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Frage zur Gesamtproteinnormalisierung in der Western-Blot-Bildanalyse

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Ich analysiere Western-Blot-Daten und verwende die Gesamtproteinnormalisierung mit Ponceau S. Mein Vorgesetzter und ich haben vereinbart, für meine Westernblots die Gesamtproteinnormalisierung anstelle von Haushaltsproteinen wie Beta-Aktin und GAPDH zu verwenden, da Studien haben gezeigt, dass sich der Gehalt an Haushaltsproteinen zwischen den Versuchsgruppen und während verschiedener Entwicklungsphasen unterscheidet. Ich habe auch Literatur gelesen, in der einzelne Proteinladungskontrollen mit Gesamtproteinfärbungen verglichen wurden, und es wurde festgestellt, dass die Gesamtproteinfärbungen zu einer reproduzierbareren und genaueren Quantifizierung führen.

Bei der Quantifizierung der Ponceau S-Färbung habe ich in mehreren Veröffentlichungen gesehen, dass sie die gesamte Spur umreißen und ihre integrierte Dichte messen. Ich habe jedoch zwei Western Blots, also analysiere ich zwei Ponceau-gefärbte Membranbilder. Auf einem Bild meiner Ponceau-gefärbten Membran sind Blasen zu sehen, die Teile der Oberseite und der Seiten einiger der Bahnen verdecken. Daher kann ich bei der Quantifizierung nicht die gesamte Spur umreißen. Mein Vorgesetzter hat mir geraten, stattdessen eine Bande auf der Spur zu skizzieren, die der Position meines interessierenden Proteins entspricht, und diese zur Normalisierung zu verwenden. Ich habe auch in einer Veröffentlichung gesehen, dass sie einen kleinen rechteckigen Abschnitt der Bahn umreißen, wenn die Gesamtproteinnormalisierung anstelle der gesamten Bahn durchgeführt wird.

Ich verstehe jedoch nicht, wie das Gesamtprotein in jeder Probe quantifiziert werden kann, wenn man nur einen Teil der Spur umreißt. Wenn Sie nur eine rechteckige Bande auf der Spur umreißen, messen Sie nur einen Teil des Gesamtproteins in der Probe. Als Ergebnis normalisieren Sie nicht gegen das Gesamtprotein in der Probe. Ich habe mich gefragt, ob jemand weiß, was die Gründe dafür sind, einen Teil der Spur zu skizzieren, wenn eine Normalisierung mit Gesamtproteinflecken durchgeführt wird?


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Definition der neuen Normalität in quantitativen Western-Blot-Daten

Wussten Sie, dass Zeitschriften wie das JBC dringend davor warnen, Housekeeping-Proteine ​​zur Normalisierung zu verwenden? Die meisten Zeitschriften verlangen heute strenge Standards für die Darstellung von Western-Blotting-Daten. Während Housekeeping-Proteine ​​(HKP) traditionell seit Jahrzehnten verwendet werden, treten die Probleme bei ihrer Verwendung erst seit kurzem in den Vordergrund. Für die Darstellung von Daten mit HKP ist mehr Validierung erforderlich. Die Normalisierung unter Verwendung von Gesamtproteinen, die in der Probe vorhanden sind, hat signifikant an Bedeutung gewonnen und hat sich als zuverlässige Methode zur Normalisierung von Western-Blots erwiesen. Hier veranschaulichen wir, warum die Methode der Gesamtproteinnormalisierung (TPN) überlegen ist und der Weg für Western Blotting ist.

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Gesamtproteinnormalisierung

Die Gesamtproteinnormalisierung (TPN) ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die Häufigkeit des interessierenden Proteins zu quantifizieren, ohne sich auf Haushaltsgene zu verlassen. Traditionell wird TPN durch Inkubieren der Membran mit einer Gesamtproteinfärbung entweder vor oder nach dem Nachweis mit Antikörpern durchgeführt. Die Häufigkeit des interessierenden Proteins wird auf die Gesamtproteinmenge in jeder Spur normalisiert, wobei Variationen entfernt werden, die mit dem Vergleich der Häufigkeit mit einem einzelnen Protein verbunden sind. TPN ist auch besser mit dem Nachweis von Proteinen mit geringerer Häufigkeit kompatibel.

Die Normalisierung mit Gesamtproteinfärbungen kann komplex und zeitaufwendig sein. Während einige Farbstoffe vor dem Immunnachweis verwendet werden können, sind andere mit dem nachgeschalteten Antikörpernachweis nicht kompatibel. Außerdem verblassen manche Flecken schnell, was die Dokumentation der Ergebnisse erschwert. Eine neuere Technik, die als fleckenfreier Ansatz bezeichnet wird, erhöht die Empfindlichkeit und reduziert die Komplexität bei gleichzeitiger Zeitersparnis.

Gesamtproteinflecken

Gesamtprotein-Färbungen binden an alle Proteine ​​auf einer Western-Blot-Membran und liefern nach dem Transfer ein visuelles Bild. Je nach Art der Färbung können Gesamtprotein-Färbungen entweder vor oder nach der Immundetektion verwendet werden. Einige der häufigsten Flecken werden unten beschrieben.

Prä-Antikörper-Färbungen

Anionische Farbstoffe wie Ponceau S und fluoreszierende Farbstoffe wie Sypro Ruby, Deep Purple und AdvanStain Scarlet sind übliche Farbstoffe, die vor der Antikörperfärbung verwendet werden.

Ponceau S

Ponceau S ist schnell und wirtschaftlich. Proteine ​​färben sich nach nur 5 Minuten Inkubation rot. Der Farbstoff wird nach Sichtbarmachung durch Inkubation in PBS oder Waschpuffer leicht entfernt. Obwohl Ponceau S keinen Einfluss auf die nachgeschaltete Immundetektion hat, nimmt die Intensität der Färbung mit der Zeit schnell ab, was die Aufnahme eines Bildes erschwert. Die roten Streifen können auch schwer zu fotografieren sein.

Fluoreszierende Flecken

Obwohl sie teurer und zeitaufwändiger als Ponceau S sind, handelt es sich bei Fluoreszenzfärbungen um hochempfindliche, permanente Gesamtproteinfärbungen, die auch vor dem Antikörpernachweis verwendet werden können. Mehrere Firmen verkaufen fluoreszierende Farbstoffe, deren Nachweisgrenzen von 1,0 ng bis 8,0 ng reichen. Die Malfarben sind langlebig und photostabil, was lange Belichtungszeiten ermöglicht. Die meisten Flecken können entweder mit UV- oder sichtbarem Licht angeregt werden und erfordern einen fluoreszierenden Imager zum Nachweis. Die Färbung kann auf Fotofilm oder mit einer CCD-Kamera dokumentiert werden. Der Färbevorgang kann je nach Fleck 30 Minuten – 1 Stunde dauern.

Hinweis: Einige Flecken enthalten Schwermetalle, die spezielle Entsorgungsverfahren erfordern.

Post-Antikörper-Färbung

Amidoschwarz

Amidoschwarz ist eine häufig verwendete permanente anionische Post-Antikörper-Färbung. Obwohl es nicht so empfindlich ist wie eine fluoreszierende Färbung, ist es empfindlicher als Ponceau S und erfordert keine spezielle Ausrüstung zur Visualisierung. Es ist auch wirtschaftlicher als fluoreszierende Flecken. Die leuchtend schwarzen Streifen sind leicht zu dokumentieren.

Kolloidales Gold

Kolloidale Goldpartikel können als Gesamtproteinfärbung verwendet werden. Bei Inkubation mit membrangebundenen Proteinen adsorbiert das Gold durch elektrostatische Wechselwirkungen an die Proteine, was zu einer vorübergehenden, rötlich-rosa Farbe führt. Die Sensitivität kann durch Sliver Enhancement erhöht werden, was zu einem stabilen dunkelbraunen Signal und einem Proteinnachweis bis hinunter zu 1 ng führt. Die kolloidale Goldfärbung ist teurer als andere Methoden und kann nicht mit nachgeschalteter Immundetektion verwendet werden.

Fleckenfrei

Der fleckenfreie Gesamtproteinnachweis ist schnell und empfindlich. Die Technologie verwendet eine Trihalogenverbindung, die direkt in das Gel eingearbeitet wird. Bei UV-Exposition modifiziert die Verbindung Tryptophanreste in Proteinen, wodurch sie fluoreszieren. Das Fluoreszenzsignal kann von einer CCD-Kamera erfasst werden. Proteine ​​können im Gel vor dem Transfer und nach dem Transfer auf die Membran sichtbar gemacht werden. Die fleckenfreie Detektion beeinträchtigt nicht die nachgeschaltete Immundetektion. Vorgefertigte Gele fleckenfreie Gele können gekauft werden oder fleckenfreie Gele können im Labor durch Mischen einer Trihalogenverbindung mit Acrylamid hergestellt werden. Die fleckenfreie Technologie kann keine Proteine ​​erkennen, die keine Tryptophane enthalten, und es wird empfohlen, dass ein Protein mindestens 2 Tryptophane enthält, um leicht nachgewiesen zu werden.


Stain-Free-Technologie als Normalisierungswerkzeug in der Western-Blot-Analyse.

Western Blots werden verwendet, um die relativen Mengen von interessierenden Proteinen in komplexen biologischen Proben spezifisch zu messen. Quantitative Messungen können aufgrund von Prozessinkonsistenzen, wie z. B. einem ungleichmäßigen Proteintransfer auf die Membran, Fehlern unterliegen. Diese nicht stichprobenbezogenen Schwankungen müssen durch einen als Normalisierung bekannten Ansatz kompensiert werden. Zwei Ansätze zur Datennormalisierung werden üblicherweise verwendet: Housekeeping Protein (HKP) Normalisierung und Total Protein Normalization (TPN). In dieser Studie haben wir die Leistung der Stain-Free-Technologie als neuartiges TPN-Tool für Western-Blotting-Experimente im Vergleich zur Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als Vertreter der HKP-Normalisierungsstrategie bewertet. Das für diese Studie verwendete Zielprotein (TP) war MCM7, ein DNA-Lizenzierungs-Replikationsfaktor, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er in bestrahlten lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs) um 20 % herunterreguliert wird. Wir untersuchten die Regulation von MCM7 mit einem Multiplex-Western-Blotting-Ansatz basierend auf fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern und fanden heraus, dass die Stain-Free-Technologie im Vergleich zur HKP-Normalisierung mit GAPDH . zuverlässiger, robuster und empfindlicher auf kleine Effekte der Proteinregulation zu sein scheint . Die Stain-Free-Technologie bietet die zusätzlichen Vorteile der Bereitstellung von Kontrollpunkten während des gesamten Western-Blotting-Prozesses, indem sie eine schnelle Visualisierung der Geltrennung und des Proteintransfers ermöglicht.


DISKUSSION

Im Allgemeinen passen die drei wöchentlichen Labormodule gut zusammen und bildeten eine logische Abfolge, um den Schülern zu helfen, die Techniken der Elektrophorese, des Western Blotting, der Immundetektion und des Gewebedrucks zu erlernen und zu verstehen. Während des Prozesses lernten sie auch, qualitative (dh relative Häufigkeit von Rubisco und seine Gewebeverteilung) und quantitative (dh Molekulargewichtsschätzung der großen Untereinheit von Rubisco) aus den Ergebnissen durch Bildanalyse und mathematische Manipulation zu extrahieren und Verbindungen aufzubauen zwischen diesen Ergebnissen und dem, was sie in Pflanzengeweben darstellen. Die Antworten nach dem Labor zeigten, dass 80 % der Studenten über ein verbessertes Verständnis der Labortechniken berichteten (Abbildung 4). Da sich jedes Labormodul auf eine Technik konzentrierte, hatten die Studenten während des Praktikums genügend Zeit, sich mit jedem Protokollsatz vertraut zu machen. Da zwischen den einzelnen Laborsitzungen jeweils eine Woche verstrich, mussten sich die Studierenden wesentliche Hintergrundinformationen und Ziele ihrer Bemühungen im vorherigen Labor ins Gedächtnis rufen, um die Logik der Kontinuität durchgängig zu erkennen. Diese Wiederholung trug dazu bei, die Beibehaltung wichtiger Konzepte zu stärken, die sie bei jedem Schritt gelernt hatten, was durch eine verbesserte Leistung in ihrem Postlab im Vergleich zu Prelab-Umfragen belegt wurde (Tabelle 2).

Schüler hatten oft Schwierigkeiten mit Mathematik bei der Berechnung der Molekülmasse des Rubisco. Sie wurden angewiesen, die gemessenen Wanderungsstrecken der Molekularmassenmarker und die Molekularmassenwerte in die Excel-Tabelle einzutragen, den Abstand gegen den Logarithmus der Molekularmasse der Markerproteine ​​aufzuzeichnen, die Trendlinie in Form einer linearen Gleichung [dh Y (Migrationsstrecke) = k × log (Molekularmasse) + b], erhalte die R 2-Wert, und sehen Sie, wie gut die Gleichung die logarithmisch-lineare Beziehung beschreibt. Anschließend berechneten sie die Molekülmasse der großen Untereinheiten von Rubisco für verschiedene Pflanzenproben, indem sie die Wanderungsstrecke des Rubisco in die Gleichung einsetzten und nach der Molekülmasse auflösten. Der Kampf ereignete sich oft im letzten Schritt der Auflösung der Molekularmasse aus der Gleichung log (Molekülmasse) = bekannter Wert, deren Antwort durch Umrechnen in die Exponentialfunktion erhalten wird (dh Molekularmasse = e potenziert mit der bekannte Wert). Darüber hinaus zeigten die Studierenden vielfältige Kenntnisse in der Datenverarbeitung mit Excel. Viele Schüler waren damit beschäftigt, Daten mit einem Taschenrechner zu verarbeiten, bis sie die Einfachheit und Geschwindigkeit der sich wiederholenden Berechnungen in der Tabellenkalkulation erkannten und lernten, wie man mathematische Funktionen verwendet und Diagramme in Excel erstellt, um experimentelle Daten visuell darzustellen. Dieses 3-wöchige Lab-Modul war das letzte von einigen anderen Labs, in dem die Studenten die Möglichkeit hatten, den Umgang mit Excel zu erlernen. Einundfünfzig Prozent der Schüler gaben an, dass sie sich bei der Verwendung einer Tabellenkalkulation wohler fühlten, während 26 % eine neutrale Antwort gaben und 12 % Schwierigkeiten mit Excel angaben (Abbildung 4). Wir glauben, dass die Unterstützung der Studenten bei der Anwendung von Mathematik zur Analyse biologischer Daten und beim Übergang von der Verwendung eines Taschenrechners zu einer ausgefeilteren Datenverarbeitungssoftware ein zusätzlicher Vorteil für die Lernerfahrung der Studenten ist, ein Aspekt im Biologieunterricht, der von der National empfohlen wurde Forschungsrat (2003).

Das Tissue-Druckmodul bot fast 60 % der Studierenden eine angenehme Laborerfahrung, und 52 % der Studierenden arbeiteten gerne mit Pflanzen (Abbildung 4). Sellerie, das Pflanzenmaterial, das für die Drucke verwendet wird, ist leicht verfügbar und robust im Umgang. Jeder Schüler in einer Gruppe wurde ermutigt, einen Druck zu machen, wobei mehrere Drucke auf jedem Stück Nitrozellulosemembran hergestellt wurden, was die Chance auf einen erfolgreichen Druck erhöhte. Die physikalische Kartierung und Visualisierung der Proteinverteilung in Geweben aus Gewebeabdrücken erwies sich für die Hälfte aller Studierenden als spannend.

Ein potenzielles Problem bei diesen Verfahren war die Ausfallzeit während der längeren Verfahrensschritte. Eine Strategie, die wir zur Nutzung dieser Inkubationszeiten angewendet haben, bestand darin, dass die Schüler ihre im vorherigen Labormodul gesammelten Daten analysieren, interpretieren und diskutieren. Die Schüler wurden auch ermutigt, Literaturrecherchen über den Nährwert und die medizinische Verwendung von Sellerie durchzuführen und die Anatomie von Selleriestielen unter einem Seziergerät zu beobachten und aufzuzeichnen. In einem der drei Laborabschnitte der Dozenten diskutierten und debattierten die Schüler ihre Vorhersage über die Gewebeposition von Rubisco und ob sich junge und reife Blattstiele im Rubisco-Gehalt unterscheiden würden. Sie waren sich im Allgemeinen einig, dass sie Rubisco im grünen Epidermisgewebe sehen würden, waren jedoch überrascht, seine Präsenz auch im inneren Gefäßgewebe zu sehen. Sie waren sich nicht einig über mögliche Unterschiede im Rubisco-Gehalt zwischen jungen und älteren Blattstielen, wobei sie den Unterschied in der Wachstumsrate und die Lage von jungen gegenüber älteren Stielen relativ zueinander innerhalb eines Bündels anführten und ob die Lichtquelle ein beitragender Faktor sein könnte. Obwohl die von ihnen erstellten Gewebeabdrücke nicht alle diese Fragen gleichermaßen gut beantworteten, profitierten sie eindeutig von diesem forschenden Ansatz.

Das Erlernen des Vorlesungsmaterials und das Verständnis von Labortechniken profitierten maßgeblich von den praktischen Aktivitäten im Labor. Neben der deutlich verbesserten Leistung der Postlab-Umfrage zu Fragen, die sich speziell auf die drei hier berichteten Labormodule bezogen (Tabelle 2), schnitten die Studierenden bei zwei weiteren Vorlesungsthemen, die ebenfalls mit Laborübungen verbunden waren, gut ab. Sie zeigten jedoch keine Verbesserung des Wissens über ein anderes photosynthetisches Enzym (dh Phosphoenolpyruvat-Carboxylase), das entweder in der Vorlesung angesprochen oder in die Textleseaufgabe aufgenommen wurde, dem jedoch keine Laboraktivität gewidmet war (Tabelle 2, parallele Vorlesungsthemen ).

Die Entwicklung eines guten Bewertungsfragebogens erfordert viel Sorgfalt und Geschick, um potenzielle Probleme zu vermeiden. Die von uns entwickelten Umfragefragen waren im Multiple-Choice-Format und können als allgemein wirksame und zuverlässige Messung des Lernens insgesamt betrachtet werden erhöhte die Wahrscheinlichkeit, dass die Schüler die richtige Antwort erraten, und riskierte größere Verzerrungen bei der Bewertung der Schüler (Tabelle 2, Fragen 10 und 17). Dennoch ist für eine eingehendere Analyse und einen Einblick in die Antworten der Schüler auf Fragen mit solchen Antworten Abhilfe möglich, indem eine Folgefrage aufgenommen wird, die das Vertrauen der Schüler in ihre Antwort prüft.

Bei der Untersuchung der Fähigkeit der Schüler, die erlernten Techniken anzuwenden, stellten wir fest, dass die Kenntnisse der Schüler darüber, wie die Techniken über das Klassenstudium hinaus angewendet werden könnten, zwar verbessert wurden, dies jedoch ein relativ kleiner Gewinn im Vergleich zum Verständnis der technischen Details und Fakten des Unterrichts war bestimmtes zu untersuchendes Molekül (Tabelle 2, Anwendung vs. andere Kategorien). In Anbetracht der Tatsache, dass die meisten unserer Studenten keine fortgeschritteneren Kenntnisse in Biochemie, organischer Chemie oder beidem hatten, glauben wir, dass ihre Fähigkeit, einen technischen Ansatz über die unmittelbare Erfahrung hinaus anzuwenden oder zu übertragen, verbessert wird, wenn sie mehr Kenntnisse in den physikalischen und chemischen Eigenschaften biologischer Moleküle aus anderen Studiengängen.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Assessment-Umfragen, dass wir die angegebenen Lernziele jedes der Labormodule erreicht haben und wir glauben, dass sie als praktikable und nützliche einführende zellbiologische Laborübung für Studenten zum Erlernen wichtiger Zellen angewendet oder modifiziert werden können biologische Techniken und ihre Anwendungsmöglichkeiten.


Das Design eines quantitativen Western-Blot-Experiments

Western Blotting ist eine seit mehr als drei Jahrzehnten praktizierte Technik, die als Mittel zum Nachweis eines Proteinziels in einer komplexen Probe begann. Obwohl es sowohl bei der Bildgebungs- als auch bei der Reagenzientechnologie erhebliche Fortschritte gegeben hat, um die Empfindlichkeit, den dynamischen Nachweisbereich und die Anwendbarkeit der Multiplex-Zielerkennung zu verbessern, ist die grundlegende Technik im Wesentlichen unverändert geblieben. In der Vergangenheit wurde Western Blot einfach verwendet, um ein bestimmtes Zielprotein in einer komplexen Mischung nachzuweisen, aber jetzt fordern Zeitschriftenredakteure und Gutachter die quantitative Interpretation von Western-Blot-Daten in Bezug auf die Veränderungen der Proteinexpression zwischen den Proben. Die Berechnungen basieren auf der Differentialdensitometrie der zugehörigen Chemilumineszenz- und/oder Fluoreszenzsignale der Blots und dies erfordert nun eine grundlegende Änderung der experimentellen Methodik, Erfassung und Interpretation der Daten. Wir haben kürzlich einen aktualisierten Ansatz zur Erstellung quantitativer densitometrischer Daten aus Western Blots veröffentlicht (Taylor et al., 2013) und fassen hier den kompletten Western Blot Workflow mit Fokus auf Probenvorbereitung und Datenanalyse für quantitatives Western Blot zusammen.

1. Einleitung

Proteomische Technologien wie zweidimensionale Elektrophorese und Massenspektrometrie sind wertvolle Werkzeuge in semiquantitativen Protein-Profiling-Studien, um breite Expressionsmuster zu identifizieren, die ein besseres Verständnis von molekularen Ereignissen, Signalwegen und Mechanismen ermöglichen [1]. Die resultierenden Daten werden typischerweise durch eine zweite, unabhängige Methode wie Western Blotting bestätigt. Western Blotting wurde von Towbin et al. [2] im Jahr 1979 und ist seitdem eine gängige Technik, die in Forschungslabors weltweit für den Immunnachweis und die Quantifizierung spezifischer Proteine ​​in komplexen Zellhomogenaten verwendet wird. In den letzten drei Jahrzehnten haben die Sensitivität, Robustheit und Flexibilität der entsprechenden Indikatorensysteme deutlich zugenommen [3, 4]. Darüber hinaus hat die laufende Entwicklung von Nachweismedien und -reagenzien der wissenschaftlichen Gemeinschaft ultraempfindliche Bildgebungssysteme zur Verfügung gestellt, die einen breiten dynamischen Nachweisbereich ermöglichen, der eine präzise und genaue Quantifizierung von Signalen sowohl von niedrig- als auch von stark exprimierenden Proteinen aus demselben Blot ermöglicht. Obwohl Labore schnell die neuesten Detektionstechnologien und Reagenzien für das Western Blotting gekauft haben, haben sich die zugehörigen Techniken zur Erstellung der densitometrischen Daten nicht weiterentwickelt, was zu veröffentlichten Daten geführt hat, die schwer oder unmöglich zu interpretieren oder zu reproduzieren sind [5–7].

Um quantitative Daten aus Western Blots zu erhalten, muss eine strenge Methodik verwendet werden, wie zuvor beschrieben [8]. Kurz gesagt, die Validierung von Antikörpern (Ab) ist entscheidend, um sowohl sicherzustellen, dass die Ab/Antigen-Interaktion spezifisch und korrekt ist, als auch um den Verdünnungsfaktor der Proben zu bestimmen, der für die Proteinbeladung im quantitativen linearen dynamischen Bereich für jeden Antikörper erforderlich ist. Darüber hinaus muss die geeignete Auswahl der Normalisierungsmethode (basierend auf Referenzsignalen, die entweder von Housekeeping-Proteinen (HKPs) nach immunchemischer Färbung oder Gesamtprotein (TP)-Intensität auf Blotting-Membranen nach Gesamtprotein-Färbung erhalten wurden) in Betracht gezogen werden, um sicherzustellen, dass die berichteten Veränderungen von das Zielprotein ist kein Artefakt des Referenzsignals. Daher ist die Datennormalisierung entscheidend, um experimentelle Fehler zu identifizieren und zu korrigieren, bei denen die Referenzinstabilität mit der Messung kleinerer Unterschiede in der Zielproteinexpression zwischen Proben immer wichtiger wird [9]. Der direkte Effekt einer schlechten Normalisierung ist offensichtlich, wenn die Probenbelastung über 10 . liegt μg Gesamtproteinlysat pro Spur werden benötigt, da herkömmliche Lade-HKPs wie GAPDH, Aktin und Tubulin stark überladen sind und daher nicht dem Zweck der Datennormalisierung dienen [8, 9]. Außerdem können diese HKPs durch die Behandlungsbedingungen des Experiments beeinflusst werden, was zu verzerrten Ergebnissen für die Zielproteinexpression führt, die die Biologie der getesteten Proben nicht widerspiegeln [10–15]. Alternativ wurde kürzlich gezeigt, dass die Normalisierung durch das gesamte, durch Blot übertragene Protein ausgezeichnete Daten für typische Gesamtproteinlysate liefert [16].

Hier beschreiben wir einige allgemeine Techniken zur Herstellung hochwertiger Proteinproben mit minimalem Abbau für eine verbesserte Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten. Ebenfalls zusammengefasst sind die grundlegenden Schritte des quantitativen Western-Blottings und ein standardisierter Ansatz zur Berechnung der zugehörigen densitometrischen Daten aus multiplen Blots.

2. Sorgfältiges experimentelles Design liefert zuverlässige und reproduzierbare Daten

Im Gegensatz zu DNA-basierten Assays, die einen vorhersagbaren Molekültyp messen, der typischerweise unter einer Vielzahl von Bedingungen stabil ist, können Proteine ​​in ihrer Expression, Stabilität, Konformation und Aktivität unter verschiedenen Puffer- und Versuchsbedingungen erheblich variieren. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von kontaminierenden Proteinen in einem Homogenat die Integrität und Aktivität von Zielproteinen stark beeinflussen [17]. Daher muss bei der Gestaltung jedes proteinbasierten Assays darauf geachtet werden, dass die offensichtlichen Unterschiede zwischen Fall- und Kontrollproben kein Artefakt der experimentellen Bedingungen oder der Probenhandhabung sind. Zu den Faktoren, die einen großen Einfluss auf das Proteom haben können, zählen Inkubationszeit und Temperatur sowie die Parameter für die Probenverarbeitung wie die Zeitspanne zwischen der Gewebeentnahme und dem anschließenden Einfrieren oder auch die Bedingungen und der Zeitpunkt des Auftauens von Gewebe oder Zellpellets (Tabelle 1).

VersuchsablaufKontrollgruppenReplikateVersuchsbedingungenProbenbehandlung
Krankheits- oder BehandlungsgruppenZeitstudium (d.h.

3. Probenvorbereitung

Es gibt mehrere Fallstricke im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung, die sich direkt auf die Dichte der Banden auf einem Western Blot auswirken können, darunter: (1) unsachgemäße Handhabung von Gewebe- oder Zellproben, was zu einem variablen Abbau und/oder einer Expression von Proteinen zwischen den Proben führt, (2) unzureichende Detergenzien , Salze und Proteaseinhibitoren im Lysepuffer, (3) schlechte Homogenisierungstechnik.

Da Proteinlysate hochkomplex mit Verunreinigungen wie Zell- oder Gewebetrümmern, Fetten, hydrophoben Proteinaggregaten, Nukleinsäuren und Proteasen sind, die die Ergebnisse von Western Blots direkt und negativ beeinflussen können, ist es wichtig, Zelllysepuffer und Homogenisierungstechniken zu verwenden, die beseitigen ihre Auswirkungen [17]. Im Allgemeinen sind Homogenisierungspuffer, die nichtionische Detergenzien wie NP-40 und Triton X-100 enthalten, weniger scharf als ionische Detergenzien wie SDS und Natriumdesoxycholat. Salze wie NaCl oder KCl werden typischerweise in einer Konzentration von 100 bis 150 mM zugegeben, um eine Proteinaggregation zu verhindern. RIPA-Puffer (1 % NP-40 oder Triton X-100, 1 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM EDTA) und komplette Mini-Protease-Inhibitor-Cocktailtabletten (Roche Applied .) Science) in Kombination mit mechanischen oder manuellen Homogenisierungsinstrumenten wurden verwendet, um Homogenate herzustellen, die solide Daten für Western-Blot-Assays liefern.

Die richtige Wahl der Gewebehomogenisierungstechnik ist eine Voraussetzung für einen erfolgreichen Western-Blot-Assay und die verwendete Methode hängt vollständig vom Probentyp ab (d. h. Gehirn versus Muskel versus Lebergewebe im Gegensatz zu plattierten oder suspendierten Zellen) [18, 19]. Ein gutes Beispiel für ein Gewebelyseprotokoll ist wie folgt: (1) Das Gewebe in flüssigem Stickstoff schockfrieren und dann das Gewebe mit einem Skalpell in einem Mörser auf Trockeneis in 1 mm große Stücke schneiden. Stellen Sie sicher, dass das Skalpell oder das Mahlwerk auch auf Trockeneis gefroren ist, um das geschnittene oder gemahlene Gewebe während des gesamten Vorgangs nahe der Temperatur von Trockeneis zu halten. (2) Fügen Sie das gewürfelte/gemahlene Gewebe zu eiskaltem RIPA-Puffer hinzu. (3) Überführen der Gewebepräparation in einen eiskalten Dounce-Gewebehomogenisator (Wheaton) und Dounce 25x auf Eis. (4) Beschallen (Tekmar Sonic Disrupter) das Dounce-homogenisierte Gewebe auf Eis für

Sekunden bei 50% Leistung und Klären der Extrakte durch Zentrifugation bei 34.000 × g bei 4°C für 30 Minuten. (5) Übertrage den Überstand in ein neues Röhrchen und führe einen Proteinassay durch (siehe unten). (6) Lagern Sie die Überstände bei –80°C oder in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung.

Für die Zelllyse die pelletierten Zellen (bei Zellsuspensionen) in eiskalten RIPA-Puffer geben oder bei plattierten Zellen den eiskalten RIPA-Puffer nach dem Waschen der Zellen direkt auf die Platte geben und die Zellen abkratzen und pipettieren und runter. Fahren Sie mit Schritt (3) oben fort.

Die Gesamtproteinkonzentration des Homogenats aus Zell- oder Gewebelysaten sollte mit einem mit Detergenzien kompatiblen Proteinassay wie dem RC DC Proteinassay von Bio-Rad gemessen werden. Idealerweise werden die Homogenate auf eine Konzentration von mindestens 2 mg/ml verdünnt, was eine Beladung zwischen 10 μg und 80 μg pro Bahn eines 1 mm dicken Mini-Polyacrylamid-SDS-Gels.

4. Bestimmen Sie den linearen dynamischen Bereich der Proteinbeladung

Die meisten Labore laden eine zufällige Proteinmenge in jede Spur eines Gels für Western-Blotting, die typischerweise zwischen 10 . liegt μg und 100 μg Gesamtlysat und es gibt in der Regel keine wissenschaftliche Grundlage für die Wahl dieser Menge. Dies führt oft zu einer Überladung von stark exprimierten Zielproteinen und insbesondere der Ladekontrollen, die zur Normalisierung der Daten verwendet werden. Dies ergibt typischerweise einheitliche Bandendichten zwischen den Spuren für die Housekeeping-Proteine, was nicht auf eine konsistente Proteinbeladung zurückzuführen ist, sondern eher auf eine Überladung der Membran mit dem Zielprotein (Abbildung 1). Um den Effekt der Membransättigung zu mildern, sollte für jedes Zielprotein eine Standardkurve der Proteinbelastung gegen die Bandendichte erstellt werden. Dies kann erreicht werden, indem eine 1/2-Verdünnungsreihe einer gepoolten Probe aus allen Lysaten in der Studiengruppe beginnend bei 100 . hergestellt wird μg Proteinbeladung über mindestens 12 Verdünnungen auf einem TGX-fleckfreien SDS-Gel (Bio-Rad). Die fleckenfreie Detektion mit dem Kamerasystem ChemiDoc MP (Bio-Rad) kann verwendet werden, um die Beladung, Qualität und Trennung des Homogenats zu überprüfen, gefolgt von der Übertragung auf eine schwach fluoreszierende PVDF-Membran unter Verwendung des Trans Blot Turbo (Bio-Rad) Proteins Transfersystem [8].


Zuverlässige Western-Blot-Daten können nur erzeugt werden, wenn die richtige Probenmenge an Protein verwendet wird. Zu viel Protein führt zu einer Signalsättigung in Western Blots, aber zu wenig führt zu schwachen Signalen. Sobald der experimentelle Aufbau und die Bedingungen für den Assay festgelegt sind, ändern Sie die Probenbeladung, Transfermethode, Transferzeit, Antikörperverdünnung, Antikörperinkubationszeit oder Temperatur in nachfolgenden Experimenten nicht, da diese Faktoren die Detektionssignale erheblich verändern können.

Eine typische Methodik zur Bestimmung der geeigneten Beladung für Proteinproben folgt: (1) Transfer und Blot entsprechend durch Inkubieren des primären Zielprotein-Antikörpers und des zugehörigen sekundären zu jedem Blot mit mindestens vier 3-minütigen Waschschritten zwischen jeder Inkubation. (2) Fügen Sie ein mit einem Imager kompatibles Chemilumineszenz-Substrat wie Clarity (Bio-Rad) hinzu, um das immunchemische Signal zu entwickeln, und erfassen Sie das Signal mit einem CCD-Kamera-basierten Imager wie dem ChemiDoc MP (Bio-Rad). (3) Bilden Sie die Blots mit einer Software ab, die genaue, vom Hintergrund subtrahierte densitometrische Werkzeuge wie Image Lab (Bio-Rad) bietet, und erstellen Sie ein Diagramm der relativen Dichte gegen die fache Verdünnung für jeden primären Antikörper. (4) Validieren der Antikörper durch Bestimmung ihres linearen dynamischen Bereichs (d. h. des Bereichs, in dem eine konsistente 1/2-Dichteabnahme erhalten wird). (5) Wählen Sie die Proteinbeladung für jeden Antikörper, die der Mitte des linearen Dynamikbereichs entspricht.

Eine Verdünnung der einzelnen Proben in der Studiengruppe bis zur Mitte des linearen dynamischen Bereichs der gepoolten Probe für jeden Antikörper kann bedeuten, dass die einzelnen Proteinproben für jeden Antikörper stark unterschiedliche Verdünnungen erfordern. Dadurch wird sichergestellt, dass die densitometrischen Daten für jedes Zielprotein innerhalb des linearen dynamischen (quantitativen) Bereichs liegen, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern, die die wahre Biologie zwischen den Proben im Studiensatz widerspiegeln (Abbildung 2). Eine unangemessene Probenbeladung kann zu keinem quantifizierbaren Unterschied zwischen den Proben für ein bestimmtes Ziel führen, einfach aufgrund der Überladung der Membran.


(Aus [9] mit Genehmigung der Autoren und Bio-Rad.) Linearitätsvergleich der fleckenfreien Gesamtproteinmessung und Immundetektion von drei Housekeeping-Proteinen in 10–50 μg HeLa-Zelllysat. Links sind repräsentative Bilder von (a), fleckenfreiem Blot und den Chemi-Blots für (b), β-Aktin (c), β-Tubulin und (d), GAPDH. Spurmarkierungen entsprechen der Gesamtproteinbelastung (μg). Obwohl die Aktin- und Tubulinsignale linear erscheinen, lag das densitometrische Verhältnis weit unter der vorhergesagten „quantitativen Reaktion“ der tatsächlichen Belastung, während das fleckenfreie Signal mit dem erwarteten Ergebnis korrelierte (e).

5. Bestimmen Sie das geeignete Referenzsignal für die Datennormalisierung

Ein gutes Referenzsignal oder „Beladungskontrolle“ ist eines, das mit dem Zielprotein in derselben Probe koexprimiert und zwischen den Proben konsistent exprimiert wird. HKPs wie Tubulin, β-Actin und GAPDH haben traditionell als Ladekontrollen gedient, aber es gibt drei potenzielle Nachteile bei der Verwendung solcher Kontrollen. (1) HKPs werden unter den experimentellen Bedingungen möglicherweise nicht einheitlich ausgedrückt, was zu falschen Ergebnissen führt [10–15]. Das gleiche Problem wurde bei Referenzgenen gefunden, die für qPCR verwendet werden, bei denen die Auswahl instabiler Targets im Gegensatz zu stabilen Targets zu gegenteiligen Ergebnissen geführt hat [20, 21]. (2) HKPs sind in Lysaten sehr reichlich vorhanden und haben typischerweise die Membran für Proben gesättigt, die mit mehr als etwa 4 . beladen sind μg pro Spur (siehe vorheriger Abschnitt) (Abbildung 2). Dies würde diesen Proteinen das „Aussehen“ von guten Normalisierungskontrollen verleihen, da die Dichten der assoziierten Banden zwischen den Bahnen als „Artefakt“ der Membransättigung alle ähnlich wären. (3) Die Datennormalisierung mit HKPs stützt sich nur auf einen Datenpunkt und bietet eine schlechte Darstellung möglicher Prozessinkonsistenzen.

Angesichts der Probleme, die bei HKP-Kontrollen auftreten, wurden von der wissenschaftlichen Gemeinschaft alternative Methoden zur Normalisierung gesucht und wir schlagen vor, dass eine ausgezeichnete Ladekontrolle (LC) die folgenden Kriterien erfüllen sollte. (1) Es hat ein gutes Ansprechverhalten (1 : 1) auf Veränderungen der Gesamtproteinmenge einzelner Proben. (2) Sie ist unempfindlich gegenüber dem Einfluss verschiedener physiologischer Bedingungen und Behandlungen und muss daher anhand der Membran selbst quantifiziert werden, um den Effekt der Transfereffizienz zu berücksichtigen [22, 23]. (3) Die Erfassung des LC wäre idealerweise in allen Phasen des Western-Blot-Prozesses (d. h. Visualisierung des Proteins auf den Pretransfer-Gelspuren, Posttransfer-Blot und Posttransfer-Gelspuren) möglich, wodurch eine konsistente Prozesskontrolle ermöglicht wird. (4) Die Erfassung des LC muss schnell, einfach und hoch reproduzierbar sein. (5) Für die Optimierung und Etablierung von LC sollte kein langwieriger Prozess erforderlich sein. (6) Das Verfahren zum LC-Nachweis sollte mit immunchemischer Färbung kompatibel sein.

Um diese Probleme anzugehen, verwendet die wissenschaftliche Gemeinschaft jetzt die Verwendung der Gesamtspurdichte des durch Blot übertragenen Proteins als Mittel zur Datennormalisierung [24–26]. Es gibt eine Reihe von Farbstoffen, die verwendet werden können, um das übertragene Protein auf dem Blot zu visualisieren, abzubilden und zu quantifizieren, darunter Ponceau S, Coomassie R-350, Amido Black, MemCode und Deep Purple. Jede dieser Färbungen weist jedoch individuelle Probleme auf, nämlich im Alltag schlecht reproduzierbar zu sein, einen begrenzten Dynamikbereich und eine eingeschränkte Kompatibilität mit Blotting-Membranen und immunchemischer Färbung [25]. In jüngerer Zeit wurde die Stain-Free-Technologie (Bio-Rad) eingeführt [24–26] und erfüllt alle sechs der oben genannten Kriterien für einen guten LC mit einem linearen Dynamikbereich zwischen etwa 10 und 80 μg Gesamtproteinbelastung aus einem typischen Zell- oder Gewebelysat [8, 9]. Dies ermöglicht die Verwendung der Gesamtspurdichte aus dem fleckenfreien Blot zur Normalisierung zwischen den Spuren für die meisten Western-Blot-Studien.

Die Technik zur vollständigen Bahnnormalisierung unter Verwendung der fleckenfreien Assay-Technologie wurde gut beschrieben, ist jedoch kurz wie folgt: (a) Die Qualität der elektrophoretischen Trennung kann innerhalb weniger Minuten überprüft werden. Nach UV-Aktivierung sind die Proteinbanden im Gel sichtbar und können mit einem Kamerasystem aufgenommen werden. Das erzeugte Fluoreszenzsignal bleibt über einige Stunden stabil. (b) Der Blot wird unmittelbar nach dem Transfer abgebildet, um den Transfer des Proteins von jeder Spur zu verifizieren. (c) Die Bilddaten der Gesamtdichte aller blot-übertragenen Proteinbanden pro Spur werden dann mit der Image Lab-Software aufgezeichnet, indem eine einzelne Bande in jeder Spur ausgewählt und die Bandbreite gestreckt wird, um alle Volumenpeaks im Spurprofil abzudecken . (d) Die Hintergrundrollscheibe wird für alle Bahnen auf einen niedrigen Wert (zwischen 1 und 5) eingestellt, um sicherzustellen, dass nur die gesamte Hintergrunddichte subtrahiert von der Summe aller Bänder pro Bahn zur Normalisierung erfasst wird.

Darüber hinaus ist die Stain-Free-Technologie sowohl mit Nitrozellulose- als auch mit PVDF-Membranen kompatibel und die Datennormalisierung mit SF-Blot-Bildern basiert auf vielen Datenpunkten und ist HKPs überlegen.

6. Datenanalyse: Das Hintergrundsubtraktionsproblem

Hintergrundsubtraktion ist ein häufiger Grund, variable oder falsche Daten aus Western Blots zu erhalten [27]. Bei Verwendung herkömmlicher densitometrischer Analyseverfahren, wie der Volumenanalyse von eingerahmten Bändern und Hintergrund, können Variationen der vom Hintergrund abgezogenen Daten auftreten, da der Hintergrund nicht von dem gleichen Kasten abgezogen wird, in dem sich die Bande befindet. Darüber hinaus enthält die Box, in der eine Bande ausgewählt wird, immer die Dichte sowohl der Bande als auch des zugehörigen Hintergrunds, was bei Banden mit niedriger Dichte häufiger vorkommt [8]. Die Kombination dieser Faktoren kann zu stark variablen Daten führen, wenn Proben mit einem unterschiedlich exprimierten Zielprotein unter Verwendung eines unspezifischen Antikörpers mit hohem Hintergrund getestet werden. Eine gute Alternative zur Volumenanalyse mithilfe von Boxen ist ein Algorithmus zur Hintergrundsubtraktion mit rollenden Scheiben in Verbindung mit einem Fahrspurprofil-Tool (Abbildung 3). Die Image Lab-Software wurde mit diesen beiden Tools entwickelt, die gleichzeitig verwendet werden können, um sicherzustellen, dass für jede Spur die geeignete Bandbreite und der entsprechende Spurhintergrund ausgewählt werden (Abbildung 3).


(Aus [8] mit Genehmigung der Autoren und Bio-Rad.) Bildaufnahme und densitometrische Analyse. Image Lab Software Version 5.0 (Bio-Rad) wurde für die Bildaufnahme und densitometrische Analyse der Gele, Blots und Filme in dieser Studie verwendet. Die Software interpretiert die Rohdaten in drei Dimensionen mit der Länge und Breite der Bande, die durch das Tool „Lanes and Bands“ in Zusammenarbeit mit dem Tool „Lane Profile“ definiert wurde, so dass das vom Blot emittierte Chemilumineszenzsignal in der dritten Dimension registriert wird als Peak, der aus der Blot-Oberfläche aufsteigt. Die Dichte einer bestimmten Bande wurde als Gesamtvolumen unter dem dreidimensionalen Peak gemessen, der mit dem Werkzeug „Spurprofil“ in zwei Dimensionen angezeigt werden konnte, um die genaue Breite der Bande an die Fläche unter dem schattierten Peak anzupassen von Interesse. Die Hintergrundsubtraktion wurde unter Verwendung der Rolling-Disc-Einstellung im „Lanes“-Tool eingestellt. Die Rolling-Disc-Werte wurden so eingestellt, dass der Hintergrund unter der interessierenden Bande (d. h. Peak) auf gleichmäßige Weise zwischen den Bahnen eines gegebenen Blots subtrahiert wurde. In diesem Fall wurde die rollende Scheibe für die beiden analysierten Spuren auf 18 bzw. 25 eingestellt, so dass die interessierenden Peaks auf einem einheitlichen Niveau zwischen den mit einem „X“ gezeigten Markierungen geschnitten wurden.

7. Computergestützte Analyse von densitometrischen Daten

Es gibt zahlreiche Berechnungen aus densitometrischen Daten, die Formeln verwenden, die in EXCEL-Tabellen enthalten sind, die mehrere Arbeitsblätter und Dateien umfassen, um quantitative Daten aus Western Blots zu erhalten. Es ist oft schwierig, den Berechnungsgrundlagen zu folgen, und wir haben festgestellt, dass es oft zu Verwirrung kommt, wenn Labormitarbeiter vor der direkten Frage stehen, wie die Rohdaten von Western Blots zu veröffentlichbaren Ergebnissen verarbeitet werden sollen. Die Analyse von Western-Blot-Daten kann unter Verwendung einer sehr ähnlichen Methodik wie bei der qPCR durchgeführt werden, indem die relative, normalisierte Proteinexpression berechnet wird, wie in den folgenden Schritten beschrieben (Tabellen 2 und 3). (1) Multiplizieren Sie für jeden Blot die vom Hintergrund abgezogene Dichte (Volumen in der Image Lab-Software) des Zielproteins (TP) in jeder Spur mit dem Dichteverhältnis der Beladungskontrolle (LC) (entweder Housekeeping-Protein oder Gesamtspurdichte) von einer Kontrollprobe, die in Spur 1 aller Studienblots geladen wurde, zu den anderen Spuren im Gel. Dies ergibt die normalisierte Dichte der Beladungskontrolle (NDL) (Tabelle 2). Die Kontrollprobe ist typischerweise ein gepooltes Homogenisat aus allen Proben in einer gegebenen Studie, das in mehrere Röhrchen aliquotiert ist, um das Laden einer frischen Kontrollprobe in Spur 1 jedes Studien-Blots zu ermöglichen. (2) Berechnen Sie die Faltungsdifferenz (FD) für jedes biologische/technische Replikat, indem Sie das NDL aus jeder Spur durch das NDL aus der Kontrollprobe in Spur 1 dividieren (Tabelle 2). (3) Bestimmen Sie die durchschnittliche FD und die zugehörigen

Werte für die biologischen Replikate durch Importieren der FD aus Schritt (2) oben in ein statistisches Analyse-Softwarepaket wie PRISM oder Analyze IT (Tabelle 3).


PROTEINDETEKTION, QUANTITATION & ANALYSE

One-Step Blue® & One-Step Lumitein™ Protein Gel Stains

Unsere One-Step Protein-Gel-Färbungen sind kostengünstig, schnell und einfach zu verwenden. Fügen Sie Ihrem SDS-PAGE-Gel einfach eine Färbung hinzu, ohne sie zu fixieren oder zu waschen, und färben Sie sie 5 bis 60 Minuten lang. Diese Flecken sind für eine sicherere Handhabung ungiftig und gemäß CCR Title 22 als ungefährlich für die Abwasserentsorgung nach pH-Neutralisation zertifiziert. One-Step Blue® ersetzt Coomassie® für sichtbare Färbung oder Nah-IR-Fluoreszenz. One-Step™ Lumitein ersetzt SYPRO® Ruby für UV-Box- oder Gel-Scanner und One-Step™ Lumitein UV ersetzt Oriole™ für UV-Transilluminator.

Ein-Schritt-Fleckenfunktionen

  • Schnelles, einfaches Färben
  • Kein Fixieren, Mikrowelle oder Waschen
  • Auf wässriger Basis und ungiftig für die Abwasserentsorgung
One-Step Blue® ist eine Alternative zur zeitaufwendigen Coomassie®-Färbung für schnelle und einfache sichtbare Färbung (links) oder Nahinfrarot-Bildgebung im LI-COR® Odyssey® 800-Kanal (rechts). Rot fluoreszierendes One-Step Lumitein™ ist eine Alternative zur zeitaufwendigen und teuren SYPRO® Rubin-Protein-Gelfärbung und kann auf einer UV-Box oder einem Fluoreszenz-Gel-Scanner abgebildet werden Der rot fluoreszierende One-Step Lumitein™ UV Protein Gel Stain wurde für die Bildgebung mit einem UV-Transilluminator entwickelt. Im Gegensatz zu Oriole™ Gel Stain enthält es keine gefährlichen Lösungsmittel und verursacht keine Gelschrumpfung.

Produktinformation

ProduktErsatz fürKatalognummerEinheitsgrößeProduktprotokollSicherheitsbericht
One-Step Blue®
Coomassie-Färbung21003-1L1LPI-21003
Einstufiger Sicherheitsbericht für Gelflecken
Ein-Schritt-Lumitein™SYPRO® Ruby Protein Gel Fleck21004-1L1LPI-21004
21004-4L4L
One-Step Lumitein™ UVOriole™ und Flamingo™ Protein-Gel-Flecken21005-1L1LPI-21005
21005-4L4L

Lumitein und seine verwandten Technologien sind durch US-amerikanische und internationale Patente geschützt. SYPRO ist ein eingetragenes Warenzeichen von Molecular Probes, Inc. Oriole ist ein Warenzeichen von Bio-Rad Laboratories. Coomassie ist ein eingetragenes Warenzeichen von Imperial Chemical Industries.

VersaBlot™ Gesamtprotein-Normalisierungskits

VersaBlot™ Total Protein Normalization Kits ermöglichen eine einfache, sensitive und hochlineare Proteinquantifizierung auf SDS-PAGE-Gelen und Western-Blot-Membranen. Mit den Kits können Sie gereinigte Proteine ​​oder Zelllysate mit unseren Nahinfrarot-CF®-Farbstoffen markieren, bevor Sie die Proben auf SDS-PAGE laufen lassen. Proteine ​​können dann mit einem Fluoreszenz-Gel-Scanner auf einem Gel oder einer Membran sichtbar gemacht werden, was den Nachweis von nur 1 ng Protein pro Bande ermöglicht. Falls gewünscht, kann die Vorfärbung nach dem Scannen rückgängig gemacht werden, was die nachgeschaltete Mehrfarben-Western-Blot-Analyse erleichtert. Die Färbung zeigt eine ausgezeichnete Linearität für die Quantifizierung des Gesamtproteins über einen weiten dynamischen Bereich und übertrifft die herkömmliche Western-Blot-Normalisierung basierend auf der Proteinerkennung im Haushalt.

VersaBlot™ Gesamtprotein-Vorfärbefunktionen

  • Reversible Vorfärbung für die nachgeschaltete mehrfarbige Western-Blot-Analyse
  • Überlegene Linearität für Western-Normalisierung im Vergleich zu Housekeeping-Proteinen
  • Hochempfindliche Proteinquantifizierung auf PAGE-Gelen oder Western-Membranen
  • Schnelle und einfache Markierung von Proteinen oder Lysaten, keine Aufreinigung erforderlich
  • Erkennen Sie nur 1 ng Protein und 10 % Unterschied im Proteingehalt
In-Gel-Fluoreszenzbild von Rinderserumalbumin (BSA), markiert mit dem VersaBlot™ Gesamtprotein-Normalisierungskit auf SDS-PAGE-Gel. Der Proteingehalt für jede Spur reicht von 10 ug bis 1 ng von links nach rechts. Die Banden oberhalb und unterhalb der Hauptbanden stammen von Verunreinigungsproteinen in der BSA-Probe. Der überschüssige Farbstoff läuft bis zum Boden des Gels. Einschub: Teil des Bildes mit erhöhter Helligkeit zur Visualisierung der Banden mit 10, 5 und 1 ng BSA. VersaBlot™ Gesamtprotein-Normalisierungskits für die Western-Blot-Normalisierung. HeLa-Zelllysat in serieller Verdünnung wurde mit (A) der CF®770T Gesamtprotein-Vorfärbung vor SDS-PAGE und Übertragung auf PVDF oder (B) Maus-Anti-Tubulin-Primärantikörper und CF®770T Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper nach dem Transfer markiert zu PVDF. (C) Diagramme der Bandenintensität vs. Proteingehalt für CF®770T-markiertes Lysat (in A gezeigt), CF®680T-markiertes Lysat (Membran nicht gezeigt) und Tubulin WB (in B gezeigt). Die VersaBlot™ Gesamtprotein-Normalisierungskits zeigen eine bessere Linearität im Vergleich zur haushaltsüblichen Proteinerkennung.

Produktinformation

ProduktKatalognummerGrößeAbs/EmBildgebende Systeme / Detektionskanäle
VersaBlot™ CF®680T Gesamtprotein-Normalisierungskit
33025-T100 Beschriftungen681 / 698 nmAmersham Typhoon™ Trio Cy®5-Kanal
Amersham Typhoon™ 5 IR-Kurzkanal
LI-COR® Odyssey® 700-Kanal
33025500 Beschriftungen
VersaBlot™ CF®770T Gesamtprotein-Normalisierungskit33026-T100 Beschriftungen764 / 787 nmAmersham Typhoon™ 5 IR langer Kanal
LI-COR® Odyssey® 800-Kanal
33026500 Beschriftungen

Typhoon ist ein Warenzeichen und Cy-Farbstoff ist ein eingetragenes Warenzeichen von GE Healthcare Odyssey ist ein eingetragenes Warenzeichen von LI-COR Biosciences.

GloMelt™ Protein-Thermostabilitätsassay

Thermoshift-Assay für Proteinstabilität

Der Thermo-Shift-Assay, auch Protein Thermal Shift™, Differential Scanning Fluorimetry oder Thermofluor-Assay genannt, ist eine einfache Technik zur Messung der Proteindenaturierungstemperatur. Es kann verwendet werden, um Bedingungen zu screenen, die die thermische Stabilität des Proteins beeinflussen, wie Mutationen, Ligandenbindung und Pufferformulierungen. Der Assay ist schnell und wird auf einem quantitativen PCR-System durchgeführt. Die thermische Verschiebung ist mit dem Hochdurchsatz-Screening kompatibel und erfordert viel weniger Protein als Methoden wie Circulardichroismus und Differentialscanningkalorimetrie.

Umweltempfindliche Fluoreszenzfarbstoffe können verwendet werden, um die temperaturabhängige Entfaltung eines Proteins zu überwachen. Die Schmelztemperatur (Tm) des Proteins ist ein Hinweis auf die thermische Stabilität des Proteins.

GloMelt™ Dye für thermische Proteinstabilität

GloMelt™-Farbstoff erfährt eine Fluoreszenzverstärkung bei der Bindung an hydrophobe Regionen von denaturierten Proteinen und kann verwendet werden, um die Proteinentfaltung in einem thermischen Shift-Assay nachzuweisen. GloMelt™-Farbstoff ist für die Detektion im SYBR® Green-Kanal optimiert und erzeugt daher ein viel stärkeres Signal als SYPRO® Orange- und PROTEOSTAT® TS-Farbstoffe, deren Spektren nicht gut mit den üblichen qPCR-Fluoreszenzkanälen übereinstimmen. Da GloMelt™ eine grüne Fluoreszenz aufweist, kann es auch mit ROX-Normalisierung für eine verbesserte Replikatkonsistenz verwendet werden.

GloMelt™ toleriert eine Vielzahl gängiger Stabilisatoren und Destabilisatoren, und im Gegensatz zu SYPRO® Orange funktioniert es gut in Gegenwart von Reinigungsmitteln. SYPRO® Orange und PROTEOSTAT® TS Farbstoffe sind stark hydrophob, daher müssen die Farbstoffe nach dem Verdünnen in Puffer sofort verwendet werden. Im Gegensatz dazu hat GloMelt™ eine ausgezeichnete Wasserlöslichkeit, was die Lagerung verdünnter Farbstofflösungen für mehr Komfort und weniger Verschwendung von Farbstoff ermöglicht.

GloMelt™-Funktionen

  • Grüne Fluoreszenz optimal für qPCR-Instrumente und ROX-Normalisierung
  • Kompatibel mit hohen Waschmittelkonzentrationen
  • Kompatibel mit einem breiten pH-Bereich, Reduktionsmitteln und gängigen Puffern/Hilfsstoffen
  • Hervorragend geeignet für Assays mit hohem Durchsatz, geringen Reaktionsvolumina und niedrigen Proteinkonzentrationen
  • Hochlöslich und stabil in wässrigen Puffern
GloMelt™ hat eine viel bessere Waschmittelverträglichkeit als SYPRO® Orange. IgG-Schmelzkurvendiagramme in Gegenwart von Detergens. Ein Thermo-Shift-Assay wurde mit 20 ug IgG in Gegenwart von 5X SYPRO® Orange oder 1X GloMeltTM Farbstoff unter Verwendung eines QuantStudioTM 5 qPCR-Systems durchgeführt. Die Anwesenheit von Detergens hemmte den SYPRO® Orange Assay, hatte jedoch wenig Einfluss auf die GloMelt™ Kurve. GloMelt™ toleriert im Gegensatz zu PROTEOSTAT® TS Reduktionsmittel. IgG-Schmelzkurvendiagramme in Gegenwart von DTT. Ein Thermoverschiebungsassay wurde mit 25 ug IgG in Gegenwart von 1X PROTEOSTAT® TS-Farbstoff oder 1X GloMelt™-Farbstoff unter Verwendung eines QuantStudio™ 5 qPCR-Systems durchgeführt. Das Vorhandensein von DTT reduzierte die Sensitivität des PROTEOSTAT®-Tests drastisch, hatte jedoch nur geringe Auswirkungen auf den GloMelt™-Farbstoff. Wie erwartet reduzierte DTT die thermische Stabilität von IgG. Die Normalisierung des GloMelt™-Signals auf den ROX-Referenzfarbstoff kann die Ergebnisse verbessern, indem die Replikatkonsistenz erhöht wird. Ein Thermo-Shift-Assay wurde mit 20 ug IgG in Gegenwart von 1X GloMeltTM Farbstoff und 50 nM ROX durchgeführt. Nach der ROX-Normalisierung war die Standardabweichung um mehr als das 5-fache reduziert.

Produktinformation

ProduktInhalt des KitsKatalognummerGröße*
GloMelt™-Kit&bull GloMelt™ Farbstoff
& Stierziege IgG-Kontrolle
33021-T200 Reaktionen
33021-12000 Reaktionen
GloMelt™ Kit mit ROX&bull GloMelt™ Farbstoff
& Stierziege IgG-Kontrolle
&bull ROX Referenzfarbstoff
33022-T200 Reaktionen
33022-12000 Reaktionen
* Größe basierend auf 20 uL Reaktionsvolumen

SYPRO is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Protein Thermal Shift and QuantStudio are trademarks of Thermo Fisher Scientific PROTEOSTAT is a registered trademark of Enzo Life Sciences.

AccuOrange™ Fluorescent Protein Quantitation Assay

AccuOrange™ Protein Quantitation Kit is a highly sensitive fluorescence-based assay for quantitating purified protein or antibody samples in 96-well format. The detection range of the assay is 0.1-15 ug/mL protein. AccuOrange™ is much more sensitive than traditional protein quantitation assays such as BCA, Bradford and Lowry, and is more linearity and reproducible compared to the NanoOrange® protein quantitation assay. The assay shows minimal variability between different proteins, and has stable fluorescence signal for up to 16 hours. The AccuOrange™ assay has low tolerance for detergents, and is not recommended for use with cell lysates.

The AccuOrange™ fluorescent protein quantitation assay is more linear and less variable than the NanoOrange® assay.

AssayDetection RangeKommentare
AccuOrange™0.1-15 ug/mLFluorescence-based (480/598 nm)
Highly linear
Signal stable for at least 16 hours
Compatible with reducing agents
Not compatible with detergents
NanoOrange®0.1-10 ug/mLFluorescence-based (470/570 nm)
Non-linear
Fluorescence stable for 6 hours
Compatible with reducing agents
Not compatible with detergents
Modified Lowry1-1500 ug/mLAbsorbance-based (750 nm)
Non-linear
Not compatible with reducing agents or detergents
BCA20-2000 ug/mLAbsorbance-based (562 nm)
Highly linear
Signal not stable over time
Not compatible with reducing agents
Compatible with detergents
Bradford (Coomassie®)50-500 ug/mLAbsorbance-based (595 nm)
Signal not stable over time
Non-linear
Compatible with reducing agents
Not compatible with detergents
Pierce® 660 nm50-2000 ug/mLAbsorbance-based (660 nm)
Non-linear
Compatible with reducing agents & detergents
EIN28050-2000 ug/mLAbsorbance-based (280 nm)
High protein-protein variability
Contaminants and detergents can affect results

Product Information

ProduktCatalog numberGrößeMerkmale
AccuOrange™ Protein Quantitation Kit30071-T200 assays&bull Highly sensitive: detect 0.1-15 ug/mL protein
&bull Excellent linearity and low variability
&bull Stable fluorescence signal
&bull Compatible with reducing agents and other additivies
&bull For use with purified protein or antibody samples
300711000 assays

NanoOrange is a registered trademark and Pierce is a trademark of Thermo Fisher Scientific Coomassie is a registered trademark of Imperial Chemical Industries.

Conjugates and accessories for western blotting

Near-infrared (near-IR) western detection is highly sensitive, and offers advantages of wider linear range and multiplexing capability compared to chemiluminscence detection (see our webinar to learn more). Biotium’s near-IR CF® dyes are the brightest and most photostable available. Learn more about CF®680 and CF®770 dyes for near-IR western, In Cell Western®, and other applications.

We offer wide selection of primary and secondary antibodies conjugated to our exceptional near-IR CF® dyes for western blot, as well as HRP conjugates for chemiluminescence detection. Also see below for our selection of protein markers, buffers, blocking agents, and more for western blotting.

CF® dye conjugates are brighter than IRDye® conjugates for near-infrared western blotting. A dilution series of HeLa cell lysate (from 2 ug to 0.125 ug) was transferred to PVDF membranes. Mouse anti-tubulin and rabbit anti-COX IV antibodies were detected using CF®680 anti-mouse and CF®770 anti-rabbit, or the corresponding IRDye® conjugates, and scanned on LI-COR® Odyssey®. Band quantitation showed

50% brighter signal with CF® dyes. M: marker.

Peacock™ and Peacock™ Plus Prestained Protein Markers on 10% Bis-Tris MES gels, labeled with apparent molecular weights of the bands.

Prinzip

Western blotting (protein blotting or immunoblotting) is a rapid and sensitive assay for detection and characterization of proteins. It is based on the principle of immunochromatography where proteins are separated into polyacrylamide gel according to their molecular weight.

The protein thus separated are then transferred or electrotransferred onto nitrocellulose membrane and are detected using specific primary antibody and secondary enzyme labeled antibody and substrate.


Verweise

Alexander SPH, Roberts RE, Broughton BRS, Sobey CG, George CH, Stanford SC, et al. Goals and practicalities of immunoblotting and immunohistochemistry: a guide for submission to the British. Br. J. Pharmacol. 2018175:407–11.

Uhlen M, Bandrowski A, Carr S, Edwards A, Ellenberg J, Lundberg E, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat-Methoden. 201613:823–7.

Vigelso A, Dybboe R, Hansen CN, Dela F, Helge JW, Guadalupe Grau A. GAPDH and beta-actin protein decreases with aging, making stain-free technology a superior loading control in Western blotting of human skeletal muscle. J Appl Physiol. 2015118:386–94.

Greer S, Honeywell R, Geletu M, Arulanandam R, Raptis L. Housekeeping genes expression levels may change with density of cultured cells. J Immunol Methods. 2010355:76–9.

Thacker JS, Yeung DH, Staines WR, Mielke JG. Total protein or high-abundance protein: which offers the best loading control for Western blotting? Anale Biochem. 2016496:76–8.

Luo S, Wehr NB, Levine RL. Quantitation of protein on gels and blots by infrared fluorescence of coomassie blue and fast green. Anale Biochem. 2006350:233–8.

Liu X, Fagotto F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Sci Signal. 20114:pl2.


Danksagung

The authors thank Dr. Nicole Davis for implementing this laboratory exercise in her biochemistry laboratory course. The authors also thank the Armstrong State University College of Science and Technology for their support through Summer Research Session Grants. This work was further supported by the National Science Foundation's STEP Program under Award No. DUE-0856593. Alle Meinungen, Ergebnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen in diesem Material sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

Zusätzliche Hintergrundinformationen finden Sie in der Online-Version dieses Artikels.

Bitte beachten Sie: Der Herausgeber ist nicht verantwortlich für den Inhalt oder die Funktionalität der von den Autoren bereitgestellten unterstützenden Informationen. Alle Anfragen (außer fehlenden Inhalten) sollten an den entsprechenden Autor des Artikels gerichtet werden.


Schau das Video: Western Blot. Protein Immunoblot explained (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Fariq

    Ich entschuldige mich, aber es kommt nicht unbedingt auf mich zu. Vielleicht gibt es noch Varianten?

  2. Kody

    Wunderbarerweise sehr unterhaltsames Stück

  3. Orwald

    Schreiben Sie gut, Erfolg in der Zukunft



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