Information

Wenn ein bestimmtes DNA-Oligo ein Aptamer ist, ist dann das entsprechende RNA-Oligo mit derselben Sequenz auch ein Aptamer?

Wenn ein bestimmtes DNA-Oligo ein Aptamer ist, ist dann das entsprechende RNA-Oligo mit derselben Sequenz auch ein Aptamer?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die Funktionalität von Aptameren hängt von der Sequenz und der Sekundärstruktur des Oligos ab. Wenn ich also ein DNA-Aptamer nehme und ein RNA-Oligo der gleichen Sequenz herstelle (T natürlich durch U ersetzt), wird dieses RNA-Oligo auch als Aptamer fungieren?


Es gibt mindestens einen bekannten Fall, in dem sowohl die DNA- als auch die RNA-Version derselben Aptamersequenz an dasselbe Ziel binden (Lauhon und Szostak, 1995).

Aber man kann dies nicht verallgemeinern, es gibt zwei Strukturunterschiede zwischen RNA und DNA, die Uracil/Thymin-Veränderung und das fehlende 2'-OH in der DNA. Diese Unterschiede können die Bindung und die Gesamtstruktur des Aptamers beeinflussen.

Es ist möglich, dass die RNA-Version eines DNA-Aptamers denselben Liganden bindet, aber dies wird nicht immer der Fall sein.


Aptamere sind einzelsträngige Sequenzen, die an Proteine ​​oder andere molekulare Partner binden. Offensichtlich haben ssDNA und ssRNA sehr unterschiedliche (im Allgemeinen) Bindungspartner. Z.B. DNA interagiert mit Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase, Histone usw., während RNA mit Ribosomen, reverser Transkriptase und anderen interagiert.

Daher ist es in Kürze wahrscheinlicher, dass Protein A, das DNA-Aptamer bindet, keine RNA mit entsprechender Sequenz bindet.

Außerdem haben DNA und dieses DNA-Transkript wahrscheinlich eine sehr unterschiedliche Sekundärstruktur.


Chimäre LNA/DNA-Oligomere imitieren RNA-Aptamere, die auf das TAR-RNA-Element von HIV-1 . gerichtet sind

1 INSERM U386, Université Victor Segalen, 33076 Bordeaux cx, Frankreich, 2 Institut Europພn de Chimie et Biologie, 2 rue Escarpit, 33607 Pessac cx, Frankreich und 3 Santaris Pharma A/S, Bøge Allé 3, DK-2970 Kopenhagen, Dänemark

Jens Bo Hansen

1 INSERM U386, Université Victor Segalen, 33076 Bordeaux cx, Frankreich, 2 Institut Europພn de Chimie et Biologie, 2 rue Escarpit, 33607 Pessac cx, Frankreich und 3 Santaris Pharma A/S, Bøge Allé 3, DK-2970 Kopenhagen, Dänemark

Henrik Orum

1 INSERM U386, Université Victor Segalen, 33076 Bordeaux cx, Frankreich, 2 Institut Europພn de Chimie et Biologie, 2 rue Escarpit, 33607 Pessac cx, Frankreich und 3 Santaris Pharma A/S, Bøge Allé 3, DK-2970 Kopenhagen, Dänemark

Carmelo Di Primo

1 INSERM U386, Université Victor Segalen, 33076 Bordeaux cx, Frankreich, 2 Institut Europພn de Chimie et Biologie, 2 rue Escarpit, 33607 Pessac cx, Frankreich und 3 Santaris Pharma A/S, Bøge Allé 3, DK-2970 Kopenhagen, Dänemark

Jean-Jacques Toulmé

1 INSERM U386, Université Victor Segalen, 33076 Bordeaux cx, Frankreich, 2 Institut Europພn de Chimie et Biologie, 2 rue Escarpit, 33607 Pessac cx, Frankreich und 3 Santaris Pharma A/S, Bøge Allé 3, DK-2970 Kopenhagen, Dänemark


Ein ssDNA-Aptamer, das die Funktion des Anti-FLAG M2-Antikörpers blockiert

Mit SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) entdeckten wir zufällig ein ssDNA-Aptamer, das selektiv an den Anti-FLAG M2-Antikörper bindet. Das Aptamer bestand aus zwei Motiven (CCTTA und TGTCTWCC), die durch 2-3 Basen getrennt waren, und die Eliminierung des einen oder anderen Motivs hob die Bindung auf. Das DNA-Aptamer und das FLAG-Peptid konkurrierten um die Bindung an die Antigen-bindende Tasche des M2-Antikörpers. Darüber hinaus eluierte das Aptamer FLAG-markierte Proteine ​​aus dem Antikörper, was eine kommerzielle Anwendung bei der Proteinreinigung nahelegt. Diese Ergebnisse zeigen die Machbarkeit der Verwendung von SELEX zur Entwicklung von ssDNA-Aptameren, die die Funktion eines spezifischen Antikörpers blockieren, eine Fähigkeit, die zur Entwicklung neuer therapeutischer Modalitäten für Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen führen könnte.

1. Einleitung

Antinukleäre Antikörper sind diagnostische Marker für systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis und andere Autoimmunerkrankungen [1]. Bei diesen B-Lymphozyten-Erkrankungen wird eine Vielzahl von Autoantikörpern gegen nukleäre Selbstantigene gebildet, einschließlich Ribonukleoproteine, Nukleosomen, Chromatin und Polynukleotide (RNA, ssDNA und dsDNA). Unter diesen wurden Anti-DNA-Antikörper am umfassendsten untersucht [2]. Anti-DNA-Antikörper binden mit hoher Affinität entweder an einzel- oder doppelsträngige DNA und viele neigen dazu, die Assoziation mit Pyrimidinbasen zu begünstigen [3, 4]. In mehreren Berichten wurde auch beschrieben, dass antinukleäre Antikörper mit Peptid-Selbstantigenen kreuzreagieren und sich im Gehirn, in den Nieren und in der Haut ablagern [5–9]. Wie von mehreren Forschern vorgeschlagen, kann diese Ablagerung eine Ursache für entzündungsbedingte Gewebeschäden sein, insbesondere in den Nieren, wo Nephritis eine Hauptursache für Morbidität ist [1, 2]. In Mausmodellen des systemischen Lupus erythematodes wurde versucht, die Funktion dieser kreuzreagierenden Antikörper mit Peptid-Aptameren zu blockieren, die entweder aus ihren verwandten Peptid-Selbstantigenen oder aus Phagen-Display-Bibliotheken stammen [10, 11]. In einigen Fällen assoziiert das Peptid-Aptamer kompetitiv mit den antinuklearen Autoantikörpern, wodurch eine antikörpervermittelte Gewebeschädigung verhindert wird [10, 11]. Somit könnte die direkte Antikörperhemmung eine wirksame Therapie bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen sein, die durch das Vorhandensein antinukleärer Antikörper ausgelöst werden. Ein weiterer gangbarer Ansatz zur Blockierung antinukleärer Antikörper könnte die Verwendung von DNA-Aptameren sein, angesichts der hohen Affinität dieser Antikörper für DNA und des Nachweises der Nukleotidbasen-Spezifität. Dieser Ansatz wurde jedoch eindeutig zu wenig erforscht, möglicherweise aufgrund des Fehlens von Berichten über die Durchführbarkeit der Entwicklung von DNA-Aptameren, um die Funktion spezifischer Antikörper zu blockieren.

Eine adaptive Technik, die verwendet wird, um die Sequenzspezifität von DNA/RNA-bindenden Proteinen zu definieren, ist SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung). Bei SELEX wird das interessierende Protein als Selektionsmatrix verwendet, um hochaffine DNA-Bindungsstellen aus einem Pool randomisierter DNA-Moleküle einzufangen [12, 13]. Dieser Pool besteht aus einem Oligonukleotid, das einen randomisierten Kern (bis zu 35 Basen groß) enthält, der von PCR-Priming-Sequenzen flankiert wird. Der randomisierte Kern wird während der chemischen Synthese unter Verwendung einer Mischung aller vier Nukleosid-Phosphoramidite an jeder der zufälligen Positionen hergestellt. Nach ihrem Einfangen werden die ausgewählten DNA-Moleküle durch PCR reamplifiziert und dann durch aufeinanderfolgende Selektionsrunden weiter angereichert. Nach 4–6 Runden werden die ausgewählten DNA-Moleküle kloniert und sequenziert, um alle gängigen DNA-Motive zu identifizieren, die vom interessierenden Protein erkannt werden. SELEX kann auf die Selektion von ssDNA-, dsDNA- oder sogar RNA-Molekülen angewendet werden [12, 13]. Es ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet wurde, um Nukleinsäureliganden für eine Vielzahl von Proteinen zu optimieren, sogar für einige, die normalerweise nicht mit DNA oder RNA interagieren. Als Beispiel wurde SELEX verwendet, um RNA-Aptamere zu entwickeln, die an Blutgerinnungsfaktoren wie Thrombin [14], Von-Willebrand-Faktor [15] und Faktor IXa [16] binden. In allen drei Fällen interagierten die ausgewählten RNA-Aptamere selektiv mit ihren entsprechenden Protein-Targets und hemmten dabei deren Blutgerinnungsaktivitäten. Eine zweite Generation von Aptameren wurde entwickelt, von denen einige in klinische Studien bei Patienten mit Blutgerinnungsstörungen eingetreten sind [15].

Mit SELEX entdeckten wir zufällig eine ssDNA-Sequenz, die selektiv an den M2-Antikörper bindet, ein häufig verwendetes Reagenz, das das Flag-Epitop (DYKDDDDK) erkennt. Das DNA-Aptamer und das Flag-Peptid konkurrierten um die Bindung an den M2-Antikörper, wodurch es dem Aptamer ermöglicht wird, Flag-markierte Proteine ​​von einem immobilisierten M2-Antikörper zu eluieren, ein üblicherweise bei der Proteinreinigung eingesetztes Verfahren. Abgesehen von dieser unmittelbaren Anwendung in der Proteinreinigung zeigt die Identifizierung dieses DNA-Aptamers die Möglichkeit, mit SELEX Aptamere zu entwickeln, die spezifische Antikörper blockieren. Die Anwendung dieses Ansatzes auf antinukleäre Autoantikörper könnte zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen führen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

Oligonukleotide wurden von der Eppley Core Facility (University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE) synthetisiert. Das Plasmid pTetFLAGhTRF2 45-501 war ein Geschenk von Dr. Titia de Lange (Rockefeller University, New York, NY) [17]. Die Polynukleotidkinase und die DNA-Polymerasen Platinum Pfx und Taq wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA) bezogen. Alle anderen Enzyme wurden von Fermentas (Hannover, MD), New England BioLabs (Beverly, MA), Promega (Madison, WI) oder Invitrogen (Carlsbad, CA) bezogen. Das TnT Quick Coupled Transcription/Translation System wurde von Promega (Madison, WI) erworben. Die γ-[ 32 P]-ATP (4500 Ci/mmol) wurde von MP Biologicals (Solon, OH) bezogen und das L-[ 35 S]-Methionin (1000 Ci/mmol) wurde von PerkinElmer (Boston, MA) bezogen. Mit einem Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper beschichtete M-450-Magnetkügelchen wurden von Dynal Biotech, Inc. (Lake Success, NY) erhalten. 3XFLAG-Peptid und alle anderen Chemikalien stammten von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Die Mini-PROTEAN 4%-20% SDS-PAGE-Gele wurden von Bio-Rad (Hercules, CA) bezogen.

2.2. Antikörper

Monoklonale Maus-Antikörper gegen das Flag-Tag (IgG1 Klon M2) und StnI/OBFC1 (IgG2ak Klon 3G12-1B7) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Normales Maus-IgG (Kat. # sc-2025) und monoklonaler Anti-Vimentin-Maus-Antikörper (IgG1 Klon sc-6260) wurden von Santa Cruz (Santa Cruz, CA) erhalten, ebenso wie der polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen TRF2 (Kat. # H-300). Ebenfalls gekauft wurden monoklonale Maus-Antikörper gegen PTOP (IgG1 Klon 1D8-1B6 Novus Biologicals, Littleton, CO) und TIN2 (IgG1 Klon 59B388, AbCam, Cambridge, MA).

2.3. Ausdrucksvektoren

Das Plasmid pcDNA3.1-Flag-Stn1 wurde durch Insertion der menschlichen Stn1-Sequenzen in das Plasmid pcDNA3.1-Flag hergestellt. Die kodierende Sequenz von Stn1 wurde aus dem Plasmid pOTB7-Stn1 (GenBank # BC017400 American Type Culture Collection, Manassas, VA) unter Verwendung der Platinum Pfx DNA-Polymerase und der Primer 5'-GACTGACAATTGGGTGGTATGCAGCCTGGATCCAG-CC-3'und 5'-GACTGAAGATCTTCAGAGAACGCTGTGTAGTAG amplifiziert. . Das PCR-Produkt wurde dann mit MfeI/BglII geschnitten und in die EcoRI/BamHI-Stellen von pcDNA3.1-Flag im Leseraster mit dem Flag-Tag inseriert. pcDNA3.1-Flag ist ein pcDNA3.1(–)-Vektor, der für ein Flag-Epitop kodiert, das sich stromabwärts eines T7-Promotors und unmittelbar gefolgt von einer EcoRI-Stelle befindet. Das Plasmid pcDNA3.1-Flag-TRF2 B wurde aus seinen pCMV1-Äquivalenten durch Übertragung seiner TRF2-Kassette auf den Vektor pcDNA3.1(–) (Invitrogen, Carlsbad, CA) hergestellt. pCMV1-Flag-TRF2 B wurde wiederum durch die Übertragung eines SacII/BamHI-Fragments von Plasmid pTetFLAGhTRF2 45-501 (ein Geschenk von Titia de Lange, Rockefeller University, NY) auf pCMV1 hergestellt [17].

2.4. Proteinexpression

Die Proteine ​​Flag-Stn1 und [ 35 S]-Flag-TRF2 ΔB wurden von in vitro Transkription/Translation in einem Kaninchen-Retikulozyten-Lysat. In einem Endvolumen von 50 μL wurde ein Mikrogramm pcDNA3.1-Flag-Stn1 mit dem TnT Quick Coupled-System gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega, Madison, WI) transkribiert/translatiert. Als Negativkontrolle wurde parallel ein wasserprogrammiertes Lysat (Mock) hergestellt. Nach der Translation wurden Aliquots der beiden Reaktionen durch Western-Blotting unter Verwendung sowohl des Stn1/OBFC1-Antikörpers als auch des Anti-Flag-M2-Antikörpers analysiert. Eine einzelne Spezies von 45 kDa wurde von den beiden Antikörpern im Stn1-programmierten Lysat nachgewiesen, jedoch nicht im Mock-Lysat (siehe Abbildung S1 in ergänzendem Material, online verfügbar unter doi: 10.4061/2011/720798). Das [ 35 S]-markierte Flag-TRF2 ΔB-Protein wurde ähnlich hergestellt, mit der Ausnahme, dass das unmarkierte Methionin durch 2 . ersetzt wurde μL L-[ 35 S]-Methionin (1000 Ci/mmol, 10 μCi/μL).

2.5. Herstellung von Beads, die mit dem Anti-Flag M2-Antikörper beschichtet sind

M2-Antikörper-beschichtete Kügelchen wurden durch Mischen von 200 μL M-450 Magnetkügelchen beschichtet mit einem Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Dynal Biotech, Inc., Lake Success, NY) mit 15 μg Anti-Flag-Antikörper (M2-Maus monoklonal, Stratagene, La Jolla, CA) in 5 ml PBS, das jeweils 0,1% NP-40 und BSA enthält. Nach einer Rotation über Nacht bei 4 °C wurden M2-beschichtete Kügelchen dreimal in PBS gewaschen, das jeweils 0,1% NP-40 und BSA enthielt, wonach die Kügelchen suspendiert und in 200 °C gelagert wurden μL des gleichen Puffers. Vor der Verwendung wurden die Kügelchen dreimal mit eiskaltem 1X Bindungspuffer gewaschen, der 0,1% BSA enthielt. Kontrollkügelchen, die mit normalem Maus-IgG (Kat. # sc-2025, Santa Cruz) beschichtet waren, wurden nach dem gleichen exakten Protokoll hergestellt.

2.6. SELEX

Ein Oligonukleotid mit einem zufälligen Kern von 35 Nukleotiden flankiert von PCR-Priming-Sequenzen wurde hergestellt: 5'-GCGTCGACAAGCTTTCTAGA(N)35GAATTCGGATCCCTCGAGCG-3′. In der ersten Auswahlrunde 5 μg dieses randomisierten Oligos (215 pmol, 130 Billionen Moleküle) wurden mit 12,5 inkubiert μL Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (entweder mit Wasser oder Flag-Stn1 programmiert) und 5 μg beschallt denaturiert E coli genomische DNA in einem 50 μL-Reaktion mit 1X Bindungspuffer (4% Glycerin, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5). Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur, 10 μL M2-beschichtete Kügelchen wurden zugegeben und die Proben wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur rotiert. Magnetische Beads wurden dreimal mit eiskaltem 1X-Bindungspuffer mit 0,1% BSA gewaschen, wonach die ausgewählten Oligos 10 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart eines Überschusses an 3XFLAG-Peptid (34 .) eluiert wurden μM in 1X Bindungspuffer). Als nächstes wurde die eluierte DNA durch PCR unter Verwendung von Platinum Taq DNA-Polymerase und den Primern 5'-GCGTCGACAAGCTTTCTAGA-3' (vorwärts) und 5'-CGCTCGAGGGATCCGAATTC-3' (rückwärts) reamplifiziert. Aliquots, die nach 10, 15, 20 und 25 PCR-Zyklen entnommen wurden, wurden auf einem 3% Agarosegel aufgelöst. Das am besten amplifizierte Aliquot (kein Abstrich, kein Supershift, innerhalb des exponentiellen Bereichs) wurde ausgewählt, geschnitten und unter Verwendung des GENECLEAN III-Kits (MP Biologicals, Solon, OH) gelgereinigt. Als nächstes wurden die gelgereinigten Produkte einer asymmetrischen PCR unterzogen, um ssDNA-Moleküle zu regenerieren, die für die folgenden SELEX-Runden benötigt werden. Sechzehn Zyklen asymmetrischer PCR wurden unter Verwendung von Platinum Taq DNA-Polymerase und dem Vorwärtsprimer durchgeführt, wonach die PCR-Produkte mit Phenol:Chloroform (1:1), nur Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol präzipitiert wurden. Das ssDNA-Pellet wurde in Wasser gelöst und konnte in der nächsten SELEX-Runde verwendet werden. Zusätzliche SELEX-Runden wurden identisch durchgeführt, außer dass das randomisierte Oligo durch die zuvor ausgewählte und reamplifizierte ssDNA ersetzt wurde.

Nach der sechsten Selektionsrunde wurde das symmetrisch amplifizierte PCR-Produkt gelgereinigt und dann für die TA-Klonierung in den Vektor pCR2.1-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA) vorbereitet. Chemisch umgewandeltes TOP10 E coli Zellen wurden auf Platten mit Kanamycin (25 μg/ml). Insgesamt wurden 50 weiße Kolonien gepickt und zur Sequenzierung geschickt. Über 30 Sequenzen wurden für jedes der zwei durchgeführten SELEX-Verfahren erhalten (Mock versus Flag-Stn1).

2.7. Radiomarkierung von DNA-Sonden

In 20 μl Vorwärtsreaktionspuffer (10 mM MgCl2, 5 mM DTT und 70 mM Tris-HCl, pH 7,6), wurden 30 pMol Oligonukleotid für 15 Minuten bei 37 °C mit 75 . markiert μCi von γ-[ 32 P]-ATP (4500 Ci/mmol) und 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Als nächstes wurden die Sonden durch Elektrophorese auf einem 8% Polyacrylamidgel aufgetrennt und gelgereinigt. Zuletzt wurden die eluierten Sonden auf einer G50-Spin-Säule (GE Healthcare, Piscataway, NJ) entsalzt.

2.8. Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA)

In 25 μL 1X Bindungspuffer, Reaktionen enthalten 1 μg des angegebenen Antikörpers und 80.000 cpm des bezeichneten [ 32 P]-markierten Oligonukleotids. Die Reaktionen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und wurden dann auf ein 4% natives Polyacrylamidgel geladen, das TBE-Puffer (45 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH 8,3) enthielt. Die Gele wurden bei 4°C für 1 Stunde bei 180 Volt laufen gelassen. Die Gele wurden dann auf ein DE81-Anionenaustauscher-Chromatographiepapier (Whatman International, Maidstone, England) übertragen, getrocknet und einem PhosphorImager-Bildschirm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) ausgesetzt. In Kompetitionsexperimenten wurden die angegebenen Kompetitoren 5 Minuten vor der Zugabe der [ 32 P]-markierten ABA-Sonde zugegeben. Die verwendeten Kompetitoren umfassten eine steigende Konzentration von 3XFLAG-Peptid (2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 oder 500 nM) oder einen Überschuss von entweder dem ABA- oder CTR-Oligo (jeweils 500 nM).

2.9. Bindungsisotherme der ABA-Sonde

Experimente wurden mit [ 32 P]-markiertem ABA wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass der M2-Antikörper in einer steigenden Konzentration (0, 50, 100, 200, 350, 500, 750, 1000, 2000 und 4000 ng) zugegeben wurde. Nachdem das Gel einem PhosphorImager-Screen ausgesetzt wurde, wurden die Menge an freiem [ 32 P]-ABA und die an den M2-Antikörper gebundene Menge an [ 32 P]-ABA durch Volumenintegration mit dem ImageQuant-Programm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. . Die Menge an gebundenem [ 32 P]-ABA, ausgedrückt als Bruchteil der Gesamtmenge, wurde als Funktion der Gesamtmenge an M2-Antikörper aufgetragen. Die resultierenden Kurven wurden durch nichtlineare Regression an eine „einseitige“ Sättigungsbindungskurve angepasst (

). Die Anpassung, die mit SigmaPlot Version 11.0 durchgeführt wurde, ermöglichte die Berechnung der scheinbaren Dissoziationskonstante ( ).

2.10. Freisetzung des eingefangenen [ 32 P]-ABA-Oligos durch das 3XFLAG-Peptid

Das [ 32 P]-markierte ABA-Oligo wurde zuerst auf den M2-beschichteten Kügelchen immobilisiert. Kurz gesagt, 150 μL M2-beschichtete Perlen wurden zu 375 hinzugefügt μL 1X Bindungspuffer, der 600.000 cpm [ 32 P]-ABA-Oligo enthält. Das Einfangen des Oligos wurde eine Stunde bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen, wonach die Kügelchen dreimal mit 500 gewaschen wurden μL eiskalter 1X Bindungspuffer (enthält 0,1% BSA). Die radioaktiven Kügelchen wurden dann in 450 . resuspendiert μL des gleichen Puffers. Um die Fähigkeit des 3XFLAG-Peptids zu beurteilen, das eingefangene Oligo zu eluieren, wurde eine steigende Konzentration des 3XFLAG-Peptids (0, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 und 5000 nM) zu 30 μL von Kügelchen, die das [ 32 P]-ABA-Oligo tragen. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Kügelchen heruntergezogen und die auf den Kügelchen und im Überstand verbleibenden Mengen an Radioaktivität wurden durch Szintillation gezählt und als Bruchteil der Gesamtmenge ausgedrückt.

2.11. Hemmung des Einfangens von [ 35 S]-markiertem Flag-TRF2 ΔB

Vor diesen Experimenten wurden die Kügelchen bei 4°C für 30 Minuten mit 5% Milch in 1X Bindungspuffer blockiert, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. In 1X Bindungspuffer wurden M2-beschichtete Beads zuerst mit dem angegebenen Kompetitor (30 .) inkubiert μM jeweils 3XFLAG, 3XABA oder 3XCTR) oder ohne Wettbewerber (No Comp). Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur 2–10 μL von [ 35 S]-markiertem FLAG-TRF2 B wurden zugegeben. Nach 1 Stunde Rotation bei Raumtemperatur wurde jede Reaktion dreimal mit 500 . gewaschen μL eiskalten 1X Bindungspuffer (enthaltend 0,1% BSA), wonach die Menge an eingefangenem [ 35 S]-Flag-TRF2 B quantifiziert wurde. In einem Experiment wurde die eingefangene Menge durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Exposition gegenüber einem PhosphorImager-Screen quantifiziert. In einem zweiten dreifach durchgeführten Experiment wurde die Menge an eingefangenem [ 35 S]-Flag-TRF2 ΔB durch Szintillationszählung quantifiziert. In beiden Experimenten wurden mit normalem Maus-IgG beschichtete Kügelchen als negative Kontrolle für das Einfangen (IgG) eingeschlossen.

2.12. Freigabe von vorab erfasstem [ 35 S]-markiertem Flag-TRF2 ΔB

Das [ 35 S]-markierte Flag-TRF2 B-Protein wurde zuerst auf den M2-beschichteten Kügelchen immobilisiert. Kurz, 80 μL M2-beschichtete Perlen wurden zu 800 hinzugefügt μL 1X Bindungspuffer mit 32 μL von [ 35 S]-Flag-TRF2 ΔB . Das Einfangen des Proteins wurde eine Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt, wonach die Kügelchen dreimal mit 500 gewaschen wurden μL eiskalter 1X Bindungspuffer (enthält 0,1% BSA). Die radioaktiven Kügelchen wurden dann in 80 ° C resuspendiert μL des gleichen Puffers. Um die Fähigkeit des 3XABA-Oligos zu beurteilen, das eingefangene Protein zu eluieren, wurden fünf Mikroliter dieser Kügelchen mit 45 μL 1X Bindungspuffer, der den angegebenen Kompetitor enthält (30 μM jeweils 3XFLAG, 3XABA oder 3XCTR) oder kein Wettbewerber (No Comp). Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Kügelchen heruntergezogen und die Radioaktivitätsmenge in den Überständen wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Exposition gegenüber einem PhosphorImager-Screen quantifiziert. In einem dreifach durchgeführten Experiment wurde die Menge an freigesetztem [ 35 S]-Flag-TRF2 ΔB auch durch Szintillationszählung quantifiziert. In beiden Experimenten wurden Kügelchen, die gekocht wurden, um das gesamte eingefangene [ 35 S]-markierte Protein freizusetzen, als positive Kontrolle für die Elution (Gesamt) eingeschlossen.

3. Ergebnisse

3.1. SELEX angetrieben durch den Anti-Flag M2-Antikörper

SELEX wurde verwendet, um die DNA-Bindungsspezifität eines humanen Flag-markierten Stn1-Proteins zu charakterisieren [18, 19], in diesem Fall hergestellt von in vitro Translation in einem zellfreien System von Kaninchen-Retikulozyten. Die in vitro translatiertes Flag-Stn1 wurde mit einem Pool von randomisierten ssDNA-Molekülen gemischt und dann wurde der Anti-Flag-M2-Antikörper verwendet, um die Flag-Stn1/DNA-Komplexe immunpräzipitieren, um nach hochaffinen Zielen zu selektieren. Nach sechs aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wurden die ausgewählten ssDNA-Moleküle kloniert und sequenziert. Die Analyse eines verwandten unselektierten Zufallspools ergab eine leichte Verzerrung für G-reiche Sequenzen, aber keine Hinweise auf wiederkehrende Motive [20]. Im Gegensatz dazu zeigte die Analyse der Flag-Stn1-selektierten Oligonukleotide ein zweiteiliges Konsensusmotiv, das aus zwei unterschiedlichen Elementen besteht: CCTTA und TGTCTWCC (wobei W = A/T Fig. 1(a)). Diese Elemente waren durch 2-3 Basen von schlecht konservierten Sequenzen getrennt. Das gleiche zweiteilige Konsensusmotiv wurde jedoch auch produziert, wenn SELEX mit dem gleichen Antikörper durchgeführt wurde, jedoch unter Verwendung eines scheinprogrammierten Retikulozytenlysats als Kontrollproteinquelle (Abbildung 1(b)). Basierend auf diesen Ergebnissen schlossen wir, dass der zweiteilige Konsensus nicht durch das Flag-Stn1-Protein ausgewählt wurde, sondern durch den M2-Antikörper selbst oder Proteine ​​des Lysats, mit denen der Antikörper kreuzreagierte.


(ein)
(B)
(ein)
(B) SELEX mit oder ohne Flag-Stn1-Protein ergibt denselben zweiteiligen Konsens. Ein randomisierter Pool von ssDNA-Molekülen wurde mit einem in vitro Translationssystem, das entweder mit einem Flag-Stn1-Plasmid (Flag-Stn1 vorhanden) oder Wasser (Flag-Stn1 fehlt) programmiert wurde, wonach Protein/DNA-Komplexe durch Immunpräzipitation unter Verwendung des Anti-Flag-M2-Antikörpers gewonnen wurden. Nach sechs aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wurden die verbleibenden Oligonukleotide kloniert und sequenziert. (a) Oligonukleotide, ausgewählt in Gegenwart des Flag-Stn1-Proteins. Die ausgewählten ssDNA-Moleküle teilen einen gemeinsamen zweiteiligen Konsensus, der aus den Motiven CCTTA (rosa) und TGTCTWCC (grün) besteht. Nicht-Nukleotid-Buchstaben bezeichnen mehrdeutige Sequenzierungs-Reads (R = A/G, Y = C/T, S = C/G, W = A/T, K = T/G, M = A/C). (b) Oligonukleotide, die in Abwesenheit des Flag-Stn1-Proteins ausgewählt wurden. Der gleiche zweigeteilte Konsens wird von den ssDNA-Molekülen geteilt, die von den scheinprogrammierten . ausgewählt wurden in vitro Übersetzungssystem.
3.2. Der M2-Antikörper bindet die Konsens-ssDNA-Motive

Um die Möglichkeit direkter Interaktionen zwischen dem zweiteiligen Konsensus und dem M2-Antikörper zu testen, wurde eine EMSA durchgeführt. Eine Reihe von [ 32 P]-markierten ssDNA-Sonden gleicher Länge, die jedes Element des Konsensus enthielten oder ihm fehlten, wurde hergestellt (Fig. 2(a)). Die Sonden AB, BA und ABA trugen sowohl das CCTTA- als auch das TGTCTWCC-Motiv, während die Sonden 2XB und 4XA aus mehreren Kopien des einen oder anderen Elements bestanden. Die nicht verwandte CTR-Sonde wurde als Negativkontrolle verwendet. 2(b) zeigt, dass der M2-Antikörper mit der ABA-Sonde und in geringerem Maße mit der AB-Sonde einen stabilen Komplex bilden könnte. Keine der anderen Sonden interagierte mit dem M2-Antikörper. Bemerkenswert ist auch, dass weder die BA-Sonde, der das CCTTA-Element fehlt, noch die AA-Sonde, der das TGTCTWCC-Element fehlt, mit dem Antikörper wechselwirkte, was anzeigt, dass beide Elemente für die Bindung essentiell sind. Fig. 2(b) zeigt auch, dass von 7 verschiedenen Antikörpern der M2-Antikörper nur mit der Sonde ABA interagierte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Sonde ABA sehr selektiv an den M2-Antikörper bindet, was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkungen die variablen Regionen des Antikörpers betreffen, sei es Teil der leichten Kette, der schweren Kette oder beides.


(ein)
(B)
(C)
(D)
(ein)
(B)
(C)
(D) Der zweiteilige ssDNA-Konsensus bindet direkt an den Anti-Flag-M2-Antikörper. (a) Sequenz und grafische Darstellung der verwendeten Sonden. Alle Sonden wurden am 5'-Ende mit [ 32 P] markiert. Sonden wurden entworfen, um keines, eines oder beide der identifizierten Motive zu tragen. Motiv A = CCTTA (rosa). Motiv B = TGTCTWCC (grün). (b) Der Anti-Flag-M2-Antikörper bindet selektiv an die Sonde ABA. Die angegebenen Sonden (80.000 cpm) wurden mit den aufgeführten Antikörpern (1 μg), wonach Protein/DNA-Komplexe durch Elektrophorese in einem nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt wurden. (c) Titration des M2-Antikörpers. Eine konstante Menge der Sonde ABA wurde mit einer steigenden Konzentration an M2-Antikörper inkubiert und die Protein/DNA-Komplexe wurden durch native Elektrophorese aufgetrennt. Bei höheren Antikörperkonzentrationen wird ein größerer Protein/DNA-Komplex beobachtet (oberer Pfeil), der das Produkt der Antikörper-Oligomerisierung darstellen kann. (d) Bindungsisotherme der Sonde ABA, die mit dem Anti-Flag-M2-Antikörper interagiert. Das Streudiagramm zeigt die Menge an gebundenem ABA (in beiden Protein/DNA-Komplexen vorhandene Menge) als Funktion der Antikörperkonzentration. Die gepunktete Linie zeigt die Anpassung der Daten an eine Sättigungsbindungskurve „einer Stelle“. Nichtlineare Regression der Daten zur Bestimmung der Dissoziationskonstante (

nM). Fehler beim Wert des

Um die Affinität des M2-Antikörpers für die Sonde ABA zu messen, wurde die scheinbare Dissoziationskonstante ( ) des Komplexes bestimmt. Eine Bindungsisotherme wurde von EMSA unter Verwendung einer konstanten Menge von [ 32 P]-ABA erzeugt, das mit einer steigenden Konzentration von M2-Antikörper inkubiert wurde ( 2(c)). Die Auftragung der gebundenen ABA-Menge als Funktion der Gesamtkonzentration des Antikörpers erzeugte eine Bindungsisotherme. Die Anpassung dieser Isotherme an eine Sättigungsbindungskurve „einer Stelle“ ermöglichte die Berechnung der . In diesem Fall wurde der scheinbare Wert von nM bestimmt (Fig. 2(d)). Der Wert ist vergleichbar mit dem offensichtlichen Wert anderer zuvor berichteter DNA-Aptamer/Antikörper-Komplexe [21]. Dieses Ergebnis zeigt, dass der M2-Antikörper mit hoher Affinität an seinen bevorzugten DNA-Liganden, die ABA-Sonde, bindet.

3.3. Das Flag-Peptid konkurriert mit der Bindung des ABA-Oligos an den M2-Antikörper

Der M2-Antikörper bindet sowohl an das Flag-Peptid (DYKDDDDK) als auch an die ABA-Sonde, daher versuchten wir festzustellen, ob die beiden Liganden umeinander konkurrieren könnten. In einer ersten Reihe von Experimenten fragten wir, ob ein Überschuss an 3XFLAG-Peptid (MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) die Bindung von [ 32 P]-markiertem ABA an den M2-Antikörper blockieren könnte. In der in Fig. 3(a) gezeigten EMSA wurde eine zunehmende Konzentration des 3XFLAG-Peptids mit dem M2-Antikörper vor der Zugabe des [ 32 P]-ABA inkubiert. Bei Konzentrationen von 50 nM und höher konnte das 3XFLAG-Peptid die Bindung von ABA an den M2-Antikörper vollständig blockieren. Eine ähnliche Hemmung wurde nach dem Einschluss eines Überschusses an unmarkiertem ABA-Oligo erzeugt, jedoch nicht nach der Zugabe des CTR-Oligos. Diese Ergebnisse zeigen, dass das 3XFLAG-Peptid mit der Bindung der Sonde ABA an den M2-Antikörper konkurriert.


(ein)
(B)
(ein)
(B) Das 3XFLAG-Peptid blockiert die Bindung von ABA an den M2-Antikörper. (a) Das 3XFLAG-Peptid verhindert die Bildung des ABA/M2-Komplexes. Der M2-Antikörper wurde mit einer steigenden Konzentration an 3XFLAG-Peptid inkubiert, wonach die [ 32 P]-ABA-Sonde zugegeben wurde. Protein/DNA-Komplexe wurden durch Elektrophorese in einem nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt. (b) Das 3XFLAG-Peptid eluiert die bereits an den M2-Antikörper gebundene ABA-Sonde. Das [ 32 P]-ABA wurde zuerst durch magnetische Beads eingefangen, die mit dem M2-Antikörper beschichtet waren. Die Kügelchen wurden dann mit einer steigenden Konzentration des 3XFLAG-Peptids inkubiert und die Menge an freigesetztem und auf den Kügelchen verbleibendem [ 32 P]-ABA wurde durch Szintillation gezählt (

In einer zweiten Reihe von Experimenten fragten wir, ob ein Überschuss an 3XFLAG-Peptid ein bereits an den M2-Antikörper gebundenes [ 32 P]-ABA-Oligo eluieren könnte. Zu diesem Zweck wurde [ 32 P]-ABA zunächst durch magnetische Beads eingefangen, die mit dem M2-Antikörper beschichtet waren, wonach eine steigende Konzentration des 3XFLAG-Peptids zugegeben wurde. In Fig. 3(b) wurden die an die Kügelchen gebundene ABA-Menge und die von den Kügelchen freigesetzte Menge als Funktion der Konzentration des 3XFLAG-Peptids aufgetragen. Die Daten zeigen, dass das ABA-Oligo durch die Zugabe des 3XFLAG-Peptids sehr effizient freigesetzt wurde. Eine kleine Fraktion von Oligo, die 36% darstellt, konnte nicht verdrängt werden, aber die andere Fraktion wurde durch 2000 nM 3XFLAG-Peptid fast vollständig freigesetzt. Die Anpassung der Daten an eine „One Site“-Wettbewerbskurve ermöglichte die Berechnung eines IC50. In Übereinstimmung mit den Werten der , der IC50 wurde mit 96 nM (95%-Konfidenzintervall: 72–127 nM) bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das 3XFLAG-Peptid das ABA-Oligo eluieren kann, wenn es an den M2-Antikörper gebunden ist.

3.4. Das 3XABA Oligo blockiert die Assoziation von Flag-markierten Proteinen mit dem M2-Antikörper

Wenn das ABA-Oligo und das Flag-Peptid um die Bindung an den M2-Antikörper konkurrieren, könnte ein Überschuss an ABA-Oligo möglicherweise die Elution von Flag-markierten Proteinen aus den M2-beschichteten Kügelchen ermöglichen, ein häufig verwendetes Verfahren bei der Proteinreinigung. Um diese Möglichkeit anzugehen, haben wir zuerst bestimmt, ob ein Überschuss an ABA-Oligo die Bindung von [S 35 ]-markiertem Flag-TRF2 B an M2-beschichtete Kügelchen blockieren könnte. In diesen Experimenten wurden die M2-beschichteten Beads zunächst mit den Kompetitoren (30 μM von 3XFLAG-Peptid, 3XABA- oder 3XCTR-Oligos) oder ohne Kompetitor (No Comp). Dann wurde das [S 35 ]-markierte Flag-TRF2 ΔB zugegeben und die Menge an [S 35 ], die von den Kügelchen eingefangen wurde, wurde entweder durch SDS-PAGE-Elektrophorese (Abbildung 4(a)) oder Szintillationszählung (Abbildung 4(b) )). Wie die Abbildungen 4(a)–4(b) zeigen, beseitigte das 3XFLAG-Peptid das Einfangen des [S 35 ]-markierten Proteins, während das 3XCTR-Oligo keine Wirkung hatte. Obwohl nicht so aktiv wie das 3XFLAG-Peptid, hemmte das 3XABA-Oligo das Einfangen von Flag-TRF2 B um 62 %. Das kürzere ABA-Aptamer wurde ebenfalls getestet, erwies sich jedoch als weniger aktiv (Abbildung S2), wobei ABA das Einfangen nur zu 45 % blockierte.


(ein)
(B)
(C)
(D)
(ein)
(B)
(C)
(D) 3XABA-Oligonukleotid blockiert die Interaktion von Flag-markierten Proteinen mit dem M2-Antikörper. (a)-(b) Das 3XABA-Oligo blockiert die Bindung von Flag-TRF2 B an M2-beschichtete Kügelchen. Mit dem M2-Antikörper beschichtete Magnetkügelchen wurden in Abwesenheit (No Comp) oder Gegenwart des angegebenen Kompetitors (3XABA, 3XCTR, 3XFLAG) inkubiert. In vitro translatiertes [ 35 S]-markiertes Flag-TRF2 B wurde dann zugegeben und die von den Kügelchen eingefangene Menge wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Exposition gegenüber einer PhophorImager-Kassette (a) bestimmt. In einem zweiten Experiment, das in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde, wurde die Menge des eingefangenen [ 35 S]-markierten Proteins durch Szintillation gezählt (b). Die Menge an [ 35 S]-markiertem Protein, die in Abwesenheit von Kompetitor (No Comp) eingefangen wurde, wurde willkürlich auf 100 % eingestellt. In beiden Experimenten wurden mit normalem Maus-IgG beschichtete Kügelchen als negative Kontrolle für das Einfangen (IgG) eingeschlossen. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D. (

). (c)-(d) Das 3XABA-Oligo eluiert die Flag-TRF2-ΔB-Proteine, die bereits an M2-beschichtete Kügelchen gebunden sind. Das [ 35 S]-Flag-TRF2 B-Protein wurde zuerst durch magnetische Beads eingefangen, die mit dem M2-Antikörper beschichtet waren. Die Kügelchen wurden dann in Abwesenheit (No comp) oder Anwesenheit des angegebenen Kompetitors (3XABA, 3XCTR, 3XFLAG) inkubiert. Die Menge an freigesetztem [ 35 S]-Flag-TRF2 B wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Exposition gegenüber einer PhophorImager-Kassette (c) bestimmt. In einem zweiten Experiment, das in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde, wurde die Menge an freigesetztem [ 35 S]-markiertem Protein durch Szintillation gezählt (d). Die durch das Kochen freigesetzte Menge an [ 35 S]-markiertem Protein (gesamt) wurde willkürlich auf 100 % eingestellt. In beiden Experimenten wurden Kügelchen, die gekocht wurden, um das gesamte eingefangene [ 35 S]-markierte Protein freizusetzen, als positive Kontrolle für die Elution (Gesamt) eingeschlossen. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D. (

Als nächstes fragten wir, ob ein Überschuss an 3XABA-Oligo ein [S 35 ]-markiertes Flag-TRF2 ΔB-Protein eluieren könnte, das bereits an die M2-beschichteten Kügelchen gebunden war. In diesen Experimenten wurde das [S 35 ]-markierte Protein zuerst von den M2-beschichteten Kügelchen eingefangen. Als nächstes wurden die radioaktiven Perlen den Konkurrenten ausgesetzt (30 μM von 3XFLAG-Peptid, 3XABA- oder 3XCTR-Oligos) oder zu keinem Kompetitor (No Comp) und die Menge an freigesetztem [S 35 ] wurde entweder durch SDS-PAGE-Elektrophorese ( 4(c)) oder Szintillationszählung ( 4( D)). Wie die Figuren 4(c)-4(d) zeigen, verursachte das 3XFLAG-Peptid die Freisetzung von 54% des eingefangenen Proteins, während das 3XCTR-Oligo keine Aktivität aufwies. Das 3XABA-Oligo war fast so wirksam wie das 3XFLAG-Peptid und bewirkte die Freisetzung von 36% des gebundenen Proteins.

4. Diskussion

Die ursprüngliche Absicht dieser Studie war es, SELEX zu verwenden, um die ssDNA-Bindungsspezifität von Flag-tagged Stn1, einer Untereinheit des CST-Komplexes, zu charakterisieren [18, 19]. Stattdessen wurde das SELEX-Verfahren für ssDNA-Moleküle angereichert, die mit hoher Affinität an den Anti-Flag-M2-Antikörper binden. Wie war diese Selektion durch den Antikörper überhaupt möglich? Erstens kann es sein, dass die in vitro Das translatierte Flag-Stn1-Protein besaß nicht die minimal erforderliche DNA-Bindungsaktivität. Eine unsachgemäße Faltung könnte zu diesem Mangel an Aktivität beigetragen haben. Alternativ kann es sein, dass die OB-fold-Domäne (Oligonukleotid/Oligosaccharid-Bindung) von Stn1 eher an der Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen als an der DNA-Bindung beteiligt ist [18, 19]. Zweitens ist das Flag-Epitop (DYKDDDDYK) stark negativ geladen, was es einem optimierten DNA-Molekül ermöglicht, die elektrostatische Signatur des Peptids nachzuahmen. Drittens ist ssDNA viel flexibler als dsDNA und könnte sich in dieser Hinsicht leichter an die positiv geladene Oberfläche der Antigen-bindenden Tasche des M2-Antikörpers anpassen [22]. Mit anderen Worten, wir schlagen vor, dass eine durch den Antikörper vermittelte Selektion nicht möglich gewesen wäre, wenn das Flag-Epitop neutral oder positiv geladen gewesen wäre, wenn SELEX unter Verwendung von dsDNA durchgeführt worden wäre oder wenn das Flag-markierte Stn1-Protein eine höhere Affinität für . gezeigt hätte ssDNA. Tatsächlich haben wir SELEX unter ähnlichen Bedingungen erfolgreich verwendet, um die ssDNA-Bindungsspezifität von POT1 zu definieren, einem Protein, das telomere DNA erkennt. Dieser SELEX, ebenfalls durchgeführt unter Verwendung des M2-Antikörpers, wurde fast ausschließlich auf Telomersequenzen selektiert, ohne dass ein Nachweis des zweiteiligen Motivs nachgewiesen wurde (Choi, K. H. und Ouellette, M. M., Manuskript in Vorbereitung). Die Selektion von Off-Target-Aptameren durch SELEX ist nicht ungewöhnlich, insbesondere bei der Selektion einzelsträngiger Nukleinsäuren [23]. Off-Target-Aptamere, die an die Selektionsmatrix binden (z. B. Avidin, M2-Antikörper), wie wir hier beobachtet haben, wurden auch von anderen beschrieben [23]. Daher sind Vorsicht und experimentelle Kontrollen erforderlich, insbesondere wenn ssDNA-Moleküle für ihre Bindung an ein Protein unbekannter Funktionalität ausgewählt werden. Unter diesen Bedingungen ist eine wichtige Kontrolle, wie wir sie hier durchgeführt haben, eine Scheinauswahl, um zu überprüfen, ob die Moleküle tatsächlich durch das interessierende Protein selektiert wurden.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass der identifizierte zweiteilige Konsensus selektiv und mit hoher Affinität an den M2-Antikörper bindet. Ein wichtiges Ergebnis war die Spezifität dieser Interaktion. Zum Beispiel band der Konsensus an keinen der anderen getesteten Antikörper, von denen viele zum gleichen Isotyp gehörten wie der M2-Antikörper (Maus-IgG1). Diese Spezifität implizierte, dass an den Wechselwirkungen die variablen Regionen des Antikörpers beteiligt waren, die zusammen die Antigen-Bindungstasche bilden. Diese Annahme wurde durch die Ergebnisse der Konkurrenzexperimente bestätigt. Wie Abbildung 4 zeigt, konnte der ssDNA-Konsensus das Flag-Peptid sehr effizient aus der Antigen-bindenden Tasche des M2-Antikörpers verdrängen. Umgekehrt könnte das Flag-Peptid in ähnlicher Weise auch das DNA-Aptamer vom Antikörper verdrängen (siehe Abbildung 3). Diese Konkurrenz zwischen dem Flag-Peptid und dem DNA-Aptamer impliziert, dass die beiden durch überlappende Bindungsdeterminanten an der Oberfläche des Antikörpers erkannt werden. Ein gemeinsames Merkmal des Flag-Peptids und des ABA-Aptamers ist ihre negative elektrostatische Ladung. Auf der Oberfläche des Antikörpers interagieren diese negativen Ladungen der beiden Liganden wahrscheinlich mit einigen derselben Bindungsdeterminanten. Die Bindungstasche des M2-Antikörpers scheint nur für die ersten 4 Aminosäuren des Flag-Peptids, nämlich DYKD, spezifisch zu sein [22]. In der Bindungstasche sind zwei Cluster von positiv geladenen Resten (Lysine, Arginin, Histidin) vorhanden, die jeweils ein Aspartat innerhalb des DYKD-Motivs koordinieren können. Dieselben zwei Cluster könnten potentiell mit Phosphatgruppen wechselwirken, die innerhalb des Rückgrats des ABA-Oligos vorhanden sind. Ebenfalls wichtig für die Bindung sind zwei Tyrosinreste, von denen jeder in der Lage ist, Stapelwechselwirkungen mit dem Tyrosin von DYKD auszubilden. Wenn sie an das ABA-Oligo gebunden sind, könnten dieselben Tyrosine Stapelwechselwirkungen mit einigen der Nukleotidbasen bereitstellen. Diese begrenzten Wechselwirkungen würden jedoch nicht ausreichen, um die beobachtete Sequenzspezifität zu erklären.Der ausgewählte Konsensus bestand aus zwei getrennten Motiven (CCTTA und TGTCTWCC) und die Mutation des einen oder anderen reichte aus, um die Bindung aufzuheben. Um die Erkennung dieses großen zweiteiligen Konsensus zu ermöglichen, müssen andere Reste impliziert werden, die mit mehreren der Nukleotidbasen in Kontakt treten. Daher muss es sein, dass das Flag-Peptid nur mit einer Teilmenge aller Reste interagiert, die an der Bindung von ABA beteiligt sind. Wenn ja, wie könnte das Flag-Peptid dann so effizient ABA vom M2-Antikörper verdrängen? Es ist möglich, dass die Bindungsdeterminanten, die die beiden Liganden teilen, für die Bindung von ABA besonders kritisch sind. Eine zweite Möglichkeit wäre, dass die Bindung des Flag-Peptids Veränderungen in der Konformation des Antikörpers verursacht und dass diese allosterischen Veränderungen mit der Bindung von ABA nicht kompatibel sind. Wie das ABA-Aptamer in der Lage ist, die Struktur des Flag-Peptids nachzuahmen, muss noch geklärt werden, aber diese Form der Nachahmung zwischen Peptid und DNA wurde bereits früher als eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen beschrieben und könnte auch wichtige Anwendungen im Arzneimitteldesign haben [ 5–9]. Das ABA-Oligo und das Flag-Peptid bieten ein ideales System, um die strukturellen Grundlagen dieser Form der molekularen Mimikry zu untersuchen.

Ein häufig verwendetes Verfahren bei der Proteinreinigung ist das Einfangen von Flag-markierten Proteinen durch den M2-Antikörper und ihre anschließende Freisetzung durch Inkubation mit einem Überschuss an 3XFLAG-Peptid [24]. Dieses Verfahren ermöglicht die Elution der gereinigten Proteine ​​unter nicht denaturierenden Bedingungen. Das Verfahren lässt jedoch das eluierte Protein mit einem Überschuss an 3XFLAG-Peptid in Lösung, was ein Problem darstellen kann, wenn das Flag-Tag funktionsfähig bleiben muss. Ein DNA-Aptamer, das die Flag-markierten Proteine ​​eluieren kann, wie 3XABA, könnte diese potentiellen Nachteile mildern. Sobald das Protein eluiert ist, könnte das DNA-Aptamer bequem durch ein Antisense-Oligo inaktiviert oder unter Verwendung von Spurenmengen von DNAse eliminiert werden. Alternativ, wenn das Aptamer biotinyliert ist, könnte seine Entfernung unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kügelchen erreicht werden. Schließlich würde ein DNA-Aptamer auch die Möglichkeit bieten, mutierte Oligos als Negativkontrollen oder zur differentiellen Elution von eingefangenen Proteinen zu verwenden.

Diese hier beschriebenen Ergebnisse können auch Auswirkungen auf die Behandlung von Autoimmunerkrankungen haben, die durch antinukleäre Antikörper ausgelöst werden. Frühere Versuche, die Funktion dieser Autoantikörper zu blockieren, wurden mit Peptidmimetika unternommen, die entweder aus Phagen-Display-Bibliotheken isoliert wurden oder von Peptid-Selbstantigenen stammen, mit denen diese antinuklearen Antikörper kreuzreagieren [10, 11]. Diese darin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass SELEX verwendet werden kann, um DNA-Aptamere zu identifizieren, die die Funktion eines bestimmten Antikörpers blockieren. Könnte dieser Ansatz verwendet werden, um Aptamere zu entwickeln, die die Funktion antinukleärer Autoantikörper blockieren? Bei bestimmten Autoimmunerkrankungen hat sich gezeigt, dass die Blockierung der Funktion antinukleärer Autoantikörper die Gewebeschädigung begrenzt [10, 11]. Die Sequenzspezifität antinukleärer Autoantikörper wurde nicht systematisch untersucht [3, 4]. SELEX wäre eine ideale Methode zur Charakterisierung der Sequenzspezifität antinukleärer Autoantikörper. Die SELEX-Daten könnten als Ausgangspunkt für das Design von Aptameren der zweiten Generation dienen, die nützlich sein könnten, um die Funktion dieser Autoantikörper zu blockieren. Die Entwicklung dieser DNA-Aptamere könnte daher einen alternativen Ansatz zur Behandlung von Patienten darstellen, die an systemischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen leiden.

5. Schlussfolgerung

Zusammenfassend identifizierte SELEX ein DNA-Aptamer, das direkt an die Antigen-bindende Tasche des Anti-Flag-M2-Antikörpers bindet. Das DNA-Aptamer und das Flag-Peptid konkurrierten um die Bindung an den M2-Antikörper und das Aptamer eluierte Flag-markierte Proteine ​​von einem immobilisierten M2-Antikörper. Dieses neue Reagens bietet daher eine alternative Methode zur Elution von Flag-markierten Proteinen, die an den M2-Antikörper gebunden sind, ein häufig verwendetes Verfahren bei der Proteinreinigung. Abgesehen von dieser unmittelbaren Anwendung in der Proteinreinigung zeigt die Identifizierung dieses zweiteiligen Konsensus die Machbarkeit der Verwendung von SELEX zur Entwicklung von DNA-Aptameren, die spezifische Antikörper blockieren. Die Anwendung dieses Ansatzes auf Autoantikörper, insbesondere die antinukleären Antikörper, könnte zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen führen.

Danksagung

Die Autoren möchten Titia de Lange (Rockefeller University, New York, NY) für das Plasmid pTetFLAGhTRF2 45-501 danken. Asserewou Honoré Etekpo wird für die Qualität seiner technischen Unterstützung gewürdigt. Sie möchten auch den Molecular Biology Core des UNMC Eppley Cancer Center und die DNA Sequencing Core Facility der UNMC würdigen. Dieses Papier wurde durch Zuschüsse des National Institute of Health (P50CA127297, P30CA036727) und ein GAANN-Stipendium des US-Bildungsministeriums (P200A090064) an A. S. Lakamp unterstützt.

Zusatzmaterialien

Abbildung S1: Western-Blot-Analyse des in vitro Flag-Stn1-Proteins.

Abbildung S2: Relative Wirksamkeit, mit der die verschiedenen Aptamere die Interaktion von Flag-markierten Proteinen mit dem M2-Antikörper blockieren.

Verweise

  1. R. Lyons, S. Narain, C. Nichols, M. Satoh und W. H. Reeves, „Effektiver Einsatz von Autoantikörpertests bei der Diagnose systemischer Autoimmunerkrankungen“, Annalen der New Yorker Akademie der Wissenschaften, Bd. 1050, S. 217–228, 2005. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  2. Y. J. Jang und B. D. Stollar, „Anti-DNA-Antikörper: Aspekte von Struktur und Pathogenität“, Zelluläre und molekulare Biowissenschaften, Bd. 60, nein. 2, S. 309–320, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  3. D. S. Pisetsky und S. A. Caster, „Bindungsspezifität eines monoklonalen Anti-DNA-Antikörpers“, Molekulare Immunologie, Bd. 19, nein. 5, S. 645–650, 1982. View at: Publisher Site | Google Scholar
  4. T. Sasaki, T. Muryoi, Y. Sekiguchi, E. Tamate, K. Yoshinaga und Y. Kitagawa, „Monoclonal human anti-DNA Antikörper from EB virus-transformed lymphocytes of systemic Lupus erythematodes (SLE)“ Zeitschrift für Klinische Immunologie, Bd. 5, nein. 4, S. 246–253, 1985. Ansicht bei: Google Scholar
  5. L. A. DeGiorgio, K. N. Konstantinov, S. C. Lee, J. A. Hardin, B. T. Volpe und B. Diamond, „Eine Untergruppe von Lupus-Anti-DNA-Antikörpern kreuzreagiert mit dem NR2-Glutamat-Rezeptor bei systemischem Lupus erythematodes.“ Naturmedizin, Bd. 7, nein. 11, S. 1189–1193, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  6. B. Deocharan, X. Qing, E. Beger und C. Putterman, „Antigene Auslöser und molekulare Ziele für Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörper“, Lupus, Bd. 11, nein. 12, S. 865–871, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  7. T. W. Faust, E. H. Chang, C. Kowal et al., „Neurotoxische Lupus-Autoantikörper verändern die Gehirnfunktion durch zwei verschiedene Mechanismen“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 107, Nr. 43, S. 18569–18574, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  8. J. B. Lefkowith, M. Kiehl, J. Rubenstein et al., „Heterogenität und klinische Bedeutung glomerulär bindender Antikörper bei systemischem Lupus erythematodes“, Journal of Clinical Investigation, Bd. 98, Nr. 6, S. 1373–1380, 1996. Ansicht bei: Google Scholar
  9. J. S. Rice, C. Kowal, B. T. Volpe, L. A. DeGiorgio und B. Diamond, „Molekulare Mimikry: Anti-DNA-Antikörper binden mikrobielle und Nichtnukleinsäure-Selbstantigene“, Aktuelle Themen der Mikrobiologie und Immunologie, Bd. 296, S. 137–151, 2005. Ansicht bei: Google Scholar
  10. B. Gaynor, C. Putterman, P. Valadon, L. Spatz, M. D. Scharff und B. Diamond, „Peptid-Hemmung der glomerulären Ablagerung eines anti-DNA-Antikörpers“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 94, Nr. 5, S. 1955–1960, 1997. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  11. H. B. Lee, B. A. Diamond und M. D. Blaufox, „In-vivo-Nachweis der Ablagerung von radioaktiv markiertem Lupus-Antikidney-Antikörper und dessen Hemmung durch lösliches Antigen“, Zeitschrift für Nuklearmedizin, Bd. 42, Nr. 1, S. 138–140, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  12. M. M. Ouellette und W. E. Wright, „Verwendung der reiterativen Selektion zur Definition von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen“, Aktuelle Meinung in der Biotechnologie, Bd. 6, nein. 1, S. 65–72, 1995. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  13. B. Zimmermann, I. Bilusic, C. Lorenz und R. Schroeder, „Genomic SELEX: a Discovery Tool for Genomic Aptamere“, Methoden, Bd. 52, nein. 2, S. 125–132, 2010. Ansicht auf: Website des Herausgebers | Google Scholar
  14. D. M. Tasset, M. F. Kubik und W. Steiner, „Oligonukleotid-Inhibitoren des menschlichen Thrombins, die verschiedene Epitope binden“, Zeitschrift für Molekularbiologie, Bd. 272, Nr. 5, S. 688–698, 1997. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  15. R. C. Becker, S. Oney, K. C. Becker und B. Sullenger, „Antidote-kontrollierte antithrombotische Therapie, die auf Faktor IXa und von Willebrand-Faktor abzielt“, Annalen der New Yorker Akademie der Wissenschaften, Bd. 1175, S. 61–70, 2009. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  16. C. P. Rusconi, E. Scardino, J. Layzer et al., „RNA-Aptamere als reversible Antagonisten des Gerinnungsfaktors IXa“, Natur, Bd. 419, Nr. 6902, S. 90–94, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  17. B. van Steensel, A. Smogorzewska und T. de Lange, „TRF2 schützt menschliche Telomere vor End-to-End-Fusionen“, Zelle, Bd. 92, Nr. 3, S. 401–413, 1998. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  18. C. M. Price, K. A. Boltz, M. F. Chaiken, J. A. Stewart, M. A. Beilstein und D. E. Shippen, „Evolution of CST function in telomere maintenance“, Zellzyklus, Bd. 9, nein. 16, S. 3157–3165, 2010. Ansicht auf: Website des Herausgebers | Google Scholar
  19. Y. Miyake, M. Nakamura, A. Nabetani et al., „Der RPA-ähnliche Säugetier-Ctc1-Stn1-Ten1-Komplex bindet an einzelsträngige DNA und schützt Telomere unabhängig vom Pot1-Weg.“ Molekulare Zelle, Bd. 36, nein. 2, S. 193-206, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  20. A. Prakash, A. Natarajan, L. A. Marky, M. M. Ouellette und G. E. Borgstahl, „Identification of the DNA-binding domains of human replication protein A thatcognize G-quadruplex DNA“, Zeitschrift für Nukleinsäuren, Bd. 2011, Artikel-ID 896947, 14 Seiten, 2011. Ansicht auf: Publisher-Site | Google Scholar
  21. S. D. Mendonsa und M. T. Bowser, „In-vitro-Evolution funktioneller DNA mit Kapillarelektrophorese“, Zeitschrift der American Chemical Society, Bd. 126, Nr. 1, S. 20–21, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  22. T. P. Roosild, S. Castronovo und S. Choe, „Struktur der Anti-FLAG-M2-Fab-Domäne und ihre Verwendung bei der Stabilisierung von konstruierten Membranproteinen“, Acta Crystallographica Sektion F, Bd. 62, nein. 9, S. 835–839, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  23. G. F. Joyce, „Gerichtete Evolution von Nukleinsäureenzymen“, Jahresrückblick Biochemie, Bd. 73, S. 791–836, 2004. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  24. A. Einhauer und A. Jungbauer, „Das FLAG-Peptid, ein vielseitiger Fusionsmarker zur Aufreinigung rekombinanter Proteine“, Zeitschrift für biochemische und biophysikalische Methoden, Bd. 49, S. 455–465, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar

Urheberrechte ©

Copyright © 2011 Amanda S. Lakamp und Michel M. Ouellette. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


2 Synthese von DNA-Amphiphilen

Ein DNA-Amphiphil basiert auf hydrophiler DNA, die ein kovalent verbundenes hydrophobes Segment enthält. 19 Normalerweise ist die hydrophobe Einheit ein Polymer oder ein kleines Molekül. Die lipophilen Modifikationen der DNA können durch Konjugation entweder am 3'- oder 5'-Terminus oder innerhalb der DNA-Sequenz erreicht werden, was den Aufbau komplexer Strukturen ermöglicht. 21-24

Diese hydrophoben Einheiten können an DNA konjugiert werden, entweder auf einem festen Träger während der DNA-Synthese oder durch Kopplung an bereits synthetisierte DNA-Einheiten in Lösung. Die erste erfolgreiche chemische Synthese eines Dinukleotids gelang 1955. 1985 wurden 25 stabile Desoxynukleosid-Phosphoramidite als Synthone eingeführt und damit das Feld eröffnet. 26 Heutzutage ermöglicht die Festphasensynthese (SPS) die Herstellung von DNA-Fragmenten von bis zu 200 Nukleotiden. Diese Technologie ermöglicht die Funktionalisierung oder Einführung von nicht-natürlichen Nukleotiden. 27 Die vollautomatische Synthese lässt sich präzise steuern, überwachen und zeichnet sich durch eine hohe Reproduzierbarkeit aus. Um den Anwendungsbereich von Syntheserobotern durch das Einbringen spezieller Lösungsmittel, Katalysatoren, extremer Reaktionsbedingungen oder langer Reaktionszeiten zu erweitern, kann der automatisierte Prozess durch die Spritzensynthesetechnik oder In-Flask-Reaktionen ersetzt werden, um verschiedene Modifikationen der DNA mit hydrophoben Einheiten zu realisieren. 20

Die Kopplung von DNA mit spezifischen Motiven in der Lösungsphase wurde als eine weitere sehr vielseitige Strategie demonstriert, die zuvor von unserer Gruppe besprochen wurde. 19 Die Lösungsphasensynthese dient der kovalenten Bindungsbildung zwischen funktionellen Gruppen wie Aminen 28 oder Thiolen 29 mit Gruppen wie Carbonsäuren 30 oder Maleinimiden. 31 Die Kupplung von DNA mit hydrophoben Molekülen in wässriger Lösung führt jedoch aufgrund der Lösungsmittelunverträglichkeit der Ausgangsmaterialien oft zu geringen Ausbeuten. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein Konjugationsprotokoll für die Kopplung hydrophober Moleküle an DNA mit hoher Effizienz veröffentlicht. 32 Durch Komplexieren von DNA mit positiv geladenen quartären Ammoniumtensiden neutralisierten wir die Ladung der DNA, sodass sie in organischen Lösungsmitteln löslich wurde. Die organische Phasenkopplungstechnik erweitert die Zahl der Möglichkeiten, amphiphile DNA-Hybride zu erzeugen.

Eines der am häufigsten verwendeten Lipide in DNA-Amphiphilen ist Cholesterin. Neben Cholesterin oder einem seiner Derivate weitere synthetische einkettige Fettsäuren, 33 Steroidmoleküle, 34 α-Tocopherol, 35 hydrophobe Polymere wie Poly(propylenoxid) (PPO), 21 oder das π-konjugierte System Porphyrin 36, 37 wurden erfolgreich in die DNA eingeführt (Abbildung 1). Daher stehen Syntheseprotokolle zur Verfügung, um eine Vielzahl hydrophober Einheiten an verschiedenen Positionen in die DNA einzuführen, was die Erforschung neuer Funktionalitäten in der Nanotechnologie ermöglicht. 38


Laden Sie diesen Artikel für Ihren persönlichen wissenschaftlichen, Forschungs- und Bildungsgebrauch herunter und drucken Sie ihn aus.

Kaufen Sie eine einzelne Ausgabe von Wissenschaft für nur 15 USD.

Wissenschaft Translationale Medizin

Band 3, Ausgabe 66
19. Januar 2011

Artikel Tools

Bitte melden Sie sich an, um eine Benachrichtigung für diesen Artikel hinzuzufügen.

Von Charles Preston Neff, Jiehua Zhou, Leila Remling, Jes Kuruvilla, Jane Zhang, Haitang Li, David D. Smith, Piotr Swiderski, John J. Rossi, Ramesh Akkina

Wissenschaft Translationale Medizin 19 Jan 2011 : 66ra6

Ein Aptamer mit zwei Funktionen, das sowohl auf ein HIV-1-Oberflächenprotein als auch auf eine kritische Boten-RNA abzielt, kann die HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen hemmen.


Methoden

Probenvorbereitung für Einzelmolekülmessungen

Das folgende Verfahren wurde verwendet, um fluoreszenzmarkierte RNA- und RNA-DNA-Komplexe herzustellen 27 . Kurz gesagt wurden alle Schritte mit fluoreszenzmarkierten Oligomeren im Dunkeln durchgeführt. Unmarkierte DNA-Oligomere, Primer und Plasmide (Ergänzungstabelle 1) wurden von Eurofins Genomics LLC und Integrated DNA Technologies bezogen. Fluoreszierend markierte Oligonukleotide wurden von Trilink (San Diego, CA) bezogen, einschließlich des Cy3-markierten 5′-Ende-Segments des F. ulcerans ZTP-Riboswitch (nt 1–33, Ergänzungstabelle 1) und die Cy5-markierte und biotinylierte Tether-DNA (Biotin-DNA-Cy5, Ergänzungstabelle 1). Fluorophore wurden an diese Oligomere über 6-Kohlenstoff-Amino-Linker an der C5-Position von U32 bzw. am 3'-Ende der biotinylierten DNA angehängt. ZTP-Riboswitch-RNAs, denen die ersten 33 Nukleotide (Δ1–33) fehlen, wurden transkribiert und von DNA-Matrizen gereinigt, die aus Plasmiden amplifiziert wurden 25,42. Mutationen am Terminatorstamm wurden über PCR-Amplifikation unter Verwendung eines die Mutationen enthaltenden reversen Primers vorgenommen. Δ1–33 RNAs wurden mit T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) phosphoryliert, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die Cy3-markierten nt 1–33 RNA und Δ1–33 RNAs wurden an eine DNA-Schiene angelagert, die mit der cDNA-dT . identisch ist20 in Einzelmolekülmessungen verwendet und unter Verwendung von T4-RNA-Ligase 2 (New England Biolabs) ligiert. Ligierte RNAs wurden durch 8% denaturierende Harnstoff-PAGE gereinigt, durch Elution in Whatman Elutrap Elektroelutionssystemen gewonnen, konzentriert, mit DEPC-Behandlungswasser gewaschen und in 0,22 &mgr;m Spinfiltern filtriert. Die Konzentrationen wurden anhand der Extinktion von Cy3 bei 552 nm berechnet (ε552 = 0.15 μM −1 cm −1 ) und die Extinktion der RNAs bei 260 nm (ε260 = 1,16 μM −1 cm −1 für die terminatorhaltigen RNAs und ε260 = 0,982 μM −1 cm −1 für die reine Aptamer-RNA) nach Korrektur des Beitrags der Cy3-Absorption bei 260 nm (

5% Korrektur). Die ligierten RNAs wurden aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei −20 °C im Dunkeln gelagert.

Fluoreszenzmarkierte RNAs für doppelte PIFE-Helikaseratenmessungen (Fig. 5d, e) wurden auf ähnliche Weise konstruiert, was zu RNAs führte, die mit der WT-Sequenz identisch waren und zwei Cy3-Markierungen enthielten. Für diese Experimente wurden drei RNAs ligiert, bestehend aus Segmenten, die die Riboswitch-Nukleotide 1–33, 34–71 und 72–94 überspannen. Die Segmente 1–33 enthielten entweder an Position U12 oder Position U32 eine Cy3-Markierung. Das Segment 72-94 enthielt eine Cy3-Markierung an Position U84 und enthielt auch die zur biotinylierten DNA komplementäre RNA-Sequenz.

Um angelagerte Heteroduplexe für Einzelmolekülmessungen zu bilden, 20 µl Reaktionsaliquote mit einem 1:0,8:10 Verhältnis von Cy3-RNA:Biotin-DNA-Cy5:cDNA-dT20 (160 nM Cy3-RNA, 128 nM Biotin-DNA-Cy5 und 1,6 μM cDNA-dT20) wurden in dem Puffer hergestellt, der 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) und 150 mM KCl enthielt. Die Reaktionsaliquote wurden in einem Thermocycler langsam von 95 °C auf 20 °C abgekühlt (30 s pro 5 °C). Der Annealing-Erfolg wurde auf 8% nicht denaturierender PAGE (in 1X FSME) im Vergleich zu Reaktionen ohne Biotin-DNA-Cy5, cDNA-dT . bewertet20, oder beides. Reaktionen ohne cDNA-dT20 wurden auch für Einzelmolekülmessungen gespeichert. Die Gele wurden mit einem Typhoon Trio Variable Mode Imager (GE Healthcare) gescannt, um Banden mit fluoreszierenden Markierungen zu identifizieren.

Für Dropoff-PIFE-Experimente (Abb. 5b, c) ist eine längere cDNA-dT20 (cDNA-Speedmer-dT20) wurde für Annealing-Reaktionen in Gegenwart eines am 3´-Ende mit Cy3 (18-Speedmer), der WT-Cy3-markierten RNA und Biotin-DNA-Cy5 markierten 18-nt-RNA-Oligos verwendet. Die Reaktionen enthielten ein 1:0,8:9:10-Verhältnis von Cy3-RNA:Biotin-DNA-Cy5:cDNA-Speedmer-dT20:18-Speedmer zur Sättigung von cDNA-Speedmer-dT20 mit 18-Gang. Der Annealing-Erfolg wurde wie oben über nicht-denaturierende PAGE bewertet.

Für Dropoff-Experimente (Ergänzende Abb.5), 20-μl-Reaktions-Aliquots mit einem Verhältnis von Biotin-DNA:cDNA-dT . von 1:1,2:1,2:1,220:Cy3-Oligo:Cy5-Oligo (1 μM Biotin-DNA, 1,2 μM cDNA-dT20, 1,2 µM Cy3-Oligo und 1,2 µM Cy5-Oligo) wurden in dem Puffer hergestellt, der 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) und 150 mM KCl enthielt. Die Reaktionsaliquote wurden in einem Thermocycler langsam von 95 °C auf 20 °C abgekühlt (30 s pro 5 °C). Die Auswahl von doppelt markierten oberflächengebundenen Molekülen stellte sicher, dass die abgebildeten Moleküle alle vier Oligos enthielten.

Einzelmolekülmessungen

Die vektorielle Faltung (VF) wurde mit dem folgenden Verfahren durchgeführt 23 . Kurz gesagt wurde Rep-X im Ladepuffer 5 min lang mit Heteroduplexen inkubiert, die auf der Bildgebungsoberfläche immobilisiert waren. Der Ladepuffer enthielt 50 nM Rep-X, 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 150 mM KCl und 10 mM MgCl&sub2;2. Freies Rep-X wurde ausgewaschen und das Abwickeln wurde durch Zugabe des Abwickelpuffers eingeleitet. Der Abwickelpuffer enthielt 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;2, 1 mM ATP und verschiedene Konzentrationen von ZMP. Um die verbleibende Aptamer-Konformation zu stabilisieren und von der Terminator-Konformation zu unterscheiden, wurde 1 mM ZMP nach 1 min vektorieller Faltung in den Bildgebungskanal zugeführt. Um die Heteroduplex-Abwicklung und die Riboswitch-Faltung in Echtzeit zu beobachten, wurde die Bildgebung gestartet

5 s vor Zugabe des Abwickelpuffers. Die während der Bildgebung verwendeten Lade- und Abwickelpuffer enthielten zusätzlich 4 mM Trolox, 0,8 Vol.-% Glukose, 165 U ml -1 Glukoseoxidase und 2170 U ml -1 Katalase, um die Photobleichungsrate zu reduzieren 43 .

Für VF-Multiple Turnover-Experimente mit Rep-X (Fig. 2d) wurden 50 nM Rep-X in den Abwickelpuffer eingeschlossen und es wurde kein separater Rep-X-Ladeschritt durchgeführt. Wenn PcrA-X anstelle von Rep-X verwendet wurde, wurden 100 nM PcrA-X in den Ladepuffer gegeben. Andere Pufferkomponenten wurden gleich gehalten.

Zur Rückfaltung von RNAs für Einzelmolekülmessungen wurden 20 µl Reaktionsaliquote mit einem Verhältnis von 1:0,8 Cy3-RNA:Biotin-DNA-Cy5 (160 nM Cy3-RNA und 128 nM Biotin-DNA-Cy5) in einem Puffer mit 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 150 mM KCl, 10 mM MgCl2 und unterschiedliche Konzentrationen von ZMP. Die Reaktionsaliquote wurden in einem Thermocycler langsam von 95 °C auf 20 °C abgekühlt (30 s pro 5 °C). Bei Rückfaltung bei 1 mM ZMP wurden RNAs innerhalb von 5 Minuten nach der Rückfaltung abgebildet, um den Verlust von ZMP-gebundenem Aptamer aufgrund der Bildung von Terminator-Haarnadeln zu minimieren.

Einzelmolekül-Datenerfassung und -analyse

Einzelmoleküldatenerfassung und -analyse wurden mit dem folgenden Verfahren 23,44 durchgeführt. Kurz gesagt wurden fluoreszenzmarkierte Proben auf DT20- oder PEG-Oberflächen durch eine Biotin-NeutrAvidin-Bindung 45,46 immobilisiert. Proben wurden mit einem auf Prismen basierenden Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-(TIRF)-Abbildungsmikroskop 47 abgebildet. Ein 532-nm-Laser (Coherent Compass 315 M) und ein 633-nm-Laser (Research Electro-Optics) wurden für die Cy3- bzw. Cy5-Anregung verwendet. Ein Wasserimmersionsobjektiv (NA 1.2, 60X, Olympus) und eine EMCCD-Kamera (Andor Technology IXon 897) wurden verwendet, um Signale mit einer Zeitauflösung von 0,075 s zu sammeln und aufzuzeichnen. Die Fluoreszenzemission wurde durch einen Langpassfilter (Semrock BLP02-561R-25) und einen Kerbfilter (Chroma ZET635NF) gefiltert, um die Anregungslaser zu blockieren. Räumlich getrennte Einzelmoleküle wurden durch einen benutzerdefinierten IDL-Code ausgewählt und ihre Intensitäten wurden für die weitere Analyse extrahiert. Um die Trajektorienüberlagerung darzustellen, haben wir die Trajektorien gemäß dem PIFE-Peakzentrum synchronisiert. Der Prozentsatz der Aptamer-ähnlichen Faltung wird als Verhältnis der Aptamer-Population (Magenta) zur Summe der Terminator- (grün) und Aptamer-Populationen berechnet.

Für Spuren mit mehreren PIFE-Peaks (Fig. 5d, e) wurden die Peakzentren durch Gauß'sche Anpassung in Origin (OriginLab, Northampton, MA) bestimmt und die Zeitunterschiede zwischen den PIFEs (Δt) wurden durch die Differenz zwischen den Peakzentren berechnet. Spuren, die anscheinend zu viele PIFE-Peaks enthalten, wurden von der Analyse ausgeschlossen (7 Spuren aus dem Datensatz 12–84 ausgeschlossen, 8 Spuren aus dem Datensatz 32–84 und 9 Spuren aus dem Tropfen-PIFE-Datensatz). Die Abwickelraten werden als Mittelwert ± s.e.m. angegeben. mit dem n ist die Anzahl der einzelnen Moleküle.

Für Dropoff-PIFE-Spuren (Abb. 5b, c) wurde der Abfall der Cy3-Intensität mit dem Auge bestimmt und die Zeit wurde aufgezeichnet. Die PIFE-Peak-Zentren wurden durch Gauß'sche Anpassung wie oben bestimmt. Die Zeitdifferenz (Δt) zwischen diesen beiden Ereignissen wurde für jede Spur berechnet und verwendet, um eine Helikase-Entwindungsrate (in nt s −1 ) mit dem bekannten Abstand von 34 nt zwischen den beiden Ereignissen zu bestimmen. Spuren mit mehr als einem PIFE-Peak wurden von der Analyse ausgeschlossen (9 Spuren ausgeschlossen). Die durchschnittliche Rate wird als Mittelwert ± SEM angegeben. mit n die Anzahl der einzelnen Moleküle (91 insgesamt).

Für Dropoff-Experimente (ergänzende Abb. 5) wurden die Abnahme des FRET-Werts und die Abnahme der Cy3-Intensität mit dem Auge bestimmt. Die Zeitdifferenz (Δt) zwischen diesen beiden Ereignissen wurde für jede Spur berechnet, und die durchschnittliche Abwickelrate wurde unter Verwendung aller Spuren berechnet, für die Δt weniger als 2 s für Rep-X (oder 10 s für PcrA-X) betrug, einschließlich Spuren, die in der Gaußschen Verteilung der Geschwindigkeiten enthalten sind.

Transkriptionsterminationsassays in einer Runde

PCR-Matrizen wurden von einem Plasmid amplifiziert, das eine 100-nt-Leadersequenz, einen λ Pr-Promotor, eine 26-nt-C-lose Region, die F. ulcerans ZTP-Riboswitch-Sequenz, die die Aptamerdomäne, die Expressionsplattform und 51 Nukleotide über die U8-Terminatorsequenz hinaus enthält. Nach der Amplifikation wurden die Matrizen durch 2% Agarosegelelektrophorese gereinigt. Mutationen an den Matrizen wurden durch ortsgerichtete Mutagenese des Plasmids hergestellt und durch Sequenzierung bestätigt.

Transkriptionsreaktionen wurden durch Anhalten der Transkription durch Weglassen von CTP und Neustarten der Transkription durch Hinzufügen von NTPs und ZMP 25 durchgeführt. Angehaltene Transkriptionskomplexe enthielten 80 pmol uL −1 DNA-Template, 20 mM Tris-HCl, pH 8, 20 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 4 % Glycerin, 0,14 mM ApU, 1 µM GTP, 2,5 µM ATP, 2,5 µM UTP,

1 µCi ml −1 [α- 32 P]-ATP, 0,04 U µL −1 Escherichia coli RNA-Polymerase-Holoenzym (Epicenter) und 10 μM eines 26 nt Oligonukleotids, das zur C-losen Region komplementär ist. Transkriptionen wurden durch Zugabe verschiedener Konzentrationen von NTPs und ZMP vor der Inkubation bei 37 °C für die Dauer des Zeitverlaufs neu gestartet, Aliquots nach Bedarf entfernt und Reaktionen durch Zugabe von Ladefarbstoff mit 8 M Harnstoff, 20 % Saccharose, 0,1 % gelöscht. SDS, 0,01 % Bromphenolblau, 0,01 % Xylolcyanol und auf Eis legen oder bei -20 °C lagern. Die Reaktionen wurden dann über 8% denaturierende Harnstoff-PAGE getrennt und analysiert 48,49. Um die scheinbaren Reaktionsraten für das Auftreten beendeter und durchgelesener Transkriptionsprodukte zu bestimmen, wurden Zeitverläufe durch einzelne exponentielle Anpassungen unter Verwendung von Origin angepasst. Für Einzelzeitpunkt-Titrationen wurden Reaktionen mit unterschiedlichen Konzentrationen von ZMP 20 min bei 37 °C inkubiert, und die Ergebnisse wurden an eine 1:1-Bindungsisotherme angepasst, um zu bestimmen T50 Werte.

Die sequentielle Faltung in silico wurde unter Verwendung von Mfold 50 mit unterschiedlich langen ZTP-Riboswitch-Transkripten als Eingaben durchgeführt.

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

Alle ITC-Messungen wurden mit dem folgenden Verfahren 51 unter Verwendung eines MicroCal iTC200 (Malvern, Egham, UK) durchgeführt und analysiert. Kurz gesagt wurden RNAs durch Erhitzen auf 95 °C für 2 min rückgefaltet und sofort auf Eis gelegt. MgCl2 wurde auf 10 mM zugegeben, die Probe wurde auf das Volumen gebracht und die RNA wurde bei 37 °C inkubiert, bevor die Titrationen bei 37 °C in einem Puffer durchgeführt wurden, der 50 mM Hepes-KOH, pH 7,4, 150 mM KCl und 10 . enthielt mM MgCl2. Typischerweise wurde die Zelle, die 20 µM RNA enthielt, mit 200 µM ZMP titriert, aber für schwächere Binder wurden höhere Konzentrationen verwendet.

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.


Rechenmethoden

Einzelzellen-Datenverarbeitung

Fastq-Dateien aus den 10x Genomics-Bibliotheken mit vier unterschiedlichen Barcodes wurden zusammengeführt und mit der standardmäßigen Drop-Seq-Pipeline (Drop-Seq-Tools v1.0, McCarroll Lab) verarbeitet. Die Lesevorgänge wurden an der verketteten hg19-mm10-Referenz ausgerichtet, und wir schlossen die oberen 50.000 Zell-Barcodes in die rohe digitale Ausdrucksmatrix als Ausgabe von Drop-Seq-Tools ein. Für die ADT- und HTO-Quantifizierung haben wir unsere zuvor entwickelte Tag-Quantifizierungspipeline [18] als Python-Skript implementiert, das unter https://github.com/Hoohm/CITE-seq-Count verfügbar ist und mit Standardparametern (maximale Hamming-Distanz von 1).

Demultiplexen mit Genotypisierungsdaten mit Demuxlet

Wir haben zuerst eine VCF-Datei generiert, die den individuellen Genotyp (GT) aus der Ausgabe des Infinium CoreExome 24-Arrays enthielt, unter Verwendung der PLINK-Befehlszeilentools (Version 1.07). Diese VCF-Datei (die Genotyp-Informationen für die 8 PBMC-Spender sowie HEK293T-Zellen enthielt) und die mit Tags versehene bam-Datei aus der Drop-Seq-Pipeline wurden als Eingaben für das Demuxlet [13] mit Standardparametern verwendet.

Einzelzell-RNA-Datenverarbeitung

Die Normalisierung und Downstream-Analyse von RNA-Daten erfolgte mit dem Seurat R-Paket (Version 3.0, Satija Lab [29]), das die integrierte Verarbeitung multimodaler (RNA, ADT, HTO) Einzelzelldatensätze ermöglicht [31, 32]. Mit der Funktion CollapseSpeciesExpressionMatrix haben wir die RNA-Expressionsmatrix der gemeinsamen Spezies reduziert, um nur die 100 am stärksten exprimierten Mausgene (zusammen mit allen menschlichen Genen) einzuschließen.

Wir betrachteten zunächst einen Satz von 20.854 Barcodes, bei denen wir mindestens 200 UMI in den Transkriptomdaten entdeckten. Da die HEK293T- und NIH-3T3-Zellen nicht mit HTOs markiert waren, identifizierten wir diese Zellen anhand ihrer Transkriptome. Wir führten ein Pre-Clustering mit niedriger Auflösung durch, indem wir PCA an den 500 am stärksten exprimierten Genen durchführten, gefolgt von k-medoides Clustering auf einer Distanzmatrix basierend auf den ersten 2 Hauptkomponenten [33,34,35]. Basierend auf dieser Clusterung identifizierten wir 160 NIH-3T3-Zellen und 2233 HEK293T-Zellen, wobei der Rest PBMCs darstellt.

Als separater Test der HEK293T-Identität haben wir den Demuxlet-Genotyp auf mögliche HEK293T-Zellen untersucht. Wir beobachteten 225 Barcodes, die vom Demuxlet-Algorithmus als HEK klassifiziert wurden, deren Transkriptome jedoch mit PBMCs gruppiert waren. Diese Zellen exprimierten zehnmal weniger UMI im Vergleich zu transkriptomisch klassifizierten HEK293T-Zellen und exprimierten keine HEK293T-spezifischen Transkripte (d. h. NGFRAP1), was beides mit einer PBMC-Identität übereinstimmt. Daher haben wir diese Barcodes von allen weiteren Analysen ausgeschlossen.

Klassifizierung von Barcodes basierend auf HTO-Levels

Die HTO-Rohzahlen wurden mithilfe der zentrierten Log-Ratio-(CLR)-Transformation normalisiert, wobei die Zahlen durch das geometrische Mittel einer HTO über die Zellen dividiert und log-transformiert wurden:

Hier, xich bezeichnet die Anzahl für ein bestimmtes HTO in Zelle ich, n die Gesamtzellzahl ist und Protokoll bezeichnet den natürlichen Logarithmus. Die paarweise Analyse von entweder normalisierten oder rohen HTO-Zählungen (Fig. 1B) zeigte sich gegenseitig ausschließende Beziehungen, obwohl die Bestimmung der genauen Cutoffs für positive und negative Signale eine weitere Analyse erforderte. Wir kamen zu dem Schluss, dass Ausreißer dieser Verteilung positive Signale darstellen würden, wenn wir eine Hintergrundverteilung für jedes HTO basierend auf „negativen“ Zellen bestimmen könnten.

Um die unbeaufsichtigte Identifizierung „negativer“ Zellen zu unterstützen, führten wir eine erste k-Medoids-Clustering für alle Zellen basierend auf den normalisierten HTO-Daten. Legen wir fest k = 9 und beobachtete (wie erwartet), dass acht der Cluster für die Expression eines bestimmten HTO stark angereichert waren, während der neunte Cluster für Zellen mit geringer Expression aller HTO stark angereichert war. Dies stellt eine erste Lösung des Demultiplexierungsproblems dar, das wahrscheinliche Populationen von „positiven“ und „negativen“ Zellen für die statistische Analyse vorschlägt.

Nach dem Clustern haben wir das folgende Verfahren unabhängig für jedes der acht HTOs durchgeführt. Wir haben die identifiziert k-medoids Cluster mit der höchsten durchschnittlichen HTO-Expression und schlossen diese Zellen aus. Als nächstes passen wir eine negative Binomialverteilung an die verbleibenden HTO-Werte an, nachdem wir die höchsten 0,5%-Werte als potenzielle Ausreißer weiter ausgeschlossen haben. Wir haben die berechnet Q = 0,99 Quantil der angepassten Verteilung und Schwellenwert für jede Zelle im Datensatz basierend auf diesem HTO-spezifischen Wert.

Mit diesem Verfahren haben wir für jeden Barcode eine „HTO-Klassifizierung“ ermittelt. Barcodes, die nur für ein HTO positiv waren, wurden als Singlets klassifiziert. Barcodes, die für zwei oder mehr HTOs positiv waren, wurden als Multipletts klassifiziert und ihnen wurden Proben-IDs basierend auf ihren beiden am stärksten exprimierten HTOs zugewiesen. Barcodes, die für alle acht HTOs negativ waren, wurden als „negativ“ klassifiziert.

Wir gehen davon aus, dass als „Singlets“ klassifizierte Barcodes einzelne Zellen darstellen, da wir nur ein einzelnes HTO erkennen. Sie könnten jedoch auch Dubletts eines PBMC mit einer HEK293T- oder NIH-3T3-Zelle darstellen, da die letzteren beiden Populationen unmarkiert waren und Negativkontrollen darstellen. Als wir die „HTO-Klassifikation“ von Zellen analysierten, die transkriptomisch als HEK293T- oder NIH-3T3-Zellen annotiert wurden, stellten wir fest, dass 60,1 % als „negativ“ bezeichnet wurden, während 32,1 % als Singuletts bezeichnet wurden, in Übereinstimmung mit unseren erwarteten Verhältnissen in unserem „supergeladenen“ 10-fach Genomics-Experiment. Diese Zellen erscheinen in der Heatmap in Fig. 1C, aber alle HEK293T- und NIH-3T3-Zellen wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Für die 2D-Visualisierung der HTO-Niveaus (Abb. 1D) haben wir aus den normalisierten HTO-Daten berechnete euklidische Distanzen als Eingaben für tSNE verwendet. Zellen werden basierend auf ihrer HTO-Klassifizierung wie zuvor beschrieben gefärbt. Zur Visualisierung und Clusterung basierend auf transkriptomischen Daten (Abb. 1F) führten wir zunächst PCA an den 1000 höchst variabelsten Genen (bestimmt durch Varianz/Mittelwert-Verhältnis) durch und verwendeten die Distanzmatrix, die durch die ersten 10 Hauptkomponenten definiert wurde, als Eingabe für tSNE und graphenbasiertes Clustering in Seurat (Fig. 1E). Wir haben die sieben Cluster basierend auf kanonischen Markern für bekannte hämatopoetische Populationen annotiert.

Vergleich mit Demuxlet

Demuxlet-Klassifikationen wurden gemäß der BEST-Spalte in der *.best-Ausgabedatei als Singlets (SNG), Dubletts (DBL) oder Ambiguous (AMB) gekennzeichnet. In Abb. 2e zeichnen wir die Posterior-Wahrscheinlichkeit einer Dublett-Zuweisung aus der PRB.DBL-Spalte in derselben Datei.

Berechnung des Färbeindex für Antikörpertitrationen

Um die optimale Färbeeffizienz für CITE-seq-Experimente zu bewerten, betrachteten wir die ADT-Spiegel für Zellen über einen Bereich von Antikörperkonzentrationen als Multiplex in einer Titrationsserie. Die ADT-Spiegel wurden unter Verwendung einer CLR-Transformation von Rohzählungen unter Verwendung eines identischen Ansatzes zur Normalisierung der HTO-Spiegel wie zuvor beschrieben normalisiert.

Nach der Normalisierung berechneten wir einen Färbeindex basierend auf Standardansätzen in der Durchflusszytometrie, die die Differenz zwischen positiven und negativen Peak-Medianen dividiert durch die Streuung (d. h. die doppelte mittlere absolute Abweichung) des negativen Peaks untersuchen.

Um eine manuelle Klassifizierung von positiven und negativen Peaks zu vermeiden, haben wir ein automatisiertes Verfahren implementiert, das auf mehrere Antikörper und Konzentrationen skaliert werden kann. Um den negativen Peak anzunähern, nutzten wir ungefärbte Kontrollzellen (Spender H). Um den positiven Peak anzunähern, haben wir die ADT-Daten in jedem Titrationsexperiment (Donor A bis Donor G) geclustert. Um das Clustering durchzuführen, haben wir eine euklidische Distanzmatrix über Zellen basierend auf normalisierten ADT-Niveaus berechnet und diese als Eingabe für die FindClusters-Funktion in Seurat mit Standardparametern verwendet. Wir untersuchten die Ergebnisse, um den Cluster mit dem maximal angereicherten ADT-Signal zu identifizieren und bezeichneten die Verteilung der ADT-Spiegel innerhalb dieses Clusters als den positiven Peak.

Unterscheiden minderwertiger Zellen von Umgebungs-RNA

Wir haben die HTO-Klassifizierung von Barcodes geringer Qualität (mit einem Ausdruck zwischen 50 und 200 UMI) unter Verwendung der zuvor festgelegten HTO-Schwellenwerte durchgeführt. Für jeden Barcode haben wir seine Expression als eine unserer zuvor bestimmten 7 hämatopoetischen Populationen unter Verwendung von Random Forests klassifiziert, wie im Ranger-Paket in R implementiert [36]. Zuerst trainierten wir einen Klassifikator auf den 13.954 PBMCs, wobei wir die 1000 variabelsten Gene als Input und ihre Clustering-Identitäten als Trainingslabels verwendeten. Diesen Klassifikator haben wir dann auf jeden der Barcodes von geringer Qualität angewendet. Wir weisen darauf hin, dass dieser Klassifikator garantiert ein Ergebnis für jeden Barcode zurückgibt.


Capture-SELEX: Auswahl von DNA-Aptameren für Aminoglykosid-Antibiotika

Kleine organische Moleküle sind herausfordernde Ziele für eine Aptamer-Selektion unter Verwendung der SELEX-Technologie (SELEX – Systematic Evolution of Ligans by EXponential Enrichment). Sie sind häufig nicht für die Immobilisierung auf festen Oberflächen geeignet, was bei bekannten Aptamer-Selektionsverfahren ein übliches Verfahren ist. Das Capture-SELEX-Verfahren ermöglicht die Auswahl von DNA-Aptameren für gelöste Ziele. Eine spezielle SELEX-Bibliothek wurde mit dem Ziel konstruiert, diese Bibliothek auf magnetischen Beads oder anderen Oberflächen zu immobilisieren. Zu diesem Zweck wurde eine Docking-Sequenz in den Random-Bereich der Bibliothek eingebaut, die eine Hybridisierung an ein komplementäres Oligo ermöglicht, das auf Magnetbeads fixiert ist. Oligonukleotide der Bibliothek, die eine hohe Affinität zum Ziel und eine zum Ziel passende Sekundärstruktur aufweisen, werden von den Kügelchen zur Bindung an das Ziel während des Aptamer-Selektionsverfahrens freigesetzt. Als Ausgangspunkt der folgenden Selektionsrunde wurden die Oligonukleotide dieser Bindungskomplexe amplifiziert, gereinigt und über die Andocksequenz an die Magnetbeads immobilisiert. Basierend auf diesem Capture-SELEX-Verfahren wird die erfolgreiche DNA-Aptamer-Selektion für das Aminoglykosid-Antibiotikum Kanamycin A als niedermolekulares Target beschrieben.

1. Einleitung

Aptamere sind eine sehr attraktive Klasse von Targeting-Molekülen, die in vielen Anwendungsbereichen stark nachgefragt werden, wie z ). Aptamere sind von Natur aus Nukleinsäuremoleküle, ihre Funktionalität beruht jedoch auf ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur, die sich von der herkömmlichen Auffassung von Nukleinsäuren als Träger genetischer Information unterscheidet. Die komplexe Faltung der kurzen, einzelsträngigen DNA- oder RNA-Aptamere entsprechend ihrer Primärsequenz ermöglicht es ihnen, mit hoher Affinität und Spezifität an das vorgegebene Target zu binden. Die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Aptamer und Target sind durch eine Kombination aus komplementärer Form, Stapelwechselwirkungen zwischen aromatischen Verbindungen und den Nukleobasen der Aptamere, elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen geladenen Gruppen und Wasserstoffbrücken gekennzeichnet [1–3]. Seit der ersten Veröffentlichung von Aptameren im Jahr 1990 [4, 5] wurden sie für eine Vielzahl unterschiedlicher Zielklassen beschrieben, von kleinen Molekülen wie Nukleotiden, Cofaktoren oder Aminosäuren über Peptide, Polysaccharide und Proteine ​​bis hin zu komplexen Strukturen wie ganzen Zellen, Viren und einzellige Organismen [6].Die im Laufe der Jahre wachsende Zahl von Aptamer-Publikationen, die deren Auswahl und Anwendung beschreiben, zeigt das große Interesse an diesem Forschungsgebiet. Eine der Herausforderungen in diesem Bereich ist die Optimierung der Methodik, um neue Aptamere mit herausragenden Bindungsfähigkeiten für ein bestimmtes Ziel zu erhalten. Aptamere werden normalerweise durch eine In-vitro-Selektions- und Amplifikationstechnologie namens SELEX – Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung erzeugt. [4, 5]. Der SELEX-Prozess ist ein iterativer Prozess. Aus einer DNA-Oligonukleotid-Bibliothek mit großer Sequenzvielfalt und struktureller Komplexität werden nur solche Oligonukleotide ausgewählt und während mehrerer SELEX-Runden angereichert, die sehr fest an das spezifische molekulare Target binden können [7, 8]. Grundlegende Schritte des SELEX-Verfahrens sind die Bindungsreaktion zwischen Oligonukleotiden und Target, Waschschritte zur Entfernung ungebundener Oligonukleotide, enzymatische Amplifikation von Target-gebundenen Oligonukleotiden und Reinigung des ausgewählten Oligonukleotidpools, um anschließend die nächste Selektionsrunde zu starten. Die am besten passenden Sequenzen überleben das Selektionsverfahren und repräsentieren den zielspezifischen Aptamerpool als Ergebnis eines erfolgreichen SELEX-Prozesses. Seit der frühen Phase der Anwendung der SELEX-Technologie wurde sie häufig modifiziert, um den Selektionsprozess effizienter und weniger zeitaufwendig zu gestalten und Aptamere mit besonderen Bindungseigenschaften (Affinität und Spezifität) für verschiedene Zielmoleküle und für verschiedene Anwendungen auszuwählen. Variationen betreffen oft die Bindungsbedingungen (Puffer, Temperatur und Zeit), die effiziente Trennung von zielbindenden und nicht bindenden Oligonukleotiden [9], die Einführung zusätzlicher Selektionsschritte, wie negative oder Gegenselektionsschritte, um unspezifisch bindende Oligonukleotide zu entfernen oder zwischen zu unterscheiden eng verwandte Zielmoleküle, die Stringenz der Waschschritte der Oligonukleotid-Ziel-Komplexe zur Verbesserung der Spezifität der zu selektierenden Aptamere, die Markierung der Oligonukleotide zur Quantifizierung oder die Elution der Oligonukleotide aus dem Bindungskomplex vor der Amplifikation [7] . Ein wichtiger Aspekt einer Aptamer-Selektion ist auch das Design der SELEX-Bibliothek und die Verwendung von Modifikationen auf Nukleotid-Ebene oder an den Enden der Oligonukleotide. Solche Modifikationen können verwendet werden, um die Stabilität der Oligonukleotide zu erhöhen, die für die Selektion von RNA-Aptameren notwendig sind, oder um neue Eigenschaften wie funktionelle Gruppen einzuführen, um neue Möglichkeiten für die Interaktion mit Zielmolekülen zu bieten [6, 10, 11]. Die zahlreichen SELEX-Varianten zeigen, dass es kein Standard-Auswahlprotokoll gibt, das auf irgendeine Art von Ziel anwendbar ist. Die Auswahlbedingungen müssen im Hinblick auf die spezifischen Zielmerkmale und die gewünschte Anwendung der Aptamere sorgfältig angepasst werden. Medizinische und analytische Anwendungen können beispielsweise unterschiedliche Anforderungen an die Arbeitsbedingungen des Aptamers wie Pufferzusammensetzung oder Temperatur stellen. Die Sondenmatrix stellt häufig Herausforderungen an die Aptamerstabilität und Spezifität, die während des Aptamerauswahlprozesses durch Nukleinsäuremodifikationen und Gegenselektionsschritte beeinflusst werden können.

In diesem Papier beschreiben wir die Entwicklung einer SELEX-Variante namens Capture-SELEX. Es leitet sich teilweise von dem 2005 veröffentlichten FluMag-SELEX-Verfahren ab [12], das durch die Immobilisierung der Zielmoleküle auf magnetischen Beads und die Fluoreszenzmarkierung der Oligonukleotide zur Quantifizierung gekennzeichnet ist. Der Hauptunterschied zwischen beiden ist die Präsentation der Zielmoleküle und der Oligonukleotide. Ziel war es, DNA-Aptamere für Targets auszuwählen, die nicht für die Immobilisierung auf festen Oberflächen geeignet sind, wie kleine organische Moleküle, zum Beispiel Pharmazeutika. Daher wurde nach Nutiu und Li, 2005 [13] eine spezielle SELEX-Bibliothek entwickelt, um die Immobilisierung der Oligonukleotide anstelle der Zielmoleküle während des Aptamer-Selektionsprozesses zu ermöglichen. Dieses Papier beschreibt auch die erfolgreiche Anwendung des Capture-SELEX-Verfahrens unter Verwendung einer Mischung von Pharmazeutika (Kanamycin A, Sulfacarbamid, Sulfamethoxazol und Sotalolhydrochlorid) als Aptamer-Selektionsziele. Arzneimittelrückstände finden sich in Oberflächen-, Grund- und Trinkwasser. Sie entstehen meist durch die Behandlung von Mensch und Tier. Antibiotika sind in diesem Zusammenhang ein zunehmendes Thema. Ihre Einführung in die Umwelt fördert die Vermehrung von Genen für Antibiotikaresistenzen in Bakterien. Aptamere mit Spezifität für Pharmaka können in Biosensoren und Assays zum schnellen und einfachen Nachweis dieser Substanzen eingesetzt werden [14]. Unter Berücksichtigung dieser Anforderung haben wir die oben genannte Zielmischung bestehend aus drei Antibiotika und dem Betablocker Sotalolhydrochlorid zusammengestellt. Mit dem Capture-SELEX-Verfahren wurde ein Aptamerpool mit Spezifität für Kanamycin A angereichert.

2. Materialien und Methoden

2.1. Chemikalien

Alle Chemikalien zur Herstellung von Puffern und Lösungen wurden von Merck (Deutschland) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Kanamycin A-Disulfatsalz-Dihydrat, Sulfacarbamid, Sulfamethoxazol und Sotalolhydrochlorid wurden von Sigma-Aldrich (Deutschland) bezogen. PCR (Polymerase Chain Reaction) Komponenten wie 10×Reaktionspuffer, 25 mMMgCl2und HOTFire-Polymerase wurden von Solis BioDyne (Estland) bezogen. 100 mM Stammlösungen von dNTPs stammten von GE Healthcare (Deutschland).

2.2. Capture-SELEX-Bibliothek, Capture Oligo und Primer

Die Capture-SELEX-Bibliothek BANK-S4 wurde von Microsynth (Schweiz) synthetisiert, einschließlich eines PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese)-Reinigungsschritts. Die Bibliothek besteht aus einer Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotide. Jeder von ihnen enthält spezifische Primerbindungsstellen (PBSs) von 18 nt an den 5'- und 3'-Enden und zwischen zwei unterschiedlich großen Zufallsregionen (N), die durch eine spezifische Andocksequenz von 12 nt getrennt sind: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N'10—TGAGGCTCGATC—N40—AGATAGTAAGTGCAATCT-3′ (Abbildung 1) [12, 15]. Die folgenden Primer wurden zur Amplifikation der Oligonukleotide während des Aptamer-Selektionsprozesses verwendet und von biomers.net (Deutschland) synthetisiert: AP10:5′-ATACCAGCTTATTCAATT-3′, AP60: die modifizierte Variante von AP10 mit 5′-Fluorescein, AP20 :5′-AGATTGCACTTACTATCT-3′ und TER-AP20:die modifizierte Variante von AP20 mit 5′-poly-dA20-HEGL [12]. Das Capture-Oligo i-ODN2Sp zeichnet sich durch eine zur Docking-Sequenz der Oligonukleotide in der Bibliothek komplementäre Sequenz aus: 5'-Bio-GTC-HEGL-GATCGAGCCTCA-3' (Abbildung 1). Es enthält außerdem drei zusätzliche Nukleotide und einen Hexaethylenglycol-Spacer (HEGL) am 5'-Ende. Das Capture-Oligo ist mit 5'-Biotin modifiziert und wurde ebenfalls von Microsynth (Schweiz) einschließlich eines PAGE-Reinigungsschritts synthetisiert.


Spezifische Zusammensetzung der Capture-SELEX-Bibliothek BANK-S4 und der Capture-Oligos i-ODN2Sp und i-ODN4Sp. PBS1 und PBS2 repräsentieren die Primer-Bindungsstellen jedes Oligonukleotids in der Bibliothek.
2.3. Kopplung von Einfangoligos an Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen

Superparamagnetische Dynabeads M-270 Streptavidin (Durchmesser 2,8 .) μm) wurden von Invitrogen/Life Technologies (USA) bezogen. Eine geeignete Menge dieser Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen wurde aus der Stammlösung in ein Probenröhrchen überführt und dreimal mit 500 gewaschen μL B&ampW-Puffer (Bindungs- und Waschpuffer, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA und 2 M NaCl). Die Perlen wurden getrennt, indem das Röhrchen in einen Magnetständer gelegt wurde. Nach dem Waschen der Kügelchen wurden sie in B&ampW-Puffer auf eine Konzentration von 2 × 10 9 Kügelchen/ml resuspendiert und ein gleiches Volumen des biotinylierten Einfangoligo i-ODN2Sp wurde zugegeben (600 pmol biotinyliertes Oligo/1 × 10 8 Kügelchen). Diese Immobilisierungsmischung wurde dann 1 h bei Raumtemperatur unter leichter Rotation unter Verwendung eines Überkopfschüttlers (Intelli-Mixer RM-2, neoLab, Deutschland) inkubiert. Die Perlen wurden getrennt und dreimal mit 500 . gewaschen μL B&W Puffer und danach dreimal mit 500 μL Selektionspuffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl und 1 mM CaCl2). Nach Resuspendieren in Selektionspuffer auf eine Endkonzentration von 1×10 9 Beads/ml sind die Streptavidin-beschichteten Magnetbeads, die nun mit dem biotinylierten Capture-Oligo i-ODN2Sp modifiziert sind, einsatzbereit im Capture-SELEX-Prozess. Die Beadkonzentration kann durch mikroskopisches Zählen (Mikroskop Olympus BX60, Olympus Europa Holding GmbH, Deutschland) mit einer nach Neubauer verbesserten Zählkammer genauer bestimmt werden.

2.4. Ziellösung

Vier Pharmazeutika (Kanamycin-A-Disulfatsalz-Dihydrat, Sulfacarbamid, Sulfamethoxazol und Sotalolhydrochlorid, siehe Tabelle 1) wurden als Zielmischung für die Aptamer-Selektion verwendet. Einzelne Stammlösungen der Pharmazeutika wurden hergestellt, in Selektionspuffer verdünnt und auf die Endkonzentration von 1 mM für jede Substanz gemischt. Diese Mischung wurde unter Verwendung eines Spritzenfilters mit einer Porengröße von 0,22 sterilfiltriert μm (VWR, Deutschland), aliquotiert und bei -18°C gelagert.

2.5. Capture-SELEX-Prozess

Jede Capture-SELEX-Runde beginnt mit der thermischen Äquilibrierung des Oligonukleotidpools im Selektionspuffer. 2-3 nmol der Bibliothek-Oligonukleotide in der ersten Runde bzw. in jeder der folgenden Runden die Gesamtmenge der ausgewählten Oligonukleotide aus der vorherigen Runde wurden 8 min lang auf 90°C erhitzt, sofort abgekühlt und bei . gehalten 4°C für 10 min gefolgt von einer kurzen Inkubation bei Raumtemperatur. Parallel dazu wurde ein Aliquot der mit den Fängeroligos modifizierten Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen (1 × 10 9 Kügelchen in der ersten Runde und 1 × 10 8 Kügelchen in jeder der folgenden Runden) dreimal mit 500 gewaschen μL Auswahlpuffer. Die Perlen wurden in 300 resuspendiert μ1 des vorbehandelten Oligonukleotidpools und über Nacht bei 21°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Dieser Schritt dient der Immobilisierung der Oligonukleotide aus dem Pool auf den magnetischen Beads durch Hybridisierung zwischen der Andocksequenz innerhalb der Oligonukleotide und den Fänger-Oligos auf den Beads. Ungebundene Oligonukleotide wurden durch neunmaliges Waschen der Kügelchen mit 500 . entfernt μL Auswahlpuffer. Im Temperaturschritt wurden alle verbleibenden unhybridisierten Oligonukleotide oder geschwächte DNA-Duplex-Strukturen durch Inkubation der DNA-Bead-Komplexe in 500 . eliminiert μL Selektionspuffer bei 28°C für 15 min unter leichtem Schütteln und anschließend siebenmal Waschen mit 500 μL Auswahlpuffer. Die anschließende Inkubation der DNA-Bead-Komplexe in 300 μL Selektionspuffer bei 21°C für 45 min unter leichtem Schütteln dient als Kontrolle für die Hintergrundelution hybridisierter Oligonukleotide von den Kügelchen, die durch das Inkubationsverfahren verursacht wurde. Nach siebenmaligem Waschen mit 500 μL Selektionspuffer wurden die DNA-Bead-Komplexe 45 min bei 21°C unter leichtem Schütteln in 300 . inkubiert μL des Zielgemisches (siehe Abschnitt 2.4). Oligonukleotide mit Affinität zum Selektionsziel können sich zur Bindung an das Ziel in Lösung in eine spezifische dreidimensionale Struktur falten und werden daher während dieses Zielbindungsschrittes aus den DNA-Bead-Komplexen freigesetzt. Sie können im Überstand durch magnetische Abtrennung von den Beads gesammelt werden.

Diese an das Target gebundenen ausgewählten Oligonukleotide wurden in 15 parallelen PCR-Reaktionen direkt amplifiziert. Jeder enthielt 1 μM der Primer AP60 und TER-AP20, je 0,2 mM dNTPs, 1,9 mM MgCl2, und 5 U HOTFire-Polymerase in PCR-Reaktionspuffer (80 mM Tris-HCl pH 9,5, 20 mM (NH4)2SO4, und 0,02% Tween20) in einem Volumen von 100 μL. Die Amplifikationsbedingungen waren 15 min bei 95 °C und 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 1 min bei 51 °C, 1 min bei 72 °C und ein letzter Schritt von 10 min bei 72 °C nach dem letzten Kreislauf. Als Ergebnis wurden dsDNA-Produkte mit einer Fluorescein-Modifikation am 5'-Ende des relevanten Sense-Strangs und einem poly-dA . erhalten20 Verlängerung am 5'-Ende des Antisense-Strangs. Elektrophorese auf 2,5% Agarosegel wurde verwendet, um die erfolgreiche Amplifikation und die korrekte Größe der amplifizierten DNA zu überwachen. Ein Einfluss der Pharmazeutika auf die PCR-Reaktionen wurde überprüft und konnte nicht beobachtet werden.

Alle PCR-Produkte wurden gepoolt, mit Ethanol in Gegenwart von linearem Polyacrylamid [19] präzipitiert und in 100 resuspendiert μL TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA). Die beiden Stränge der dsDNA unterscheiden sich in der Länge aufgrund des poly-dA20 Verlängerung des Antisense-Strangs [20]. Dies wurde für die Trennung der beiden DNA-Stränge in einer präparativen denaturierenden PAGE mit einem 8 % Polyacrylamidgel mit 7 mM Harnstoff und 20 % Formamid in TBE-Puffer (90 mM Tris-HCl, 90 mM Borsäure und 2 mM EDTA) verwendet. . Die Fluorescein-markierten Sense-Stränge konnten im Gel unter Verwendung eines UV-Transilluminators identifiziert werden. Die entsprechenden DNA-Banden wurden ausgeschnitten und die einzelsträngige DNA (ssDNA) wurde mit 2 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat und pH 7,8 bei 80°C für 150 min unter leichtem Schütteln aus dem Gel eluiert. Nach Entfernen der Gelreste durch Filtrieren durch silanisierte Glaswolle wurde die eluierte ssDNA mit Ethanol in Gegenwart von linearem Polyacrylamid [19] präzipitiert und in Selektionspuffer resuspendiert. Ein neuer Pool ausgewählter und Fluorescein-markierter Oligonukleotide war nun bereit für die nächste Runde des Capture-SELEX-Prozesses, beginnend mit der Immobilisierung des Oligonukleotid-Pools auf magnetischen Kügelchen.

Die Fluorescein-Markierung, die ab der zweiten Runde an den Oligonukleotiden angebracht ist, ermöglicht die Quantifizierung der in den SELEX-Fraktionen vorhandenen Oligonukleotide wie Waschschritte, Temperaturschritt, Hintergrundelution und Zielbindung. Dies ist wichtig, um den Auswahlfortschritt über mehrere SELEX-Runden hinweg beurteilen zu können. Auf diese Weise wurde die Anreicherung von spezifischen Ziel-bindenden Oligonukleotiden überwacht. Insgesamt wurden 13 Runden dieses Capture-SELEX-Verfahrens durchgeführt und ein pharmazeutisch-spezifischer Aptamerpool ausgewählt.

Der ausgewählte Aptamerpool aus Runde 13 des Capture-SELEX wurde mit den unmodifizierten Primern AP10 und AP20 amplifiziert und anschließend in den Vektor pCR2.1-TOPO (TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen/Life Technologies, USA) kloniert. Die resultierenden rekombinanten Vektoren wurden in chemisch kompetente Escherichia coli TOP10-Zellen (auch vom TOPO TA Cloning Kit bereitgestellt). Mehrere positive Transformanten könnten durch Kolonie-PCR unter Verwendung einer Kombination aus einem vektorspezifischen Primer (M13 Vorwärtsprimer oder M13 Rückwärtsprimer) und einem Aptamer-spezifischen Primer (z. B. Primer AP10) analysiert werden. Diese Methode ermöglicht ein schnelles Screening auf korrekte Plasmid-Inserts direkt aus E coli Kolonien. Die Plasmid-DNA von 96 Klonen wurde mit dem QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit von QIAgen (Deutschland) isoliert und die inserierte Aptamer-DNA jedes Klons sequenziert (Microsynth, Schweiz). Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem webbasierten Tool ClustalW des EBI-Webservers (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) [21–23] analysiert und ausgerichtet.

2.6. Spezifitäts- und Affinitätstests von Aptameren

Einzelne Aptamerkandidaten, die für weitere Charakterisierungen ausgewählt wurden, wurden mit einer 5'-Fluorescein-Markierung von Microsynth (Schweiz) einschließlich eines PAGE-Reinigungsschritts synthetisiert. Vergleichende Bindungstests mit einzelnen Aptameren wurden gemäß den Capture-SELEX-Bedingungen unter Verwendung der Zielmischung (siehe Abschnitt 2.4) sowie der einzelnen pharmazeutischen Lösungen durchgeführt. Als Hintergrundkontrolle wurde Selektionspuffer ohne jegliche Zielsubstanz verwendet.

Mehrere Bindungstests wurden parallel durchgeführt. Ein frisches Aliquot einer geeigneten Menge Streptavidin-beschichteter magnetischer Kügelchen, modifiziert mit Einfang-Oligos (5 × 10 7 Kügelchen für jeden Bindungstest) wurde zuerst dreimal mit 500 gewaschen μL Auswahlpuffer. 50 pmol Aptamer pro 5 × 10 7 Kügelchen wurden in 300 suspendiert μL Selektionspuffer und vorbehandelt durch Erhitzen auf 90 °C für 8 min, sofortiges Abkühlen auf 4 °C für 10 min und Halten bei Raumtemperatur für 5-6 min, bevor es zu den gewaschenen Perlen gegeben wird. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 21°C und unter leichtem Schütteln zur Immobilisierung der Aptamere an Magnetkügelchen. Im Durchschnitt wird in jedem Test eine Menge von

pmol der Aptamere (bestimmt als Differenz zwischen der anfänglich eingesetzten ssDNA und der ssDNA im Überstand nach dem Immobilisierungsschritt über Nacht) wurde auf (

)×10 7 Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen, modifiziert mit Fänger-Oligos. Die folgenden Schritte bis zur Hintergrundelution waren identisch mit den im Abschnitt Capture-SELEX beschriebenen. Nach der Hintergrundelution wurden die Kügelchen sechsmal mit 500 gewaschen μL Selektionspuffer und entsprechend der Anzahl der geplanten Bindungstests gleichmäßig auf Reaktionsröhrchen verteilt. Die DNA-Bead-Komplexe wurden dann in 300 . resuspendiert μL Arzneimittelmischung (Endkonzentration für jedes Arzneimittel 1 mM), in 300 μL pharmazeutische Einzellösungen (Endkonzentration 1 mM) für Spezifitätstests, in 300 μL unterschiedlich konzentrierte pharmazeutische Einzellösungen für Affinitätstests (z. B. Konzentrationsreihen von Kanamycin A im Bereich von 0–1,5 mM), oder nur in 300 μL Auswahlpuffer als Kontrolle. Die Inkubation wurde bei 21°C für 45 min unter leichtem Schütteln durchgeführt. Alle weiteren Schritte waren identisch mit denen, die im Abschnitt Capture-SELEX beschrieben wurden.

Die während des Zielbindungsschritts von den Kügelchen freigesetzte Aptamermenge wurde durch Fluoreszenzdetektion und Berechnung unter Verwendung einer Kalibrierungskurve bestimmt. Die Fluoreszenzbedingungen waren wie in Abschnitt 2.7 beschrieben. Die Lösungen wurden zentrifugiert, bevor sie in die 96-Mikrowell-Platte pipettiert wurden, um die meisten der verbleibenden Kügelchen zu entfernen. Aptamere, die zur Bestimmung der Eichkurven verwendet wurden, wurden der gleichen thermischen Vorbehandlung unterzogen wie die Aptamere, die für die Spezifitäts- und Affinitätstests verwendet wurden.

2.7. Fluoreszenzdetektion

Alle Fluoreszenzmessungen von fluoresceinmarkierter DNA wurden auf einem Wallac 1420 Victor 2 V Multilabel Counter (PerkinElmer, Deutschland) mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 535 nm (prompte Fluorometrie, Zeit 1 s, CW-Lampenenergie 22500) durchgeführt. Die Messungen wurden in schwarzen 96-Mikrotiterplatten von NUNC/Thermo Fisher Scientific (Deutschland) mit einem Probenvolumen von 100 durchgeführt μL/gut. Zur Berechnung der DNA-Konzentration in den Proben wurde eine Kalibrationskurve im Bereich von 0,4–40 pmol/ml Fluorescein-markierter ssDNA aus der Capture-SELEX-Bibliothek (BANK-S4) verwendet. Bei zugekauften Fluorescein-markierten Aptameren musste jeweils eine Kalibrierkurve erstellt werden. Es wurde kein Einfluss der Pharmazeutika auf die Fluoreszenzmesswerte festgestellt.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Design der Capture-SELEX-Bibliothek und der Capture-Oligos

Ausgangspunkt eines Selektionsprozesses zielspezifischer Aptamere ist die SELEX-Bibliothek, die eine große Menge verschiedener Oligonukleotide (ca. 10 15 einzigartige Sequenzen) umfasst, die sich zu unterschiedlichen dreidimensionalen Strukturen falten können. Diese Funktionalität wird durch eine randomisierte Region der Oligonukleotide erreicht.Eine typische SELEX-Bibliothek besteht aus Oligonukleotiden gleicher Länge und einer zentralen, randomisierten Region von 20–60 Nukleotiden, flankiert von spezifischen Sequenzen am 5′- und 3′-Ende. Letztere dient als Primer-Bindungsstellen für die Amplifikation der Oligonukleotide durch PCR während des Aptamer-Selektionsprozesses. Diese vollständig zufällige Bibliothek kann in eine teilweise randomisierte Bibliothek umgewandelt werden, um ihr neue Eigenschaften zu verleihen, beispielsweise durch Einführen definierter Sequenzen in die randomisierte Region. Hier beschreiben wir die Verwendung einer solchen zusätzlichen, definierten Sequenzregion als Docking-Sequenz, um eine Capture-SELEX-Bibliothek aufzubauen. In einem typischen SELEX-Experiment werden die Zielmoleküle normalerweise auf einer festen Oberfläche immobilisiert, um eine effiziente Trennung von Ziel-bindenden und nicht-bindenden Oligonukleotiden in jeder SELEX-Runde zu ermöglichen. Dies ist ein sehr entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Aptamer-Selektion. Herkömmliche Methoden sind die Affinitätschromatographie mit Target-Immobilisierung auf unterschiedlichem Säulenmaterial oder die Verwendung von Magnetbeads als Immobilisierungsmatrix. Dieser methodische Ansatz ist jedoch nicht auf alle potentiellen Aptamer-Targets anwendbar, insbesondere auf sehr kleine, organische Zielmoleküle mit nur wenigen oder keinen geeigneten funktionellen Gruppen. Eine zusätzliche Funktionalisierung solcher Moleküle beeinflusst oft ihre strukturellen Eigenschaften. Die Beibehaltung der nativen Biomolekülstrukturen der Targets ist jedoch für die Bindungseigenschaften der auszuwählenden Aptamere sehr wichtig. Andererseits sind größenabhängige Trenntechniken wie Filtration oder Zentrifugation für kleine, organische Zielmoleküle oft nicht praktikabel. Die Capture-SELEX-Bibliothek bietet einen alternativen Ansatz durch Immobilisierung der Oligonukleotide auf einer festen Matrix anstelle der Targets. Dies geschieht durch Hybridisierung zwischen der Andocksequenz innerhalb der Oligonukleotide und einem komplementären Capture-Oligo, das durch Affinitätsbindung oder kovalente Bindung an die feste Matrix gekoppelt ist. Das Selektionskonzept basiert auf der Freisetzung derjenigen Oligonukleotide aus der Matrix, die eine Affinität zum Selektionstarget zeigen und daher eine spezifische Konformationsänderung zur Bindung an das Target in Lösung erfahren. Ein mögliches Risiko dieses Konzepts besteht darin, dass nicht alle Oligonukleotide einer SELEX-Bibliothek produktiv sind. Diejenigen von ihnen, die an das Ziel binden können, aber keine Konformationsänderung einschließlich der Andocksequenz erfahren, werden nicht freigesetzt und werden daher insbesondere während der ersten SELEX-Runde nicht selektiert.

Das Design der Capture-SELEX-Bibliothek namens BANK-S4 (siehe Abbildung 1) wurde von Designs abgeleitet, die in Nutiu und Li, 2005 [13] beschrieben sind. Sie beschrieben zunächst ein Aptamer-Selektionsverfahren, das auf der Idee des Strukturwechsels basiert, mit dem Ziel, die ausgewählten Aptamere sofort in fluoreszenzsignalisierende Reportermoleküle für den Nachweis der Bindungskomplexe umzuwandeln.

BANK-S4 ist durch eine intern unstrukturierte 12-Nukleotid-Docking-Sequenz gekennzeichnet, die von zwei zufälligen Regionen in asymmetrischer Anordnung flankiert wird. Einer von ihnen wurde mit 40 nt relativ groß gebaut, um die strukturelle Komplexität der Bibliothek zu erhöhen. Der andere besteht aus nur 10 nt. Eine kurze randomisierte Region (20–25 nt) einer SELEX-Bibliothek scheint für eine erfolgreiche Aptamer-Selektion ausreichend zu sein, da Post-SELEX-Optimierungen wie Trunkierungen oft eine relativ kurze minimale funktionelle Sequenz vieler Aptamere ergeben. Längere Random-Regionen (mindestens 60–70 nt) verleihen den Bibliotheken jedoch eine höhere strukturelle Komplexität, z Domäne beider Bindungspartner. Das Design der Dockingsequenz (Länge und Nukleotidzusammensetzung) muss darauf ausgerichtet sein, das Gleichgewicht zwischen Duplexbildung mit dem Fänger-Oligo für eine stabile Immobilisierung der Bibliothek und zielabhängiger Freisetzung von Oligonukleotiden aus der Duplexstruktur zur Bildung spezifischer Oligonukleotid- Zielkomplexe. Die Primerbindungsstellen am 5'- und 3'-Ende der BANK-S4-Oligonukleotide wurden aus der FluMag-SELEX-Bibliothek abgeleitet, die in Stoltenburg et al. 2005 [12].

Der zweite Teil des Capture-SELEX-Bibliothekskonzepts ist das Capture-Oligo (Abbildung 1), das aus 12 zur Andocksequenz komplementären Nukleotiden besteht und für die bequeme Kopplung an eine Streptavidin-modifizierte Matrix, beispielsweise magnetische Beads, biotinyliert ist. Die Hybridisierung zwischen der Docking-Sequenz und dem Matrix-gekoppelten Capture-Oligo ermöglicht die Immobilisierung der Capture-SELEX-Bibliothek. Die zwei Arten des Capture-Oligo-Designs bezüglich der Biotinylierungsstelle am 5'- oder 3'-Ende der Oligos (i-ODN2Sp oder i-ODN4Sp, Abbildung 1) implizieren zwei Ausrichtungen der in der SELEX-Bibliothek enthaltenen Oligonukleotide aufgrund von die asymmetrische Anordnung der Zufallsfolgen. Theoretisch sind zwei Ausrichtungen möglich: Bei Hybridisierung mit i-ODN2Sp wird die längere randomisierte Region (N40) ist auf die Oberfläche des magnetischen Beads gerichtet, während bei der Hybridisierung mit i-ODN4Sp die kürzere randomisierte Region (N10) ist zum Wulst gerichtet. Das Capture-Oligo enthält weiterhin einen Hexaethylenglykol-Spacer (HEGL) zwischen den Nukleotiden und der Biotinylierungsstelle. Ein alternatives Poly-dA9 Spacer hat sich für diese Anwendung als weniger geeignet erwiesen, da eine unerwünschte Co-Selektion von T-reichen Oligonukleotiden aus der Bibliothek erfolgt, die mit dem Fänger-Oligo über eine erweiterte Domäne einschließlich des Poly-dA . hybridisieren können9 Abstandshalter.

Die folgenden Abschnitte beschreiben das Capture-SELEX-Verfahren genauer und seine erfolgreiche Anwendung zur Selektion von DNA-Aptameren für das Aminoglykosid-Antibiotikum Kanamycin A.

3.2. Allgemeine Vorgehensweise der Capture-SELEX

Als Variante der SELEX-Technologie zur Selektion zielspezifischer Aptamere wurde das Capture-SELEX-Verfahren mit BANK-S4 als SELEX-Bibliothek etabliert und optimiert. Es ist gekennzeichnet durch das Einfangen der Oligonukleotide (SELEX-Bibliothek oder ausgewählter Oligonukleotid-Pool) auf magnetischen Beads. Dadurch müssen die Zielmoleküle nicht immobilisiert werden und können in gelöster Form eingesetzt werden. Die magnetische Separationstechnologie bietet eine bequeme Handhabung und eine effiziente Trennung von beadgebundenen Komponenten von anderen Komponenten der Lösung [12]. Die Capture-SELEX-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt. Um eine Selektionsrunde des Capture-SELEX-Prozesses einzuleiten, wurden die Oligonukleotide der Bibliothek in der ersten Runde bzw Perlen. Diese Beads werden zusätzlich durch Kopplung der biotinylierten Fänger-Oligos modifiziert (Abbildung 1). Die Hybridisierung zwischen beiden DNA-Partnern während einer Inkubation über Nacht führt zur Immobilisierung der SELEX-Bibliothek oder des ausgewählten Oligonukleotidpools auf den Beads. Anschließend wurden die DNA-Bead-Komplexe zweimal in Selektionspuffer inkubiert, um die unspezifische Freisetzung von Oligonukleotiden aus den Komplexen zu reduzieren. Zuerst führten wir den Temperaturschritt bei erhöhter Temperatur ein, um nicht hybridisierte Oligonukleotide oder geschwächte DNA-Duplexstrukturen zu eliminieren. Der nächste Inkubationsschritt, der Hintergrundelutionsschritt, ist durch die gleichen Inkubationsbedingungen (Zeit und Temperatur) gekennzeichnet, die für den folgenden Zielbindungsschritt verwendet wurden. Wir verwendeten diese Hintergrundelution in Selektionspuffer, um die Menge an Oligonukleotiden zu bestimmen, die aus den Komplexen freigesetzt wurden, die nur durch das Inkubationsverfahren verursacht wurden. Außerdem kann dieser Schritt durch Zugabe entsprechender Substanzen zum Selektionspuffer leicht mit einem negativen Selektionsschritt kombiniert werden. Negative Selektionsschritte sind oft sinnvoll und empfehlenswert für eine Aptamer-Selektion, um nicht nur die Anreicherung unspezifisch bindender Oligonukleotide zu vermeiden, sondern auch um die Selektion von Aptameren beispielsweise auf ein spezifisches Epitop des Targets zu lenken oder zwischen eng verwandten Targets zu unterscheiden Moleküle. Nach der Immobilisierung und den verschiedenen Inkubationsschritten mussten die DNA-Bead-Komplexe ausgiebig gewaschen werden, um ungebundene Oligonukleotide weitgehend zu entfernen. Im nächsten Zielbindungsschritt wurden die DNA-Bead-Komplexe der Ziellösung ausgesetzt. Die Zielkonzentration kann typischerweise im Bereich von 0,1 mM–1 mM liegen. Für strengere Selektionsbedingungen, die die Affinität der zu selektierenden Aptamere beeinflussen können, besteht die Möglichkeit, diese Konzentration während des SELEX-Prozesses zu reduzieren. Es besteht auch die Möglichkeit, ein Target-Gemisch (2 oder mehr verschiedene Target-Moleküle) zur parallelen Selektion von Aptameren in einem SELEX-Prozess zu verwenden. Oligonukleotide mit Affinität zum Ziel können sich zu einer spezifischen dreidimensionalen Struktur falten, um an das Ziel zu binden. Diese Oligonukleotide sind in der Lage, einen stabilen Bindungskomplex zu bilden und werden daher während des Zielbindungsschritts aus dem Bead-gebundenen Zustand in Lösung freigesetzt. Die verbleibenden DNA-Bead-Komplexe werden abgetrennt und die Target-eluierte DNA direkt in die folgenden Amplifikations- und Reinigungsschritte der ausgewählten Oligonukleotide einer SELEX-Runde überführt. Diese Schritte sind die gleichen wie für das FluMag-SELEX-Verfahren [12] beschrieben. Nach der ersten Selektionsrunde werden alle Oligonukleotide während der Amplifikation durch PCR mit einem 5'-modifizierten Primer (Sense-Primer) mit Fluorescein markiert. Dies ermöglicht eine Quantifizierung von DNA durch direkte Fluoreszenzdetektion und damit die Überwachung der Anreicherung von zielbindenden Oligonukleotiden. Wir verwendeten das Verhältnis der Fraktion von Oligonukleotiden, die von den Zielmolekülen (Zielbindungsschritt) eluiert wurde, im Vergleich zu der von Selektionspuffer eluierten (Hintergrundelutionsschritt), um Informationen über den Fortschritt der Aptamer-Selektion in jeder SELEX-Runde zu erhalten. Ein zweiter modifizierter Primer (Antisense-Primer) wird für die PCR verwendet, um eine Nukleotidverlängerung in den Antisense-Strang einzuführen, die die größenabhängige Trennung beider Stränge durch Denaturieren von PAGE und anschließende Reinigung des relevanten Sense-Strangs ermöglicht. Der resultierende neue Pool von Oligonukleotiden wird für die nächste SELEX-Runde verwendet, beginnend mit ihrer Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Viele solcher Capture-SELEX-Runden (typischerweise 10-15) sind notwendig, um einen zielbindenden Oligonukleotidpool (Aptamerpool) anzureichern. Jeder SELEX-Prozess endet mit der Klonierung der PCR-Produkte der letzten Runde, um individuelle Aptamere zu erhalten. Wir wählen normalerweise bis zu 100 Aptamerklone für ihre Charakterisierung durch Sequenzierung und Sequenzanalyse aus. Anschließend werden Bindungstests mit einzelnen Aptameren durchgeführt, um nach den besten Bindungsaptamer-Kandidaten zu suchen, die zur weiteren Charakterisierung ausgewählt werden, um Informationen über Affinität, Spezifität und minimale Bindungsdomäne zu erhalten.


3.3. Auswahl von Aptameren für Arzneimittel nach dem Capture-SELEX-Verfahren

Insgesamt wurden 13 Runden Capture-SELEX wie oben beschrieben durchgeführt (siehe auch Abschnitt 2.5). Als Target wurde eine konstante Mischung von vier Pharmazeutika in einer Konzentration von jeweils 1 mM in Selektionspuffer verwendet (siehe Abschnitt 2.4.). Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Bindungssequenzen zu mindestens einer der Zielsubstanzen zu finden, wurde eine Mischung von Arzneimitteln gewählt, da die Entwicklung von Aptameren zu unterschiedlichen Targets während eines Multi-Target-SELEX-Verfahrens theoretisch nicht behindert wird [25]. Der Hintergrundelutionsschritt wurde mit Selektionspuffer ohne zusätzliche Substanzen und damit ohne Kombination mit einem negativen Selektionsschritt durchgeführt. Hinsichtlich der Frage, welches der beiden möglichen Fängeroligos i-ODN2Sp und i-ODN4Sp zu bevorzugen ist, wurden die Hybridisierungseffizienzen getestet, bestimmt als Verhältnis von immobilisierter ssDNA zur Anzahl der verwendeten Beads. Da die Hybridisierungseffizienzen in beiden Aggregaten sehr ähnlich waren, wurde die Verwendung von i-ODN2Sp als Fänger-Oligo entschieden.

In der ersten Runde wurden etwa 2 nmol ssDNA der SELEX-Bibliothek BANK-S4 zu 7,9 × 10 8 Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen, die mit Einfang-Oligos modifiziert wurden, hinzugefügt. Auf diesen Beads wurde eine Menge von 600 pmol (bestimmt als Differenz zwischen der anfänglich eingesetzten ssDNA und der ssDNA im Überstand nach dem Immobilisierungsschritt über Nacht) immobilisiert. In den folgenden Runden wurden durchschnittlich 45 pmol (30–70 pmol) ssDNA aus der vorangegangenen SELEX-Runde auf 1 × 10 8 modifizierten Beads immobilisiert. Es wurde festgestellt, dass nach allen Waschschritten sowie den Temperatur- und Hintergrundelutionsschritten eine Menge von – durchschnittlich – 37 pmol (10–75 pmol) dieser immobilisierten ssDNA auf den Beads verbleibt und für den Zielbindungsschritt zur Verfügung steht. Die Konzentration der Zielmoleküle betrug 1 mM in 300 μL jeweils. Daher war die Konzentration jedes in der Probe während des Zielbindungsschritts vorhandenen Ziels etwa 8000-mal höher als die der immobilisierten ssDNA. Daher ist die Wahrscheinlichkeit, dass Oligonukleotide, sobald sie durch die Anwesenheit eines Bindungspartners von den Einfangoligos auf den Kügelchen freigesetzt wurden, zu den Einfangoligos zurückkehren, vernachlässigbar. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, deutete ab Runde 10 eine Zunahme der Menge an eluierter ssDNA im Zielbindungsschritt auf die Anreicherung von Aptameren im Prozess hin. Die Gesamtmenge der zieleluierten ssDNA stieg in Runde 12 von ungefähr 1 pmol auf mehr als 8 pmol. In Runde 13 sank sie auf 7,4 pmol und zeigte an, dass das Ende des SELEX-Verfahrens erreicht war. Das Verhältnis der im Zielbindungsschritt eluierten Oligonukleotidmengen im Vergleich zum Hintergrundelutionsschritt ist ein weiterer Parameter, der für die Beurteilung des Fortschritts bei Capture-SELEX berücksichtigt werden kann. Wenn nur eine sehr kleine Menge an spezifisch bindenden Oligos in der Lösung vorhanden ist, sollte dieses Verhältnis zunächst eins sein, da die Bedingungen für die Zielbindung und die Hintergrundelution gleich sind. Wenn eine erfolgreiche Auswahl von Aptameren fortschreitet und die Menge an Bindemitteln wächst, wird der Wert steigen. Dies kann aus Abbildung 3 geschlossen werden, wo das Verhältnis der Mengen an Oligonukleotiden, die im Zielbindungsschritt eluiert wurden, im Vergleich zum Hintergrundelutionsschritt von


Anreicherung von Fluorescein-markierten Aptameren während 13 Runden von Capture-SELEX für die Zielmischung bestehend aus Kanamycin-A-Disulfatsalz-Dihydrat, Sulfacarbamid, Sulfamethoxazol und Sotalolhydrochlorid, jeweils 1 mM in Selektionspuffer. Die Mengen an eluierter einzelsträngiger DNA (ssDNA) im Zielbindungsschritt (dunkelrot) und im Hintergrundelutionsschritt (blau) sind dargestellt. Da die Ausgangs-Oligonukleotid-Bibliothek anfänglich nicht mit Fluorescein markiert war, gibt es keine Balken für Runde 1.

Nach Klonen und Transformation des ausgewählten Aptamer-Pools, 99 E coli Klone wurden weiter untersucht. Davon wurden 96 positive Transformanten bestimmt und die enthaltene Plasmid-DNA wurde zum Sequenzieren der inserierten Aptamer-DNA jedes Klons präpariert. Die 79 eindeutig identifizierbaren Sequenzen [26] wurden nach ihrer Sequenzähnlichkeit in 10 Gruppen und 9 Orphans eingeteilt (Abbildung 4). Die erste Gruppe ist diejenige mit der größten Mitgliederzahl. Es besteht aus 17 Sequenzen, die 97 Nukleotide lang sind (eine Deletion trat während des SELEX-Prozesses innerhalb der Docking-Sequenz auf). Diese 17 Sequenzen unterscheiden sich nur in einem, höchstens zwei, gelb markierten Basenaustauschen. Außerdem gibt es in Gruppe 1 zwei Sequenzen, die 126 Nukleotide lang sind. Sie leiteten sich offensichtlich von Klon #3_7 (repräsentativ für 4 identische Sequenzen) dieser Gruppe durch Sequenzverdoppelung der 5'-Primerbindungsstelle und die zusätzliche Insertion von 11 Nukleotiden ab.


Gruppen und Orphans von Oligonukleotiden (5′ → 3′), erhalten nach Klonierung und Sequenzierung der einzelsträngigen DNA, die durch das Zielgemisch (Kanamycin-A-Disulfatsalz-Dihydrat, Sulfacarbamid, Sulfamethoxazol und Sotalolhydrochlorid, jeweils 1 mM in Selektionspuffer) selektiert wurde ) während 13 Capture-SELEX-Runden. Der Vertreter jeder Gruppe ist rot gedruckt. Jede Gruppe könnte in Untergruppen von völlig identischen Sequenzen unterteilt werden. Die Anzahl der Sequenzen in jeder Untergruppe wird angegeben (Menge) und der Vertreter wird in Schwarz gedruckt. Grün: Bindungsstelle für Primer AP60 (18mer), Magenta: Andocksequenz, ursprünglich: TGAGGCTCGATC, blau: Bindungsstelle für Primer AP20 (18mer), gelbe Markierung: Basenaustausch- oder Deletionsstellen und unterstrichen: möglicher G-Quadruplex-Bereich.

Gruppe 2 mit ihren 15 Mitgliedern (12 identische Sequenzen und 3 Sequenzen mit Einzelbasenaustausch) ist viel homogener als Gruppe 1 ebenso wie Gruppe 3 mit 10 identischen Klonen. Zusätzlich gibt es in Gruppe 3 eine 124 Nukleotidsequenz, die wiederum aus der Elternsequenz (Klon #13_83 als Vertreter) hervorgegangen ist durch Verdoppelung der 5'-Primerbindungsstelle und ein zusätzliches Insert von acht Basen. Die Gruppen 4 (6 Mitglieder), 5 (5 Mitglieder), 6 (4 Mitglieder), 7 und 8 (je 3 Mitglieder) sowie 9 und 10 (je 2 Mitglieder) sind mehr oder weniger homogen. Bei Verwendung des webbasierten Tools ClustalW konnte jedoch keine Konsensussequenz zwischen den Gruppen gefunden werden [23].

In den Sequenzen der Gruppe 1 fällt eine Anhäufung von vier Abschnitten von jeweils zwei bis drei Guaninresten auf, die durch ein bis zwei andere Basen getrennt sind (in Abbildung 4 unterstrichen). Dies ermöglicht die Bildung einer G-Quadruplex-Struktur während der dreidimensionalen Faltung der Aptamere.

Ein interessantes Merkmal der abgeleiteten Sequenzen sind die Variationen der ursprünglichen Docking-Sequenz (TGAGGCTCGATC, in Magenta gedruckt), die in Abbildung 4 gelb markiert sind. In den meisten Gruppen finden sich Änderungen der ursprünglichen Docking-Sequenz, wie Basenaustausch, oder Löschungen. Besonders auffällig in der Dockingsequenz der Gruppe 10 gehen fünf Nukleotide im Vergleich zur ursprünglichen Dockingsequenz verloren.

Aufgrund des Designs des Capture-SELEX-Prozesses ist es notwendig, dass potentielle Binder beim Wechsel von der Duplexstruktur mit dem Capture-Oligo zu der spezifischen Zielbindungsstruktur Konformationsänderungen erfahren. Daher besteht ein Selektionsdruck hin zu Docking-Sequenzen, die weniger stabil an die Fänger-Oligos angeheftet sind. Andererseits müssen die Andocksequenzen spezifisch genug sein, da die Hybridisierung stabil genug sein muss, um die Elutionsschritte vor dem Zielbindungsschritt zu überleben. Die Ausgewogenheit dieser beiden Anforderungen konnte in unserer Auswahl als Zunahme der eluierten ssDNA während des Temperaturelutionsschritts ab Runde 3 von beobachtet werden

17 pmol in Runde 6. Diese Menge blieb hoch (

12 pmol), bis sie wieder auf . gesunken ist

7 pmol in den Runden 12 und 13 (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ist es nicht verwunderlich, dass die Basenaustausche in den Dockingsequenzen in 11 Fällen zu G·T- und in 2 Fällen zu C·A-Fehlpaarungen führen, da diese zu den stabilsten Fehlpaarungen in der DNA gehören [28, 29], aber von Natürlich sind sie weniger stark als perfekte Übereinstimmungen.

Aus jeder der zehn Gruppen wurde ein Vertreter (Abbildung 4, rot gedruckt) zur weiteren Untersuchung ausgewählt.Diese zehn ausgewählten Aptamere wurden synthetisiert, mit Fluorescein markiert (Microsynth, Schweiz) und anschließend durch Spezifität und einige von ihnen durch Affinitätstests charakterisiert.

3.4. Spezifität und Affinität ausgewählter Aptamere für Kanamycin A

Zunächst wurde die Bindungsfähigkeit der Vertreter der zehn Aptamergruppen an die Zielmischung durch Bindungstests vergleichbar den Bedingungen in den Auswahlrunden (SELEX-Bedingungen, siehe Abschnitt Materialien und Methoden) überprüft. Von den zehn getesteten Sequenzen zeigten nur sechs eine Bindung an das Zielgemisch, die den Bereich der Negativkontrolle überstieg (als Schwellenwert wurde die Elution von 1 pmol ssDNA gewählt, um eine Sequenz als Bindungssequenz zu definieren). Diese sechs Sequenzen waren die Vertreter der Gruppen 1 (#3_7), 4 (#4_30), 6 (#13_82), 7 (#3_18), 8 (#11_76) und 9 (#3_19). Da vier mögliche Zielsubstanzen parallel verwendet wurden, war es insbesondere erforderlich, in Spezifitätstests zu bestimmen, an welche(n) Ziel(e) die Aptamere binden. Daher wurde jede der vier Zielsubstanzen untersucht. Parallel dazu wurde als Negativkontrolle Selektionspuffer ohne jegliche Zielsubstanz getestet (Abbildung 5). Es konnte gezeigt werden, dass die meisten Bindungssequenzen nur von Kanamycin A (und der Mischung aller vier Pharmazeutika) eluiert wurden, während Sequenz #13_82 auch eine schwache Bindung an Sulfacarbamid und Sulfamethoxazol zeigte. Von den vier Pharmazeutika ist Kanamycin A das hydrophilste und besitzt die meisten Aminogruppen (siehe Tabelle 1), die die elektrostatische Wechselwirkung mit dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der Aptamer-DNA und die Bildung von Wasserstoffbrücken zwischen Aptamer und Target begünstigen. Die Stapelwechselwirkung der aromatischen Ringe der anderen drei Pharmazeutika mit den Nukleobasen scheint hier von untergeordneter Bedeutung zu sein.


Spezifitätstests des Vertreters jeder der Gruppen von DNA-Oligonukleotiden, die von Capture-SELEX abgeleitet sind, gegenüber dem Arzneimittelgemisch. Die Bedingungen wurden vergleichbar zu den Schritten im SELEX-Verfahren gewählt. Die vier Pharmazeutika wurden einzeln in einer Konzentration von 1 mM in Selektionspuffer sowie deren Mischung und Selektionspuffer allein als Negativkontrolle getestet. Die Menge an eluierter ssDNA wurde auf 5 × 10 7 Kügelchen normalisiert. Bei Bindungssequenzen (Aptameren), den Vertretern der Gruppen 1, 4, 6, 7, 8 und 9 wurden Versuche in Doppel- oder Dreifachversuchen durchgeführt.

Außer den Bindungssequenzen gibt es vier Gruppen (Gruppen 2, 3, 5 und 10) von Oligonukleotiden, die nicht an eines der vier Ziele oder die Mischung binden. Zwei davon sind sogar starke Gruppen mit vielen Mitgliedern (Gruppen 2 und 3). Der Grund dafür liegt sicherlich im Design des Capture-SELEX. Obwohl es Temperatur- und Hintergrund-Elutionsschritte und eine Vielzahl von Waschschritten gibt, ist es dennoch möglich, dass während des Zielbindungsschritts eine gewisse unspezifische Elution stattfindet. Die spezifischen Sequenzen sollten jedoch letztendlich den Auswahlprozess dominieren. Daher ist es beim Capture-SELEX besonders wichtig, die Spezifitätstests gründlich durchzuführen, um Nichtbinder aus dem empfangenen Satz von Sequenzen zu eliminieren.

In Abbildung 5 sind die Standardabweichungen (Fehlerbalken) manchmal ziemlich groß, da die Experimente in ihren vielen Schritten sehr komplex sind und es daher nicht einfach ist, konstante absolute Mengen an eluierter DNA zu erhalten. Auch nach dem vorhergehenden Zentrifugationsschritt stören noch in der Lösung verbleibende Beads, die mit der Fluoreszenzmessung nachzuweisen sind, durch Reflexion des Anregungsstrahls. Auch die geringfügig unterschiedliche Menge an Kügelchen, die in jeder Zubereitung verwendet wird, trägt selbst nach Normalisierung der Kügelchenmenge auf einen festen Wert von 5 × 10 7 Kügelchen zum Fehler bei. Nichtsdestotrotz wurde dieses Design des Bindungsassays gewählt, da es den SELEX-Bedingungen am nächsten kam, und daher wurde erwartet, dass die Bindungsreaktion der resultierenden Aptamere an das Ziel nicht von Änderungen in der Assay-Konfiguration beeinflusst wird. Darüber hinaus könnten die Pharmazeutika weiterhin in Lösung eingesetzt werden – bevorzugt für eine zukünftige Anwendung der entwickelten Aptamere beim Nachweis dieser Pharmazeutika in Umweltproben – und ohne die Notwendigkeit einer Immobilisierung und dem möglichen Risiko des Verlustes von Bindungseigenschaften. In zukünftigen Untersuchungen müssen jedoch unterschiedliche Bindungsassay-Designs getestet werden.

Um die Affinität einiger ausgewählter Aptamere zu Kanamycin A frei in Lösung zu bestimmen, wurden Affinitätstests ähnlich dem Capture-SELEX-Verfahren durchgeführt, wie im Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Bei der Zielbindung des ausgewählten Aptamers an Kanamycin A in unterschiedlichen Konzentrationen werden bestimmte Mengen an Fluorescein-markiertem Aptamer aus den Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen, die mit Einfangoligos modifiziert sind, freigesetzt. Diese Mengen werden dann durch Fluoreszenzdetektion quantifiziert (Abbildung 6) und die resultierenden Daten werden durch das Modell der direkten Bindung an einer Stelle unter Verwendung einer rechteckigen Hyperbel, die auch als Bindungsisotherme oder Sättigungsbindungskurve bekannt ist, angepasst (OriginLab Corporation, OriginPro 8G SR2). Die für dieses Modell verwendete Gleichung beschreibt die Gleichgewichtsbindung eines Liganden an einen Rezeptor als Funktion der steigenden Ligandenkonzentration, und

ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante. Wenn die Zielkonzentration gleich ist, ist die Hälfte der Bindungsstellen (Aptamere) im Gleichgewicht besetzt. Die abgeleiteten Dissoziationskonstanten, , für Aptamervertreter der Gruppen 1, 6, 8 und 9 liegen im niedrigen mikromolaren Bereich ((#3_7 (gr. 1): 24 μM, #13_82 (gr. 6): 5.1 μM, #11_76 (gr.8): 9,6 μM und #3_19 (gr. 9): 3,9 μM).


Affinitätstests an den Vertretern von Aptamergruppen wurden aus Capture-SELEX entwickelt. Affinitätstests wurden ähnlich dem Capture-SELEX-Verfahren durchgeführt, und ssDNA wurde durch verschiedene Konzentrationen von Kanamycin A in Selektionspuffer eluiert. Die Daten wurden durch das Modell einer direkten Bindung an einer Stelle unter Verwendung einer rechteckigen Hyperbel für die Sättigungskurve (OriginLab Corporation, OriginPro 8G SR2) angepasst.

Mit einer anderen SELEX-Methode (Affinitätschromatographie mit Kanamycin-immobilisierten Sepharose-Beads) selektierten Song et al., 2011 erst kürzlich DNA-Aptamere für Kanamycin [27]. Sie begannen mit einer synthetischen ssDNA-Bibliothek von 90 nt Länge mit einer zufälligen Sequenz von 40 nt flankiert von zwei Primer-Bindungsstellen. Kanamycin wurde auf CNBr-aktivierten Sepharosekügelchen immobilisiert. Diese Kügelchen wurden zur Herstellung einer Affinitätssäule für Kanamycin-bindende Oligonukleotide verwendet. Nach neun Selektionsrunden erhielten sie 16 einzelne Sequenzen aus 48 Klonen. Ein T-GG-A-Motiv mit einem Stem-Loop-Faltungsmuster war in 11 der Sequenzen vorhanden und wurde als Bindungsregion der Aptamere angenommen. Die Affinität von Aptamer Kana2 zu an Magnetbeads immobilisiertem Kanamycin wurde getestet und ein Wert von 85,6 nM angegeben.

Um mögliche Sequenzähnlichkeiten zu finden, haben wir die Sequenzen der Vertreter der zehn Oligonukleotidgruppen, die wir in unserem Capture-SELEX gefunden haben, mit all den 13 Sequenzen verglichen, die in der Veröffentlichung von Song et al. [27] mit dem webbasierten Tool ClustalW [23]. Wir verglichen die zuvor angegebenen Regionen (die Primer-Bindungssequenzen bzw. in unserem Fall die Docking-Sequenz) und die Zufallsregionen. Die höchste Ähnlichkeit – insbesondere in den Random-Regionen – zeigte ein Sequenzpaar (unsere Sequenz #3_18 (gr. 7) und ihr Kana18). Es wurde jedoch kein Konsens zwischen der Sequenz gefunden, die von Song et al. als Bindungsregion bestimmt wurde. und unsere Sequenzen (Abbildung 7). Daher muss in unserem Fall von einem anderen Bindungsmotiv ausgegangen werden. Die Experimente zum Auffinden der Bindungsregion innerhalb unserer ausgewählten Aptamere werden folgen.


ClustalW [23] Vergleich der Sequenzen für Kanamycin-bindende Aptamere, die von verschiedenen SELEX-Typen abgeleitet sind. #3_18 (gr. 7): Aptamer entwickelt von Capture-SELEX wie hier beschrieben. Kana18: Aptamer, entwickelt von Song et al., 2011 [27] mittels Affinitätschromatographie mit Kanamycin-immobilisierten Sepharosekügelchen. Fixierte Regionen sind mit Grün (5'-Primer-Bindungsregionen), Blau (3'-Primer-Bindungsregionen) und Magenta (Andocksequenz) markiert. Zufällige Regionen werden schwarz gedruckt. Rot: Bindungsregion, wie von Song et al., 2011 [27] angenommen, und unterstrichen: Stem-Loop-Bildungssequenz wie in [27] angegeben.
3.5. Aptamer-Assay-Entwicklung basierend auf dem Capture-SELEX-Prinzip

Analytische Anwendungen von Aptameren erfordern oft einige Modifikationen nach SELEX. Typische Modifikationen sind die Anbringung funktioneller Gruppen, beispielsweise zur Immobilisierung der Aptamere auf Sensoroberflächen, die Anbringung von Reportermolekülen zur Überwachung der Aptamer-Target-Bindung, Sequenzänderungen oder eine Kombination davon. Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Aptamer-Target-Interaktionen in ein aufzeichnungsfähiges Signal umzuwandeln [30–33]. Die Risiken solcher Modifikationen sind jedoch der mögliche Verlust der Affinität und Spezifität der Aptamere für ihre Ziele. Um dieses Problem zu umgehen, wurden einige alternative Methoden zur direkten Selektion fluoreszenzsignalisierender Aptamere beschrieben [13, 34–36]. Diese in vitro Selektionsprozesse zeichnen sich durch den Einbau von Signalkomponenten wie Reportermolekülen für den fluoreszenzbasierten Nachweis, speziellen Sequenzen oder zusätzlichen Oligonukleotiden aus, so dass große post-SELEX-Modifikationen vermieden werden können.

Das in dieser Arbeit beschriebene Capture-SELEX-Prinzip bietet auch die Möglichkeit, Nachweisassays basierend auf der Duplexbildung zwischen der Dockingsequenz des ausgewählten Aptamers und dem Capture-Oligo zu entwickeln. Die zielabhängige Konformationsänderung führt zur Freisetzung des Aptamers aus der Duplexstruktur mit dem Fänger-Oligo. Dieser Wechsel vom hybridisierten zum dehybridisierten Stadium des Aptamers kann verwendet werden, um ein aufzeichnungsfähiges Signal zu erzeugen. Abbildung 8 zeigt mögliche Strategien für eine auf Fluorometrie basierende Assayentwicklung unter Verwendung bekannter Methoden wie Änderungen der Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), Molecular Beacon oder Fluoreszenzpolarisation (FP). Die in den Abbildungen 8(a) und 8(b) gezeigten Strategien ermöglichen den direkten Nachweis von Aptamer-Target-Komplexen. Das Aptamer ist mit einem Fluorophor markiert und somit kann der nach Zugabe des Targets gebildete Bindungskomplex direkt durch Fluoreszenzdetektion gemessen werden. Die Strategien in den Abbildungen 8(c) und 8(d) sind durch indirekte Nachweise von Aptamer-Target-Komplexen gekennzeichnet. Dies bedeutet, dass das Aptamer unmarkiert ist, während das Capture-Oligo mit einem oder zwei Fluorophoren markiert ist. Nach Zugabe des Targets wird das Aptamer aus der Duplexstruktur mit dem Fänger-Oligo freigesetzt, was zu Veränderungen im Fluoreszenzverhalten des Fänger-Oligos führt, die anstelle des Aptamer-Target-Komplexes nachgewiesen werden können. Abbildung 8(a) stellt dieselbe Strategie dar, die während des Capture-SELEX-Prozesses verwendet wird. Wir haben diese Assay-Strategie für das Screening auf die besten bindenden Aptamer-Kandidaten nach Klonierung und Sequenzierung des ausgewählten Aptamer-Pools sowie für Spezifitäts- und Affinitätstests angewendet (siehe Abschnitt 3.4.). Alle anderen Assay-Strategien basieren auf unterschiedlichen Modifikationen meist der Fänger-Oligos (Anheftung von Fluoreszenz-Reportermolekülen und Sequenzveränderungen). Die Abbildungen 8(c) und 8(d) zeigen Strategien zum Nachweis von Aptamer-Target-Komplexen ohne jegliche Modifikationen der Aptamere. Unsere zukünftigen Arbeiten zielen auf die Entwicklung eines Aptamer-Assays für Kanamycin A unter Verwendung der beschriebenen Strategien.


Potentielle Assay-Strategien unter Verwendung von Aptameren, die nach dem Capture-SELEX-Prinzip ausgewählt wurden. Der Wechsel vom hybridisierten zum dehybridisierten Stadium der Aptamere nach der Targetaddition kann verwendet werden, um ein aufnehmbares Signal basierend auf fluorometrischen Methoden wie Änderungen der Fluoreszenzintensitäten, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), FRET mit Molecular Beacon Bildung oder Fluoreszenzpolarisation zu erzeugen (FP).

4. Schlussfolgerung

Eine spezielle Variante der SELEX-Technologie, das Capture-SELEX-Verfahren, hat sich zur Selektion von DNA-Aptameren für solche Targets etabliert, die nicht auf einer festen Oberfläche immobilisiert werden können, beispielsweise kleine organische Targetmoleküle. Die Immobilisierung eines der Bindungspartner ist jedoch eine sehr wichtige und bequeme Methode, um eine effiziente Trennung von zielbindenden und nicht bindenden Oligonukleotiden während des Aptamer-Selektionsverfahrens zu ermöglichen. Daher wurde eine teilweise randomisierte DNA-Bibliothek mit einer definierten Andocksequenz innerhalb der Zufallsregion entworfen, um mit Einfang-Oligos auf magnetischen Kügelchen zu hybridisieren. Auf diese Weise können anstelle der Zielmoleküle die Oligonukleotide der Bibliothek immobilisiert werden. Ein ausgiebiges Waschen der resultierenden DNA-Bead-Komplexe wird empfohlen, um alle nicht hybridisierten DNA-Moleküle zu entfernen. Darüber hinaus werden zwei spezielle Elutionsschritte vor dem Zielbindungsschritt verwendet, um die Menge an Oligonukleotiden zu minimieren, die unspezifisch aus den Beads freigesetzt wird, beispielsweise durch falsche Duplexbildung oder durch mechanische Kräfte. Für die Bewertung des Selektionsfortschritts in jeder SELEX-Runde wird der direkte Vergleich zwischen dem Hintergrund-Elutionsschritt und dem Zielbindungsschritt verwendet. Die Menge an Oligonukleotiden, die in Gegenwart des Ziels eluiert wird, sollte die Hintergrundelution deutlich übersteigen und während des Capture-SELEX-Prozesses weiter ansteigen (bis ein Höchstwert erreicht wird). Ein Fluorescein-Label dient zur Quantifizierung der DNA in den verschiedenen SELEX-Fraktionen jeder SELEX-Runde (ab der zweiten Runde) durch Fluoreszenzdetektion.

Die Konfiguration des Capture-SELEX-Prozesses ist sehr flexibel. Der Hintergrundelutionsschritt kann leicht mit einem Negativ- oder Gegenselektionsschritt kombiniert werden, um die Spezifität der zu selektierenden Aptamere zu beeinflussen. Neben einzelnen Zielsubstanzen ist das Capture-SELEX-Verfahren auch auf Zielgemische anwendbar, die zwei oder mehr verschiedene Substanzen enthalten, um eine parallele Selektion unterschiedlich gezielter Aptamere zu ermöglichen. Darüber hinaus ist das Capture-SELEX-Prinzip für andere Klassen von Zielmolekülen wie Polysaccharide, Peptide oder Proteine ​​gleichermaßen attraktiv.

Die erfolgreiche Anwendung des Capture-SELEX-Verfahrens zur Selektion von DNA-Aptameren für KanamycinA wurde demonstriert und Dissoziationskonstanten bestimmt. Zur genaueren Untersuchung der erhaltenen Aptamere müssen Bindungsspezifitäten gegenüber anderen Aminoglykosid-Antibiotika bestimmt werden. Dies wird derzeit untersucht und wird Gegenstand einer folgenden Veröffentlichung sein.

Das Capture-SELEX-Prinzip bietet auch die Möglichkeit, fluoreszenzbasierte Nachweisassays ohne umfangreiche zusätzliche Modifikationen der ausgewählten Aptamere zu entwickeln. Der Wechsel der Oligonukleotide zwischen der Duplex-Struktur (mit den Fänger-Oligos) und dem Aptamer-Target-Komplex bei Zugabe von Zielmolekülen kann verwendet werden, um ein messbares Signal zu erzeugen. Zukünftige Arbeiten werden daher auf die Entwicklung von Assays für einen sensitiven Nachweis von Kanamycin A basierend auf den besonderen Strukturmerkmalen der ausgewählten Aptamere abzielen, wie in Abschnitt 3.5 dargestellt.

Danksagung

Diese Arbeit wurde von der Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen (AiF) im Rahmen des Förderprogramms PRO INNO II (KF 011004DA6) und vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) im Rahmen des Programms BIONA (01RB0805B) gefördert. Die Autoren danken ihren Kollegen Anja Prange, Carina Flores de Looß und Christine Reinemann für fachliche Unterstützung und Diskussion.

Verweise

  1. T. Hermann und D. J. Patel, „Adaptive Erkennung durch Nukleinsäureaptamere“, Wissenschaft, Bd. 287, Nr. 5454, S. 820–825, 2000. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  2. D. J. Patel, „Strukturanalyse von Nukleinsäureaptameren“, Aktuelle Meinung in der chemischen Biologie, Bd. 1, nein. 1, S. 32–46, 1997. Ansicht bei: Google Scholar
  3. D. J. Patel, A. K. Suri, F. Jiang et al., „Struktur, Erkennung und adaptive Bindung in RNA-Aptamer-Komplexen“, Zeitschrift für Molekularbiologie, Bd. 272, Nr. 5, S. 645–664, 1997. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  4. A. D. Ellington und J. W. Szostak, „In-vitro-Selektion von RNA-Molekülen, die spezifische Liganden binden“, Natur, Bd. 346, Nr. 6287, S. 818–822, 1990. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  5. C. Türk und L. Gold, „Systemische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung: RNA-Liganden zur Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase“, Wissenschaft, Bd. 249, Nr. 4968, S. 505–510, 1990. Ansicht bei: Google Scholar
  6. S. Klussmann, Das Aptamer-Handbuch, Funktionelle Oligonukleotide und ihre Anwendungen, Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland, 2006.
  7. R. Stoltenburg, C. Reinemann und B. Strehlitz, „SELEX-A (r)evolutionary method to gene high-affinity nucle acid ligands“, Biomolekulare Technik, Bd. 24, nein. 4, S. 381–403, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  8. G. Aquino-Jarquin und J. D. Toscano-Garibay, „RNA-Aptamer-Evolution: zwei Jahrzehnte der Selektion“, Internationale Zeitschrift für Molekularwissenschaften, Bd. 12, nein. 12, S. 9155–9171, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  9. S. C. B. Gopinath, „Für SELEX entwickelte Methoden“, Analytische und Bioanalytische Chemie, Bd. 387, Nr. 1, S. 171–182, 2007. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  10. S. D. Jayasena, „Aptamere: eine aufstrebende Klasse von Molekülen, die in der Diagnostik mit Antikörpern konkurrieren“, Klinische Chemie, Bd. 45, nein. 9, S. 1628–1650, 1999. Ansicht bei: Google Scholar
  11. W. Kusser, „Chemisch modifizierte Nukleinsäureaptamere für In-vitro-Selektionen: Evolving Evolution“, Zeitschrift für Biotechnologie, Bd. 74, Nr. 1, S. 27–38, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  12. R. Stoltenburg, C. Reinemann und B. Strehlitz, „FluMag-SELEX als vorteilhafte Methode zur DNA-Aptamer-Selektion“, Analytische und Bioanalytische Chemie, Bd. 383, Nr. 1, S. 83–91, 2005. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  13. R. Nutiu und Y. Li, „In-vitro-Selektion strukturwechselnder Signalaptamere“, Angewandte Chemie, Bd. 44, Nr. 7, S. 1061–1065, 2005. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  14. B. Strehlitz, C. Reinemann, S. Linkorn und R. Stoltenburg, „Aptamere für Pharmazeutika und ihre Anwendung in der Umweltanalytik“, Bioanalytische Bewertungen, Bd. 4, nein. 1, S. 1–30, 2012. View at: Publisher Site | Google Scholar
  15. A. Crameri und W. P. C. Stemmer, „1020-fache Aptamer-Bibliothek-Amplifikation ohne Gelreinigung“, Nukleinsäureforschung, Bd. 21, nein. 18, s. 4410, 1993. Ansicht bei: Google Scholar
  16. Santa Cruz Biotechnology Inc, „Kanamycin-Säure-Sulfat-Datenblatt“, 2007-2012, http://www.scbt.com/datasheet-263433-Kanamycin-acid-sulfate.html. Ansehen bei: Google Scholar
  17. SRC, „Interaktive physProp-Datenbankdemo“, 2011, http://www.syrres.com/what-we-do/databaseforms.aspx?id=386. Ansehen bei: Google Scholar
  18. Sigma-Aldrich, „Sotalol-Hydrochlorid-Spezifikationsblatt (Nr.d.),“ http://www.sigmaaldrich.com/catalog/DataSheetPage.do?brandKey=SIGMA&symbol=S0278&PrintPreview=1. Ansehen bei: Google Scholar
  19. C. Gaillard und F. Strauss, „Ethanol-Fällung von DNA mit linearem Polyacrylamid als Träger“, Nukleinsäureforschung, Bd. 18, nein. 2, s. 378, 1990. Ansicht bei: Google Scholar
  20. K. P. Williams und D. P. Bartel, „PCR-Produkt mit ungleich langen Strängen“, Nukleinsäureforschung, Bd. 23, nein. 20, S. 4220–4221, 1995. Ansicht bei: Google Scholar
  21. M. A. Larkin, G. Blackshields, N. P. Brown et al., „Clustal W und Clustal X Version 2.0“, Bioinformatik, Bd. 23, nein. 21, S. 2947–2948, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  22. J. D. Thompson, D. G. Higgins und T. J. Gibson, „CLUSTAL W: Improve the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment through Sequence Weighting, Position Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice“, Nukleinsäureforschung, Bd. 22, nein. 22, S. 4673–4680, 1994. Ansicht bei: Google Scholar
  23. R. Chenna, H. Sugawara, T. Koike et al., „Multiple Sequence Alignment with the Clustal series of programmes“, Nukleinsäureforschung, Bd. 31, Nr. 13, S. 3497–3500, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  24. X. Luo, M. Mckeague, S. Pitre et al., „Computergestützte Ansätze zum Design von Pools für die In-vitro-Selektion komplexer Aptamere“, RNA, Bd. 16, nein. 11, S. 2252–2262, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  25. B. Vant-Hull, A. Payano-Baez, R. H. Davis und L. Gold, „Die Mathematik von SELEX gegen komplexe Ziele“, Zeitschrift für Molekularbiologie, Bd. 278, Nr. 3, S. 579–597, 1998. View at: Publisher Site | Google Scholar
  26. N. Nikolaus, A. Prange, R. Stoltenburg und B. Strehlitz, Aminoglykosid-spezifisches Aptamere. Patent, Anmeldenummer: DE10 2011 006612. 1-41, Deutschland, 2011.
  27. K. M. Song, M. Cho, H. Jo et al., „Gold-Nanopartikel-basierter kolorimetrischer Nachweis von Kanamycin mit einem DNA-Aptamer“, Analytische Biochemie, Bd. 415, Nr. 2, S. 175–181, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  28. H. T. Allawi und J. SantaLucia, „Nearest Neighbour thermodynamic parameters for internal G·Eine Nichtübereinstimmung in der DNA“, Biochemie, Bd. 37, nein. 8, S. 2170–2179, 1998. View at: Publisher Site | Google Scholar
  29. H. T. Allawi und J. SantaLucia, „Nearest-Neighbor Thermodynamics of internal A·C-Fehlpaarungen in der DNA: Sequenzabhängigkeit und pH-Effekte“, Biochemie, Bd. 37, nein. 26, S. 9435–9444, 1998. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  30. E. J. Cho, J. W. Lee und A. D. Ellington, „Anwendungen von Aptameren als Sensoren“, Jährlicher Überblick über die analytische Chemie, Bd. 2, S. 241–264, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  31. K. Sefah, J. A. Phillips, X. Xiong et al., „Nucleinsäureaptamere für Biosensoren und bioanalytische Anwendungen“, Analytiker, Bd. 134, Nr. 9, S. 1765–1775, 2009. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  32. K. Han, Z. Liang und N. Zhou, „Designstrategien für Aptamer-basierte Biosensoren“, Sensoren, Bd. 10, nein. 5, S. 4541–4557, 2010. Ansicht auf: Website des Herausgebers | Google Scholar
  33. R. E. Wang, Y. Zhang, J. Cai, W. Cai und T. Gao, „Aptamer-basierte fluoreszierende Biosensoren“, Aktuelle medizinische Chemie, Bd. 18, nein. 27, S. 4175–4184, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  34. D. P. Morse, „Direkte Selektion von RNA-Beacon-Aptameren“, Biochemische und biophysikalische Forschungskommunikation, Bd. 359, Nr. 1, S. 94–101, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  35. M. Rajendran und A. D. Ellington, „In-vitro-Selektion molekularer Beacons“, Nukleinsäureforschung, Bd. 31, Nr. 19, S. 5700–5713, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  36. R. Nutiu und Y. Li, „Aptamere mit fluoreszenzsignalisierenden Eigenschaften“, Methoden, Bd. 37, nein. 1, S. 16–25, 2005. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar

Urheberrechte ©

Copyright © 2012 Regina Stoltenburg et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


Konsens Meinungen

Dieses Dokument soll als Brennpunkt für Diskussionen zwischen Vertretern der Industrie und der Aufsichtsbehörden dienen, um zu versuchen, bewährte Verfahren für die Bewertung von EP mit Oligonukleotiden aufgrund von Unsicherheiten bei der Beurteilung der regulatorischen Erwartungen in Bezug auf den Umfang der EP-Bewertung zu ermitteln.

Der Schwerpunkt lag auf den ON-Unterklassen, die die Expression von „Wirts“-Genprodukten beeinflussen (Antisense, siRNAs und verwandte ONs, die auf mRNA abzielen), mit späteren und begrenzteren Diskussionen über die Aptamer- und IS-Unterklassen. Daher werden die Ergebnisse der Diskussionen für jede dieser Arten von ONs präsentiert. Es wird erwartet, dass viele der Prinzipien für andere Unterklassen relevant sind, aber sie müssen sorgfältig geprüft werden, wenn diese Entwicklungsprogramme in Richtung klinischer Studien voranschreiten.

ONs, die die Expression von Genprodukten beeinflussen

Artenauswahl

Eine zentrale Frage, die zunächst behandelt wurde, war, wie viele und welche Tierarten für die Bewertung von EP herangezogen werden sollten. Die Charakterisierung der speziesübergreifenden pharmakologischen Aktivität ist wichtig, insbesondere bei den Spezies, die üblicherweise für Toxizitätsstudien verwendet werden, und mit Blick auf die Spezies, die in der Vergangenheit für die Sicherheitsbewertung von ONs verwendet wurden, wie z relevanten Arten. Die oben beschriebene Speziesspezifität von ONs schließt jedoch häufig eine ubiquitäre Aktivität bei den üblicherweise verwendeten Tierspezies aus. In einigen Fällen kann die Aktivität für eine Spezies (z. B. Affe) dokumentiert oder vorhergesagt werden (basierend auf Sequenzhomologie), aber sie kann bei anderen üblichen Laborspezies fehlen. Oder es kann keine artenübergreifende Aktivität geben. Unter solchen Umständen können Bedenken hinsichtlich der Validität des Einsatzes tieraktiver Analoga entstehen (siehe unten). Um Urteile über den angemessenen Umfang der EP-Bewertung zu fällen, sollte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von schädlichen Wirkungen aufgrund von EP berücksichtigt werden. Diesbezüglich wurden nur wenige Beispiele identifiziert, in denen EP bei Tieren exprimiert wurde, was zu einer signifikanten Toxizität führte, und der Unterausschuss konnte ONs nicht ohne weiteres identifizieren, bei denen eine solche Expression von EP ein zentrales Sicherheitsproblem darstellte, das sich auf die Auswahl der klinischen Anfangsdosis auswirkte. Das Fehlen zahlreicher Beispiele schwerwiegender Toxizität, die EP mit ONs zuzuschreiben sind, könnte zumindest teilweise mit der oft unvollständigen oder bescheidenen Auswirkung von ASOs auf die Genexpression zusammenhängen, der am häufigsten untersuchten Unterklasse. Darüber hinaus wird das Toxizitätsprofil vieler Arten von ONs oft von unspezifischen „Klasseneffekten“ dominiert, insbesondere für ONs, die chemisch modifizierte Rückgrate enthalten, die einen starken anionischen Charakter verleihen, insbesondere solche mit einer Phosphorothioat-Modifikation. Die Phosphorothioat-Modifikation wurde weit verbreitet eingesetzt, um Nukleaseresistenz zu verleihen und längere zu fördern in vivo Gewebepersistenz. Für solche Moleküle manifestieren sich die Klasseneffekte typischerweise bei niedrigeren Dosisniveaus als diejenigen, die erforderlich sind, um eine vollständige Hemmung der Genproduktexpression zu bewirken, wodurch jegliche nachteilige Wirkungen, die von EP stammen, verschleiert oder ausgeschlossen werden.

Eine intensivere Untersuchung von EP könnte aufgrund der Art des Ziels und aus begründeter Besorgnis über die Folgen eines Knockdowns des spezifischen Ziels oder aufgrund des völligen Fehlens von Informationen über die Folgen eines solchen Knockdowns gerechtfertigt sein. Die neueren Generationen von ASOs sowie die neueren Unterklassen, die auf die Expression von Genprodukten (wie siRNAs und microRNAs) abzielen, scheinen im Allgemeinen pharmakologisch wirksamer zu sein, da mehr in vivo Stabilität und/oder ihrem Wirkmechanismus. Bei diesen neueren Arten von ONs kann der Beurteilung des EP mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Im Allgemeinen sollte der Aufwand für die Bewertung der Sicherheitsauswirkungen von EP mit ON auf der Grundlage der verfügbaren Informationen (von Fall zu Fall) erfolgen, und es sollten keine starren Anforderungen an die Anzahl der Arten und die Bedingungen für die Prüfung gestellt werden. Bei der Beurteilung des Umfangs der EP-Bewertung sollten folgende Arten von Informationen berücksichtigt werden: (1) die Rolle des Zielgenprodukts und was über den Verlust seiner Funktion bekannt ist (z. B. aus Knockout-Modellen) (2) die Potenz und Persistenz der ON-induzierten Inaktivierung (3) Verabreichungsweg (und Wahrscheinlichkeit einer ausgedehnten systemischen Exposition) (4) Expressionsprofil des spezifischen Zielmoleküls (5) Dosierungshäufigkeit und -dauer und (6) klinische Indikation ( Risiko-Nutzen-Überlegungen).

Beispielsweise kann die Besorgnis über eine mögliche EP-bedingte Toxizität erhöht sein, wenn das ON auf ein ubiquitäres Schlüsselregulationsprotein abzielt, während es weniger Bedenken geben kann, wenn das ON gegen ein Protein gerichtet ist, das nur in erkranktem Gewebe exprimiert wird oder abnorme Zellen (z. B. Krebszellen). In ähnlicher Weise können die Folgen von EP stärker besorgniserregend sein, wenn das ON systemisch in relativ hohen Dosen verabreicht wird und weit in die Gewebe verteilt wird, im Gegensatz zu einem ON, das topisch auf einen diskreten Hautbereich verabreicht wird und nicht systemisch absorbiert wird. Offensichtlich ist die Anzahl möglicher Szenarien ziemlich groß, und eine ausführlichere Diskussion spezifischer Umstände und Überlegungen würde den Rahmen dieses Dokuments sprengen.

Im Allgemeinen kann es angebracht sein, die Optionen für die Behandlung von EP bei 2 Arten (dh sowohl der Nagetier- als auch der Nicht-Nagetierart) in Betracht zu ziehen, wenn ONs nach neuartigen Mechanismen wirken und/oder das Toxizitätsprofil der Unterklasse nicht gut ist gekennzeichnet. Für die diskutierten ON-Unterklassen sollte jedoch die Untersuchung von EP bei einer Spezies ausreichen, es sei denn, weitere Untersuchungen sind aufgrund zwingender theoretischer Bedenken oder aufgrund der Ergebnisse allgemeiner Toxizitätsstudien gerechtfertigt, die eine neue Toxizität offenbaren, die von EP herrührt. Abgesehen von diesen Vorbehalten steht die Bewertung bei einer Spezies im Einklang mit der International Conference on Harmonization (ICH) S6 (R1), wo ähnliche Einschränkungen der speziesübergreifenden Aktivität bestehen können, insbesondere angesichts der Tatsache, dass die dosislimitierende Toxizität von Biopharmazeutika am häufigsten ist eine Erweiterung der pharmakologischen Aktivität, während dies bei den diskutierten ON-Subklassen selten der Fall war.

Bestimmung der pharmakologischen Relevanz

Ein weiteres Thema ausführlicher Diskussionen war der Informationsstand, der benötigt wird, um eine Art für die Untersuchung von EP zu „validieren“. Wenn zwischen den menschlichen und tierischen Ziel-mRNA-Sequenzen 100 % Sequenzhomologie besteht, wird das menschliche ON höchstwahrscheinlich in der Tierspezies aktiv sein, insbesondere wenn das menschliche ON auf optimale Aktivität gescreent wurde. Unter solchen Umständen ist eine Dokumentation der Aktivität des ON bei der Tierart wahrscheinlich nicht erforderlich. Wenn der Grad der Nichthomologie jedoch mäßig ist (z. B. 1 oder 2 Fehlpaarungen), kann die Tierart immer noch ein gültiges Modell für die Bewertung von EP sein (mit dem menschlichen ON), aber die Unsicherheit rechtfertigt Untersuchungen, um die pharmakologische Aktivität zu untermauern, entweder durch den Nachweis einer verminderten Zielgenexpression oder eines anderen Maßes der beabsichtigten Aktivität, das eine verminderte Genexpression widerspiegelt (zB Wirksamkeit in einem relevanten Tiermodell). Die pharmakologische Aktivität konnte durch eine relativ einfache in vitro Assay, wie der Nachweis einer reduzierten Ziel-mRNA- oder Proteinexpression nach Inkubation des ON in einem relevanten in vitro System, das das Zielgen enthält (z. B. ein Affen-Leukozytenpräparat aus peripherem Blut). Die Potenz des menschlichen ON im ganzen Tier oder in vitro System muss nicht genau dem des ON in einem menschlichen System entsprechen, um die Ergebnisse extrapolieren zu können. Diese Ansicht wird durch die Tatsache gestützt, dass das ON in Toxizitätsstudien normalerweise mit hohen klinischen Mehrfachdosen getestet wird, so dass wahrscheinlich eine Hemmung des Zielgenprodukts erreicht wird. Bei Programmen, bei denen eine hohe klinische Mehrfachdosis nicht in Toxizitätsstudien bewertet werden kann (z bei dieser Art angemessen bewertet werden.

Wenn bei einer der Tierarten, die üblicherweise für Toxizitätsstudien verwendet werden, keine Aktivität für ein ON beim Menschen nachgewiesen werden kann, sollte die Verwendung von tieraktiven Analoga (Surrogaten) zur Beurteilung von EP bei einer Tierart in Betracht gezogen werden (siehe unten).

Fallstudien

Viele Fälle liegen zwischen den Extremen der allgegenwärtigen speziesübergreifenden Aktivität für das menschliche ON und keiner speziesübergreifenden Aktivität, und mehrere davon wurden diskutiert. Ein häufig anzutreffendes Szenario ist, wenn das menschliche ON 100 % Sequenzhomologie (dh Komplementarität) mit der Ziel-mRNA-Region für eine Tierart (z Toxizitätsuntersuchungen ausreichend ist und der Sponsor zusätzlich ein Nagetieranalogon für pharmakologische Untersuchungen verwendet hat. Unter diesen Umständen wurde die Dokumentation von EP bei einer einzelnen Spezies (z. B. nicht-menschlichen Primaten) als ausreichend angesehen. Die Aufnahme des Nagetieranalogons in die Toxizitätsstudie der guten Laborpraxis (GLP) sollte nicht erforderlich sein, da die EP des klinischen Kandidaten in der Nicht-Nagetierstudie angemessen bewertet werden sollte. Diese Position stimmt auch mit ICH S6 (R1) überein. Mehrere Entwickler haben jedoch einen Präzedenzfall für die Untersuchung der Toxizität eines Nagetieranalogons unter solchen Umständen geschaffen, entweder weil solche Tests von einer Prüfabteilung der Food and Drug Administration angefordert wurden oder weil der Dialog mit der Agentur vor Beginn der Toxizitätsstudien nicht geführt werden konnte und der Bauträger war besorgt, dass die Bewertung von EP nur bei einer Art (Nicht-Nagetier) von der Agentur als unzureichend angesehen werden könnte. Wichtig ist, dass in all diesen Fällen die zusätzlichen Tests mit dem Nagetieranalogon nicht über die Risiken von EP informierten (d die für die klinische Entscheidungsfindung schwer zu interpretieren waren (z. B. keine nachteiligen Befunde mit dem klinischen Kandidaten in einer relevanten Studie an nicht humanen Primaten und Toxizität mit dem Nagetieranalogon in einer Nagetierstudie).

In einigen Entwicklungsprogrammen war das menschliche ON bei Nicht-Nagetieren inaktiv, bei Nagetieren jedoch aktiv. Im Allgemeinen wären die gleichen Überlegungen zur potenziellen Angemessenheit einer 1-Spezies-Bewertung von EP anwendbar, sodass eine EP-Untersuchung bei einer Nicht-Nagetierart nicht unbedingt erforderlich sein sollte. In solchen Fällen, in denen ein Analogon der Nicht-Nagetierspezies verfügbar ist (z. B. weil es für die Verwendung in pharmakologischen Studien entwickelt wurde), kann die Einbeziehung dieses Analogons in die Nicht-Nagetier-Toxizitätsstudie in Betracht gezogen werden.

Ein weiteres Szenario ist der Fall eines ON, das bei Nicht-Nagetieren (z. B. nicht-menschlichen Primaten) oder bei Nagetieren pharmakologisch nicht aktiv ist, aber ein Nagetier-Analogon verfügbar ist. Dieser Umstand kann die Verwendung des Nagetieranalogons in der GLP-Toxizitätsstudie rechtfertigen, um EP zu behandeln (d. h. parallel mit der menschlichen Sequenz getestet), aber Entwickler sollten die unten aufgeführten Bedenken hinsichtlich der Verwendung von Analoga sorgfältig berücksichtigen.

Bedenken hinsichtlich der Verwendung von tieraktiven Analoga

Es gab zahlreiche Programme mit ONs, für die ein tieraktives Analogon als pharmakologisches Werkzeug entwickelt und schließlich in einer GLP-Toxizitätsstudie an derselben Spezies auf Sicherheit getestet wurde. Diese Analoga haben oft eine wesentlich oder vollständig andere Nukleotidsequenz als das menschliche ON und sind daher unterschiedliche molekulare Einheiten. Ein Problem besteht darin, dass die Intensität der Klasseneffekte zwischen ONs unterschiedlicher Sequenzen erheblich variieren kann, was zu unterschiedlichen Toxizitätsmanifestationen zwischen dem humanen ON und dem Analogon führen kann, die als Beweis für eine EP ausgelegt werden können, aber tatsächlich ein Spiegelbild einer nicht-pharmakologischen -basierter sequenzbezogener Unterschied. Unternehmen mit umfangreicher Erfahrung in der Sicherheitsbewertung von Antisense-ONs haben im Laufe der Jahre gelernt, dass bestimmte ONs aus Gründen, die nicht mit EP zusammenhängen, eine dramatisch höhere Toxizität aufweisen als andere Sequenzen, und diese anomale Toxizität kann bei etwa 10–20 % der getesteten ONs auftreten ( persönliche Kommunikation zwischen den Mitgliedern des Unterausschusses). Die Struktur-Wirkungs-Beziehung für diese Art von unerwarteter Toxizität ist nicht gut verstanden, und daher sollten Sponsoren aktive Analoga auswählen, die solche Eigenschaften nicht aufweisen, bevor sie in einen direkten Vergleich mit dem humanen ON in die Toxizität aufgenommen werden Studien. Aufgrund der Dringlichkeit der meisten ON-Entwicklungsprogramme entscheiden sich jedoch viele Sponsoren dafür, auf ein vorläufiges Toxizitätsscreening aktiver Analoga zu verzichten.

Darüber hinaus birgt die Tatsache, dass das Analogon eine andere Sequenz aufweist als das menschliche ON, die Gefahr, dass das Analogon zufällig eine Art mechanismusbasierter (z eines anderen Genprodukts), das sich in Toxizität niederschlägt. Wenn bei einem Analogon eine unerwartete Toxizität auftrat, kann es schwierig sein zu erkennen, ob der Effekt EP widerspiegelte oder ein Off-Target-Effekt war. Es gibt andere mögliche Unterschiede in den Eigenschaften zwischen dem menschlichen ON und einem Analogon, die nicht mit EP verwandt sind, aber eine unterschiedliche Toxizität ergeben könnten, die als Beweis für EP ausgelegt werden könnte. Dazu gehören Unterschiede in der Pharmakokinetik (PK), der Bioverteilung und der Gewebestabilität. Obwohl das PK- und Gewebeverteilungsprofil bei strukturell verwandten ONs typischerweise ähnlich ist, kann es einen gewissen Einfluss der Nukleotidsequenz auf die ON-Disposition geben, der die toxikologische Wirksamkeit beeinflussen könnte.

Für den Fall, dass das menschliche Molekül nicht spezieskreuzreaktiv war und EP bei mindestens einer Spezies untersucht werden musste, kann es im Allgemeinen angemessener sein, gezielte Sicherheitsbewertungen mit Analoga in einem Krankheitsmodell durchzuführen, bei dem das Ziel möglicherweise über- ausgedrückt, mit spezifischen Untersuchungen der Endpunkte, von denen erwartet wird, dass sie durch das EP beeinflusst werden, anstatt das Analogon parallel zur humanen ON einer allgemeinen Toxizitätsbewertung zu unterziehen. Studien in Krankheitsmodellen können eine Herausforderung darstellen und können in der Regel nicht immer unter GLP-konformen Bedingungen durchgeführt werden. Das Fehlen einer GLP-Einstellung sollte jedoch nicht von der Durchführung solcher Studien abschrecken, solange die Durchführungs- und Aufzeichnungspraktiken für solche Studien solide sind. Allerdings besteht auch bei gezielteren Sicherheitsstudien das Potenzial, mit Analoga auf Off-Target-Toxizitäten zu stoßen und könnte zu schwer zu interpretierenden Ergebnissen führen.

Der mögliche Nutzen von Analoga für spätere Untersuchungen der Reproduktionstoxizität und/oder Kanzerogenität wurde ebenfalls diskutiert.Bei humanen ONs, die bei nichtmenschlichen Primaten, aber nicht bei Nagetieren, aktiv sind, kann ein Nagetieranalogon verwendet werden, um die EP-bedingte Reproduktionstoxizität zu bewerten, aber solche Beurteilungen sollten zumindest teilweise auf dem Grad der Besorgnis oder Unsicherheit beruhen darüber, ob zu erwarten ist, dass eine gehemmte Expression des anvisierten Genprodukts die Fortpflanzungsleistung beeinflusst. Daher sollte die Verwendung von tierischen aktiven Analoga für allgemeine Toxizitätsuntersuchungen mit Vorsicht angegangen werden, es wird jedoch anerkannt, dass solche Analoga die beste Option sein können, um die Anforderungen an Reproduktionstoxizitätsprüfungen zu erfüllen. Darüber hinaus können solche Analoga eine Rolle bei der Bewertung der Karzinogenität spielen, da diese Studien nur an Nagetieren durchgeführt werden Zielinaktivierung und andere Faktoren).

Bei der Bewertung der Sicherheit eines tieraktiven Analogons gibt es eine Reihe taktischer Überlegungen, wie dies erreicht werden kann. Zu Beginn ist es wichtig, die zusätzlichen Ressourcen zu verstehen, die zur Herstellung und Charakterisierung eines zweiten Prüfgegenstands erforderlich sind. Das gängigste Paradigma war die Einbeziehung einer oder mehrerer Gruppen, die mit dem Analogon in die GLP-Toxizitätsstudie parallel zur humanen Sequenz behandelt werden sollen. Bei vielen Programmen haben sich Sponsoren dafür entschieden, nur eine Dosis des Analogons zu testen, die typischerweise der hohen oder mittleren Dosis der menschlichen Sequenz entspricht. Die Bewertung einer Einzeldosishöhe birgt jedoch das Risiko, dass, falls die Gruppe eine einzigartige oder stärker ausgeprägte Toxizität aufweist, die als Manifestation von EP angesehen wird, ein regulatorisches Problem daraus entstehen kann, dass keine Dosis ohne Nebenwirkungen charakterisiert wurde ( NOAEL) für diesen Effekt. Daher muss die Anzahl der Gruppen, die für die richtige Bewertung eines Analogons erforderlich sind, sorgfältig geprüft werden. Wie bereits erwähnt, kann ein Vorscreening einer Reihe von Dosen diesen Entscheidungsprozess unterstützen, obwohl es zeiteffizienter sein kann, einfach mehrere Gruppen in eine GLP-Toxizitätsstudie einzubeziehen.

Es wurde auch gefragt, ob die Verwendung eines aktiven Analogons als Testartikel in einer GLP-Toxizitätsstudie der gleichen analytischen Strenge unterliegen sollte wie der primäre (humane ON) Testartikel. Der Unterausschuss war der Meinung, dass die Voruntersuchung des Analogs nicht unter GLP- oder GMP-Bedingungen durchgeführt werden muss, solange das Material durch eine ähnliche Methodik wie für den Primärtestartikel (human ON) gut charakterisiert ist und die Analyseergebnisse gut dokumentiert. Wie jedoch für jedes Studienelement, das nicht vollständig GLP-konform ist, zu erwarten ist, sollte die Verwendung von Nicht-GMP-Material in einer GLP-Studie im Abschnitt „Compliance“ des Studienberichts behandelt werden.

Ebenso sollten hinsichtlich der Dosimetrie und/oder Expositionsüberprüfung für Analoga einige Zugeständnisse in Bezug auf die vollständige GLP-Konformität zugelassen werden. Es wurde anerkannt, dass die Ressourcenzuweisung nicht trivial ist, insbesondere für Programme mit mehreren ONs mit entsprechenden analogen Kombinationen. Für die GLP-konforme Bestimmung der Dosimetrie müsste ein Sponsor eine Methodenentwicklung und -validierung durchführen, um die Analyse der Analogkonzentration, Homogenität und Stabilität in Dosierlösungen unter GLP-konformen Bedingungen zu ermöglichen, ähnlich wie beim Menschen Reihenfolge. Daher haben sich die meisten Sponsoren entschieden, auf die Bewertung der Dosimetrie für Analoga zu verzichten. Die Begründung für diese Entscheidung basiert im Wesentlichen auf der Tatsache, dass die Dosierlösungen des Analogons auf die gleiche Weise wie der primäre (humane) Testartikel hergestellt und geliefert werden. Das Fehlen einer Dosimetrieüberprüfung für ein tieraktives Analogon sollte im Studienbericht als Ausnahme von der GLP-Compliance angeführt werden.

Die Bestimmung der Exposition der Tiere gegenüber dem Analogon im Rahmen einer GLP-Toxizitätsstudie würde eine zusätzliche Ressourcenallokation in Form einer bioanalytischen Methodenentwicklung und Validierung vor der Analyse der Studienproben erfordern. Da jedoch die meisten ONs auf intravenösem oder subkutanem Weg verabreicht werden und da die Resorption bei intravenöser Dosierung vollständig ist und bei subkutaner Dosierung bekanntermaßen umfangreich ist, kann davon ausgegangen werden, dass die Exposition des Testsystems für ein Analogon und die menschliche Sequenz ziemlich ähnlich ist. Dies rechtfertigt das Vertrauen auf die toxikokinetischen Daten, die mit dem primären Prüfgegenstand (menschliche Sequenz) erhalten wurden, um die wahrscheinliche Exposition des Analogons darzustellen. Der wichtigste Vorbehalt gegenüber dieser Annahme besteht darin, dass nach systemischer Absorption die in vivo Die Stabilität des Analogons kann sich erheblich von der der humanen Sequenz unterscheiden, was bei wiederholter Verabreichung zu einem anderen Grad der Gewebeakkumulation führen könnte, der eine andere Schwere der Toxizität diktieren könnte. Solche Unterschiede in der Toxizität zwischen der analogen und der menschlichen Sequenz können unangemessen als Beweis für EP ausgelegt werden. Daher kann es ratsam sein, zusätzliche Tiere in die mit Analogon behandelten Gruppen für die toxikokinetische Probennahme (Plasma und Gewebe) aufzunehmen, die gefroren gelagert und möglicherweise analysiert wird, wenn ein Analogon einen anderen Toxizitätsgrad als die menschliche Sequenz aufwies.

Die Verwendung von inaktiven Analoga als Kontrollartikel

Inaktive Analoga wurden verwendet, um die Unterscheidung von EP-bezogenen Wirkungen von nicht-pharmakologischen Wirkungen zu ermöglichen. Dieser Ansatz wird bei siRNA-Programmen immer häufiger angewendet, insbesondere bei solchen Programmen, bei denen die siRNA über eine spezielle Formulierung abgegeben wird und eine rezepturbasierte Toxizität erwartet wird. Dieser Umstand stellt Herausforderungen bei der Unterscheidung zwischen den Wirkungen der Formulierungshilfsstoffe, den unspezifischen Wirkungen der ON-Klasse und den Wirkungen, die von EP herrühren. In solchen Fällen kann die Aufnahme eines inaktiven Analogons sehr aufschlussreich sein. Die geäußerten Bedenken bezüglich der Verwendung aktiver Analoga sind jedoch für die Verwendung inaktiver Analoga relevant (dh dass sich eine anomale Toxizität im Zusammenhang mit Off-Target-Mechanismen oder anderen sequenzabhängigen Effekten manifestieren und die Interpretation der Studiendaten verfälschen könnte ). In den Fällen, in denen das humane ON bei der Tierart keine Aktivität aufweist, könnte das humane ON als inaktives Kontroll-ON dienen und die beste Wahl für eine solche Kontrolle sein, da es das Hinzufügen einer weiteren inaktiven Sequenz zum Studiendesign vermeidet . Es ist jedoch wichtig sicherzustellen, dass das menschliche ON bei der Tierart wirklich inaktiv ist.

Die Rolle von Formulierungen

Viele ON-Entwicklungsprogramme schreiten mit spezialisierten Verabreichungssystemen voran, was die Wahrscheinlichkeit einer signifikanten Toxizität im Zusammenhang mit EP beeinträchtigen könnte. Einerseits könnten Formulierungen, die eine gezielte Abgabe an spezifische Zelltypen ermöglichen, das Potenzial für nachteilige Manifestationen von EP in diesen Zelltypen dramatisch erhöhen. Wenn jedoch eine solche gezielte Abgabe gegen Krebszellen oder Zellen gerichtet ist, die Nicht-Wirtspathogene enthalten, und wenn das pharmakologische Ziel die Zellzerstörung ist, können nachteilige Folgen von EP in diesen Zelltypen strittig sein. Bei mehreren Arten spezialisierter Formulierungen scheint es, dass die Toxizität, die von Hilfsstoffen oder anderen Eigenschaften der Formulierung abgesehen vom ON-Gehalt herrührt, viel ausgeprägter sein kann als jede EP-Wirkung des ON, insbesondere wenn das formulierte ON wenig oder keine xenobiotischen Chemikalien enthält Änderung. Es ist jedoch von vornherein schwierig zu wissen, ob die auf die Formulierung basierende Toxizität oder die ON-bezogene Toxizität überwiegen wird. Daher führt die zunehmende Verwendung von Formulierungen für die Abgabe zu neuen Überlegungen zu den Strategien und dem Umfang der EP-Bewertung, und Sponsoren werden ermutigt, die Umstände ihres Programms/Ihrer Programme zu prüfen und geeignete Vorschläge für regulatorische Interaktionen zu unterbreiten.

Aptamer-ONs

Aptamere sind eine einzigartige Unterklasse von ONs, die im Gegensatz zu mRNA mit einem Protein interagieren sollen. Die Tertiärstruktur von ONs ist ausreichend komplex, um eine Vielzahl von Konformationen für die Interaktion mit den Proteinen bereitzustellen, und ein komplexer progressiver Selektionsprozess wird angewendet, um ein Molekül mit sehr hoher Affinität für das Zielprotein zu erhalten, so dass die Bindung des Aptamers ON an das Protein hemmt die Funktion des Proteins. Daher besitzt das ausgewählte Anti-Human-Aptamer eine einzigartige Struktur, die für das Zielprotein hochspezifisch ist. In dieser Hinsicht verhalten sich Aptamere insofern wie monoklonale Antikörper, als ihre speziesübergreifende Aktivität eingeschränkt sein kann, wenn die Konservierung der Proteinsequenz und -struktur über die Spezies hinweg schlecht ist. Daher zeigen die meisten Aptamere Aktivität bei Primatenarten, jedoch typischerweise nicht bei Nagetieren oder anderen Nicht-Primatenarten wie Kaninchen und Hunden.

Die führenden Entwickler in diesem Bereich haben sich oft auf pharmakologische Daten von menschlichen oder nicht-menschlichen Primatenmodellen verlassen und gelegentlich ein Nager-analoges Aptamer entwickelt, um dies zu ermöglichen in vivo pharmakologische Studien, wenn nicht-menschliche Primatenmodelle nicht verfügbar oder durchführbar sind. Da die Aptamerfindung jedoch eher ein sequenzieller Selektionsprozess als ein molekularer Designprozess ist, wird sich das Analogon in Länge, Zusammensetzung und Struktur immer wesentlich von dem Anti-Human-Aptamer unterscheiden, und die einzigen gemeinsamen Eigenschaften können die homologe Zielbindung und . sein Grundstruktur der Nukleinsäure. Das Analogon ist ein wertvolles Werkzeug zur Durchführung pharmakologischer Studien der Zielbiologie, kann jedoch den klinischen Kandidaten nicht vollständig nachahmen.

Viele der Aptamere, die sich derzeit in der klinischen und nichtklinischen Entwicklung befinden, sind Polyethylenglykol-Konjugate (PEGyliert), die üblicherweise eingeführt werden, um wünschenswerte pharmakokinetische Eigenschaften zu verleihen. Die PEGylierung kann die Aktivität eines Aptamers tiefgreifend beeinflussen, was vorschreibt, dass die letzten Stufen der Auswahl eines optimal aktiven menschlichen Aptamers mit PEGylierten Molekülen durchgeführt werden müssen. Da jedoch das Nagetier-Analogon, das für Zielbiologie-Untersuchungen verwendet wird, typischerweise nicht PEGyliert ist, können signifikante Unterschiede in den Eigenschaften des Analogons bestehen, die seine gültige Verwendung in Toxizitätsstudien ausschließen. Bei PEGylierten Aptameren ist die primäre beobachtete chemiebedingte Toxizität die Vakuolisierung verschiedener Zellen, was die Aufnahme des PEGylierten Moleküls widerspiegelt. Daher kann das Toxizitätsprofil eines nicht-PEGylierten Nager-Analoga-Aptamers nicht direkt mit dem PEGylierten Human-Aptamer verglichen werden.

Aus all diesen Gründen haben Aptamerhersteller die Verwendung analoger Aptamere in Toxizitätsstudien im Allgemeinen vermieden und sich hauptsächlich auf die Tests verlassen, die mit dem menschlichen Aptamer in Toxizitätsstudien an Primaten durchgeführt wurden (d. h. 1-Spezies-Bewertung von EP). Wie für die anderen Unterklassen erörtert, sollte der angemessene Umfang der EP-Bewertung für Aptamere von Fall zu Fall beurteilt werden.

Immunstimulatorische ONs

Immunstimulatorische (IS) ONs sind viel weniger speziesspezifisch als andere Unterklassen und können bei den meisten Spezies eine übertriebene Pharmakologie aufweisen. Die IS ONs interagieren mit Toll-like Rezeptoren (TLRs) auf immunkompetenten Zellen und lösen intrazelluläre Ereignisse aus, die in verschiedene Zytokin-vermittelte Antworten übersetzen. Häufige anatomische pathologische Befunde, die sich aus der beabsichtigten IS-Aktivität ergeben, umfassen Reaktionen an der Injektionsstelle, lymphoide Hyperplasie, zelluläre Infiltration in verschiedene Organe und verwandte Reaktionen. Diese Wirkungen dominieren ausnahmslos das Toxizitätsprofil von IS ONs und sind dosislimitierend. Somit ist EP aus Pharmakologie- und Toxizitätsstudien von IS ONs ziemlich offensichtlich, und die größte Herausforderung besteht darin, zu bestimmen, welche Tierart das am besten geeignete Modell für menschliche Reaktionen ist.

In dieser Hinsicht haben mehrere neuere Veröffentlichungen die Unterschiede zwischen Nagetier- und Primatenarten in Bezug auf die zelluläre Verteilung von TLRs, die nachgelagerten Zytokinreaktionen und andere Folgeerscheinungen sowie die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen für die TLR-Aktivierung dokumentiert. Die Erörterung der Einzelheiten dieser Artenunterschiede würde den Rahmen dieses zusammenfassenden Dokuments sprengen (dies wurde vom Immunmodulatorischen Unterausschuss der OSWG behandelt). Es gibt jedoch immer mehr Beweise dafür, dass die Schwere und Vielfalt der anatomischen Pathologie, die durch IS ONs bei Nagetieren hervorgerufen wird, möglicherweise nicht repräsentativ für menschliche Reaktionen sind. Nichtmenschliche Primaten scheinen ein besseres Modell für menschliche Reaktionen auf IS ONs zu sein. Es sind weitere Diskussionen erforderlich, um festzustellen, ob die Ratte im Zusammenhang mit der allgemeinen Toxizitätsbewertung und der Auswahl der Dosis beim Menschen einen zusätzlichen Wert bietet.

MikroRNA

Es entstehen mehrere neue Unterklassen von ONs, die einzigartige Eigenschaften aufweisen und neue Fragen für die Bewertung von EP aufwerfen. Eine der vielversprechendsten neuen Unterklassen ist die microRNA (miR). Es werden verschiedene Strategien zur Abgabe von Anti-miRs oder miR-Mimetika eingesetzt, aber solche Programme befinden sich derzeit in einem frühen Stadium. Der Mechanismus für die Modulation der Genregulation durch miRs teilt einige Merkmale mit dem RNAi-Weg, jedoch mit einigen wichtigen Unterschieden. MicroRNAs funktionieren, indem sie den RNA-induzierten Silencing-Komplex verwenden, um an kurze „Seed-Regionen“ in mRNAs zu binden, die typischerweise innerhalb der 3’-untranslatierten Region von mRNAs für mehrere miteinander verbundene Gene vorhanden sind. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen zur Blockierung der Genexpression, die auf ein Ziel abzielen (z. B. Antisense und RNAi), beeinflusst die Einführung eines miR-Mimetikums oder Anti-miR typischerweise eine Konstellation von weitgehend miteinander verbundenen Genprodukten. Die direkte Wirkung eines anti-miR ist die Derepression der Expression (Erhöhung), aber nachgelagerte Gene können sich in eine positive oder negative Richtung ändern (ziemlich häufig in beide Richtungen für verschiedene Genprodukte). Ziel von miR-basierten Therapien ist es, einen gewissen Grad an Gesamtmodulation einer biologischen Reaktion durch Nachahmen oder Hemmen eines krankheitsbezogenen miR zu erreichen. Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen miR-basierter Therapie und siRNAs und ASOs besteht darin, dass das Ausmaß der Modulation eines bestimmten Genprodukts bescheiden ist (in der Regel nicht mehr als eine 2-fache Änderung), im Gegensatz zu der dramatischeren Hemmung, die für andere ONs beabsichtigt ist, die Genexpression. MicroRNAs funktionieren durch Feinabstimmung der Expressionsniveaus. Obwohl die Erfahrungen bisher begrenzt sind, führt die artenübergreifende Erhaltung von miRs in Kombination mit ihrem Wirkmechanismus zu einer robusten artenübergreifenden Aktivität, so dass die meisten miRs die gewünschten Veränderungen der Biomarker in Arten aufweisen, die üblicherweise für die Sicherheitsbewertung von ONs verwendet werden ( dh Affen und Nagetiere). Daher werden tieraktive Analoga im Allgemeinen nicht benötigt, um EP für diese Klasse zu bewerten.

Das Ausmaß, in dem das Muster der miR-induzierten Modulation der Genproduktexpression bei allen Arten analog sein wird, ist ungewiss, obwohl theoretisch eine beträchtliche Gemeinsamkeit bestehen sollte. Aufgrund des breiteren Spektrums von mRNA-Targets für ein einzelnes miR kann es schwierig sein zu unterscheiden, ob eine spezifische Veränderung der Genexpression beabsichtigtes Targeting gegenüber Off-Targeting gegenüber einer kompensatorischen Reaktion der Zelle widerspiegelt. Mikroarrays und andere Mittel zur Charakterisierung von Veränderungen in der Genproduktexpression können verwendet werden, um Momentaufnahmen des Modulationsprofils zu erhalten, da eine solche Profilierung von zentraler Bedeutung für das Verständnis der pharmakologischen Reaktion des miR ist. Aus solchen Informationen könnten auch Erkenntnisse gewonnen werden, ob aufgrund des beobachteten Musters von Veränderungen in der Genexpression bestimmte Nebeneffekte zu erwarten sind. Es ist jedoch fraglich, ob diese Art von Informationen als Anstoß für spezielle, dedizierte Toxizitätsuntersuchungen abseits der üblichen behördlichen Sicherheitsstudien dienen sollen.

Zusammenfassend muss der derzeitige Ansatz zur Identifizierung potenzieller Sicherheitsprobleme im Zusammenhang mit der beabsichtigten pharmakologischen Wirkung von miRs berücksichtigt werden, insbesondere aufgrund der Neuheit solcher Moleküle und der Unsicherheit über die Reihe der betroffenen Gen-Targets und etwaige nachgelagerte Folgen solcher Wirkungen. Da die derzeit in der Entwicklung befindlichen miRs jedoch eine speziesübergreifende Aktivität gezeigt haben und da sie typischerweise nur einen mäßigen Grad an Modulation der Genproduktexpression bewirken, sollten keine erhöhten Bedenken hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit bestehen, bei diesen Molekülen auf eine übertriebene Pharmakologie zu stoßen, und Es besteht kein Grund zu der Annahme, dass konventionelle Toxizitätsstudien keine sicherheitsrelevanten Wirkungen in der Kategorie EP zeigen werden.


Danksagung

Diese Arbeit wurde vom Schwedischen Medizinischen Forschungsrat und der Schwedischen Krebsgesellschaft unterstützt. Wir danken Samir El Andaloussi, Anna Berglöf und Roger Strömberg, Karolinska Institutet Mark A. Behlke, Integrated DNA Technologies (IDT), Inc. Peter B. Dervan, California Institute of Technology Scott Henry, ISIS Pharmaceuticals Per Trolle Jørgensen, Erik B. Pedersen und Jesper Wengel, University of Southern Denmark und Rula Zain, Karolinska University Hospital, für wertvolle Kommentare. Wir entschuldigen uns bei allen, die auf vielfältige Weise zur Entwicklung von ON-Therapien beigetragen haben, dass wir aus Platzgründen nicht auf ihre Arbeit zitieren konnten.


Schau das Video: Aptagen Technology (Kann 2022).