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Gibt es Tiermodelle für Clostridium difficile, die eine menschliche Infektion besser nachbilden als Hamster?

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Also suche ich nach Informationen über die infektiöse Dosis, die erforderlich ist, um einen Menschen mit zu kolonisieren Clostridium difficile. Es gibt keine Human Challenge-Studien, und da es sich nicht um einen durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserreger handelt, können wir aus den Ausbruchsdaten nur wenig entnehmen.

Was mich dazu bringt, mir Tiermodelle anzusehen, um zumindest die zu bekommen Form der Infektionswahrscheinlichkeit basierend auf einer gegebenen Dosis. Aber die Papiere über Hamster lassen den Anschein erwecken, dass sie sich relativ leicht anstecken, und dass diese Infektion besonders schwerwiegend ist.

Gibt es ein anderes Tiermodell, das die Infektionsdynamik von C. schwierig in Menschen?


Hamster gelten als das beste Tiermodell, das am meisten untersucht wurde.
C. difficile wurde bei Kälbern, Straußen, Hühnern, Elefanten, Hunden, Pferden und Schweinen gefunden, aber seine Rolle bei der Infektion und seine Pathogenese bei Tieren sind weitgehend unbekannt und möglicherweise unterschätzt


Humanisierte Mikrobiota-Mäuse als Modell für rezidivierende Clostridium difficile Krankheit

Clostridium difficile Krankheit ist die führende Antibiotika-assoziierte Ursache für Durchfall und nosokomial erworbene Infektionen in der westlichen Welt. Allein in den USA beläuft sich die jährliche Belastung auf 250.000 Fälle mit 14.000 zugeschriebenen Todesfällen und medizinischen Kosten von über einer Milliarde Dollar. Neue Modelle für das Studium von C. schwierig Infektionen sind daher relevant.

Ergebnisse

Keimfreie C57BL/6-Mäuse, denen eine gesunde menschliche Fäkalmikrobiota mit einer Sonde verabreicht wurde, behielten über mehrere Generationen hinweg eine stabile „humanisierte“ Mikrobiota, wenn sie unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten wurden. Wie bei Mäusen, die eine konventionelle Mikrobiota enthalten, macht die Behandlung mit einem Fünf-Antibiotika-Cocktail gefolgt von einer Einzeldosis Clindamycin die Tiere anfällig für C. schwierig Infektion (CDI). Interessanterweise reicht eine einzige intraperitoneale Injektion von Clindamycin nach der Genesung von der anfänglichen CDI-Infektion aus, um einen CDI-Rückfall auszulösen. Ein Rückfall von CDI kann bis zu 35 Tage nach der Infektion nach Erholung von der anfänglichen Infektion induziert werden, und es können mehrere Rückfälle induziert werden.

Schlussfolgerungen

Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von rezidivierenden C. schwierig Krankheit in einem Wirt, der eine vom Menschen stammende Mikrobiota enthält. Probiotische Behandlungen mit vom Menschen stammenden Mikroben, entweder prophylaktisch oder kurativ, können im Modell getestet werden. Die Identifizierung und das Testen von vom Menschen stammenden mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb eines humanisierten Mikrobiota-Mausmodells kann eine höhere Erfolgsrate von bakterienbasierten Behandlungen aus dem Labor auf menschliche Patienten ermöglichen, da die beteiligten Mikroben vom Menschen ausgehen und an ihn angepasst werden GI-Trakt.


Einführung

Clostridioides difficile wurde 1978 als Erreger der pseudomembranösen Kolitis etabliert und hat sich seitdem zu einer der am häufigsten auftretenden nosokomialen Infektionen in den Vereinigten Staaten entwickelt. 1,2 Eine bevölkerungs- und laborbasierte Überwachungsstudie schätzt, dass die nationale Belastung von C. schwierig Infektion (CDI) in den Vereinigten Staaten betrug im Jahr 2017 462.100 Fälle. 3 Die jährlichen Behandlungskosten im Zusammenhang mit CDI werden in den US-amerikanischen Akutversorgungseinrichtungen auf 4,8 Milliarden US-Dollar geschätzt, mit zusätzlicher Belastung in ambulanten Einrichtungen und Langzeitpflegeeinrichtungen. 4 Eine kürzlich durchgeführte systemische Überprüfung und Metaanalyse untersuchte Berichte über CDI-Inzidenzraten, um eine Schätzung der aktuellen globalen Beweise für die Infektion zu entwickeln. Sie schätzten, dass die Gesamtinzidenzrate von CDI im Zusammenhang mit Gesundheitseinrichtungen 2,24 pro 1000 Aufnahmen pro Jahr und 3,54 pro 10.000 Patiententage betrug. 5 Eine weitere globale systemische Analyse, die 195 Länder umfasste, ergab, dass C. schwierig war für die meisten Todesfälle bei Kindern unter 5 Jahren und bei allen Altersgruppen in Ländern mit einem höheren soziodemografischen Index verantwortlich. 6

Die Gastgeberantwort auf die C. schwierig Bakterium reicht von asymptomatischer Beförderung, leichtem Durchfall bis hin zu lebensbedrohlicher Kolitis und in einigen Fällen sogar zum Tod. 7 Das Wiederauftreten einer Erkrankung nach einer Erstinfektion stellt nach wie vor eine der größten Herausforderungen in der Behandlung dar. Rezidivierende CDI werden bei 15� % der Patienten nach einer Erstinfektion und bei 33� % der Patienten, die zwei oder mehr Infektionen hatten, beobachtet. 8 Das breite Spektrum der Ergebnisse wird durch bakterielle Virulenzfaktoren beeinflusst, darunter Toxine, die im Pathogenitätslocus kodiert sind, und Adhärenz- und Motilitätsfaktoren sowie komorbide Zustände des Wirts und Immunantworten. 9 Das Vorhandensein eines gesunden Darmmikrobioms hat auch einen Einfluss auf die Entwicklung von CDI, da es eine Resistenz gegen C. schwierig Kolonisation. 10 Die Rate der asymptomatischen Kolonisation bei gesunden Erwachsenen liegt bei bis zu 17,5 %. 11 � Asymptomatische Kolonisatoren können als potenzielle Krankheitsüberträger dienen und das Risiko haben, CDI auf andere zu übertragen oder selbst zu einer Infektion fortzuschreiten, wenn sie die toxigenen Stämme tragen. 14,15 Obwohl eine Störung des schützenden Darmmikrobioms, meist durch den Einsatz von Antibiotika, für CDI prädisponieren kann, 16 bestimmt auch das Immunsystem des Wirts die Entwicklung einer symptomatischen Erkrankung und es wird angenommen, dass eine wiederholte Reinfektion aus der Umgebung zu einem schützenden Antikörper führt Reaktion bei gesunden Erwachsenen. 17 Die Erkenntnis der entscheidenden Rolle, die die menschliche Immunantwort bei der Pathogenese der Krankheit spielt, hat auch zur Entwicklung medikamentöser Therapien geführt, die auf das Immunsystem abzielen.


Einführung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wurden Infektionserreger, die Infektionen der unteren Atemwege, Durchfallerkrankungen und Tuberkulose verursachen, zu den zehn häufigsten Todesursachen weltweit gezählt, was 2016 zu 5,7 Millionen Todesfällen führte (1). Es ist klar, dass wir unser Verständnis dieser Krankheiten und Krankheitserreger verbessern müssen, um wirksamere Medikamente und Impfstoffe zu entwickeln. Zu diesem Zweck brauchen wir ein geeignetes Tiermodell, das die Pathogenese einer Infektion am genauesten nachahmen kann, da eine Infektion normalerweise einen komplexen Prozess von Immunreaktionen des Wirts induziert, der in vitro Experimente können nicht simuliert werden. Nur in vivo Modelle können die Komplexität von Wirtsreaktionen genau einschätzen und ermöglichen die Bewertung der Wirksamkeit und der Nebenwirkungen von Medikamenten oder Impfstoffen.

Der Syrische Hamster (Mesocricetus auratus) wird seit über 60 Jahren als Tiermodell zur Untersuchung von humanassoziierten Krankheiten verwendet. Eine Reihe von Studien hat belegt, dass Syrische Hamster im Vergleich zu Mausmodellen bessere Modelle für die Analyse von Virusinfektionen darstellen, da die Ähnlichkeit zum Menschen in Bezug auf Krankheitssymptome, Pathogenese und Immunantwort größer ist (2𠄴). Wir und andere haben gezeigt, dass menschliche Zytokine, einschließlich Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin-12 (IL-12), in Hamstermodellen voll funktionsfähig sind, aber nicht in Mausmodellen (5, 6). Zusammen mit anderen Vorteilen, wie der schnellen Fortpflanzungsrate und der einfachen Handhabung, sind Syrische Hamster im Vergleich zu anderen Kleintieren eine überlegene Wahl.

Obwohl Syrische Hamster seit jeher in der Krankheitsforschung eingesetzt wurden, wurde ihr Wert als Tiermodell bei der Erforschung von Infektionskrankheiten erst vor kurzem erkannt. Mit den Fortschritten in den Gen-Editing-Technologien hat ihre Popularität deutlich zugenommen (Abbildung 1). Der Einsatz gentechnisch veränderter syrischer Hamster (GESH)-Modelle ist entscheidend für das Verständnis des Krankheitsverlaufs und für die Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Behandlungsschemata. Der erste STAT2-Gen-Knockout (KO) syrischer Hamster wurde 2014 unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems entwickelt, um auf die Hamsterkeimbahn abzuzielen (7). STAT2 ist ein entscheidendes Element des Typ-I-Interferon (IFN)-Signaltransduktionsweges und das Hamstermodell hat sich als das einzige Kleintiermodell herausgestellt, das für eine Adenovirus (AdV)-Infektion zulässig ist Pathogenese (8).

Abbildung 1. Anzahl der Veröffentlichungen, die Syrische Hamster als Krankheitsmodell verwenden. Gezeigt wird die Anzahl der Veröffentlichungen, bei denen der syrische Hamster als Tiermodell von 1997 bis 2017 verwendet wurde. Für jeden Standard wurde die Anzahl der Publikationen über eine Suche in der ScienceDirect-Datenbank ermittelt. Die Suche wurde mit den Schlüsselwörtern “Syrian Hamster” oder “Golden Hamster” AND “model” AND (1) “viral” oder “virus,” (2) �teria durchgeführt, ” (3) ȁInfektion” oder ȁKkrankheit”.


Clostridium difficile und die Mikrobiota

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Innere Medizin und Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA.

Adressieren Sie die Korrespondenz an: Vincent B. Young, Abteilung für Innere Medizin, Abteilung für Infektionskrankheiten, Medizinische Fakultät der Universität Michigan, 1520B MSRB I, 1500 W. Medical Center Drive, Ann Arbor, Michigan 48109, USA. Telefon: 734.764.2237 E-Mail: [email protected]

Artikel von Seekatz, A. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Innere Medizin und Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA.

Adressieren Sie die Korrespondenz an: Vincent B. Young, Abteilung für Innere Medizin, Abteilung für Infektionskrankheiten, Medizinische Fakultät der Universität Michigan, 1520B MSRB I, 1500 W. Medical Center Drive, Ann Arbor, Michigan 48109, USA. Telefon: 734.764.2237 E-Mail: [email protected]

Clostridium difficile Infektion (CDI) ist die führende Krankheit im Gesundheitswesen. Sowohl Human- als auch Tiermodelle haben gezeigt, wie wichtig die Fähigkeit der Darmmikrobiota ist, eine Kolonisationsresistenz gegen C. schwierig. Zu den Risikofaktoren für die Krankheitsentwicklung gehört die Verwendung von Antibiotika, die die Darmmikrobiota stören, was zum Verlust der Kolonisationsresistenz und nachfolgender CDI führt. Die Identifizierung der spezifischen Mikroben, die diese Funktion wiederherstellen können, bleibt schwer fassbar. Zukünftige Studien, die darauf abzielen, wie mikrobielle Gemeinschaften die metabolische Umgebung beeinflussen, können helfen, die Rolle der Mikrobiota bei der Entwicklung von Krankheiten aufzuklären. Diese Erkenntnisse werden die aktuellen Biotherapeutika für Patienten mit CDI verbessern, insbesondere für solche mit rezidivierenden Erkrankungen.

1935 erstmals identifiziert, Clostridium difficile ist zu einer der Hauptursachen für im Krankenhaus erworbene Infektionen geworden (1, 2). Von erheblicher Besorgnis ist die Zunahme der Schwere und Morbidität, die in den letzten zehn Jahren beobachtet wurde. In den USA werden schätzungsweise 14.000 Todesfälle auf C. schwierig Infektion (CDI) jährlich, mit den damit verbundenen Kosten zwischen 1 Milliarde US-Dollar und 3 Milliarden US-Dollar ( 3 ). Darüber hinaus versagen die anfänglichen Behandlungsoptionen bei 20–30% der Patienten, was zu einem Wiederauftreten der Krankheit führt. Diese Zunahmen der CDI-Belastung traten in Verbindung mit dem Auftreten hyperendemischer Stämme auf ( 4 , 5 ).

Seit der Entdeckung von C. schwierig Als ätiologisches Agens von Antibiotika-assoziierter Diarrhoe haben wir die Bedeutung von Veränderungen der einheimischen Darmmikroben, die zusammenfassend als Mikrobiota bezeichnet werden, für die Entwicklung von CDI erkannt (6). Diese Mikroben enthalten schätzungsweise 100-mal mehr genetisches Potenzial als unser eigenes Genom. Somit kann die Mikrobiota Funktionen bereitstellen, die der Wirt allein nicht liefern kann, wie den Abbau essentieller Nährstoffe, den Arzneimittelstoffwechsel, die Immunentwicklung und die Pathogenresistenz (7). Jüngste technologische Fortschritte haben unser Verständnis der Rolle der Mikrobiota bei der Pathogenese von CDI verbessert. Das Vorhandensein einer gesunden Darmmikrobiota ist für die Entwicklung von CDI besonders relevant, und zukünftige therapeutische Strategien werden auf einem umfassenderen Verständnis der Rolle der Mikrobiota bei der Krankheitsprävention beruhen. In diesem Aufsatz werden wir unser derzeitiges Wissen über die Rolle der Mikrobiota bei der Pathogenese der CDI diskutieren.

Ein Verständnis der Pathogenese der CDI ist für die Behandlung und Prävention von Krankheiten von entscheidender Bedeutung (Abbildung 1). C. schwierig ist ein obligater Anaerobier, der durch die Aufnahme von Sporen über den fäkal-oralen Weg erworben wird. Diese Sporen können sogar unter rauen Umweltbedingungen überleben (8). Weil C. schwierig Sporen sind auch gegen alkoholhaltige Reiniger resistent, Sporen sind besonders in Krankenhausumgebungen verbreitet und wurden Monate nach der ersten Exposition nachgewiesen ( 9 , 10 ). Infektion mit einem toxigenen Stamm von C. schwierig führt zu einer Reihe klinischer Anzeichen und Symptome, von Durchfall und Krämpfen in leichten Fällen bis hin zur Entwicklung einer pseudomembranösen Kolitis und sogar zum Tod bei schweren Erkrankungen. Obwohl die meisten CDI-Fälle im Zusammenhang mit der Gesundheitsversorgung stehen, tritt ein Prozentsatz der Fälle in der Gemeinde auf und scheint nicht mit dem Einsatz von Antibiotika oder einer früheren Exposition gegenüber der Gesundheitsversorgung in Zusammenhang zu stehen (Abbildung 1 und Ref. 11). Eine aktuelle molekularepidemiologische Studie von Eyre et al. die die Sequenzierung des gesamten Genoms verwendet haben, um die Exposition und Übertragung von zu verfolgen C. schwierig kamen zu dem Schluss, dass ein Drittel der CDI-Fälle nicht mit dem Krankenhaus in Zusammenhang standen (12). Darüber hinaus waren nur ein Drittel der Fälle genetisch miteinander verwandt, was auf eine alternative Quelle für C. schwierig Exposition. C. schwierig Sporen wurden in verschiedenen Umweltquellen nachgewiesen, darunter domestizierte Tiere, Wasserquellen und Boden ( 13 ). Ein weiteres potenzielles Reservoir an C. schwierig lebt in der Säuglingspopulation, bei der eine Kolonisation bei bis zu 45% der Individuen geschätzt wird (14, 15). Das Säuglingsmikrobiom unterscheidet sich vom Erwachsenenmikrobiom, und Unterschiede im Mikrobiom können sowohl für die Kolonisation als auch für die Krankheitsresistenz wichtig sein (16, 17). Obwohl hohe Raten von C. schwierig Kolonisation bei Säuglingen beobachtet werden, entwickeln sie selten eine Krankheit. Es wurde postuliert, dass Säuglingen möglicherweise der für die Krankheitsentwicklung notwendige Rezeptor fehlt (18) oder dass Verbindungen in der menschlichen Muttermilch, wie mütterliches IgA, die Toxinbindung verhindern können (19). Zukünftige Studien, die Unterschiede im kolonisierten Säuglingsmikrobiom analysieren, können nützliche Informationen über spezifische Mikroben liefern, die gegen C. schwierig Besiedelung und Infektion.

CDI-Pathogenese. Die Entwicklung der Krankheit ist abhängig von verschiedenen Stadien der C. schwierig Lebenszyklus. Eine anfängliche Sporenexposition aus verschiedenen Quellen führt nicht unbedingt zu einer Krankheit, insbesondere bei einer gesunden Person. Eine gesunde, vielfältige Mikrobiota ist in der Lage, C. schwierig Sporenkeimung und vegetatives Wachstum. Wenn jedoch die metabolische und mikrobielle Umgebung des Darms gestört wurde, treten Sporenkeimung, vegetatives Auswachsen und Toxinproduktion auf. Epitheliale Schäden, Entzündungen und klinisch manifeste Erkrankungen resultieren aus der Toxinproduktion. Sporulation von C. schwierig, Freisetzung von Sporen in die Umwelt und Übertragung auf neue Wirte verewigen den Infektionszyklus.

Nach der Aufnahme müssen Sporen keimen und zu vegetativen Zellen heranwachsen, die den Magen-Darm-Trakt besiedeln. Die Exposition gegenüber Sporen führt nicht immer zu einer Kolonisation, da die Magen-Darm-Umgebung für das Auftreten dieser Ereignisse günstig sein muss. In-vitro-Studien weisen darauf hin, dass die Keimung und das Auswachsen in die vegetative Form vom Vorhandensein spezifischer primärer Gallensäuren wie Taurocholat abhängt (20, 21). Umgekehrt hemmen andere sekundäre Gallensäuren wie Chenodesoxycholat die Keimung von C. schwierig Sporen ( 22 ). Mikroben im Magen-Darm-Trakt spielen eine Schlüsselrolle beim Stoffwechsel von Gallensäuren ( 23 ), und es wird vermutet, dass die Modulation der Mikrobiota-Gemeinschaft die Verfügbarkeit von Metaboliten beeinflussen kann. Giel et al. stellten fest, dass Blinddarmextrakte von antibiotisch behandelten Mäusen erhöhte Mengen an Gallensalzen enthielten und die Sporenkeimung förderten, während Blinddarmextrakte von unbehandelten Mäusen dies nicht taten (24). In ähnlicher Weise haben Theriot et al. beobachteten signifikante Verschiebungen im Metabolom von mit Antibiotika behandelten Mäusen, die mit Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur korrelierten (25). Sowohl Human- als auch In-vivo-Studien an Mäusen haben die Bedeutung von Gallensäuren in C. schwierig Keimung und erweitern unser Wissen über die Sporenkeimung ( 25 – 27 ).

Einmal kolonisiert, C. schwierig kann zu Toxin-vermittelten Entzündungen und Krankheiten führen. C. schwierig produziert 2 Haupttoxine, die für Krankheiten verantwortlich sind, die großen Clostridien-Toxine A und B (TcdA und TcdB). Diese Toxine, die während der stationären Phase des vegetativen Wachstums produziert werden, sind maßgeblich für die Schädigung des Schleimhautepithels und die Induktion einer Entzündungsreaktion verantwortlich ( 28 ). Ein weiteres Gift, das C. schwierig Es wurde beobachtet, dass binäres Toxin (CDT) das Aktin-Zytoskelett zerstört, und einige Studien deuten darauf hin, dass seine Anwesenheit die Stammvirulenz erhöhen kann (29, 30), jedoch korreliert seine Anwesenheit nicht immer mit der Schwere der Erkrankung (31). Der dynamische Lebenszyklus von C. schwierig ist komplex, und an jedem Schritt können mehrere Wirtsfaktoren beteiligt sein (Abbildung 2). Da Sporenexposition und C. schwierig Besiedelung führt nicht unbedingt zu einer klinischen Erkrankung, die mikrobielle Gemeinschaft des Magen-Darm-Trakts und der Wirt können während des gesamten Lebenszyklus von . eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Krankheit spielen C. schwierig.

Vorgeschlagene Mechanismen der Mikrobiota auf die Pathogenresistenz und den Wirt während der CDI. (EIN) Sowohl mikrobielle als auch Wirtsfaktoren können die Keimung und das Wachstum von . hemmen C. schwierig. Eine gesunde Mikrobiota ist in der Lage, sowohl mikrobielle als auch vom Wirt erzeugte Metaboliten aufzunehmen, wodurch das Wachstum von C. schwierig. Ein Cross-Talk zwischen der Mikrobiota und dem Immunsystem des Wirts führt zu einer regulierten Immunantwort. Darüber hinaus kann die Mikrobiota die Produktion von antimikrobiellen Peptiden und sekretorischem IgA (sIgA) stimulieren, die die Zusammensetzung der Mikrobiota aufrechterhalten können. (B) Störungen der Mikrobiota aufgrund von Faktoren wie Antibiotika, Medikamente, Ernährung oder Entzündungen können zur Entwicklung von CDI führen. Eine dysbiotische Mikrobiota kann aufgrund von Veränderungen der strukturellen und/oder metabolischen Umgebung zum Verlust der Kolonisationsresistenz führen. Der Verlust bestimmter Mitglieder der Gemeinschaft beeinflusst möglicherweise die Konzentrationen von mikrobiellen und vom Wirt erzeugten Metaboliten, was zu einem anderen funktionellen Zustand führt, der die Sporenkeimung und das vegetative Auswachsen fördert. Eine dysbiotische Mikrobiota kann auch zu einer unausgeglichenen Immunantwort durch den Verlust der Immunregulation und einen proinflammatorischen Zustand führen, die beide die Krankheitsentwicklung beeinflussen können. Toxinproduktion durch vegetative C. schwierig kann die Produktion von entzündlichen Zytokinen, Neutrophilen und Antitoxin-Antikörpern stimulieren.

Im Zentrum der CDI-Pathogenese steht die Störung der Mikrobiota (Abbildung 2). Eine gesunde Darmmikrobiota ist zum Schutz vor einer Besiedelung mit Krankheitserregern notwendig, die als Kolonisierungsresistenz bezeichnet wird ( 32 ). Eine ungestörte Mikrobiota ist in der Lage, der Kolonisierung durch Krankheitserreger zu widerstehen, und es wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, warum eine Zerstörung der Mikrobiota zum Verlust der Kolonisationsresistenz führt, einschließlich Konkurrenz um Nährstoffe, ökologische Konkurrenz und Nischenausschluss (33). Während viele mit CDI verbundene Risikofaktoren zu einer Störung der Mikrobiota führen können, ist der am häufigsten damit verbundene Faktor die Verwendung von Antibiotika. Sowohl kurz- als auch langfristige Veränderungen der Darmmikrobiota wurden nach der Anwendung von Antibiotika beobachtet. Eine Abnahme der Vielfalt der Darmmikrobiota ist innerhalb von Tagen nach der Antibiotikaanwendung nachweisbar, obwohl Änderungen der Zusammensetzung von dem verwendeten Antibiotikum sowie der zugrunde liegenden Mikrobiotagemeinschaft des Individuums abhängen können (34, 35). Die Rekonstitution der mikrobiellen Vielfalt erfolgt nach Beendigung des Antibiotikaeinsatzes, kann aber auch zu einer veränderten Gemeinschaftsstruktur führen. Dethlefsenet al. fanden heraus, dass, obwohl die Genesung innerhalb von Wochen nach dem Absetzen von Ciprofloxacin einsetzte, die neue Gemeinschaft nicht unbedingt alle Gemeinschaftsmitglieder umfasste, die vor der Antibiotikaanwendung beobachtet wurden (36). Die mit der Entwicklung von CDI assoziierten Antibiotikaklassen umfassen Clindamycin, Cephalosporine und Penicilline (37).

Es wurde auch beobachtet, dass das zunehmende Alter, ein weiterer bekannter Risikofaktor für die Entwicklung von CDI, die Struktur des Mikrobioms beeinflusst. Das menschliche Darmmikrobiom unterliegt im Laufe des Lebens extremen Veränderungen, und es überrascht nicht, dass bei älteren Menschen Veränderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung beobachtet wurden (38, 39). Während das Darmmikrobiom gesunder Erwachsener im Laufe der Zeit relativ stabil erscheint, wurde beobachtet, dass das Darmmikrobiom älterer Menschen in Bewegung und weniger vielfältig ist. Mikrobiota-Studien an älteren Kohorten haben eine Abnahme der schützenden Arten beobachtet, wie z Bifidobakterien und einige Firmicutes-Mitglieder sowie eine Zunahme von Bacteroidetes und schädlicheren Arten wie Proteobakterien (38, 40). Diese Veränderungen scheinen teilweise den Abbau des Immunsystems im Alter zu begleiten, der als Immunoseneszenz bezeichnet wird. Angesichts dieser Beobachtungen überrascht es nicht, dass die CDI-Rate bei Personen ab 65 Jahren höher ist und die Mehrheit der Durchfallfälle in Langzeitwohneinrichtungen ausmacht ( 41 – 43 ). Obwohl es möglich ist, dass das Alter ein unabhängiger Risikofaktor für CDI ist, ist das zunehmende Alter auch mit einem erhöhten Antibiotikaeinsatz, häufigeren Krankenhausbesuchen und der Entwicklung von Krankheiten im Allgemeinen verbunden, die alle Auswirkungen haben C. schwierig Anfälligkeit.

Auch andere Risikofaktoren im Zusammenhang mit der Entwicklung von CDI können die Mikrobiota stören (Abbildung 2). Die Anwendung von Protonenpumpenhemmern (PPI), insbesondere in Verbindung mit Antibiotika, wurde in einigen Studien mit einer höheren CDI-Inzidenz korreliert (44, 45). Es wird vermutet, dass PPIs, die im Allgemeinen den pH-Wert des Magens erhöhen, andere Magen-Darm-Orte beeinflussen und somit in der Lage sind, die Mikrobiota zu modulieren (46). Tatsächlich haben In-vitro-Studien gezeigt, dass PPIs das Wachstum von Lactobazillen, ein häufiger Bewohner von Mund und Darm (47).

Patienten, die an anderen Magen-Darm-Erkrankungen leiden, können auch mit höherer Wahrscheinlichkeit C. schwierig. Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wurden mit einem schwereren Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht und gelten zunehmend als Risikofaktor für CDI (48, 49). In der Mikrobiota von CED-Patienten wurde eine verminderte Diversität von Firmicutes und Bacteroidetes beobachtet (50). Darüber hinaus wurde die Mikrobiota von Patienten mit CED mit dem Vorhandensein mehrerer potenziell pathogener Bakterien, hauptsächlich innerhalb des Proteobacteria-Stamms, in Verbindung gebracht (51, 52). Wie sich diese Gemeinschaften jedoch auf die Anfälligkeit für C. schwierig selbst erscheint komplex.

Die Immunantwort des Wirts hat auch die Fähigkeit, die Mikrobiota zu modulieren. Die Beobachtung, dass CED den Krankheitsverlauf von CDI verschlimmern kann, legt nahe, dass Entzündungen zur Entwicklung von CDI beitragen können. Entzündungsprodukte, wie die antimikrobiellen Peptide Lipocalin-2 und Calprotectin, begrenzen die Verfügbarkeit von Nährstoffen in der Darmumgebung und beeinträchtigen möglicherweise das Wachstum der umgebenden Mikroben (53, 54). Diese Änderungen können eine zugänglichere Umgebung für C. schwierig Kolonisation und anschließende CDI. Neben entzündungsbedingten Veränderungen des Mikrobioms können auch andere wirtsbedingte Immunreaktionen am Krankheitsverlauf beteiligt sein. Die Art der Darmgemeinschaft kann potenziell das residente IgA-Repertoire der Schleimhaut beeinflussen ( 55 ), und bei Kolonbiopsien von Patienten mit rezidivierenden Erkrankungen wurde eine Verringerung der IgA-produzierenden Zellen beobachtet ( 56 ). Es wurde auch beobachtet, dass verschiedene Mikroben Teilmengen von T-Zellen beeinflussen, wie z. B. die Induktion von Tregs durch Clostridium Spezies ( 57 ) und Th17-Zelldifferenzierung durch segmentierte filamentöse Bakterien ( 58 ). Die Modulation dieser mikrobiellen Populationen, z. B. nach Antibiotika, beeinflusst wahrscheinlich die Kolonisierung von Krankheitserregern. Russellet al. beobachteten, dass die Vancomycin-Behandlung bei Mäusen zu einer verringerten Menge an Bakteroiden Arten im Darm, was mit einer verringerten Häufigkeit von Tregs im Dickdarm korreliert war (59). Es ist wahrscheinlich, dass Wirtsfaktoren, die durch Antibiotika moduliert werden oder nicht, den Krankheitsverlauf beeinflussen.

Das Human Microbiome Project zeigte das Ausmaß der Variation innerhalb der „gesunden“ oder „normalen“ Darmmikrobiota (60). Diese Beobachtungen haben unsere Definition von Dysbiose innerhalb der Darmmikrobiota deutlich verfeinert und erschweren weiterhin die kausale Rolle des Mikrobioms bei der Krankheitsentwicklung. In Zukunft hoffen wir, mehr mechanistische Fragen zu den Risikofaktoren zu beantworten, die mit der Störung der Mikrobiota und der Entwicklung von CDI korrelieren.

Während die allgemeine Bedeutung der Darmmikrobiota für die CDI-Entwicklung gut bekannt ist, bleiben die genauen Mikroben, die für den Schutz oder die Anfälligkeit verantwortlich sind, unklar (Tabelle 1). Das Fehlen prospektiver menschlicher Proben vor der CDI hat die Identifizierung von Mikrobiom-Signaturen, die mit dem Schutz korrelieren, erschwert. Mehrere Querschnittstudien haben Proben von CDI-Patienten mit Proben von gesunden und Nicht-CDI-Patienten mit Durchfall verglichen. Säuglinge stellen eine interessante Studienpopulation dar, da die meisten Säuglinge kolonisiert werden können, aber keine Krankheiten entwickeln. Rousseauet al. beobachtet, dass C. schwierig Die Kolonisation bei Säuglingen wurde von der Anwesenheit von begleitet Ruminokokken und Klebsiella Arten, während Bifidobakterium schien vor Kolonisation schützend zu sein (17). Mehrere Studien haben auch Proben von älteren Bevölkerungsgruppen verglichen, die anfälliger sind. Unter Verwendung von Nichtsequenzierungsverfahren haben Hopkins et al. beobachteten, dass ältere Patienten mit CDI höhere Zahlen von Enterobacteriaceae (Proteobakterien) aufwiesen, Enterokokken, und Lactobazillen (beide Firmicutes), während gesunde ältere Patienten vielfältigere Bakteroiden Stämme (Bacteroides) (61). Gesunde Erwachsene hatten auch eher mehr Bifidobakterien und Bakteroiden im Vergleich zu beiden älteren Bevölkerungsgruppen. Neuere Studien mit Hochdurchsatz-Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens haben einen tieferen Einblick in die Gemeinschaftsstruktur in C. schwierig–positive Menschen ( 62 – 64 ). In einer Kohorte älterer Patienten haben Rea et al. beobachteten, dass Patienten mit aktiver CDI im Vergleich zu ihren gesunden Kollegen eine weniger vielfältige Darmmikrobiota aufwiesen (63). Bei Patienten, die positiv auf C. schwierig. Ähnliche Ergebnisse wurden in Studien berichtet, in denen gesunde Erwachsene mit CDI- und Nicht-CDI-Patienten mit Durchfall verglichen wurden (64, 65). Im Vergleich zu gesunden Erwachsenen hatten beide Gruppen signifikant weniger vielfältige Gemeinschaften, insbesondere eine weniger vielfältige Firmicutes-Population. Die Familien der Lachnospiraceae, Ruminococcaceae und Bacteroidaceae dominierten die bei gesunden Menschen beobachteten Lebensgemeinschaften. Interessanterweise wiesen Nicht-CDI- und CDI-Patienten mit aktiver Diarrhoe auffallend ähnliche Gemeinschaften auf, was darauf hindeutet, dass Diarrhoe oder Entzündung selbst mit einer bestimmten Mikrobiota-Gemeinschaft korreliert sein können. Darüber hinaus wurden die meisten CDI-Proben während des Antibiotika-Einsatzes gesammelt, was die beobachtete Gemeinschaftsstruktur vereinfachen könnte. Während die Ergebnisse verschiedener Studien übereinstimmen, sind die interindividuellen Unterschiede in der Darmmikrobiota zwischen den Studien offensichtlich. Sowohl Wirtsfaktoren als auch Umwelteinflüsse auf die Darmmikrobiota und die Krankheit selbst erschweren die Identifizierung spezifischer mikrobieller Marker, die für den Krankheitsschutz verantwortlich sind.

Zusammenfassung der beobachteten schützenden mikrobiellen Taxa (negativ korreliert mit C. schwierig Kolonisation) und anfällige mikrobielle Taxa (positiv korreliert mit C. schwierig Kolonisation) in Humanstudien zur Untersuchung von Veränderungen in der Mikrobiota-Gemeinschaft und CDI

Ähnliche allgemeine Beobachtungen wurden in Mausmodellen gemacht, in denen Umwelt- und genetische Varianzen besser kontrolliert werden können. Wie beim Menschen verringert die Verabreichung von Antibiotika die Vielfalt der Darmmikrobiota bei Mäusen und macht sie anfälliger für mehrere Darmerkrankungen, einschließlich CDI. Lawleyet al. beobachteten, dass eine reduzierte mikrobielle Diversität im Mäusedarm, dominiert von Enterokokken und Proteobakterien, die nach einer Behandlung mit Clindamycin die Krankheit und die Absonderung ansteckender Sporen induzierten (66). Ein anderes Clindamycin-basiertes CDI-Modell bei Mäusen berichtete über ähnliche Abnahmen der Enterobacteriaceae-Mitglieder sowie über Unterschiede in der Erholung der Gemeinschaften mit und ohne CDI (67). Reeveset al. fanden heraus, dass anfällige Mäuse vor der Infektion nach einer Behandlung mit Cefoperazon, Clindamycin oder einem Multiantibiotikum-Cocktail von Lactobacillaceae- und Enterobacteriaceae-Familien dominiert wurden (68). Umgekehrt dominierten Lachnospiraceae-Mitglieder Tiere, die gegen CDI resistent blieben. Eine Folgestudie, die auf diesen Beobachtungen basierte, beobachtete, dass Mäuse, die von Lachnospiraceae-Isolaten besiedelt waren, nicht jedoch Mäuse, die von E coli Isolate, ausgestellt vermindert C. schwierig Kolonisation und weniger schwere Erkrankung (69). Trotz der Unterschiede bei niedrigeren taxonomischen Ebenen in der Darmmikrobiota zwischen Mensch und Maus, haben Mausmodelle einen prüfbareren Weg zur Identifizierung von Komponenten geboten, die bei der CDI-Entwicklung schützen.

Eine der Schwierigkeiten, die die Identifizierung der spezifischen Gemeinschaftsmitglieder behindert hat, die Kolonisierungsresistenz verleihen, ist die inhärente interindividuelle Variabilität der in der menschlichen Bevölkerung beobachteten Mikrobiota. Darüber hinaus garantiert die Identifizierung der gleichen Mikrobenart weder, dass die Mikrobe eine identische genetische Funktion hat, noch schließt die Identifizierung verschiedener Mikroben die Möglichkeit ähnlicher Funktionen innerhalb einer Gemeinschaft aus. Stattdessen haben neuere Studien vorgeschlagen, dass die metabolische oder funktionelle Umgebung im Vergleich zur Gemeinschaftsstruktur eher ein Hinweis auf anfällige Zustände sein kann. Eine aktuelle Studie von Theriot et al. legt nahe, dass durch Antibiotika induzierte Veränderungen, die Mäuse anfällig für C. schwierig spiegeln sich besser in metabolischen Veränderungen als in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft wider (25). Obwohl die mit Antibiotika behandelten Mäuse schließlich die Kolonisierungsresistenz erholten, war ihre Gemeinschaftszusammensetzung im Vergleich zu ihrer präantibiotischen Gemeinschaft verändert, was darauf hindeutet, dass eher funktionelle Veränderungen als Veränderungen in der Gemeinschaft für die Aufrechterhaltung der CDI-Resistenz wichtig sind. Um die Struktur-Funktions-Beziehung des Mikrobioms während einer Infektion aufzuklären, sind weitere Studien erforderlich, die untersuchen, wie verschiedene Gemeinschaften ähnliche Funktionen erfüllen können.

Ein Hauptanliegen bei der CDI-Behandlung ist das Wiederauftreten der Krankheit nach einem scheinbar erfolgreichen Ansprechen auf eine Standardtherapie bestehend aus Antibiotika, von denen bekannt ist, dass sie das Wachstum von C. schwierig, Metronidazol und/oder Vancomycin. Es wird geschätzt, dass bei 20–30 % der CDI-Patienten nach jeder Inzidenz ein Rezidiv auftritt, die Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs steigt ( 70 ). Obwohl nicht bekannt ist, warum bei einigen Patienten ein Rezidiv auftritt und bei anderen nicht, gehören zu den Risikofaktoren für eine rezidivierende CDI die Verwendung von Nicht-CDI-Antibiotika nach einer ersten Episode sowie ein erhöhtes Alter und eine erhöhte Krankheitsschwere (71). Es wird vermutet, dass eine Antibiotikabehandlung die Fähigkeit der Darmmikrobiota beeinträchtigt, sich vollständig zu erholen und die Kolonisationsresistenz bei einigen Individuen wiederherzustellen. Alternativ könnte ein Rezidiv darauf hinweisen, dass der Wirt nicht in der Lage ist, eine schützende Immunantwort gegen . aufzubauen C. schwierig.

Nur wenige Studien haben strukturelle Signaturen im Mikrobiom untersucht, die möglicherweise zu einem Wiederauftreten führen. Die meisten CDI-Studien am Menschen haben keinen Längsschnitt in ihre Studien einbezogen oder Patienten mit mehrfach rezidivierender CDI nicht unterschieden. Changet al. beobachteten, dass die Mikrobiota-Gemeinschaft bei rezidivierenden Patienten weniger vielfältig war als bei Patienten mit einem einzelnen Fall von CDI, was darauf hindeutet, dass ein Wiederauftreten auf der Grundlage der während der Infektion vorhandenen Mikrobiota-Gemeinschaft vorhergesagt werden könnte ( 72 ). While some studies comparing non-CDI and CDI samples have included secondary recurrent samples in their analysis, none were able to identify particular aspects unique to patients with recurrent CDI ( 63 ).

Interestingly, much of our knowledge about the microbiota during recurrent CDI comes from an alternative treatment method, fecal microbiota transplantation (FMT). Use of FMT, or fecal bacteriotherapy, has become a popular, highly effective treatment method for recurrent CDI. The success rate of FMT is up to 92% in multiply recurrent CDI patients, depending on the protocol used ( 73 ). It is presumed that FMT is capable of restoring the microbiota and colonization resistance. However, as with the identification of which specific microbes may indicate susceptibility to CDI, the microbes responsible for restoring colonization resistance have not been specifically identified. Earlier studies using either culture-based or PCR-based methods have reported the recovery of Bakteroiden species and detection of more Firmicutes in culture, only after the FMT procedure, along with successful clinical recovery ( 74 , 75 ). Recent studies using 16S rRNA surveys have observed that after FMT, diversity of the gut microbiota increases and resembles the donor’s ( 76 – 78 ). Recovery of both Firmicutes and Bakteroiden wurde beobachtet. Additionally, the level of Proteobacteria, generally found at high levels within patients with active CDI, decreases after FMT. Interestingly, the dominant donor microbes classified at either at the genus level or the operational taxonomic unit level are observed to be prevalent within the recipient for only days following FMT ( 77 , 79 ). The microbes that are found to be dominant within recipients in the long term appear to be recipient-specific, even if the community is more similar to the donor’s than before FMT. These observations suggest that direct colonization by the donor’s microbes is not necessarily what accounts for recovery of the microbiota community following FMT.

As with the identification of communities that render an individual more susceptible to C. schwierig during initial infection, the functional state of the environment may be more telling than the structure. Indeed, human microbiome studies of CDI have observed a decrease in butyrate-producing microbial taxa and have postulated that the abundance of microbial by-products, such as short-chain fatty acids, may be indicative of susceptibility to CDI ( 64 , 80 , 81 ). A recent study by Weingarden et al. observed high concentrations of primary bile acids in patients with recurrent CDI ( 27 ). Following FMT, the concentration of secondary bile acids, undetected in pre-FMT samples, was increased and was found at a relative abundance close to that of healthy donors. These results are in agreement with the in vitro and in vivo mouse studies that have previously observed that secondary bile acids, such as lithocholic or deoxycholic acid, inhibit C. schwierig growth ( 20 , 25 ). Although the bacterial community is responsible for producing the metabolic environment, it is possible that several types of bacterial communities with similar functions may be capable of the same metabolic outcome, and that structure alone may not be enough to determine recurrence risk ( 82 ).

In addition to standard therapy or FMT, other treatment methods for CDI have been explored. Ideally, therapy would be effective against C. schwierig but fail to globally affect the indigenous gut microbiota. Antibiotics other than vancomycin or metronidazole, such as fidaxomicin, tigecycline, and rifampicin, have been used to treat severe or recurrent CDI ( 83 , 84 ). Fidaxomicin was also shown to exert little effect on Bakteroiden counts, which may be advantageous in preserving colonization resistance ( 85 ). Tigecycline has been observed to inhibit toxin production and growth in mice and has been used to treat severe disease in humans ( 86 , 87 ). However, even antibiotics that have intrinsic capability against C. schwierig are able to change the microbiota, potentially resulting in a loss of colonization resistance ( 88 ). The future of CDI treatment will likely include nonantibiotic therapeutic approaches against CDI, which are advantageous since they may be less likely to perturb the microbiota in a detrimental manner. One option is to treat the primary cause of disease development in CDI, toxin activity by toxins A and B. Serum IgG antibodies against toxins A and B have been correlated with protection in human studies ( 89 , 90 ). Both passive and active immunization strategies against toxins have been explored as potential methods to treat C. schwierig ( 91 ). Drugs that bind toxin in vitro, such as tolevamer, have also been used in human trials, but with limited success ( 92 ). Although antitoxin therapies may prevent the effects of toxin and disease development, they do not prevent C. schwierig colonization or potential spore transmission.

Like FMT, therapies involving live microorganisms have great promise in CDI treatment and prevention. Synthetic mixes of bacteria have been suggested as potential biotherapeutic approaches to treating CDI as an alternative to fecal transplantation directly from a donor. Although donors are generally screened for known pathogens before FMT, there is still a risk of transmission of unknown pathogens or unknown risks associated with the microbiota. A synthetic mix provides control over many safety issues compared with direct fecal matter, such as reducing the potential risk of pathogen transmission and providing more reproducible control over the types of bacteria contained in the mixture. Lawley et al. were able to identify a population of 6 different bacteria that were efficient at clearing CDI in mice ( 93 ). In humans, Petrof et al. reported successful treatment of recurrent CDI in 2 patients with a community consisting of 33 isolates from a healthy donor ( 94 ). Furthermore, if the functional aspects rather than the community itself can lead to colonization resistance, formulation of an effective biotherapeutic option may include organisms that are capable of providing a metabolic environment that promotes the growth of existing healthy microbes, such as Bakteroiden or Firmicutes, rather than fully replacing the community favorable to C. schwierig. These data have generated great interest in creating commercial biotherapeutics to replace FMT, potentially leading to the development of prebiotics or prescribed diets instead of bacterial communities to enhance an environment resistant to C. schwierig outgrowth and/or colonization.

The observation that asymptomatically colonized patients have a reduced risk of developing CDI has prompted research into using nontoxigenic strains as preventative therapy against C. schwierig ( 95 ). Recently, Nagaro et al. observed that hamsters infected with nontoxigenic strains were protected from infection with the hyperendemic BI/NAP1/027 strain, which is usually 100% fatal in hamsters ( 96 ). Nontoxigenic strains have also been used safely in studies of volunteer patients in prevention of recurrent C. schwierig ( 97 ). Both the generation of a protective immune response by the host and competitive niche theories have been hypothesized to explain these results. However, the potential for gene transfer of virulence factors and antibiotic resistance among nontoxigenic and toxigenic strains is a concern.

Although a basic picture of CDI pathogenesis is known, a better understanding of the microbiota’s role in disease prevention is necessary. The role of the gut microbiota is integral throughout the life cycle of C. schwierig from spore transmission, germination, and growth, into disease development. Although our understanding about the complexity of disease development and transmission has improved in recent decades, we still lack knowledge on which components are crucial points of interruption. The development of future therapeutics to treat disease and minimize transmission depends on expanding our current knowledge.

The NIH grant U19AI090871 (to V.B. Young) and the Michigan Gastrointestinal Peptide Research Center (P30DK034933) provided funding for this research. We thank Mark Mazaitis for his consultation on the figure concepts.

Interessenkonflikt: Die Autoren haben erklärt, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Reference information: J Clin Invest. 2014124(10):4182–4189. doi:10.1172/JCI72336.


Abstrakt

Clostridium difficile is now considered to be one of the most important causes of health care-associated infections. C. schwierig infections are also emerging in the community and in animals used for food, and are no longer viewed simply as unpleasant complications that follow antibiotic therapy. Since 2001, the prevalence and severity of C. schwierig infection has increased significantly, which has led to increased research interest and the discovery of new virulence factors, and has expanded and focused the development of new treatment and prevention regimens. This Review summarizes the recent epidemiological changes in C. schwierig infection, our current knowledge of C. schwierig virulence factors and the clinical outcomes of C. schwierig Infektion.


The increased incidence and severity of Clostridium difficile infection (CDI) in older adults (age, ⩾65 years) corresponds with the emergence of the BI/NAP1 strain, making elucidation of the host immune response extremely important. We therefore infected germ-free C57BL/6 mice aged 7–14 months with a BI/NAP1 strain and monitored the mice for response. Infected mice were moribund 48–72 h after infection and developed gross and histological cecitis and colitis and elevated concentrations of keratinocyte chemoattractant, interleukin 1β, monocyte chemotactic protein 1, and granulocyte colony-stimulating factor and decreased levels of interferon γ, interleukin 12 p40, interleukin 12 p70, and interleukin 10 compared with controls. We conclude that aged, germ-free C57BL/6 mice are susceptible to fulminant CDI from a BI/NAP1 strain and represent a novel model to further elucidate the host immune response to acute CDI.

The incidence, severity, and mortality of Clostridium difficile infection (CDI) have increased, especially in individuals ⩾65 years of age, possibly in association with the emergence of the epidemic restriction endonuclease analysis and pulse field gel electrophoresis BI/NAP1 strain [ 1]. This strain has been present since the 1980s but was not previously responsible for outbreaks 2]. It hyperproduces toxins A and B, secretes a binary toxin, hypersporulates, and has developed high-level fluoroquinolone resistance, which suggests that these traits have led to increased virulence and spread [ 2].

A murine model of infection is extremely important to help elucidate the host immune response to CDI and to better understand the pathogenesis induced by BI/NAP1 as well as additional C. schwierig Stämme. The traditional animal model of CDI, the Syrian hamster, is limited by an inability to study the host cytokine response due to a lack of host-specific reagents. Previous germ-free CDI experiments with murine strains other than C57BL/6, particularly in the 1980s and early 1990s, resulted in minimal intestinal pathogenesis to severe cecal and colon ulceration with 100% mortality [ 3, 4]. The majority of these studies, however, utilized a highly toxigenic laboratory strain, VPI 10463, which has high levels of toxin A and B production, has low sporulation rates, and has never been found to cause human colitis. No gnotobiotic murine studies have been performed with the BI/NAP1 strain, and it has not yet been determined whether germ-free C57BL/6 mice are susceptible to CDI. Additionally, the murine mucosal cytokine response to CDI has not been documented.

Therefore, we undertook this study to determine whether germ-free C57BL/6 mice—a commonly investigated strain that can be bred for transgenic and knockout mouse studies—inoculated with a clinically relevant BI/NAP1 strain could be a beneficial model to study the pathogenesis of and host mucosal cytokine responses to acute CDI.

Methoden. UVA13, a human-infecting C. schwierig isolate that was previously cultured from a fecal specimen from a patient with CDI at the University of Virginia Hospital and typed as BI/NAP1 by the Hines Reference Laboratory at the Hines Veterans Affairs Hospital (Hines, IL) with the use of restriction endonuclease analysis and a protocol that has been described elsewhere [ 5], was inoculated into chopped meat broth and incubated anaerobically at 38°C for 24 h. Sixteen germ-free C57BL/6 mice (age, 7–14 months) from the National Gnotobiotic Rodent Resource Center at the University of North Carolina were orally gavaged with 330 μL of incubated broth containing a total of 1 X 10 8 organisms. Similarly, VPI 11186, a nontoxigenic strain of C. difficile, was incubated in broth for 24 h, and 2 germ-free mice were orally gavaged with 1 X 10 8 organisms. Six germ-free mice received a similar dosage of uninoculated broth and served as uninfected controls. Sterility was confirmed in germ-free mice by aerobic and anaerobic culture and Gram staining of stool samples, as outlined elsewhere [ 6].

Mice were monitored every 8 h after inoculation for clinical signs and symptoms of disease, including diarrhea and impaired physical condition and behavior. Weights were obtained as a measure of disease at the time of euthanasia. Mice that were determined to be moribund according to Animal Care and Use Committee policy and approved protocol were weighed and euthanized. (See Appendix 1, which appears only in the online version of the Tagebuch .)

Cecal and colon segments were collected from euthanized mice and prepared for histological analysis by use of hematoxylin-eosin stain and antibodies directed against myeloperoxidase. Histological specimens were scored by 2 blinded investigators (S.W.P. and R.F.) on a scale of 0–3 (minimal score, 0 maximal score, 3) on the basis of each of the following criteria: inflammatory cell infiltration, mucosal hypertrophy, vascular congestion, epithelial disruption, and submucosal edema. (See Appendix 2, which appears only in the online version of the Tagebuch .)

Cecal and colon segments were homogenized and assayed for the cytokines granulocyte colony-stimulating factor (GCSF), interleukin 1β (IL-1β), keratinocyte chemoattractant (KC), tumor necrosis factor α (TNF-α), interferon γ (IFN-γ), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), interleukin 12 p40 (IL-12p40), interleukin 12 p70 (IL-12p70), interleukin 6 (IL6), interleukin 17 (IL-17), interleukin 13 (IL-13), and interleukin 10 (IL-10) by use of bead-based Luminex immunoanalysis (Bio-Rad).

Mean differences in cecal and colon histopathological scores and cytokine levels were analyzed with SPSS software (version 17 SPSS) and evaluated using an independent Student T Prüfung. Results for which P⩽ .05 were determined to be significant.

Ergebnisse. All mice given UVA13 died or were moribund (necessitating euthanasia) within 72 h, whereas mice given VPI 11186 or broth were asymptomatic. Germ-free mice administered UVA13 developed diarrhea and/or wet tail, accompanied by weight loss. Eleven (69%) of 16 UVA13-infected mice were euthanized and processed for histological and cytokine analysis (5 UVA13-infected mice died and could not be processed). Broth control mice (n= 6) and mice infected with the nontoxigenic strain (n= 2) were euthanized after 72 h, processed, and assessed for comparison of histological scores and cytokine levels.

In a gross comparison, UVA13-infected mice had shorter ceca than those of controls, with evidence of purulent, hemorrhagic, or loose cecal contents with less pronounced alterations in colon segments. Histopathological scores were significantly higher in UVA13-infected mice than in control mice, with evidence of both cecal and colon ulceration, loss of mucosal architecture, epithelial exfoliation, inflammatory cell in filtration, edema, and hemorrhage in the lamina propria ( Figure 1). Although neutrophilic infiltration was demonstrated with myeloperoxidase staining, it was relatively minor, and there was evidence of myeloperoxidase both within neutrophils and extravasated within the lumen ( Figure 1).

Histopathological analysis of cecal and colon segments 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic C. schwierig strain), or broth. EIN, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the nontoxigenic strain. B, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain. C, Myeloperoxidase stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain (brown indicates myeloperoxidase activity). D, Histopathological differences in the cecum and colon between BI-infected mice (n = 11), mice infected with the nontoxigenic strain (n = 2), and broth controls (n = 6) as determined by inflammatory cell infiltration, mucosal hypertrophy, vascular congestion, epithelial disruption, and submucosal edema, with a maximum score of 15. *P ⩽ .001 for BI-infected mice compared with broth controls. L, lumen.

Histopathological analysis of cecal and colon segments 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic C. schwierig strain), or broth. EIN, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the nontoxigenic strain. B, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain. C, Myeloperoxidase stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain (brown indicates myeloperoxidase activity). D, Histopathological differences in the cecum and colon between BI-infected mice (n = 11), mice infected with the nontoxigenic strain (n = 2), and broth controls (n = 6) as determined by inflammatory cell infiltration, mucosal hypertrophy, vascular congestion, epithelial disruption, and submucosal edema, with a maximum score of 15. *P ⩽ .001 for BI-infected mice compared with broth controls. L, lumen.

We next examined cecal and colon segments to determine mucosal cytokine concentrations produced after infection. UVA13 infection led to elevated cecal and colonic concentrations of KC, MCP-1, IL-1β, and G-CSF compared with those in controls concentrations were greater in the cecum than in the colon ( Figure 2). Additionally, BI/NAP1 infection led to lower levels of cecal and colonic IL-12p40, IL-12p70, IFN-γ, and IL-10 ( Figure 2). There were no differences in the concentrations of the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-13, and IL-17.

Cytokine concentrations in the cecum and colon 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic strain), or broth. Cecal (EIN) and colon (B) segments were homogenized in a proteinase inhibitor cocktail and assayed for the cytokines granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), keratinocyte chemoattractant (KC), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 12 p40 (IL-12p40), interleukin 12 p70 (IL-12p70), interferon γ (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), interleukin 17 (IL-17), and interleukin 13 (IL-13) by use of Luminex immunoanalysis (Bio-Rad). There were no significant differences in IL-6, IL-17, or IL-13 concentrations between the groups (data not shown). * P⩾ .05 for BI-infected mice (n = 11) compared with broth controls (n = 6) ** P ⩽ .001 for BI-infected mice (n = 11) compared with broth controls (n = 6).

Cytokine concentrations in the cecum and colon 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic strain), or broth. Cecal (EIN) and colon (B) segments were homogenized in a proteinase inhibitor cocktail and assayed for the cytokines granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), keratinocyte chemoattractant (KC), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 12 p40 (IL-12p40), interleukin 12 p70 (IL-12p70), interferon γ (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), interleukin 17 (IL-17), and interleukin 13 (IL-13) by use of Luminex immunoanalysis (Bio-Rad). There were no significant differences in IL-6, IL-17, or IL-13 concentrations between the groups (data not shown). * P⩾ .05 for BI-infected mice (n = 11) compared with broth controls (n = 6) ** P ⩽ .001 for BI-infected mice (n = 11) compared with broth controls (n = 6).

Diskussion. The results of this study indicate that acute infection with a clinically relevant BI/NAP1 C. schwierig strain leads to weight loss, symptomatic disease, cecal and colonic ulceration, a relatively minor neutrophil infiltration, a measurable cytokine response, and eventual death in monoassociated C57BL/6 mice. The clinical and histopathological findings are in agreement with those of Vernet and colleagues [ 4], who previously observed that germ-free C3H/He mice infected with C. schwierig that secreted elevated levels of toxin A in vitro developed cecal and colon ulceration and 100% mortality. The findings of other studies demonstrate that the BI/NAP1 strain hyperproduces toxins A and B in vitro, and those of additional studies, as well as of work in our laboratory, indicate that VPI 10463, which was used in the majority of previous studies involving CDI in germ-free mice, produces even greater levels of toxin A in vitro compared with UVA13 [ 2].

Previous studies of the host cytokine response to toxins A and B have been limited to data from cell culture and small intestinal loops directly exposed to purified toxins A or B, and those studies have shown a predominant inflammatory response to toxin exposure. Binding of the toxins to their respective receptor leads to induction of mitogen-activated protein kinase, translocation of nuclear factor κB into the nucleus, inhibition of the Rho family of proteins, and activation of submucosal neurons, all of which have the effect of activation of pro-inflammatory cytokines, recruitment of neutrophils, epithelial cell apoptosis, and disruption of tight junctions. Not only does toxin exposure lead to the secretion of some pro-inflammatory cytokines, it may also lead to decreased levels of protective cytokines such as transforming growth factor β (TGF-β) [ 7]. We demonstrated increased production of many, but not all, proinflammatory cytokines produced by innate immune cells and epithelial cells, as well as decreased mucosal production of IL-10, another protective cytokine. We did not measure TGF-β concentrations.

The elevations of IL-1β, KC (human interleukin 8 [IL-8] equivalent), and MCP-1 in our study of BI/NAP1 CDI are in agreement with the findings of cell culture and murine intestinal loop studies that show elevations in the same cytokines in response to toxin exposure. Our results are also in agreement with cytokine data in studies of CDI in humans, which show elevated fecal IL-8 levels in patients with clinically severe CDI [ 8]. Similarly, decreased levels of IL-10, which are normally thought to play a role in maintaining the host barrier defense and suppressing inflammation, in our BI/NAP1-infected mice are in agreement with our preliminary data from rabbit intestinal loops showing decreased IL-10 levels after toxin A exposure (C.A.W., oral communication, April 2010). These similarities of cytotoxic profiles further validate the clinical relevance of our model.

Interestingly, there was no difference in the pro-inflammatory cytokine TNF-α, which has previously been shown to be increased in toxin A enteritis [ 9]. In addition, the significantly lower levels of IFN-γ in our severely infected mice are in contrast to those found in studies of small intestinal loops exposed to purified toxin A by Ishida and colleagues [ 9], who hypothesized that IFN-γ is the crucial mediator of toxin-induced enteritis after noting attenuated disease in IFN-γ knockout mice. The interrelationship among cytokines likely explains the low levels of TNF-α, as IFN-γ is partially responsible for TNF-α expression in murine intestinal loops exposed to toxin A [ 9]. Additionally, IL-12, which was significantly lower in our BI/ NAP1-infected mice, has been shown to induce IFN-γ expression in macrophages, T cells, and intestinal loops and therefore may be partially responsible for the low levels of IFN-γ found [ 9–11].

The differences in cytokine expression between our model of CDI and studies involving pure toxin exposure of cell culture and intestinal loops may in part be due to a lack of direct host-pathogen interaction in the latter models. Toxin A-negative, toxin B-positive C. schwierig strains lead to severe human CDI despite the limited pathogenesis observed when purified toxin B is inoculated into murine, hamster, and rabbit small intestinal loops [ 5]. On the other hand, purified toxin A within murine, hamster, and rabbit small intestinal loops leads to severe disease. Further lending credence to the importance of the pathogen-host interaction is a recent study indicating that toxin B is responsible for pathogenesis as opposed to toxin A. In this study, Lyras and colleagues [ 12] found that hamsters exposed to a toxin A-positive, toxin B-negative C. schwierig showed no evidence of disease, whereas disease was observed in hamsters exposed to a toxin A-negative, toxin B-positive variant. Zusätzlich, C. schwierig surface layer proteins lead to pro-inflammatory IL-1β and IL-6 secretion, which highlights the importance of host-pathogen recognition and signaling and the interaction of the toxin and the C. schwierig -derived components [ 13].

While we were performing our germ-free studies, Chen and colleagues [ 14] discovered a murine model of CDI using conventional C57BL/6 mice, which leads to ulcerative cecitis, colitis, and a moribund state after exposure to 6 antibiotics and VPI 10463, whereas a BI/NAP1 strain given in a similar manner leads to symptomatic disease and cecal and colon pathogenesis, but no mortality. Histological analysis of the cecum and colon of BI/NAP1-infected mice in the study by Chen and colleagues [ 14] demonstrated subcutaneous edema and neutrophilic infiltration but little epithelial disruption, whereas mice given VPI 10463 showed destruction of the host architecture in addition to edema and neutrophil margination, indicating that epithelial disruption is necessary to induce mortality, which is similar to the results found for gnotobiotic mice [ 4, 1 4]. Why the BI/ NAP1 strain was able to induce epithelial destruction and death in our monoassociated mice, as opposed to in the conventional mice in the study by Chen and colleagues [ 14], is unknown, but possibilities include the greater number of organisms used to colonize our mice (1 X 10 8 vs 1 X 10 5 colony-forming units), age-related differences in the host immune response, less developed mucosal responses in germ-free mice, or an influence by the retained host microbiota after antibiotics [ 15]. While microbiota analysis was not performed on fecal pellets before or after exposure to antibiotics, one can hypothesize that exposure to 6 different antibiotics led to decreased normal bacterial concentrations and altered composition, although antibiotics do not induce a sterile state.

We have thus shown that BI/NAP1 CDI in an aged germ-free C57BL/6 mouse leads to symptomatic disease, a moribund state, and profound histopathology in the cecum and colon. Additionally, as a result of CDI, certain cecal and colonic cytokines are produced, which had not previously been documented. Differences in cytokine production between in vivo infection and small intestinal loop studies or in vitro toxin studies highlight the importance of the host-pathogen relationship in CDI. Use of this model in concurrence with other newly established conventional C57BL/6 mouse models will lead to a greater understanding of the host-pathogen interaction and the role of the host microbiota in CDI.


Schlussfolgerungen

This review shows that dysbiosis is a complicated disorder in the intestinal microbiota, i.e., strongly believed to play a role in the pathogenesis of IBD and other disorders like CRC and allergic disorders however, future work must be done to confirm this hypothesis. Future researchers must also be aware of the various factors, such as genetics, diet, and environmental factors, which impact the formation of gut dysbiosis. Based on this knowledge, along with the continuing work of identifying the gut microbiota present in humans, future researchers should be able to come closer in successfully intervening against dysbiosis and its associated diseases.


Ergebnisse

Caco-2 cell infection with C. schwierig

Initial experiments were performed to investigate the viability of Caco-2 cells at 30, 60, and 120 min p.i. MTT assays showed that cell viability was drastically reduced in a time-dependent fashion following infection ( Fig. 1A ). Morphological changes of cells were also examined. Cell disruption and aggregation was observed at 30 min p.i. and became increasingly evident at 60 and 120 min p.i. ( Fig. 1B ).

Infection of Caco-2 cells with C. schwierig. (A) Quantification of Caco-2 cell viability at different times post-infection. All assays were conducted in triplicate and repeated independently three times. Cell viability is as expressed as the percentage of survival of the control wells. Results are expressed as means ± 1 standard deviation for the replicate experiments, and the Student T test was used for statistical analysis of the data. Significant difference from the control (p < 0.05) is indicated by an asterisk. Caco-2 cells under anaerobic conditions at different time points without the infection were also evaluated but they were not significantly different from the control cells. (B) Photomicrographs of infected Caco-2 cells with C. schwierig at 30, 60 and 120 min post-infection.

Transcriptome of Caco-2 and C. schwierig during infection

The global gene expression profiles of Caco-2 cells and C. schwierig at 30, 60, and 120 min p.i. were compared with those of uninfected cells. A total of 271 genes in Caco-2 cells and 207 genes in C. schwierig were significantly DE in at least one time point during the infection. The numbers of up- and down-regulated genes in Caco-2 cells and C. schwierig at each time point are shown in Fig. 2A . We also performed hierarchical clustering of DE genes at each time point ( Fig. 2B and 2C ). The clustered data demonstrate a clear pattern of transcriptional regulation during the infection.

Transcriptional dialogue between Caco-2 cells and C. schwierig während der Infektion. (A) The number of up- or down-regulated genes after 30, 60, and 120 min p.i., as compared to the expression levels at the time of infection. (B, C) Hierarchical clustering analysis of differentially expressed genes in Caco-2 cells and C. schwierig während der Infektion. Genes identified to be significantly differentially expressed at 30, 60 or 120 min in Caco-2 or C. schwierig cells p.i. relative to in vitro growth. Genes significantly different with p-value < 0.05 after the infection were pooled and used to create heatmaps for (B) Caco-2 cells, and (C) C. schwierig. Genes are ordered in rows, conditions as columns. Red color indicates genes induced post-infection vs. prior to infection (fold change) green color denotes repression.

Functional classes of DE genes and their network interaction

To further characterize the DE genes in Caco-2 cells and C. schwierig according to their functional groups, an enrichment analysis based on the biological process categories of the GO database was performed ( Fig. 3 ). For Caco-2 cells, �.9% of the DE transcripts were annotated as being involved in metabolic processes including metabolism of nucleic acids (17.3%), proteins (16.7%), lipids (3%). A significant number of transcripts were assigned known functions in cell organization and biosynthesis (13.9%), transport (11.4%), cell communication (10.5%), signal transduction (9.9%), and transcription (9.3%). Genes associated with cell differentiation (5.7%), cell cycle (4.2%), response to stress (3.2%), cell death (3.0%), and cytoskeleton organization and biogenesis (2.3%) were also differentially expressed during the infection. Similarly, DE genes with metabolic functions in C. schwierig were found to be most prevalent (68.0%). Genes involved in transport (18.9%), transcription (17.2%), biosynthesis (16.0%), cell communication (10.2%), signal transduction (10.2%), cell organization and biogenesis (4.1%), and protein modification (2.9%) were also abundant.

Functional annotation of genes in Caco-2 cells and C. schwierig, which are differentially expressed between infected and uninfected conditions. All differentially expressed genes were annotated using generic GO-slim for biological process.

To understand the biological interaction between the DE genes, we constructed functional networks using String v.8.1. Network analysis of the DE genes in Caco-2 cells facilitated the identification of genes involved in signal transduction including Rho and Wnt pathways, cytoskeleton, cell cycle, immune response, and cell death. Zum C. schwierig, the results revealed a complex network of ribosomal proteins, as well as genes associated with cell envelope biosynthesis, purine biosynthesis, regulatory proteins, two component systems, and phosphotransferase systems.

Validation of microarray data using qRT-PCR

To confirm the microarray results and the involvement of key biological pathways, two sets of 11 DE genes as well as one house-keeping gene each from Caco-2 cells and C. schwierig were selected for qRT-PCR (See Supplementary Table S1). Although the differences in gene expression appeared to be underestimated in the microarray results, overall the expression ratios obtained by microarray and qRT-PCR analyses were consistent, with a correlation coefficient (R 2 ) of 0.869 ( Fig. 4 ).

Validation of microarray data by qRT-PCR. Gene expression changes in infected versus uninfected cells measured by microarray analysis or qRT-PCR are compared. Data are plotted as log2 ratios of microarray data (x-axis) compared to those of qRT-PCR (y-axis).


DISKUSSION

We previously demonstrated that coprisin analogue has antibacterial activity against various pathogenic bacterial species (13). Here, we assessed whether this peptide had antibiotic activity against C. schwierig, the primary etiologic agent of antibiotic-associated pseudomembranous colitis and severe diarrhea in humans and animals (4, 16�, 22). Our results revealed that coprisin analogue treatment significantly inhibited the growth rate of C. schwierig ( Fig. 1 ) but did not alter the growth rates of Lactobazillen und Bifidobakterium ( Fig. 2 ). Given that normal microbiota (46), along with probiotics, have inhibitory activities against pathogenic bacteria (3) and that effective antibiotics should have specific antimicrobial activity against pathogenic but not nonpathogenic microbes, coprisin analogue may be a good candidate for use as a potential therapeutic reagent for C. schwierig-associated acute colitis.

Although antibiotic-associated diarrhea has been linked to numerous antibiotics, including the beta-lactam antibiotics (26), clindamycin, which is usually used to treat anaerobic bacterial infections, is considered to be a primary cause of C. schwierig-associated diarrhea and pseudomembranous colitis (16, 17). Here, we found that clindamycin treatment markedly inhibited the growth of the tested Lactobazillen Spezies (L. casei und L. delbrueckii Untersp. lactis), as well as Bifidobakterium und C. schwierig. This nonselective antibiotic activity against normal microbiota, which can inhibit the growth of pathogenic bacteria, may facilitate C. schwierig colonization and subsequent damage. Compared to vancomycin, which has antimicrobial activity against Bifidobakterium aber nicht Lactobazillen species ( Fig. 2 ), coprisin analogue is more selective and does not appear to have antibiotic activity against the tested normal gut microorganisms.

The amino acid sequence of coprisin is very similar to that of the �-amino-acid defensin and defensin-like peptides, which confer antibacterial activity by disrupting the membrane or suppressing cell cycle signaling (48). In the current study, we found that coprisin analogue treatment damaged the plasma membrane of C. schwierig but not that of Bifidobakterium sp. ( Fig. 3C and D). Since both of those bacterial species are Gram positive and since they have biologically similar membranes (3), future work would be necessary to determine the basis for the selective antimicrobial activity of coprisin analogue. For example, a specific receptor for coprisin analogue may exist on the plasma membrane of C. schwierig, or negatively charged components of the lipid membrane, such as teichoic acids (30) and peptidoglycan (30), may play a role in the interaction with coprisin analogue. Alternatively, the selectivity of coprisin analogue may arise as a result of the presence of three positively charged amino acids (NH2-RKK-COOH) at the C terminus of the peptide. The defensin family peptides can interact with a wide variety of membrane components, including lipopolysaccharides (41), cardiolipin (11), and sphingolipids (44) beyond those interactions, structural features of the peptides further determine their specificity for binding to the surface of a given microorganism (e.g., via disulfide cross-linking through a cysteine) (7). Since coprisin analogue contains a cysteine in the middle position, potentially allowing it to dimerize, the peptide structure itself may affect its microbial binding capacity or selectivity.

In a mouse model of acute gut inflammation following C. schwierig infection, the presence of coprisin analogue markedly ameliorated inflammatory responses and weight loss and improved survival rates. The sharp decreases in body weight on days 2 and 3 following C. schwierig infection were only partially reversed by coprisin analogue treatment it was not until day 4 that coprisin analogue-treated mice returned to control-level body weights. However, coprisin analogue did not prevent inflammation resulting from injection of purified toxin A into the ileal lumen (data not shown), suggesting that the apparent anti-inflammatory activity of coprisin analogue is associated with its antimicrobial activity rather than with inhibition of the activity of the toxins.

In summary, we report that coprisin analogue, a disulfide dimer and insect-derived peptide, has selective antibiotic activity against C. schwierig aber nicht Lactobazillen und Bifidobakterium, members of the normal bowel flora. Furthermore, coprisin treatment has a strong beneficial effect on C. schwierig infection-induced mouse gut inflammation. These novel findings suggest that coprisin could be a useful candidate for therapeutic use against C. schwierig-associated diarrhea and pseudomembranous colitis.



Bemerkungen:

  1. Samumi

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    Lesen Sie bitte

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    Der autoritäre Standpunkt

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  6. Karg

    and this has the analog?

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    Ich entschuldige mich, aber ich denke, Sie liegen falsch. Geben Sie ein, wir werden diskutieren. Schreiben Sie mir in PM.



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