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Können Neutrophile Bakterien in anderen Zellen abtöten?

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Sind Neutrophile in der Lage, in Epithelzellen einzudringen, um Bakterien abzutöten? Selbst wenn ein Bakterium in die Epithelzellen eindringt, können daher die Neutrophilen in das Epithel eindringen, um die Bakterien abzutöten?

Auch wenn die Bakterien in den Blutkreislauf gelangen, können Neutrophile die Bakterien abtöten?

Ich habe keinen biologischen Hintergrund. Eine einfache Erklärung ist also hilfreich


Sind Neutrophile in der Lage, in Epithelzellen einzudringen, um Bakterien abzutöten? Selbst wenn ein Bakterium in die Epithelzellen eindringt, können daher die Neutrophilen in das Epithel eindringen, um die Bakterien abzutöten?

Nein. Erstens, weil Bakterien (außer in ganz besonderen Fällen) nicht in Epithelzellen (oder andere) eindringen - das ist es, was Viren tun. Zweitens erkennen Neutrophile Bakterien anhand von Markern an ihrer Zellwand. Diese Marker können von den Bakterien selbst oder vom angeborenen Immunsystem (siehe Komplementsystem) stammen, das die Bakterien "markiert". Fälle wie diese werden von den CD8+ T-Zellen des adaptiven Immunsystems behandelt.

Auch wenn die Bakterien in den Blutkreislauf gelangen, können Neutrophile die Bakterien abtöten?

Jawohl, das ist ihre Aufgabe und Neutrophile befinden sich normalerweise im Blut(strom), sodass sie dort Bakterien finden und abtöten können.


Menschliche Neutrophile töten Bacillus anthracis

Bacillus anthracis Sporen verursachen natürliche Infektionen und werden als biologische Waffen eingesetzt. Inhalationsinfektion mit B. anthrazit, der ätiologische Erreger von Milzbrand, ist fast immer tödlich, dennoch bleiben Hautinfektionen gewöhnlich lokalisiert und klingen spontan ab. Neutrophile werden typischerweise für kutane, aber selten für andere Formen von Milzbrandinfektionen rekrutiert, was die Möglichkeit erhöht, dass Neutrophile abtöten B. anthrazit. In dieser Studie infizierten wir menschliche Neutrophile entweder mit Sporen oder vegetativen Bakterien eines Wildtyp-Stamms oder mit Stämmen, die nur einen der beiden Hauptvirulenzfaktoren exprimieren. Die menschlichen Neutrophilen verschlungen B. anthrazit Sporen, die intrazellulär keimten und dann effizient abgetötet wurden. Interessanterweise war die Abtötung von Neutrophilen unabhängig von der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. Wir fraktionierten einen humanen Neutrophilen-Granula-Extrakt mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und identifizierten α-Defensine als die verantwortliche Komponente für B. anthrazit Tötung. Diese Daten legen nahe, dass die rechtzeitige Rekrutierung von Neutrophilen Hautinfektionen und möglicherweise andere Formen von B. anthrazit Infektionen, und dass α-Defensine eine wichtige Rolle bei der wirksamen Anti-B. anthrazit Aktivität von Neutrophilen.


NET-Grundlagen

Neutrophile sind wichtig für die Immunabwehr und die Vorbeugung von mikrobieller Überwucherung. Sie sind sehr reichlich vorhanden – etwa 100 Milliarden werden an einem einzigen Tag im Knochenmark eines Menschen produziert – und sie zirkulieren im Blutkreislauf, um schnell Gewebe zu infiltrieren, wenn die Neutrophilen eine mikrobielle Bedrohung erkennen. Sie gehören zu einer Klasse von weißen Blutkörperchen, die Granulozyten genannt werden, und sind durch ein Zytoplasma gekennzeichnet, das mit Körnchen gefüllt ist, die antimikrobielle Proteine ​​​​enthalten. Neutrophile können Krankheitserreger verschlingen und dann ihre Körnchen mit ihren Phagosomen verschmelzen, die die internalisierten Mikroben enthalten. Alternativ können die Zellen ihre Granula mit der Plasmamembran verschmelzen, um antimikrobielle Mittel freizusetzen, um extrazelluläre Parasiten anzugreifen.

Die Erforschung von Neutrophilen wird durch die Tatsache erschwert, dass es sich um kurzlebige Zellen handelt. Im Gegensatz zu einigen anderen menschlichen Zelltypen können Neutrophile beispielsweise nicht länger als ein paar Stunden kultiviert werden, und sie sind nicht der Gen-Editierung zugänglich. Aus diesem Grund fehlt uns noch ein detailliertes mechanistisches Bild davon, wie genau NETs gebildet werden. Frühe Berichte bestätigten die ursprüngliche Hypothese, dass NETs nicht aus einer passiven Nekrose von Neutrophilen resultieren. Spätere Studien fügten die Komplexität hinzu, indem sie zeigten, dass verschiedene Entzündungsauslöser verschiedene Wege induzieren, die alle zur Freisetzung von NETs führen, und dass die NET-Freisetzung nicht immer zur Lyse der Neutrophilen führt.

Allerdings töten die meisten Wege der NET-Bildung die Immunzelle, typischerweise als Folge der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Bakterielle oder pilzliche Pathogene bewirken, dass Neutrophile Kinasen aktivieren, die den Aufbau eines Enzymkomplexes namens Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase induzieren. Die NADPH-Oxidase produziert dann große Mengen an Superoxid – einer hochreaktiven Sauerstoffverbindung, die ein zusätzliches Elektron trägt – während eines Prozesses, der als oxidativer Ausbruch der Neutrophilen bezeichnet wird. ROS, die aus dem oxidativen Burst resultieren, lösen den Zerfall eines Multiproteinkomplexes aus, um aktives NE, eine Hauptkomponente von NETs, ​​in das Zytoplasma freizusetzen. (Siehe Abbildung auf Seite 45.)

NE wandert dann zum Kern des Neutrophilen, wo es Histone und andere Proteine ​​spaltet, um das Chromatin zu dekondensieren. Schließlich füllt das Chromatin die gesamte Zelle auf, bis die Zelle lysiert und das NET in den extrazellulären Raum extrudiert, ein Prozess, der als NETose bekannt ist. Wir haben kürzlich eine wichtige Rolle des porenbildenden Proteins Gasdermin D sowohl bei der Kernexpansion als auch bei den Lyseprozessen identifiziert, obwohl die Mechanismen noch nicht klar sind. Im extrazellulären Raum sollen die Netze die auslösenden Krankheitserreger einfangen und abtöten.


Rezension

Neutrophile Funktion gegen mikrobielle Infektion

Neutrophile schützen den Körper an vorderster Front vor einer mikrobiellen Infektion. Sobald die bakterielle oder Pilzinfektion etabliert ist, werden Neutrophile innerhalb von Stunden aus dem Knochenmark in den Blutkreislauf abgegeben und wandern dann nach den Chemoattraktanten in die extravaskuläre Infektionsstelle. Gewebeneutrophile werden durch die entzündlichen Zytokine, Komplemente und andere entzündungsfördernde Mediatoren aktiviert. An der infektiösen Stelle nehmen Neutrophile Mikroorganismen auf und verdauen sie, was als Phagozytose bekannt ist, und dieser Prozess wird als die wichtigste Rolle der Neutrophilen bei der Wirtsabwehr angesehen. Neutrophile phagozytieren und verschlingen Mikroben in Phagosomen, die schnell mit den Granula verschmelzen, die die toxischen Moleküle, Phospholipasen, ROS und Proteasen enthalten, einschließlich Lysozym, bakterizides permeabilitätssteigerndes Protein (BPI), Defensine und Cathelicidine[8] (Abbildung 1).

Phasenkontrastmikroskopische Ansicht der Phagozytose (Objektiv × 40). Phagozytiert Escherichia coli werden in Vakuolen visualisiert, die als Phagolysosomen bekannt sind (Pfeile). Maßstabsleiste repräsentiert eine Länge von 10 µm.

Neutrophile sind von Natur aus kurzlebig, etwa 5–6 Tage, und unterliegen einer spontanen Apoptose[9]. In infizierten Geweben kann deren Apoptose sowohl durch mikrobielle Bestandteile als auch durch proinflammatorische Stimuli verzögert werden[10, 11]. Im Allgemeinen sterben die Gewebeneutrophilen bei der Apoptose, wenn die Infektion jedoch ernst genug ist, erleiden einige eine Nekrose oder andere Arten des Zelltods. Mit Ausnahme des apoptotischen und autophagischen Zelltods kann die unkontrollierte Freisetzung toxischer Substanzen aus den toten Neutrophilen die Entzündungsreaktion fortpflanzen, die zu Gewebeschäden führt. Daher ist es für die Aufrechterhaltung der Homöostase von entscheidender Bedeutung, den unprogrammierten Tod und das Abfangen der sterbenden Neutrophilen zu vermeiden[12, 13]. Um die Entzündung zu beenden, ist es nicht nur notwendig, die Bildung entzündungshemmender Mediatoren abzuschwächen, sondern auch die Entzündungszellen zusammen mit den aufgenommenen Mikroben zu entfernen [14].

Nekrose

Induktion von Nekrose

Die meisten Neutrophilen durchlaufen eine Apoptose, nachdem sie den peripheren Kreislauf ohne Infektion verlassen haben [15]. Wenn die Apoptose in geordneter Weise abläuft, nehmen Gewebemakrophagen und andere Phagozyten die apoptotischen Körper auf, die potentiell schädliche granuläre Enzyme enthalten. Im Gegensatz dazu ist die Nekrose ein turbulenter Zelltod. Wird dieser versehentliche Zelltod durch unerwartete Ereignisse ausgelöst, werden toxische Bestandteile wie proteolytische Enzyme und Oxidationsmittel erzeugende Enzyme unreguliert aus den nekrotischen Zellen freigesetzt. Neutrophile Nekrose ist wahrscheinlich eine der Hauptursachen für Gewebeschäden während einer Infektion[16], aber es ist wenig darüber bekannt, wie sie Nekrose durchlaufen, und es gibt keine einfache Methode, um die Nekrose von Neutrophilen nachzuweisen.

Reaktion auf Nekrose

Nekrotische Zellen setzen eine Vielzahl von Gefahrensignalen frei, die als schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) bekannt sind, wie zum Beispiel High-Mobility Group Box 1 (HMGB1), Harnsäure, Hitzeschockproteine, DNA-Chromatin-Komplexe und antimikrobielle Peptide. Viele dieser Substanzen werden von spezifischen Rezeptoren erkannt, die als Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) bezeichnet werden und stimulieren die Synthese entzündungsfördernder Mediatoren. Beispielsweise wird HMGB1, ein nukleäres Protein, das an DNA bindet und die Gentranskription reguliert, aus den nekrotischen Zellen freigesetzt und stimuliert nachweislich die inflammatorische Zytokinsekretion durch Monozyten[17]. Harnsäure und ihre aktive Form, Mononatriumurat (MSU), werden unter Entzündungsstimulation in das zytosolische Kompartiment freigesetzt. MSU hat in letzter Zeit als starker Induktor von Entzündungsreaktionen Aufmerksamkeit erregt [18]. Es wurde auch gezeigt, dass DNA-Chromatin-Komplexe[19] und Hitzeschockproteine[20, 21] die entzündungsfördernde Zytokinproduktion stimulieren[22]. Da bekannt ist, dass PRRs die molekularen Muster von Mikroorganismen und ihren verwandten Produkten erkennen, wird der als Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) bekannte intra- und extrainflammatorische Stimulus bei der Sepsis durch ähnliche Rezeptoren vermittelt. PAMPs sind gemeinsame Bestandteile vieler Mikroben, beispielsweise Lipopolysaccharid, Peptidoglycan und Flagellin, die bakteriellen Ursprungs sind, sowie RNA und DNA, die viralen oder bakteriellen Ursprungs sein können. Bei den PRRs ist der Toll-like-Rezeptor (TLR) der bekannteste, und mehr als zehn Subtypen wurden beim Menschen identifiziert. Unter ihnen ist TLR-3 ein Rezeptor für virale doppelsträngige RNA, der es Makrophagen ermöglicht, Nebenprodukte von nekrotischen Neutrophilen zu erkennen und dadurch die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen zu stimulieren[23].

Das Auftreten von nekrotischen Neutrophilen

Nekrotische Neutrophile haben ein geschwollenes Zytoplasma mit einem nicht abgelagerten Kern. Unter serieller Beobachtung wurde der erste Schritt der morphologischen Veränderung im Kern beobachtet, d. h. gelappte Kerne (Abbildung 2a) verschmolzen und verwandelten sich in eine große runde Struktur (Abbildung 2b). Im zweiten Schritt wurden Ballonbildung der Zelle und Membranzerfall erkannt (Abbildung 2c). Dies waren jedoch nicht die primären morphologischen Veränderungen, da viele der Neutrophilen anfänglich eine Apoptose durchlaufen. Wenn die Beleidigung jedoch schwerwiegend genug ist, verwandeln sich einige Neutrophile unter dem Weg der Apoptose in Nekrose, und dieser Stil wird als „sekundäre Nekrose“ bezeichnet[24]. Im späten Stadium der Nekrose war, obwohl die Kernmembran intakt schien, das Chromatin dekondensiert und der Kerninhalt ist in das Zytoplasma ausgeströmt, und dieses Ereignis wurde unter der immunfluoreszenzmikroskopischen Beobachtung als Färbung des Zytoplasmas erkannt (Abbildung 3, Mitte). ). Die Zellnekrose führt schließlich zur Permeabilisierung der zytoplasmatischen Membran und zum Zellzerfall (offene Autolyse) mit Austritt von Zellinhalt[25].

Morphologische Veränderungen bei nekrotischen Neutrophilen. Zeitrafferaufnahmen der Neutrophilen. Nekrose wurde durch Lipopolysaccharide induziert in vitro. Der gelappte Kern (Pfeil) (ein) verschmolzen und wurde zu einer runden mononuklearen Zelle (B). Die nekrotischen Zellen beeinträchtigen die Zellmembran, die das Anschwellen der Zellen ermöglicht (C). Maßstabsleiste repräsentiert eine Länge von 10 µm.

Immunfluoreszenzfärbung von nekrotischen Neutrophilen. Hellfeld (linkes Feld) und Überlagerung (mittleres Panel) Bilder, die die DNA-Verteilung in Maus-Neutrophilen zeigen, die durch Lipopolysaccharid stimuliert wurden. Bei den nekrotischen Neutrophilen (weiße Pfeile), DNA breitet sich im Zytoplasma aus und wird durch ID-Rot (rot), während andere Zellen die Körnchen behalten und die DNA in den Kernen (schwarze pfeile). Die rechte Tafel zeigt das kombinierte Bild der ausgewählten Zellen. Mikroskopische Bilder wurden 3 h nach der Stimulation aufgenommen. Alle Maßstabsleisten 20 µm Länge darstellen.

Apoptose

Induktion der Apoptose

Im Gegensatz zur Nekrose, die eine passive Folge von Ereignissen ist, die zum Zerfall der Kernhülle und der zytoplasmatischen Membranen führt, stellt die Apoptose einen hoch organisierten programmierten Zelltod dar[26]. Die Fähigkeit, Zellen eher durch Apoptose als durch Nekrose zu eliminieren, ist für den Wirt günstig, da die geordnete Zellelimination das Ausmaß des Zelltods und der Entzündung begrenzen kann, die durch die unkontrollierte Freisetzung toxischer Neutrophilenprodukte während der Nekrose verursacht werden. Die Apoptose wird entweder durch einen intrinsischen oder einen extrinsischen Weg eingeleitet. Der intrinsische Weg wird durch verschiedene schädliche Reize aktiviert und beinhaltet die Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien in das Cytosol[27]. Diese Freisetzung löst die Aktivierung intrazellulärer Caspasen aus, die für die Spaltung von DNA und strukturellen zytoplasmatischen Proteinen verantwortlich sind[28]. Der zweite, extrinsische Apoptoseweg wird durch die Bindung extrazellulärer Liganden wie Tumornekrosefaktor (TNF)-α oder Fas-Ligand (FasL) an spezifische TNF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche ausgelöst[29]. Die Bindung dieser Liganden erzeugt dann ein Transmembransignal, um die Caspase-Sequenz zu aktivieren. Bei Neutrophilen ist der Zeitpunkt der Apoptose streng reguliert. Insbesondere neutrophile Granulozyten werden innerhalb von 24–48 h nach Verlassen des systemischen Kreislaufs auf eine Apoptose vorbereitet, aber der genaue Zeitpunkt, zu dem dies eintritt, wird von mehreren Faktoren beeinflusst[30, 31].

Das Auftreten von apoptotischen Neutrophilen

Nachdem sie ihren Zweck an einer Infektionsstelle erfüllt haben, durchlaufen Neutrophile Apoptose und entsorgen Zellen effizient durch Aufnahme durch Makrophagen[32, 33]. Morphologische Merkmale der Apoptose umfassen die Kondensation von Chromatin (Abbildung 4a) und seine Wanderung in die Kernperipherie (Abbildung 4b), die Fragmentierung der nuklearen DNA und das Ausblasen von Zellmembranen, wodurch apoptotische Körper (Abbildung 4c) gebildet werden, die für die Aufnahme durch die benachbarten . bereit sind Fresszellen[32, 34].

Morphologische Veränderungen bei apoptotischen Neutrophilen. Zeitrafferaufnahmen der Neutrophilen. Frühe apoptotische Morphologie mit einem durch Lipopolysaccharid induzierten kondensierten Kern (Pfeil) (ein). Roundup-Zelle mit perinukleärer Chromatin-Aggregation, aber Zytoplasma-Integrität (B). Im späten Stadium der Apoptose kollabiert der Kern und die zytoplasmatischen Granula sind dicht gepackt. Schließlich werden Blasen von der Plasmamembran gebildet (C). Maßstabsleiste repräsentiert eine Länge von 10 µm.

Autophagie

Autophagie ist ein homöostatischer Mechanismus, der an der Beseitigung geschädigter Organellen und am zellulären Überleben unter bestimmten Belastungen oder Nährstoffmangel beteiligt ist, um durch das Recycling der zytosolischen Organellen essentielle Nährstoffe und Proteine ​​bereitzustellen[35]. Die Bedeutung der Autophagie für die angeborene Immunität muss noch geklärt werden, aber eine mögliche Erklärung für die aktivierte Autophagie während der Sepsis besteht darin, dass der autophagische Prozess zur Entfernung intrazellulärer Pathogene (Xenophagie) während der Sepsis führt [36, 37]. Über die Regulation der Autophagie durch Aktivierung von ROS, TLR und entzündlichen Zytokinen wie TNF-α und Interferonen wurde berichtet[38–40]. Die TLR-Aktivierung führt nicht zu einem übermäßigen oxidativen Burst, aber die Hemmung der Apoptose führt zur Induktion von Autophagie[41, 42]. In Anbetracht der regulatorischen Rolle der Apoptose im Entzündungsprozess verstärkt die überlebensfördernde Induktion der Autophagie bei Neutrophilen die Entzündungsreaktionen durch Verzögerung des Zelltods und könnte an der Pathogenese der Sepsis im Zusammenhang mit der Unterdrückung der Apoptose beteiligt sein, was zu Gewebeschäden führt. Wie bereits erwähnt, ist die Autophagie im Grunde der Überlebensmechanismus von Zellen, jedoch führt die Autophagie bei übermäßiger Belastung zum autophagischen Zelltod. Morphologische Merkmale dieses Zelltods umfassen Vakuolisierung, Abbau des zytoplasmatischen Inhalts und fehlende Chromatinkondensation. Zellen, die einem autophagischen Zelltod unterliegen, können von benachbarten Zellen internalisiert werden. Daher wird diese Art des Zelltods als nicht-entzündliche Form angesehen[43].

NETose

Induktion von NETose

Der Begriff „NETose“ für den Neutrophilenzelltod führt zur Bildung von NETs. NETose ist der dritte programmierte Zelltod von Neutrophilen, der sich stark von anderen Arten des Zelltods unterscheidet. Unter den Umständen einer bakteriellen, pilzlichen oder parasitären Infektion können mikrobielle Komponenten wie Lipopolysaccharid und Lipoteichonsäure sowie ROS einschließlich Wasserstoffperoxid besondere morphologische Veränderungen bei Neutrophilen hervorrufen[44]. Eine schnelle NET-Bildung wird auch durch über TLR-4 aktivierte Blutplättchen induziert[45]. Ebenso werden Alarmine wie Hitzeschockproteine, HMGB1, sowie RNA und DNA des Wirts als Initiatoren der NETose nachgewiesen. In Bezug auf PRRs werden RNA und DNA von TLR-9 erfasst[46], während Histone von TLR-2 und TLR-4 erfasst werden[47].

Mechanismen der NETose

Unter einer bestimmten Stimulation wird im ersten Schritt ROS aktiviert, dann wandern neutrophile Elastase (NE) und Myeloperoxidase (MPO) von den Granula in den Zellkern, und schließlich führt die Verarbeitung von Histonen zum Aufbrechen der Zelle. Einer der häufigsten Induktoren der NETose ist Phorbolmyristatacetat (PMA), das direkt die Proteinkinase C (PKC) stimuliert und anschließend zur Produktion von ROS führt. Eines der charakteristischen Erscheinungsbilder der NETose ist das homogene Nukleoplasma, und diese Veränderung hängt von der Aktivität von NE und MPO ab. NE wird zunächst in azurophilen Granula im Zytosol gespeichert. Nach der Stimulation wird NE aus den Granula freigesetzt und dringt in den Zellkern ein, wo es den Linker Histon H1 abbaut und Kernhistone verarbeitet[48]. MPO wandert auch in den Zellkern und fördert die Chromatindekondensation. Somit kooperieren NE und MPO, um weitere Histonmodifikationen zu durchlaufen, um die Chromatinstruktur zu dekondensieren. Schließlich werden NETs schnell entfernt, sobald die Infektion behoben ist. NETs sind anfällig für DNase1[49] und die von DNase1 hinterlassenen Trümmer werden von Makrophagen und Neutrophilen beseitigt, die an die Entzündungsstelle rekrutiert werden[50].

Die Rolle von NETs

Eine der Hauptaufgaben von Neutrophilen ist die Eliminierung von Mikroorganismen. Zu diesem Zweck wird von NETs erwartet, dass sie Mikroben einfangen und ihre Verbreitung in das zirkulierende Blut verhindern. Auch die Inaktivierung der Virulenzfaktoren und die Abtötung von Krankheitserregern werden gefordert. Das Einfangen von Mikroben, höchstwahrscheinlich durch Ladungswechselwirkung,[51] verhindert ihre Verbreitung und schließt sie am ursprünglichen Infektionsort ein. Interessanterweise Gruppe A Streptococcus pyogenes[52], Pneumokokken und Staphylococcus aureus[53] sind in der Lage, sich von NETs zu befreien, da sie für Endonukleasen kodieren. Tatsächlich ist die Expression von DNase essentiell für die Pathogenität dieser Bakterien[52]. Anders als DNA enthalten NETs mehrere Proteine, die für Mikroben toxisch sind. Dazu gehören Lysozym, antimikrobielle Peptide, Ionenchelatoren (Calgranulin) und Histone. Die antimikrobielle Aktivität von NETs ist wahrscheinlich das Ergebnis der Kombination dieser Komponenten. Ihre Wirkung wird durch die Kombinationsarbeit und die erreichten hohen lokalen Konzentrationen an NET verstärkt. MPO auf NETs ist auch wichtig, um Mikroben abzutöten. Die antimykotische Aktivität von NETs wurde Calgranulin zugeschrieben[51]. Histone sind die wichtigsten toxischen Komponenten von NETs, ​​jedoch ist der Mechanismus der Histontoxizität kaum bekannt. Bei schwerer Sepsis können extranukleäre Histone im zirkulierenden Blut nachgewiesen werden, die während der NETose reichlich freigesetzt werden[51]. Da zirkulierende Histone auch für die Wirtszellen schädlich sind[54], sind Histone das Ziel der neuen Therapiestrategie.

Das Auftreten von NETs

NETs sind im Lichtmikroskop kaum zu sehen. Sie sehen nur aus wie Ablagerungen der toten Zellen (Abbildung 5, linkes oberes Feld). Im Allgemeinen ist NETose morphologisch durch den Verlust intrazellulärer Membranen gekennzeichnet, bevor die Integrität der Plasmamembran beeinträchtigt ist[55]. Die elektronenmikroskopisch beobachtete Struktur von NETs ist ziemlich einzigartig NETs bestehen aus netzartigen Filamenten von Nukleosomen mit einem Durchmesser von ca. 17 nm und bolzenartigen Komponenten granulärer Proteine ​​mit einem Durchmesser von ca. 50 nm[51]. Diese Morphologie in der Rasterelektronenmikroskopie unterscheidet NETs leicht von anderen Faserstrukturen wie Fibrin. Unter Immunfluoreszenzmikroskopie werden NETs als wolkenartige Strukturen visualisiert, die die toten Neutrophilen umgeben (Abbildung 5, untere Felder). Der zeitliche Verlauf der NETosis ist wie folgt: Minuten nach der Aktivierung sind die Neutrophilen abgeflacht und in der nächsten Stunde fest mit dem Substrat verbunden, der Kern verliert seine Läppchen (Abbildung 6a) und das Chromatin dekondensiert (Abbildung 6b) nach mehreren Stunden, der Kern Hülle zerfällt in Vesikel (Abbildung 6c) und das Nukleoplasma wird homogen (Abbildung 6d) und schließlich reißt die Zellmembran und das Innere der Zelle wird in den extrazellulären Raum ausgestoßen (Abbildung 6e), wodurch NETs gebildet werden (Abbildung 6f).

Immunfluoreszenzfärbung von NETs. Das Hellfeld (linkes oberes Panel) Ansicht der durch 10 nM PMA induzierten NETose. Immunfluoreszenzfärbung durch Propidiumjod visualisiert DNA, die aus den Neutrophilen ausgestoßen wurde (linkes unteres Panel, gleiches Feld wie oben). Phasenkontrastansicht der durch PMA stimulierten Neutrophilen (rechtes oberes Panel) und das Overlay-Bild (rechte untere Platte) zeigt die DNA-Verteilung (rot). Pfeile zeigen die ausgestoßene DNA an. Alle Maßstabsleisten 20 µm Länge darstellen.

Morphologische Veränderungen bei NETose. Zeitrafferaufnahmen der Neutrophilen. Der Kern verliert seine Läppchen (ein), das Chromatin dekondensiert (B), die Kernhülle zerfällt (C), wird das Nukleoplasma homogen (D), die Zellmembran reißt und das Zellinnere wird herausgeschleudert (Pfeilspitze) (e)und Chromatine (Pfeile) werden vertrieben (F). NETose wurde durch 10 nM PMA induziert. Maßstabsleiste repräsentiert eine Länge von 10 µm.

Neutrophiler Zelltod und Gerinnung

Es besteht allgemein Einigkeit darüber, dass sich während einer Sepsis eine Gerinnungsstörung entwickelt und zu einer unangemessenen intravaskulären Thrombusbildung führt. Im Gegensatz dazu wird noch diskutiert, ob die Koagulopathie eine pathogene Rolle beim Fortschreiten der Sepsis spielt oder nur eine Reaktion auf den Insult ist. Diese Debatte ist noch nicht schlüssig, da die Ergebnisse der klinischen Studien mit Antikoagulanzien widersprüchlich sind [56–59].

Einer der Zwecke dieser Übersicht ist es, aufzuklären, dass der Tod von Neutrophilen mit der Aktivierung der Gerinnung zusammenhängt. Tatsächlich ist die Tatsache, dass die Aktivierung des Gerinnungssystems eine wesentliche angeborene Immunantwort darstellt, die die mikrobielle Ausbreitung einschränkt, ein weltweiter Konsens[60]. Monozyten/Makrophagen werden weithin als Hauptakteure im Prokoagulans-Prozess akzeptiert, neuere Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass auch Neutrophile eine wichtige Rolle spielen. Einer der Mechanismen wird durch den Gewebefaktor erklärt, der auf der Oberfläche der sterbenden Neutrophilen[61] sowie auf Mikropartikeln, die von Neutrophilen stammen,[62] exponiert ist. Von Neutrophilen abgeleitete Proteinasen wie Elastase und Cathepsin G aus den toten Neutrophilen tragen ebenfalls dazu bei. Diese Proteasen spalten den Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)[63] und Antikoagulanzien wie Antithrombin und aktiviertes Protein C[64]. Abgesehen von diesen Quellen bieten NETs auch prokoagulierende Aktivitäten. Während der Sepsis sammeln sich Neutrophile an und haften fest am Endothel. Dort vertreiben Neutrophile NETs, ​​die als Gerüst für die Thrombusbildung dienen[65] (Abbildung 7). Serinproteasen in Neutrophilen wie NE und Cathepsin G bauen physiologische Gerinnungshemmer wie Antithrombin ab und beschleunigen die Gerinnung. Die Hauptkomponenten von NETs, ​​Chromatin und Histone, sind die starken Initiatoren der Gerinnung [54, 66]. Diese Phänomene weisen darauf hin, dass die Gerinnselbildung durch NETs verstärkt wird. Abgesehen davon exprimieren NETs hohe Mengen an Gewebefaktor. Die Freisetzung von Gewebefaktor-tragenden NETs an den Entzündungsherden kann zu einer lokalisierten Aktivierung der Gerinnungskaskade führen[67]. Heute wissen wir, dass zahlreiche Neutrophile rekrutiert werden und an das vaskuläre Endothel haften und eine wichtige Rolle bei der Thrombusbildung spielen. Dort kooperieren aktivierte Thrombozyten mit Neutrophilen, um ebenfalls NET zu bilden[68, 69].

NETose und Mikrothrombusbildung bei Sepsis. Mikroben aktivieren die Neutrophilen. Aktivierte Neutrophile aktivieren die Blutplättchen und das Gerinnungssystem, indem sie Mikropartikel, Kernkomponenten und granuläre Proteine ​​ausstoßen. Gleichzeitig sammeln sich Neutrophile an und haften in Zusammenarbeit mit Blutplättchen während der Sepsis am Endothel. Dort vertreiben Neutrophile NETs, ​​die Bakterien abtöten und das Gerinnungssystem aktivieren. NETs dienen als Gerüst für die Thrombusbildung. Thromben führen im Wesentlichen zu Mikrozirkulationsschäden und dann bei einer Sepsis zu Organdysfunktionen.

Eine Thrombusbildung verursacht eine Obstruktion in der Mikrovaskulatur und induziert Gewebeischämie und -verletzung, wodurch sie zu multiplem Organversagen und Tod beiträgt. Daher sollte die Organfunktion erhalten bleiben, wenn die Mikrothrombusbildung verhindert oder abgeschaltet wird. In der Praxis gibt es jedoch in solchen Situationen vielschichtige Störfaktoren, darunter Bevölkerungsheterogenität, Komorbiditäten und Kontraindikationen für Standardtherapien. Da die Thrombusbildung ein wesentlicher Teil des Abwehrmechanismus des Wirts ist, wird darüber hinaus, wie in dieser Übersicht festgestellt, weder die bedingungslose Anwendung einer Antikoagulationstherapie noch die Modulation des Neutrophilentods für den Wirt von Vorteil sein.


Neutrophile Subpopulationen in der Gesundheit

Die bisherige Beschreibung des Lebenszyklus von Neutrophilen lässt vermuten, dass diese Zellen im Knochenmark produziert werden, in den Kreislauf gelangen, zu Infektions- oder Entzündungsherden wandern, ihre antimikrobiellen Funktionen ausführen und dann leise von geweberesidenten Makrophagen beseitigt werden. Diese einfache Ansicht, dass Neutrophile nur pathogen-tötende Zellen sind, ist weit entfernt von dem komplexen Verhalten, das Neutrophile tatsächlich zeigen. Es wurde bereits erwähnt, dass Neutrophile tatsächlich transkriptionell aktive Zellen sind, die das Potenzial haben, die Expression mehrerer Membranmoleküle zu verändern und Zytokine zu produzieren (Tecchio et al., 2014, Tecchio und Cassatella, 2016), und folglich sind Neutrophile in der Lage, unterschiedliche Leistungen zu erbringen Zellfunktionen abhängig von den Geweben, in denen sie sich befinden (Borregaard, 2010 Mayadas et al., 2014 Nauseef und Borregaard, 2014). Neutrophile scheinen also keine homogene Population zu sein, die sich immer gleich verhält. Tatsächlich wurde die Existenz mehrerer Subpopulationen von Neutrophilen bei verschiedenen Gesundheits- und Krankheitszuständen vermutet.

Neutrophile Subpopulationen im Kreislauf

Unter normalen Bedingungen bleiben Neutrophile nur wenige Stunden im Kreislauf (die Halbwertszeit wird auf 6� h geschätzt), bevor sie ins Gewebe gelangen (Summers et al., 2010). Während dieser Zeit scheinen Neutrophile ihren Phänotyp zu ändern. Betrachtet man die Neutrophilen im Kreislauf gesunder Mäuse alle 4 Stunden über einen Tag, so wurde festgestellt, dass diese Zellen ihre Morphologie und ihren Phänotyp ändern (Casanova-Acebes et al., 2013). Frisch freigesetzte Neutrophile aus dem Knochenmark durchlaufen mehrere Veränderungen, die sich ansammeln, bis die Zellen beginnen, sich aus dem Blutkreislauf in das Gewebe zu bewegen. Diese Veränderungen des Neutrophilen-Phänotyps von der Freisetzung aus dem Knochenmark (frische Neutrophile) bis zum Verlassen des Kreislaufs (gealterte Neutrophile) ohne Entzündung werden als Alterung bezeichnet (Adrover et al., 2016). Die Anzahl der gesamten Neutrophilen oszilliert zirkadian. Frische Neutrophile werden in das Blut abgegeben, wenn die Mäuse ihre Aktivitätsphase beginnen, und gealterte Neutrophile werden am Ende ihrer Ruhephase beseitigt (Casanova-Acebes et al., 2013).

Vorherige in vitro Studien zur Alterung von Neutrophilen zeigten, dass es in Zellen, die in Kultur gehalten werden, zu einer spontanen Hochregulation des Rezeptors CXCR4 kommt. Frisch isolierte Blutneutrophile zeigen diese Zunahme der CXCR4-Expression bereits nach 4 h in Kultur (Nagase et al., 2002). Wie bereits erwähnt, fungiert das Chemokin CXCL12, das von Stromazellen des Knochenmarks produziert wird, als Retentionssignal für Neutrophile. Daher wird angenommen, dass die Reexpression von CXCR4 auf Neutrophilen “seneszente” Neutrophile dazu anregt, in das Knochenmark zurückzukehren (Martin et al., 2003). Bei Mäusen mit CXCR4-defizienten myeloischen Zellen wurden jedoch keine Veränderungen der Neutrophilen-Clearance beobachtet (Eash et al., 2009), was darauf hindeutet, dass neben dem Knochenmark auch andere Organe zur Neutrophilen-Clearance beitragen (Adrover et al., 2016). Darüber hinaus regulieren Neutrophile in Kultur auch die Expression von CXCR2 herunter, was entgegengesetzte Wirkungen zu CXCR4 hat und die Freisetzung von Zellen aus dem Knochenmark fördert (Eash et al., 2010). Daher scheint es, dass diese phänotypischen Veränderungen Neutrophile darauf vorbereiten, den Kreislauf in das Gewebe zu verlassen.

In vivo Studien haben andere phänotypische Veränderungen bei Neutrophilen identifiziert. Bei Mäusen zeigten Neutrophile, die experimentell gezwungen wurden, länger im Blutkreislauf zu bleiben, eine niedrigere Expression von L-Selectin (CD62L) zusammen mit einer höheren Expression von CXCR4 (Casanova-Acebes et al., 2013). Diese gealterten Neutrophilen erschienen im Kreislauf nach zirkadianen Oszillationen im Laufe der Zeit. Ihre Zahl nahm während des Tages zu (wenn die Mäuse in Ruhe waren) und verschwanden am Abend, wenn die Mäuse ihre aktive Phase beginnen (Casanova-Acebes et al., 2013). Andere Moleküle werden auch in höheren Konzentrationen auf der Zellmembran dieser gealterten Neutrophilen exprimiert, einschließlich CD11b (αm) und CD49d (㬔), die Alpha-Untereinheiten für die Integrine Mac-1 bzw. VLA4. Diese Integrine sind an der Adhäsion an aktivierte Endothelzellen an Entzündungsstellen beteiligt. Im Gegensatz dazu war die Expression des Moleküls CD47, ein 𠇍on't eat me”-Signal für apoptotische Zellen (Jaiswal et al., 2009), auf der Membran dieser Neutrophilen reduziert. Dies würde nahelegen, dass gealterte Neutrophile leichter von Makrophagen phagozytiert werden. In einer neueren Studie wurde die Expression von CD47 jedoch nicht reduziert (Zhang et al., 2015). In jüngerer Zeit wurde auch festgestellt, dass die Oberflächenexpression anderer Moleküle in gealterten Neutrophilen erhöht ist. Einige dieser Moleküle umfassen TLR4, ICAM-1, CD11c, CD24 und CD45 (Zhang et al., 2015) (Abbildung ​ (Abbildung3). 3 ). Im Gegensatz dazu war auch der Maus-Neutrophilenmarker Ly6G in gealterten Zellen reduziert (Zhang et al., 2015) (Abbildung ​ (Abbildung3). 3 ). Zusammen mit den Veränderungen der Oberflächenexpression dieser Moleküle zeigten die Zellen morphologische Veränderungen. Gealterte Neutrophile sind kleiner, enthalten weniger Körnchen und weisen einen körnigen multilobulären Kern auf (Casanova-Acebes et al., 2013 Abbildung ​ Abbildung 3 3 ).

Phänotyp gealterter Neutrophilen. Nach Freisetzung aus dem Knochenmark exprimiert ein 𠇏resh” Neutrophiler (PMN) die Oberflächenmoleküle CD62L und CXCR4. Nach mehreren (4𠄶 h) Stunden im Kreislauf verändern Neutrophile die Expression vieler Oberflächenmoleküle. Der neue Phänotyp wird als 𠇊ged” Neutrophile beschrieben. Diese gealterten Neutrophilen werden dann durch Migration in Gewebe oder durch Rückführung in das Knochenmark aus dem Blut entfernt.

Darüber hinaus ergab eine transkriptomische Analyse alternder Neutrophilen, dass sich mehrere Signalwege von den aktiven Signalwegen in frischen Neutrophilen unterscheiden. Die Signalgebung im Zusammenhang mit Zellaktivierung, mikrobiellem Nachweis, Adhäsion, Migration und Zelltod ist verändert (Zhang et al., 2015). These changes in aged neutrophils are similar to changes in neutrophils at inflammation sites. Thus, it might be that aged neutrophils are in an activated state (Adrover et al., 2016). Together these reports suggest that neutrophils spontaneously change their phenotype in circulation, such that different surface molecules may facilitate migration into tissues. At present, it is not known how these differences in receptor expression may control neutrophil clearance into particular tissues, but a similar mechanism to the one controlling neutrophil exit from and return to the bone marrow is likely to be at work. Identifying particular neutrophil phenotypes will certainly help us understand how these cells are directed to various parts of the body.

Neutrophil subpopulations in tissues

In normal homeostasis, neutrophils are found in many tissues (von Vietinghoff and Ley, 2008, 2009), where they perform specialized functions. For the most part, there is very little knowledge on how neutrophils are directed to the different organs, and the particular functions they perform in each tissue. Evidence suggests that indeed neutrophils display different phenotypes in various organs. For example, in the lung a large number of neutrophils accumulate adhered to the vascular lumen and in the interstitial space. These neutrophils are kept in the tissue by a CXCR4-dependent mechanism (Devi et al., 2013). Because aged neutrophils express more CXCR4 it is possible that they preferentially migrate to the lungs (Adrover et al., 2016). Similarly, in the spleen many neutrophils are found in the marginal zone, producing cytokines that induce somatic hypermutation and antibody production by marginal B lymphocytes (Puga et al., 2011). Also, neutrophils in spleen display the phenotype CD62L low CD11b hi ICAM-1 hi , and have a tendency to produce NETs (Cerutti et al., 2013), similar to aged neutrophils in the circulation (Summers et al., 2010 Casanova-Acebes et al., 2013).

Another subpopulation of neutrophils has been found to preferentially move into lymph nodes to interact with T lymphocytes, carrying antigens to the lymph nodes and mediate T cell activation (Duffy et al., 2012 Hampton and Chtanova, 2016). These neutrophils can selectively migrate to the lymph node because they express the CCR7 receptor (Beauvillain et al., 2011), as well as the integrin LFA-1 and the chemokine receptor CXCR4. These receptors are also involved in neutrophil trafficking through afferent lymphatics (Gorlino et al., 2014).

Yet another subtype of neutrophils in tissues is capable of inducing angiogenesis. These neutrophils display the phenotype CD49d hi CXCR4 hi VEGFR1. The latter is the receptor for vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). These neutrophils are efficiently recruited to non-vascularized tissues under hypoxia conditions, and promote angiogenesis (Massena et al., 2015). Interestingly, this proangiogenic subset of neutrophils is similar to neutrophils that support tumor vascularization (Jablonska et al., 2010 see later).

The examples described above indicate that indeed neutrophils can display great phenotypic and functional heterogeneity, and support the idea that at least some of the neutrophil subtypes may derive from aging neutrophils migrating into tissues.

Migrating neutrophil subpopulations

Some neutrophils have been observed to perform reverse transendothelial migration (rTEM) or reverse interstitial migration (rIM), depending on their initial location (Nourshargh et al., 2016). Neutrophils doing rTEM have been observed in mice (Woodfin et al., 2011), whereas neutrophils doing rIM have been seen only in the transparent zebra fish model (Mathias et al., 2012). Neutrophils performing rTEM present the phenotype ICAM-1 hi CXCR1 low , which is different from the phenotype ICAM-1 low CXCR1 hi of circulatory neutrophils and the phenotype ICAM-1 low CXCR1 low of neutrophils in tissues (Buckley et al., 2006).

Neutrophil subpopulations induced by the microbiota

Neutrophils can modify their functional responses after being exposed to multiple factors, through the process named neutrophil priming (Downey et al., 1995 El-Benna et al., 2016). Recent studies in mice suggest that microbial products derived from the microbiota can induce neutrophil diversity. For example, diaminopimelic acid-bearing peptides, which are recognized by the nucleotide𠅋inding oligomerization domain containing 1 (NOD1) receptor, modify the lifespan of neutrophils (Hergott et al., 2016) and prime neutrophils for improved antimicrobial function (Clarke et al., 2010). In addition, endotoxins from the gut microbiota can enter the blood circulation and influence neutrophil aging (Zhang et al., 2015) and also the development of B cell-helper neutrophils in the spleen (Puga et al., 2011). Thus, neutrophils can display different phenotypes after priming by the microbiota.


Synopsis

Bacillus anthracis is the bacterium that causes anthrax, a disease that can occur through natural infections and also through intentional release. B. anthrazit makes spores, which are in a dormant state, similar to seeds of a plant, and are extremely resistant to the environment. B. anthrazit spores can infect through the skin or the lung. Lung infections disseminate through the body and are lethal. In contrast, skin infections often remain localized, and patients survive even without treatment. It is not well understood why these bacteria cause a localized infection through the skin and a lethal disease through the lung.

Little is known about how B. anthrazit is controlled. Neutrophils are the first white blood cells recruited to a site of infection and are specialized in killing microbes. Previous studies show that neutrophils are abundant in the skin form, but not in the lung form of anthrax. The researchers report that human neutrophils can take up B. anthrazit Sporen. Once inside, the spores germinate to form vegetative bacteria. The vegetative bacteria are extremely susceptible to neutrophil-killing mechanisms. Die B. anthrazit virulence factors (molecules that make bacteria cause diseases) manipulate other human cells but do not deter neutrophils. B. anthrazit is indeed exquisitely sensitive to the neutrophil protein α-defensin. These data support a new model where B. anthrazit skin, but not lung, infections are controlled by the antimicrobial activity of neutrophils.

Zitat: Mayer-Scholl A, Hurwitz R, Brinkmann V, Schmid M, Jungblut P, Weinrauch Y, et al. (2005) Human Neutrophils Kill Bacillus anthracis. PLoS Pathog 1(3): e23. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010023

Editor: John Young, The Salk Institute for Biological Studies, United States of America

Empfangen: April 4, 2005 Akzeptiert: October 3, 2005 Veröffentlicht: November 11, 2005

Urheberrechte ©: © 2005 Mayer-Scholl et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Abkürzungen: CFU, colony forming unit DPI, diphenyleneiodonium hNGE, human neutrophil granule extract MOI, multiplicity of infection NADPH, nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate PMF, peptide mass fingerprinting ROS, reactive oxygen species production RP-HPLC, reverse phase high-performance liquid chromatography TEM, transmission electron microscopy


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Structured Abstract

EINLEITUNG

The collective behavior of cells and insects often relies on self-organizing processes. By releasing attractant signals, a few individuals can initiate the accumulation and aggregation of a whole population. Neutrophils, key players in the innate immune response, infiltrate inflamed and infected tissues in large numbers. These cells make use of such positive feedback amplification to find and kill bacteria in tissues. By secreting attractants that act through cell surface–expressed G protein–coupled receptors (GPCRs) on neighboring cells, neutrophils use this form of intercellular communication and coordinate their hunt for pathogens as a swarm. How this swarming response is terminated to avoid uncontrolled neutrophil accumulations and prevent excessive inflammation is currently unknown.

RATIONALE

The stop signals for neutrophil swarming in mammalian tissues have not yet been defined. They may be derived from cells of the surrounding inflammatory environment or from neutrophils themselves. We reasoned that the attractants released by neutrophils may become highly concentrated at sites where these cells cluster in larger numbers. It is well established that high chemoattractant concentrations can attenuate cellular responses by a process termed GPCR desensitization. We hypothesized a self-limiting mechanism for swarming: The local accumulation of the same neutrophil-expressed attractants that amplify swarming during early stages would cause desensitization of their respective GPCRs at later stages of neutrophil clustering. This led us to investigate the role of GPCR desensitization in neutrophil tissue navigation and host defense.

ERGEBNISSE

We generated mouse strains whose neutrophils were deficient in GPCR kinases (GRKs), critical enzymes for mediating the GPCR desensitization process. Of the four GRK isoforms tested, in vitro experiments identified GRK2 as the kinase necessary to desensitize GPCRs activated by swarm-released attractants (LTB4 and CXCL2). When neutrophils sense high concentrations of swarm attractants in vitro, GRK2 desensitizes the corresponding receptors to induce migration arrest. Two-photon intravital imaging of injured skin and infected lymph nodes of mice showed that GRK2 and GPCR desensitization play critical roles during neutrophil swarming in physiological tissue. At sites where swarming neutrophils accumulate and self-generate local fields of high swarm attractant concentration, GPCR desensitization was crucial to stop neutrophil migration arrest. Desensitization-resistant neutrophils moved faster and explored larger areas of lymph node tissue infected with the bacterium Pseudomonas aeruginosa. Such behavior suggested more effective bacterial sampling throughout the infected organ. Surprisingly, mice with GRK2-deficient neutrophils showed impaired rather than improved bacterial clearance. This finding could not be explained by altered antibacterial effector functions. In vitro assays for the detailed analysis of swarming behavior and bacterial growth revealed that GPCR desensitization to swarm attractants is required to induce neutrophil arrest for optimal bacterial phagocytosis and containment in swarm clusters.

FAZIT

We describe a cell-intrinsic stop mechanism for the self-organization of neutrophil collectives in infected tissues, which is based on sensing the local accumulation of the same cell-secreted attractants that amplify swarming during early stages. GPCR desensitization acts as a negative feedback control mechanism to stop neutrophil migration in swarm aggregates. This navigation mechanism allows neutrophils to self-limit their dynamics within forming swarms and ensures optimal elimination of bacteria. Desensitization to a self-produced activation signal as a principle of self-organization is important for immune host defense against bacteria, and likely informs other categories of collective behavior in cells and insects.

Top: Swarming neutrophils self-amplify their highly chemotactic recruitment toward sites of tissue injury or bacterial invasion by releasing attractants that act on neighboring neutrophils. Neutrophils are displayed as spheres with migration tracks (right). Bottom: The local accumulation of the same cell-secreted attractants stops neutrophils when they accumulate and form clusters, a process important for the containment of bacteria in infected tissues.


CONTRIBUTION OF OXIDANTS TO BACTERIAL KILLING BY NEUTROPHILS

Oxidative and nonoxidative mechanisms.

Efficient control of a multitude of microorganisms is so important for host survival that the neutrophil does not rely on a single antimicrobial weapon. This review concentrates on oxidative mechanisms, but as discussed elsewhere,120-122 this is complemented by nonoxidative killing by granule proteins that are released into the phagosome. The mechanism that predominates may vary depending on the microbial species, its metabolic state, and the prevailing conditions.61

Optimal killing of many species of bacteria requires products from the oxidative burst. This is best exemplified in CGD, where affected individuals have an impaired or completely absent oxidative burst and suffer from recurrent and life-threatening infections.9,10The strains of bacteria that are killed poorly in vitro are responsible for the infections that are characteristic of CGD.10 Normal neutrophils tested in anaerobic environments, or in the presence of the NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium, are also impaired in their ability to kill these bacteria.123-126 Other species are killed normally, either because they are catalase-negative and able to supply an alternative source of hydrogen peroxide,127,128or because they can be disposed of effectively by nonoxidative mechanisms.

Myeloperoxidase and HOCl.

Myeloperoxidase appears critical for oxidative killing in experimental systems. Neutrophils isolated from the blood of myeloperoxidase-deficient individuals kill a variety of microorganisms poorly,129-131 and inhibitors of myeloperoxidase such as azide, cyanide, and salicylhydroxamic acid impair killing by normal cells.106,130,132,133 Neutrophil cytoplasts that lack granule enzymes but generate hydrogen peroxide only kill bacteria if they are coated with myeloperoxidase before ingestion.134

Measurements of rates of killing of S. aureus by neutrophils isolated from human blood reinforce the importance of myeloperoxidase.106,126 Inhibition of the oxidative burst with diphenyleneiodonium, or removal of oxygen, decreases the rate constant for killing by 80%, enabling separation of the oxidative and nonoxidative components (Fig 4). Killing rates are substantially decreased in the presence of the myeloperoxidase inhibitors azide and 4-aminobenzoic acid hydrazide, and with myeloperoxidase-deficient neutrophils. Only the oxidative component is affected, and is six times slower when myeloperoxidase is not active. These results indicate that, at least with S. aureus, the normal mechanism for oxidative killing uses myeloperoxidase. Direct killing by hydrogen peroxide, or other alternative oxidative mechanisms, are poor substitutes.

Rate constants for killing of S. aureus by human neutrophils. Opsonized bacteria were mixed with neutrophils in a 1:1 ratio. Numbers of extracellular and viable intracellular bacteria were measured at 0, 10, 20, and 30 minutes, and from these independent first-order rate constants for phagocytosis and killing were measured. Superoxide dismutase was conjugated to IgG (IgG-SOD) and attached to the bacteria through binding to the protein A on their surface. ABAH, the myeloperoxidase inhibitor 4-aminobenzoic acid hydrazide. The shaded area represents the contribution of nonoxidative killing measured in the presence of diphenyleneiodonium (DPI) or anaerobically (N2). The data are taken from Hampton,117 and show the mean and SD of at least three experiments.

Rate constants for killing of S. aureus by human neutrophils. Opsonized bacteria were mixed with neutrophils in a 1:1 ratio. Numbers of extracellular and viable intracellular bacteria were measured at 0, 10, 20, and 30 minutes, and from these independent first-order rate constants for phagocytosis and killing were measured. Superoxide dismutase was conjugated to IgG (IgG-SOD) and attached to the bacteria through binding to the protein A on their surface. ABAH, the myeloperoxidase inhibitor 4-aminobenzoic acid hydrazide. The shaded area represents the contribution of nonoxidative killing measured in the presence of diphenyleneiodonium (DPI) or anaerobically (N2). The data are taken from Hampton,117 and show the mean and SD of at least three experiments.

Although HOCl stands out as the prime candidate for the lethal agent produced by myeloperoxidase, there is currently insufficient evidence to exclude other products of the enzyme. We recently observed that the fraction of tyrosyl residues converted to chlorotyrosine in phagocytosed S. aureus (0.5% ± 0.2%, SEM of 10 experiments) was similar to that for S. aureus treated with a lethal amount of HOCl (Fig 5). This suggests that enough HOCl is generated in the phagosome for it to be responsible for killing. A similar conclusion was reached by Jiang et al119 measuring fluorescein chlorination. Inhibition of killing of Candida pseudohyphae by scavengers of HOCl and chloramines also supports the involvement of chlorinated oxidants.135 However, more direct evidence is necessary to confirm this role for HOCl.

Chlorotyrosine formation and loss of viability for S. aureus exposed to reagent HOCl. Bacteria (1 × 10 8 /mL) were treated with a range of concentrations of HOCl and then analyzed for tyrosine and chlorotyrosine content,165 and the number of remaining viable colony-forming units. The results are taken from Hampton.117 The means and SD of three experiments are reported.

Chlorotyrosine formation and loss of viability for S. aureus exposed to reagent HOCl. Bacteria (1 × 10 8 /mL) were treated with a range of concentrations of HOCl and then analyzed for tyrosine and chlorotyrosine content,165 and the number of remaining viable colony-forming units. The results are taken from Hampton.117 The means and SD of three experiments are reported.

Role of superoxide.

Neutrophils must generate superoxide to kill oxidatively. Its role could simply be as a precursor of hydrogen peroxide, or it could participate directly in the killing process. Distinguishing between these possibilities experimentally is complicated by the difficulty of getting sufficient superoxide dismutase (SOD) into the phagosome to scavenge all the superoxide generated. Adding SOD to phagocytosing neutrophils136 or modifying the expression of SOD in target bacteria137-142 has generally had little effect, but this could be because the SOD did not gain access to the phagosome. The few studies where this has been achieved indicate a direct role for superoxide in killing. Johnston et al136 showed that the killing of S. aureus was impeded when SOD-coated latex beads were co-ingested with the bacteria. The accessibility problem has also been overcome by attaching SOD to the surface of S. aureus.106 The SOD was covalently crosslinked to IgG that then bound to protein A in the cell wall. The bacteria were ingested normally, but the rate constant for killing was decreased by 30% (Fig 4). This represents a decrease in rate of oxidative killing to almost a half. SOD had no effect in the presence of peroxidase inhibitors, which suggests that it acts on a myeloperoxidase-dependent process.

The effect of SOD could be explained on the basis of its inhibiting hydroxyl radical production.136 If the route to hydroxyl radicals was via superoxide and HOCl, this could also explain the apparent involvement of a myeloperoxidase-dependent process. However, as argued above, the hydroxyl radical is unlikely to be a major player in the phagosome. An alternative explanation, which is consistent with the modeling studies of oxidant production, is that superoxide prevents reversible inactivation of myeloperoxidase, thereby optimizing killing by HOCl. More direct analyses are needed before firm conclusions can be drawn on the mechanism.

In the context of superoxide having a direct role in killing, it is of interest that Mycobacterium tuberculosis,143,Nocardia asteroides,144,Helicobacter pylori,145 and Actinobacillus pleuropneumoniae 146 all secrete SOD. Antibodies to the superoxide dismutase of N asteroides enhanced both bacterial killing by neutrophils147 and clearance upon inoculation of mice.148 It is possible that this surface-associated superoxide dismutase could slow down intraphagosomal killing and be a factor in their pathogenicity.


Modulation of inflammatory and immune responses by short-chain fatty acids

17.3.1 Neutrophils

Neutrophils are the first cells that migrate into tissues in response to invading bacteria and other micro-organisms, and are the predominant infiltrating cell types in the cellular phase of the acute inflammatory response. These cells are recruited and migrate from the bloodstream to inflamed tissue in a multistep and highly controlled process ( Ley et al., 2007 ).

The effect of SCFAs on recruitment of neutrophils has, in particular, attracted the attention of several groups. In part, this reflects the interest in understanding the actions of these compounds in the GI tract and at sites of anaerobic bacterial infections such as periodontal tissue and abscess, where concentrations of 10–50 mM of SCFAs have been described ( Ladas et al., 1979 Rotstein et al., 1985). In this context, SCFAs induce chemotaxis of neutrophils ( Le Poul et al., 2003 Maslowski et al., 2009 Sina et al., 2009 Vinolo et al., 2009b ), an effect dependent on activation of GPR43 receptor, and modulate the expression of adhesion molecules on neutrophils ( Vinolo et al., 2009b ) and endothelial cells ( Zapolska- Downar et al., 2004 Miller et al., 2005 Zapolska-Downar and Naruszewicz, 2009 ), indicating that these compounds may be important for neutrophil migration.

Once in the inflammatory site, neutrophils internalize, kill and digest bacteria and fungi through effector mechanisms such as production of reactive oxygen species (ROS) and release of granule enzymes. SCFAs affect the phagocytic capacity of neutrophils, but both inhibition and stimulation of neutrophil phagocytosis by SCFAs have been described ( Eftimiadi et al., 1990 Mills et al., 2006 Vinolo et al., 2009a). The effects of SCFAs on the production of ROS by neutrophils are also inconsistently reported: some groups have found that SCFAs increase ROS production ( Stringer et al., 1996 Nakao et al., 1998 ), while others have found inhibition ( Eftimiadi et al., 1987 Tonetti et al., 1991 Liu et al., 2001 Sandoval et al., 2007 Vinolo et al., 2009a). These discrepancies probably result from differences in the protocols used such as concentration of SCFAs, measurement of ROS with different methodologies (i.e. lucigenin-amplified chemiluminescence and reduction of cytochrome c), stimulus used to elicit ROS production (i.e. PMA or fMLP), source and state of neutrophil activation (i.e. neutrophils isolated from human blood or elicited rat neutrophils).

Neutrophils are important sources of cytokines such as tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-8 (the rat analogue is CINC-2αβ) and transforming growth factor (TGF)-β ( Cassatella, 1995 ) that, together with other mediators such as nitric oxide (NO) and eicosanoids, are released in the inflammatory site and coordinate different steps of the inflammatory process. SCFAs modify the production of inflammatory mediators by neutrophils: Tedelind et al. (2007) have shown that acetate, propionate and butyrate at 30 mM reduce TNF-α production by lipopolysaccharide (LPS)-stimulated human neutrophils. We have found that SCFAs (propionate and butyrate) inhibit the production of pro-inflammatory mediators (TNF-α, CINC-2αβ and NO) by rat neutrophils ( Vinolo et al., 2011). In agreement with previous studies performed in macrophages ( Park et al., 2007 Usami et al., 2008 ) and other cell types such as endothelial cells ( Ogawa et al., 2003 Zapolska-Downar et al., 2004 ), we have found that propionate and butyrate inhibit NF κ B activation ( Vinolo et al., 2011). Our hypothesis is that by inhibiting HDAC activity and thus modifying the acetylation status of proteins, SCFAs modulate the activation of transcription factors such as NF κ B and consequently the expression of genes involved in the inflammatory response.


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