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Woher kommen die Lysine bei der Ubiquitinierung?

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Ich weiß, dass Ub mit Lysin eine Isopeptidbindung eingeht, aber woher kommt das Lysin?

Sind sie für die Ub während des Ubiquitinierungsprozesses einfach immer verfügbar? Ist auf jedem der zusätzlichen Ub, die der Kette hinzugefügt werden, ein freies Lysin verfügbar? Muss der E2/E3-Komplex nach dem Anfügen des ersten Ub an das Zielprotein noch jedes Mal binden, wenn ein Ub an die Kette hinzugefügt wird?


Der Wikipedia-Artikel zu Ubiquitin gibt eine ziemlich gute Antwort auf Ihre Fragen. Schauen Sie sich die referenzierten Artikel an, wenn Sie detailliertere Antworten erhalten möchten.

Sind sie für die Ub während des Ubiquitinierungsprozesses einfach immer verfügbar?

Ja, dieser [Ubiquitinierung]-Prozess bindet am häufigsten die letzte Aminosäure von Ubiquitin (Glycin 76) an einen Lysinrest auf dem Substrat.

Ist auf jedem der zusätzlichen Ub, die der Kette hinzugefügt werden, ein freies Lysin verfügbar?

Ubiquitin hat sieben Lysine und jedes von ihnen kann an das N-terminale Glycin des nächsten Ubiquitins gebunden werden.

Muss der E2/E3-Komplex nach dem Anfügen des ersten Ub an das Zielprotein noch jedes Mal binden, wenn ein Ub an die Kette hinzugefügt wird?

Ja, aber das ist komplizierter als der allgemeine Mechanismus. Eine Poly-Ubiquitin-Kette kann genauso wie ein einzelnes Ubiquitin angehängt werden oder ein mehrere Ubiquitine können an einen bestehenden Ubiquitin-Protein-Komplex konjugiert werden. Siehe zum Beispiel Brown et al. und David et al.


Mechanismen der Mono- und Poly-Ubiquitinierung: Die Spezifität der Ubiquitinierung hängt von der Kompatibilität zwischen dem katalytischen Kern von E2 und den Aminosäureresten in der Nähe des Lysins ab

Ubiquitinierung beinhaltet die Anlagerung von Ubiquitin an Lysinreste auf Substratproteinen oder sich selbst, was zu einer Proteinmonoubiquitinierung oder -polyubiquitinierung führen kann. Die Anheftung von Ubiquitin an verschiedene Lysinreste kann verschiedene Substrat-Ubiquitin-Strukturen erzeugen, die Proteine ​​auf unterschiedliche Schicksale lenken. Die Mechanismen der Lysin-Selektion sind nicht gut verstanden. Die Ubiquitinierung durch die größte Gruppe von E3-Ligasen, die E3 s der RING-Familie, wird durch die Kooperation zwischen der nicht-katalytischen Ubiquitin-Ligase (E3) und dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2) katalysiert, wobei der RING E3 das Substrat bindet und das E2 katalysiert den Ubiquitintransfer. Frühere Studien legen nahe, dass Ubiquitinierungsstellen durch E3-vermittelte Positionierung des Lysins in Richtung des aktiven Zentrums von E2 ausgewählt werden. Letztlich erfolgt auf katalytischer Ebene die Ubiquitinierung von Lysinresten innerhalb des Substrats oder Ubiquitins durch nukleophilen Angriff des Lysinrests auf die Thioesterbindung, die das katalytische E2-Cystein mit Ubiquitin verbindet. Einer der am besten untersuchten RING E3/E2-Komplexe ist der Skp1/Cul1/F-Box-Proteinkomplex SCF Cdc4 und sein verwandtes E2, Cdc34, die auf den CDK-Inhibitor Sic1 für die K48-verknüpfte Polyubiquitinierung abzielen, was zu seinem proteasomalen Abbau führt. Unsere jüngsten Studien dieses Modellsystems zeigten, dass Reste, die Sic1-Lysine oder Lysin 48 in Ubiquitin umgeben, für die Ubiquitinierung entscheidend sind. Diese Sequenzabhängigkeit ist mit evolutionär konservierten Schlüsselresten in der katalytischen Region von Cdc34 verbunden und kann bestimmen, ob Sic1 mono- oder polyubiquitiniert ist. Unsere Studien zeigen, dass Aminosäuredeterminanten in der katalytischen Region von Cdc34 und ihre Kompatibilität mit den umgebenden Akzeptor-Lysin-Resten eine wichtige Rolle bei der Lysin-Selektion spielen. Dies könnte einen allgemeinen Mechanismus darstellen, der den Ubiquitinierungsmodus in E2 s steuert.


Schlüsselkomponenten der APC-Reaktion

Die Protein-Ubiquitinierung durch die APC erfordert die Zusammenarbeit von vier Proteinkomponenten: dem APC-Kern, der Aktivator-Untereinheit, E2 und dem Substrat (Abbildung 3). Aktivatoren, E2s und Substrate binden alle reversibel mit unterschiedlichen Affinitäten an den APC-Kern und interagieren auch miteinander. Um den Beitrag jeder dieser Komponenten zur Ubiquitinierungsreaktion zu verstehen, ist es hilfreich, zunächst ihre grundlegenden Eigenschaften zusammenzufassen.

Die vier Hauptproteinkomponenten in einer APC-Reaktion. Die Katalyse hängt von kooperativen Wechselwirkungen zwischen APC-Kern, Aktivator, Substrat und E2 ab.

APC-Kern

Die APC ist ein mit etwa 1 MDa eng verbundener Komplex aus 11 bis 13 Untereinheiten, die in Eukaryoten im Allgemeinen gut konserviert sind (Abbildung 4, Tabelle 1). Die APC ist eine Ubiquitin-Protein-Ligase vom Cullin-RING-Typ [7], in der die Untereinheiten Apc2 und Apc11 die Cullin- bzw. RING-Domänen enthalten. Wie bei anderen Cullin-RING-Ligasen interagiert die RING-Domäne von Apc11 direkt mit dem E2, und die Cullin-Domäne von Apc2 bindet Apc11 und stellt wahrscheinlich ein verlängertes Gerüst bereit, das diese beiden Untereinheiten mit dem Rest des Enzyms verbindet.

Der APC-Kern enthält mehrere Unterkomplexe. Der knospende Hefe-APC-Kern ist ein Komplex von ungefähr 1 MDa aus 13 Untereinheiten (Tabelle 1), einschließlich der neun hier gezeigten Schlüsseluntereinheiten. Ein Subkomplex (dunkelgrün) enthält die Cullin-Untereinheit Apc2 und das RING-Domänen-Protein Apc11, das E2s rekrutiert. Ein weiterer Unterkomplex (hellgrün) enthält die drei TPR-haltigen Untereinheiten Cdc27, Cdc23 und Cdc16 sowie zwei Untereinheiten, Apc4 und Apc5, die sie über Apc1 mit dem Rest der APC verbinden. Die TPR-enthaltenden Untereinheiten stellen Bindungsstellen für den Aktivator (Cdh1 oder Cdc20) bereit, der mindestens zwei APC-Interaktionsmotive, das Ile-Arg (IR)-Motiv und die C-Box, sowie eine große WD40-Wiederholungssequenz enthält, die wahrscheinlich eine Propeller-ähnliche Bindungsstelle für das Substrat bildet.

Die Analyse von APC, das aus Hefestämmen gereinigt wurde, denen einzelne Untereinheiten fehlen, führte zur Identifizierung von APC-Subkomplexen (Abbildung 4) [8]. Eine enthält Apc2 und Apc11 sowie eine dritte Untereinheit, Doc1. Doc1 enthält eine als Doc-Domäne bekannte β-Fass-Struktur, die in anderen Proteinen an der Bindung an kleine Liganden beteiligt ist, und diese Untereinheit kann zur Substratbindung beitragen, wie später diskutiert wird. Der andere APC-Subkomplex enthält drei große Untereinheiten (Cdc27, Cdc16 und Cdc23 in Hefe), die zehn oder mehr Kopien eines 34-Reste-Sequenzmotivs tragen, das als Tetratricopeptid-Repeat (TPR) bezeichnet wird. Diese Untereinheiten scheinen sequentiell mit der APC zu assoziieren, so dass die Assoziation von Cdc27 von Cdc16 und die Assoziation von Cdc16 von Cdc23 abhängt [8]. Stöchiometrische Berechnungen legen nahe, dass die TPR-Untereinheiten in zwei Kopien auf dem APC vorhanden sind [9, 10]. TPRs bilden im Allgemeinen proteinbindende Furchen, und daher stellen die mehreren TPR-Untereinheiten wahrscheinlich eine große Anzahl von Interaktionsoberflächen auf dem APC-Kern bereit.

Die beiden APC-Subkomplexe werden von der größten APC-Untereinheit Apc1 zusammengehalten (Abbildung 4). Apc4 und Apc5 helfen dabei, Apc1 mit der Basis des TPR-Subkomplexes Cdc23 zu verbinden. Die nicht essentiellen Untereinheiten Cdc26 und Swm1 (in der Abbildung nicht gezeigt) helfen, die Assoziation der TPR-Untereinheiten mit dem Rest der APC zu stabilisieren [11, 12]. Cdc26 fördert die APC-Integrität, indem es einen Komplex mit den TPR-Rillen von Cdc16 bildet [13]. Die Funktionen anderer APC-Untereinheiten bleiben unklar.

Mehrere elektronenmikroskopische (EM) Analysen haben einen Einblick in die Größe und Form der APC gegeben [9, 10, 14–16]. Bei einer Auflösung von etwa 30 Å scheint die Hefe-APC ein dreieckiges Partikel zu bilden, und die Lokalisierung einzelner Untereinheiten durch Antikörpermarkierung stimmt ungefähr mit der Architektur überein, die aus Subkomplexstudien ermittelt wurde [10, 16]. In der EM-Struktur mit der höchsten Auflösung sind die TPR-Untereinheiten in einer „Bogenlampen“-Struktur lokalisiert, und Apc2 befindet sich in einer angrenzenden „Plattform“-Region, in der E2s wahrscheinlich binden [16].

Aktivator

Trotz seiner Größe weist der APC-Kern in Abwesenheit eines seiner Aktivatorproteine, Cdc20 oder Cdh1, nur eine geringe Aktivität auf (ein dritter Aktivator, Ama1, wird ausschließlich in der Meiose exprimiert und wird hier nicht diskutiert [17]). Cdc20 assoziiert mit dem APC in der frühen Mitose, was zur Zerstörung von Zielen führt, die den Beginn der Anaphase kontrollieren. Die Cdc20-Bindung an die APC wird durch die Phosphorylierung mehrerer APC-Untereinheiten gefördert [18–23]. Später in der Mitose wird Cdc20 durch Cdh1 ersetzt, das die Aktivität durch das folgende G1 aufrechterhält. Die Assoziation von Cdh1 mit APC hängt von der Dephosphorylierung von Cdh1 ab [20, 24, 25].

Aktivatorproteine ​​sind an der Substraterkennung durch die APC beteiligt. Die carboxyterminalen Regionen von Cdc20 und Cdh1 enthalten eine WD40-Domäne, von der angenommen wird, dass sie eine Propeller-ähnliche Bindungsplattform bildet, die APC-Substrate bindet [26–29]. Es ist wahrscheinlich, dass Sequenzvariationen in den WD40-Domänen von Cdc20 und Cdh1 zu unterschiedlichen Substratspezifitäten führen. Diese Unterschiede in der Spezifität liefern einen Mechanismus für das Timing der Zerstörung verschiedener APC-Ziele in der Mitose: Cdc20 zielt auf eine kleine Anzahl von Schlüsselsubstraten für die Zerstörung in der Metaphase ab, während Cdh1 eine breitere Spezifität besitzt und auf diese Proteine ​​und viele mehr in der späten Mitose und G1 abzielt [ 30, 31].

Aktivatoren enthalten auch mindestens zwei Sequenzmotive, das Ile-Arg (IR)-Motiv und die C-Box, die für die Aktivatorbindung an den APC-Kern erforderlich sind. Das IR-Motiv besteht aus den beiden Resten am Carboxylterminus des Aktivators, und die C-Box ist ein Motiv mit acht Resten in der Nähe des Aminoterminus [29, 32, 33]. Die Aktivatorbindung an die APC wird zumindest teilweise durch die TPR-Untereinheiten vermittelt (Abbildung 4): Cdh1 bindet direkt an Cdc27 in vitro [26, 32] und spezifische Reste in den Protein-Interaktionsfurchen, die von den TPRs in Cdc27 und Cdc23 gebildet werden, sind für die Bindung von Cdh1 und Cdc20 erforderlich [34]. Das Aktivator-IR-Motiv bindet an die TPRs von Cdc27, und eine zusätzliche nicht identifizierte Aktivatorregion scheint die TPRs von Cdc23 zu binden [34]. Die C-Box-Bindungsstelle bleibt unbekannt, aber eine Möglichkeit ist die Apc2-Untereinheit, da die Entfernung von Apc2 aus dem APC die Aktivatorbindung reduziert [8]. Zusammen erzeugen diese multiplen Wechselwirkungen eine sehr hochaffine Bindung des Aktivators an den APC-Kern, und es ist wahrscheinlich, dass der Aktivator während mehrerer Substratbindungsereignisse gebunden bleibt [34]. Neuere EM-Analysen deuten darauf hin, dass sich der Aktivator zwischen der TPR-Bogenlampe und Apc2 in einer idealen Position befindet, um Substrate zu präsentieren, um eingehende E2-Ubiquitin-Konjugate anzugreifen [16].

Substrat

Während sowohl das E2 als auch das Zielprotein während der Ubiquitinierung chemisch verändert werden, verwenden wir der Übersichtlichkeit halber den Begriff „Substrat“, um sich auf das ubiquitinierte Ziel und nicht auf das E2 zu beziehen. Die beiden wesentlichen Substrate der APC sind Securin und die mitotischen Cycline (Abbildung 1) [35]. Der Abbau von Securin löst die Schwesterchromatid-Trennung aus, und der Abbau der mitotischen Cycline ist für den Abschluss der Mitose erforderlich. Das APC, insbesondere wenn es an Cdh1 gebunden ist, ubiquitiniert auch zahlreiche andere Proteine, die an verschiedenen Aspekten des mitotischen Austritts beteiligt sind [5].

Substrate binden spezifisch an den APC-Aktivator-Komplex durch Abbausequenzen, von denen die am besten verstandenen die D-Box (RXXLXXXN) und KEN-Box (KEN) sind [36, 37]. Obwohl D- und KEN-Box-Sequenzen für die Ubiquitinierung vieler Substrate durch die APC erforderlich sind, reichen sie oft nicht aus, was darauf hindeutet, dass Substrate zusätzliche nicht identifizierte Abbausequenzen enthalten [36, 37]. Zahlreiche APC-Substrate enthalten nicht-kanonische Abbausequenzen, denen jegliche eindeutige Sequenzähnlichkeit fehlt [38–45]. Es ist wahrscheinlich, dass die meisten, wenn nicht alle APC-Substrate mehrere Abbausequenzen enthalten und daher zu multivalenten Wechselwirkungen mit dem APC-Aktivator-Komplex fähig sein könnten.

Abbausequenzen und ubiquitinierte Lysine werden häufig in Substratregionen gefunden, die wahrscheinlich ungeordnet sind. Beispielsweise geht der globulären Cdk-Bindungsdomäne von Cyclinen im Allgemeinen eine ungeordnete aminoterminale Region voraus, die die kritischen D- und KEN-Box-Sequenzen zusammen mit zahlreichen Lysinen enthält. Securin besitzt wahrscheinlich auch eine ungeordnete aminoterminale APC-Erkennungsregion angrenzend an eine carboxyterminale funktionelle Domäne. Die Trennung von Abbau- und funktionellen Domänen könnte verhindern, dass das Abbausignal die normale Funktion des Proteins stört, und könnte somit die Evolution des regulatorischen Abbaus erleichtern. Da ungefaltete Sequenzen an den Amino- oder Carboxyltermini von Proteinen für ihre effiziente Entfaltung und Translokation in die Proteasompore zum Abbau erforderlich sind [46, 47], können diese ungefalteten Regionen ein Kennzeichen aller Abbauziele sein.

E2s teilen sich eine konservierte Kerndomäne von ungefähr 150 Aminosäuren, einschließlich des zentralen Cysteinrests, an den Ubiquitin gebunden ist, einige E2s enthalten auch amino- oder carboxyterminale Erweiterungen, die ihren Funktionen Spezifität verleihen. E2s werden durch das Ubiquitin-aktivierende Enzym E1 mit Ubiquitin beladen (Abbildung 2a). Da E2s dieselbe Bindungsschnittstelle verwenden, um sowohl mit E1 als auch mit E3 zu interagieren, müssen E2s von E3 dissoziieren, um mit Ubiquitin aufgeladen zu werden [48]. Der Umsatz von E2 ist sehr schnell: während in vitro Ubiquitinierungsexperimenten kann die APC innerhalb von Sekunden bis zu zehn Ubiquitine zu einem Substrat hinzufügen (MR-B und MEM, unveröffentlichte Ergebnisse).

Ubiquitin-Proteinligasen wie die APC katalysieren zwei unterschiedliche Reaktionen: die Ligation von Ubiquitinen an verschiedene Substrat-Lysine (als multiple Monoubiquitinierung bezeichnet) und die Übertragung von Ubiquitinen auf spezifische Lysine an zuvor gebundenen Ubiquitinen, was zur Bildung von Ubiquitinketten führt (als Polyubiquitinierung bezeichnet). . Die Lysin-Spezifität wird hauptsächlich durch das E2 bestimmt. In Hefe beispielsweise fördert Ubc4 die Addition von Ubiquitinen an Substrat-Lysine, während Ubc1 die Ubiquitinierung von Lysin 48 (K48) eines zuvor gebundenen Ubiquitins katalysiert, was zu K48-verknüpften Ketten führt, die vom Proteasom erkannt werden [49]. Die unterschiedlichen Vorlieben dieser E2s ermöglichen es ihnen, zusammenzuarbeiten in vivo, so dass Ubc4 die ursprünglichen Ubiquitine an Substrat-Lysine bindet und Ubc1 diese Ubiquitine in K48-verknüpfte Ketten verlängert. Bei Vertebraten neigt UbcH5 wie sein Hefe-Ortholog Ubc4 dazu, unspezifische Bindungen an Substrat-Lysine zu erzeugen [50, 51], während E2-25K wie Hefe-Ubc1 K48-verknüpfte Ketten erzeugt [49, 52]. UbcH10 ermöglicht es der APC, K11-verknüpfte Ketten herzustellen [51].


Raschke, T. M., Kho, J. & Marqusee, S. Bestätigung der hierarchischen Faltung von RNase H: eine Protein-Engineering-Studie. Nat. Struktur. Biol. 6, 825–830 (1999).

Kenniston, J. A., Burton, R. E., Siddiqui, S. M., Baker, T. A. & Sauer, R. T. Auswirkungen der lokalen Proteinstabilität und der geometrischen Position des Substratabbau-Tags auf die Effizienz der ClpXP-Denaturierung und -Abbau. J. Struktur. Biol. 146, 130–140 (2004).

Liu, T., Whitten, S. T. & Hilser, V. J. Ensemble-basierte Signaturen der Energieausbreitung in Proteinen: eine neue Sicht auf ein altes Phänomen. Proteine ​​Struktur. Funktion Genet 62, 728–738 (2006).

Martin, A., Baker, T. A. & Sauer, R. T. Die Proteinentfaltung durch eine AAA+-Protease hängt von den ATP-Hydrolyseraten und der Substratenergielandschaft ab. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 15, 139–145 (2008).

Xin, F. & Radivojac, P. Posttranslationale Modifikationen induzieren signifikante, aber nicht extreme Veränderungen der Proteinstruktur. Bioinformatik 28, 2905–2913 (2012).

Swatek, K.N. &. Komander, D. Ubiquitin-Modifikationen. Zellres. 26, 399–422 (2016).

Prakash, S., Tian, ​​L., Ratliff, K.S., Lehotzky, R.E. & Matouschek, A. Eine unstrukturierte Initiationsstelle ist für einen effizienten Proteasom-vermittelten Abbau erforderlich. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 11, 830–837 (2004).

Yu, H. & Matouschek, A. Erkennung von Clientproteinen durch das Proteasom. Annu. Rev. Biophys. 46, 149–173 (2017).

Hagai, T., Azia, A., Tóth-Petróczy, . &. Levy, Y. Intrinsische Störung in Ubiquitinierungssubstraten. J.Mol. Biol. 412, 319–324 (2011).

Godderz, D. et al. Der Cdc48-unabhängige proteasomale Abbau geht mit einem verringerten Bedarf an Ubiquitylierung einher. Wissenschaft Repräsentant 5, 1–8 (2015).

Tsuchiya, H. et al. Die in vivo-Ubiquitin-Linkage-Type-Analyse zeigt, dass die Cdc48-Rad23/Dsk2-Achse zur K48-gebundenen Kettenspezifität des Proteasoms beiträgt. Mol.-Nr. Zelle 66, 488–502.e7 (2017).

Olszewski, M. M., Williams, C., Dong, K. C. & Martin, A. Die Cdc48-Unfoldase bereitet gut gefaltete Proteinsubstrate für den Abbau durch das 26S-Proteasom vor. Komm. Biol 2, 29 (2019).

Hagai, T. &. Levy, Y. Ubiquitin dient nicht nur als Markierung, sondern unterstützt auch den Abbau, indem es die Proteinentfaltung induziert. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 107, 2001–2006 (2010).

Gavrilov, Y., Hagai, T. &. Levy, Y. Unspezifisch, aber entscheidend: Die Ubiquitinierung kann die Dynamik des modifizierten Proteins im nativen Zustand beeinflussen. Protein Sci. 24, 1580–1592 (2015).

Faggiano, S. & Pastore, A. Die Herausforderung der Herstellung ubiquitinierter Proteine ​​für Strukturstudien. Zellen 3, 639–656 (2014).

Morimoto, D., Walinda, E., Fukada, H., Sugase, K. &. Shirakawa, M. Ubiquitylation induziert direkt die Faltungsdestabilisierung von Proteinen. Wissenschaft Repräsentant 6, 39453 (2016).

Cundiff, M. D. et al. Ubiquitin-Rezeptoren werden für die substratvermittelte Aktivierung der Entfaltungsfähigkeit des Proteasoms benötigt. Wissenschaft Repräsentant 9, 14506 (2019).

Saeki, Y., Isono, E. &. Toh-E, A. Herstellung von ubiquitinierten Substraten durch das PY-Motiv-Insertionsverfahren zur Überwachung der 26S-Proteasom-Aktivität. Methoden Enzymol. 399, 215–227 (2005).

Kim, H.C., Steffen, A.M., Oldham, M.L., Chen, J. &. Huibregtse, J.M. Structure and function of a HECT domain ubiquitin-binding site. EMBO-Repräsentant 12, 334–341 (2011).

Kamadurai, H.B. et al. Mechanismus der Ubiquitin-Ligation und Lysin-Priorisierung durch eine HECT E3. eLife 2013, 1–26 (2013).

Khurana, Ritu, Hate, AnitaT., Nath, Utpal & Udgaonkar, J. B. pH-Abhängigkeit der Stabilität von Barstar gegenüber chemischer und thermischer Denaturierung. Protein Sci. 4, 1133–1144 (1995).

Myers, J. K., Pace, C. N. & Scholtz, J. M. Denaturant m-Werte und Wärmekapazitätsänderungen: Beziehung zu Änderungen der zugänglichen Oberflächenbereiche der Proteinentfaltung. Protein Sci. 4, 2138–2148 (1995).

Nolting, B. et al. Der Faltungsweg eines Proteins mit hoher Auflösung von Mikrosekunden bis Sekunden. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 94, 826–830 (1997).

Zaidi, F.N., Nath, U. &. Udgaonkar, J.B. Multiple Intermediates and Transition States during protein unfolding. Nat. Struktur. Biol. 4, 1016–1024 (1997).

Park, C. &. Marqusee, S. Sondierung der Hochenergiezustände in Proteinen durch Proteolyse. J.Mol. Biol. 343, 1467–1476 (2004).

Park, C. Untersuchung der transienten partiellen Entfaltung in Proteinen durch Proteolyse im nativen Zustand.Bio. Des.3, 117–128.

Bard, J. A. M., Bashore, C., Dong, K. C. & Martin, A. Das 26S-Proteasom verwendet ein kinetisches Gateway, um den Substratabbau zu priorisieren. Zelle 177, 286–298.e15 (2019).

Bashore, C. et al. Ubp6-Deubiquitinase kontrolliert die Konformationsdynamik und den Substratabbau des 26S-Proteasoms. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 22, 1–10 (2015).

Chojnacki, M. et al. Polyubiquitin-photoaktivierbare Vernetzungsreagenzien zur Kartierung von Ubiquitin-Interaktomen identifizieren Rpn1 als eine Proteasom-Ubiquitin-assoziierende Untereinheit. Zellchem. Biol. 24, 443–457.e6 (2017).

Lee, C., Schwartz, M. P., Prakash, S., Iwakura, M. & Matouschek, A. ATP-abhängige Proteasen bauen ihre Substrate ab, indem sie sie prozessiv aus dem Abbausignal entwirren. Mol.-Nr. Zelle 7, 627–637 (2001).

Twomey, E.C. et al. Die Substratprozessierung durch den Cdc48-ATPase-Komplex wird durch die Entfaltung von Ubiquitin initiiert. Wissenschaft 365, eaax1033 (2019).

A. H. De la Peña, E. A. Goodall, S. N. Gates, G. C. Lander & A. Martin. Wissenschaft 362, eaav0725 (2018).

Worden, E.J., Dong, K.C. & Martin, A. Ein AAA motorbetriebener mechanischer Schalter in Rpn11 steuert die Deubiquitinierung am 26S-Proteasom. Mol.-Nr. Zelle 67, 799–811.e8 (2017).

Greene, E. R. et al. Spezifische Kontakte auf der Lid-Basis im 26S-Proteasom steuern das Konformationsschalten, das für den Substrateingriff und die Degradation erforderlich ist. eLife 8, https://doi.org/10.1011/687921 (2019).

Reichard, E. L. et al. Die Substrat-Ubiquitinierung steuert die Entfaltungsfähigkeit des Proteasoms. J. Biol. Chem.-Nr. 291, jbc.M116.720151 (2016).

Guo, Q. et al. Die In-situ-Struktur neuronaler C9orf72-Poly-GA-Aggregate zeigt die Rekrutierung von Proteasomen. Zelle 172, 696–705.e12 (2018).

Komander, D. & Rape, M. Der Ubiquitin-Code. Annu. Rev. Biochem. 81, 203–229 (2012).

Sakamoto, K.M.et al. Protacs: chimäre Moleküle, die Proteine ​​zur Ubiquitinierung und zum Abbau an den Skp1-Cullin-F-Box-Komplex richten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 98, 8554–8559 (2001).

Nowak, R.P. et al. Plastizität bei der Bindung verleiht Selektivität bei einem durch Liganden induzierten Proteinabbauartikel. Nat. Chem.-Nr. Biol. 14, 706–714 (2018).

Smith, B.E.et al. Differentielle PROTAC-Substratspezifität, diktiert durch die Orientierung der rekrutierten E3-Ligase. Nat. Komm. 10, 1–13 (2019).

Huang, H.T.et al. Ein chemoproteomischer Ansatz zur Abfrage des abbaubaren Kinoms unter Verwendung eines Multi-Kinase-Degradierers. Zellchem. Biol. 25, 88–99.e6 (2018).

Bondeson, D.P. et al. Lektionen im PROTAC-Design durch selektive Degradation mit einem promiskuitiven Gefechtskopf. Zellchem. Biol. 25, 78–87.e5 (2018).

Batey, S., Nickson, A. A. & Clarke, J. Studying the Folding of Multidomain Proteins. HFSP J. 2, 365–377 (2008).

Carrion-Vazquez, M. et al. Die mechanische Stabilität von Ubiquitin ist bindungsabhängig. Nat. Struktur. Biol. 10, 738–743 (2003).

Morimoto, D. et al. Die unerwartete Rolle von Polyubiquitinketten bei der Bildung von fibrillären Aggregaten. Nat. Komm. 6, 6116 (2015).

Sousa, R. & Lafer, E. M. Die Physik des entropischen Ziehens: ein neuartiges Modell für den Hsp70-Motormechanismus. Int. J.Mol. Wissenschaft 20, 2334 (2019).

Freudenthal, B. D., Gakhar, L., Ramaswamy, S. & Washington, M. T. Structure of monoubiquitinated PCNA and Implikationen für die Transläsionssynthese und den DNA-Polymeraseaustausch. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 17, 479–484 (2010).

Varadan, R., Walker, O., Pickart, C. & Fushman, D. Strukturelle Eigenschaften von Polyubiquitinketten in Lösung. J.Mol. Biol. 324, 637–647 (2002).

Eddins, M. J., Varadan, R., Fushman, D., Pickart, C. M. & Wolberger, C. Kristallstruktur und Lösungs-NMR-Untersuchungen von Lys48-verknüpftem Tetraubiquitin bei neutralem pH. J.Mol. Biol. 367, 204–211 (2007).

Debelouchina, G. T., Gerecht, K. &. Muir, T. W. Ubiquitin verwendet einen sauren Oberflächenfleck, um die Chromatinstruktur zu verändern. Nat. Chem.-Nr. Biol. 13, 105–110 (2017).

Beckwith, R., Estrin, E., Worden, E. J. & Martin, A. Die Rekonstitution des 26S-Proteasoms zeigt funktionelle Asymmetrien in seiner AAA+-Unfoldase. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 20, 1164–1172 (2013).

Matyskiela, M. E., Lander, G. C. & Martin, A. Konformationswechsel des 26S-Proteasoms ermöglicht Substratabbau. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 20, 781–788 (2013).

Pollard, T. D. MBOC technische Perspektive: ein Leitfaden für einfache und informative Bindungsassays. Mol.-Nr. Biol. Zelle 21, 4061–4067 (2010).


Kerscher, O., Felberbaum, R. &. Hochstrasser, M. Modifikation von Proteinen durch Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Proteine. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 159–180 (2006).

Ulrich, H. D. & Walden, H. Ubiquitin-Signalgebung bei der DNA-Replikation und -Reparatur. Nat. Pfr. Mol. Zellbiol. 11, 479–489 (2010).

Komander, D. & Rape, M. Der Ubiquitin-Code. Annu. Rev. Biochem. 81, 203–229 (2012).

Pickart, C. M. &. Eddins, M. J. Ubiquitin: Strukturen, Funktionen, Mechanismen. Biochim. Biophys. Acta 1695, 55–72 (2004).

Tokunaga, F. et al. Beteiligung der linearen Polyubiquitylierung von NEMO an der NF-κB-Aktivierung. Nat. Zellbiol. 11, 123–132 (2009).

Scaglione, K. M. et al. Das Ubiquitin-konjugierende Enzym (E2) Ube2w ubiquitiniert den N-Terminus von Substraten. J. Biol. Chem.-Nr. 288, 18784–18788 (2013).

Tatham, M. H., Plechanovová, A., Jaffray, E. G., Salmen, H. & Hay, R. T. Ube2W konjugiert Ubiquitin an α-Aminogruppen von Protein-N-Termini. Biochem. J. 453, 137–145 (2013).

Deshaies, R. J. & Joazeiro, C. A. Ubiquitinligasen der RING-Domäne E3. Annu. Rev. Biochem. 78, 399–434 (2009).

Li, W. et al. Die genomweite und funktionelle Annotation menschlicher E3-Ubiquitin-Ligasen identifiziert MULAN, ein mitochondriales E3, das die Dynamik und Signalübertragung der Organelle reguliert. Plus eins 3, e1487 (2008).

Metzger, M. B., Hristova, V. A. & Weissman, A. M. HECT- und RING-Fingerfamilien der E3-Ubiquitinligasen auf einen Blick. J. Cell Sci. 125, 531–537 (2012).

Budhidarmo, R., Nakatani, Y. & Day, C.L. RINGs sind der Schlüssel zum Ubiquitin-Transfer. Trends Biochem. Wissenschaft 37, 58–65 (2012).

Huibregtse, J. M., Scheffner, M., Beaudenon, S. & Howley, P. M. Eine Familie von Proteinen, die strukturell und funktionell mit der E6-AP-Ubiquitin-Proteinligase verwandt sind. Proz. Natl. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 92, 2563–2567 (1995).

Wenzel, D. M. & Klevit, R. E. Nach Ariadnes Thread: Eine neue Perspektive auf RBR-Ubiquitin-Ligasen. BMC Biol. 10, 24 (2012).

van Wijk, S. J. & Timmers, H.T. Die Familie der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme (E2s): Entscheidung über Leben und Tod von Proteinen. FASEB J. 24, 981–993 (2010).

Wenzel, D. M., Stoll, K. E. & Klevit, R. E. E2s: baulich sparsam und funktionell vollgestopft. Biochem. J. 433, 31–42 (2011).

Wu, P. Y. et al. Ein konservierter katalytischer Rest in der Familie der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme. EMBO J. 22, 5241–5250 (2003).

Berndsen, C. E., Wiener, R., Yu, I. W., Ringel, A. E. & Wolberger, C. Ein konserviertes Asparagin spielt eine strukturelle Rolle bei Ubiquitin-konjugierenden Enzymen. Nat. Chem.-Nr. Biol. 9, 154–156 (2013).

Yunus, A. A. & Lima, C. D. Lysinaktivierung und Funktionsanalyse der E2-vermittelten Konjugation im SUMO-Weg. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 13, 491–499 (2006).

Plechanovová, A., Jaffray, E.G., Tatham, M.H., Naismith, J.H. & Hay, R. T. Struktur einer RING-E3-Ligase und Ubiquitin-beladenem E2, die für die Katalyse vorbereitet wurden. Natur 489, 115–120 (2012).

Jin, L., Williamson, A., Banerjee, S., Philipp, I. &, M. Rape. Mechanism of Ubiquitin-chain formation by the human anaphase-promoting complex. Zelle 133, 653–665 (2008).

Wickliffe, K. E., Lorenz, S., Wemmer, D. E., Kuriyan, J. &. Rape, M. Der Mechanismus der bindungsspezifischen Ubiquitin-Kettenverlängerung durch eine einzelne Untereinheit E2. Zelle 144, 769–781 (2011).

Sakata, E. et al. Kristallstruktur des UbcH5b ∼ Ubiquitin-Intermediats: Einblick in die Bildung der selbstorganisierten E2 ∼ Ub-Konjugate. Struktur 18, 138–147 (2010).

Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M. &. Wolberger, C. Mms2–Ubc13, kovalent an Ubiquitin gebunden, zeigt die strukturelle Basis der bindungsspezifischen Polyubiquitin-Kettenbildung. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 13, 915–920 (2006).

McKenna, S. et al. Ein NMR-basiertes Modell des Ubiquitin-gebundenen menschlichen Ubiquitin-Konjugationskomplexes Mms2.Ubc13: die strukturelle Grundlage für die Lysin-63-Ketten-Katalyse. J. Biol. Chem.-Nr. 278, 13151–13158 (2003).

Pruneda, J. N., Stoll, K. E., Bolton, L. J., Brzovic, P. S. & Klevit, R. E. Ubiquitin in Bewegung: Strukturstudien des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms ungefähr Ubiquitin-Konjugat. Biochemie 50, 1624–1633 (2011).

Lorick, K. L. et al. RING-Finger vermitteln Ubiquitin-konjugierendes Enzym (E2)-abhängige Ubiquitinierung. Proz. Natl. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 96, 11364–11369 (1999).

Bentley, M. L. et al. Erkennung von UbcH5c und des Nukleosoms durch den Bmi1/Ring1b-Ubiquitin-Ligase-Komplex. EMBO J. 30, 3285–3297 (2011).

Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K. & Huang, D. T. Die BIRC7-E2-Ubiquitin-Konjugatstruktur zeigt den Mechanismus der Ubiquitinübertragung durch ein RING-Dimer. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 19, 876–883 (2012).

Yin, Q. et al. E2-Wechselwirkung und Dimerisierung in der Kristallstruktur von TRAF6. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 16, 658–666 (2009).

Zheng, N., Wang, P., Jeffrey, P.D. & Pavletich, N. P. Struktur eines c-Cbl-UbcH7-Komplexes: Funktion der RING-Domäne in Ubiquitin-Proteinligasen. Zelle 102, 533–539 (2000).

Liew, C. W., Sun, H., Hunter, T. & Day, C. L. Die Dimerisierung der RING-Domäne ist für die RNF4-Funktion essentiell. Biochem. J. 431, 23–29 (2010).

Brzovic, P.S., Rajagopal, P., Hoyt, D.W., King, M.C. & Klevit, R. E. Struktur eines heterodimeren BRCA1-BARD1-RING-RING-Komplexes. Nat. Struktur. Biol. 8, 833–837 (2001).

Buchwald, G. et al. Struktur und E3-Ligase-Aktivität des Ring-Ring-Komplexes der Polycomb-Proteine ​​Bmi1 und Ring1b. EMBO J. 25, 2465–2474 (2006).

Campbell, S. J. et al. Molekulare Einblicke in die Funktion der RING-Finger (RNF)-haltigen Proteine ​​hRNF8 und hRNF168 bei der Ubc13/Mms2-abhängigen Ubiquitylierung. J. Biol. Chem.-Nr. 287, 23900–23910 (2012).

Ohi, M. D., Vander Kooi, C. W., Rosenberg, J. A., Chazin, W. J. & Gould, K. L. Strukturelle Einblicke in die U-Box, eine Domäne, die mit Multi-Ubiquitinierung verbunden ist. Nat. Struktur. Biol. 10, 250–255 (2003).

Eletr, Z. M., Huang, D. T., Duda, D. M., Schulman, B. A. & Kuhlman, B. E2-konjugierende Enzyme müssen sich vor dem E3-abhängigen Ubiquitin- und Ubiquitin-ähnlichen Transfer von ihren E1-Enzymen lösen. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 12, 933–934 (2005).

Lydeard, J. R., Schulman, B. A. & Harper, J. W. Aufbau und Umbau von Cullin-RING E3-Ubiquitinligasen. EMBO-Repräsentant 14, 1050–1061 (2013).

Skaar, J. R., Pagan, J. K. & Pagano, M. Mechanismen und Funktion der Substratrekrutierung durch F-Box-Proteine. Nat. Pfr. Mol. Zellbiol. 14, 369–381 (2013).

Hibbert, R. G., Huang, A., Boelens, R. &. Sixma, T. K. E3-Ligase Rad18 fördert eher die Monoubiquitinierung als die Bildung von Ubiquitinketten durch das E2-Enzym Rad6. Proz. Natl. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 108, 5590–5595 (2011).

Mace, P.D. et al. Strukturen der cIAP2-RING-Domäne zeigen Konformationsänderungen, die mit der Rekrutierung des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2) verbunden sind. J. Biol. Chem.-Nr. 283, 31633–31640 (2008).

Ozkan, E., Yu, H. & Deisenhofer, J. Mechanistische Einblicke in die allosterische Aktivierung eines Ubiquitin-konjugierenden Enzyms durch Ubiquitin-Ligasen vom RING-Typ. Proz. Natl. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 102, 18890–18895 (2005).

Plechanovová, A. et al. Mechanismus der Ubiquitylierung durch die dimere RING-Ligase RNF4. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 18, 1052–1059 (2011).

Spratt, D. E., Wu, K., Kovacev, J., Pan, Z.Q. & Shaw, G. S. Selektive Rekrutierung eines E2 ∼ Ubiquitin-Komplexes durch eine E3-Ubiquitin-Ligase. J. Biol. Chem.-Nr. 287, 17374–17385 (2012).

Dou, H. et al. Strukturelle Grundlage für die Autohemmung und phosphorylierungsabhängige Aktivierung von c-Cbl. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 19, 184–192 (2012).

Reverter, D. & Lima, C.D. Einblicke in die E3-Ligaseaktivität durch einen SUMO-RanGAP1-Ubc9-Nup358-Komplex. Natur 435, 687–692 (2005).

Pruneda, J. N. et al. Die Struktur eines E3:E2 ∼ Ub-Komplexes zeigt einen allosterischen Mechanismus, der von RING/U-Box-Ligasen geteilt wird. Mol.-Nr. Zelle 47, 933–942 (2012).

Bruice, T. C. & Pandit, Großbritannien Intramolekulare Modelle, die die kinetische Bedeutung von „Fit“ in der enzymatischen Katalyse darstellen. Proz. Natl. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 46, 402–404 (1960).

Jencks, W. P. Katalyse in Chemie und Enzymologie (Dover, New York, 1987).

Saha, A., Lewis, S., Kleiger, G., Kuhlman, B. & Deshaies, R.J. Wesentliche Rolle für die Interaktion von Ubiquitin-Ubiquitin-konjugierendem Enzym bei der Ubiquitin-Ausscheidung von cdc34 zum Substrat. Mol.-Nr. Zelle 42, 75–83 (2011).

Das, R. et al. Allosterische Aktivierung der E2-RING-Finger-vermittelten Ubiquitylierung durch eine strukturell definierte spezifische E2-Bindungsregion von gp78. Mol.-Nr. Zelle 34, 674–685 (2009).

Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W. & Klevit, R.E.A. Der nichtkovalente UbcH5/Ubiquitin-Komplex ist für die prozessive BRCA1-gerichtete Ubiquitinierung erforderlich. Mol.-Nr. Zelle 21, 873–880 (2006).

Das, R. et al. Die allosterische Regulation von E2:E3-Interaktionen fördert eine prozessive Ubiquitinierungsmaschine. EMBO J. 32, 2504–2516 (2013).

Notenboom, V. et al. Funktionelle Charakterisierung von Rad18-Domänen für Rad6, Ubiquitin, DNA-Bindung und PCNA-Modifikation. Nukleinsäuren Res. 35, 5819–5830 (2007).

Metzger, M. B. et al. Eine strukturell einzigartige E2-Bindungsdomäne aktiviert die Ubiquitinierung durch das ERAD E2, Ubc7p, über mehrere Mechanismen. Mol.-Nr. Zelle 50, 516–527 (2013).

Huang, L. et al. Struktur eines E6AP-UbcH7-Komplexes: Einblicke in die Ubiquitinierung durch die E2-E3-Enzymkaskade. Wissenschaft 286, 1321–1326 (1999).

Verdecia, M. A. et al. Konformationsflexibilität liegt der Ubiquitin-Ligation zugrunde, die durch die E3-Ligase der WWP1-HECT-Domäne vermittelt wird. Mol.-Nr. Zelle 11, 249–259 (2003).

Kamadurai, H. B. et al. Einblicke in Ubiquitin-Transferkaskaden aus einer Struktur eines UbcH5B ∼ Ubiquitin-HECT(NEDD4L)-Komplexes. Mol.-Nr. Zelle 36, 1095–1102 (2009).

Kamadurai, H. B. et al. Mechanismus der Ubiquitin-Ligation und Lysin-Priorisierung durch eine HECT E3. Elife 2, e00828 (2013).

Maspero, E. et al. Die Struktur einer Ubiquitin-beladenen HECT-Ligase zeigt die molekulare Grundlage für das katalytische Priming. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 20, 696–701 (2013).

Ronchi, V. P., Klein, J. M. &. Haas, A. L. E6AP/UBE3A-Ubiquitin-Ligase beherbergt zwei E2∼-Ubiquitin-Bindungsstellen. J. Biol. Chem.-Nr. 288, 10349–10360 (2013).

Kim, H. C. &. Huibregtse, J. M. Polyubiquitination by HECT E3s and the determinants of chain type specificity. Mol.-Nr. Zelle. Biol. 29, 3307–3318 (2009).

Aguilera, M., Oliveros, M., Martinez-Padron, M., Barbas, J.A. & Ferrus, A. Ariadne-1: ein lebenswichtiges Drosophila Gen wird in der Entwicklung benötigt und definiert eine neue konservierte Familie von Ringfingerproteinen. Genetik 155, 1231–1244 (2000).

Dawson, T. M. & Dawson, V. L. Die Rolle von Parkin bei der familiären und sporadischen Parkinson-Krankheit. Umzug Unordnung. 25, S32–S39 (2010).

Wenzel, D. M., Lissounov, A., Brzovic, P. S. & Klevit, R. E. Das UBCH7-Reaktivitätsprofil zeigt, dass Parkin und HHARI RING/HECT-Hybride sind. Natur 474, 105–108 (2011).

Duda, D. M. et al. Struktur von HHARI, einer RING-IBR-RING-Ubiquitin-Ligase: Autohemmung einer E3 der Ariadne-Familie und Einblicke in den Ligationsmechanismus. Struktur 21, 1030–1041 (2013).

Riley, B. E. et al. Struktur und Funktion der Parkin E3-Ubiquitin-Ligase zeigen Aspekte von RING- und HECT-Ligasen. Nat. Komm. 4, 1982 (2013).

Trempe, J. F. et al. Die Struktur von Parkin offenbart Mechanismen der Ubiquitin-Ligase-Aktivierung. Wissenschaft 340, 1451–1455 (2013).

Wauer, T. &. Komander, D. Struktur der humanen Parkin-Ligase-Domäne in einem autoinhibierten Zustand. EMBO J. 32, 2099–2112 (2013).

Stieglitz, B. et al. Strukturelle Grundlage für die Ligase-spezifische Konjugation linearer Ubiquitinketten durch HOIP. Natur 503, 422–426 (2013).

Kirisako, T. et al. Ein Ubiquitin-Ligase-Komplex baut lineare Polyubiquitin-Ketten auf. EMBO J. 25, 4877–4887 (2006).

Chaugule, V. K. et al. Autoregulation der Parkin-Aktivität durch seine Ubiquitin-ähnliche Domäne. EMBO J. 30, 2853–2867 (2011).

Burchell, L., Chaugule, V.K. &. Walden, H. Kleine, N-terminale Tags aktivieren die Ubiquitin-Ligase-Aktivität von Parkin E3, indem sie seine autoinhibierte Konformation unterbrechen. Plus eins 7, e34748 (2012).

Cookson, M. R. Parkinsonismus aufgrund von Mutationen in PINK1, Parkin und DJ-1 sowie oxidativem Stress und mitochondrialen Signalwegen. Kalter Frühlingshafen. Perspektive. Med. 2, a009415 (2012).

Hofmann, K. & Bucher, P. Die UBA-Domäne: ein Sequenzmotiv, das in mehreren Enzymklassen des Ubiquitinierungswegs vorhanden ist. Trends Biochem. Wissenschaft 21, 172–173 (1996).

Walden, H. &. Martinez-Torres, R.J. Regulation der Parkin E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität. Zelle. Mol.-Nr. Leben Sci. 69, 3053–3067 (2012).

Komander, D., Clague, M.J. & Urbe, S. Breaking the Chains: Struktur und Funktion der Deubiquitinasen. Nat. Pfr. Mol. Zellbiol. 10, 550–563 (2009).

Smit, J. J. et al. Die E3-Ligase HOIP spezifiziert den linearen Aufbau der Ubiquitinkette durch ihre RING-IBR-RING-Domäne und die einzigartige LDD-Erweiterung. EMBO J. 31, 3833–3844 (2012).

Stieglitz, B., Morris-Davies, A. C., Koliopoulos, M. G., Christodoulou, E. & Rittinger, K. LUBAC synthetisiert lineare Ubiquitinketten über ein Thioester-Zwischenprodukt. EMBO-Repräsentant 13, 840–846 (2012).

Smit, J. J. et al. Die Zielspezifität der E3-Ligase LUBAC für Ubiquitin und NEMO beruht auf unterschiedlichen Mindestanforderungen. J. Biol. Chem.-Nr. 288, 31728–31737 (2013).

Vijay-Kumar, S., Bugg, C. E. & Cook, W. J. Structure of Ubiquitin verfeinert bei 1,8 Auflösung. J.Mol. Biol. 194, 531–544 (1987).

Komander, D. et al. Molekulare Diskriminierung von strukturell äquivalenten Lys 63-verknüpften und linearen Polyubiquitinketten. EMBO-Repräsentant 10, 466–473 (2009).

Datta, A.B., Hura, G.L. & Wolberger, C. The structure and conformation of Lys63-linked tetraubiquitin. J.Mol. Biol. 392, 1117–1124 (2009).

Cook, W.J., Jeffrey, L.C., Carson, M., Chen, Z. & Pickart, C.M. Structure of a diubiquitin conjugate and a model for interaction with ubiquitin conjugating enzyme (E2). J. Biol. Chem.-Nr. 267, 16467–16471 (1992).

Wu, G. et al. Structure of a β-TrCP1-Skp1-β-catenin complex. Mol.-Nr. Zelle 11, 1445–1456 (2003).

Zheng, N. et al. Structure of the Cul1–Rbx1–Skp1–F box Skp2 SCF ubiquitin ligase complex. Natur 416, 703–709 (2002).

Duda, D.M. et al. Structural insights into NEDD8 activation of cullin-RING ligases: conformational control of conjugation. Zelle 134, 995–1006 (2008).


Diskussion

Previously, we have shown that KLHL12 interacts with the polymorphic repeats of the D4R and enhances its ubiquitination [8] but this has no influence on receptor degradation [31]. In the present study we investigated which specific residues of the D4R are ubiquitinated by the KLHL12-Cullin3 E3 ligase complex. In the whole sequence of D4R there are only four lysine residues and all of them can potentially serve as ubiquitin binding sites as they are localized in the intracellular domains of the receptor. Using a site-directed mutagenesis approach each lysine was separately mutated to arginine. Next, sequential double IP experiments demonstrated that all four mutants are ubiquitinated and overexpression of KLHL12 increases their ubiquitination level ( Fig 2 ). This suggests that ubiquitination occurs on multiple lysines or that the ubiquitination system is flexible and when the most preferred ubiquitin binding site is unavailable it can ubiquitinate another available lysine. Next, we created the quadruple mutant HA D4.2 4KRR in which all four lysines were mutated to arginines. This mutant should be unable to undergo lysine-mediated ubiquitination. Surprisingly, we could still detect basal ubiquitination of this mutated receptor and upon co-expression of KLHL12 an increase in its ubiquitination was visualized ( Fig 3 ). This finding encouraged us to search for other possible ubiquitination sites in the D4R. Ubiquitination on non-lysine residues is still a poorly studied phenomenon and until now ubiquitination on the N-terminus [11�, 40], cysteine [14�], serine and threonine [17�] residues was described, but it has only been suggested once for a GPCR unfortunately without characterizing the precise amino acid residue [32]. In our study we investigated the possibility of ubiquitin binding to cysteine, serine and threonine residues within the intracellular domains of the D4R. One of the most common approaches to verify ubiquitination on a non-lysine residue is a chemical cleavage of ubiquitin [38]. Ubiquitin attached to a lysine residue forms an isopeptide bond which is very stable, whereas a thioester bond connecting ubiquitin with cysteine can be destroyed during treatment with a highly reducing agent e.g. a high concentration of DTT [15, 16, 36]. Our results clearly indicate that upon treatment with a very high concentration of DTT the ubiquitination signal detected after the second IP is significantly reduced for both WT D4.2R and D4.2 4KRR, suggesting ubiquitination on cysteine residues ( Fig 4 ).

Next, we examined the possibility of ubiquitination on serine and/or threonine residues. When ubiquitin is attached to a serine or threonine residue an oxyester bond is formed which is susceptible for cleavage in a strong alkaline environment [36, 37]. We have performed a ubiquitination assay in which, after the first IP, the samples were treated with NaOH and after the second IP a strong decrease in ubiquitination signal was observed ( Fig 5A ). These results thus suggest that D4R ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine residues can be promoted by KLHL12. It is, however, not possible to say which residues are the most preferred for KLHL12-induced ubiquitination as quantification of the results from multiple independent experiments indicates a comparable decrease in ubiquitination levels for both types of treatments ( Fig 5B� ). The decrease is more explicit when Etag KLHL12 is co-expressed which suggests that during KLHL12-promoted ubiquitination more non-lysine residues in the D4R are ubiquitinated compared to the basally ubiquitinated receptor. This decrease is even more striking in case of the D4.2 4KRR mutant in which no lysine residues are available. This indicates that in the WT receptor KLHL12 promotes ubiquitination on lysine and non-lysine residues and in the D4.2 4KRR mutant, in which lysines are not available, only non-lysine residues are ubiquitinated. The fact that in all experiments we detect an overall lower ubiquitination signal from D4.2 4KRR ( Fig 5F ) compared to WT D4.2R further supports the hypothesis about the involvement of lysine residues in KLHL12-mediated ubiquitination of D4R. To exclude the possibility that the alkaline treatment affects amide bonds which are normally formed between ubiquitin and lysine residues we have also checked the influence of NaOH on ubiquitination of other GPCRs for which lysines were described as ubiquitin binding sites. We have used the CXCR4 receptor for which three lysines in the C-terminal tail were shown to be critical for receptor ubiquitination [26]. As a second receptor we used the β2AR for which lysines in the third intracellular loop and in the C-terminal tail were presented to be important for ubiquitination and subsequent lysosomal degradation [28]. In this control experiment (S3 Fig), we have seen again a very strong effect of NaOH treatment on basal and KLHL12-induced ubiquitination of D4.2R and no effect on CXCR4 and β2AR ubiquitination. This result allows us to conclude that the conditions used for alkaline treatment are not affecting amide bonds which are formed during the typical lysine-linked ubiquitination process. Most papers that study ubiquitination on non-lysine residues identified several different residues as possible ubiquitination sites. Some of them are most preferred by the ubiquitination machinery but when those are not available ubiquitin can bind to other amino acids. Such situation was described for example for NS-1 nonsecreted immunoglobulin light chain (NS-1 LC) which is predominantly ubiquitinated on serine/threonine residues but when these amino acids were mutated then lysine residues could serve as ubiquitin-binding sites. Mutation of all three types of amino acids (serines, threonines and lysines) was required to efficiently reduce ubiquitination and stabilize the NS-1 LC [37]. Another example represents the T-cell antigen receptor α-chain (TCRα) for which mutation of two conserved serine residues to alanines in the cytosolic tail inhibited significantly receptor ubiquitination. However, when serine residues were replaced with lysine, cysteine or threonine residues the protein was still ubiquitinated [17]. Our findings seem to be in agreement with this previously described phenomenon showing that the ubiquitination machinery is a very flexible system and can easily change from one to another ubiquitination site if necessary.

To obtain a direct proof of ubiquitination on a non-lysine residue we decided to perform mass spectrometry (MS) analysis. Detection of ubiquitination by MS is possible due to the di-glycine remnant that remains attached to the ubiquitinated residue after tryptic digestion [41]. We have performed MS/MS analysis using a Fourier transform mass spectrometer but no ubiquitination was detected. Unfortunately, during tryptic digestion D4R is cut to single amino acid or very large fragments making it very hard to analyze. The computational prediction of cleavage of D4R with other enzymes, commonly used to prepare samples for MS analysis, did not suggest any good alternative to trypsine that could resolve this problem. According to our knowledge non-conventional ubiquitination was never proved with MS analysis probably due to the labile nature of thio-/oxy-ester bonds which are formed between ubiquitin and non-lysine residues. So far, only one study described the use of a novel peptide-based SILAC method to identify non-conventional ubiquitination of T-cell receptor α [42]. The authors could identify modified peptide which did not contain lysine in its sequence, however, they were unable to pinpoint the specific residue that undergoes ubiquitination.

Therefore, it is not very surprising that the detection of ubiquitination of D4R with MS/MS was not successful.

However, and most importantly, all the obtained data allow us to conclude that KLHL12 can promote ubiquitination of D4R on non-lysine residues and that ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine is possible. The functional role of this non-lysine ubiquitination is hard to study because it would require the creation of a receptor with all possible ubiquitination sites mutated. Mutation of all intracellular cysteines, serines and threonines increases the chances of disrupted protein folding and it can also interfere with other posttranslational modifications. GPCRs are tightly regulated by phosphorylation which mainly occurs on serine and threonine residues and also by palmitoylation on cysteine residues (conserved cysteines located on the C-terminus of many GPCR) and also D4R shows these posttranslational modifications. Additionally, this can also inhibit binding of some interacting proteins, e.g. β-arrestins for which often phosphorylation of the receptor is required and which also play a critical role in the regulation of GPCR signaling. Therefore, mutation of all of these residues increases the possibility of creating of a mutant with completely different signaling properties compared to the wild type receptor. In most of the examples of non-lysine ubiquitination, which were described up to now, this modification seems to serve as a signal for protein degradation [14, 17�, 21]. Only in the case of Pex5p receptor (cytosolic receptor for peroxisome matrix proteins) ubiquitination of conserved cysteine 11 was shown to be involved in regulation of the recycling of the receptor form the peroxisomes to cytosol [15]. To the best of our knowledge, ubiquitination of the non-lysine residue was suggested only once for a GPCR. The group of Shenoy has shown that β2AR is probably ubiquitinated on a non-lysine residue in response to the treatment with an antagonist, carvedilol, as they could still detect ubiquitination of the β2AR in which lysines were mutated. Interestingly, the same mutant was not ubiquitinated upon agonist, isoproterenol, treatment. Carvedilol-promoted ubiquitination is mediated by a completely different E3 ubiquitin ligase which is not involved in the, already well defined, lysine-mediated ubiquitination of β2AR. However, both types of ubiquitination lead to endocytosis and lysosomal sorting of the receptor [32].

In the second part of our study we investigated the ubiquitination status of the three most common D4R polymorphic variants. First, the interaction of KLHL12 with these variants was examined. After IP of HA-tagged receptors co-precipitation of Etag KLHL12 with D4.2R, D4.4R and D4.7R was detected ( Fig 6 ). As a negative control we used D4.0R which is an artificial receptor variant lacking the polymorphic repeats. Next, a double sequential IP was performed to investigate the ubiquitination status of the different polymorphic variants. Ubiquitination of D4.2R and D4.4R was clearly increased when Etag KLHL12 was co-expressed, but surprisingly we hardly observed increased D4.7R ubiquitination ( Fig 7A and 7B ), although this receptor variant is still able to form a complex with KLHL12 and Cullin3 ( Fig 8 ). The differential ubiquitination pattern of the D4.7R, compared to the other D4R variants, is highly interesting as until now there is hardly evidence for pharmacological differences between this variant and the other receptor variants [43�], although behavioral research showed that the D4.7R is linked with a predisposition to develop ADHD [6], and also its association with increased sexual behavior, alcohol and cigarette craving was suggested. The functional role of differential KLHL12-mediated ubiquitination of the D4R is still under investigation. This finding opens a lot of new questions for future research on the possible role of ubiquitination in receptor signaling and suggests that ubiquitination can regulate GPCRs in a much more complicated way than previously expected.


Abstrakt

Ubiquitin (Ub)-conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin ligases (E3s) catalyze the attachment of Ub to lysine residues in substrates and Ub during monoubiquitination and polyubiquitination. Lysine selection is important for the generation of diverse substrate-Ub structures, which provides versatility to this pathway in the targeting of proteins to different fates. The mechanisms of lysine selection remain poorly understood, with previous studies suggesting that the ubiquitination site(s) is selected by the E2/E3-mediated positioning of a lysine(s) toward the E2/E3 active site. By studying the polyubiquitination of Sic1 by the E2 protein Cdc34 and the RING E3 Skp1/Cul1/F-box (SCF) protein, we now demonstrate that in addition to E2/E3-mediated positioning, proximal amino acids surrounding the lysine residues in Sic1 and Ub are critical for ubiquitination. This mechanism is linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34 and independent of SCF. Changes to these core residues altered the lysine preference of Cdc34 and specified whether this enzyme monoubiquitinated or polyubiquitinated Sic1. These new findings indicate that compatibility between amino acids surrounding acceptor lysine residues and key amino acids in the catalytic core of ubiquitin-conjugating enzymes is an important mechanism for lysine selection during ubiquitination.

Protein ubiquitination plays a fundamental role in most cellular processes and involves three classes of enzymes (22). First, the 8-kDa protein ubiquitin (Ub) forms a thioester bond with the E1 Ub-activating enzyme. Ub is then transferred from E1 to the active-site cysteine of E2. Finally, E2s in conjunction with an E3 transfer Ub to a substrate lysine to form an isopeptide bond. E3 ligases are important for substrate recognition, and two major families exist. The RING (really interesting new gene) finger E3s, which lack catalytic activity, recruit the substrate and E2 into one complex to facilitate ubiquitination (19). Catalytic HECT (homologous to E6-AP carboxyl terminus) E3s accept Ub from E2 via a catalytic cysteine and then transfer Ub to a substrate lysine (22). The versatility of Ub in regulating different processes derives from its ability to be conjugated as a monomer (monoubiquitination) or polymer (polyubiquitination) to substrate lysines. Since Ub contains seven lysines, polyubiquitination can generate chains with different topologies (18). Monoubiquitination can regulate DNA repair, viral budding, trafficking, and gene expression (17). Polyubiquitination through Ub K11, K29, or K48 results in proteasomal degradation, while K63-linked Ub chains function in kinase activation, DNA damage tolerance, signal transduction, and endocytosis (17). In RING E3s the mode of ubiquitination (mono- or polymeric) and Ub linkage specificity are determined by E2, while HECT E3s specify the mode of ubiquitination with this family (11, 12).

The mechanisms that control mono- or polyubiquitination, chain topology, and lysine selection are poorly understood. Insights into this area have come from studies of the RING E3 ligase Skp1-Cdc53/cullin F-box (SCF) protein and its cognate E2, Cdc34, (19). One critical substrate of the budding yeast SCF Cdc4 /Cdc34 complex (superscript indicates the F-box protein) is Sic1. Sic1 is an inhibitor of the cyclin-dependent kinase (CDK) Cdc28 (29), containing a CDK-inhibitory domain within its C-terminal 70 amino acids (9). In Saccharomyces cerevisiae, G1-S-phase cell cycle progression depends on the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated polyubiquitination of Sic1 on at least one of the six N-terminal lysine residues (K32, K36, K50, K53, K84, and K88) via K48-linked Ub chains, leading to its proteasomal degradation (9, 20). A Sic1 mutant missing these six lysines is still ubiquitinated on the remaining 14 lysines in vitro but is not degraded and is stable in vivo, leading to cell cycle arrest (20).

While a Ub chain on any one of six Sic1 N-terminal lysines sustains proteolysis, the turnover rates vary by 5-fold between the K36 and K84 sites, indicating that the context of the Ub chain is important (20). How SCF Cdc4 /Cdc34 ubiquitinates different Sic1 lysines and whether a lysine preference exists are poorly understood, but a “positioning model” has been proposed, where E3 positions substrate lysines favorably for the attack of the E2∼Ub thioester bond (19, 37). Previous studies suggested that the number of substrate ubiquitination sites correlates with the number of its F-box protein binding sites (8, 33, 37). For example, the ubiquitination of β-catenin and I㮫α is directed by a single high-affinity F-box protein binding site, and changes to the distance between the binding site and the lysine affect catalysis by 𢏂-fold (37). The phosphorylation of Sic1 on multiple CDK sites at the N terminus generates several low-affinity Cdc4 binding sites that dynamically bind Sic1 to the single site of Cdc4 in various geometries, leading to ubiquitination on numerous lysines. The directed binding of Sic1 to Cdc4 through a single artificial high-affinity binding site at the extreme N terminus confines efficient ubiquitination to lysines K84 and K88 (33). Sic1 lysine selection flexibility may also be achieved by the dimerization of the RING E3/E2 complex (8, 33). In addition, the neddylation of the cullin subunit induces conformational variation to the E2, enhances the recruitment of E2 to SCF, and brings substrate lysines toward the Cdc34∼Ub thioester to accommodate the ubiquitination of different lysines (6, 25). Lysine selection flexibility may also be achieved by the release of the ubiquitin-charged Cdc34∼Ub from SCF to transfer Ub to different substrate lysines, as proposed by the “hit-and-run” hypothesis (5). Apart from higher-order structures contributing to lysine selection flexibility, studies with the human anaphase-promoting complex (APC/C) RING E3 and its E2, UbcH10, have identified a sequence motif adjacent to acceptor lysines, termed the TEK box, which is important for lysine selection (11).

Similar to the E3-mediated positioning of substrate lysines, structural aspects of E2s position Ub lysines to generate Ub chains of different topologies by RING E3/E2 complexes (11, 12). Structural studies of Mms2/Ubc13-Ub demonstrate that this complex assembles so that K63 of Ub is positioned proximal to the Ubc13-Ub thioester bond during Ub chain formation (35). Similarly, Cdc34 dimerization, a noncovalent Ub binding domain (UBD), and structural constraints such as an acidic loop region were suggested previously to position K48 of Ub for the attack of the Cdc34∼Ub thioester bond (21, 36). However, E2s such as human UbcH5 utilize all Ub lysines but display a preference for K11, K48, and K63, indicating less structural constraint and that other mechanisms contribute to Ub lysine preference (12).

To further elucidate the mechanisms of lysine specificity, we assessed the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated ubiquitination of Sic1's N-terminal lysines and K48 in Ub. SCF Cdc4 /Cdc34 displayed a strong preference for Sic1 K53. Changes to proximal amino acids regulated the rate of ubiquitination in Sic1 and K48 of Ub. This was linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34. The mutation of these core sites differentially affected Cdc34 preference toward lysines on Sic1 or Ub K48. Our studies demonstrate that in addition to the importance of the SCF/Cdc34-mediated positioning of lysines, efficient catalysis is dependent on residues surrounding ubiquitinated lysines and their compatibility with the Cdc34 catalytic core residues. We propose that this compatibility is an important mechanism for lysine selectivity during ubiquitination.


Ubiquitin Specific Peptidase 16

Normal Function and Disease Involvement

Histone ubiquitination occurs primarily on histone H2A and H2B with ubiquitination levels between 5–15% and 0.1–1% for histone H2A and H2B respectively [29,30] . Histone H2A is ubiquitinated by Polycomb Repressive Complex 1 catalytic subunit Ring1b [31–33] . H2A ubiquitination is strongly associated with gene repression. Usp16 opposes the activity of Ring1b by removing ubiquitin from H2A lysine 119 [10] . Histone H2A deubiquitination has been shown to play pivotal roles in cell cycle progression, gene expression and DNA damage response [5,10,11] .

Early work demonstrated a requirement for Usp16 deubiquitinase activity during mitosis. A catalytically inactive Usp16 mutant was found to coat mitotic chromosomes and block cell cycle progression [5] . Subsequently, it was discovered that Usp16 H2A deubiquitination is required for the Aurora B catalyzed Ser-10 phosphorylation of H3 [10] . The phosphorylation status of Usp16 changes sequentially during cell cycle progression, possibly through the activity of cdc-2/cyclin B [5] . Although changes in phosphorylation state have not been associated with altered deubiquitinase activity in vitro, the phosphorylation state of Usp16 may control its cellular localization, oligomerization state, or may serve as a docking site for associating proteins.

Characterizations of the H2A ubiquitin ligase Ring1b established the importance of H2A ubiquitination for Hox gene repression and X chromosome inactivation [31–33] . Usp16 mediated H2A deubiquitination is required for Hox gene expression [10] . Developmental studies in X. laevis demonstrate that Usp16 catalyzed H2A deubiquitination of Hox genes is required for proper Hox gene expression and posterior body patterning [10] .

Recapitulating its role in gene expression, Usp16 also reverses the ubiquitin H2A stimulated transcriptional repression that occurs during DNA damage response [11] . Following DNA damage, H2A is rapidly ubiquitinated for several hundred kilobases from the site of damage. The ubiquitination of H2A following DNA damage is associated with transcriptional silencing and is required for the recruitment of DNA damage repair proteins [34,35] . Usp16 participates in the restoration of normal gene expression following damage repair by deubiquitinating H2A [11] .

Recent characterization of the genome and epigenome of human breast tumors and leukemias has revealed that Usp16 is consistently downregulated in cancer cells. In addition to the genetic changes which initiate cancer, general epigenetic misregulation is common in tumors, including epigenetic silencing of tumor suppressors and activation of oncogenes. It is theorized that Usp16 downregulation could be associated with stable gene silencing following DNA damage [11] . Alternatively, Usp16 downregulation may influence global gene expression levels. Additionally, genetic inversions involving Usp16 and RUNX1 (a key regulator of hematopoiesis) have been observed in chronic myelomonocytic leukemias. The inversion results in the partial deletion of Usp16 and Runx1 and the creation of a new Usp16-Runx1 fusion protein [36] . The pathogenic potential of Usp16 downregulation and deletions has not been thoroughly explored.


Abstrakt

Endocytosis and targeting of growth factor receptors for lysosomal degradation have been associated with ubiquitination of the intracellular part of the receptors. To elucidate the role of receptor ubiquitination in internalization and sorting of fibroblast growth factor receptor (FGFR), we constructed several mutants of FGFR1 in which lysines, potential ubiquitination sites, were substituted for arginines. Substitution of all lysine residues in the intracellular part of FGFR1 resulted in inactivation of the tyrosine kinase domain of the receptor. However, several multilysine FGFR1 mutants, where up to 26 of 29 lysines in the intracellular part of the receptor were mutated, retained tyrosine kinase activity. The active multilysine mutants were poorly ubiquitinated, but internalized normally, indicating that ubiquitination of the receptor is not required for endocytosis. In contrast, degradation of the multilysine mutants was dramatically reduced as the mutants were inefficiently transported to lysosomes but rather sorted to recycling endosomes. The altered sorting resulted in sustained signaling. The duration of FGFR1 signaling seems to be tightly regulated by receptor ubiquitination and subsequent sorting to the lysosomes for degradation.


Additional Information

Zugangscodes: Coordinates and structure factors have been deposited in the RCSB protein data bank (PDB) under accession codes: 5KTY (hMiro1-BC_Ca 2+ ), 5KU1 (hMiro1-BC_GDP), 5KSZ (hMiro1-BC_GMPPCP), 5KSP (hMiro1-C C2221), 5KSY (hMiro1-C P41212), 5KSO (hMiro1-C P3121), 5KUT (hMiro2-C).

How to cite this article: Klosowiak, J. L. et al. Structural insights into Parkin substrate lysine targeting from minimal Miro substrates. Wissenschaft Vertreter. 6, 33019 doi: 10.1038/srep33019 (2016).