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Abstammungsselektion in der Plasmidevolution

Abstammungsselektion in der Plasmidevolution


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Ich habe Paulsson (2002) gelesen und bin mir nicht sicher, was er im vorletzten Abschnitt mit "Auswahl der Abstammung" meint. Der Artikel befasst sich mit der Plasmidreplikation und konzentriert sich hauptsächlich auf die gegensätzlichen Belastungen aus zwei Selektionsebenen:

  1. Intrazellulare Auswahl - Konkurrenz zwischen Plasmiden in einer einzelnen Zelle. Ein Plasmid kann eine cis-Mutation durchlaufen und sich überreplizieren, was zu einer höheren Intrazell-Fitness als das fokale Plasmid führt. Die Plasmide reproduzieren sich.
  2. Auswahl zwischen Zellen - Konkurrenz zwischen Zellen. Zellen mit einer größeren Menge an Plasmiden brauchen länger zur Reproduktion, und Plasmide, die eine hohe Ladung produzieren, haben eine geringere Fitness zwischen den Zellen. Die Plasmide enthaltenden Zellen vermehren sich.

In diesem Kontext, Was bedeutet die dritte Selektionsebene – Abstammungsauswahl –? Was reproduziert? Wie teilen oder interagieren die Linien?

Meine Vermutung

Bedeutet Linienselektion einfach Gruppenselektion auf getrennten Zellkolonien? Wie werden in diesem Fall neue Linien gebildet? Ich würde erwarten, dass diese Gruppenebene nach Null-Plasmiden selektiert (da sie die Zellen nicht belasten und daher diese Zellgruppen am schnellsten wachsen), aber Paulsson (2002) schlägt das Gegenteil vor:

Abstammungsselektion könnte Plasmidmerkmale begünstigen, die der Population von Plasmid-haltigen Zellen helfen, Plasmid-freie Zellen zu bekämpfen.

Gibt es hierzu ausführlichere Diskussionen als den einen Abschnitt in Paulsson (2002)? Weder die Auswahleinheit noch die Wikipedia-Artikel zur evolutionären oder genetischen Abstammung gehen auf meine Frage ein. Der erste erwähnt die Abstammung nur am Rande, und die zweiten beiden diskutieren keine Auswahlmodelle.


Verweise

Paulsson, J. (2002). Mehrstufige Selektion auf Plasmidreplikation. Genetik, 161(4): 1373-1384.


Er definiert die Abstammungsselektion als Selektion auf Merkmale, die die Fitness einer Gruppe von Plasmiden erhöhen, und nicht auf ein einzelnes Plasmid in einer Zelle oder eine bestimmte Zelle, die Plasmide enthält. Er sagt, dass die Selektionseinheit "Plasmid-Host-Clades" sind: mit anderen Worten, die Selektionseinheit ist die Gruppe eng verwandter Plasmide in getrennten Zellen. Es ist ein Beispiel für eine Verwandtschaftsselektion, obwohl ich die spezifische Terminologie noch nicht weit verbreitet gesehen habe. Wahrscheinlich verwendet er keine Verwandtschaftsselektion, weil die Plasmide keine genau definierten Nachkommen haben, daher verwendet er einen breiteren Begriff für Verwandtschafts-Abstammung. Ich hätte vielleicht eine Kladenauswahl bevorzugt, aber dieser Begriff hat sein eigenes Gepäck. Ich bin mir nicht sicher (und Paulsson auch nicht), dass die Verwandtschaftsselektion notwendig ist, um die „trotzlich niedrigen Verlustraten“ zu erklären, da sowohl die intrazelluläre als auch die interzelluläre Selektion niedrigere Verlustraten begünstigen.


Chromosomales Barcoding von E coli Populationen zeigt die Dynamik der Abstammungsvielfalt in hoher Auflösung

Die Evolutionsdynamik in großen asexuellen Populationen wird stark von mehreren konkurrierenden nützlichen Abstammungslinien beeinflusst, von denen sich die meisten in sehr niedrigen Frequenzen trennen. Technische Hindernisse für die Verfolgung einer großen Zahl dieser seltenen Abstammungslinien in Bakterienpopulationen haben jedoch bisher eine detaillierte Aufklärung der evolutionären Dynamik verhindert. Hier überwinden wir diese Hürde, indem wir eine Chromosomen-Barcoding-Technik entwickeln, die die gleichzeitige Verfolgung von etwa 450.000 verschiedenen Abstammungslinien in . ermöglicht Escherichia coli, die wir verwenden, um die Wirkung von subinhibitorischen Konzentrationen üblicher Antibiotika auf die evolutionäre Dynamik niederfrequenter Abstammungslinien zu testen. Wir stellen fest, dass Populationen die Diversität der Abstammungslinien mit unterschiedlichen Raten verlieren, die ihrem Antibiotika-Regime entsprechen. Wir stellen auch fest, dass einige Abstammungslinien in unabhängigen Experimenten ähnliche Schicksale haben. Durch die Analyse der Trajektoriendynamik führen wir die reproduzierbaren Schicksale dieser Abstammungslinien auf das Vorhandensein vorbestehender nützlicher Mutationen zurück und wir zeigen, wie der relative Beitrag von vorbestehenden und de novo-Mutationen zwischen den Medikamentenregimen variiert. Schließlich reproduzieren wir die beobachtete Liniendynamik durch Simulationen. Insgesamt bieten unsere Ergebnisse eine wertvolle Methodik zur Untersuchung der bakteriellen Evolution sowie Einblicke in die Evolution unter subinhibitorischen Antibiotikaspiegeln.


Einführung

Plasmide sind akzessorische genetische Elemente, die horizontal zwischen Bakterien übertragen werden können. Sie tragen Gene, die ihrem Wirt helfen, sich an neue Nischen und Belastungen anzupassen, und spielen eine Schlüsselrolle in der bakteriellen Evolution. 1 Plasmide kodieren häufig für Antibiotikaresistenzgene, die für die Verbreitung von Antibiotikaresistenz und Multiresistenz unter pathogenen Bakterien verantwortlich sind, was derzeit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit darstellt. 2,3

Eine der zentralen Fragen der Plasmidbiologie ist, wie Plasmide in Bakterienpopulationen langfristig stabil gehalten werden können. 4 Dies ist aufgrund von Faktoren, die das Überleben des Plasmids behindern, schwer zu verstehen. Insbesondere (i) verursachen Plasmide Kosten für die Wirtsbakterien, 5 verursachen einen Wettbewerbsnachteil und (ii) können Plasmide während der Zellteilung verloren gehen (selbst wenn dies nur mit einer sehr geringen Rate geschieht). 6 Zusammengenommen sagen diese 2ꃺktoren einen konstanten Rückgang der Plasmidhäufigkeit in der Population im Laufe der Zeit voraus. 7 Es gibt jedoch Faktoren, die den Kosten- und Segregationsverlusten entgegenwirken und zur Plasmiderhaltung in Bakterienpopulationen beitragen, wie (i) Selektion auf Plasmid-kodierte Merkmale, (ii) horizontaler Transfer des Plasmids zwischen Bakterien (hauptsächlich durch Konjugation) ) und (iii) kompensatorische Mutationen, die die durch das Plasmid verursachten Kosten verringern. 4,8 Das Gleichgewicht zwischen all diesen Faktoren bestimmt das Schicksal eines bestimmten Plasmids in einer Bakterienpopulation. 9

Frühere theoretische Studien haben argumentiert, dass Plasmide in einer Bakterienpopulation nur erhalten werden können, wenn sie in der Lage sind, zu konjugieren. 8,10,11 Jüngste Fortschritte in der Genomsequenzierung haben jedoch gezeigt, dass paradoxerweise ein großer Teil der Plasmide durch Konjugation entsprechend ihrer Sequenz “nicht-übertragbar zu sein scheint. 12 Die Mechanismen, die die Persistenz nicht übertragbarer Plasmide ermöglichen, sind kaum verstanden. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir mathematische Modellierung, funktionelle Genomik und experimentelle Evolution verwendet, um dieses Problem zu untersuchen. 13 Wir entwickelten ein Modellsystem basierend auf dem opportunistischen Erreger Pseudomonas aeruginosa PAO1 trägt das kleine nicht-konjugative Plasmid pNUK73, das bei diesem Stamm besonders hohe Fitnesskosten verursacht (ungefähr 20 % Verringerung der relativen Fitness). pNUK73 verleiht Neomycin-Resistenz, wodurch die minimale Hemmkonzentration (MHK) von PAO1 um das 60-Fache erhöht wird. Nach 30 täglichen Passagen (300 Generationen) wies die Plasmid-tragende Subpopulation kompensatorische Mutationen auf, die die Kosten des Plasmidtransports vollständig kompensierten. Diese Mutationen inaktivierten mutmaßlich 3 bestimmte chromosomale Gene: eine Helikase, die eine UvrD-ähnliche Helikase-C-terminale Domäne trägt (PA1372) und 2 zusammenhängende mutmaßliche Serin/Threonin-Proteinkinasen (PA4673.15 und PA4673.16).

Allerdings passte sich auch die Plasmid-freie Subpopulation an die Umweltbedingungen an und somit erhöhte sich auch ihre Fitness im Vergleich zum Elternstamm. Dies war auf den Erwerb allgemein vorteilhafter Mutationen zur Anpassung an die Laborbedingungen zurückzuführen. Diese Mutationen zielten hauptsächlich auf das Diguanylatcyclase-Gen wspF (PA3703) in unserem Versuchssystem. Somit starb die Plasmid-tragende Abstammungslinie weiterhin aus, wenn auch mit einer langsameren Geschwindigkeit. Als Ergebnis war die Populationsgröße der Plasmid-tragenden Abstammungslinie zu klein, um die allgemein vorteilhaften Mutationen zu fixieren. Die Plasmid-tragenden Populationen konnten jedoch durch Zugabe von Antibiotika gerettet werden. Dies führte zu einer Zunahme der Populationsgröße der Plasmid-tragenden Zellen, die es erlaubte, allgemein vorteilhafte Mutationen zu fixieren. Daher fanden wir, dass positive Selektion und kompensatorische Adaptation interagieren, um pNUK73 zu stabilisieren: positive Selektion erhöht die Wahrscheinlichkeit einer kompensatorischen Adaptation durch Erhöhung der Populationsgröße von Plasmid-tragenden Linien, wodurch die Chancen für neue adaptive Mutationen in den Plasmid-tragenden Zellen verbessert werden. Die kompensatorische Anpassung erhöht wiederum die Wirkung der positiven Selektion auf die Plasmidstabilität, indem sie die Geschwindigkeit verlangsamt, mit der das Plasmid zwischen Episoden der positiven Selektion verloren geht.

Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, dass Kompensation und positive Selektion dazu beitragen, nicht übertragbare Plasmide über einige hundert Generationen hinweg zu stabilisieren. Die langfristige Aufrechterhaltung dieser Plasmide bleibt jedoch schwierig zu verstehen. 13 In diesem Kommentar erweitern wir die Ergebnisse unseres Populationsgenetikmodells, um die Auswirkungen verschiedener Selektionsregime sowie den Einfluss des horizontalen Gentransfers auf die Langzeitstabilität dieser Plasmide zu analysieren.


Ergebnisse

MODELL

Wir betrachten eine Population, die aus Zellen besteht, die entweder chromosomal resistent oder chromosomal empfindlich sein können ( oder ), ohne Plasmid, ein resistentes Plasmid oder ein sensitives Plasmid (, , oder ). Daraus ergeben sich sechs mögliche Zelltypen: , , , , , und (der erste Buchstabe bezeichnet das Chromosom, der zweite Buchstabe das Plasmid).

Wir beginnen mit der Entwicklung eines Modells der Dynamik dieser Zellen (Abb. 1) und bezeichnen die Dichte jedes Zelltyps mit . Zellen replizieren mit Geschwindigkeit . Die Konkurrenz zwischen den Zellen wird durch eine dichteabhängige Todesrate erfasst , wo ist die Gesamtzelldichte (). Plasmide verbreiten sich durch dichteabhängige Übertragung zwischen Zellen mit einer Geschwindigkeit und gehen während der Zellreplikation mit Wahrscheinlichkeit verloren (Trennungsverlust). Die Beförderung von Plasmiden ist mit Fitnesskosten verbunden , was die Replikationsrate reduziert um den Faktor . Wir gehen davon aus, dass Zellen jeweils nur mit einem Plasmid infiziert werden können. Zellen ohne Widerstand ( und ) erleben eine zusätzliche Sterberate durch Antibiotika-Exposition. Widerstand ist mit Fitnesskosten verbunden, die die Replikationsrate um den Faktor . reduzieren . Wir gehen davon aus, dass Resistenzgene die gleichen Fitnesskosten und die gleiche Wirksamkeit haben, egal ob sie chromosomal oder Plasmid-getragen sind. Zellen, die sowohl chromosomale als auch Plasmid-übertragene Resistenz aufweisen, haben doppelte Fitnesskosten . Die Auswirkung einer Änderung dieser Annahmen wird in den Hintergrundinformationen untersucht (Abschnitt 2). Unsere Hauptergebnisse sind im Allgemeinen robust, wobei Sensitivitäten im Haupttext hervorgehoben werden.

Schema der modellierten Dynamik (Gl. 1). Jeder graue Kreis steht für einen Zelltyp, wobei die inneren Kreise das Chromosom (groß) und das Plasmid (klein) darstellen, mit bezeichnet Widerstand und Empfindlichkeit. Die Pfeile zeigen modellierte Prozesse an: Zellreplikation (dunkelblau), Tod (violett), Plasmidübertragung (orange) und Segregationsverlust (hellblau). Die Beschriftungen geben die Geschwindigkeit an, mit der diese Prozesse ablaufen. gibt die Dichte eines Zelltyps an, also ist die Gesamtzelldichte (), ist die Gesamtdichte der Zellen mit einem resistenten Plasmid (), und ist die Gesamtdichte der Zellen mit einem sensitiven Plasmid (). ist die Replikationsrate die dichteabhängige Sterberate die Antibiotika-assoziierte Sterberate die Plasmidübertragungsrate die Wahrscheinlichkeit des Segregationsverlustes die Kosten für den Plasmidtransport und die Kosten für das Tragen des Resistenzgens. (1)

Die Modellparameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Wir erwarten, dass sich die Parameterwerte (d. h. Raten und Kosten) erheblich unterscheiden, z. B. abhängig von Bakterienspezies, Plasmidtyp, Antibiotikum und Umgebung. Unser Ziel ist es, das Verhalten eines generalisierten Systems qualitativ zu verstehen, anstatt quantitative Vorhersagen über ein bestimmtes System zu treffen. Wir untersuchen daher eine breite Palette von Parameterwerten (Hintergrundinformationen, Abschnitt 1), anstatt Parameter so auszuwählen, dass sie ein bestimmtes System widerspiegeln.

Parameter Definition Maße Haupttextwert (SI-Bereich) Bistabilität, wenn
Replikationsrate Zeit -1 1 (0.5, 2) Hoch
Todesrate Volumen Zellen -1 mal -1 1 (0.5, 2) Niedrig
Antibiotika-assoziierte Todesrate Zeit -1 1 (0, 2) Niedrig
Kosten der Antibiotikaresistenz Dimensionslos 0.05 (0, 0.5) Hoch
Kosten des Plasmidtransports Dimensionslos 0.075 (0, 0.5) Niedrig
Plasmidübertragungsrate Volumen Zellen -1 mal -1 0.2 (0, 0.25) Hoch
Trennungsverlust Dimensionslos 0.005 (0, 0.1) Niedrig
  • Notiz: Genauer gesagt gibt die fünfte Spalte an, ob die Region der Bistabilität (in der Resistenz entweder Plasmid-übertragen oder chromosomal sein kann) bei hohen oder niedrigen Parameterwerten auftritt, verglichen mit der Region, in der nur die chromosomale Resistenz evolutionär stabil ist (siehe Hintergrundinformationen, Abschnitt 1) . Die Parametereinheiten sind willkürlich. Die wichtigsten Textwerte werden so gewählt, dass sie die Bandbreite der evolutionär stabilen Ergebnisse am besten veranschaulichen.

EVOLUTIONÄRE STABILITÄT DER PLASMID-BORNEN UND CHROMOSOMALEN BESTÄNDIGKEIT

Uns interessiert die evolutionäre Stabilität von chromosomaler und Plasmid-getragener Resistenz, dh ob etablierte Chromosomen-Resistenz durch Plasmid-getragene Resistenz verdrängt werden kann und umgekehrt. Wir bestimmen Parameterbereiche, in denen jede Widerstandsart stabil ist (Abb. 2, sowie S1 und S2) mit Hilfe der linearen Stabilitätsanalyse (siehe Methoden). Unter Bedingungen, die auf Resistenz selektieren, beobachten wir drei Verhaltensweisen: evolutionäre Stabilität von chromosomaler – aber nicht von Plasmiden getragener Resistenz – evolutionäre Stabilität von Plasmid-getragener – aber nicht chromosomaler – Resistenz und evolutionäre Stabilität von beiden Resistenzformen. In dieser dritten Region tritt Resistenz entweder auf dem Plasmid oder auf dem Chromosom auf, aber nicht auf beiden: Sowohl eine chromosomale als auch eine durch Plasmid übertragene Resistenz erhöht die Resistenzkosten, bietet aber keinen zusätzlichen Nutzen.

Evolutionäre Stabilität von Plasmid-übertragener und chromosomaler Resistenz. Die Farben zeigen an, welche Resistenzform evolutionär stabil ist: nur chromosomale Resistenz (orange) nur Plasmid-bedingte Resistenz (blau) oder entweder (violett). Wenn die Resistenz chromosomal ist, kann das sensitive Plasmid entweder vorhanden sein oder in der Population fehlen (dunkel vs. hellorange). Im weißen Bereich im linken Feld ist keine Resistenzform stabil (die Population ist antibiotikasensitiv). Parameterwerte sind: , , . Für linkes Panel = 0,075 und . Für rechte Platte und . Die Abbildungen S1 und S2 zeigen Ergebnisse für weitere Parametrisierungen. Beachten Sie, dass im Parameterraum, in dem Widerstand von Vorteil ist, dieser entweder wesentlich sein kann (: antibiotikaempfindliche Zellen sind nicht lebensfähig, auch wenn keine Konkurrenz durch resistente Zellen vorhanden ist) oder nicht essentiell. Diese Unterscheidung hat keinen Einfluss auf unsere Ergebnisse (Abb. S1 und S2).

Nur Chromosomenresistenz

Wenn nur die Chromosomenresistenz evolutionär stabil ist, werden Resistenzgene über einen evolutionären Zeitraum immer auf dem Chromosom landen. Das Plasmid wird entweder empfindlich sein oder in der Population fehlen. Allgemein (Tabelle 1 und Abb. S1 und S2) ist die chromosomale Resistenz das einzige evolutionär stabile Ergebnis, wenn der Nutzen der Resistenz hoch ist (hohe Antibiotika-assoziierte Mortalität, geringe Resistenzkosten), wenn die Fitness des Plasmids gering ist (niedrig Plasmidübertragungsrate, hoher Segregationsverlust, hohe Plasmidkosten) und wenn die Gesamtzelldichte niedrig ist (hohe Todesrate, niedrige Replikationsrate).

Nur durch Plasmid übertragene Resistenz

Wenn die durch Plasmide übertragene Resistenz evolutionär stabil ist, werden Resistenzgene immer auf dem Plasmid landen. Beachten Sie, dass in dieser Region die chromosomale Resistenz überhaupt nicht stabil ist (Abb. S12): Sie stellt eine Region dar, in der Resistenzgene nur bei horizontaler Übertragung persistieren können (van Dijk et al. 2020 ). Dieses Ergebnis tritt nur unter sehr spezifischen Bedingungen auf (kleiner Parameterraum, wenn Resistenzen nur einen geringen Fitnessvorteil bringen Abb. 2) und sein Vorhandensein ist modellstrukturabhängig (z. B. wie die antibiotische Wirkung modelliert wird siehe Abb. S7). Wir halten dies daher für keine ökologisch plausible Erklärung dafür, warum sich Resistenzgene auf Plasmiden befinden.

Bistabilität

Wenn beide Gleichgewichte evolutionär stabil sind, kann die Resistenz abhängig von den Anfangsbedingungen entweder chromosomal oder Plasmid-bedingt sein. Hat sich die eine Form des Widerstands einmal etabliert, kann sie nicht mehr durch die andere verdrängt werden.

Um die Abhängigkeit von den Anfangsbedingungen weiter zu untersuchen, simulieren wir das System numerisch, beginnend mit verschiedenen Anfangszelldichten (siehe Methoden). Wir betrachten ein Szenario mit einer Ausgangspopulation bestehend aus resistenten Zellen und sensitiven Zellen (Abb. 3). Wir variieren (i) die anfängliche Häufigkeit des sensitiven Plasmids in der sensitiven Population, (ii) die anfängliche Häufigkeit von chromosomaler gegenüber Plasmid-übertragener Resistenz in der resistenten Population und (iii) ob die chromosomal resistenten Zellen das sensitive Plasmid tragen. Die Ergebnisse dieser Simulationen (Abb. 3 und S3 und S4) geben Aufschluss über den evolutionären Druck, der die Lokalisation von Resistenzgenen auf drei Arten bestimmt.

Die Auswirkung der Anfangsbedingungen auf die Gleichgewichtsposition des Resistenzgens, die ein evolutionäres Ergebnis zeigt, hängt sowohl von der Anfangshäufigkeit der Plasmid-übertragenen und chromosomalen Resistenz als auch von der Anfangshäufigkeit des sensitiven Plasmids ab. Die linken Felder veranschaulichen die Variation der Anfangsbedingungen. Die rechten Felder veranschaulichen, ob im Gleichgewicht eine Plasmid-übertragene (blau) oder chromosomale Resistenz (orange) beobachtet wird. Die x-Achse gibt die Häufigkeit des sensitiven Plasmids in der anfänglich sensitiven Population an . Die ja-Achse gibt die Häufigkeit der Plasmid-übertragenen Resistenz in der anfänglich resistenten Population an für Platte A, für Panel B. Plasmid-übertragene Resistenz ist ein typischeres Ergebnis in Panel B als A, da das sensitive Plasmid in der anfänglichen chromosomal resistenten Population in Panel A vorhanden ist. Die Gesamtdichten der anfänglichen sensitiven und resistenten Population sind beide 1. (Die Variation des anfänglichen Resistenz-zu-Sensitivitäts-Verhältnisses hat keinen Einfluss auf die qualitativen Ergebnisse – Abb. S3). Parameterwerte sind wie folgt: , , , = 0.075, , , und .

Erstens, das Vorliegen einer positiven frequenzabhängigen Selektion: Plasmidübertragene Resistenz ist ein typischeres Ergebnis, wenn die anfängliche Häufigkeit der Plasmidübertragenen Resistenz im Vergleich zur Häufigkeit der chromosomalen Resistenz hoch ist. In ähnlicher Weise führt eine hohe anfängliche Häufigkeit von Chromosomenresistenz im Vergleich zu einer durch Plasmid übertragenen Resistenz zu einer Chromosomenresistenz als evolutionäres Ergebnis. Die Fitness einer Widerstandsart korreliert daher positiv mit ihrer Häufigkeit. Diese Frequenzabhängigkeit entsteht, weil zweifach resistente Zellen weniger fit sind als Zellen mit jeder Form von Einfachwiderstand: Doppelwiderstand verursacht zusätzliche Fitnesskosten, bietet jedoch keinen zusätzlichen Fitnessvorteil.Je höher die Häufigkeit von chromosomaler Resistenz ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein resistentes Plasmid eine chromosomal resistente (eher als chromosomal empfindliche) Zelle infiziert. Dies benachteiligt das resistente Plasmid. In ähnlicher Weise ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine chromosomal resistente Zelle mit dem resistenten Plasmid infiziert wird, umso höher, je höher die Häufigkeit des resistenten Plasmids ist. Dies benachteiligt das resistente Chromosom. Je häufiger die Widerstandsform ist, desto größer ist ihre Fitness im Vergleich zur anderen Form.

Zweitens hängt das evolutionäre Ergebnis auch von der Häufigkeit des sensitiven Plasmids ab. Plasmidübertragene Resistenz profitiert davon, dass das sensitive Plasmid selten ist: Plasmidübertragene Resistenz ist ein typischeres Ergebnis, wenn die anfängliche chromosomal resistente Population das sensitive Plasmid nicht trägt und wenn die Häufigkeit des Plasmids in der sensitiven Population gering ist. Dies liegt daran, dass eine niedrige Anfangsfrequenz des sensitiven Plasmids bedeutet, dass sich die Plasmid-getragene Resistenz sowohl vertikal (Zellreplikation) als auch horizontal (Plasmidübertragung) ausbreiten kann, wodurch sie schneller zunehmen kann als die chromosomale Resistenz.

Drittens ist die chromosomale Resistenz insgesamt ein typischeres Ergebnis dieser Simulationen als die von Plasmiden übertragene Resistenz. Dies liegt daran, dass die Plasmid-getragene Resistenz im Gegensatz zur chromosomalen Resistenz einem Segregationsverlust unterliegt: Sie wird nicht immer während der Zellreplikation vererbt. Tatsächlich begünstigt die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit eines Segregationsverlustes die Chromosomenresistenz (Abb. S4).

ROBUSTE ERGEBNISSE

Wir testen die Robustheit dieser Ergebnisse gegenüber einer Reihe von Annahmen über die Modellstruktur (siehe Methoden und Hintergrundinformationen, Abschnitt 2). Das allgemeine Ergebnis ist, dass das Vorhandensein von Bistabilität robust ist, obwohl sich die Größe des Bistabilitätsbereichs ändern kann. Die einzige entscheidende Annahme für eine positive Frequenzabhängigkeit ist, dass der Doppelwiderstand weniger vorteilhaft ist als der Einzelwiderstand (Abb. S5 und S6). Mit anderen Worten, das Eliminieren der zusätzlichen Kosten durch den Doppelwiderstand oder das Erhöhen des Nutzens des Doppelwiderstands so weit, dass er diese zusätzlichen Kosten aufwiegt, beseitigt den Bereich der Bistabilität. Unter diesen Umständen dominiert die Doppelresistenz (d. h. die Population besteht aus einem resistenten Plasmid, das in einer chromosomal resistenten Population zirkuliert).

Besonders hervorzuheben sind die Ergebnisse zweier Sensitivitätsanalysen. Erstens sind unsere Ergebnisse robust gegenüber der Einbeziehung des Genflusses zwischen dem Plasmid und dem Chromosom (z. B. Transposition des Resistenzgens). Der Genfluss ermöglicht, dass die ansonsten ausgeschlossene Resistenzform mit niedriger Häufigkeit persistiert (analog zum Mutations-Selektions-Gleichgewicht) und erhöht die Bandbreite der Anfangsbedingungen, die zu einer chromosomalen Resistenz führen (Abb. S8). Diese Effekte werden jedoch erst bei unrealistisch hohen Umsetzungsraten substanziell (siehe Abschnitt 2.4 der Hintergrundinformationen) (Sousa et al. 2013 ). Zweitens ist das Vorhandensein von Bistabilität robust gegenüber der Modellierung eines schwankenden, statt eines konstanten antibiotischen Drucks. Abhängig von ihrer Periode kann die Fluktuation die Plasmid-getragene Resistenz begünstigen, wodurch der Parameterraum vergrößert wird, in dem nur die Plasmid-getragene Resistenz evolutionär stabil ist (Abb. S10).

VERHÄLTNIS ZU VORHERIGEN MODELLIERERGEBNISSEN

Als nächstes gehen wir auf einige frühere Modellierungsergebnisse zurück. Wie in der Einleitung erörtert, sagen frühere Modellierungen voraus, dass lokal vorteilhafte Merkmale eher von Plasmiden als von Chromosomen getragen werden, was eine komplementäre Hypothese dafür liefert, warum sich bestimmte Gene auf Plasmiden befinden (Bergstrom et al. 2000). Das Modell, von dem diese Vorhersage abgeleitet wird, geht jedoch davon aus, dass das Plasmid außerhalb der lokalen Nische fehlt. Wir fragen daher, ob eine lokale Anpassung eine Plasmid-übertragene Resistenz begünstigt, wenn das empfindliche Plasmid außerhalb der lokalen Nische bestehen kann. Wir modifizieren unser Modell, um einen Zustrom empfindlicher Zellen einzubeziehen, und variieren die Häufigkeit des empfindlichen Plasmids in diesen ankommenden Zellen (siehe Abschnitt 3 der Hintergrundinformationen). Dies entspricht einem Szenario, in dem Resistenz in der modellierten Umgebung lokal vorteilhaft ist, aber nicht anderswo ausgewählt. Wie in 4 gezeigt, begünstigt ein Zustrom empfindlicher Zellen ohne das empfindliche Plasmid tatsächlich die Plasmid-übertragene Resistenz, wie zuvor vorgeschlagen (Bergstrom et al. 2000). Ein Zustrom sensitiver Zellen mit dem sensitiven Plasmid begünstigt jedoch die Chromosomenresistenz. Die Stärke dieses Effekts hängt von der Einstromrate empfindlicher Zellen ab. Somit begünstigt eine lokale Adaptation die Plasmid-übertragene Resistenz nur dann, wenn die Häufigkeit des sensitiven Plasmids außerhalb der lokalen Nische gering ist.

Die Lokalisation (chromosomal oder Plasmid-getragen) eines lokal nützlichen Resistenzgens hängt von der Anwesenheit des sensitiven Plasmids in Einwanderungszellen ab. Die Anfangspopulation ist vollständig resistent (mit chromosomal resistenten Zellen, die das empfindliche Plasmid tragen, entsprechend Tafel A in Abbildung 3), mit dem ja-Achse, die die Häufigkeit von Plasmid-übertragenen Resistenzen in dieser Ausgangspopulation angibt . Die x-Achse gibt die Häufigkeit des sensitiven Plasmids in den eingewanderten Zellen an. Die Anwesenheit des Plasmids in diesen eingewanderten Zellen begünstigt die Chromosomenresistenz. Die hohe Zustromrate beträgt , ist die niedrige Zuflussrate . Andere Parameterwerte sind: , , , = 0.075, , , und .

Zweitens gehen wir auf Ergebnisse bezüglich der Plasmidpersistenz ein. Frühere Modellierungsarbeiten haben gezeigt, dass, wenn die Plasmid-Fitness zu gering ist, als dass Plasmide als reine Parasiten bestehen bleiben (dh ohne Gene, die für die Wirtszelle nützlich sind), sich nützliche Gene immer auf dem Chromosom und nicht auf dem Plasmid befinden (ohne lokale Anpassung Bergstrom et al., 2000). Somit ist die Persistenz von Plasmiden mit geringer Übertragbarkeit ein Paradox: Sie können ohne nützliche Gene nicht aufrechterhalten werden, aber nützliche Gene können nicht auf diesen Plasmiden aufrechterhalten werden (Bergstrom et al. 2000).

Wir testen diese Vorhersage in unserem Modell (wie in Abschnitt 4 der Hintergrundinformationen ausführlich beschrieben), indem wir den Parameterraum vergleichen, in dem die Plasmid-übertragene Resistenz evolutionär stabil ist (dh Resistenzgene können sich auf dem Plasmid selbst in Gegenwart einer Konkurrenz durch Chromosomenresistenz lokalisieren). mit dem Parameterraum, in dem ein parasitäres Plasmid persistieren kann (dh ein sensitives Plasmid kann in einer chromosomal sensitiven Population persistieren). Wir stellen fest, dass die bisherigen Ergebnisse für die hier vorgestellte Modellstruktur nicht zutreffen: Resistenzgene können sich auf dem Plasmid statt auf dem Chromosom lokalisieren, selbst wenn die Plasmidübertragbarkeit zu gering ist, um das Plasmid als Parasit zu persistieren (Abb. S11). Dies impliziert, dass es theoretisch möglich ist, dass es Plasmide mit geringer Übertragbarkeit gibt, die nur aufgrund des Vorteils bestehen, den sie Wirtszellen bieten. Bemerkenswert ist jedoch, dass der Parameterraum, in dem dies geschieht, klein ist (Abb. S11).

ERFASSUNGSRATE BESTIMMT DEN STANDORT DES WIDERSTANDS-GENS

Bisher zeigen unsere Ergebnisse, dass für mäßig nützliche Gene (d. h. diejenigen in der bistabilen Parameterregion) das Vorliegen einer positiven frequenzabhängigen Selektion bedeutet, dass die Plasmid-getragene Resistenz trotz des Verlusts der Segregation evolutionär stabil sein kann. Diese frequenzabhängige Selektion allein ist keine ausreichende Erklärung dafür, warum Resistenzgene Plasmid-getragen sind. Es deutet jedoch darauf hin, dass sich die zuerst erworbene Resistenzform (plasmidübertragen oder chromosomal) wahrscheinlich in der Bevölkerung etablieren wird: Wenn die erste Resistenzform vor dem Erwerb der anderen Form Zeit hat, an Dichte zuzunehmen, ist es eine höhere Frequenz gibt ihm einen Fitnessvorteil. Der erste Widerstandstyp muss nicht fixiert sein, um ein Eindringen des anderen auszuschließen: Der frequenzabhängige Vorteil ist selbst bei niedrigen Gesamtwiderstandsfrequenzen ausreichend stark (Abb. S13). Wenn die Rate des Widerstandserwerbs im Vergleich zur Anstiegsrate der einmal erworbenen Widerstandsfrequenz niedrig ist, wird daher die erste Form des Widerstands bestehen bleiben.

Somit könnte das Vorhandensein von Resistenzgenen auf Plasmiden dadurch erklärt werden, dass die Erwerbsrate der Plasmid-übertragenen Resistenz höher ist als die Erwerbsrate der chromosomalen Resistenz. Tatsächlich sind die Raten des konjugativen Plasmidtransfers im Allgemeinen höher als die Raten des chromosomalen horizontalen Gentransfers (eine Schätzung, basierend auf dem Vergleich experimenteller Messungen, legt eine Größenordnung von höher, obwohl dies wahrscheinlich stark kontextabhängig ist Nazarian et al. 2018). Darüber hinaus wird für eine Reihe von Bakterienarten tatsächlich angenommen, dass der primäre Mechanismus des Erwerbs von Resistenzgenen der Transfer von Resistenz-tragenden Plasmiden zwischen den Spezies ist (Baker et al. 2018 MacLean und San Millan 2019).

Um diese Idee zu formalisieren, entwickeln wir ein einfaches Modell des Resistenzerwerbs bei mehreren Arten (Abb. 5 und Abschnitt „Methoden“). Wir modellieren Spezies ein Resistenzgen, das für alle Spezies nützlich ist und ein Plasmid, das zwischen allen Spezies übertragen werden kann und in allen Spezies persistiert (entweder weil es ein breites Wirtsspektrum hat oder weil sein Spektrum nach dem Transfer verschoben oder erweitert werden kann Loftie-Eaton et al. 2016 ). Die Resistenz kann entweder durch Plasmide oder durch Chromosomen hervorgerufen werden. Sobald eine Art eine Resistenzform erworben hat, etabliert sich diese Resistenzform und kann nicht mehr ersetzt werden (aufgrund positiver frequenzabhängiger Selektion). Wir gehen davon aus, dass Resistenzgene erst de novo auf dem Chromosom entstehen (bei Rate ). Das Gen kann sich durch den horizontalen Transfer von Chromosomenresistenz zwischen den Spezies (z. B. Transformation) ausbreiten (mit einer Geschwindigkeit von ) oder Interspezies-Transfer von Resistenzplasmiden (bei Rate ). Wir gehen davon aus, dass sich das Gen mit geringer Geschwindigkeit zwischen dem Plasmid und dem Chromosom bewegen kann, wodurch die ansonsten ausgeschlossene Form der Resistenz mit geringer Häufigkeit persistieren kann. Wir modellieren diese Koexistenz nicht explizit, modellieren aber den horizontalen Transfer der niederfrequenten Form (bei Rate für Plasmid-bedingte Resistenz und Rate für Chromosomenresistenz, wobei ist die Frequenz der Niederfrequenzform).

Prävalenz von Plasmid-übertragener Resistenz. Panel A: Darstellung der Modellstruktur. repräsentiert Arten ohne das Resistenzgen Spezies mit dem Resistenzgen auf dem Plasmid Spezies mit dem Resistenzgen auf dem Chromosom. ist die Rate, mit der Resistenz durch Mutation entsteht die Geschwindigkeit, mit der die Plasmid-übertragene Resistenz zwischen den Spezies übertragen wird die Rate, mit der die Chromosomenresistenz zwischen den Arten übertragen wird und fängt den Genfluss zwischen dem Plasmid und dem Chromosom ein. Panel B: Der Anteil der Plasmid-übertragenen Resistenz hängt von der Anzahl der simulierten Spezies und dem Verhältnis der Interspezies-Transferrate des Chromosoms ab () und das Plasmid-getragene Gen (). Die horizontalen gestrichelten Linien zeigen den maximalen Anteil an Plasmidresistenz, da die Resistenz erst auf dem Chromosom entstehen muss (). Die Fehlerbalken repräsentieren 95 % Konfidenzintervalle, basierend auf 1000 Realisierungen. Parameter waren: , und . Ergebnisse für alternative Parametrisierungen sind in Abbildung S14 dargestellt.

Wir simulieren dieses System stochastisch (siehe Abschnitt „Methoden“), ausgehend von keiner Spezies mit dem Resistenzgen. Abbildung 5 zeigt den Anteil der Arten mit Plasmid-übertragener Resistenz, nachdem sich das Gen auf alle Arten ausgebreitet hat. Erwartungsgemäß steigt der Anteil der Spezies mit Plasmid-übertragener Resistenz mit der Rate des Plasmidtransfers zwischen den Spezies. Zudem steigt dieser Anteil auch mit der Zahl der modellierten Arten. Dieser Effekt entsteht aus zwei Gründen. Erstens muss sich das anfängliche de novo-Erscheinen des Gens auf dem Chromosom befinden. So kann beispielsweise, wenn nur zwei Arten modelliert werden, eine Plasmid-übertragene Resistenz nur bei einer von zwei Arten auftreten. Zweitens nimmt der Einfluss der Übertragungsrate zwischen den Arten mit der Anzahl potenzieller Spenderarten zu. Diese Ergebnisse sind robust gegenüber unterschiedlichen Parametrisierungen (Abb. S14).


Evolution in bakteriellen Plasmiden und Selektionsniveaus

Der Genfluss zwischen verschiedenen reproduktiven wie bakteriellen Plasmiden und Chromosomen stellt für die evolutionäre Analyse ungewöhnliche Probleme. Weit mehr als bei Eukaryoten müssen die Fortpflanzungsvorteile auf mehreren Selektionsebenen – Gene, Transposons, Plasmide, Zellen und Klone – gleichzeitig berücksichtigt werden, um die Plasmidevolution zu verstehen. In Konfliktsituationen herrscht keine Ebene durchgängig vor, und einige Fortpflanzungseinheiten tragen Gene, die ihre eigene Fortpflanzung oder ihr Überleben einschränken, anscheinend um die Fortpflanzung oder das Überleben der Fortpflanzungseinheiten höherer Ebene, die sie tragen, zu verbessern. Trotz des Genflusses zwischen Plasmiden und Chromosomen zeigen Gene für bestimmte Funktionen starke Tendenzen, auf Plasmiden aufzutreten, während andere durchweg auf Chromosomen auftreten. Die mit Plasmiden im Allgemeinen assoziierten Funktionen sind vielfältig, aber alle sind nur in lokal eingeschränkten Kontexten nützlich. Es wird argumentiert, dass die selektiven Konsequenzen der größeren horizontalen (innerhalb der Generation) Übertragung von Plasmiden für dieses Muster verantwortlich sind. Die Tendenz der ebenfalls horizontal beweglichen Prokaryoten-Transposons, Gene zu tragen, die denen ähnlich sind, die üblicherweise auf Plasmiden vorkommen, unterstützt dieses Argument. Die offensichtlichen Tendenzen bei eukaryotischen Plasmiden und Transposons, dieselben Merkmale zu vermissen, stimmen auch mit Vorhersagen der Hypothese der lokalen Anpassung überein, da Gene auf diesen genetischen Einheiten im Allgemeinen nicht horizontaler beweglich sind als chromosomale Gene. Es gibt theoretische Gründe zu erwarten, dass sich Plasmidgene tendenziell schneller entwickeln als chromosonale Gene.


Ergebnisse

Die Existenz charakteristischer Exemplarnummern

Wir beginnen damit, unsere Aufmerksamkeit auf eine einzelne Zelle zu richten, die eine Population von Plasmiden enthält, die bezüglich ihres Replikationsprofils identisch sind. Wir ignorieren zunächst die stochastische Natur der Replikation und Zellteilung und betrachten die Kopienzahl als kontinuierliche Variable, wobei sowohl das Wirtswachstum als auch die Kopienzahl durch deterministische Differentialgleichungen beschrieben werden (siehe Gleichungen 1 und 2 im Ergänzungstext S1). Unser Modell erlaubt es uns, eine Beziehung zwischen der Anzahl der Plasmide zu Beginn des Zellzyklus herzustellen () und die Zahl der Plasmide am Ende des Zellzyklus zum Zeitpunkt der Zellteilung (), wo stellt die Anzahl der Plasmide in den resultierenden Tochterzellen dar, unter der Annahme einer Gleichverteilung während der Zellteilung. Abbildung 2 zeigt eine typische Beziehung zwischen und , die von der Plasmid-Replikationsrate abhängt, die wiederum eine Funktion der Plasmidparameter ist , und (siehe Gleichung 2). Abhängig von der anfänglichen Anzahl von Plasmiden in der Elternzelle , haben die resultierenden Tochterzellen entweder weniger (), mehr () oder so viele Plasmide () als ursprünglich enthaltene Elternzelle. Der letztere Fall repräsentiert das generationsübergreifende Gleichgewicht einer bestimmten Kopienzahl für einen gegebenen Satz von Plasmidparameterwerten. Dieses Gleichgewicht kann in Abhängigkeit von der Reaktion des Systems auf Fluktuationen der Kopienzahl entweder stabil oder instabil sein. Die Bedingungen für ein stabiles Gleichgewicht mit a stabile charakteristische Kopienzahl kann definiert werden nach:

so dass, wenn eine Zelle weniger als . hat Plasmide zu Beginn des Zellzyklus, Plasmide überreplizieren und wenn es mehr als Plasmide, Plasmide unterreplizieren. In beiden Fällen, die durch Stochastiken bei der Plasmidreplikation oder Segregation bei der Zellteilung entstehen können, geht die Tendenz zu einem Gleichgewicht des zukünftigen Zellzyklus mit Plasmide wieder. Ein Beispiel für eine stabile charakteristische Kopienzahl ist der in Abbildung 2 mit einem ausgefüllten Kreis markierte Punkt. Der mit einem offenen Kreis markierte Punkt auf derselben Kurve ist eine instabile Gleichgewichtskopienzahl, jede Störung führt entweder zu einer Über- oder Unterreplikation des Plasmids, wobei letzterer Fall in diesem Fall zu einer Bewegung in Richtung des stabilen Gleichgewichts führt.

Jede Kurve repräsentiert die deterministische Beziehung zwischen der Anzahl der Plasmide zu Beginn des Elternzellzyklus und die Anzahl der Plasmide zu Beginn des Tochterzellzyklus (unter der Annahme einer Gleichverteilung während der Zellteilung), für eine Reihe von anfänglichen Kopienzahlen und einen festen Satz von Zell- und Plasmidparametern. Die Diagonale stellt die Konsistenz der Kopienzahlen zwischen Eltern- und Tochterzellen dar. Punkte unter der Diagonale zeigen eine Plasmidunterreplikation an, während Punkte über der Diagonale eine Plasmidüberreplikation anzeigen. Die Form der Kurve und ihre Schnittpunkte mit der Diagonalen hängen von den Plasmidparameterwerten ab Kurven, die sich nicht mit der Diagonalen schneiden, stellen den Fall einer konsistenten Unter- oder Überreplikation von Plasmiden für jede anfängliche Kopienzahl dar (blau tief Kurve und Cyan hoch Kurve bzw.). Das obere Ende jeder Kurve entspricht einer Grenze, jenseits derer die Zelle ihre Plasmidpopulation aufgrund einer negativen Zellwachstumsrate, die zum Zelltod führt, nicht aufrechterhalten kann. Mit Kreisen markierte Punkte auf dem Medium Kurve (grün) stellt Gleichgewichtskopienzahlen dar. Ein ausgefüllter Kreis zeigt Stabilität und das Vorhandensein einer charakteristischen Kopienzahl an, während ein offener Kreis ein instabiles Gleichgewicht anzeigt. Die kritische Kurve (rot), die tangential zur Diagonale verläuft, stellt die Grenze (Kante) der Stabilität dar, bei der die stabilen und instabilen charakteristischen Kopienzahlen auf einen einzigen Punkt zusammenfallen.

Die Grenzen der Plasmidstabilität

Für jede Konfiguration von Plasmid-Replikationsparametern , und , können wir feststellen, ob eine stabile charakteristische Kopienzahl existiert, welchen Wert sie hat und wie hoch die entsprechende Zellfitness ist, die als Kehrwert der Zeit definiert ist benötigt, damit sich eine Zelle teilen kann. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung des Raums der Plasmidparameter für zwei verschiedene CNC-Regime. Zunächst betrachten wir den Fall, in dem Plasmide unabhängig von der Anwesenheit anderer Plasmide im selben Wirt selbstbestimmte Replikationsraten aufweisen (, NO-CNC). In diesem Fall ist der einzige Mechanismus zur Kontrolle der Kopienzahl die Selbstbeschränkung des Plasmids (in Form von ), was frühe theoretische Ansätze als “passive” Kopienzahlkontrolle bezeichneten [36]. Zweitens betrachten wir den Fall einer aktiven negativen Rückkopplungsschleife zwischen Kopienzahl und Plasmid-Replikationsrate, die durch die Synthese von trans-wirkenden Replikationsinhibitoren realisiert wird (, mit , CNC).

Stabile (durchgezogene) und instabile (gestrichelte) Gleichgewichtskopienzahlen für eine einzelne Zelle als Funktion der basalen Plasmid-Replikationsraten zum und verschiedene Werte der Bindungsaffinität (blau für grün für rot für ).Die Werte der Zellfitness (berechnet als Kehrwert der Zellteilungszeit ), die den stabilen charakteristischen Kopienzahlen entsprechen, werden im unteren Feld angezeigt. Die stabilen und instabilen Gleichgewichtskopienzahlen kollabieren zu einem singulären Punkt (der Rand der Kopienzahlstabilität, wie durch den kritischen Kurve in 2 ), die durch eine farbige vertikale gestrichelte Linie markiert ist, jenseits derer keine charakteristischen Kopienzahlen existieren, d. h. Plasmide replizieren für jede anfängliche Kopienzahl über. Die Grenze, unterhalb derer die stabile charakteristische Kopienzahl wird null ist . In dem Fall, wo (blaue Linien), der Rand der Stabilität fällt mit der maximalen Zellfitness für . zusammen (grüne, rote Linien) ist der Host-Fitnesspeak von suboptimalen Parameterkonfigurationen umgeben, die sich durch Stabilität in Bezug auf die Kopienzahl auszeichnen.

Im ersteren Fall (NO-CNC) beobachten wir, dass das System eine stabile charakteristische Kopienzahl ungleich Null für einen extrem begrenzten Bereich der basalen Plasmid-Replikationsraten aufweist . Diese stabile Region ist von Regionen mit Plasmidinstabilität umgeben, die durch eine konsistente Unter- oder Überreplikation von Plasmiden für jede anfängliche Kopienzahl gekennzeichnet sind (beschrieben durch die niedrigen und hohen Kurven in Abbildung 2). Im Bereich der Plasmidstabilität steigt die Zellfitness mit bis zu einem kritischen Punkt, der den Übergang zur Instabilität markiert, an dem sich Plasmide ständig überreplizieren. Daher würde die interzelluläre Selektion ohne CNC steigende Werte der Plasmid-Replikationsrate begünstigen (), da dies zu einer höheren Zellfitness führt, bis der kritische Punkt der Plasmidinstabilität erreicht ist. Dieser Übergang (in Abbildung 3 durch eine vertikale gestrichelte Linie gekennzeichnet) tritt bei maximaler Zellfitness auf und ist durch den Zusammenbruch der stabilen und instabilen Gleichgewichtskopienzahlen zu einer singulären Kopienzahl gekennzeichnet (ein Ereignis, das von den kritischen erfasst wird Kurve in Abbildung 2). Konsequente Überreplikation führt zu zukünftigen Zellzyklen mit einer steigenden Zahl von Plasmiden, was schließlich zu Plasmidexplosion und Zelltod führt. Die Aktivierung des CNC-Systems (, mit ) erweitert effektiv den Bereich der Plasmidstabilität und entkoppelt vor allem den Punkt des Übergangs zur Instabilität vom Punkt des optimalen Zellwachstums. Als Ergebnis ist die Konfiguration der Plasmid-Replikationsparameter, die ein optimales Zellwachstum ergibt, nun von suboptimalen, aber auch stabilen Regionen umgeben. Unter diesen Bedingungen würde eine interzelluläre Selektion für erhöhte Zellteilungsraten Zellen begünstigen, die Plasmide mit stabilen Kopienzahlen enthalten.

Plasmidstabilität und Wirtswachstum

Unsere vorherigen Simulationen haben gezeigt, dass es bei Vernachlässigung der Stochastik nur einen begrenzten Bereich von das ermöglicht Stabilität bei der Plasmidreplikation. Ohne CNC würde eine Optimierung der Zellteilungsrate zu Plasmid-Replikationsraten am Rande der Stabilität führen, während die Anwesenheit von CNC sowohl den Bereich stabiler Replikationsraten erweitert als auch eine Situation schafft, in der eine optimale zelluläre Fitness ist befindet sich im Inneren dieser Stabilitätsregion. Wir fahren nun fort, indem wir das bisher betrachtete deterministische einzellige Gerüst erweitern, um die Plasmidstabilität und die Wirtsleistung im Kontext stochastischer multizellulärer Simulationen zu untersuchen, die das asynchrone Wachstum und die Teilung (oder den Tod) von Wirten und die autonome Replikation von Plasmiden innerhalb von beschreiben solche Gastgeber. Wir führen Stochastik in die Plasmidreplikation ein, indem wir die erwartete Anzahl von Replikationsereignissen für Plasmide in jedem Wirt zu jedem diskreten Zeitpunkt als Poisson-verteilt betrachten, wie in Gleichung 2 angegeben (für weitere Details siehe Ergänzungstext S1).

Die Leistung eines bestimmten Stamms in einer solchen stochastischen Simulation, bei der Wirte durch Plasmide mit identischen Replikationsparameterwerten infiziert werden, kann durch Berechnen der durchschnittlichen Netto-Wirtswachstumsrate als Differenz zwischen der durchschnittlichen Wirtsteilungs- und Todesrate bewertet werden. Abbildung 4 zeigt die resultierende Fitnesslandschaft unabhängiger Stämme als Funktion der entsprechenden Werte der Plasmid-Replikationsparameter und gegeben . Wir stellen fest, dass aufgrund der Homogenität der Plasmidpopulation Parameter und austauschbar sind (siehe auch Gleichung 2) und damit die Fitnesslandschaft von und gegeben ist identisch mit der Fitnesslandschaft von und gegeben . Der Bereich der Plasmidstabilität in dieser Landschaft wird vom Gradienten der Netto-Wirtswachstumsrate dominiert, was zu einem Bereich mit optimalem Wachstum führt, in dem der Gehorsam gegenüber der Polizei maximal stark ist (). Genau wie im einzelligen deterministischen Fall ist die stabile Region von Regionen mit Plasmidinstabilität umgeben, in denen Plasmide aufgrund des Fehlens einer stabilen charakteristischen Kopienzahl aus der Wirtspopulation eliminiert werden und die konsistente Unter- oder Überreplikation von Plasmiden. Konsequente Unterreplikation führt zur allmählichen Verdünnung und schließlich zum Verschwinden von Plasmiden aus der Population (weißer Bereich unter der stabilen Region in Fig. 4). Konsequente Überreplikation führt zu einer erhöhten Kopienzahl, die das Zellwachstum verlangsamt (siehe auch Gleichung 1), wodurch den Plasmiden mehr Zeit zur Replikation verschafft wird, wodurch das Zellwachstum weiter beeinträchtigt wird. Als solche können Plasmid-freie Wirte, die aus stochastischen Segregationsfehlern resultieren, aus überinfizierten Wirten herauswachsen, bis die Population vollständig Plasmid-frei ist (weißer Bereich über der stabilen Region in Fig. 4). Bei extremem Plasmid-Egoismus (bei hoher , niedrig ) kollabiert die Wirtspopulation unter dem Gewicht der übermäßigen Plasmid-Überreplikation, bevor Plasmid-freien Segreganten die Möglichkeit gegeben wird, überinfizierte Wirte auszuwachsen und eine Plasmid-freie Population zu bilden (schwarze Cluster in Fig. 4).

Die Heatmap zeigt die durchschnittliche Nettowachstumsrate der Population (ausgedrückt als Differenz zwischen der durchschnittlichen Teilungs- und Sterberate) als Funktion der Plasmid-Replikationsparameter und , gemittelt über drei unabhängige stochastische multizelluläre Simulationen mit Plasmidhomogenität (keine Mutationen) und einer festen Rate der Inhibitorproduktion. Die weißen Bereiche unterhalb und oberhalb der stabilen Region stellen die Regionen des Plasmidparameterraums dar, in denen Plasmide aufgrund konsistenter Unter- bzw. Überreplikation aus der Population eliminiert werden. Die schwarzen Cluster in der oberen linken Ecke repräsentieren den Zusammenbruch der Wirtspopulation unter dem Gewicht der übermäßigen Plasmidreplikation. Die horizontale gestrichelte Linie zeigt den Wert von für die das System ein optimales Wachstum bei . erreicht (siehe Abbildung 5). Schließlich skizziert der schwarze leiterartige Pfad die Entwicklung der CNC in einer stochastischen Simulation, bei der und dürfen mit Wahrscheinlichkeit mutieren und ein Festpreis der Inhibitorproduktion.

Gehorsamsstufen und Effizienz der Replikationssteuerung

Die Stochastiken bei der Plasmidreplikation und -segregation bei der Zellteilung führen zu einer Verteilung der Kopienzahlen in der Population, die im Verlauf einer Simulation über alle Plasmid-infizierten Wirte auftritt. Wir haben die Auswirkungen von Gehorsam untersucht ( oder Polizei , da diese aufgrund der Homogenität der Plasmidpopulation austauschbar sind) über die Merkmale dieser Verteilungen, indem ein Querschnitt der Fitnesslandschaft für einen festen Wert der basalen Replikationsrate der Plasmide betrachtet wird , was der optimalen Nettowachstumsrate bei maximalem CNC (). Das schwache CNC-Regime entlang dieses Querschnitts der Fitnesslandschaft () ist instabil und Plasmide werden schließlich aus der Population eliminiert (siehe Fig. 5). Die Breite der Kopienzahlverteilungen in diesem Regime spiegelt die umfangreiche Variation und Drift der Kopienzahlen in der Population aufgrund der Verstärkung stochastischer Kopienzahlfluktuationen wider [15]. Die Transformation der Verteilungen beginnt im mittleren Gehorsamsbereich (), wobei dennoch ein klarer Peak auftritt, weist das Vorhandensein eines schweren Schwanzes auf das Fortbestehen von Plasmidreplikationsinstabilitäten hin. Diese Instabilitäten werden im Bereich starker CNC minimiert (), da die Verteilungen aufgrund der zunehmenden Effizienz bei der Kontrolle von stochastischen Kopienzahlschwankungen und der entsprechenden Verringerung der Kopienzahlvariation zunehmend weniger schief werden. Gleichzeitig ist die Diskrepanz zwischen der durchschnittlichen Kopienzahl der Distributionen und die Exemplarnummer die für das Wirtswachstum optimal ist (siehe auch Gleichung 1) wird mit zunehmendem Gehorsam geringer , wodurch eine Beschleunigung des durchschnittlichen Netto-Wirtswachstums bis zur optimalen Rate bei maximaler CNC ().

Die Auswirkungen des Gehorsams (erhöhte Kontrolle der Kopienzahl) ) zur Verteilung der Plasmidkopienzahlen für einen festen Wert der basalen Replikationsrate der Plasmide , so gewählt, dass die Populationsfitness für diesen Wert bei maximaler CNC optimal ist (siehe horizontale gestrichelte Linie in 4 ). Das schwache CNC-Regime () ist instabil und Plasmide werden schließlich aus der Population eliminiert. Kopienzahlverteilungen werden für verschiedene Werte von angegeben (oben links blau für , grün für , rot für , cyan für und magenta für ). Die Verteilungen wurden berechnet, indem die Kopienzahlen aller Plasmid-infizierten Wirte über den gesamten Verlauf einer multizellulären stochastischen Simulation aufgezeichnet wurden. Die Diskrepanz zwischen der durchschnittlichen Kopienzahl und die Exemplarnummer die für das Wirtswachstum optimal ist als Funktion von (oben rechts) sowie die Standardabweichung (unten links) und Schiefe (unten rechts) der Kopiennummernverteilungen.

Die Entwicklung kollektiver Zurückhaltung

Nachdem wir die Auswirkungen einer homogenen Plasmidkooperation auf das Wirtswachstum und die Plasmidstabilität untersucht haben, fragen wir nun, wie diese Effekte die Evolution der Plasmidreplikationsparameter im breiteren Kontext des Konflikts zwischen den Selektionsebenen beeinflussen. Zu diesem Zweck führen wir Plasmidvariation in unsere multizellulären stochastischen Simulationen ein: Jedes Plasmidreplikationsereignis impliziert die Möglichkeit einer Mutation mit Wahrscheinlichkeit , in welchem ​​Fall der Wert von genau einem der Replikationsparameter des Plasmids, der zufällig mit gleichen Wahrscheinlichkeiten ausgewählt wird, modifiziert wird.

Beginnend mit einer anfänglichen Population von Plasmiden, die nicht auf Inhibitoren ansprechen (d. h. ), wir erlauben und sich bei einer festen Inhibitorproduktionsrate entwickeln . Die resultierende evolutionäre Dynamik, die in Abbildung 4 gezeigt ist, zeigt das Aufkommen einer effizienten Replikationssteuerung, die durch die Synergien zwischen intrazellulärer Selektion und der Begünstigung sofortiger Plasmid-Reproduktionsgewinne (höherer Egoismus , geringer Gehorsam ) und interzelluläre Selektion, die evolutionäre Anpassungen in Richtung auf jene Regionen des Plasmidparameterraums begünstigt, in denen die Nettowachstumsrate des Wirts zunimmt. Tatsächlich und aufgrund der vorübergehenden und epigenetischen Natur der stochastischen Kopienzahlfluktuationen wirkt die interzelluläre Selektion auf die über einige Generationen akkumulierte Netto-Wirtswachstumsrate und daher auf die Kopienzahlverteilungen, die mit bestimmten Konfigurationen der Plasmidreplikation verbunden sind Parameter [27]. Daher kommen die evolutionären Anpassungen, die durch die interzelluläre Selektion begünstigt werden, in Form kooperativer Plasmidparameter-Mutationen, wie einer erhöhten Plasmid-Selbstbeschränkung (geringerer Egoismus) ) oder erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor (höherer Gehorsam ), die den Replikationsmodus des Plasmids ändern, um zunächst eine Verringerung der Diskrepanz zwischen den optimalen und gemein Kopienzahlen und zweitens in der Größe der Kopienzahlfluktuationen (d. h. der Variation der Kopienzahlverteilung). Auf diese Weise entfaltet sich die Evolution der CNC mit einer eskalierenden Folge egoistischer und kooperativer Plasmidparametermutationen, die sich entlang des Gradienten der Wirtsfitnesslandschaft entwickeln und das System in Richtung des optimalen Wirtswachstums bei maximaler CNC führen. Eine weitere Eskalation wird aufgrund der Beschränkungen, die den Plasmidparameterwerten auferlegt werden, verhindert. Das Fehlen solcher Beschränkungen würde zu einem Ratchet-Effekt führen, bei dem die Abfolge egoistischer und kooperativer Mutationen auf unbestimmte Zeit andauern würde, nur begrenzt durch die Kosten der Herstellung der entsprechenden Faktoren, die an Plasmiden beteiligt sind Replikation (Initiatoren und Inhibitoren).

Das gleiche kooperative Ergebnis (Entwicklung eines effizienten CNC-Systems) wird erhalten, wenn wir alle drei Plasmid-Replikationsparameter zulassen , und sich aus einem Anfangszustand zu entwickeln, in dem Plasmide weder () noch antworten () zu Inhibitoren (siehe Abbildung 6). In diesem Fall können kooperative Mutationen entweder cis-spezifisch sein (höherer Gehorsam ) wie bisher oder transspezifisch (mehr Polizeiarbeit) ), in diesem Fall eine Mutation, die die Rate erhöht der Inhibitorproduktion durch ein einzelnes Plasmid beeinflusst nicht nur die Mutante, sondern alle Plasmide im intrazellulären Replikationspool (aufgrund der Term in Gleichung 2). Die cis-Spezifität von impliziert, dass eine kooperative Mutation, die eine höhere Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor induziert, auf intrazellulärer Ebene kostspielig ist, da sie die Chancen der Mutante auf einen sofortigen Reproduktionserfolg im Replikationspool verringert. Die Transspezifität von führt ein zwingendes Element in die Kooperation ein, da die Produktion von Inhibitoren die Replikation aller Plasmide im Pool reguliert. Es eröffnet auch das Potenzial für subversive Plasmidstrategien, nach denen einzelne Plasmide durch die eifrige Produktion des Inhibitors einen Vorteil im Replikationspool erlangen können (high policing ) unter Beibehaltung einer geringen Sensibilität (Gehorsam ) zu diesem Inhibitor selbst. Dennoch verhindert dieser Spielraum für opportunistisches Verhalten nicht die Entstehung des polizeilichen CNC-Mechanismus. Tatsächlich stellen wir fest, dass die Variation der Plasmidparameter innerhalb von Zellen ziemlich gering ist (siehe Tabelle 1), so dass die Wirte von einer mehr oder weniger homogenen Plasmidpopulation bewohnt werden (dh Plasmide sind stark mit ihren intrazellulären Nachbarn verwandt) auf das Fehlen von Plasmidmigration (horizontale Übertragung) zwischen Wirten. Der Grad der Plasmidhomogenität wird zwischen den Wirten um ungefähr eine Größenordnung verringert, verglichen mit seinem Wert innerhalb der Wirte, wodurch das Wirtswachstumsdifferential erzeugt wird, auf das die interzelluläre Selektion durch eine strengere Kontrolle der Plasmidreplikation wirkt.

Durchschnittliche Plasmidparameterwerte (Blau), (grün) und (rot) über die Zeit, zeigt die Entwicklung des CNC-Mechanismus in stochastischen multizellulären Simulationen mit Mutationswahrscheinlichkeit . Die Ergebnisse wurden über 50 unabhängige Simulationen mit den gleichen Anfangsbedingungen gemittelt.

Tabelle 1

innerhalb von Gastgebernzwischen Gastgebern
Die Tabelle fasst die intrazelluläre (innerhalb von Wirten) und interzelluläre (zwischen Wirten) Variation der Plasmid-Replikationsparameter zusammen, dargestellt als Standardabweichung , gemittelt über die Zeit und über 50 unabhängige stochastische multizelluläre Simulationen (die entsprechenden Mittelwerte der Plasmidparameter sind in 6 gezeigt). Die intrazelluläre Variation wird für alle Plasmide innerhalb eines Wirts in Bezug auf den intrazellulären Mittelwert des Wirts berechnet und über alle Wirte in der Population gemittelt. Die interzelluläre Variation wird für den intrazellulären Mittelwert aller Wirte in Bezug auf den (globalen) Mittelwert der Population berechnet.

Die Auswirkungen der Polizeikosten auf die Entwicklung von CNC

Wir haben auch den Einfluss der Polizeikosten auf die Entwicklung der kollektiven Zurückhaltung und die Gesamtleistung der Bevölkerung untersucht, indem wir einen zusätzlichen Kostenbegriff eingeführt haben in Gleichung 1, wobei sind die Produktionskosten pro Inhibitoreinheit, die vom Wirt bezahlt werden. Dies impliziert, dass aufgrund der damit verbundenen Polizeikosten, die das Wirtswachstum verlangsamen, nun auf interzellulärer Ebene eine Selektion gegen die Produktion von Polizeiressourcen stattfindet. Abbildung 7 zeigt, dass der Anstieg der Polizeikosten einer Abnahme der Produktion von Polizeiressourcen entspricht (), aber kein Zusammenbruch des Plasmidgehorsams () zur Polizei. Im Gegenteil, der Gehorsam wird nicht nur aufrechterhalten, sondern nimmt mit steigenden Polizeikosten auch leicht zu. Gleichzeitig ist die basale Plasmidreplikationsrate () sinkt, um die allmähliche Verringerung der Verfügbarkeit von Polizeiressourcen (). Dadurch bleibt das CNC-System durchgehend funktionsfähig (da auf interzellulärer Ebene noch Selektion für hohen Gehorsam stattfindet ), wird jedoch mit steigenden Polizeikosten weniger effizient und die Leistung der Population verschlechtert sich mit niedrigeren Teilungsraten für Wirte und höheren Raten von Segregationsverlusten für Plasmide (siehe 7 ).

Durchschnittswerte der Plasmidparameter (, , ), die Raten der Wirtsteilung und des Segregationsverlusts sowie der Anteil der Plasmid-infizierten Wirte in der Population (Plasmid-Ausbreitung) für unterschiedliche Polizeikosten. Letzteres wird hier als Produktionskosten ausgedrückt pro Inhibitoreinheit bezogen auf die konstanten allgemeinen Wartungskosten pro Plasmidkopie (z. B. Kosten für Genexpression, Replikation etc.).

Vergleiche zwischen individueller und kollektiver Zurückhaltung

Die positiven Wirkungen von CNC sind nicht auf Wirte beschränkt, sondern erstrecken sich auch auf Plasmide. Wir haben die Vorteile von CNC für Wirte und Plasmide bewertet, indem wir die Ergebnisse unserer multizellulären stochastischen CNC-Simulationen (CNC evolution) zu denen des Basismodells, bei dem keine Überwachung stattfindet und die Plasmide sich unabhängig von der Anwesenheit anderer Plasmide im selben Wirt replizieren (NO-CNC entwickelt sich, ). Die Wirtsleistung wurde anhand der durchschnittlichen Teilungs- und Todesraten bewertet, während die Leistung der Plasmide auf der Grundlage der Genauigkeit der vertikalen Übertragung und der Verbreitung von Plasmiden in der Wirtspopulation bewertet wurde. Abbildung 8 zeigt, dass alle Maßnahmen bei funktionsfähiger CNC (CNC-Simulationen) im Vergleich zum Fall ohne CNC-Mechanismus (NO-CNC-Simulationen) signifikant verbessert wurden. Somit ermöglichen die vorteilhaften Auswirkungen des CNC-Mechanismus auf die Plasmidstabilität aufgrund der strengeren Kontrolle der stochastischen Kopienzahlschwankungen eine weit verbreitete Wirtsinfektion und die Minimierung von Segregationsverlusten innerhalb der durch die interzelluläre Selektion erlaubten Grenzen, wodurch die Persistenz gefestigt wird der Plasmidlinie in der Population.

Die Wirtsleistung wird anhand der Teilungs- (oben links) und der Todesrate (oben rechts) gemessen, während die Leistung von Plasmiden anhand der Segregationsverluste (unten links) und des Anteils der Plasmid-infizierten Wirte in der Population gemessen wird ( unten rechts). Die Rate des Segregationsverlusts wird berechnet, indem bei jedem Zeitschritt die Vorkommen einer Plasmid-freien Tochterzelle, die aus einer Plasmid-infizierten Elternzelle stammt, unter allen Teilungen von Plasmid-infizierten Zellen aufgezeichnet werden. Es werden Vergleiche zwischen dem Basismodell gezogen, in dem die Polizei nicht vorhanden ist (NO-CNC in blauer Farbe) entwickelt sich, ) und das Modell, in dem sich Polizei und Gehorsam entwickeln dürfen (CNC in grüner Farbe sich entwickeln). Die Verteilungen wurden aus den Werten der letzten 100.000 Schritte von 50 unabhängigen stochastischen multizellulären Simulationen mit den gleichen Anfangsbedingungen und Mutationswahrscheinlichkeiten berechnet .

Schließlich untersuchten wir auch die Persistenz und Stabilität eines etablierten Überwachungsmechanismus bei Plasmiden gegen das Eindringen egoistischer Individuen, d. h. Plasmide, die gegenüber Replikationsinhibitoren unempfindlich sind und sich unabhängig von der Anwesenheit anderer Plasmide im selben Wirt replizieren. Genauer gesagt simulierten wir die Konkurrenz zwischen den NO-CNC ( nur mit ) und die CNC () Arten (a) durch gleichmäßiges Mischen beider Arten innerhalb der Wirte (Heterogenität innerhalb des Wirts) und (b) durch getrennte und gleichmäßige Verteilung der beiden Arten auf verschiedene Wirte in der Population (Heterogenität zwischen den Wirten). In jedem von uns untersuchten Fall haben wir die schnelle Verdrängung des egoistischen Typus aus der Bevölkerung beobachtet. Die vollständige Prävalenz des CNC-Typs zeigt die Robustheit und Stabilität des Mechanismus der kollektiven Zurückhaltung angesichts der Invasion egoistischer Elemente, die den Polizeimechanismus umgehen, um einen relativen Vorteil im intrazellulären Replikationspool zu erlangen.


Materialen und Methoden

Tabelle Reagenzien und Werkzeuge

Reagenz/Ressource Referenz oder Quelle Kennung/ Katalognummer
Medien
Luria-Bertani (LB) BD Difco von Fisher Scientific DF0446 07 5
M9CA Amresco M9CA Medium Brühe Pulver Los Nr. 2055C146
Plasmide
Spender und Empfänger
Stamm-Genotyp
RP4-Spender (Lopatkin et al, 2016 ) DA32838 Eco galK::cat-J23101-dTomato
pR-Spender (Lopatkin et al, 2016 ) DA26735 Eco lacIZYA::FRT, galK::mTagBFP2-amp
p41 Spender (Lopatkin et al, 2016 ) E coli isolieren Sie die Nummer 41
p168-Spender (Lopatkin et al, 2016 ) E coli isolieren Sie die Nummer 168
p193-Spender (Lopatkin et al, 2016 ) E coli isolieren Sie die Nummer 193
p283-Spender (Händel et al, 2015 ) ESBL 242
R6K-Spender (Lopatkin et al, 2016 ) E coli C600
R6Kdrd-Spender Großzügiges Geschenk von D. Mazel (Baharoglu et al, 2010 ) E coli Dh5a
R1-Spender Großzügiges Geschenk von F. Dionisio und J. Alves Gama (Gama et al, 2020 ) E coli MG1655 Dara
R1d. Spender Großzügiges Geschenk von F. Dionisio und J. Alves Gama (Gama et al, 2020 ) E coli MG1655 Dara
pRK100-Spender Großzügiges Geschenk von T. Sysoeva E coli HB101
RIP113-Spender Großzügiges Geschenk von D. Mazel (Baharoglu et al, 2010 ) E coli Dh5a
RB933-Empfänger Großzügiges Geschenk von I. Gordo (Leónidas Cardoso et al, 2020 ) E. coli lacIZYA::Narbe galK::Katze-YFP gatZ::FRT-aph-FRT rpoB H526Y
MG1655 (Lopatkin et al, 2016 ) E coli MG1655 (K-12 F – λ – ilvGrfb-50 rph-1)
DA838F (Lopatkin et al, 2016 ) DA32838 Eco galK::cat-J23101-dTomato
DA838 (Lopatkin et al, 2016 ) DA32838 Eco galK::cat-J23101-dTomato
P (Empfänger für p41, p193 und p168) Diese Studie, Laborbestand E coli MG1655 (K-12 F – λ – ilvGrfb-50 rph-1)
KPN-Empfänger (Gomez-Simmonds et al, 2015) Klebsiella pnseumoniae isolieren KP0064, ST17
Software
MATLAB gegen R2020a https://www.mathworks.com/products/matlab.html N / A
Werkzeuge
Tecan unendlicher Mplex-Plattenleser Tecan N / A

Methoden und Protokolle

Stämme, Medien und Wachstumsbedingungen

Die Experimente wurden mit einzelnen Klonen begonnen, die von Agarplatten entnommen, in 2 ml Luria-Bertani (LB)-Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C für genau 16 h unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert wurden. Gegebenenfalls wurden LB-Medien mit spezifischen Antibiotika ergänzt. Um beispielsweise die Anschaffungskosten von RP4 zu messen, wurden D, R und adaptiertes T mit 50 µg/ml Kanamycin (Kan), 50 µg/ml Spectinomycin (Spec) oder beidem gezüchtet (Tabelle S1A im Anhang). Für alle anderen Spender- und Empfängerkombinationen sind die jeweiligen Antibiotika und Konzentrationen im Anhang Tabelle S1B zu finden. Alle Experimente wurden in M9-Medium (M9CA-Medium-Bouillon-Pulver von Amresco, Chargen-Nr. 2055C146, enthaltend 2 mg/ml Casaminosäure, ergänzt mit 2 mM MgSO .) durchgeführt4, 0,1 mM CaCl2 und 0,4 % w/v Glucose.)

Generierung von adaptierten RP4-Transkonjuganten

Um adaptiertes T zu erzeugen, wurden einzelne Klone von D und R gemäß der vorherigen Beschreibung über Nacht gezüchtet. Nach 16 Stunden wurden alle Kulturen 1:1 in M9CA resuspendiert. Gleiche Volumina (je 400 µl) von D und R wurden in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt und 1 h in einem Kühlbrutschrank bei 25 °C inkubiert. Nach der Konjugationsphase wurden die Mischungen auf Spec-Kan-Platten ausgestrichen und für 16 h bei 37 °C kultiviert, was ausreichend lang ist, um eine physiologische Anpassung zu ermöglichen (Erickson® et al, 2017 ) ohne genetische Mutationen (Harrison et al, 2016 Lopatkin et al, 2017) und stimmt mit früheren Protokollen zur Etablierung von Transkonjuganten für Fitnesskostenschätzungen überein (Buckner et al, 2018 Dimitriu et al, 2019 ).

Quantifizierung der Anschaffungskosten für RP4

Generieren de novo T, einzelne Klone von D und R wurden über Nacht gezüchtet und wie oben beschrieben konjugiert. Parallel dazu wurden adaptierte T-Kolonien über Nacht gezüchtet, um die Standardkurve zu erstellen. Während der Konjugationszeit von D und R wurden auch 800 µl adaptiertes T in ein Eppendorf-Röhrchen aliquotiert und in den 25 °C-Kühlbrutschrank gestellt. Nach der Konjugationsphase de novo T wurde aus der Mischung von D und R quantifiziert, wobei entweder Koloniebildungseinheiten (CFU) oder durch Verdünnung in den Plattenleser verwendet wurden. Für CFU wurde die D- und R-Mischung seriell in 10-fach Verdünnungsinkrementen verdünnt. 10 µl aller Verdünnungsfaktoren (10 0 –10 7 ) wurden auf Spec-Kan-Agarplatten getüpfelt, dann 16 h bei 37 °C inkubiert und gezählt. Für den Plattenleser wurde die D- und R-Mischung in M9CA-Medien verdünnt, die Spec-Kan enthielten, und 200 ul wurden in technischen Dreifachproben in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte aliquotiert. Wie in Pilotversuchen festgestellt wurde, de novo T wurde auf 1.000× verdünnt, um ungefähr 2.000 Zellen pro Vertiefung zu ergeben, was sich als niedrig genug herausstellte, um Hintergrundwachstum oder Konjugation zu verhindern.

CFU von adaptiertem T wurde zu diesem Zeitpunkt auch unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben beschrieben quantifiziert. Die Standardkurve wurde unter Verwendung von sieben Verdünnungsfaktoren von adaptiertem T erstellt (Fig. 2B). Angepasste T-Zellen wurden in M9CA-Medium mit Spec-Kan verdünnt, und dann wurden 200 &mgr;l-Aliquots jedes Verdünnungsfaktors auf dieselbe 96-Well-Platte ausplattiert, ebenfalls in technischer Dreifachbestimmung. Alle Wells wurden dann mit 50 µl Mineralöl bedeckt, um eine Verdunstung zu verhindern, und sofort in einen Tecan-Plattenleser gegeben. In allen Fällen wurden alle 15 min für mindestens 24 h Extinktionsmessungen bei 600 nm durchgeführt, bis alle Zellen die stationäre Phase erreichten. Alle RP4-Daten wurden in mindestens biologischen Triplikaten durchgeführt.

Allgemeingültigkeit der Anschaffungskosten bei anderen Plasmiden

Das gleiche oben beschriebene Konjugationsprotokoll wurde für alle zusätzlichen Plasmide mit wenigen Modifikationen verwendet. Zunächst hingen die zur Selektion auf Transkonjuganten verwendeten Antibiotika jeweils von den Plasmid-kodierten Resistenzgenen und dem kompatiblen Empfängerstamm ab (Anhang Tabelle S1B). Außerdem fanden wir von den sieben Verdünnungsfaktoren, die für die RP4- und pR-Standardkurven verwendet wurden, die Untermenge der Verdünnungsfaktoren bei 10 2 X, 10 4 X und 10 6 X ausreichend, um die Anschaffungskosten beider Plasmide genau zu quantifizieren (wie bei der Bestimmung mit allen Verdünnungen). Somit wurden diese drei Verdünnungsfaktoren verwendet, um Standardkurven für den Rest der Experimente zu erstellen. Die maximale Zelldichte (definiert durch OD600) und die Wachstumsraten unterschieden sich je nach Stamm und Plasmid, basierend auf der Konjugationseffizienz. In allen Fällen wurde der Verdünnungsfaktor in den Plattenleser basierend auf Pilotversuchen bestimmt, um die höchste Anfangsdichte in den Wells ohne beobachtbare Hintergrundkonjugation zu identifizieren. In Fällen, in denen die Hintergrundkonjugation nicht vollständig eliminiert werden konnte, wurde das Wachstum abgezogen, so dass die exponentielle Phase erhalten blieb. Um konsistent innerhalb der exponentiellen Phase zu bleiben, wurde die Schwellenzelldichte auf 50 % der maximalen Dichte eingestellt, die für jedes Experiment erreicht wurde, dieser Wert schien am konsistentesten den in Fig. 2A angegebenen Bereich auszuwählen, wie in den Ergebnissen beschrieben. Die Veränderung der Schwelle innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase hat keinen qualitativen Einfluss auf unsere Schlussfolgerungen. Schließlich stellen wir fest, dass die Anschaffungskosten zwischen biologischen Replikaten in vielen Fällen sehr gut reproduzierbar waren (siehe Anhang Abb. S10A). pro Well einmal in 96-Well-Platten verdünnt. Wo biologische Doppelergebnisse reproduzierbar waren und nicht zu unterschiedlichen statistischen Schlussfolgerungen führten, konzentrierten wir uns stattdessen auf die technische Variabilität innerhalb eines repräsentativen Replikats. Daher maximieren wir die Genauigkeit der damit verbundenen statistischen Schlussfolgerungen, indem wir in jedem Fall die variabelsten Daten verwenden. In jedem Fall sind die zur Generierung von Statistiken verwendeten Replikattypen in Anhangstabelle S3A (Abb. 3H) aufgeführt. Wir weisen darauf hin, dass unabhängig von den zur Erstellung von Statistiken verwendeten Replikaten die spezifischen Anschaffungskosten identisch bleiben. Darüber hinaus änderte sich die Beziehung zwischen Anschaffungs- und Fitnesskosten nicht, je nachdem, ob stattdessen biologische Replikatdurchschnitte verwendet wurden (Anhang Abb. S10B).

Berechnung der Wachstumsrate

wo ja2 > ja1, wo ja2 und ja1 sind die OD600 manchmal T+2 und T−2 bzw. Die Prensky-Verzögerungszeit wurde durch den x-Schnittpunkt der Tangentenlinie, die durch die maximale Wachstumsrate verläuft, in Übereinstimmung mit der geometrischen Verzögerungszeit in Fig. 2A gefunden.

Wettbewerbsexperimente

Alle Konkurrenzexperimente wurden in einer früheren Veröffentlichung durchgeführt und die Daten wurden mit Genehmigung von Nature Communications (Lopatkin et al, 2017), das unter der Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) lizenziert ist. Kurz gesagt, Plasmid-freie und Plasmid-tragende Populationen wurden in einem Verhältnis von 1:1 gemischt und über aufeinanderfolgende Generationen zwischen 14-21 Tagen gezüchtet. Alle 24 h wurden die Populationen 10.000-fach verdünnt und die KBE in regelmäßigen Abständen auf doppelselektivem Agar überwacht.

Modellrechnungen

Simulationen wurden durchgeführt, um die beobachtete Wachstumsrate zu berechnen, μobsund die maximale spezifische Wachstumsrate, μ, für einen Bereich von α- und β-Werten ( 4A ). μobs wurde wie in Anhang Gleichung S6 beschrieben berechnet. μobs wurde basierend auf einer beobachteten Wachstumsrate, die unter 98% des Maximalwerts fiel (z. B. wenn μobs < 0,98*μ). In allen Fällen für die Datenanpassung wurde mit der Funktion fminsearch in MATLAB berechnet. fminsearch ist eine Optimierungsfunktion, die jede benutzerdefinierte Zielfunktion minimiert und eine anfängliche Schätzung des/der anzupassenden Parameter(s) erfordert. In unserem Fall haben wir diese Anpassung implementiert, indem wir die Differenz zwischen der ODE-Lösung von S D + S A und den Rohdatenkurven wie in Anhang Abb. S7 gezeigt minimiert haben, da ρ durch experimentelle Schätzung des Verhältnisses der Wachstumsraten zwischen angepassten und eingeschränkt wurde de novo Populationen war β der einzige verbleibende freie Parameter, der angepasst werden musste. Somit wurde für jedes Plasmid die anfängliche β-Abschätzung als die geometrische Verzögerungszeit der entsprechenden Wachstumskurve festgelegt, und die Ausgabe der fminsearch-Optimierung war eine geschätzte β, die am besten zu unseren experimentellen Daten passt.


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Vehikel, Replikatoren und interzelluläre Bewegung genetischer Informationen: Evolutionäre Zerlegung einer Bakterienzelle

Die prokaryontische Biosphäre ist in vielerlei Hinsicht sehr vielfältig. Jede gegebene Bakterienzelle kann in verschiedenen Kombinationen Viren, Plasmide, Transposons und andere genetische Elemente zusammen mit ihren Chromosomen enthalten. Diese Wirkstoffe interagieren in komplexen Umgebungen auf verschiedene Weise und verursachen eine Vielzahl von phänotypischen Wirkungen auf ihre Wirtszellen. In dieser Diskussion führe ich eine Sektion für eine Bakterienzelle durch, um die Vielfalt in Komponenten zu vereinfachen, die helfen können, sich dem Ozean von Details in sich entwickelnden mikrobiellen Welten zu nähern. Die Zelle selbst wird von allen genetischen Replikatoren getrennt, die das Zellvehikel zur Konservierung und Vermehrung verwenden. Ich führe eine Klassifikation ein, die verschiedene Replikatoren nach ihrem horizontalen Bewegungspotential zwischen Zellen und nach ihren Auswirkungen auf die Fitness ihrer gegenwärtigen Wirtszellen gruppiert. Die Klassifikation wird verwendet, um die Methoden zu diskutieren und zu verbessern, mit denen wir uns allgemeinen evolutionären Tendenzen in mikrobiellen Gemeinschaften nähern. Darüber hinaus wird die Klassifikation als Werkzeug verwendet, um evolutionäre Hypothesen zu formulieren und neu auftretende bakterielle Krankheitserreger zu diskutieren sowie das Verständnis der durchschnittlichen Phänotypen verschiedener Replikatoren im Allgemeinen zu fördern. Es wird auch diskutiert, dass sich jede gegebene Biosphäre, die prokaryontische Zellvehikel und genetische Replikatoren umfasst, auf natürliche Weise entwickeln kann, um sich horizontal bewegende Replikatoren verschiedener Typen zu haben.

1. Einleitung

Es ist bekannt, dass Viren, die prokaryontische Zellen infizieren, eine enorme genetische Vielfalt aufweisen [1, 2]. Die meisten neuen viralen Isolate weisen wahrscheinlich zumindest einige Gene auf, die keine Homologen unter den zuvor bekannten Genen aufweisen, einschließlich derer in den Genomen verwandter Viren [3]. Umstritten ist jedoch, ob in Viren tatsächlich neue Gene entstehen können [3]. Viren sind auf zelluläre Ressourcen wie Nukleotide, Aminosäuren und Lipide angewiesen, um mehr Viren zu produzieren, daher erscheint die Frage berechtigt, ob sie auch zelluläre Gene für ihre genetische Information nutzen. Wenn virale Gene jedoch in Datenbanken mit anderen Genen verglichen werden, scheint es oft, dass sie keine zellulären Gegenstücke haben [2]. Woher kommen dann diese viralen Gene? Wurden sie von einem zellulären Wirt gewonnen, den wir einfach noch nicht sequenziert haben? Oder entwickeln sich die zellulären Gene in viralen Genomen vielleicht nur so schnell, dass ihre gemeinsame Abstammung mit den Wirtsgenen nicht mehr abgeleitet werden kann? Oder ist es vielleicht tatsächlich möglich, dass in Viren selbst neue Gene entstehen?

Forterre und Prangishvili vom Pasteur Institute argumentierten, dass der Kern des Streits in der Vorstellung zu liegen scheint, dass Viren oft nur als ihre proteinverkapselten extrazellulären Formen angesehen werden [4], die nur zelluläre Ressourcen (einschließlich Gene) für ihre eigenen Zwecke stehlen [3, 5, 6]. Nehmen Sie ein beliebiges Lehrbuch über Viren und die meisten Bilder, die Viren darstellen, zeigen die verschiedenen Arten von Virushüllen, die aus Proteinen (und manchmal Lipiden) bestehen, die das Virusgenom umschließen. Aber diese infektiösen Viruspartikel oder Virionen sind in jeder Hinsicht inert, es sei denn, sie treffen auf eine anfällige Wirtszelle [7]. Und aufgrund dieser Trägheit von Virionen ist es schwer zu verstehen, wie ein Virus jemals mit völlig neuen Genen aufwarten konnte.

Die Antwort ist natürlich, dass Viren während ihres extrazellulären Zustands keine neuen Gene produzieren können und daher jedes potenzielle Ereignis für die Entstehung eines neuen viralen Gens innerhalb einer Zelle während des Replikationszyklus eines Virus stattfinden muss [5]. Aber wenn das Gen im Genom eines Virus auftaucht, wäre dann eher das Virus und nicht die Zelle der Urheber dieses Gens? Oder anders ausgedrückt: War es nicht das Virus, das von der Entstehung neuer genetischer Informationen profitierte? Der eigentliche Prozess, der dazu führt, dass die genetische Information den Status eines Gens erhält, wäre immer noch auf ähnliche Prozesse zurückzuführen wie die Entstehung von Genen innerhalb von Chromosomen (dies sind verschiedene Arten von genetischen Veränderungen, wie Punktmutationen, Insertionen, Deletionen, Genduplikationen, usw.), aber diese Änderungen würden aufgrund ihrer Verbesserungen der Fitness des Virus ausgewählt. Diese Argumentation hat Forterre dazu veranlasst, ein Modell vorzuschlagen, bei dem Viren im Wesentlichen als zelluläre Lebensform angesehen werden, die auch einen extrazellulären Zustand haben kann [7, 8]. Das Virus ist dem Protein-umschlossenen viralen Genom nicht genau äquivalent. Vielmehr sollte die extrazelluläre Form eines Virus als Virion bezeichnet werden, und dieses Virion sollte nicht mit einem Virus verwechselt werden. Viren im vollständigen Sinne sind Organismen, die in Zellen leben (d. h. Ribosomen-kodierende Organismen) und andere Zellen in Virus-Zell-Organismen verwandeln können, indem sie mehr Virionen produzieren. Mit anderen Worten, Viren können eine extrazelluläre eingekapselte Form nutzen, um ihre genetische Information von einer Zelle zur anderen zu übertragen. Forterre hat einen Begriff geprägt virocell, die sich auf das Stadium des Viruslebens bezieht, in dem sich das Virus in einer Zelle befindet [7]. Der Virozell-Organismus ist tatsächlich sowohl ein (Capsid-kodierendes) Virus als auch ein (Ribosomen-kodierendes) Chromosom, und der eigentliche Phänotyp der Virozelle wird von diesen beiden genetischen Einheiten kodiert. Die Virozellen sind ebenso wie Zellen in der Lage, neue genetische Informationen zu entwickeln, und daher sollte eine Annäherung an Viren aus dieser Perspektive alle Kontroversen über die Entstehung neuer genetischer Informationen in Viren klären.

Forterres Argumentation zusammen mit meinen eigenen Studien zu verschiedenen genetischen Elementen (einschließlich Charakterisierung temperierter und virulenter Viren [9, 10] Bestimmung gemeinsamer Vorfahren zwischen Plasmiden, Viren und chromosomalen Elementen [11] Durchführung von Evolutionsexperimenten mit Bakterien, Viren, und Plasmide [12, 13] sowie theoretischere Arbeiten zur horizontalen Bewegung genetischer Informationen [14, 15]) dienten als Inspiration für diese Arbeit. Tatsächlich könnte man allgemeiner argumentieren, was es bedeutet, dass prokaryontische Zellen Chimären verschiedener Arten genetisch reproduzierender Elemente sein können (und oft sind). Das Virocell-Konzept beseitigt effektiv viele der Verwechslungen zwischen Viren und Virionen und ihrer Beziehung zu Zellen. Dennoch ist Virocell nur ein Sonderfall unter allen möglichen Typen prokaryontischer Organismen. Bakterielle und archaeale Zellen können auch konjugative Plasmide, verschiedene Typen von Transposons, defekte Prophagen und viele andere unabhängige Replikatoren enthalten, die sich von dem für das prokaryontische Chromosom kodierenden Ribosom unterscheiden. Zusammen können diese Replikatoren Organismen in allen möglichen Kombinationen produzieren. Damit die Argumente über Virozellen mit den anderen potentiellen Chimären genetischer Replikatoren übereinstimmen, muss die Zelle selbst als eine von allen genetischen Replikatoren (einschließlich Chromosomen) getrennte Einheit betrachtet werden, die die Zellstruktur für die Replikation nutzen. In den folgenden Kapiteln werde ich eine evolutionäre Dissektion an einer Bakterienzelle durchführen. Dies führt zur Trennung von Zellvehikel und Replikatoren voneinander und bietet somit einen möglichen Zugang zur Evolution bakterieller Organismen.

2. Fahrzeuge und Replikatoren

Ein Fahrzeug ist jede Einheit, die diskret genug ist, um einen Namen zu verdienen, die eine Sammlung von Replikatoren beherbergt und als Einheit für die Erhaltung und Verbreitung dieser Replikatoren dient“, schrieb Richard Dawkins in Erweiterter Phänotyp. Dawkins verwendete die Konzepte von Replikatoren und Vehikeln in einem Argument, das besagte, dass die Evolution letztendlich auf der Ebene der genetischen Information und nicht auf der Ebene von Populationen von Organismen, Arten oder sogar Zellen operiere. Replikatoren beziehen sich auf Pakete mit genetischer Information, die für jeden effektiven Phänotyp des Vehikels verantwortlich sind. Vehikel selbst kann eine Zelle, ein vielzelliger Organismus oder beispielsweise der Wirtsorganismus eines Parasiten sein. “Ein Fahrzeug ist kein Replikator“, argumentierte Dawkins, um zu unterstreichen, dass sich der Replikator (wie das Chromosom eines Parasiten) und nicht das Vehikel (wie die parasitierte Zelle) entwickelt. Dieser Unterschied mag jedoch manchmal scheinbar trivial sein, weshalb er unter Evolutionsbiologen zu einigen Dissonanzen geführt hat.

Nichtsdestotrotz konzentrierte sich Dawkins’ Arbeit hauptsächlich darauf, evolutionäre Probleme eukaryotischer Organismen zu erklären, aber die replikatorzentrierte Evolution funktioniert natürlich auch innerhalb und zwischen prokaryotischen Zellen. Tatsächlich gibt es eine große Vielfalt an verschiedenen Formen genetischer Replikatoren, die prokaryontische Zellvehikel für ihre Konservierung und Vermehrung verwenden. Jeder bestimmte Prokaryot, der in dieser Biosphäre lebt, sei es ein Bakterium auf Ihrer Stirn oder ein Archaeon auf dem Grund des Pazifischen Ozeans, beherbergt ein Chromosom, kann aber auch eine Sammlung anderer Replikatoren beherbergen, einschließlich Plasmiden, Transposons und Viren. Einige der Replikatoren, wie konjugative Plasmide und Viren, können sich aktiv zwischen verfügbaren Vehikeln in ihrer Umgebung bewegen, wodurch diese Replikatoren weniger abhängig vom Überleben einer bestimmten Linie von Zellvehikeln werden. Daher sind sie kein inhärenter Bestandteil eines bestimmten Bakteriums und können daher als eigenständige Formen genetisch replizierender Einheiten betrachtet werden, die Zellen für ihre Vermehrung und ihr Überleben nutzen (ähnlich den Viren im Virocell-Konzept von Forterre).

Der ständige Kampf ums Dasein innerhalb und zwischen prokaryotischen Vehikeln verändert die Phänotypen der Replikatoren. Es wurde viel theoretische und experimentelle Arbeit geleistet, um die Funktionen und den evolutionären Verlauf von Viren, Bakterienzellen und Plasmiden in verschiedenen ökologischen Kontexten und unter verschiedenen Selektionsdrücken aufzuklären. In dieser Diskussion gehe ich jedoch einen Schritt weg von einem bestimmten Typ eines Replikators oder Organismus und untersuche aus einer allgemeinen Perspektive, ob das laterale Bewegungspotenzial (oder das Fehlen desselben) der Replikatoren dazu beitragen könnte, einige evolutionäre Aspekte der prokaryotischen Biosphäre zu beleuchten . Diese Diskussion versucht, einen intuitiven Überblick über die egoistischen Gene und verschiedene Arten von Replikatoren in Bakterien- und Archaeenzellen zu geben. Es ist meine Absicht, den Text einfach und lesbar zu halten, unabhängig von der Erfahrung des Lesers über Bakterien, Viren, Plasmide oder, was das betrifft, Evolutionstheorie. Darüber hinaus hoffe ich, dass die Leser angesichts der Vielzahl von Details in der mikrobiellen Welt erkennen, dass an verschiedenen Stellen bestimmte Ecken geschnitten werden mussten, um den Text in einer realistischen Länge zu halten.

Um die Einfachheit beizubehalten, werden in diesem Dokument außerdem die folgenden Nomenklaturen und Definitionen verwendet. EIN Zellenfahrzeug bezeichnet eine prokaryontische Zelle mit Membranen, Ressourcen und allem anderen, schließt jedoch jegliches genetisches Material aus. Zell-Fahrzeug-Abstammung bezeichnet ein einzelnes Vehikel und seinen direkten Nachkommen, die durch Zellteilung entstehen. EIN Replikator ist jede ausreichend diskrete Sammlung von genetischem Material (die eine Benennung wert zu sein scheint), die das Zellvehikel für ihre Konservierung und Vermehrung nutzt. Replikatoren werden als unterschiedliche Einheiten repliziert, die eine zusammenhängende Sammlung von genetischem Material bilden, die mit vertretbarem Aufwand von anderen Replikatoren getrennt werden kann. Replikatoren können als Teil der Replikation anderer Replikatoren repliziert werden, da integrative Viren zusammen mit der Wirtschromosomenvermehrung repliziert werden, aber im Wesentlichen können diese beiden Replikatoren als zwei unterschiedliche Einheiten bezeichnet werden, da das integrative Virus seine genetischen Informationen auch getrennt replizieren kann aus der Replikation des Chromosoms. Der Mittelwert, mit dem die genetische Information eines Replikators repliziert wird, ist nicht relevant. Ich ziehe es jedoch vor, einen Replikator nicht zu streng zu definieren, da dies wahrscheinlich zu unproduktiven haarspalterischen Argumenten führt.Es muss jedoch beachtet werden, dass Replikatoren keine Ribosomen oder andere Nukleinsäuren enthaltenden Moleküle umfassen, die im Wesentlichen eine enzymatische Funktion haben, aber nicht als Matrize für ihre eigene Replikation verwendet werden. Vertikale Beziehung oder vertikale Vererbung eines Replikators zeigt an, dass dieser genetische Replikator sich innerhalb einer sich teilenden Linie von Zellvehikeln bewahrt. Horizontales Bewegungspotential bezeichnet, dass der Replikator in der Lage ist, sich selbst in eine Zell-Vehikel-Linie einzuführen, in der der Replikator zuvor nicht vorhanden war. Jedes Merkmal, das von einem Replikator kodiert oder induziert wird, wird als a . bezeichnet Phänotyp. Abbildung 1 verknüpft diese Begriffe mit ihren biologischen Gegenstücken.


ANHANG D

Wir berechnen TP, die erwartete Persistenzzeit eines Plasmids in einer Population mit selektiven Sweeps. Dazu berechnen wir der Reihe nach die Elemente von Gleichung 11 im Text, die definiert TP. Der größte Aufwand (bis zu Gleichung D13) besteht in der Berechnung PR wir geben dann Ausdrücke für Tein und TF.

Zuerst berechnen wir PR, die Wahrscheinlichkeit, dass das Plasmid nach dem Erscheinen einer chromosomalen Variante durch einen selektiven Sweep gerettet wird, bevor es erlischt. Nehmen wir zunächst an, die chromosomale Variante entsteht zum Zeitpunkt T = 0.

Dann beachte das PR ist gegeben durch P R = ∫ 0 ∞ P M ( t ) P X ( t ) d t , (D1) wobei Pm(T) ist die Wahrscheinlichkeit, dass die erste Mutante während des Intervalls [t,t + dt) nach dem Auftreten des Chromosoms und Px(T) ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Plasmid während seines selektiven Sweeps in die mutierte Abstammungslinie überführt wird, vorausgesetzt, der Sweep begann im Intervall [t,t + dt).

In Ermangelung eines triftigen Grundes für eine komplexere Annahme gehen wir davon aus, dass neue Mutationen als Poisson-Prozess mit einer konstanten Rate σ in der Population ankommen. Dann gilt P M ( t ) = e − σ t . (D2)

Berechnen Px(T) verwenden wir das folgende Modell. Betrachten Sie eine lokal angepasste Population mit fester Dichte n in einem Band V, damit es NV Bakterien vorhanden. Die Population besteht zunächst aus Bakterien, die das fokale Gen auf einem Plasmid tragen, die eine Dichte haben P(T) zum Zeitpunkt T, und Bakterien, die das fokale Gen auf ihrem Chromosom tragen, die eine Dichte haben C(T). Wir nehmen an, dass alle Fitnesseffekte multiplikativ sind, dass der Fitnessvorteil des fokalen Gens β beträgt und dass die Fitnesskosten des Plasmids α betragen. Dann weisen die chromosomalen und die Plasmid-tragenden Populationen Wachstumsraten von ψ(1 + β) bzw. ψ(1 + β)(1 − α) auf. Nach dem Auftreten einer Mutante verfolgen wir die Mutantendichte in der Population als m(T), und wir gehen davon aus, dass die Mutation, die sie trägt, einen Fitnessvorteil mit sich bringt B, was eine Wachstumsrate von ψ(1 + B), da es weder das fokale Gen noch das Plasmid trägt. Der Einfachheit halber vernachlässigen wir die Segregation, die die qualitativen Ergebnisse nicht ändert. Die Werte dieser Parameter werden durch die folgenden Annahmen eingeschränkt:

Der Fitnessnutzen des fokalen Gens ist größer als die Fitnesskosten des Plasmids: β > α/(1 – α).

Der Fitnessvorteil der neuen Mutation ist größer als der des fokalen Gens (so dass das fokale Gen zur Fixierung geht): B >β.

Die Konsequenz des Stewart- und Levin-Kriteriums: Das Plasmid konnte nicht in Konkurrenz mit der chromosomalen Version bestehen, indem es seine Fitnesslast durch Transfer ausgleicht: γn < α(1 + β).

Um Änderungen in den Dichten (nachverfolgt durch Großbuchstaben) von Plasmidträgern, Chromosomen und Mutanten (ohne Berücksichtigung von Transkonjuganten für den Moment) zu modellieren und eine konstante Populationsgröße einzuschränken, gilt d P ( t ) dt = [ Ψ ( 1 − α ) ( 1 + β ) − Ψ ¯ ] P + γ PC (D3) d C ( t ) dt = [ Ψ ( 1 + β ) − Ψ ¯ ] C − γ PC (D4) d M ( t ) dt = [ Ψ ( 1 + b ) − Ψ ¯ ] M , (D5) wobei Ψ ¯ ( t ) = Ψ [ ( 1 − α ) ( 1 + β ) P ( t ) + ( 1 + β ) C ( t ) + ( 1 + b ) M ( t ) ] ∕ N ist die gewichtete durchschnittliche Wachstumsrate der Bevölkerung zu diesem Zeitpunkt T und wird von den individuellen Wachstumsraten abgezogen, um eine konstante Populationsgröße beizubehalten.

Wir nehmen an, dass das Chromosom bei erscheint T = 0 in einem einzelnen Bakterium entspricht dies einer Anfangsdichte von C(0) = 1/V. Nach dem Auftreten des Chromosoms, aber bevor eine Mutante in die Population eintritt, betrachten wir nur die Häufigkeiten der chromosomalen und Plasmid-tragenden Typen. Während dieser Zeit verfolgen wir die Häufigkeit des Plasmid-tragenden Typs, P = P/(P + C), die aus (D3) und (D4) berechnet werden kann als d p ( t ) d t = [ γ N − Ψ α ( 1 + β ) ] p ( 1 − p ) . (D6)

Dies hat die Lösung p ( t ) = ( N V − 1 ) e [ γ N − Ψ α ( 1 + β ) ] t 1 + ( N V − 1 ) e [ γ N − Ψ α ( 1 + β ) ] t . (D7)

Angenommen, die Mutante erscheint zu einem bestimmten Zeitpunkt T = T*. Zum Zeitpunkt des Auftretens der Mutante werden die Dichten der Plasmidträger, Chromosomen bzw. Mutanten in der Population durch P ( t ∗ ) = ( N − 1 ∕ V ) p ( t ∗ ) (D8 ) C ( t ∗ ) = ( N − 1 ∕ V ) ( 1 − p ( t ∗ ) ) (D9) M ( t ∗ ) = 1 ∕ V , (D10) wobei P(T*) ist gegeben durch (D7). Nach dem Auftreten der Mutante wird die Dynamik dieser drei Populationen durch die Gleichungen D3, D4 und D5 gegeben. Diese Dynamik besteht aus einer Zunahme der Mutantenzahl (dem selektiven Sweep), während die Zahl der Plasmidträger und Chromosomen abnimmt.

Wir wollen rechnen Px, die Wahrscheinlichkeit, dass das Plasmid mindestens einmal auf die mutierte Population übertragen wird, wodurch eine Transkonjugante entsteht, bevor die Plasmidträger aussterben. Wir verwenden die erwartete Anzahl von Transkonjuganten, die während des Sweeps erzeugt werden, um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass während des Sweeps mindestens eine Transkonjugante produziert wird. Die momentane Rate des Auftretens von Transkonjuganten während dieses Sweeps beträgt γP(T)m(T), so x(T*), die erwartete Anzahl von Transkonjuganten in einem selektiven Sweep beginnend zum Zeitpunkt T = T*, ist gegeben durch X ( t ∗ ) = γ ∫ t ∗ ∞ P ( s ) M ( s ) d s , (D11) wobei P(S) und m(S) werden berechnet, indem die Gleichungen D3, D4 und D5 integriert werden, beginnend bei T*, mit den Anfangsbedingungen der Gleichungen D8, D9 und D10. Die Wahrscheinlichkeit Px(T*) dass mindestens eine Transkonjugante erscheint, dann in einem selektiven Sweep beginnend mit der Zeit T*, ist gegeben durch P X ( t ∗ ) = 1 − e − X ( t ∗ ) . (D12)

Einsetzen von (D2) und (D12) in (D1) gilt PR = ∫ 0 ∞ σ e − σ t [ 1 − e − X ( t ) ] dt = ∫ 0 ∞ σ e − σ t [ 1 − e − γ ∫ t ∞ P ( s ) M ( s ) ds ] dt . (D13)

Zum Schluss berechnen TP aus Gleichung 11 brauchen wir Ausdrücke für Tein und TF. Angenommen, in einer Population, die für die Plasmid-getragene Version des Gens fixiert ist, erscheinen Chromosomen als Poisson-Prozess mit einer Rate χ, Tein = 1/χ. TF kann angenähert werden, indem angenommen wird, dass das Chromosom fixiert, da in diesem Fall kein selektiver Sweep stattfindet, TF ist einfach die Zeit, die benötigt wird, um die Anzahl der Chromosomen von 1 auf > . zu erhöhen n − 1 oder äquivalent, damit die Häufigkeit der Plasmidträger von 1 − 1/n zu <1/N. Dies kann berechnet werden aus (D7) durch Einstellung P(TF) = 1/n in (D7) und auflösen nach TF. Dies ergibt T f = 2 ln ( N V − 1 ) α ( 1 + β ) − γ N . (D14)

Anmerkung zur Berechnung: (D3, D4 und D5) sind nicht analytisch lösbar (H ofbauer und S igmund 1988). Sie lassen sich jedoch leicht durch numerische Integration lösen. Die Häufigkeit von Plasmid-tragenden Zellen wird immer mindestens so schnell wie in (D7) zurückgehen, da Mutanten, falls sie auftreten, nur den Rückgang des Plasmids beschleunigen (Transkonjuganten ignorieren).

Daher ist es sinnvoll, die Integration bei zu beenden TF, der Zeitpunkt, zu dem die Zahl der Plasmid-tragenden Zellen <1 ist. Für Rechenzwecke gilt also TF kann sicher als obere Grenze beider Integrale (ersetzen von ∞) in (D13) verwendet werden.


Schau das Video: What is a Plasmid? - Plasmids 101 (Kann 2022).