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DNA-Replikation und -Kombination

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„Jede Gamete ist genetisch einzigartig, weil die DNA der Elternzelle vor der Zellteilung gemischt wird. Dies trägt dazu bei, dass auch die neuen Organismen, die durch die sexuelle Fortpflanzung gebildet werden, einzigartig sind.“

Warum sagen wir dann, dass die DNA der Eltern die Eigenschaften des Kindes beeinflusst, während die DNA des Kindes als Kombination aus gemischten Stickstoff- und Phosphatbasen gebildet wird?


Um es kurz zu erklären:

Nehmen wir als Beispiel einen Menschen, Sie sind diploid und haben ein Paar von 23 Chromosomen (= insgesamt 46) und die Geschlechtschromosomen, die ich für diese Erklärung ausschließe.

Ihre Gamete ist haploid und besitzt daher nur eines der beiden gepaarten Chromosomen. Für jedes Chromosomenpaar gibt es also 2 mögliche Chromosomen. Insgesamt hast du also 223 Möglichkeiten, Chromosomen anzuordnen. Die Gamete des Sexualpartners hat auch 223 Möglichkeiten, Chromosomen anzuordnen. Insgesamt hat also ein neuer diploider Organismus (223)x(223) Möglichkeiten. So einzigartig.

Es sind jedoch immer die Chromosomen der Eltern. Also ja, Eltern beeinflussen die Kinder, weil die genetischen Informationen der Kinder in einem der beiden Elternteile zu finden sind.

Außerdem hast du Rekombination, aber du hast schon eine andere Frage dazu gestellt. Daher werde ich diese Antwort nicht erweitern.

Es gibt relevante Artikel in Wikipedia über genetische Rekombination und Meiose, die ich empfehlen würde.


Eltern beeinflussen den Charakter der Kinder, weil das Mischen (Überkreuzen) nur wenige Gene verändert, die auf dem Elternchromosom vorhanden sind und auch diese veränderten Genteile sind auch elterlich, also erhalten wir tatsächlich ein nicht elterliches Chromosom (durch Mischen erzeugt), aber die darauf vorhandenen Gene sind immer noch vorhanden Eltern… Hoffe das hilft


MCAT Biology: DNA-Replikation und -Reparatur

In einem Labor wird eine Kultur menschlichen Gewebes gezüchtet, um die Mitose zu untersuchen. Eine Lösung, die radioaktiv markierte Cytosine enthielt, wurde der Kultur in der Mitte der Prophase zugesetzt, und dann wurde das Wachstum am Ende der Telophase gestoppt. Wo würden die Wissenschaftler radioaktiv markierte DNA sehen?

Nur in den Mutterzellen – nicht in den Zellen, die am Ende der Telophase gebildet werden

In den Kernen jeder Zelle

Nur in den Kernen der Hälfte der Zellen

In den am Ende der Telophase produzierten Zellen – nur die Tochterzellen

DNA wird in der S-Phase repliziert. Prophase ist ein Teil der Mitose oder M-Phase. Da die gesamte DNA, die am Ende der Telophase vorhanden wäre, bereits in der S-Phase synthetisiert worden war, würde keines der radioaktiv markierten Cytosine in die DNA irgendwelcher Zellen in der Kultur eingebaut werden.

Beispielfrage #2: DNA-Replikation und -Reparatur

Welche Antwortmöglichkeit stimmt richtig mit dem Molekül mit seiner Funktion bei der DNA-Replikation überein?

Topoisomerase – verhindert das Reannealing der DNA während der Replikation

Einzelsträngige Bindungsproteine ​​– entwirren Supercoils

Einzelsträngige Bindungsproteine ​​– verhindert das erneute Anlagern der DNA während der Replikation

Polymerase – fügt Nukleotide zu neuen Strängen hinzu

DNase – fügt Nukleotide zu neuen Strängen hinzu

Einzelsträngige Bindungsproteine ​​– entwirren Supercoils

Polymerase – fügt RNA-Primer vor der Replikation hinzu

Primase – fügt Nukleotide zu neuen Strängen hinzu

Einzelsträngige Bindungsproteine ​​– verhindert das erneute Anlagern der DNA während der Replikation

Topoisomerase funktioniert, um das Supercoiling der DNA zu entwirren, bei dem sich die DNA in sich selbst überwindet. Dieser Mechanismus erleichtert die Abwicklungswirkung der Helikase während der Replikation. Einzelsträngige Bindungsproteine ​​binden an die beiden entpackten DNA-Stränge, um zu verhindern, dass sie vorzeitig wieder zu einem ganzen Molekül zusammenkommen, sonst würde die Replikation unterbrochen.

Die anderen diskutierten Proteine ​​erfüllen die folgenden Funktionen.

Polymerase – fügt Nukleotide zu neuen Strängen hinzu

Primase – fügt RNA-Primer vor der Replikation hinzu

DNase – spaltet und baut DNA-Moleküle ab

Beispielfrage Nr. 1: DNA-Replikation und -Reparatur

Welcher der folgenden Schritte ist der erste, der während der DNA-Replikation aktiv wird?

Helicase ist die erste Komponente der DNA-Replikationsmaschinerie, die während der Replikation aktiv wird. Es funktioniert, indem es die doppelsträngige DNA "entpackt", damit anschließend die Replikation erfolgen kann. Nach der Arbeit der Helikase erzeugt Primase einen Primer, zu dem die DNA-Polymerase anschließend Desoxynukleotide hinzufügt und den Strang verlängert. Die DNA-Ligase wirkt am Ende der Replikation, indem sie die Okazaki-Fragmente des nacheilenden Strangs zusammenfügt.

Beispielfrage Nr. 4: DNA-Replikation und -Reparatur

Das Meselson-Stahl-Experiment lieferte die notwendigen Beweise, um den Mechanismus der DNA-Replikation aufzudecken. Diese Entdeckung gelang ihnen, indem sie zunächst DNA mit dem schweren 15 N Stickstoffisotop kultivierten. Dann ließen sie die "schwere" DNA mit DNA, die in normalem 14 N Stickstoff gezüchtet wurde, replizieren. Die Dichte jeder Generation replizierter DNA wurde durch Markieren ihrer Position in einem Teströhrchen nach der Zentrifugation aufgezeichnet. Die Position jeder Generation wurde dann mit den Positionen von reiner 15 N DNA und reiner 14 N DNA verglichen.

Angenommen, die erste Generation nach der Replikation zeigte nach dem Zentrifugieren zwei Banden: eine bei der reinen 14 N-Marke und eine bei der reinen 15 N-Marke. Welche Replikationsmethode würde diese Beobachtung unterstützen?

Eine weitere Generation wäre nötig, um einen tragfähigen Mechanismus zu finden

Konservative Replikation schlägt vor, dass beide DNA-Stränge als Matrize fungieren, sich jedoch während der Replikation nicht trennen. Wenn die schweren Stränge zusammenbleiben würden, würden wir einen "schweren" DNA-Satz an der 15 N-Marke sowie einen "normalen" DNA-Satz an der 14 N-Marke erwarten.

Sowohl die semikonservative als auch die dispersive Replikation würde eine singuläre DNA-Bande zwischen den beiden Markierungen vorhersagen.

Beispielfrage Nr. 5: DNA-Replikation und -Reparatur

Im Vergleich zur RNA-Polymerase weist die DNA-Polymerase eine viel geringere Fehlerrate beim Nukleotideinbau auf. Welcher strukturelle Unterschied zwischen den beiden Polymerasen ist dafür verantwortlich?

RNA ist viel weniger stabil als DNA, und diese Instabilität erschwert das Korrekturlesen der RNA-Polymerase, da sie Basen in die Sequenz einbaut.

RNA-Moleküle werden nach ihrer Synthese Korrektur gelesen, DNA-Moleküle jedoch nicht.

DNA-Polymerase enthält eine Korrekturlesedomäne, die es ihr ermöglicht, eine falsche Basenpaar-Insertion zu erkennen, bevor sie weitergeht. RNA-Polymerase tut dies nicht.

Die RNA-Polymerase baut die Nukleinsäuren so in Sequenzen ein, dass sie fester an ihre Partnernukleinsäure gebunden sind, was das Ersetzen falscher Insertionen deutlich erschwert.

DNA-Polymerase enthält eine Korrekturlesedomäne, die es ihr ermöglicht, eine falsche Basenpaar-Insertion zu erkennen, bevor sie weitergeht. RNA-Polymerase tut dies nicht.

RNA-Polymerase enthält keine Korrekturlesedomäne, was sie viel fehleranfälliger macht als DNA-Polymerase. Diese Domäne in der DNA-Polymerase verhindert eine falsche Nukleotid-Insertion und reduziert die Fehler, die bei der DNA-Replikation gemacht werden.

Beispielfrage Nr. 1: DNA-Replikation und -Reparatur

Für die DNA-Replikation werden mehrere Enzyme benötigt. Welche Enzymklasse wird benötigt, um die DNA an der Replikationsgabel abzuwickeln?

DNA-Helikasen verwenden ATP, um die Wasserstoffbrückenbindungen aufzubrechen, die komplementäre DNA-Stränge trennen. Während der DNA-Replikation bewegen sich DNA-Helikasen entlang des DNA-Rückgrats mit der Replikationsgabel und sind für das Abwickeln der DNA an der Gabelung verantwortlich.

Beispielfrage Nr. 1: DNA-Replikation und -Reparatur

Prionen sind die mutmaßliche Ursache für eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen bei Säugetieren. Prionen sind nach herrschender Theorie infektiöse Partikel, die nur aus Protein bestehen und in hohen Konzentrationen im Gehirn infizierter Tiere vorkommen. Alle Säugetiere produzieren normales Prionprotein, PrP C , ein Transmembranprotein, dessen Funktion unklar bleibt.

Infektiöse Prionen, PrP Res , induzieren Konformationsänderungen in den bestehenden PrP C -Proteinen gemäß der folgenden Reaktion:

PrP C + PrP Res → PrP Res + PrP Res

Es besteht dann der Verdacht, dass sich das PrP Res im Nervengewebe von infizierten Patienten anreichert und Krankheiten verursacht. Dieses Übertragungsmodell erzeugt replizierte Proteine, umgeht dabei aber das Standardmodell des zentralen Dogmas der Molekularbiologie. Transkription und Übersetzung spielen bei diesem Replikationsprozess offenbar keine Rolle.

Diese Theorie ist eine wesentliche Abweichung von früher etablierten biologischen Dogmen. Ein Wissenschaftler beschließt, die reine Proteintheorie der Prionenausbreitung zu testen. Er begründet sein Experiment wie folgt:

In die Gehirne von gesunden Kaninchen wird homogenisiertes Hirnmaterial von infizierten Kaninchen gemäß der folgenden Tabelle injiziert:

Kaninchen 1 und 2: Injektion mit normaler Kochsalzlösung an den Tagen 1 und 2

Die obigen Versuche dienen als Kontrollen.

Kaninchen 3 und 4: an den Tagen 1 und 2 mit homogenisierter Hirnsubstanz injiziert

Die oben genannten Studien verwenden unmodifizierte Hirnsubstanz.

Kaninchen 5 und 6: an den Tagen 1 und 2 mit bestrahlter homogenisierter Hirnsubstanz injiziert

Die obigen Versuche verwenden bestrahlte Hirnsubstanz, um Nukleinsäuren im Homogenisat zu zerstören.

Kaninchen 7 und 8: an den Tagen 1 und 2 mit proteinfreier zentrifugierter homogenisierter Hirnsubstanz injiziert

Die obigen Versuche verwenden Hirnmaterial, das zentrifugiert wurde, um ein proteinfreies Homogenat und ein proteinreiches Homogenat basierend auf dem Molekulargewicht zu erzeugen.

Kaninchen 9 und 10: injiziert mit gekochter homogenisierter Hirnsubstanz an den Tagen 1 und 2

Die oben genannten Versuche verwenden gekochtes Hirnmaterial, um alle bakteriellen Verunreinigungen im Homogenisat zu zerstören.

Bei dem mit Kaninchen 5 und 6 verwendeten Material wurde Bestrahlung verwendet, um DNA zu zerstören. Welche Arten von Genen kodieren in funktionierenden, normalen Zellen typischerweise für DNA-Reparaturproteine?

Tumorsuppressor-Gene wie p53 und Rb kodieren normalerweise für DNA-Reparaturenzyme. Proto-Onkogene kodieren typischerweise für Zellwachstumsfaktoren oder -rezeptoren, und pro-apoptotische Proteine ​​würden nicht zur DNA-Reparatur führen, aber die Tumorentwicklung über Zelltod-Wege verhindern.

Beispielfrage #8: DNA-Replikation und -Reparatur

Die DNA-Replikation ist viel genauer als die RNA-Transkription. Bei der Replikation ist im Durchschnitt nur eine Basis von zehn Milliarden falsch platziert.

Was ist der Hauptgrund dafür, dass die Transkription zu mehr Fehlern führt als die DNA-Replikation?

Die Transkription verläuft viel schneller als die Replikation. Dies führt zu mehr Fehlern durch die RNA-Polymerase.

DNA-Polymerase synthetisiert einen neuen Strang. Unmittelbar danach hängt ein Korrekturleseenzym an und "überprüft" den neuen Strang auf Fehler.

DNA-Polymerase ist in der Lage, fehlgepaarte Nukleotide zu reparieren.

Die Replikation erfolgt sehr langsam, nur ein paar Basenpaare pro Sekunde, um Fehler durch DNA-Polymerase zu vermeiden.

DNA-Polymerase ist in der Lage, fehlgepaarte Nukleotide zu reparieren.

Zusätzlich zur Bildung eines neuen DNA-Strangs kann die DNA-Polymerase als Exonuklease fungieren. DNA-Polymerase I hat die Fähigkeit, fehlgepaarte Nukleotide aus dem neuen Strang zu entfernen und zu korrigieren. Als Ergebnis ist die DNA-Replikation sehr genau, da die DNA-Polymerase über einen Korrekturlesemechanismus verfügt.

Beispielfrage Nr. 9 : DNA-Replikation und -Reparatur

Welche Aussage beschreibt am besten die Funktion des Enzyms DNA-Helikase?

Es überprüft die neu synthetisierte DNA auf Fehler.

Es beginnt die Replikation des führenden Strangs während der DNA-Synthese.

Es öffnet und entwickelt die DNA-Doppelhelix, indem es die Wasserstoffbrücken aufbricht.

Es verhindert eine übermäßige Verdrehung der DNA während der Replikation.

Es verbindet Nukleotid-Untereinheiten miteinander.

Es öffnet und entwickelt die DNA-Doppelhelix, indem es die Wasserstoffbrücken aufbricht.

DNA-Helikasen sind Enzyme, die die beiden DNA-Stränge trennen und sie entlang der Helix abwickeln. Es funktioniert ähnlich wie ein Reißverschluss, der die DNA abwickelt.

Beispielfrage #10: DNA-Replikation und -Reparatur

Welches Basenpaar benötigt zum Aufbrechen am wenigsten Energie?

Die Basenpaarung von Adenin und Thymin bildet 2 Wasserstoffbrückenbindungen. Sowohl Cytosin als auch Guanin bilden drei Wasserstoffbrücken. Somit weist das A-T-Basenpaar die schwächste Wechselwirkung auf und benötigt zum Aufbrechen die geringste Energiemenge.

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Verweise

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Lernübersicht &ndash

Große Konzepte

Die originalgetreue Replikation des genetischen Materials (DNA) ist die Grundlage allen Lebens auf der Erde. Das Experiment von Meselson und Stahl ergab, dass die DNA nach einem halbkonservativen Mechanismus repliziert, wie von Watson und Crick vorhergesagt, bei dem jeder Strang der Doppelhelix als Matrize für einen neuen Strang fungiert, mit dem er bis zur nächsten Replikation assoziiert bleibt .

Verwendete Begriffe aus dem Bio-Wörterbuch

Bakteriophage (Phagen) , Base , Basenpaarung , Chromosom , DNA , Hershey-Chase-Experiment, Eukaryont , Mutation , Nukleotide , Prokaryonten (Bakterien) , Rekombination , RNA , ultraviolettes Licht

Begriffe und Konzepte erklärt

Gleichgewichtsdichtegradientenzentrifugation, DNA-Replikation, Isotope, semikonservative DNA-Replikation

Einführung

Matthew Meselson und Franklin Stahl (beide 24 Jahre alt) trafen sich im Marine Biological Laboratory in Woods Hole in Massachusetts und beschlossen, das Watson-Crick-Modell für die DNA-Replikation zu testen, das zu dieser Zeit noch nicht bewiesen war.

Welche Ereignisse gingen dem Experiment voraus?

Watson und Crick schlugen 1953 ein „semi-konservatives“ Modell für die DNA-Replikation vor, das von ihrem Modell der DNA-Doppelhelix abgeleitet wurde. In diesem Vorschlag trennen sich die Stränge des Duplex und jeder Strang dient als Matrize für die Synthese eines neuen komplementären Strangs. Watsons und Cricks Idee für die DNA-Replikation war ein Modell, und sie hatten keine Daten, um es zu stützen. Einige prominente Wissenschaftler hatten Zweifel.

Zwei weitere Modelle, "konservativ" und "dispersiv", für die DNA-Replikation wurden vorgeschlagen.

Aufbau des Experiments

Es war eine Methode erforderlich, um einen Unterschied zwischen den elterlichen und den (neu replizierten) Tochter-DNA-Strängen zu erkennen. Dann könnte man dem Eltern-DNA-Molekül in der Nachkommenschaft folgen. Meselson glaubte, zwischen elterlicher und neu synthetisierter DNA zu unterscheiden, indem ein Dichteunterschied in den Bausteinen (Nukleotiden) verwendet wurde, um die DNA zu konstruieren. Die drei Modelle für die DNA-Replikation würden unterschiedliche Ergebnisse für die Dichte der replizierten DNA in den Tochterzellen der ersten und zweiten Generation vorhersagen.

Die allgemeine experimentelle Idee bestand darin, zuerst Bakterien in einem chemischen Medium zu züchten, um DNA mit hoher Dichte herzustellen, und dann die Bakterien abrupt auf ein Medium mit niedriger Dichte umzustellen, so dass die Bakterien nun während der kommenden Replikationsrunden DNA mit niedrigerer Dichte synthetisieren würden. Die alte und neu synthetisierte DNA würden sich durch ihre Dichte unterscheiden.

Um einen Dichteunterschied in der DNA zu messen, erfanden Meselson und Stahl eine Methode namens Gleichgewichtsdichtegradientenzentrifugation. Bei dieser Methode wird die DNA in einem Röhrchen mit einer Lösung von Cäsiumchlorid zentrifugiert. Beim Zentrifugieren bildet das Cäsiumchlorid, das dichter als Wasser ist, einen Dichtegradienten, der nach einigen Stunden ein stabiles Gleichgewicht erreicht. Die DNA wandert zu einem Punkt im Gradienten, an dem ihre Dichte der Dichte der CsCl-Lösung entspricht. Schwere und leichte DNA würden zu unterschiedlichen Ruhepunkten kommen und somit physisch getrennt.

Das Schlüsselexperiment machen

Meselson und Stahl beschlossen zunächst, die Replikation von DNA eines Bakteriophagen, eines Virus, das sich in Bakterien repliziert, zu untersuchen, und verwendeten einen Dichteunterschied zwischen zwei Formen der Nukleobase Thymin (normales Thymin und 5-Bromuracil). Diese Experimente haben nicht funktioniert.

Die Ermittler änderten ihre Pläne. Sie untersuchten die Replikation des bakteriellen Genoms und verwendeten zwei Stickstoffisotope (15N (schwer) und 14N (leicht)), um die elterliche und neu synthetisierte DNA zu markieren.

Als sich die Bakterienpopulation verdoppelte, stellten Meselson und Stahl fest, dass die DNA eine mittlere Dichte hatte, auf halbem Weg zwischen der dichten und der leichten DNA im Gradienten. Nach zwei Verdopplungen war die Hälfte der DNA vollständig hell und die andere Hälfte hatte eine mittlere Dichte. Diese Ergebnisse wurden vom halbkonservativen Modell vorhergesagt und stimmen nicht mit dem konservativen und dispersiven Modell überein.

Meselson und Stahl führten ein weiteres Experiment durch, bei dem sie Hitze verwendeten, um die beiden Stränge der Tochter-DNA nach einer Replikationsrunde zu trennen. Sie fanden heraus, dass ein Strang aus schwerer DNA bestand und der andere aus leichter DNA. Dieses Ergebnis stimmte mit dem halbkonservativen Modell überein und lieferte zusätzliche Beweise gegen das dispersive Modell.

Insgesamt lieferten die Ergebnisse den Beweis für eine halbkonservative Replikation, die mit dem von Watson und Crick vorgeschlagenen Modell übereinstimmt.

Was als nächstes geschah?

Innerhalb von ein paar Wochen nach ihrem Schlüsselexperiment schrieb Meselson einen Brief an Jim Watson, um ihr Ergebnis mitzuteilen (einschließlich Brief).

Max Delbruck, der Caltech-Physiker und Biologe, der das dispersive Modell vorgeschlagen hatte, war von den Ergebnissen begeistert, obwohl Meselson und Stahl seine Replikationshypothese widerlegten, und forderte die jungen Wissenschaftler auf, ihre Ergebnisse zur Veröffentlichung aufzuschreiben und das wichtige Ergebnis dem Welt (1958).

Wissenschaftler wissen heute viel über die Proteinmaschinerie, die für die DNA-Replikation verantwortlich ist.

Schlussgedanken

Das Meselson-Stahl-Experiment hatte eine starke psychologische Wirkung auf dem Gebiet der Genetik und Molekularbiologie. Es war der erste experimentelle Test des Watson- und Crick-Modells, und die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass sich die DNA in Zellen genau so verhielt, wie Watson und Crick vorhergesagt hatten.

Neben einer guten Idee zeigt der Blick hinter die Kulissen des Meselson-Stahl-Experiments, dass Freundschaft und Beharrlichkeit bei der Überwindung anfänglicher Misserfolge eine wichtige Rolle im wissenschaftlichen Entdeckungsprozess spielen. Wichtig war auch eine Atmosphäre der Freiheit, die es Meselson und Stahl, damals noch sehr jung, erlaubte, ihre eigenen Ideen zu verfolgen.

Geführtes Papier

Meselson, M. und Stahl, F. W. (1958). Die Replikation von DNA in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 44: 672–682.


Diskussion

Hier haben wir die Funktion des BLM-Homologs OsRecQl4 während der DNA-Replikation in Reis über Knockout-Mutanten untersucht. Mit dem Comet-Assay haben wir die Induktion von DSBs in mit Aphidicolin behandelten . nachgewiesen osrecql4 mutierte Zellen. Die TUNEL-Analyse deutete darauf hin, dass DNA-Schäden einschließlich DSBs am RAM induziert wurden. Der HR-Assay mit dem GUS-Rekombinationsreporter zeigte, dass mindestens ein Teil der DSBs durch HR repariert werden konnte, was erklärt, warum HR in verstärkt wird osrecql4 Mutanten. Der PI-Färbungsassay zeigte, dass nicht reparierte DSBs den Zelltod am Wurzelmeristem induzierten. Die kombinierten Ergebnisse der Kometen-, TUNEL- und HR-Assays sowie der PI-Färbung mit mutierten Pflanzen unter einer Kombination von Aphidicolin-Behandlungen zeigten deutlich die wichtige Rolle von OsRecQl4 im Erholungsprozess von einem DNA-Replikationsstillstand und auch die konservierte Rolle von orthologen BLM-Proteinen in diesem Prozess. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Rolle von OsRecQl4 bei der genomischen Erhaltung während der DNA-Replikation im RAM. OsRecQl4 wird jedoch auch in der SAM exprimiert (Abbildung 1B, C). Daher gehen wir davon aus, dass OsRecQl4 an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität während der DNA-Replikation sowohl am SAM als auch am RAM beteiligt ist. Daher könnten sich vermehrt Mutationen in akkumulieren osrecql4 mutierte Pflanzen während des mitotischen Zellzyklus, und diese Mutationen sollten von nachfolgenden Generationen vererbt werden.

Die osrecql4-1 (T-DNA-Linie) hat nur eine geringe Menge an verkürztem Protein und osrecql4-2 (Tos17-Linie) hat gemäß der Northern-Blot-Analyse ein längeres Protein (Abbildung 1B). Daraus schlossen wir, dass sowohl die osrecql4-1 und der osrecql4-2 Mutanten produzieren eine abweichende Größe des OsRecQ14-Proteins, das in der Konsensusdomäne RQC defekt ist, wenn es exprimiert wird. Die beiden Mutanten können unterschiedliche Wirkungen haben. Wir haben jedoch gezeigt, dass beide Mutanten eine Überempfindlichkeit gegenüber DNA-Schädigungsmitteln aufweisen und den Zelltod nach einer Aphidicolin-Behandlung erhöhen.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass der DNA-Replikationsstopp zu einem Hyperrekombinations-Phänotyp in Pflanzen führt. Urawaet al. [39] berichteten, dass der nicht transkribierte Spacer (NTS) zwischen ribosomalen RNA-Genen (rDNA), der eine Replikationsgabelbarriere von rDNA enthält [40], die HR in . erhöht Arabidopsis. In Escherichia coli, wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine beschädigte DNA-Replikationsgabel durch die Bildung der Holliday-Kreuzung neu gestartet werden könnte, was zur DNA-Spaltung durch die Auflösung der Holliday-Kreuzung und schließlich zur Reparatur durch HR führt. Dieser Mechanismus birgt jedoch das Risiko einer unangemessenen Rekombination. Somit könnte eine blockierte Gabel (die nicht zur DNA-Spaltung führt) von DNA-Helikasen verarbeitet werden, um Replikationsfehler zu vermeiden [41].

Kürzlich haben Schuermann et al. [42] berichteten, dass ein Defekt der DNA-Polymerase Delta 1 (POLδ1) in Arabidopsis zeigten eine erhöhte HR-Frequenz bei blockierten und kollabierten Replikationsgabeln. Dieser Bericht unterstützte auch unsere Schlussfolgerung, dass DNA-Replikationsstress HR in Pflanzen induziert. Der molekulare Mechanismus, der DNA-Replikationsstress und erhöhte HR verbindet, bleibt jedoch bei Pflanzen unklar. Hier sehen wir eine Beziehung zwischen akkumulierten DSBs, HR und dem Zelltod, der den DNA-Replikationsstopp an der Meristemstelle begleitet.

Die Rad51-abhängige Reparatur-HR umfasst bruchinduzierte Replikation (BIR), Double-Holliday-Junction (dHJ) und SDSA. Rad51-unabhängige SSA repariert auch DSB [43]. Kürzlich wurde berichtet, dass mit einem Direct-Repeat-GU-US-Rekombinationsreporter ein funktionelles GUS-Gen hauptsächlich über den SSA-Weg generiert werden kann, wobei SDSA nach DSB nur eine untergeordnete Rolle spielt [44]. Während der Replikation induzieren induzierte DSBs jedoch nicht zwei freie Enden, sondern eher ein einseitiges DSB, d. h. ein DNA-Doppelstrangende (DSE). Das DSE dringt in sein zu reparierendes Schwesterchromatid ein, mit DNA-Synthese durch BIR [45, 46]. Obwohl hier eine erhöhte HR-Effizienz unter Verwendung des Direct-Repeat-GU-US-Rekombinationsreporters zur Assoziation von OsRecQ14 und HR gezeigt wurde, sollte die nachgewiesene HR also eine Rad51-abhängige HR-Reparatur sein. Dies könnte in Zukunft durch eine Doppelmutante mit Rad51 bestätigt werden. Weitere Punkte, die die Hypothese einer alternativen Reparatur des GU-US-Reporters stützen, sind die Unterschiede in Geweben (Pflanze vs. Kalli) und Induktion (I-SceI vs. Aphidicolin), was zu einer unterschiedlichen Prävalenz von Zellzykluszuständen führen könnte, in denen die Reparatur stattfindet.

Wir haben die Sensitivität von osrecql4 Mutanten zu Aphidicolin und Bleomycin. Da Defekte in OsRecQl4 die Empfindlichkeit von Reis gegenüber diesen beiden letzteren Verbindungen erhöhen, OsRecQl4 könnte an der Erholung von einem DNA-Replikationsstopp und einer DSB-Reparatur beteiligt sein. Auf der anderen Seite, osrecql4 Mutanten zeigten normales Wachstum und waren fruchtbar, obwohl osrecql4 Mutanten zeigten OsRecQ14-Protein mit abweichender Größe, was darauf hindeutet, dass OsRecQ14 möglicherweise nicht essentiell ist. In dieser Hinsicht wurde berichtet, dass Mitglieder der Gene der RecQ-Familie in Reis –OsRecQ1, OsRecQ2, OsRecQsim und OsRecQ886– werden in Meristemen exprimiert [27], was darauf hindeutet, dass Mitglieder der RecQ-Helikase-Familie überlappende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Genomstabilität in proliferativen Zellen spielen könnten. Allerdings homozygot blm Mäuse weisen eine Wachstumsverzögerung auf [47]. Es könnte interessant sein, das Wachstum der osrecql4 Mutante unter erhöhten UV-Bedingungen, da der DNA-Replikationsstopp durch UV-Photoprodukte induziert wird.

Obwohl die Empfindlichkeit von Arabidopsis atrecq4A Mutanten zur Behandlung mit Bleomycin war die gleiche wie bei WT-Pflanzen, in unserer Studie beobachteten wir eine erhöhte Bleomycin-Sensitivität in Reis osrecql4 Mutanten im Vergleich zu WT-Pflanzen. Dies könnte auf Unterschiede im System, Gewebe und experimentellen Verfahren zurückzuführen sein. Außerdem beobachteten wir den Zelltod im Wurzelmeristem von osrecql4 mutierte Pflanzen. Diese Unterschiede könnten auf das Auftreten von Endoreduplikation in zurückgeführt werden Arabidopsis, da Zellen, die DNA-Schäden erleiden, in den Endozyklus eintreten und vom mitotischen Zellzyklus getrennt werden können Arabidopsis.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass OsRecQ14 an SAM und RAM exprimiert wird, d. h. an den Stellen der Zellteilung. Darüber hinaus wurde die Expression von OsRecQl4 durch Aphidicolin-Behandlung induziert, jedoch nicht durch Bleomycin (Zusatzdatei 1: Abbildung S5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass OsRecQl4 je nach Transkriptionsniveau eine wichtigere Rolle bei der Reparatur während der DNA-Replikation spielt als bei der DSB-Reparatur. BLM sammelt sich an blockierten Replikationsgabeln [4, 6], was die Vorstellung einer induzierbaren Expression von OsRecQl4 durch DNA-Replikationsstopp unterstützt (zusätzliche Datei 1: Abbildung S5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass OsRecQ14 für die Erholung von einem DNA-Replikationsstopp benötigt wird. Die osrecql4-2 Mutante konnte sich nicht vom DNA-Replikationsstopp erholen, was zu einer erhöhten Anzahl von DSBs führte, die möglicherweise durch HR repariert werden mussten.

Interessanterweise fanden wir, dass ohne Aphidicolin-Behandlung sowohl WT als auch osrecql4-2 Mutanten produzierten eine sehr geringe Menge an DSBs (Abbildung 4), wenn man aus dem Comet-Assay urteilt. Ebenso DNA-Schäden in osrecql4-2 an der von TUNEL analysierten Zellteilungswurzelzone war fast vergleichbar mit der von WT-Pflanzen. Allerdings ist die osrecql4-2 Mutante zeigte unter normalen Wachstumsbedingungen ohne Aphidicolin-Behandlung eine höhere Frequenz von HR als WT-Pflanzen. Dies deutete darauf hin, dass DSBs in der osrecql4-2 Mutante könnte unter normalen Wachstumsbedingungen durch DNA-Reparatursysteme, einschließlich HR, repariert werden, da HR ohne RecQ-Helikase langsam ablaufen kann [48]. Überschüssige DSBs, die durch die Aphidicolin-Behandlung induziert wurden, konnten jedoch nicht durch intrinsische DNA-Reparatursysteme repariert werden, und nicht reparierte DSBs wurden daher durch Comet- und TUNEL-Assay nachgewiesen. Darüber hinaus könnten nicht reparierte DSBs den Zelltod in osrecql4 Mutanten nach Aphidicolin-Behandlung. Somit könnte OsRecQl4 erforderlich sein, um Pflanzen vor genotoxischem Stress zu retten.

Im Großen und Ganzen behalten RecQ-Helikasen die DNA-Stabilität bei. Die RecQ-Helikase BLM fördert nicht nur die Erholung nach dem DNA-Replikationsstopp, sondern auch die Exonuklease-1-vermittelte DNA-Resektion während des ersten Schritts der DSB-Reparatur [49]. OsRecQl4 spielt auch eine Rolle bei der Förderung der Verarbeitung der HR-vermittelten DSB-Reparatur in Reis [26]. OsRecQl4 wurde ebenfalls ausschließlich in Meristemen exprimiert, andere RecQ-ähnliche Gene aus Reis wurden in meristematischen Geweben exprimiert [27]. Daher erwarten wir überlappende und unterschiedliche Rollen für die sieben RecQ-Helikase-Gene in Reis.


PriA: an der Schnittstelle von DNA-Replikation und -Rekombination

PriA ist eine einzelsträngige DNA-abhängige ATPase, DNA-Translokase und DNA-Helikase, die ursprünglich aufgrund ihres in vitro-Bedarfs für die Umwandlung der viralen DNA des Bakteriophagen Phi X174 in die replizierende Duplexform entdeckt wurde. Studien zeigten, dass PriA den Zusammenbau eines Primosoms, eines Multiproteinkomplexes, der die DNA-Synthese ankurbelt, auf phi X174-DNA katalysiert. Es wurde gezeigt, dass das Primosom in der Lage ist, sowohl die DNA-Entwindungsfunktion als auch die Okazaki-Fragment-Priming-Funktion bereitzustellen, die für das Fortschreiten der Replikationsgabel erforderlich sind. Während jedoch sieben Proteine, PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB, DnaC und DnaG, für den Aufbau der Primosomen auf der phi X174-DNA erforderlich waren, waren nur DnaB, DnaC und DnaG für die Replikation von oriC erforderlich, was darauf hindeutet, dass die anderen Proteine waren nicht an der chromosomalen Replikation beteiligt. Stämme, die priA-Null-Mutationen trugen, wurden jedoch für die SOS-Antwort konstitutiv induziert und waren hinsichtlich der homologen Rekombination, der Reparatur von UV-geschädigter DNA und Doppelstrangbrüchen sowie sowohl der induzierten als auch der konstitutiv stabilen DNA-Replikation defekt. Die Grundlage für diesen Phänotyp kann nun durch die Fähigkeit von PriA erklärt werden, Replikationsgabeln an einer D-Schleife zu laden, einem Zwischenprodukt, das sich während der homologen Rekombination, der Doppelstrangbruchreparatur und der stabilen DNA-Replikation bildet. Somit wird ein seit langem theoretisierter Zusammenhang zwischen Rekombination und Replikation demonstriert.


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Über diesen Kurs

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Lassen Sie uns die Grenzen unseres aktuellen Wissens über die Replikationsmaschinerie und -wege erkunden, die die Genauigkeit der DNA-Synthese schützen. Wenn Sie bereit sind für die Herausforderung, machen Sie mit bei 7.28x Teil 1: DNA-Replikation und -Reparatur.

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Schritte in der DNA-Replikation

The process of DNA replication is a complex one, and involves a set of proteins and enzymes that collectively assemble nucleotides in the predetermined sequence. In response to the molecular cues received during cell division, these molecules initiate DNA replication, and synthesize two new strands using the existing strands as templates. Each of the two resultant, identical DNA molecules is composed of one old and one new strand of DNA. Hence the process of DNA replication is said to be a semi-conservative one.

The series of events that occur during prokaryotic DNA replication have been explained below.

Einleitung

DNA replication begins at specific site termed as origin of replication, which has a specific sequence that can be recognized by initiator proteins called DnaA. They bind to the DNA molecule at the origin sites, thus flagging it for the docking of other proteins and enzymes essential for DNA replication. An enzyme called helicase is recruited to the site for unwinding the helices into single strands.

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Helicases break the hydrogen bonds between base pairs, in an energy-dependent manner. This point or region of DNA is now known as the replication fork. Once the helices are unwound, proteins called single-strand binding proteins (SSB) bind to the unwound regions, and prevent them for annealing. The replication process thus initiates, and the replication forks proceed in two opposite directions along the DNA molecule.

Primer Synthesis

The synthesis of a new, complementary strand of DNA using the existing strand as a template is brought about by enzymes known as DNA polymerases. In addition to replication they also play an important role in DNA repair and recombination.

However, DNA polymerases cannot start DNA synthesis independently, and require and 3′ hydroxyl group to start the addition of complementary nucleotides. This is provided by an enzyme called DNA primase which is a type of DNA-dependent RNA polymerase. It synthesizes a short stretch of RNA onto the existing DNA strands. This short segment is called a primer, and comprises 9-12 nucleotides. This gives DNA polymerase the required platform to begin copying a DNA strand. Once the primers are formed on both the strands, DNA polymerases can extend these primers into new DNA strands.

The unwinding of DNA may cause supercoiling in the regions following the fork. These DNA supercoils are relaxed by specialized enzyme called topoisomerase which binds to the DNA stretch ahead of the replication fork. It creates a nick in the DNA strand in order to relieve the supercoil.

Leading Strand Synthesis

DNA polymerases can add new nucleotides only to the 3′ end of an existing strand, and hence can synthesize DNA in 5′ → 3′ direction only. But the DNA strands run in opposite directions, and hence the synthesis of DNA on one strand can occur continuously. This is known as the leading strand.

Here, DNA polymerase III (DNA pol III) recognizes the 3′ OH end of the RNA primer, and adds new complementary nucleotides. As the replication fork progresses, new nucleotides are added in a continuous manner, thus generating the new strand.

Lagging Strand Synthesis

On the opposite strand, DNA is synthesized in a discontinuous manner by generating a series small fragments of new DNA in the 5′ → 3′ direction. These fragments are called Okazaki fragments, which are later joined to form a continuous chain of nucleotides. This strand is known as the lagging strand since the process of DNA synthesis on this strand proceeds at a lower rate.

Here, the primase adds primers at several places along the unwound strand. DNA pol III extends the primer by adding new nucleotides, and falls off when it encounters the previously formed fragment. Thus, it needs to release the DNA strand, and slide further up-stream to start the extension of another RNA primer. A sliding clamp holds the DNA in its place as it moves through the replication process.

Primer Removal

Although new DNA strands have been synthesized the RNA primers present on the newly formed strands need to be replaced by DNA. This activity is performed by the enzyme DNA polymerase I (DNA pol I). It specifically removes the RNA primers via its 5′ → 3′ exonuclease activity, and replaces them with new deoxyribonucleotides by the 5′ → 3′ DNA polymerase activity.

Ligation

After primer removal is completed the lagging strand still contains gaps or nicks between the adjacent Okazaki fragments. The enzyme ligase identifies and seals these nicks by creating a phosphodiester bond between the 5′ phosphate and 3′ hydroxyl groups of adjacent fragments.

Beendigung

This replication machinery halts at specific termination sites which comprise a unique nucleotide sequence. This sequence is identified by specialized proteins called tus which bind onto these sites, thus physically blocking the path of helicase. When helicase encounters the tus protein it falls off along with the nearby single-strand binding proteins.

Fact File

The DNA replication process is almost error free with the help of 3′ → 5′ exonuclease activity of the DNA polymerases. DNA pol III proofreads the nucleotides being newly added to the strand. If a nucleotide has been incorrectly added, DNA pol III recognizes the error immediately, removes the incorrect base, adds the correct nucleotide, and then continues ahead.

Difference Between Prokaryotic and Eukaryotic DNA Replication

Although the basic mechanism remains the same, eukaryotic DNA replication is much more complex, and involves a higher number of proteins and enzymes. The regulatory mechanisms for DNA replication are also more evolved and intricate.

  • In prokaryotes, DNA replication is the first step of cell division. On the other hand, eukaryotic DNA replication is intricately controlled by the cell cycle regulators, and the process takes place during the ‘S’ or synthesis phase of the cell cycle.
  • Unlike prokaryotic DNA, the eukaryotic DNA is always present in combination with histone proteins that are involved in regulation of gene expression. During replication, these proteins need to be removed just before the unwinding of DNA.
  • Owing to higher genomic size and complexity of eukaryotes, several origin and termination sites for replication are present along the DNA. The region between one set of origin and termination sites is called a replication unit or replicon, within which one event of replication takes place. This enables faster and more accurate DNA replication as compared to the prokaryotic system of having a single replicon.
  • The Okazaki fragments formed in prokaryotes are longer as compared to those in eukaryotes. In Escherichia coli (E. coli) they are about 1000 to 2000 nucleotides long whereas in eukaryotes their length ranges between 100 and 200 nucleotides.
  • Another interesting difference in prokaryotic and eukaryotic DNA replication is in the termination step of replication. In prokaryotes, the two replication forks, moving in opposite directions along the circular DNA molecule, meet at the termination site, and replication halts. However, eukaryotic DNA being a linear molecule, the lagging strand is shorter than the template strand. To avoid the loss of genetic information through such shortening, chromosomal ends have a set of repetitive sequences called telomeres that comprise noncoding DNA.

Fact File

The human DNA is copied at about 50 base pairs per second. Due to initiation of replication at multiple locations, the process is completed within one hour. If this were not the case, it would take about a month to finish replicating a single chromosome!

The genes of an organism contain all the necessary information to synthesize the right molecule, in the right amounts, and at the right time. Replication is the way to ensure that this coded information is passed down to every cell of the body, and also to the successive generations. After all, as rightly pointed by Richard Dawkins:

“They are the replicators and we are their survival machines. Wenn wir unseren Zweck erfüllt haben, werden wir beiseite geworfen. But genes are denizens of geological time: genes are forever.”

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