentriolen enthält. Wir behandelten humane iPSC-abgeleitete NSCs 0, 2 oder 5 Tage lang mit Centrinon-B vor der neuronalen Induktion und quantifizierten die Anzahl der Centriolen pro Zelle. Centriolen wurden als Puncta mit überlappender Färbung von Pericentrin und Centrin definiert (Fig. 2A). Wir beobachteten eine erfolgreiche Entfernung von entweder 1 oder 2 Zentriolen in

50% der NSCs nach 2 Tagen Centrinon-B-Behandlung (Abb. 2B). Dies wurde nach einer verlängerten 5-tägigen Behandlung mit Centrinone-B nicht signifikant verstärkt, wahrscheinlich weil die Zellen während dieser Zeit eine vorzeitige neuronale Differenzierung und damit den Austritt des terminalen Zellzyklus durchliefen. Die Behandlung mit Centrinon-B erhöhte die Anzahl der Zellen mit einer charakteristischen neuronenähnlichen Morphologie, noch bevor die neuronale Differenzierung eingeleitet wurde. Dieser Phänotyp der vorzeitigen neuronalen Differenzierung ist ein gut beschriebenes Kennzeichen der Zentrosom-Dysfunktion in verschiedenen in vivo oder 3D in vitro und es liegt der Mikrozephalie und anderen neurologischen Entwicklungsstörungen zugrunde (Lancaster et al., 2013). Wir fanden signifikant mehr Neuronen nach 2 Tagen Centrinone-B-Behandlung, gemessen als relative Anzahl von Zellen, die positiv für die Neuronendifferenzierungsmarker MAP2 oder β3-Tubulin oder den Proliferationsmarker Ki67 waren (Abb. EV2A–E-EV2A–E). Zusammen zeigen diese Daten, dass die Behandlung mit Centrinon-B zu einer erfolgreichen Depletion von Zentriolen in menschlichen iPSC-abgeleiteten neuronalen Zellen führt und dass sie neuronale Entwicklungsphänotypen rekapituliert, die allgemein mit Zentrosom-Defekten assoziiert sind.

Abbildung 2. Centriolenverlust in NSCs stört nachfolgendes axonales Trim46-Targeting und die Reifung des Aktionspotenzials

  • A. Typische Beispiele von Centrinon-B-behandelten oder Kontroll-humanen iPSC-abgeleiteten NSCs, die für Pericentrin und Centrin immungefärbt wurden. Einsätze stellen Zentriol(en) dar. Maßstabsbalken = 5 µm in der Übersicht, 2 µm in den Einsätzen.
  • B. Quantifizierung des Prozentsatzes von Zellen mit 0, 1 oder 2 Centriolen pro Zelle nach 0 (Kontrolle), 2 oder 5 Tagen Centrinon-B-Behandlung und vor der neuronalen Induktion. n = 48–51 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • C. Typische Beispiele von Centrinon-B-behandelten oder Kontroll-menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen (12–15 Tage), die für AnkG, Trim46, MAP2 und Centrin immungefärbt wurden. Pfeilspitzen markieren AIS-Strukturen, Pfeile markieren Zentrosomen. Inserts repräsentieren Zentrosomen, Zooms auf der rechten Seite repräsentieren AIS-Strukturen. Maßstabsbalken = 20 µm im Überblick, 2 µm im Insert, 10 µm im Zoom.
  • D. Quantifizierung des Prozentsatzes menschlicher iPSC-abgeleiteter Neuronen (12–15 Tage), die mit Centrinone-B behandelt wurden, das einen Trim46-positiven oder Trim46-negativen Prozess enthält. Neuronen werden basierend auf der Centrin-Immunfärbung in Populationen mit 2 Centriolen oder weniger als 2 Centriolen unterteilt. n = 31–53 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • E. Quantifizierung des Prozentsatzes menschlicher iPSC-abgeleiteter Neuronen (12–15 Tage), die mit Centrinon-B behandelt wurden, das einen AnkG-positiven oder AnkG-negativen Prozess enthält. Neuronen werden basierend auf der Centrin-Immunfärbung in Populationen mit 2 Centriolen oder weniger als 2 Centriolen unterteilt. n = 27–32 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • F. Quantifizierung des Prozentsatzes menschlicher iPSC-abgeleiteter Neuronen (12–15 Tage), die mit Centrinone-B behandelt wurden, die AnkG-positive Prozesse enthalten, die Trim46-positiv oder Trim46-negativ sind. Neuronen werden basierend auf der Centrin-Immunfärbung in Populationen mit 2 Centriolen oder weniger als 2 Centriolen unterteilt. n = 27 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • G. Oberteil: Schematische Darstellung des experimentellen elektrophysiologischen Aufbaus. Um die Frequenz des Aktionspotentials (AP) zu bestimmen, wurden somatische Strominjektionen von -10 pA bis 50 pA (Schritte von 5 pA, 400 ms) angewendet. Unterseite: Repräsentatives Beispiel für evozierte AP-Feuer in einem Centrinon-B-behandelten menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuron, Reaktion auf hyperpolarisierende und die ersten beiden depolarisierenden Stromschritte, aufgezeichnet an Tag 13.
  • H. Neuronale Erregbarkeit wurde in 54/61 Kontrollzellen und 53/54 Centrinon-B-behandelten Zellen aufgezeichnet. Prozentsatz der Zellen, die keine, einen oder mehrere APs in der Kontrolle abfeuern (4 unabhängige Experimente ohne AP: n = 2, Einzel-AP: n = 32, mehrere APs: n = 22) versus mit Centrinon-B behandelte Kulturen (3 unabhängige Experimente ohne AP: n = 9, Einzel-AP: n = 34, mehrere APs: n = 10).
  • I. Repräsentative Beispiele für evoziertes AP-Feuern in Centrinone-B-behandelten menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen, aufgezeichnet am 11. ein Neuron, das mehrere APs feuert. Der Offsetstrom (Ihalt) wurde so eingestellt, dass das Grundlinienmembranpotential bei ungefähr –60 mV (gestrichelte Linien) gehalten wurde.
  • J. Streudiagramme der AP-Amplitude gegen die AP-Halbwertsbreite, gruppiert nach Tagen nach der Plattierung für Centrinon-B-behandelt (10–11 Tage: n = 14 Zellen in einem unabhängigen Experiment, 13–14 Tage: n = 28 Zellen in drei unabhängigen Experimenten) und Kontrolle (7 Tage: n = 7 Zellen, 10–11 Tage: n = 15 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten, 13–14 Tage: n = 36 Zellen in vier unabhängigen Experimenten) menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen.
  • K. Phasendiagramme eines repräsentativen AP eines menschlichen iPSC-abgeleiteten Neurons, das mit Centrinon-B behandelt wurde, und eines Kontrollneurons von 13 bzw. 14 Tagen.
  • L. AP-Halbwertsbreite aufgezeichnet in Centrinon-B-behandelt (n = 43 Zellen in drei unabhängigen Experimenten) und kontrollieren menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen (n = 59 Zellen in vier unabhängigen Experimenten).
  • M. AP-Schwelle, Amplitude und Nach-Hyperpolarisation aufgezeichnet in mit Centrinon-B behandelten (n = 43 Zellen in drei unabhängigen Experimenten) und Kontrollen von humanen iPSC-abgeleiteten Neuronenkulturen (n = 59 Zellen in vier unabhängigen Experimenten).
  • N. Links oben: Schematische Darstellung des Spannungsrampenprotokolls, das verwendet wurde, um das maximale Natriumstrom-Membranpotential zu bestimmen, wurde in 400 ms von -100 mV auf 200 mV geändert. Links unten: Repräsentatives Beispiel des maximalen Natriumpeaks, der von einem Kontrollneuron an Tag 13 aufgezeichnet wurde. Rechts: Maximaler Natriumpeak in Centrinon-B-behandelt (n = 52 Zellen in drei unabhängigen Experimenten) und kontrollieren menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen (n = 48 Zellen in drei unabhängigen Experimenten).

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Chi-Quadrat-Test inklusive post hoc Analyse mit Bonferroni-Korrektur (B, D, E, F) Mann-Whitney-Test (L, M: Nach-Hyperpolarisation, N), Student’s T-Test (M: Schwellenwert, AP-Amplitude). ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Abbildung EV2. Zentriolverlust stört das axonale Trim46-Targeting und die Aktionspotential-Reifung

  • A. Typische Beispiele von humanen iPSC-abgeleiteten NSCs/Neuronen (Tag 3) mit 0 (Kontrolle) oder 3 Tagen Centrinon-B-Behandlung und immungefärbt für Ki67, β3-Tubulin und MAP2. Maßstabsbalken = 15 µm im Überblick.
  • B. Quantifizierung des Verhältnisses MAP2-positiv/Ki67-positiv Centrinon-B-behandelte oder Kontroll-humane iPSC-abgeleitete NSCs/Neuronen an Tag 1, 3 und 5. n = 54–110 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • C. Quantifizierung des Verhältnisses β3-Tubulin-positiv/Ki67-positiv Centrinon-B-behandelte oder Kontroll-humane iPSC-abgeleitete NSC/Neuronen an Tag 1, 3 und 5. n = 49–104 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • D. Quantifizierung des Prozentsatzes von MAP2-positiven Centrinon-B-behandelten oder Kontroll-menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen an Tag 1, 3 und 5. n = 121–165 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • E. Quantifizierung des Prozentsatzes von β3-Tubulin-positiven Centrinon-B-behandelten oder Kontroll-menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen an Tag 1, 3 und 5. n = 121–165 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • F. Quantifizierung des Prozentsatzes von Kontroll- und Centrinon-B-behandelten humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen (12–14 Tage) mit 0, 1 oder 2 Zentriol(en) und unterteilt in Populationen von Neuronen, die ein Trim46-positives oder ein Trim46 . enthalten -negativer Prozess. n = 30 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • G. Typische Beispiele von humanen iPSC-abgeleiteten NSCs, die mit CRISPR/Cas9-Kontrolle oder SAS6 KO-Lentivirus transduziert und für -Tubulin und Centrin immungefärbt wurden. Einsätze stellen Zentriol(en) dar. Maßstabsbalken = 5 µm in der Übersicht, 2 µm in den Einsätzen.
  • H. Quantifizierung des Prozentsatzes von Zellen mit 0, 1 oder 2 Centriolen pro Zelle nach Transduktion mit CRISPR/Cas9-Kontrolle oder SAS6 KO-Lentivirus am Tag 5 und vor neuronaler Induktion. n = 65–147 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • I. Typische Beispiele für humane iPSC-abgeleitete Neuronen (15 Tage, neuronale Induktion an Tag 5), die mit CRISPR/Cas9-Kontrolle oder SAS6 KO-Lentivirus transduziert und für Trim46 immungefärbt wurden. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • J.Quantifizierung des Prozentsatzes menschlicher iPSC-abgeleiteter Neuronen (Tag 15, neuronale Induktion an Tag 5), die einen Trim46-positiven oder Trim46-negativen Prozess nach Transduktion mit CRISPR/Cas9-Kontrolle oder SAS6 KO-Lentivirus enthalten. n = 280–354 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • K. Western-Blot von Zelllysaten aus humanen iPSC-abgeleiteten Kontrollneuronen oder Centrinon-B-behandelten Neuronen, gefärbt auf TRIM46 und Actin.
  • L. Quantifizierung des Prozentsatzes menschlicher iPSC-abgeleiteter Neuronen (Tag 11), die einen Trim46-positiven oder Trim46-negativen Prozess mit oder ohne Centrinon-B-Behandlung nach neuronaler Differenzierung (Tag 5) enthalten. n = 51 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • M. Quantifizierung des Prozentsatzes menschlicher iPSC-abgeleiteter Neuronen (Tag 11), die AnkG-positive Prozesse enthalten, die Trim46-positiv oder Trim46-negativ sind. n = 51–53 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • N. AP-Amplitude aufgezeichnet in Centrinone-B-behandelten und Kontroll-Neuronen aus humanen iPSC von 10–11 Tagen (Kontrolle: n = 15 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten +Centrinon-B: n = 14 Zellen in einem unabhängigen Experiment) und 13–14 Tage (Kontrolle: n = 36 Zellen in vier unabhängigen Experimenten, +Centrinon-B: n = 27 Zellen in drei unabhängigen Experimenten).
  • O. AP-Halbwertsbreite, aufgezeichnet in Centrinone-B-behandelten und Kontroll-menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen von 10–11 Tagen (Kontrolle: n = 15 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten +Centrinon-B: n = 14 Zellen in einem unabhängigen Experiment) und 13–14 Tage (Kontrolle: n = 36 Zellen in vier unabhängigen Experimenten, +Centrinon-B: n = 27 Zellen in drei unabhängigen Experimenten).
  • P. Ruhemembranpotential von Centrinon-B-behandelt (n = 54 Zellen in drei unabhängigen Experimenten) und Kontrolle (n = 64 Zellen in vier unabhängigen Experimenten) menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen.
  • Q. Eingaberesistent von Centrinon-B-behandelt (n = 54 Zellen in drei unabhängigen Experimenten) und Kontrolle (n = 63 Zellen in vier unabhängigen Experimenten) menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen.
  • R. AP-Amplitude, aufgezeichnet in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen mit oder ohne Centrinon-B-Behandlung nach neuronaler Differenzierung (Kontrolle: n = 17 Zellen in drei unabhängigen Experimenten, +Centrinon nach Differenzierung: n = 16 Zellen in drei unabhängigen Experimenten).
  • S. AP-Halbwertsbreite, aufgezeichnet in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen mit oder ohne Centrinon-B-Behandlung nach neuronaler Differenzierung (Kontrolle: n = 17 Zellen in drei unabhängigen Experimenten, +Centrinon nach Differenzierung: n = 16 Zellen in drei unabhängigen Experimenten).

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Chi-Quadrat-Test inklusive post hoc Analyse mit Bonferroni-Korrektur (D, E, H, J, L, M) Schüler T-Test (N: Kontrolle vs. Centrinon-B, 10–11 vs. 13–14 Tage, S) Mann-Whitney-Test (O: Kontrolle vs. Centrinon, 10–11 vs. 13–14 Tage, P, Q, R). ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Abbildung EV3. Entwicklungsproteomdynamik nach Zentriolverlust

  • A. Korrelative Matrix biologischer Replikate von Kontrollneuronen oder Centrinon-B (Cent-B)-behandelten Neuronen, die für die Proteomanalyse verwendet werden.
  • B. Korrelative Analyse der relativen Proteinexpression in Kontrollneuronen an Tag 7 bis Tag 3 und Tag 1. Spezifische Stammzellmarker (blau), Neuronenmarker (gelb) und Axonmarker (rot) sind hervorgehoben.
  • C. Korrelative Analyse der relativen Proteinexpression in Centrinon-B-behandelten Neuronen an Tag 7 bis Tag 3 und Tag 1. Spezifische Stammzellmarker (blau), Neuronenmarker (gelb) und Axonmarker (rot) sind hervorgehoben.
  • D. Verhältnisse der relativen Proteinexpression an Tag 1, 3 und 7 und kalibriert auf Tag 1 für Stammzellproteine, Neuronenproteine ​​und Axonproteine.
  • E. Quantifizierung der Gesamt-Phalloidin-Intensität in einem fächerartigen Wachstumskegel an Tag 5 und Tag 9. n = 71–80 Wachstumskegel in zwei unabhängigen Experimenten.

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM.

Abbildung EV4. Zentriolverlust hemmt Mikrotubuli-Remodeling während der frühen Axonentwicklung

  • A. Kymogramme und schematische Darstellungen von Zeitrafferaufnahmen des proximalen Axons für verschiedene Zeitpunkte (Tag 7 Tag 13) und Bedingungen (Kontroll-Centrinone-B). Maßstabsbalken = 5 µm.
  • B. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 7 im proximalen Axon eine gleichmäßige oder ungleichmäßige Kometenorientierung in anterograder Richtung aufweisen. n = 13–14 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • C. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 13 im proximalen Axon eine gleichmäßige oder ungleichmäßige Kometenorientierung in anterograder Richtung aufweisen. n = 12–17 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • D. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich an Tag 7 und Tag 13 in anterograde Richtung im proximalen Axon bewegen. n = 12–17 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • E. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich an Tag 7 und Tag 13 in retrograder Richtung im proximalen Axon bewegen. n = 12–17 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • F. Kymographen und schematische Darstellungen von Zeitrafferaufnahmen des Dendriten für verschiedene Zeitpunkte (Tag 7 Tag 13) und Bedingungen (Kontroll-Centrinon-B). Maßstabsbalken = 5 µm.
  • G. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 7 im Dendriten eine gleichmäßige oder ungleichmäßige Kometenorientierung in anterograder Richtung aufweisen. n = 12–13 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • H. Quantifizierung des Prozentsatzes an Neuronen, die am Tag 13 im Dendriten eine einheitliche oder nicht einheitliche Kometenorientierung in anterograder Richtung aufweisen. n = 13–16 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • I. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich an Tag 7 und Tag 13 in anterograde Richtung im Dendriten bewegen. n = 12–16 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • J. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich an Tag 7 und Tag 13 in retrograder Richtung im Dendriten bewegen. n = 12–16 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • K. Kymogramme und schematische Darstellungen von Zeitrafferaufnahmen des proximalen Axons nach LS für verschiedene Zeitpunkte (Tag 7 Tag 13) und Bedingungen (Kontroll-Centrinone-B). Rote Linie und rote Pfeilspitze bezeichnen Ort und Zeit von LS. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • L. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 7 nach LS eine gleichförmige oder ungleichförmige Kometenorientierung in anterograder Richtung im proximalen Axon aufweisen. n = 20–21 Neuronen in drei unabhängigen Experimenten.
  • M. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 13 nach LS eine gleichförmige oder ungleichförmige Kometenorientierung in anterograder Richtung im proximalen Axon aufweisen. n = 22–25 Neuronen in drei unabhängigen Experimenten.
  • N. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich an Tag 7 und Tag 13 in anterograde Richtung im proximalen Axon nach LS bewegen. n = 20–25 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • O. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich nach LS an Tag 7 und Tag 13 in retrograder Richtung im proximalen Axon bewegen. n = 20–25 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • P. Kymogramme und schematische Darstellungen von Zeitrafferaufnahmen des Dendriten nach LS für verschiedene Zeitpunkte (Tag 7 Tag 13) und Bedingungen (Kontroll-Centrinon-B). Rote Linie und rote Pfeilspitze bezeichnen Ort und Zeit von LS. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • F. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich in anterograder Richtung im Dendriten nach LS an Tag 7 und Tag 13 bewegen. n = 20–26 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • R. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich in retrograder Richtung im Dendriten nach LS an Tag 7 und Tag 13 bewegen. n = 20–26 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • S. Quantifizierungen des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 13 für unterschiedliche Bedingungen (Kontroll-Centrinon-B-Zugabe nach Differenzierung am Tag 5) gleichförmige oder ungleichmäßige Kometenorientierungen in anterograder Richtung im distalen Axon aufweisen. n = 21–23 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • T. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die im distalen Axon an Tag 13 in anterograde Richtung zeigen, für verschiedene Bedingungen (Kontrolle Centrinon-B-Zugabe nach Differenzierung an Tag 5). n = 21–23 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.
  • U. Quantifizierung der Anzahl von Kometen pro Minute, die im distalen Axon am Tag 13 in retrograder Richtung zeigen, für verschiedene Bedingungen (Kontrolle Centrinon-B-Zugabe nach Differenzierung am Tag 5). n = 21–23 Zellen in zwei unabhängigen Experimenten.

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Chi-Quadrat-Test (B, C, G, H, L, M, S), ungepaart T-test (D, E, I, J, N, O, Q, R, T, U) **P < 0,005, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Zentriolverlust stört das axonale Targeting von Trim46

Als nächstes fragten wir, ob diese Zentriol-defizienten und vorzeitig differenzierten Neuronen bei der Behandlung mit Centrinon-B einem normalen Entwicklungstiming folgen und funktionelle Axone wachsen. Um die Rolle von Zentrosomen bei der Axonspezifikation zu untersuchen, untersuchten wir, ob die Entwicklung von Axonen im Frühstadium durch den Verlust von Zentriolen beeinflusst wurde. Ein wichtiger Aspekt der Axonentwicklung im Frühstadium ist die spezifische Sortierung axonaler Proteine, einschließlich des AIS-Proteins Trim46. Daher testeten wir, ob die axonspezifische Lokalisation von Trim46 durch die Centrinon-B-induzierte Zentriolentfernung beeinflusst wurde. Neuronen wurden mit Centrin und Trim46 immungefärbt, um die Zentriolzahl und das Vorhandensein von axonalem Trim46 für jede Zelle zu korrelieren ( 2C ). Wir beobachteten einen deutlichen

50%ige Reduktion der Zellen mit einem Trim46-positiven Prozess in der Subpopulation von Zellen, die 1 Zentriol(e) enthalten, im Vergleich zu Zellen, die nach Centrinon-B-Behandlung noch 2 Zentriolen enthalten (Fig. 2D). Dementsprechend wurden Trim46-negative Prozesse häufiger in Neuronen mit Centriolenmangel beobachtet als in Neuronen, die nach Centrinon-B-Behandlung noch beide Zentriolen enthielten, während dieser Unterschied in der Kontrolle nicht beobachtet wurde (Fig. EV2F). Um mögliche Off-Target-Effekte von Centrinon-B zu kontrollieren, haben wir einen zusätzlichen Ansatz verwendet, um den Zentriolverlust basierend auf der genetischen Manipulation von SAS6 zu induzieren, einem wichtigen Regulator der Zentriol-Duplikation und einer Komponente der Centriolen-Wagenradstruktur (Nakazawa et al., 2007). Die Transduktion von humanen iPSC-abgeleiteten NSCs mit CRISPR/Cas9-SAS6-gRNA-Knockout-Lentivirus (SAS6 KO) für fünf Tage führte zu einer signifikanten Verringerung der Zentriolzahlen (Fig. EV2G und H). Das axonale Erscheinungsbild von Trim46 war in Neuronen, die mit SAS6-KO-Lentivirus transduziert wurden, signifikant reduziert, wodurch unser früherer Befund bestätigt wurde (Abb. EV2I und J). Die Depletion von Centriolen schien die Gesamtexpressionsniveaus von Trim46 in Neuronen nicht zu beeinflussen, da bei der Centrinon-B-Behandlung mit Western-Blot-Analyse keine klaren Unterschiede gefunden wurden (Abb. EV2K). Ein weiteres wichtiges Protein, das einer axonalen Sortierung unterzogen wird, ist das Haupt-AIS-Gerüst AnkG. Im Gegensatz zu Trim46 beobachteten wir keine Veränderungen im axonalen Erscheinungsbild von AnkG nach Centrionon-B-induzierter Zentriol-Erschöpfung (Fig. 2E). Übereinstimmend zeigten Zellen, die ≤ 1 Zentriol(en) enthielten, eine reduzierte Trim46-Kolokalisation an AnkG-positiven axonalen Strukturen ( 2F ). Um mögliche Postdifferenzierungseffekte der PLK4-Hemmung unabhängig von der Zentriolzahl zu kontrollieren, untersuchten wir, ob das axonale Targeting von Trim46 beeinflusst wurde, wenn die Centrinone-B-Behandlung nach neuronaler Differenzierung angewendet wurde. Die Behandlung von Neuronen mit Centrinon-B drei Tage nach der neuronalen Induktion, über die wir zuvor als einen Zeitpunkt berichtet haben, an dem die meisten Neuronen differenziert, aber noch nicht polarisiert sind, hatte keinen Einfluss auf das Trim46-Erscheinungsbild an Axonen oder AnkG-positiven Strukturen in späteren Stadien (Abb. EV2L und M) (Lindhout et al., 2020). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass Zentrosomen für das Targeting von Trim46, aber nicht von AnkG, auf Axone in frühen Stadien der neuronalen Entwicklung wichtig sind.

Zentriolverlust führt zu unausgereifter Aktionspotentialauslösung

Das axonale Zielen von Trim46 und AnkG ist erforderlich, um das AIS aufzubauen, die hochspezialisierte Struktur, die für ein ausgereiftes und effizientes AP-Schießen unerlässlich ist. Daher untersuchten wir, ob die beobachteten unterschiedlichen Wirkungen auf das Axon-Protein-Targeting bei der Zentriol-Verarmung mit Veränderungen der AP-Eigenschaften korrelieren. Wir führten Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Kontroll- oder Centrinon-B-behandelten Neuronen von 7–14 Tagen durch, was mit der frühen Axonentwicklung zusammenfällt. Um die neuronale Erregbarkeit zu messen, haben wir die Anzahl der APs bestimmt, die mit zunehmender somatischer Strominjektion gezündet wurden (Schritte von 5 pA 400 ms) (Abb. 2G). In Centrinon-B-behandelten Kulturen,

17% der Neuronen feuerten keine APs ab, während dies nur der Fall war

3% in Kontrollkulturen (Fig. 2H und I). Von den feuernden Neuronen gab es im Vergleich zur Kontrolle weniger mit Centrinon-B behandelte Neuronen, die mehrere APs feuerten. Neuronen, die keine APs feuerten, erzeugten bei Stromstimulation kleine Spitzen, was auf die Öffnung von Natriumkanälen hindeutete, erzeugten jedoch keine positive Rückkopplung, um das Membranpotential schnell zu erhöhen, wie es für APs charakteristisch ist. Außerdem zeigten mit Centrinon-B behandelte Neuronen keine fortschreitende Reifung der AP-Eigenschaften von Tag 10 bis Tag 14, wie dies bei Kontrollneuronen beobachtet wurde ( 2J und EV2N und O). APs, die von Centrinon-B-behandelten Neuronen gefeuert wurden, erschienen unausgereifter, da sie breiter waren, kleinere Amplituden und kleinere Nach-Hyperpolarisationen aufwiesen (Abb. 2K–M und EV2N und O). In Centrinon-B-behandelten Neuronen war der Eingangswiderstand ebenfalls höher, aber das Membranpotential unterschied sich nicht von der Kontrolle (Abb. EV2O–Q–EV2O–Q). Obwohl die AP-Schwelle durch die Centrinon-B-Behandlung nicht beeinflusst wurde ( 2M ), waren die maximalen Natriumströme in Centrinon-B-behandelten Neuronen signifikant kleiner ( 2N ). Um Zentriol-unabhängige Wirkungen der PLK4-Hemmung zu kontrollieren, testeten wir die Wirkung der Centrinon-B-Behandlung nach der Differenzierung auf das Auslösen des Aktionspotentials. Als Centrinon-B nach der Differenzierung hinzugefügt wurde, beobachteten wir keinen Unterschied in der AP-Amplitude und Halbwertsbreite in Neuronen von 13–14 Tagen (Abb. EV2R und S). Zusammen zeigen die elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Centrinon-B-behandelten Neuronen ein unreiferes AP-Feuer und reduzierte Natriumströme, wodurch die funktionelle Relevanz von Zentrosom-vermittelten Kontrollmechanismen in frühen Stadien der neuronalen Entwicklung hervorgehoben wird.

Die Erschöpfung der Zentriolen führt zu einer reduzierten Expression von Wachstumskegelproteinen

Unsere Beobachtungen zeigten, dass sich die Zentriol-verarmten NSCs zu Neuronen mit strukturellen und funktionellen Störungen in der Axonentwicklung entwickeln. Als nächstes zielten wir darauf ab, die Auswirkungen der Zentriol-Verarmung während der Axon-Spezifikation mit unverzerrtem Profiling zu quantifizieren. Daher führten wir an den Tagen 1, 3 und 7 eine auf Massenspektrometrie basierende quantitative Proteomik-Analyse durch, die im Allgemeinen dem Entwicklungsstadium 1, dem Beginn des Stadiums 2 bzw. dem Beginn des Stadiums 3 entspricht (Lindhout et al., 2020). Wir verglichen die Proteomdynamik während der frühen Neuroentwicklung von Replikaten von Centrinon-B-behandelten und Kontrollneuronen (Abb. EV3A, DATASET EV1). Die Behandlung mit Centrinon-B veränderte die relative Proteinexpression im Laufe der Zeit nicht merklich ( 3A ). Das Proteinexpressionsprofil der Kontrollneuronen zeigte eine Entwicklungsverschiebung, die den Übergängen von Stufe 1 zu Stufe 2 und von Stufe 2 zu Stufe 3 entspricht (Abb. EV3B). Die Proteinexpression von Zentriol-depletierten Neuronen folgt weitgehend dem gleichen Trend (Fig. EV3C). In beiden Populationen werden Proteine, die als spezifisch für NSCs gelten, an den Tagen 3 und 7 herunterreguliert (z. B. Ki67, Nestin, Otx, Notch1), während neuronale Proteine ​​hochreguliert werden (z. B. Stathmin1, Map2, Doublecortin, Tubß3) (Abb. EV3D). Der Beginn von Stadium 3 markiert die Axonspezifikation, und tatsächlich beobachteten wir eine starke Hochregulierung der axonalen Proteine ​​Trim46 und Tau am Tag 7, die durch die Centrinon-B-Behandlung nicht beeinflusst wurde ( 3B ). Die Expression der Wachstumskegelproteine ​​Basp1, Gap43 und Marcks war an Tag 3 sowohl in Kontrollen als auch in Centrinon-B-behandelten Neuronen erhöht. Diese Hochregulierung war am Tag 7 in den Kontrollneuronen noch stärker, wurde jedoch in den zentriolverarmten Neuronen deutlich unterdrückt ( 3C und EV3D ). Zusammengenommen zeigt die quantitative Proteomanalyse, dass die Behandlung mit Centrinon-B das Proteinexpressionsprofil während der frühen Stadien der Neuroentwicklung nicht dramatisch verändert, was eine erfolgreiche globale Qualitätskontrolle von Centrinon-B-behandelten Zellen ermöglicht. Diese Ergebnisse zeigen jedoch eine spezifische Wirkung auf Wachstumskegelproteine ​​bei der Verarmung an Zentriolen.

Abbildung 3. Der Verlust von Zentriolen in NSCs wird von Veränderungen in der Morphologie der Neuritenwachstumszapfen begleitet

  • A. Korrelatives Diagramm der Veränderungen der Proteinhäufigkeit zwischen Kontrollneuronen und Neuronen, die mit Centrinon-B behandelt wurden (Tag 7/Tag 3). Korrelation nach Pearson R = 0.5716, P < 0,001. Spezifische, sich signifikant verändernde Wachstumskegelproteine ​​rot hervorgehoben.
  • B. Proteinabundanzprofil über die Zeit für die Axon-verwandten Proteine ​​Trim46 und Tau in Kontrollneuronen und Neuronen, die mit Centrinon-B (+C) behandelt wurden.
  • C. Proteinabundanzprofil über die Zeit für die Wachstumskegel-verwandten Proteine ​​Basp1, Gap43 und Marcks in Kontrollneuronen und Neuronen, die mit Centrinon-B (+C) behandelt wurden.
  • D. Repräsentative Bilder von fächerartigen Wachstumskegeln am Tag 5 der Kontrolle und Centrinon-B-behandelten Neuronen mit oder ohne Nocodazol-Behandlung. Wachstumskegel werden durch Immunfärbung für Phalloidin sichtbar gemacht. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • E. Quantifizierungen der durchschnittlichen Fläche (um 2 ) von Wachstumskegeln von Kontroll- und Centrinon-B-behandelten Neuronen mit oder ohne Nocodazol-Behandlung zu verschiedenen Zeitpunkten. n = 25–83 Wachstumskegel in drei unabhängigen Experimenten.
  • F. Repräsentative Bilder verschiedener morphologischer Kategorien von Wachstumskegeln: fächerartig, torpedoartig und knollenartig. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • G. Quantifizierung der Verhältnisse verschiedener Subtypen (fächerartig, torpedoartig, knollenartig) von Wachstumskegeln von Kontroll- und Centrinon-B-behandelten Neuronen mit oder ohne Nocodazol-Behandlung zu verschiedenen Zeitpunkten.
  • H. Quantifizierung der durchschnittlichen Fläche (µm 2 ) verschiedener Subtypen (fächerartig, torpedoartig, knollenartig) von Wachstumskegeln von Kontroll- und Centrinon-B-behandelten Neuronen, mit oder ohne Nocodazol-Behandlung, zu verschiedenen Zeitpunkten . n = 5–55 Wachstumszapfen in drei unabhängigen Experimenten.

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Einweg-ANOVA einschließlich Tukeys post hoc Analyse (E), Chi-Quadrat-Test inklusive post hoc Analyse mit Bonferroni-Korrektur (G), Einweg-ANOVA einschließlich Sidaks post hoc Analyse (H). ***P < 0,001, **P < 0,005, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Die Erschöpfung der Zentriolen beeinflusst die Morphologie des Neuritenwachstumskegels

Als nächstes untersuchten wir, ob die reduzierte Expression von Wachstumskegelproteinen zu Defekten der axonalen Wachstumskegelmorphologie führte. Wir fanden heraus, dass in Kontrollneuronen die Größe der Wachstumskegel zu Beginn der Entwicklung relativ groß ist und mit der Zeit abnimmt (Abb. 3D und E).Wachstumskegel von mit Centrinon-B behandelten Neuronen blieben am 5. Tag kleiner und ihre Größe nahm später in der Entwicklung noch weiter ab. Da Mikrotubuli wesentliche Komponenten für die Bildung von Wachstumskegeln sind, untersuchten wir, ob die Manipulation des Mikrotubulus-Zytoskeletts die Wirkung der Zentriol-Erschöpfung durch Centrinone-B-Behandlung auf die Größe der Wachstumskegel nachahmt (Dent et al., 2011). Tatsächlich führte auch die Behandlung mit Nocodazol, einem Mikrotubuli-Destabilisator, bereits am 5. Tag zu kleineren Wachstumskegeln (Abb. 3D und E). Interessanterweise zeigte die Behandlung mit Nocodazol keinen zusätzlichen Effekt auf die Größe des Wachstumskegels in zentrolarmen Neuronen, was auf ähnliche zugrunde liegende Mechanismen schließen lässt. Um die Wirkung der Zentriol-Erschöpfung auf Wachstumszapfen genauer zu untersuchen, haben wir drei Untertypen kategorisiert: fächerartig, torpedoartig und knollenartig (Abb. 3F) (van der Vaart et al., 2013). Wir fanden am Tag 5 eine Mehrheit von fächerartigen Wachstumskegeln, die sich mit zunehmender Reifung der Axone zu eher torpedo- und knollenartigen Wachstumskegeln verlagerten (Abb. 3G). Weder Centrinon-B- noch Nocodazol-Behandlung veränderten die relative Häufigkeit dieser Arten von Wachstumskegeln. Die Behandlung mit Centrinon-B sowie mit Nocodazol führte jedoch am Tag 5 zu signifikant kleineren fächerartigen Wachstumskegeln, die in Kontrollneuronen erheblich größer sind als torpedo- und knollenartige Wachstumskegel (Fig. 3H). Dieser Effekt war bei fächerartigen Wachstumskegeln deutlich, da die Größen von torpedo- und knollenartigen Wachstumskegeln nicht beeinflusst wurden, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Abnahme der Wachstumskegelgröße speziell auf betroffene fächerartige Wachstumskegel zurückzuführen ist (Abb. 3E und H). Das Aktin-Zytoskelett ist eine weitere wichtige Komponente des Zytoskeletts an Wachstumskegeln und wurde zuvor durch Mikrotubuli sowie die Zentrosomenaktivität in dissoziierten Nagetierneuronen (Zhao et al., 2017 et al., 2019). Hier beobachteten wir keine Veränderungen der lokalen F-Aktin-Spiegel an Wachstumszapfen, was darauf hindeutet, dass die reduzierte Größe der fächerartigen Wachstumszapfen nicht durch Änderungen der F-Aktin-Spiegel in Wachstumszapfen verursacht wird (Abb. EV3E). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Depletion der Zentriolen während des Axonwachstums Defekte in der Morphologie des Wachstumszapfens verursacht, vermutlich durch Mikrotubuli-vermittelte Mechanismen.

Die Depletion der Zentriolen stört die Reorganisation der Mikrotubuli in sich entwickelnden Axonen

Um mehr Einblick in die potenzielle Rolle von Zentrosomen bei der einzigartigen Organisation des axonalen Mikrotubulus-Zytoskeletts zu gewinnen, das durch eine einheitliche Organisation von Plus-End-Out-Mikrotubuli gekennzeichnet ist, untersuchten wir die Auswirkungen des Zentriolverlustes auf die Mikrotubuli-Remodellierungsprozesse während der Entwicklung. Wir analysierten systematisch die Plus-End-Dynamik und die Orientierung von Mikrotubuli in Axonen und Dendriten an Tag 7 und 13, die mit dem Beginn von Stadium 3 bzw et al., 2020). Für die Analyse an Axonen haben wir sowohl proximale als auch distale Regionen gemessen, da wir zuvor berichteten, dass die Axonentwicklung während dieses Zeitfensters in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen (Lindhout et al., 2020). Wir verwendeten zweifarbige Lebendzell-Bildgebung, um die Neuritenmorphologie und Mikrotubuli-Plus-End-Tracking-Proteine ​​(MT+TIPs) in Kontrollneuronen und Centrinon-B-behandelten Neuronen zu visualisieren (Abb. 4A, MOVIE EV1). Die Bewegungsrichtung der MT+TIPs wird als Ablesung für die Mikrotubuli-Orientierung verwendet, da anterograde und retrograde Bewegungen von MT+TIPs Plus-End-Out- bzw. Minus-End-Out-Mikrotubuli markieren. Am Tag 7 ist der Prozentsatz an Centrinon-B-behandelten Neuronen mit einer einheitlichen Mikrotubuli-Polarität, die ein Markenzeichen reifer Axone ist, ähnlich wie bei Kontrollneuronen sowohl in proximalen als auch in distalen Axonen ( 4B und C sowie EV4A und B). Ebenso ändert sich die Anzahl anterograd und retrograd wachsender MT+TIPs bei der Behandlung mit Centrinon-B nicht (Abb. 4D und E sowie EV4D und E). Am Tag 13 wurde jedoch der Anteil der Neuronen mit einheitlichen Mikrotubuli im distalen Axon durch die Centrinon-B-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollneuronen signifikant reduziert ( 4B und F). Die Polarität der Mikrotubuli wurde speziell im distalen Axon beeinflusst, das das reifste Axonstadium darstellt, da kein Unterschied in den proximalen Axonen und den Dendriten von Kontrollneuronen und Centrinon-B-Neuronen beobachtet wurde (Abb. EV4, EV4, EV4, EV4, EV4, EV4, EV4, EV4A–C,F–H). Dies weist darauf hin, dass die Depletion der Zentriolen die Neuronen daran hindert, die charakteristische einheitliche Organisation der Mikrotubuli mit dem Plus-Ende während der axonalen Entwicklung beizubehalten. Darüber hinaus zeigen Centrinon-B-behandelte Neuronen mehr MT+TIP-Bewegung, insbesondere bei anterograden beweglichen MT+TIPs, was auf eine globale Zunahme der Mikrotubuli-Dynamik hindeutet (Abb. 4G und H). Eine Zunahme der Anzahl von MT+TIPs wird auch im proximalen Axon am 13. Tag beobachtet, jedoch nicht in den Dendriten (Abb. EV4D,E,I,J). Die Geschwindigkeit und Lauflänge der wachsenden MT+TIPs war zwischen Kontrollneuronen und Centrinon-B-behandelten Neuronen an Dendriten sowie proximalen und distalen Axonen über beide Zeitpunkte hinweg konsistent (DATASET EV2). Die Bildgebung von MT+TIPs liefert nur Informationen über die dynamischen Enden von Mikrotubuli, berücksichtigt jedoch nicht stabilisierte Mikrotubuli. Als nächstes zielten wir darauf ab, die Mikrotubuli-Orientierungen des gesamten axonalen Mikrotubulus-Netzwerks zu analysieren, einschließlich stabiler und dynamischer Mikrotubuli. Dies wurde durch die Kombination unseres Ansatzes mit Laserabtrennung angegangen, um neue Mikrotubuli-Enden zu erzeugen, indem Mikrotubuli mit einem kurz gepulsten Laser geschnitten werden, der neu gebildete MT+TIPs auslöst (Abb. 4I und J, MOVIE EV2) (Yau et al., 2016). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen beobachteten wir eine deutliche

40 % Reduktion der Neuronen mit einer einheitlichen Plus-End-Mikrotubuli-Organisation in distalen Axonen mit Centrinone-B-Behandlung nach Laserdurchtrennung der Mikrotubuli, während in den proximalen Axonen keine signifikanten Veränderungen beobachtet wurden (Abb. 4K,L,O und EV4K,L,M ). An den distalen Axonen war die Anzahl der retrograden Kometen nach der Behandlung mit Centrinon-B signifikant erhöht, während die anterograden Kometen nicht betroffen waren, was darauf hindeutet, dass der Verlust von Zentriolen bei sich entwickelnden Axonen mit stabileren Minus-End-out-Mikrotubuli einhergeht (Abb. 4M,N,P,Q ). Erwartungsgemäß wurde die Anzahl der anterograden und retrograden Kometen an proximalen Axonen und Dendriten durch die Behandlung mit Centrinone-B nicht verändert (Abb. EV4N,O,P,Q,R). Um PLK4-Hemmungseffekte in postmitotischen Neuronen zu kontrollieren, die nicht mit der Zentriolzahl in Zusammenhang stehen, analysierten wir die Mikrotubuli-Organisation in distalen Axonen am Tag 13 in Neuronen, die nach der Differenzierung mit Centrinon-B behandelt wurden, und beobachteten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle (Abb. EV4S,T,U). . Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass Zentrosomen für die einzigartige axonspezifische Reorganisation in Richtung einheitlicher Mikrotubuli am Plus-Ende-Ausgang wichtig sind (Abb. 4R).

Abbildung 4. Centriolenverlust hemmt die Mikrotubuli-Remodellierung während der frühen Axonentwicklung

  • A. Beispielstills aus einer Drehscheiben-Zeitrafferaufnahme eines mit mRFP und GFP-MT+TIP transfizierten Neuriten. Das obere Feld ist ein Standbild eines Neuriten in mRFP, das die Neuritenmorphologie zeigt. Die anderen Felder zeigen sich bewegende GFP-MT+TIP-Kometen, die entweder in anterograde Richtung (grüne Pfeilspitzen) oder retrograd (blaue Pfeilspitzen) zeigen. P bezeichnet die proximale Richtung und D die distale Richtung des Neuriten. Zeitstempel in Minuten:Sekunden unten rechts angegeben. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • B. Kymographen und schematische Darstellungen von Zeitrafferaufnahmen des distalen Axons, wie in (A) gezeigt, für verschiedene Zeitpunkte (Tag 7 Tag 13) und Bedingungen (Kontroll-Centrinon-B). Maßstabsbalken = 5 µm.
  • C. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 7 im distalen Axon gleichförmige oder ungleichmäßige Kometenorientierungen in anterograder Richtung aufweisen. n = 15–17 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • D. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich am Tag 7 in anterograde Richtung im distalen Axon bewegen. n = 15–17 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • E. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich am Tag 7 in retrograder Richtung im distalen Axon bewegen. n = 15–17 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • F. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die am Tag 13 im distalen Axon eine gleichmäßige oder ungleichmäßige Kometenorientierung in anterograder Richtung aufweisen. n = 11–18 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • G. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich am Tag 13 in anterograde Richtung im distalen Axon bewegen. n = 11–18 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • H. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich am Tag 13 in retrograder Richtung im distalen Axon bewegen. n = 11–18 Zellen in vier unabhängigen Experimenten.
  • I. Schematische Darstellung von Mikrotubulus-Laser-Severing (LS)-Experimenten.
  • J. Beispielstills aus einer Drehscheiben-Zeitrafferaufzeichnung eines mit mRFP und GFP-MT+TIP transfizierten Neuriten. Rote Linie kennzeichnet die Position von LS. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • K. Kymogramme und schematische Darstellungen von Zeitrafferaufnahmen des distalen Axons, wie in (J) nach LS gezeigt, für verschiedene Zeitpunkte (Tag 7 Tag 13) und Bedingungen (Kontroll-Centrinone-B). Rote Linie und rote Pfeilspitze bezeichnen Ort und Zeit von LS. Maßstabsbalken = 5 µm.
  • L. Quantifizierung des Prozentsatzes der Neuronen, die am Tag 7 nach LS eine einheitliche oder uneinheitliche Kometenorientierung in anterograder Richtung im distalen Axon aufweisen. n = 20–22 Neuronen in drei unabhängigen Experimenten.
  • M. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich nach LS am Tag 7 in anterograde Richtung im distalen Axon bewegen. n = 20–22 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • N. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich nach LS am Tag 7 in retrograder Richtung im distalen Axon bewegen. n = 20–22 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • O. Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die nach LS an Tag 13 gleichförmige oder ungleichmäßige Kometenorientierungen in anterograder Richtung im distalen Axon aufweisen. n = 24–27 Neuronen in drei unabhängigen Experimenten.
  • P. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich nach LS an Tag 13 in anterograde Richtung im distalen Axon bewegen. n = 24–27 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • F. Quantifizierung der Anzahl der Kometen pro Minute, die sich nach LS am Tag 13 in retrograder Richtung im distalen Axon bewegen. n = 24–27 Zellen in drei unabhängigen Experimenten.
  • R. Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Ausrichtung der Mikrotubuli im distalen Axon unter Kontrollbedingungen und nach Centrinone-B-Behandlung.

Dateninformationen: Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Chi-Quadrat-Test (C, F, L, O), ungepaart T-Test (D, E, G, H, M, N, P, Q) **P < 0,005, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.


Wartung des Zentrosoms

Historisch galten Zentriolen als außergewöhnlich stabile Strukturen. Sie sind resistent gegenüber arzneimittel- und kälteinduzierter MT-Depolymerisation (Kochanski und Borisy, 1990), gegenüber Kräften und MT-Instabilität in der Mitose (Belmont et al., 1990). Darüber hinaus ist die Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) des Basalkörpers α-Tubulin in Tetrahymena zeigt wenig Umsatz (Pearson et al., 2009). Ein elegantes Experiment in C. elegans zeigten, dass bei Befruchtung mit Spermien, die ein einzelnes väterlich eingebrachtes Zentriol enthielten, das mit SAS4 markiert wurde, das an GFP markiert wurde, um die Zentriolwände zu markieren, bis zum ∼350-Zell-Stadium nach der Befruchtung nachgewiesen werden konnte (Balestra et al., 2015), was darauf hindeutet, dass Zentriolen stabil durch viele Teilungen vererbt werden.

Zentrosomen gehen jedoch aus Oozyten der meisten Metazoen-Spezies verloren (Delattre und Gönczy, 2004, Manandhar et al., 2005) und sind bekanntermaßen in einigen Zelltypen, die einer Differenzierung unterliegen, wie z. Muskel- und Epithelzellen (Sanchez und Feldman, 2017). Bei der neuronalen Differenzierung bei Säugetieren und Drosophila, verlieren Zentrosomen PCM-Proteine ​​und damit ihre MTOC-Kapazität (Stiess et al., 2010 Nguyen et al., 2011). Axon-Extension kann in Abwesenheit aktiver Zentrosomen in Säugetieren und in Drosophila (Tassin et al., 1985 Stiess et al., 2010 Nguyen et al., 2011). Bei der Myozytendifferenzierung verlieren Zentrosomen PCM-Proteine ​​und wurden als in Muskelfasern nicht vorhanden beschrieben (Srsen et al., 2009 Przybylski, 1971). Gleichzeitig akkumulieren PCM-Proteine ​​an der Kernperipherie, aus der MTs nukleiert werden (Srsen et al., 2009 Przybylski, 1971). Mehrere Epithelzelltypen inaktivieren auch die MT-Nukleation und/oder heben ihre Verankerung von Zentrosomen auf und erzeugen so MTs entlang der apikal-basalen Achse (Sanchez und Feldman, 2017 Muroyama und Lechler, 2017). Diese Beweislinien legen nahe, dass das Zentrosom einem homöostatischen Erhaltungsprogramm unterliegt, das reguliert werden kann, wodurch unterschiedliche MT-Arrays entstehen.

Darüber hinaus sind mehrere Zentriolkomponenten dynamisch, wie Centrin im Lumen des Zentriols (Bahmanyar et al., 2010), das abnorme Protein 6 (SAS6) der Spindelanordnung im Wagenrad (Keller et al., 2014) und das zentrosomale Protein 120 ( CEP120) an der Zentriolwand (Mahjoub et al., 2010). Daher zeichnet sich ein Bild ab, bei dem ein allgemeines homöostatisches Erhaltungsprogramm (Kasten 1) für Zentrosomen existiert, das sowohl ihrer Stabilität in zyklischen Zellen (Izquierdo et al., 2014) als auch ihrer Instabilität in einigen Geweben wie Eizellen zugrunde liegen könnte , Neuronen und Epithelzellen (Pimenta-Marques et al., 2016 Yonezawa et al., 2015 Muroyama et al., 2016).

Das homöostatische Erhaltungsprogramm des Zentrosoms hängt von kritischen Aspekten seiner Struktur ab, wie dem PCM, den Zentriolwänden und dem Zentriolwagenrad, und wird von Zellzyklusregulatoren wie CDKs und PLKs kontrolliert (Yang und Feldman, 2015 Muroyama et al ., 2016). Von diesen Kinasen ist bekannt, dass sie die Biogenese, Reifung und Funktion der Zentrosomen regulieren et al., 1991 Lindon und Pines, 2004 Murray, 1989). Eine hohe Aktivität von CDKs und PLKs wird für ein aktives mitotisches Zentrosom benötigt, wohingegen eine niedrigere Aktivität dieser Kinasen oft mit Zentrosomen von Zellen in der Interphase oder solchen, die den Zellzyklus verlassen haben, assoziiert ist. Schließlich wird keine Aktivität dieser Kinasen beobachtet, wenn das Zentrosom vollständig inaktiviert wurde, was oft mit Zentriolverlust verbunden ist ( 2A ).

Als nächstes diskutieren wir detaillierter verschiedene Komponenten des Zentrosom-Erhaltungsprogramms.

In menschlichen kultivierten Zellen werden neu gebildete Zentriolen, die durch die Entfernung von CEP295 daran gehindert wurden, zu Zentrosomen zu reifen, am Ende des Zyklus nach dem Verlust des Wagenrads zerlegt (Izquierdo et al., 2014). Die Hemmung von PLK1 hielt das Rad zurück (Wang et al., 2011) und rettete den Verlust nicht ausgereifter Zentriolen (Izquierdo et al., 2014). Gereifte Zentriolen zerfallen jedoch nicht, obwohl sie normalerweise das Rad am Ende des Zellzyklus verlieren, weil sie PCM haben. Dies deutete darauf hin, dass sowohl das PCM als auch das Cartwheel redundant sind, um den Zentriolen Stabilität zu verleihen und sich beim Zentrosomenschutz gegenseitig zu kompensieren. Eine solche Redundanz ist möglicherweise nicht bei allen Arten und/oder Geweben vorhanden. In S-Phase-gesichert Drosophila Zellen, die Verarmung von vier Haupt-PCM-Proteinen (SPD-2, CNN, Asl und D-PLP) oder von Polo (dem Ortholog von PLK1), reichte aus, um zu einer Verringerung der Zentriolenzahl zu führen, was zeigt, dass Zentrosomen homöostatisch durch die Erneuerung ihrer Komponenten (Pimenta-Marques et al., 2016).

Zentriolwandkomponenten und ihre posttranslationalen Modifikationen sind auch für die Zentriolenstabilität wichtig. Injektion oder Elektroporation mit einem Antikörper gegen Tubulin-Glutamylierung (α-GT335) führte zum Verschwinden von Zentriolen und Zentrosomen (Bobinnec et al., 1998). In diesem Fall tauchten schließlich Zentriolen und diskrete Zentrosomen in der Zellpopulation wieder auf, jedoch zeigten einige Zentriolen den Verlust der MT-Tripletts (Bobinnec et al., 1998), die für normale Zentriolen charakteristisch sind ( 1A ). Möglicherweise stabilisiert die Glutamylierung selbst die zentriolare MT-Struktur oder fördert die Bindung von Stabilisatoren. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von ATF5, das sowohl mit glutamyliertem Tubulin als auch mit Pericentrin interagiert und dadurch das Zentriol mit dem PCM verbindet, die Akkumulation von PCM am Zentrosom blockiert und die Fragmentierung der Zentriolen verursacht (Madarampalli et al., 2015 ). Centrobin, ein weiterer Faktor, der an zentrioläres Tubulin bindet und normalerweise mit Tochterzentriolen assoziiert ist (Gudi et al., 2011, Zou et al., 2005), fördert die Verlängerung der Zentriolen und verhindert die PCM-Rekrutierung in kultivierten zyklischen Zellen. Die Expression von dominant-negativem Centrobin führte zu einer Zunahme der Anzahl von Zellen ohne Centriolen (Gudi et al., 2011). Schließlich tragen bei bestimmten Arten auf Zentriolen gefundene δ- und ε-Tubuline zur Bildung und/oder Stabilität der Triplett-MTs bei (Übersicht in Winey und O'Toole, 2014). Alles in allem legen diese Studien nahe, dass es ein Zusammenspiel zwischen dem Rad, den Zentriolwänden (einschließlich der posttranslationalen Modifikationen der Tubulin- und Centrobinfunktion) und dem PCM bei der Unterstützung der Zentriolstabilität gibt.

Neuere Studien zeigen, dass die Inaktivierung des PCM zu einer geplanten Zentrosomeninaktivierung (z. B. in Neuronen, Muskel- und Epithelzellen) oder sogar zu ihrem vollständigen Verschwinden (z. B. in Eizellen, Abb. 2A) führt. Ursprünglich 1933 von Hüttner beobachtet, ist heute bekannt, dass Eizellen mehrerer Arten während der Meiose ihre Zentrosomen verlieren (Hüttner und Rabinowitz, 1933, Manandhar et al., 2005), was in verschiedenen Organismen auf unterschiedliche Weise erreicht wird (siehe Kasten 2). In Drosophila, während der frühen Oogenese wird aus diesen eine Zyste aus 16 miteinander verbundenen Zellen gebildet, eine wird zur Oozyte und erbt alle Zentriolen durch interzelluläre Zentriolwanderung, was zu einem großen MTOC aus 64 Zentriolen führt. Polo und einige PCM-Komponenten wie SPD-2 werden transkriptionell herunterreguliert, bevor Zentriolen verschwinden (Jambor et al., 2015). Dies korreliert mit dem Verlust von Polo- und PCM-Proteinen aus dem MTOC der Eizelle, gefolgt vom Verschwinden der Zentriole, bevor sich das Ei teilt (Pimenta-Marques et al., 2016). Die erzwungene Lokalisierung von Polo an Zentriolen in der Oogenese führte zu einer PCM-Aufrechterhaltung und folglich zu einer Persistenz der Zentriolen (Pimenta-Marques et al., 2016) (Abb. 2A). Diese Ergebnisse in Eizellen weisen auf die Bedeutung der aktiven Rekrutierung neu synthetisierter Polo- und PCM-Komponenten an das Zentrosom hin, was die Existenz eines regulierten homöostatischen Erhaltungsprogramms, das abgeschaltet werden kann, weiter unterstützt.

Zentrosomen werden aus den Eizellen der meisten Metazoenarten eliminiert (Manandhar et al., 2005), wodurch nach der Befruchtung eine korrekte Anzahl von Zentrosomen erreicht werden kann.Bei Fruchtfliegen, Würmern und Menschen werden Zentriolen vor der meiotischen Teilung eliminiert, einer der wenigen zentriolären Teilungen bei diesen Arten (Delattre und Gönczy, 2004 Manandhar et al., 2005 Cunha-Ferreira et al., 2009 Mikeladze-Dvali et al ., 2012). In Drosophilawurde ein von Polo und PCM abhängiges Zentrosom-Erhaltungsprogramm aufgeklärt, das während der Oogenese abgeschaltet wird (Pimenta-Marques et al., 2016 siehe Haupttext zur Diskussion). Bei einigen Arten werden Zentriolen zusammen mit DNA durch ihre Extrusion in die Polkörperchen während der meiotischen Teilung eliminiert, wie beispielsweise in Schneckeneizellen, die nur ein einziges Paar Zentriolen enthalten (Krioutchkova et al., 1994). Interessanterweise verwenden Stachelhäuter (Seeigel, Seestern und Seegurke) beide Strategien, um Zentriolen zu eliminieren: Extrusion und Elimination. Diese Arten treten mit zwei Zentriolenpaaren in die Meiose ein, eines an jedem Pol der Meiose-I-Spindel. Ein Paar wird durch den Polkörper I (PBI) extrudiert. Anschließend sind an den Spindelpolen der Meiose II einzelne Zentriolen vorhanden, die Mutter, die MT-Keimbildungskapazität hat, wird mit PBII extrudiert (Borrego-Pinto et al., 2016), wobei eine einzelne Zentriole im reifen Ei zurückbleibt (Kato et al., 1990 Miyazaki et al., 2005 Nakashima und Kato, 2001). Das restliche Zentriol wird schließlich eliminiert, aber es ist nicht genau bekannt, wie dies erreicht wird. Wenn Zentriolen künstlich zurückgehalten werden, können sie nicht inaktiviert werden, was zu multipolaren Zygospindeln führt (Borrego-Pinto et al., 2016). Das zurückgehaltene Tochter-Zentriol bildet keine MT-Keime, vielleicht wegen unzureichender PCM-Spiegel, die eine Destabilisierung des Zentriols verursachen können. Möglicherweise müssen Mutter- und Tochterzentriolen auf unterschiedliche Weise eliminiert werden, da diese Zellen keinen Mechanismus haben, um PCM aktiv zu entfernen. Zukünftige Studien sind erforderlich, um zu verstehen, ob verschiedene Arten ähnliche Mechanismen verwenden, um Zentrosomen-Erhaltungsprogramme zu inaktivieren und Zentrosomen-Eliminierung zu erreichen.

Im menschlichen Körper gibt es mehrere andere Beispiele für Zellen, in denen Zentrosomen entweder teilweise oder vollständig inaktiviert sind. In einigen dieser Fälle bestehen Zentriolen, während in anderen keine schlüssigen Beweise vorliegen. Während der Differenzierung der Skelettmuskulatur werden zum Beispiel Zentriolen bei der Fusion von Myoblasten inaktiviert, um die synzytialen Myotuben zu erzeugen. Hier werden Proteine ​​wie γ-Tubulin, Pericentrin und Ninein von Nesprin an der Kernhülle eingefangen, aus der MTs nukleiert werden und sich ausbreiten, was zur Bildung von longitudinalen MT-Bündeln entlang der Längsachse der Zelle führt (Tassin et al., 1985 Espigat-Georger et al., 2016). Bei der Differenzierung von Hippocampus-Neuronen ist die Zentrosomeninaktivierung mit dem Verlust von γ-Tubulin, Pericentrin und Centrin aus dem Zentrosom verbunden (Stiess et al., 2010). MTs werden durch Augmin- und γTuRC-abhängige Nukleation aus bestehenden MTs erzeugt. Dies gewährleistet eine einheitliche Plus-End-Out-MT-Polarität in Axonen (Sánchez-Huertas et al., 2016). Sowohl in Muskeln als auch in Neuronen ist jedoch nicht klar, ob Zentriolen schließlich verschwinden und was passieren würde, wenn die Zentrosomenaktivität aufrechterhalten würde.

Während der epithelialen Differenzierung hören Zentrosomen oft auf, die Haupt-MTOC in der Zelle zu sein, wenn azentrosomale MTOCs etabliert sind. Der Verlust der CDK1-Aktivität scheint ein wichtiger Auslöser für diese Veränderung zu sein (Muroyama et al., 2016). Ein interessantes Beispiel sind hier proliferative Basalzellen der Säugetierepidermis, MTs werden bei der Differenzierung in die Zellrinde rekrutiert. Der Verlust der CDK1-Aktivität beim Verlassen des Zellzyklus führt zu mehreren Veränderungen an Zentrosomen und in der Zelle. MTs werden weiterhin durch CDK5RAP2-γ-TuRC-Komplexe am Zentrosom nukleiert, während Nedd1-γ-TuRC-Komplexe, die für die MT-Verankerung in diesem System erforderlich sind, schnell von den Zentrosomen delokalisieren, was zu einem Verlust der astralen MT-Konfiguration führt (Abb. 2A) (Muroyama, et al., 2016). Diese Studie legt nahe, dass verschiedene Populationen von γ-TuRCs unterschiedliche Funktionen haben und unterschiedlich reguliert werden. Der Verlust der zentrosomalen MTOC-Aktivität in diesen Zellen ist mit dem Verlust von Pericentrin und γ-Tubulin aus Zentrosomen verbunden, aber Zentriolen werden nicht vollständig eliminiert (Abb. 2A) (Muroyama et al., 2016). Ebenso während der Zelldifferenzierung von C. elegans embryonalen Darmzellen wird die MTOC-Funktion nach der Herunterregulierung von CDK-1 der apikalen Membran zugeschrieben. Interessanterweise können sich Zellen in diesem Fall nach der Differenzierung teilen. Die Reaktivierung des zentrosomalen MTOC ist abhängig vom konservierten zentrosomalen Protein Spindel-defektes Protein 2 (SPD-2 CEP192 beim Menschen) und der mitotischen CDK-Aktivität (Yang und Feldman, 2015).

Zusammenfassend ist es möglich, dass Kinasen wie PLK1 und CDK1 sowohl als Regulatoren der Zentrosomaktivität als auch der Aufrechterhaltung fungieren, was es in einigen Fällen schwierig macht, klare Grenzen zwischen beiden Prozessen zu ziehen (Muroyama et al., 2016). Die Hochregulation von PLK1 und CDK1 in der Mitose führt zu einer Reifung des Zentrosoms und einer erhöhten MT-Nukleation. Ihre Anwesenheit in der Interphase und in vielen differenzierten Zellen ist jedoch für die Aufrechterhaltung der Zentrosomen und sogar für die Nukleation notwendig, wobei ihre Abwesenheit zur Inaktivierung und zum Verschwinden der Zentrosomen führt Drosophila (Abb. 2A). Zukünftige Arbeiten werden hoffentlich entschlüsseln, wie dieses Programm auf transkriptioneller und posttranskriptionaler Ebene reguliert wird und wie dynamisch die PCM- und Zentriolproteine ​​tatsächlich sind.


Zilienpflege

Verschiedene Organismen und Zelltypen regulieren wahrscheinlich unterschiedlich die strukturelle und funktionelle Aufrechterhaltung von Zilien. Obwohl bestimmte langlebige differenzierte Zellen stabile Zilien wie Photorezeptoren beherbergen, ist bekannt, dass Zilien sich in zyklischen Zellen zusammenbauen und zerlegen ( 2B ). Das äußere Segment des Photorezeptors (ein modifiziertes Zilien) wird innerhalb weniger Tage vollständig ersetzt und erfordert daher eine kontinuierliche Wartung (Besharse und Hollyfield, 1979 Hsu et al., 2017). Die Integrität des Ziliens, sowohl als strukturelles als auch als signalgebendes Kompartiment, ist entscheidend für seine Funktion (Abb. 2B). Es ist wahrscheinlich, dass Modifikationen, die die Struktur robuster machen, sowie die Synthese von Ziliarkomponenten und deren Transport in die Zilien wichtige Faktoren für deren Erhaltung sind (siehe auch Kasten 3). Bei den Zentriolen spielen posttranslationale Modifikationen von Tubulin eine Rolle bei der Stabilisierung axonemaler MTs in Zilien. Mutation in der Tubulin-Deglutamylase CCPP-1 in C. elegans führt zu einem progressiven Degenerationsphänotyp der axonemalen MTs (O'Hagan et al., 2011). Diese Würmer scheinen in frühen Larvenstadien normale Zilien zu bilden, aber im Laufe der Zeit treten Ziliendefekte auf (O'Hagan et al., 2011). Die Tubulin-Glycylierung ist für die Retina-Entwicklung bei der Maus nicht erforderlich, aber die Photorezeptoren degenerieren mit dem Alter, wenn die Tubulin-Glutamylierung und -Glycylierung nicht richtig ausbalanciert sind (Bosch Grau et al., 2017) (Abb. 2B). Die Autoren schlagen vor, dass dieser Phänotyp mit der Unfähigkeit des Photorezeptors zusammenhängt, sich angemessen an die mechanische Belastung anzupassen (Bosch Grau et al., 2017).

Wichtige Erkenntnisse über die homöostatische Zilienerhaltung kamen von der zweigeißelten Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Chlamydomonas Flagellen (im Folgenden als Zilien bezeichnet) können biochemisch isoliert werden (Witman et al., 1972) und seit Ende der 1970er Jahre steht eine Sammlung temperaturempfindlicher Mutanten zur Verfügung, die es ermöglichen, Zilien akut zu zerlegen (Huang et al., 1977) . Diese Werkzeuge führten zur Identifizierung von Genen und Mechanismen, die an der Erhaltung der Zilien beteiligt sind. Insbesondere wurde gezeigt, dass eine zuvor beschriebene intraziliare „Motilität“ (Kozminski et al., 1993) von einer kinesingetriebenen motorischen Bewegung abhängt (Kozminski et al., 1995). Diese Motilität wird heute als intraflagellarer Transport (IFT) bezeichnet und besteht bekanntlich aus einem Proteinkomplex von 22 Untereinheiten (Piperno et al., 1998 Taschner und Lorentzen, 2016 Vashishtha et al., 1996). Die akute Entfernung von IFT führt zur Resorption der Zilien, was zeigte, dass dieser Komplex für die Aufrechterhaltung der Zilien wichtig ist. Live-Imaging und Modellierung zeigten, dass die Zilienlänge dynamisch durch den Tubulinumsatz gesteuert wird (Marshall und Rosenbaum, 2001 Marshall et al., 2005). Das Blockieren des IFT verhindert die Zugabe von neuem Tubulin an der Spitze und verursacht eine Verkürzung der Zilien (Marshall und Rosenbaum, 2001). Allerdings wurde erst 12 Jahre später gezeigt, dass Tubulin bei mehreren Arten tatsächlich eine echte IFT-Fracht ist (Bhogaraju et al., 2013). Kernkomponenten des IFT sind in anderen Spezies konserviert und können bei Mutation ähnliche Phänotypen wie bei menschlichen Pathologien verursachen (Pazour et al., 2000, 2002). Die Aufrechterhaltung der Proteinzusammensetzung in Zilien geht jedoch über den Tubulintransport hinaus: 20 % aller Axonemal- und Membranproteine ​​werden innerhalb von 6 Stunden in Chlamydomonas (Lied und Dentler, 2001). Zumindest einige davon könnten IFT-Ladungen sein, was darauf hindeutet, dass IFT neben der Länge zusätzliche Ziliareigenschaften beibehält. In jüngerer Zeit wurde jedoch gezeigt, dass nicht alle Chlamydomonas Proteine ​​sind für ihre Ziliarlokalisation von IFT abhängig (Harris et al., 2016). Dies eröffnet die Möglichkeit, dass die Ziliareigenschaften sowohl durch IFT-abhängige als auch durch IFT-unabhängige Mechanismen aufrechterhalten werden.

Die Aufrechterhaltung von Zilien, wie bei Zentriolen, erfordert wahrscheinlich auch eine kontinuierliche Transkription und Translation von Ziliarkomponenten. Beweise dafür liefert eine Studie über die Rolle von miRNAs bei der Photorezeptorerhaltung bei Mäusen hier, Tiere, bei denen miRNA182 und miRNA183 deletiert waren, bildeten in den ersten Wochen nach der Geburt voll funktionsfähige Photorezeptoren, zeigten jedoch spezifische Defekte in der Erhaltung dieser Zellen ( Busskamp et al., 2014). In derselben Studie wurde eine Reihe von Gen-Targets von miRNA182 und miRNA183 als mit Zilien und/oder Zentrosomen assoziiert annotiert und könnten daher für die Aufrechterhaltung von Photorezeptoren und allgemeiner Zilien relevant sein (Abb. 2B). Darüber hinaus wurde die Kernaktivität des Tumorsuppressorgens VHL mit der Erhaltung der Zilien in der Niere in Verbindung gebracht (Thoma et al., 2007). Hier ermöglicht der Verlust von VHL und die anschließende Resorption von Zilien den Zellen den Wiedereintritt in den Zellzyklus und führt zur Zystenbildung (Abb. 2B). Es ist jedoch unklar, durch welche Gene VHL die Aufrechterhaltung der Zilien steuert.

IFT spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Ziliarstruktur und der Integrität des Ziliens als Signalkompartiment (Kasten 3). IFT tritt ständig auf, selbst in vollständig ausgebildeten Zilien, wie FRAP-Experimente und andere Live-Cell-Imaging-Techniken zeigen (Hu et al., 2010 Milenkovic et al., 2015 Trivedi et al., 2012 Ye et al., 2013). Bei Grünalgen führte die Hemmung des IFT zu einer Verkürzung der zunächst normal funktionierenden Zilien (Marshall und Rosenbaum, 2001 Marshall et al., 2005). Dies führte zu der Vorstellung, dass Ziliarproteine ​​ständig ergänzt werden müssen, um die Geißellänge aufrechtzuerhalten (Marshall et al., 2005). Tatsächlich führt die Entfernung von IFT durch Gendeletion speziell in der Netzhaut von erwachsenen Mäusen zur Degeneration der Photorezeptoren (Jiang et al., 2015). Unter den IFT-Frachten wurde Tubulin, der Hauptbestandteil des Ziliaraxonems, als Transport durch die IFT-Komplexproteine ​​IFT81 und IFT74 in verschiedenen Spezies identifiziert (Bhogaraju et al., 2013) und direkt durch Kinesin-2 in Drosophila, das diese IFT-Untereinheiten nicht aufweist (Girotra et al., 2017 van Dam et al., 2013). Allerdings sind möglicherweise nicht alle Systeme gleichermaßen auf IFT für die Zilienpflege angewiesen, da voll ausgebildete Geißeln von Trypanosoma zeigen IFT-vermittelte Motilität, aber in diesem Fall ist der IFT-Komplex nur erforderlich, um die Flagellenfunktion und nicht ihre strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten (Fort et al., 2016). Zusätzlich, Drosophila Spermien benötigen weder zur Biogenese noch zur Erhaltung IFT (Han et al., 2003 Sarpal et al., 2003) und IFT fehlt bei reifen Mäusespermien und ist daher auch nicht für deren Erhaltung erforderlich (San Agustin et al., 2015 .). ). Weitere Erkenntnisse darüber, wie IFT die Erhaltungszilienfunktion reguliert, können aus der Hedgehog-Signalgebung gewonnen werden. Wie viele andere Signalwege erfordert die Hedgehog-Signalgebung Zilien (Bangs und Anderson, 2017). Der G-Protein-gekoppelte Rezeptor smoothened initiiert die Hedgehog-Signalgebung, wenn er sich an der Ziliarmembran ansiedelt. Bei Mäusen wurde gezeigt, dass IFT27 erforderlich ist, um unstimulierte Zilien in einem ausgeschalteten Zustand zu halten, indem es geglättet aus dem Zilien exportiert wird (Eguether et al., 2014). , 2013). Da IFT27 für die Hedgehog-Funktion erforderlich ist (Eguether et al., 2014), ist es unwahrscheinlich, dass IFT die Hedgehog-Signalisierungskapazität in diesen Systemen aufrechterhält. Tatsächlich, in Drosophila, ist die Hedgehog-Signalgebung weitgehend unabhängig von Zilien (Han et al., 2003 Sarpal et al., 2003), mit Ausnahme seiner Rolle beim Riechen (Kuzhandaivel et al., 2014 Sanchez et al., 2016). Dies deutet darauf hin, dass die Eigenschaften, die durch IFT aufrechterhalten werden, von der Art abhängen und möglicherweise auch zwischen den Zilien innerhalb eines Organismus variieren.

Die Rolle des IFT bei der Ziliarerhaltung kann auch durch die Ziliarwurzel reguliert werden. In C. elegans Rootletin-Mutanten, die keine Wurzeln bilden, sondern Zilien und IFT-Komplexe zusammenbauen (Mohan et al., 2013), bewegen sich IFT-Partikel mit geringerer Geschwindigkeit und die Zilien degenerieren schließlich. In Drosophila, wurden bei Rootletin-Mutanten keine strukturellen Defekte gefunden, jedoch wurde auch eine Ziliardysfunktion beobachtet (Chen et al., 2015). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Ziliarwurzel für die homöostatische Aufrechterhaltung der Zilienfunktion, jedoch nicht für ihre strukturelle Integrität erforderlich ist. In Zukunft wird es wichtig sein zu verstehen, welche IFT-Ladungen im Vergleich zu ihren Signalisierungskapazitäten für die Aufrechterhaltung der Zilienstruktur wichtig sind und wie der Transport durch das Rootlet reguliert wird.

Schließlich wurde in jüngerer Zeit gezeigt, dass Zilien aktinabhängig extrazelluläre Vesikel (oft als Exosomen bezeichnet) produzieren (Nager et al., 2017). Diese Exosomen sind biologisch aktiv und werden zum Schlüpfen benötigt Chlamydomonas (Wood et al., 2013) oder werden in der Kommunikation zwischen Einzelpersonen verwendet C. elegans (Wang et al., 2014). Exosomen können auch Zilien nach der Aktivierung in einen inaktiven Zustand zurückversetzen (Nager et al., 2017) und könnten an der Aufrechterhaltung anderer Ziliareigenschaften beteiligt sein.


Koevolution von Nek-Kinasen und Centriolen

Mehrere deflagellationsdefekte Mutantenstämme der einzelligen Biflagellaten Chlamydomonas tragen Mutationen in FA2 (für "Flagellar-Autotomie"), ein Gen, das einen Nek kodiert (Mahjoub et al., 2002). Deflagellation (auch bekannt als Dezilation) ist eine Kalzium-vermittelte Stressreaktion, bei der die Zilien an ihrer Basis durchtrennt und in die Umwelt abgegeben werden (Übersicht von Quarmby, 2004). Warum ist ein Familienmitglied, das für seine Zellzyklusfunktionen bekannt ist, für einen wichtigen Ziliarweg verantwortlich? Die fa2-Null-Mutation führt eher zu einer Verzögerung des Zellzyklus bei G2-M (Mahjoub et al., 2002) als zur Letalität, was darauf hindeutet, dass ein kompensatorischer Weg existiert, der möglicherweise ein anderes Mitglied der Nek-Familie einbezieht. Während mehrere mikrobielle Eukaryoten, einschließlich einzelliger Pilze, nur ein oder zwei Mitglieder der Familie haben (Übersicht von O'Connell et al., 2003), Chlamydomonas express 10 Neks (Bradley et al., 2004) (B. Bradley und L.M.Q., unveröffentlicht). Da die Pilze weder Zentriolen noch Zilien haben, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Nek-Familie in Flimmerorganismen expandiert und Zilien mit dem Zellzyklus koordiniert (Bradley et al., 2004 Quarmby und Parker, 2005).

Die Untersuchung der Genome mehrerer Organismen zeigt eine Korrelation zwischen der Anzahl der Neks in einem bestimmten Organismus und ob er Flimmerzellen hat oder nicht (Abb. 2). Drosophila und Caenorhabditis elegans haben bewimperte Zellen und daher ist zu erwarten, dass sie mehr Neks haben als die höheren Pflanzen, dargestellt durch Arabidopsis, die keine Flimmerzellen haben. Wir gehen jedoch davon aus, dass die einzigen Flimmerzellen in Drosophila und C. elegans terminal differenziert sind, müssen diese Organismen die Zilien und den Zellzyklus nicht koordinieren (d. h. sie haben keine Zentriolen, die sowohl als Basalkörper als auch als Mikrotubuli-organisierende Zentren dienen). In der Tat haben wir diese Hypothese mit der Evolutionssoftware Continuous v1 getestet, indem wir einen binären Ansatz verwenden, bei dem '1' Organismen mit Flimmerzellen zugeordnet wird, die wieder in den Zellzyklus eintreten, und '0' Organismen, die dies nicht tun .0d13 PPC (Pagel, 1994). Das Ergebnis des Vergleichs eines Modells, bei dem sich die Anzahl der Nek-Gene und die Fähigkeit von Flimmerzellen zur Teilung unabhängig voneinander entwickeln, mit einem alternativen Modell, bei dem sich die beiden Merkmale korreliert entwickeln, unterstützt unsere Hypothese stark (P= 0,01). Wir vermuten, dass die große Anzahl von Neks in den höheren Pflanzen eine Folge einer eigenständigen Expansion mit erheblichen Sub- und Neofunktionalisierungen ist. Mit anderen Worten, in höheren Pflanzen könnte diese Kinasenfamilie im Dienste zellulärer Aktivitäten, die nichts mit ihren angestammten Funktionen zu tun haben, kooptiert und erweitert worden sein. In Übereinstimmung damit ist der Befund, dass Neks höherer Pflanzen in eine Klade fallen, die sich von den Neks anderer Organismen unterscheidet (Fig. 1C).


Informationen zum Autor

Giulia Pollarolo und Joachim G. Schulz: Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Mitgliedschaften

Abteilung für Molekulare und Entwicklungsgenetik, Vlaams Instituut voor Biotechnologie, Campus Gasthuisberg, Leuven, Belgien

Giulia Pollarolo, Joachim G. Schulz, Sebastian Munck und Carlos G. Dotti

Katholieke Universiteit Leuven Zentrum für Humangenetik, Campus Gasthuisberg, Leuven, Belgien

Giulia Pollarolo, Joachim G. Schulz, Sebastian Munck und Carlos G. Dotti

Centro de Biologìa Molecular Severo Ochoa, Universitad Autónoma de Madrid, Madrid, Spanien

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Beiträge

G.P.: Experimentelles Design, Datensammlung und -zusammenstellung, Dateninterpretation, Manuskripterstellung. J.G.S.: Experimentelles Design, Datenzusammenstellung und -interpretation, Manuskripterstellung. S.M.: technische und bildgebende Unterstützung, Datenanalyse. C.G.D.: Leitung und Koordination des Projekts, Erstellung und Bearbeitung von Manuskripten. J.G.S. und C.G.D.: Überwachung des Projekts.

Korrespondierende Autoren


Materialen und Methoden

Fliegenbestände, Antikörper und Immunfluoreszenz

Die in dieser Studie verwendeten Fliegenbestände wurden zuvor beschrieben: Wildtyp Oregon R, GFP-Sas6 (Peel et al., 2007), GFP-Ana2 (Stevens et al., 2010a) und bld10c 04199 (Cep135Δ) (Mottier-Pavie und Megraw, 2009). Alle analysierten mutierten Gewebe waren sowohl mütterlich als auch zygotisch mutiert (d. h. sie wurden von homozygoten Mutanten entnommen, die von homozygot mutierten Müttern stammten), mit Ausnahme von reifen adulten Hoden, bei denen die Hoden von Fliegen entnommen wurden, die von einer Mischung homozygoter und heterozygoter Weibchen stammten.Alle hier erzeugten transgenen Linien exprimierten GFP- oder RFP-Fusionen von Cep135/Bld10 unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors, der die Expression in allen Geweben auf moderatem Niveau antreibt (Lee et al., 1988). Für die Immunfluoreszenzanalyse verwendeten wir die folgenden Antikörper: Kaninchen anti-Cep135 (diese Studie – gegen die Aminosäuren 401–700 der Drosophila Cep135/Bld10-Codierungssequenz) Meerschweinchen-Anti-Asl (diese Studie – gegen die Aminosäuren 1–333 der Asterless-Codierungssequenz) Kaninchen-Anti-Cnn (Lucas und Raff, 2007). Als sekundäre Antikörper wurden Alexa 488 Anti-Kaninchen und Alexa 568 Anti-Meerschweinchen verwendet. Hoden adulter Fliegen wurden wie zuvor beschrieben seziert und fixiert (Dix und Raff, 2007). Die Hoden wurden auf einem Olympus Flouview FV1000 mit einem 100×/1,40 Oil UPlanSApo Objektiv abgebildet. Bilder wurden verarbeitet und Zentriolen mit ImageJ gemessen.

Probenvorbereitung, Elektronentomographie und Immunelektronenmikroskopie

Die Probenvorbereitung für Hoden wurde bereits beschrieben (Stevens et al., 2010b). Flügelscheiben von Larven im 3. Larvenstadium wurden in PBS seziert und ähnlich wie Hoden präpariert. Embryonen wurden 1 h in Fruchtsaftplatten gesammelt und 1 h gealtert. Frühe synzytiale Embryonen wurden wie zuvor beschrieben verarbeitet (Dzhindzhev et al., 2010). Immunmarkierung und Elektronentomographie wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Stevens et al., 2010b). Primäre Antikörper für die Immunmarkierung waren Kaninchen-anti-Asterless (Stevens et al., 2009) oder Kaninchen-anti-Cep135 (diese Studie). Der verwendete sekundäre Antikörper war 10 nm Gold-konjugiertes Ziege-Anti-Kaninchen (Invitrogen). Tilt-Serien wurden mit SerialEM (Mastronarde, 2005) aufgenommen und Tomogramme mit dem IMOD-Paket rekonstruiert (Kremer et al., 1996).

3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie

Proben von Hoden und Flügelscheiben von Larven im dritten Larvenstadium wurden für 3D-SIM ähnlich wie für die Immunfluoreszenz mit geringfügigen Änderungen vorbereitet. Hoden und Flügelscheiben wurden auf Deckgläser gequetscht und fixiert. Die verwendeten Antikörper waren Kaninchen-anti-Asl (Stevens et al., 2009), Kaninchen-anti-DSpd2 (Dix und Raff, 2007), Kaninchen-anti-PLP (Martinez-Campos et al., 2004). Als sekundäre Antikörper wurden Alexa 590 anti-Rabbit (Invitrogen) und GFP-Booster (Chromotek) verwendet. Bildstapel für die hochauflösende Bildgebung wurden in einem OMX-Mikroskop (Applied Precision) mit einem 100×, 1,4 NA-Ölobjektiv (Olympus) aufgenommen und mit der SoftWorx-Software (Applied Precision) verarbeitet.

Datenanalyse

Die GFP-Proteindurchmesser wurden durch Anpassen eines Guassian an die Profilintensität und Extrahieren des Halbwerts der vollen Breiten-Hälfte gemessen. Die Durchmesser der asterlosen Röhren wurden gemessen, indem eine Doppelgaußsche Kurve an das Intensitätsprofil angepasst und der Abstand zwischen beiden Peaks gemessen wurde. Die Anpassung erfolgte mit der Software Prism 5d (GraphPad). Die Verteilungen wurden durch den Omnibus-Test von D’Agostino & Pearson auf Guass-Verteilungen getestet. Die Signifikanz zwischen den Verteilungen wurde von einem ungepaarten . getestet T Test für Gauß-Verteilungen und der Mann-Whitney-Test für Nicht-Gauß-Verteilungen.