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ATP zu Zerlegung des Nukleotidverhältnisses

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DNA-Helicase, das Enzym, das für das Zerreißen der Stränge vor der DNA-Replikation verantwortlich ist, benötigt ATP, um Nukleotide zu zerreißen. Ich habe diese Frage mehreren Professoren gestellt und sie konnten mir keine klare Antwort geben. Meine Frage: Was ist das ATP:Nukleotid-Bindungsbruchverhältnis? Mit anderen Worten, wie viele Nukleotidbindungen können von einem einzelnen ATP durch Helikase gebrochen werden.


Die Antwort darauf ist vielleicht nicht so einfach, wie Sie vielleicht denken, auch weil es im menschlichen Körper viele verschiedene Helikasen gibt. Es gibt auch eine gewisse passive Aktivität einer Helikase, die kein ATP benötigt.

Es ist nicht genau klar, ob ATP nur an der Translokation der Helikase oder der eigentlichen Entwindung beteiligt ist.

Für eine RecQ-Helikase in E coli, fand eine Studie, dass "die bestimmte enge mechanochemische Kopplung von 1,1 ± 0,2 ATP, die pro gereistem Nukleotid verbraucht wird, auf einen Mechanismus vom Typ eines Inchwurms hinweist." Für weitere Informationen siehe Sarlós et al. (2012).

Eine andere Studie (Donmez und Patel, 2008) stellt fest, dass "im Vergleich zu nicht-ringförmigen Helikasen wie PcrA (Dillingham et al, 2000) und UvrD (Tomko et al, 2007), die sich durchschnittlich 1 nt pro ATP . bewegen, hydrolysiert, ist die ringförmige T7-Helikase dreimal kraftstoffsparender." Dies zeigt, wie viel Abwechslung möglich ist.

Fazit - Sie können die Anzahl der Nukleotide, die von einer Helikase pro ATP abgewickelt werden, an Ihren Fingern abzählen.


Adeninnukleotid-Translokator

Adeninnukleotid-Translokator (AMEISE), auch bekannt als ADP/ATP-Translocase (AMEISE), ADP/ATP-Trägerprotein (AAC) oder mitochondrialer ADP/ATP-Träger, tauscht freies ATP gegen freies ADP über die innere mitochondriale Membran aus. [1] [2] ANT ist das am häufigsten vorkommende Protein in der inneren mitochondrialen Membran und gehört zur Familie der mitochondrialen Träger. [3]

Freies ADP wird aus dem Zytoplasma in die mitochondriale Matrix transportiert, während durch oxidative Phosphorylierung produziertes ATP von der mitochondrialen Matrix in das Zytoplasma transportiert wird und so die Zellen mit ihrer Hauptenergiewährung versorgt. [4] ADP/ATP-Translokasen sind exklusiv für Eukaryoten und sollen sich während der Eukaryontenentwicklung entwickelt haben. [5] Menschliche Zellen exprimieren vier ADP/ATP-Translokasen: SLC25A4, SLC25A5, SLC25A6 und SLC25A31, die mehr als 10 % des Proteins in der inneren Mitochondrienmembran ausmachen. [6] Diese Proteine ​​werden in die mitochondriale Träger-Superfamilie eingeordnet.


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Wissenschaft

Band 331, Ausgabe 6014
14. Januar 2011

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Von Michael J. Rust, Susan S. Golden, Erin K. O’Shea

Wissenschaft 14. Januar 2011: 220-223

Cyanobakterielle zirkadiane Uhrenkomponenten sind durch Interaktionen mit Adeninnukleotiden direkt an den Stoffwechselstatus der Zelle gekoppelt.


Nukleotid-Beispiele

Adenin

Adenin ist ein Purin, das eine von zwei Familien stickstoffhaltiger Basen ist. Purine haben eine Doppelringstruktur. In der DNA bindet Adenin an Thymin. In der RNA bindet Adenin an Uracil. Adenosintriphosphat verwendet, wie zuvor diskutiert, das Nukleotid Adenin als Base. Von dort können drei Phosphatgruppen angehängt werden. Dadurch kann viel Energie in den Bindungen gespeichert werden. Aus dem gleichen Grund, warum das Zucker-Phosphat-Rückgrat so stark ist, sind es auch die Bindungen in ATP. In Kombination mit speziellen Enzymen, die sich zur Freisetzung der Energie gebildet haben, kann diese auf andere Reaktionen und Moleküle übertragen werden.

Guanin

Guanin ist wie Adenin ein Purinnukleotid mit einem Doppelring. Es bindet an Cytosin sowohl in DNA als auch in RNA. Wie im Bild oben zu sehen ist, bindet Guanin über drei Wasserstoffbrücken an Cytosin. Dadurch ist die Cytosin-Guanin-Bindung etwas stärker als die Thymin-Adenin-Bindung, die nur zwei Wasserstoffbrücken bildet.

Cytosin

Pyrimidine sind die andere Klasse von Nukleotiden. Cytosin ist ein Pyrimidinnukleotid, das nur einen Ring in seiner Struktur hat. Cytosin bindet sowohl in DNA als auch in RNA an Guanin. Durch Bindung mit dem Nukleotid Guanin bilden die beiden ein starkes Paar.

Thymin

Thymin ist wie das Nukleotid Cytosin ein Pyrimidinnukleotid und hat einen Ring. Es bindet an Adenin in der DNA. Thymin kommt in RNA nicht vor. In der DNA bildet es nur zwei Wasserstoffbrücken mit Adenin, was sie zum schwächeren Paar macht.

Uracil

Uracil ist auch ein Pyrimidin. Während der Transkription von DNA zu RNA wird Uracil überall dort platziert, wo ein Thymin normalerweise hinkommt. Der Grund dafür ist nicht vollständig geklärt, obwohl Uracil einige deutliche Vor- und Nachteile hat. Die meisten Lebewesen verwenden Uracil nicht innerhalb der DNA, da es kurzlebig ist und zu Cytosin abgebaut werden kann. In RNA ist Uracil jedoch das bevorzugte Nukleotid, da RNA ebenfalls ein kurzlebiges Molekül ist.


Meiose beinhaltet auch DSBs

Die Rekombination zwischen homologen Chromosomen in der Meiose I beinhaltet auch die Bildung von DSBs und deren Reparatur. Es ist daher nicht verwunderlich, dass bei diesem Verfahren die gleichen Enzyme verwendet werden.

Meiose I mit dem Alignment homologer Sequenzen bietet einen Mechanismus zur Reparatur beschädigter DNA, dh Mutationen. Tatsächlich sind viele Biologen der Meinung, dass die Hauptfunktion des Geschlechts darin besteht, diesen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms bereitzustellen.

Die meisten Gene auf dem menschlichen Y-Chromosom haben jedoch kein Gegenstück auf dem X-Chromosom und können daher nicht von diesem Reparaturmechanismus profitieren. Sie scheinen dieses Problem zu lösen, indem sie mehrere Kopien desselben Gens haben und in entgegengesetzte Richtungen orientiert sind. Das Schleifen der dazwischenliegenden DNA bringt die Duplikate zusammen und ermöglicht eine Reparatur durch homologe Rekombination.


Polymerisation und Depolymerisation von Aktin mit Nukleotidzuständen an Filamentenden

Die Polymerisation induziert die Hydrolyse von an Aktin gebundenem ATP, gefolgt von der Freisetzung von γ-Phosphat, was den Abbau von Aktinfilamenten in ADP-G-Aktin vorantreibt. Das mechanische Verständnis dieses Zusammenhangs zwischen Aktin-Assembly und ATP-Hydrolyse ist seit vielen Jahrzehnten Gegenstand intensiver Studien in der Biochemie und Strukturbiologie. Obwohl die Aktinpolymerisation und -depolymerisation nur an den mit Widerhaken versehenen oder spitzen Enden stattfindet und sich die kinetischen und Gleichgewichtseigenschaften wesentlich voneinander unterscheiden, ist die Charakterisierung ihrer Eigenschaften durch Massenassays schwierig, da diese Assays den Durchschnitt aller Aktinfilamente in Lösung angeben und sind daher nicht in der Lage, die Eigenschaften einzelner Aktinfilamente zu erkennen. Biochemische Studien der Aktinpolymerisation und -hydrolyse wurden durch diese inhärenten Eigenschaften von Aktinfilamenten behindert. Die Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie überwand dieses Problem durch die Beobachtung einzelner Aktinfilamente. Mit TIRF wissen wir jetzt nicht nur, dass jedes Ende unterschiedliche Eigenschaften hat, sondern auch, dass die Geschwindigkeit der -Phosphat-Freisetzung von den Enden viel schneller ist als aus dem Inneren der Aktinfilamente. Die Freisetzungsrate von γ-Phosphat aus den Aktinfilamentenden wird noch beschleunigt, wenn Latrunculin A gebunden wird. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Auflösung struktureller Unterschiede zwischen Aktinmolekülen im Inneren des Filaments und denen an beiden Filamentenden. Dieser Aufsatz bietet eine Geschichte der Beobachtung von Aktinfilamenten unter Lichtmikroskopie, einen Überblick über die dynamischen Eigenschaften der ATP-Hydrolyse am Ende des Aktinfilaments und strukturelle Ansichten der -Phosphat-Freisetzung.

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Einführung

Das Membranenzym FÖF1-ATP-Synthase ist die allgegenwärtige Proteinmaschine, die den größten Teil der zellulären „Energiewährung“ Adenosintriphosphat ATP produziert. Das Enzym arbeitet in der Plasmamembran von Bakterien, in der Thylakoidmembran von Chloroplasten und in der inneren Membran von Mitochondrien. Es wird durch eine protonenmotorische Kraft (1) angetrieben, die eine Protonen- (oder Na + in einigen Organismen) Konzentrationsdifferenz plus ein elektrisches Potenzial über die Membran umfasst, um die Umwandlung von ADP und P . zu erreichenich in ATP.

Anfang der 1980er Jahre stellte sich Paul Boyer eine motorähnliche Rotation der Untereinheiten vor, um die verschiedenen katalytischen Schritte in jeder der drei katalytischen Nukleotidbindungsstellen des F1 Teil von FÖF1-ATP-Synthase wurden durch einen „Kontroll-Untereinheitskern“ (2, 3) synchronisiert. Es basierte auf der Tatsache, dass die F1 Teil enthält drei katalytisch aktive plus drei nichtkatalytische Bindungsstellen für Nukleotide, d. h. für ATP, ADP oder Pich. Die F1 Teil der Escherichia coli Enzym kann auch ATP zu ADP und P . hydrolysierenich in Gegenwart von Mg 2+ , mit einem 10 5 -fachen Anstieg der Raten von unterstöchiometrischen zu hohen ATP-Konzentrationen (überprüft in (4)). Diese starke positive Kooperativität für die ATP-Hydrolyseraten wurde durch einen „zirkulären Katalyse“-Modus der drei katalytischen Nukleotid-Bindungsstellen erklärt (zusammengefasst in ( 5 ) mit 65 experimentellen Befunden zur Untermauerung der „Bindungsänderungsmechanismen“) vor dem erste hochauflösende, atomare Struktur des mitochondrialen F1 aus Rinderherz wurde 1994 von John Walker und Mitarbeitern berichtet (6).

Diese Röntgenstruktur des mitochondrialen F1 zeigten drei α- und drei β-Untereinheiten, die abwechselnd in einem hexameren Ring angeordnet waren, und die γ-Untereinheit in der Mitte zentriert. Der Nukleotidgehalt in jeder der drei katalytischen Stellen war unterschiedlich, ebenso wie die Konformationen der drei β-Untereinheiten, die hauptsächlich diese Stellen umfassten. Die zentrale γ-Untereinheit zeigte eine asymmetrische Struktur mit großen Kontaktflächen zu allen drei β-Untereinheiten. Es schien, dass die Orientierung von γ eng mit der β-Konformation und dem Inhalt der entsprechenden Nukleotid-Bindungsstelle zusammenhängt. Daher wurde die Struktur als Unterstützung des „Bindungsänderungsmechanismus“ und einer Rotationsbewegung der γ-Untereinheit interpretiert. Anschließend wurde den beiden Wissenschaftlern 1997 der Nobelpreis für Chemie verliehen (sowie Jens Skou für die Identifizierung der Na + /K + -Pumpe).

Sofort wurden spektroskopische Ansätze entwickelt, um die Rotation der γ-Untereinheit während der Katalyse aufzudecken. Thomas Duncan und Richard Cross (7, 8) verwendeten eine reversible biochemische Vernetzung von radioaktiv markierten Untereinheiten von E coli F1 um zu zeigen, dass sich die Orientierung der γ-Untereinheit sowohl während der ATP-Hydrolyse als auch der ATP-Synthese in Bezug auf eine markierte β-Untereinheit ändert. Wolfgang Junge und Mitarbeiter ( 9 ) verwendeten ein Fluorophor, das an die γ-Untereinheit des immobilisierten Chloroplasten F . gebunden war1. Erholung der polarisierten Extinktion nach anisotropem Photobleichen ( 9 ) in Gegenwart von ATP zeigte die durch Hydrolyse induzierte Rotationsneuorientierung der fluoreszenzmarkierten γ-Untereinheit an.

Die Anordnung der Untereinheiten in FÖF1-ATP-Synthase ist von Natur aus asymmetrisch. Das bakterielle Enzym aus E coli enthält nicht nur die rotierenden Untereinheiten von γ und ε als zentrale Verbindung zum Ring der 10 membran-eingebetteten C-Untereinheiten des FÖ Teil, sondern auch eine einzelne periphere Verbindung, die durch die δ-Untereinheit von F . aufgebaut wird1 und das Dimer B2 plus die ein-Untereinheiten von FÖ. Um die Rotation durch Stopped-Flow-Experimente zu überwachen, stellt sich die Frage, wie diese unterschiedlichen Orientierungen der rotierenden Untereinheiten in Bezug auf diese peripheren, nicht rotierenden Teile des Enzyms synchronisiert werden können. Da dies nicht erreichbar ist, werden die Vorteile der Überwachung jeweils eines einzelnen Moleküls offensichtlich. Grundsätzlich möchte man ein einzelnes Enzym über längere Zeit beobachten, damit alle im Katalysezyklus nacheinander auftretenden Konformationen identifiziert und die Übergänge zwischen ihnen charakterisiert werden können.


6 Zusammenfassung, Perspektive und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Entwicklung von ATP-responsiven und ATP-befeuerten selbstorganisierenden Systemen und Materialien aufgrund der biologischen Relevanz von ATP hoch motiviert ist. ATP wird in biologischen Systemen häufig verwendet, um verschiedene Stoffwechselprozesse zu regulieren und aktive Systeme bereitzustellen. Beispiele sind die Verwendung in chemischen Synthesen, die Bedeutung als chemischer Botenstoff, für den Aufbau des dynamischen Zytoskeletts, für den Transport mit molekularen Motoren, die Nervenimpulsausbreitung und die Muskelkontraktion. [ 1-3, 204-208 ] Es weist auch deutlich unterschiedliche Konzentrationen innerhalb und außerhalb des Zytosols auf, und bösartige Gewebe wie Krebs weisen höhere ATP-Spiegel auf, die relevante Türen für das Targeting von Zellen und Krankheiten öffnen.

Alle oben besprochenen Systeme haben gemeinsame Prinzipien zur Integration von ATP: Entweder wird ATP als zusammenbauende Komponente verwendet oder seine chemische Energie (und manchmal Teile seiner Struktur) wird übertragen, um selbstbauende Systeme auszulösen. Es ist absolut klar, dass die Selektivität in Co-Assembly-Systemen ein Schlüsselthema bleibt. Sicherlich gab es auf dem Gebiet der supramolekularen Chemie äußerst ausgefeilte Ansätze zum Design von Rezeptoreinheiten, und auch das DNA/RNA-Aptamer-Gebiet bietet attraktive Einheiten, aber die Selektivität für ATP gegenüber AXPs oder XTPs bleibt begrenzt und wird teilweise nicht für spezifische beschrieben Systeme. Dies erfordert das Design noch aufwendigerer Rezeptoreinheiten aus dem Gebiet der supramolekularen Chemie, und auch die DNA/RNA-Aptamer-Gebiete basieren weitgehend auf relativ alten Sequenzen, die hinsichtlich der Selektivität optimiert werden könnten. Eine der ungelösten Herausforderungen besteht darin, auch in Richtung der Erkennung und Handhabung anderer Arten von Nukleosidtriphosphaten zu denken, damit GTP-responsive und angetriebene Selbstorganisation in Reichweite kommen könnten. Langfristig könnte dies orthogonale in-vivo-Selbstorganisationen liefern, die getrennt auf ATP und GTP reagieren. In diesem Zusammenhang ist es auch wichtig zu erkennen, dass viele der ATP-responsiven Wirkstoffträger in In-vitro-Umgebungen mit Zelllinien funktionieren, was ermutigend ist, aber die nächste Herausforderung wäre, sie in In-vivo-Umgebungen zu übertragen.

Die selektivste „Erkennung“ und Handhabung von ATP in selbstorganisierenden Systemen kann mit Enzymen erreicht werden, die ATP liefern, die ATP für chemische Reaktionen verwenden oder die ATP abbauen. Ein entscheidender Vorteil ist die Tatsache, dass diese Biokatalysatoren eine hervorragende Kontrolle über die Reaktionsgeschwindigkeiten und die Verwendung von ATP in einem System ermöglichen. Es wurden mehrere ziemlich ausgeklügelte Strategien entwickelt, um Enzyme in Tandem- oder antagonistischer Weise arbeiten zu lassen. Allerdings zeigen enzymatische Reaktionen, die ATP verbrauchen, auch eine hohe Selektivität gegenüber den Substraten, was bedeutet, dass dies den möglichen Baublockraum für das Targeting anderer selbstorganisierender Strukturen einschränken könnte. Kritisch ist, dass in vielen Fällen die Langlebigkeit oder auch die Hemmung der Enzyme ein unbekannter Faktor ist und je nach Puffer und Selbstorganisationssystem variieren kann, und Batch-to-Batch- und Herstellervariationen sind unbekannte Faktoren. Sicherlich gibt es keine universelle Lösung für dieses Problem und es bleibt den Forschungsteams überlassen, die Robustheit ihrer Systeme sicherzustellen und idealerweise Daten zu diesem Thema zu diskutieren. Für Anwendungen in in-vivo-Systemen liegt es auf der Hand, dass nicht immer die richtigen Enzyme in angemessenen Konzentrationen für das angestrebte Verhalten vorliegen, daher sind solche Systeme derzeit von höchster Relevanz für die Entwicklung hin zu komplexen chemischen Systemen.

Entsprechend dem Grad ihres autonomen Betriebs und der Systemkomplexität können sie in ATP-getriggerte unidirektionale Selbstanordnungen, Gegentrigger-vermittelte reversible Selbstanordnungen und ATP-befeuerte autonome Systeme, die durch inhärent eingebettete Deaktivierungsprozesse ermöglicht werden, kategorisiert werden. Fast alle reversiblen Prozesse beinhalten bisher den Einsatz von Enzymen zum Abbau von ATP oder zur Abspaltung einiger chemischer Gruppen, die durch die Verwendung von ATP erzeugt wurden. Als Perspektive für das Design autonomer Systeme und um sich möglicherweise den biologischen Aktin- und Mikrotubuli-Systemen anzunähern, müsste man eindeutig eine ATPase-Aktivität implementieren, wie sie in Aktin vorhanden ist, wo die Hydrolyse in und über die Bindungstasche des chemischen Brennstoffs stattfindet .

ATP-betriebene Systeme für das Design autonomer Systeme beziehen sich auf das aufstrebende und sehr aktive Gebiet der Nichtgleichgewichts-Selbstorganisation. [ 42, 81, 84, 88, 200 ] Auch wenn die Ausarbeitung aller Unterschiede der verschiedenen Ansätze nicht der zentrale Teil dieses Aufsatzes ist, ist es wichtig, auf einige wichtige hinzuweisen. Durch Unterscheidung, wie ATP in den zusammengesetzten Strukturen gespeichert und verwendet wird, wurden zwei Haupttypen von ATP-Kraftstoff-getriebenen Selbstanordnungen entwickelt. [ 180, 181 ] Im ersten Fall sind bei der Umwandlung von Brennstoff in Abfall weder die Monomere noch die Aggregate beteiligt, und ATP wird direkt durch ein zugesetztes Enzym hydrolysiert. ATP wird eher als Signal verwendet, um eine aktive Umgebung zu schaffen, deren zeitlicher Abbau genau orchestriert wird. Im zweiten Fall wird der ATP-Verbrauch durch die selbstorganisierenden Moleküle (aktive Strukturen) geleitet, meist über einige kovalente Prozesse, um seine Energie zu übertragen. Beide Ansätze haben Vor- und Nachteile, und viele Herausforderungen müssen noch angegangen werden. Der erste Ansatz ermöglicht einen einfachen Zugang zu programmierbaren Lebensdauern basierend auf ATP-responsiven Co-Assemblies. Da jedoch ATP im Überschuss vorhanden ist und der Abbau von ATP bevorzugt auf Basis des gelösten ATP erfolgt, ist eine aufwendige Strukturdynamik ähnlich der des Zytoskeletts nicht zu erwarten. Der zweite Ansatz beruht häufig auf spezifischeren enzymatischen Systemen, die sorgfältig für die einzelnen molekularen Baugruppen ausgewählt werden müssen. Neben dem Zugang zu programmierbaren Lebensdauern bieten solche Systeme prinzipiell auch einen Zugang zur Strukturdynamik im ATP-getriebenen stationären Zustand, da Energieaufnahme und Energiedissipation gleichzeitig erfolgen und an die Modifikationen der strukturbildenden Einheiten gekoppelt sind. Nichtsdestotrotz müssen diese energetischen Ereignisse auch mit der Kinetik von Strukturübergängen korrelieren, was begrenzte oder perfekt zugeschnittene kinetische Offsets erfordert, um strukturelle Dynamik (wie flussähnlicher Austausch oder Instabilitäten) zu realisieren. Das Verständnis dieser Strukturdynamik erfordert oft eine schwierige experimentelle Überprüfung. In all diesen Fällen richten sich diese autonomen Systemansätze zunehmend auf das Gebiet der Systemchemie. Die Erhöhung der Robustheit der enzymatischen Reaktionsnetzwerke und die Diversifizierung ihres Verhaltens durch Kombinationen von Bausteinen und verstärkten Rückkopplungsschleifen bieten zahlreiche Möglichkeiten für zukünftige Forschungsvorhaben in komplexen Systemen. Dasselbe gilt für kollektive Eigenschaften, die aus koordinierten Interaktionen energiezerstreuender Einheiten hervorgehen, um eine raumzeitliche Organisation hervorzubringen.

Insgesamt sind die aufkommenden ATP-getriggerten und ATP-befeuerten selbstorganisierenden Systeme im Hinblick auf die in der Natur vorkommenden ATP-vermittelten Stoffwechselprozesse noch relativ simpel. Die Entwicklung der ATP-getriebenen Nicht-Gleichgewichts-Selbstorganisation befindet sich in einem noch früheren Stadium im Vergleich zu klassischeren Ansätzen zu ATP-responsiven Systemen. Es ist jedoch offensichtlich, dass beide Klassen – ATP-responsive Systeme und ATP-betriebene Systeme –, die auf präzisionsgefertigten molekularen Systemen basieren, viel versprechend sind, mit biologischen Systemen zu interagieren. Dies kann kurzfristig intelligente ATP-reaktive Wirkstoffträger oder Biomaterialien betreffen oder ATP-dissipierende Implantate vom Typ aktiver Materie, die auf lange Sicht Arbeit schaffen und Funktionen ausführen können, indem sie die vom biologischen System bereitgestellte Energie nutzen. Ein besseres Verständnis von ATP als Energie- und Signalwährung der Biologie und die Umsetzung dieser Prinzipien in synthetische Materialien werden den notwendigen Werkzeugkasten liefern, um langfristig die Kluft zwischen rein lebenden Systemen und rein synthetischen Materialien zu überwinden und lebensechte Materialsysteme zu erreichen, die in der Lage sind, kommunizieren, reagieren und interagieren mit biologischen Systemen basierend auf biologischen Brennstoffen und Signalen.


EINLEITUNG

Viele endosomale Ladungen, die für das Lysosom bestimmt sind, werden während der Bildung von multivesikulären Körpern (MVBs) einer zusätzlichen Sortierung unterzogen (Slagsvold et al., 2006 Piper und Luzio, 2007 Raiborg und Stenmark, 2009). Defekte in der MVB-Sortierung stabilisieren Ladungen, die normalerweise über diesen Weg abgebaut werden sollen, und können zu einer verlängerten Signalübertragung aktivierter Wachstumsfaktorrezeptoren führen, die nicht in den MVB gelangen (Gruenberg und Stenmark, 2004 Slagsvold et al., 2006 Tanaka et al., 2008 Stuffers et al., 2009). Die MVB-Sortierung ist in allen Eukaryoten konserviert, ebenso wie die zelluläre Maschinerie, die für diese Reaktion verantwortlich ist: die für den Transport erforderlichen endosomalen Sortierkomplexe (ESCRTs) und assoziierte Proteine ​​(Piper und Katzmann, 2007, Hurley, 2008, Übersicht in Davies et al., 2009 Raiborg und Stenmark, 2009). ESCRT-0, -I, -II und -III und assoziierte Proteine ​​führen eine Ladungsselektion und Membrandeformation während der MVB-Sortierung durch. Die ESCRT-Maschinerie trägt auch zu topologisch ähnlichen Membrandeformationsereignissen bei, einschließlich Knospung umhüllter Viren und Membranabszision während der Zytokinese (Morita und Sundquist, 2004 Carlton und Martin-Serrano, 2007 Morita et al., 2007 Carlton et al., 2008 Lee et al., 2008). Somit beeinflusst die ESCRT-vermittelte Membrandeformation die Zellphysiologie auf mehreren Ebenen.

ESCRT-III ist unter den ESCRTs insofern einzigartig, als seine Membranrekrutierung und -montage zusammenfallen (Katzmann et al., 2001 Babst et al., 2002a Babst et al., 2002b Bilodeau et al., 2003). Yeast ESCRT-III besteht aus vier für die MVB-Sortierung wesentlichen Kern-Untereinheiten (Vps20, Snf7, Vps24 und Vps2) und drei zusätzlichen Untereinheiten (Did2, Ist1 und Vps60), die redundant funktionieren (Babst et al., 2002a Dimaano et al., 2008 Rue et al., 2008 Bajorek et al., 2009b Xiao et al., 2009). Obwohl ESCRT-III-Untereinheiten eine konservierte Kerntertiärstruktur aufweisen (Muziol et al., 2006 Bajorek et al., 2009b Xiao et al., 2009), weisen sie Divergenz an ihren Carboxyltermini auf und scheinen einzigartige Funktionen zur ESCRT-III beizutragen.

Genetische und biochemische Beweise unterstützen eine zeitliche Rekrutierung und den Zusammenbau von ESCRT-III-Untereinheiten zu einem Polymer, von dem angenommen wird, dass es eine Fibrillenform annimmt (Babst et al., 2002a Ghazi-Tabatabai et al., 2008 Hanson et al., 2008 Lata et al., 2008 Teis et al., 2008 Saksena et al., 2009). Die In-vitro-Zugabe von Kern-ESCRT-III-Untereinheiten zu riesigen unilamellaren Vesikel zeigte, dass ESCRT-III die ILV-Bildung antreiben kann, jedoch erforderte die kontinuierliche ILV-Bildung die Zugabe von Vps4, um eine wiederholte ESCRT-III-Funktion zu ermöglichen (Wollert et al., 2009). In-vivo-Studien haben eine Rolle von Vps4 bei der Vermittlung der ESCRT-III-Zerlegung impliziert, aber die genaue Rolle von Vps4 und ESCRT-III während der ILV-Bildung wird nicht verstanden (Davies et al., 2009 Hanson et al., 2009). Vps4 ist eine Typ-1-AAA-ATPase, die eine aminoterminale Microtubule Interacting and Trafficking (MIT)-Domäne enthält, die an ESCRT-III (Babst et al., 1997 Scott et al., 2005a Scott et al., 2005b Obita et al., 2007 Stuchell-Brereton et al., 2007 Kieffer et al., 2008). Es wurde vermutet, dass der ATPase-Zyklus von Vps4 durch die Interaktion mit membranassoziierten ESCRT-III-Polymeren beeinflusst wird: ESCRT-III-Bindung erleichtert die Oligomerisierung von Vps4 Oligomerisierung stimuliert die ATP-Hydrolyse von Vps4 und es wurde vorgeschlagen, dass die ATP-Hydrolyse sowohl zur Vps4-Oligomerdissoziation als auch zu ESCRT- III-Zerlegung, Freisetzung von ESCRT-III-Untereinheiten in das Zytoplasma (Babst et al., 1997 Babst et al., 1998 Scott et al., 2005a Landsberg et al., 2009). Ein alternatives Modell hat jedoch vorgeschlagen, dass Vps4 während des ESCRT-III-Abbaus als stabiles Oligomer fungiert, wie durch die Oligomerisations-fördernde Aktivität des Vps4-Cofaktors Vta1 durch Mutation der Vps4-Zentralpore und in Analogie zu anderen AAA-ATPasen vorgeschlagen (Scott et al., 2005a Azmi et al., 2006 Weiß und Lorbeer, 2007 Gonciarz et al., 2008 et al., 2008 Landsberg et al., 2009). Während die Vps4-Zerlegung von ESCRT-III eine entscheidende Rolle bei der MVB-Sortierung spielt, sind der Mechanismus, durch den Vps4 ESCRT-III zerlegt und die Mittel, mit denen die ESCRT-III-Zusammensetzung und die Vps4-vermittelte Zerlegung koordiniert werden, unklar.

Um die Rolle von Vps4 beim Abbau von ESCRT-III zu verstehen, wurde ein in vitro-System zur Charakterisierung von ESCRT-III- und Vps4-Beiträgen entwickelt. Dieses System rekapitulierte Beobachtungen von Experimenten in Hefe und validierte seine Verwendung zur Untersuchung der Vps4-Zerlegung von ESCRT-III. Unsere Analysen zeigten, dass innerhalb des Vps4-Oligomers keine konzertierte Hydrolyse erforderlich ist und dass nicht alle Untereinheiten gleichzeitig über MIT-Domänen an ESCRT-III angreifen müssen. Der Einbau von Vps4-Untereinheiten voller Länge, die nicht in der Lage sind, ATP zu hydrolysieren (Vps4 E233Q), unterbrach jedoch die Vps4-vermittelte ESCRT-III-Zerlegung und deckte die Koordination zwischen der ESCRT-III-Bindung über die MIT-Domäne und der ATP-Hydrolyse auf Untereinheitsebene innerhalb des Vps4-Oligomers auf. Diese Ergebnisse legen ferner nahe, dass Vps4 als stabiles Oligomer wirken kann, das auf einzelne ESCRT-III-Untereinheiten einwirkt, um den ESCRT-III-Polymerabbau auf prozessive Weise zu erleichtern.


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