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3.3B: Phasenkontrastmikroskopie - Biologie

3.3B: Phasenkontrastmikroskopie - Biologie


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Phasenkontrastmikroskopie visualisiert Unterschiede in den Brechungsindizes verschiedener Teile einer Probe relativ zu unverändertem Licht.

Lernziele

  • Beschreiben Sie die Mechanik, Vor- und Nachteile der Phasenkontrastmikroskopie

Wichtige Punkte

  • Ein Phasenkontrast-Mikroskop teilt einen Lichtstrahl in 2 Lichtarten, direkt und gebrochen (reflektiert) auf und führt sie zu einem Bild der Probe zusammen.
  • Wo die Lichter „gleichphasig“ sind, ist das Bild heller, wo die Lichter „außer Phase“ sind, ist das Bild dunkler, und durch die Verstärkung dieser Lichtunterschiede wird der Kontrast verbessert.
  • Die Phasenkontrastmikroskopie ermöglicht die detaillierte Beobachtung lebender Organismen, insbesondere der inneren Strukturen.

Schlüsselbegriffe

  • Brechungsindex: das Verhältnis der Lichtgeschwindigkeit in Luft oder Vakuum zu der in einem anderen Medium.

Phasenkontrastmikroskopie ist eine Methode zur Manipulation von Lichtwegen durch die Verwendung von strategisch platzierten Ringen, um transparente Objekte zu beleuchten. Der niederländische Physiker Fritz Zernike entwickelte die Technik in den 1930er Jahren; für seinen Einsatz erhielt er 1953 den Nobelpreis.

Bei der Phasenkontrastmikroskopie werden parallele Lichtstrahlen durch Objekte unterschiedlicher Dichte geleitet. Das Mikroskop enthält spezielle Kondensoren, die das Licht „phasenverschoben“ werfen, sodass es mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Objekt gelangt. Mit diesem Mikroskop sind innere Details und Organellen lebender, ungefärbter Organismen (z. B. Mitochondrien, Lysosomen und der Golgi-Körper) deutlich zu erkennen.

Ein Phasenring im Kondensor lässt einen Lichtzylinder durch ihn hindurch, während er noch in Phase ist. Unverändertes Licht trifft auf den Phasenring im Objektiv und wird ausgeschlossen. Licht, das durch Passieren durch einen anderen Brechungsindex leicht verändert wird, wird durchgelassen. Licht, das zelluläre Strukturen wie Chromosomen oder Mitochondrien durchdringt, wird verzögert, da sie einen höheren Brechungsindex als das umgebende Medium haben. Elemente mit niedrigerem Brechungsindex fördern die Welle. Ein Großteil des Hintergrundlichts wird entfernt und Licht, das konstruktiv oder destruktiv interferiert wurde, wird mit erhöhtem Kontrast durchgelassen.

Die Phasenkontrastmikroskopie ermöglicht die Visualisierung lebender Zellen in ihrem natürlichen Zustand mit hohem Kontrast und hoher Auflösung. Dieses Werkzeug funktioniert am besten mit einer dünnen Probe und ist nicht ideal für eine dicke Probe. Phasenkontrastbilder haben einen charakteristischen grauen Hintergrund mit hellen und dunklen Merkmalen, die über die Probe verteilt sind. Ein Nachteil der Phasenkontrastmikroskopie ist die Halo-Bildung, genannt Halo-Light-Ring.


Phasenkontrastmikroskop

Die Phasenkontrastmikroskop eine ganz neue Welt auf dem Gebiet der Mikroskopie eröffnet.

Bis zu dieser Entdeckung waren Wissenschaftler auf Hellfeldbeleuchtung beschränkt und hatten nicht die Möglichkeit, lebende Mikroorganismen zu sehen.

Die Phasenkontrastbeobachtung ist heute bei fast allen modernen Mikroskopen Standard.

Rechts ist ein Blick durch das Okular eines Standard-Phasenkontrastmikroskops zu sehen, der ein Hämozytometer mit Fibroblasten zeigt.

Geschichte und Hintergrundinformationen

Frits Zernike, ein niederländischer Physiker und Mathematiker, baute 1938 das erste Phasenkontrastmikroskop.

Es dauerte einige Zeit, bis die wissenschaftliche Gemeinschaft das Potenzial von Zernikes Entdeckung erkannte, er erhielt 1953 den Nobelpreis und die deutsche Firma Zeiss begann während des Zweiten Weltkriegs mit der Herstellung seines Phasenkontrastmikroskops.

Zernike experimentierte mit der Geschwindigkeit des auf eine Probe gerichteten Lichtwegs und entdeckte Interferenzmuster, die dazu führen, dass das Bild dunkler oder heller erscheint.

Er entwickelte ein System mit Ringen oder Ringen, die in der Linse und unter dem unteren Kondensor eines zusammengesetzten Mikroskops platziert wurden, um Interferenzen in Lichtmustern zu verursachen. Zernike manipulierte die Ringe und die Lichtquelle und reduzierte letztendlich die Lichtwellenlänge um eine halbe Phase. Jede Vergrößerungseinstellung, egal ob 10x oder 100x, benötigt einen analogen Ring im Lichtkondensor.

Die Qualität der Beobachtung, insbesondere der Kontrast und die Auflösung einer Probe oder eines Partikels (P), hängt von der Beziehung zwischen den umgebenden (S)-Wellen (auch als ungebeugt oder nullter Ordnung bekannt) und den gebeugten (D) sphärischen Wellenfronten ab . Die Hauptgleichung hinter dem Phasenkontrast ist P=S+D.

Dieser Prozess ermöglichte es ihm, nullte Ordnung (S) von gebeugtem Licht (D) zu trennen, wodurch die Definition und Sichtbarkeit von Bildern/Partikeln (P) verbessert wurde.

Im Wesentlichen haben Zernikes Ansatz und Anpassungen der Beleuchtung die Art und Weise verändert, wie wir Mikroskope verwenden und Proben betrachten.

Phasenobjekte

Phasenkontrast ist am nützlichsten bei der Beobachtung transparenter, farbloser und/oder ungefärbter Proben, die als „Phasenobjekte“ bezeichnet werden.

Da diese Objekte kein Licht absorbieren, waren sie vor Zernikes Entdeckung nicht detailliert zu sehen.

Das neue System nutzte sowohl direktes als auch gebeugtes Licht, um die Qualität und Definition transparenter Proben zu verbessern.

Am wichtigsten ist, dass viele Phasenobjekte lebende biologische Proben sind. Die möglichen Auswirkungen und Anwendungen des Phasenkontrasts in der Welt der Mikroskopie sollten nicht unterschätzt werden.

Heutzutage gibt es zwei Haupttypen von Phasenkontrasten, positiv und negativ. Da die beobachteten Partikel in der Regel dünn und transparent sind, liefern diese Polarkontraste auffallend unterschiedliche Bilder.

Positiver Phasenkontrast zeigt mittel- bis dunkelgraue Bilder auf einem helleren grauen Hintergrund. Diese Bilder haben oft einen hellen Lichthof am Rand der Probe.

Negativer Phasenkontrast ist das Gegenteil. Die Probe erscheint heller mit einem dunklen Hintergrund, sie haben auch einen dunklen Lichthof, der das Bild umreißt.

Anwendungen in der Mikroskopie

Die Anwendungsmöglichkeiten des Phasenkontrastmikroskops von Zernike in der Mikroskopie liegen in den Bereichen Molekular- und Zellbiologie, Mikrobiologie und medizinische Forschung.

Zu den Proben, die beobachtet und untersucht werden können, gehören lebende Mikroorganismen wie Protozoen, Erythrozyten, Bakterien, Schimmelpilze und Spermien, dünne Gewebeschnitte, lithographische Muster, Fasern, Glasfragmente und subzelluläre Partikel wie Kerne und Organellen.

Vorteile

Zu den Vorteilen des Phasenkontrastmikroskops gehören:

  • Die Fähigkeit, lebende Zellen zu beobachten und als solche die Fähigkeit, Zellen in einem natürlichen Zustand zu untersuchen
  • Die Beobachtung eines lebenden Organismus in seinem natürlichen Zustand und/oder seiner Umgebung kann weitaus mehr Informationen liefern als Proben, die getötet, fixiert oder gefärbt werden müssen, um sie unter einem Mikroskop zu betrachten
  • Kontrastreiche, hochauflösende Bilder
  • Ideal zum Studium und Interpretieren dünner Proben
  • Kombinationsmöglichkeit mit anderen Beobachtungsmitteln wie Fluoreszenz
  • Moderne Phasenkontrastmikroskope mit CCD- oder CMOS-Computergeräten können Foto- und/oder Videobilder aufnehmen

Darüber hinaus ermöglichen Fortschritte beim Phasenkontrastmikroskop, insbesondere bei solchen, die Technologie enthalten, einem Wissenschaftler, die winzigen inneren Strukturen eines Partikels zu verfeinern und sogar eine kleine Anzahl von Proteinmolekülen zu erkennen.

Nachteile

Nachteile und Einschränkungen des Phasenkontrasts:

  • Ringe oder Ringe begrenzen die Blende bis zu einem gewissen Grad, was die Auflösung verringert
  • Diese Beobachtungsmethode ist nicht ideal für dicke Organismen oder Partikel
  • Dicke Proben können verzerrt erscheinen
  • Bilder können grau oder grün erscheinen, wenn weißes bzw. grünes Licht verwendet wird, was zu einer schlechten Mikrofotografie führt
  • Shade-Off und Halo-Effekt, bezogen auf Phasenartefakte
  • Bei größeren Partikeln tritt Shade-Off auf, was zu einer stetigen Reduzierung des Kontrasts von der Mitte des Objekts zu seinen Rändern führt
  • Halo-Effekt, bei dem Bilder oft von hellen Bereichen umgeben sind, die Details entlang des Umfangs der Probe verdecken

Moderne Fortschritte und Techniken bieten Lösungen für einige dieser Grenzen, wie zum Beispiel den Halo-Effekt.

Der Apodized-Phasenkontrast verwendet Amplitudenfilter, die Filme mit neutraler Dichte enthalten, um den Halo-Effekt zu minimieren. Im Wesentlichen wird damit versucht, die durch Phasenkontrastringe erreichte Auflösung umzukehren, aber der Halo-Effekt kann nie vollständig eliminiert werden.

Die Vorteile, die der Phasenkontrast in die Mikroskopie gebracht hat, überschreiten bei weitem seine Grenzen. Dies lässt sich leicht an den unzähligen Fortschritten auf den Gebieten der Zell- und Mikrobiologie sowie der Medizin- und Veterinärwissenschaften ablesen.


3.3B: Phasenkontrastmikroskopie - Biologie

Die Phasenkontrastmikroskopie, erstmals 1934 vom niederländischen Physiker Frits Zernike beschrieben, ist eine kontrastverstärkende optische Technik, die verwendet werden kann, um kontrastreiche Bilder von transparenten Proben wie lebenden Zellen (normalerweise in Kultur), Mikroorganismen, dünnen Gewebeschnitten zu erzeugen , lithographische Muster, Fasern, Latexdispersionen, Glasfragmente und subzelluläre Partikel (einschließlich Kerne und andere Organellen).

Abbildung 1 - Konfiguration des Phasenkontrastmikroskops

Tatsächlich verwendet die Phasenkontrasttechnik einen optischen Mechanismus, um winzige Phasenvariationen in entsprechende Amplitudenänderungen zu übersetzen, die als Unterschiede im Bildkontrast sichtbar gemacht werden können. Einer der großen Vorteile der Phasenkontrastmikroskopie besteht darin, dass lebende Zellen in ihrem natürlichen Zustand untersucht werden können, ohne vorher abgetötet, fixiert und gefärbt zu werden. Dadurch kann die Dynamik laufender biologischer Prozesse beobachtet und kontrastreich mit scharfer Klarheit kleinster Probendetails aufgezeichnet werden.

Vorgestellt in Abbildung 1 ist ein Schnittdiagramm eines modernen aufrechten Phasenkontrastmikroskops, einschließlich einer schematischen Darstellung des Phasenkontrast-Optikzuges. Die teilweise kohärente Beleuchtung der Wolfram-Halogen-Lampe wird durch eine Kollektorlinse geleitet und auf einen speziellen Ring fokussiert (mit der Bezeichnung Kondensatorring) in der vorderen Brennebene des Untertischkondensators positioniert. Durch den Ringraum hindurchtretende Wellenfronten beleuchten die Probe und passieren entweder ungestört oder werden durch in der Probe vorhandene Strukturen und Phasengradienten gebeugt und phasenverzögert. Vom Objektiv gesammeltes ungestörtes und gebeugtes Licht wird in der hinteren Brennebene um a . getrennt Phasenplatte und auf die Zwischenbildebene fokussiert, um das in den Okularen beobachtete endgültige Phasenkontrastbild zu bilden.

Vor der Erfindung der Phasenkontrasttechniken war die Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung einer der am häufigsten verwendeten Beobachtungsmodi in der optischen Mikroskopie, insbesondere für fixierte, gefärbte Proben oder andere Arten von Proben mit hoher natürlicher Absorption von sichtbarem Licht. Zusammenfassend werden Proben, die mit Hellfeldbeleuchtung leicht abgebildet werden können, als . bezeichnet Amplitudenobjekte (oder Proben), da die Amplitude oder Intensität der beleuchtenden Wellenfronten verringert wird, wenn Licht durch die Probe geht.

Das Hinzufügen von optischem Phasenkontrast-Zubehör zu einem Standard-Hellfeld-Mikroskop kann als Technik verwendet werden, um in transparenten Präparaten einen kontrastverstärkenden Effekt zu erzielen, der an eine optische Färbung erinnert (siehe Figur 2). Lichtwellen, die von der Probe gebeugt und phasenverschoben werden (bezeichnet als a Phasenobjekt) lassen sich durch Phasenkontrast in Amplitudenunterschiede umwandeln, die in den Okularen beobachtbar sind. Auch große, ausgedehnte Proben lassen sich aufgrund von Beugungs- und Streuphänomenen, die an den Rändern dieser Objekte auftreten, mit Phasenkontrastoptiken gut sichtbar machen. Die Leistungsfähigkeit moderner Phasenkontrastmikroskope ist so ausgereift, dass sie in Kombination mit elektronischer Verstärkung und Bildverarbeitung nach der Aufnahme den Nachweis von Proben mit sehr kleinen inneren Strukturen oder sogar nur wenigen Proteinmolekülen ermöglicht.

Vorgestellt in Figur 2 ist ein Vergleich von lebenden Zellen in Kultur, die sowohl bei Hellfeld- als auch bei Phasenkontrastbeleuchtung abgebildet wurden. Die Zellen sind menschliches Glia-Gehirngewebe, das in Monolayer-Kultur gezüchtet wurde, die mit einem Nährmedium gebadet wurde, das Aminosäuren, Vitamine, Mineralsalze und fötales Kälberserum enthält. Bei Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 2(a)), erscheinen die Zellen halbtransparent, wobei nur stark brechende Bereiche wie die Membran, der Zellkern und nicht befestigte Zellen (abgerundet oder kugelförmig) sichtbar sind. Bei Betrachtung mit optischem Phasenkontrast-Zubehör zeigt das gleiche Sichtfeld deutlich mehr strukturelle Details (Abbildung 2(b)). Zelluläre Anhaftungen werden erkennbar, ebenso wie ein Großteil der inneren Struktur. Außerdem wird der Kontrastumfang drastisch verbessert.

Figur 2 - Lebende Zellen im Hellfeld und Phasenkontrast

Zernikes Entwicklung der optischen Phasenkontrasttheorie ist ein hervorragendes Beispiel dafür, wie Forschungsergebnisse aus einem hochspezialisierten Gebiet (in diesem Fall der theoretischen Physik) zu innovativen Neuentwicklungen in scheinbar unverwandten Disziplinen wie Biologie und Medizin führen können. Während des Zweiten Weltkriegs baute das Optische Werk Zeiss in Jena als erster Hersteller praxistaugliche Phasenkontrastoptiken in seine Mikroskope ein. Die unmittelbaren Auswirkungen auf die biologische Forschung waren erheblich, und die weit verbreitete Anwendung der Technik dauert bis heute an. Moderne Phasenkontrastobjektive, die von Nikon und anderen optischen Herstellern entwickelt und hergestellt werden, können in Kombination mit kontrastverstärkenden Hilfstechniken wie differentiellem Interferenzkontrast, Fluoreszenz und polarisiertem Licht betrieben werden. Diese Objektive sind mit internen Phasenplatten erhältlich, die unterschiedliche Absorptionsniveaus und Phasenverschiebungen der umgebenden (ungebeugten) Beleuchtung aufweisen, um ein breites Spektrum an Probenkontrast- und Hintergrundintensitätsoptionen für die Phasenkontrastmikroskopie zu erzeugen.

Wechselwirkung von Lichtwellen mit Phasenproben

Eine in einem Beleuchtungslichtstrahl vorhandene einfallende Wellenfront wird beim Durchgang durch eine Phasenprobe in zwei Komponenten geteilt. Die primäre Komponente ist eine nicht abgelenkte (oder ungebeugte) nullter Ordnung) planare Wellenfront, allgemein als bezeichnet umgeben (S) Welle, die durch und um die Probe geht, aber nicht mit ihr wechselwirkt. Außerdem ist ein abweichendes oder gebeugt sphärische Wellenfront (D-Welle) entsteht, die über einen weiten Bogen (in viele Richtungen) gestreut wird, der durch die volle Öffnung des Objektivs geht. Nach dem Verlassen der Probenebene treten umgebende und gebeugte Lichtwellen in die Objektivvorderlinse ein und werden anschließend auf die Zwischenbildebene fokussiert, wo sie sich durch Interferenz zu einem resultierenden Partikel Welle (oft als a . bezeichnet P-Welle). Der mathematische Zusammenhang zwischen den verschiedenen Lichtwellen, die in der Phasenkontrastmikroskopie erzeugt werden, lässt sich einfach wie folgt beschreiben:

Formel 1 - Beziehung zwischen verschiedenen Lichtwellen, die in der Phasenkontrastmikroskopie erzeugt werden

Die Detektion des Probenbildes hängt von den relativen Intensitätsunterschieden und damit von den Amplituden von Partikel und Umgebung ab (P und S) Wellen. Unterscheiden sich die Amplituden der Teilchen- und Umgebungswellen in der Zwischenbildebene deutlich, so erhält die Probe einen erheblichen Kontrast und ist in den Mikroskopokularen gut sichtbar. Andernfalls bleibt die Probe transparent und erscheint wie unter normalen Hellfeldbedingungen (ohne Phasenkontrast oder andere kontrastverstärkende Techniken).

In Bezug auf die Variationen des optischen Weges zwischen der Probe und ihrem umgebenden Medium ist der Anteil der einfallenden Lichtwellenfront, der die Probe durchquert (D-Welle), durchdringt aber nicht das umgebende Medium (S-Welle), ist leicht verzögert. Für Argumente in der Phasenkontrastmikroskopie ist die Rolle der Probe bei der Veränderung der optischen Weglänge (eigentlich der relativen Phasenverschiebung) der durchlaufenden Wellen von größter Bedeutung. In der klassischen Optik ist die optische Weglänge (OPL) durch ein Objekt oder einen Raum ist das Produkt des Brechungsindex (n) und die Dicke (T) des Objekts oder intervenierenden Mediums, wie durch die Beziehung beschrieben:

Formel 2 - Optische Pfadlänge

Optische Weglänge (OPL) = n × t

Wenn Licht von einem Medium in ein anderes übergeht, ändert sich die Geschwindigkeit proportional zu den Brechungsindexunterschieden zwischen den beiden Medien. Wenn also eine kohärente Lichtwelle, die vom fokussierten Mikroskopfaden emittiert wird, durch eine Phasenprobe mit einer bestimmten Dicke (T) und Brechungsindex (n) wird die Geschwindigkeit der Welle entweder erhöht oder verringert. Wenn der Brechungsindex der Probe größer ist als der des umgebenden Mediums, wird die Welle beim Durchgang durch die Probe in ihrer Geschwindigkeit verringert und anschließend beim Austritt aus der Probe in der relativen Phase verzögert. Im Gegensatz dazu, wenn der Brechungsindex des umgebenden Mediums den der Probe überschreitet, wird die Welle beim Austritt aus der Probe phasengleich fortbewegt. Der Ortsunterschied einer austretenden Wellenfront zwischen Probe und umgebendem Medium wird als bezeichnet Phasenverschiebung (δ) und ist im Bogenmaß definiert als:

Formel 3 - Phasenverschiebung

In der obigen Gleichung ist der Term D wird als bezeichnet optischer Gangunterschied, die der optischen Weglänge ähnlich ist:

Formel 4 - Optischer Wegunterschied

Optischer Wegunterschied (OPD) = = (n2 - n1) × t

wo n(2) ist der Brechungsindex der Probe und n(1) ist der Brechungsindex des umgebenden Mediums. Der optische Gangunterschied ergibt sich aus dem Produkt zweier Terme: der Dicke der Probe und ihrer Brechzahldifferenz zum umgebenden Medium. In vielen Fällen kann der optische Wegunterschied ziemlich groß sein, obwohl die Dicke der Probe klein ist. Wenn andererseits der Brechungsindex der Probe gleich dem des umgebenden Mediums ist, ist die optische Wegdifferenz null, unabhängig davon, ob die Dicke der Probe groß oder klein ist.

Interaktives Tutorial - Variationen der optischen Weglänge der Probe

Untersuchen Sie die Auswirkungen von Änderungen des Brechungsindex und der Dicke auf die optische Weglänge und entdecken Sie, wie zwei Proben unterschiedliche Kombinationen dieser Variablen aufweisen können, aber dennoch dieselbe Weglänge aufweisen.

Für einzelne Zellen in Gewebekultur ist der optische Wegunterschied relativ klein. Eine typische Zelle in Monolayer-Kultur hat eine Dicke von etwa 5 Mikrometer und einen Brechungsindex von etwa 1,36. Die Zelle ist von einem Nährmedium mit einem Brechungsindex von 1,335 umgeben, was einen optischen Gangunterschied von 0,125 Mikrometer oder etwa eine Viertelwellenlänge (von grünem Licht) ergibt. Subzelluläre Strukturen erzeugen viel kleinere Verzögerungen. Diese kleinen optischen Wegunterschiede erzeugen eine lineare Verringerung der Intensität mit zunehmender Phasenverschiebung (das Bild wird zunehmend dunkler) bis zu einem Punkt (je nach Konfiguration der Phasenplatte), wonach das Probenbild durch Kontrastumkehr heller wird. In der Phasenkontrastmikroskopie steht die Intensität eines Bildes für den gesamten Dicken- und Brechungsindexbereich nicht in einer einfachen linearen Beziehung zum von der Probe erzeugten optischen Gangunterschied.Stattdessen hängt die Intensität von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Absorption an der Phasenplatte, dem Grad der Phasenvoreilung oder -verzögerung an der Phasenplatte und dem relativen Vorzeichen dieser Phasenverschiebung.

Welleninteraktionen in der Phasenkontrastmikroskopie

Phasenbeziehungen zwischen Umgebung, Beugung und Partikel (S, D, und P) Wellen im Bereich der Probe in der Bildebene für die Hellfeldmikroskopie (ohne phasenkontrastoptisches Zubehör) sind in . dargestellt Figur 3. Die Umgebungs- und Partikelwellen, deren relative Amplituden den Kontrast der Probe bestimmen, werden als rote bzw. grüne Linien dargestellt. Die durch Beugung an der Probe erzeugte Welle, die nie direkt beobachtet wird, wird als blaue Welle geringerer Amplitude dargestellt. Die umgebenden und gebeugten Wellen rekombinieren durch Interferenz, um die resultierende Teilchenwelle in der Bildebene des Mikroskops zu erzeugen. Die Amplitude jeder Welle, dargestellt in Figur 3 repräsentiert die Summe der elektrischen Vektoren der einzelnen Komponentenwellen.

Figur 3 - Wellenphasenbeziehungen in der Hellfeldmikroskopie

Die gebeugte Welle hat im Verhältnis zur Umgebungswelle eine geringere Amplitude (da am Bildpunkt weniger gebeugte als Umgebungsphotonen vorhanden sind) und ist durch Wechselwirkung mit der Probe um etwa 90 Grad (eine Viertelwellenlänge) phasenverzögert. Die leichte Phasenverschiebung von 1/20 Wellenlänge, die die resultierende Teilchenwelle zeigt (die aus der Interferenz zwischen den gebeugten und umgebenden Wellen entsteht) wird typischerweise für winzige Details in einer Zelle beobachtet und hängt mit der optischen Weglängendifferenz zusammen. Da die Amplituden der Umgebungs- und Partikelwellen nahezu gleich sind, ist das transparente Präparat völlig kontrastarm und bei Überlagerung vor dem hellen Hintergrund fast unsichtbar.

Der Zusammenhang zwischen einzelnen Wellenfronten in der Hellfeld- und Phasenkontrastmikroskopie lässt sich vektoriell mit einem Polarkoordinatensystem beschreiben. In diesem System stellt die Vektorlänge die Amplitude einer bestimmten Welle dar, während der Drehwinkel des Vektors relativ zu einer festen Referenz (die Winkelphasenverschiebung) den Grad der Phasenverschiebung bezeichnet (siehe Abbildung 3(b)). Die Vektordarstellung von Wellenwechselwirkungen in der Phasenkontrastmikroskopie wurde von Frits Zernike eingeführt und später von Robert Barer im Detail entwickelt. Obwohl diese Beschreibungshilfe heute selten genutzt wird, stützen sich viele Texte und Forschungsberichte der letzten Jahre auf Diskussionen über Wellenbeziehungen, die durch Vektordiagramme veranschaulicht werden.

In Phasenkontrast-Vektordiagrammen werden Phasenverzögerungen als Drehungen im Uhrzeigersinn (bezogen auf einen willkürlichen Azimut) dargestellt, während Phasenverschiebungen als Drehungen gegen den Uhrzeigersinn dargestellt werden. In Abbildung 3(b), technisch gesehen ein Zeigerdiagramm, die Vektorsumme des Surround (S) und gebeugt (D) Wellenfronten ergibt das resultierende Teilchen (P) Wellenfront. Dieser Mechanismus zur Darstellung von Wellenbeziehungen ist praktisch, da er die Visualisierung von Phasenverschiebungen in der gebeugten Welle und deren Einfluss auf die Phase der resultierenden Teilchenwelle (und umgekehrt) unterstützt. Die Phasenverschiebung der gebeugten Welle relativ zur umgebenden Welle im Diagramm in Abbildung 3(b) wird als Φ dargestellt, wobei:

Formel 5 - Phasenverschiebung der gebeugten Welle relativ zur Surround-Welle

In der Gleichung ist φ die relative Phasenverschiebung (eine Funktion des optischen Wegunterschieds) zwischen der Umgebung (S) und Teilchen (P) Wellenvektoren. Für Proben, die eine vernachlässigbare optische Wegdifferenz (tatsächlich keine Phasenverschiebung) aufweisen, ist der letztere Term der Gleichung gleich Null und wird ± 90 Grad. Wie vorgestellt in Abbildung 3(b), eine gebeugte (D)-Welle mit sehr geringer Amplitude und kleiner (oder nicht vorhandener) Phasenverschiebung führt zu einer Teilchenwelle mit einer Amplitude, die nahezu gleich der der umgebenden Welle ist. Wenn Umgebungs- und Partikelwellen ähnliche Amplituden (oder Intensitäten) aufweisen, wird kein Kontrast erzeugt und die Probe bleibt auf einem hellen Hintergrund unsichtbar.

Das Phasenkontrastmikroskop

Das wichtigste Konzept, das dem Design eines Phasenkontrastmikroskops zugrunde liegt, ist die Trennung von umgebenden und gebeugten Wellenfronten, die aus der Probe austreten und auf verschiedene Stellen in der hinteren Brennebene des Objektivs (die Beugung Ebene an der hinteren Objektivöffnung). Außerdem muss die Amplitude des umgebenden (unverzerrten) Lichts reduziert und die Phase vor- oder nachgestellt werden (um eine Viertelwellenlänge), um die Intensitätsunterschiede zwischen der Probe und dem Hintergrund in der Bildebene zu maximieren. Der Mechanismus zur Erzeugung einer relativen Phasenverzögerung ist ein zweistufiger Prozess, wobei die gebeugten Wellen an der Probe um eine Viertelwellenlänge phasenverzögert werden, während die umgebenden Wellen durch eine Phasenplatte, die in oder sehr positioniert ist, phasenverschoben (oder verzögert) werden in der Nähe der hinteren Brennebene des Objektivs. Es sind nur zwei spezielle Zubehörteile erforderlich, um ein Hellfeldmikroskop für die Phasenkontrastbeobachtung umzurüsten. In der vorderen Brennebene des Kondensors befindet sich eine speziell konstruierte ringförmige Blende, die im Durchmesser angepasst und optisch zu einer internen Phasenplatte konjugiert ist, die sich in der hinteren Brennebene des Objektivs befindet.

Figur 4 - Optischer Zug des Phasenkontrastmikroskops

Die Kondensatorring (illustriert in Abbildung 1 und Abbildung 4) Ring. Der Mikroskopkondensor bildet die ringförmige Blende im Unendlichen ab, während das Objektiv ein Bild in der hinteren Brennebene erzeugt (wo eine konjugierte Phasenplatte positioniert ist, wie unten erörtert). Es sei darauf hingewiesen, dass viele Texte die aus dem Kondensor eines Phasenkontrastmikroskops austretende Beleuchtung als hohlen Lichtkegel mit dunklem Zentrum beschreiben. Dieses Konzept ist nützlich, um die Konfiguration zu beschreiben, ist jedoch nicht genau. Der Kondensorring ersetzt die einstellbare Irisblende in der vorderen Öffnung des Kondensors oder befindet sich in deren Nähe. Wenn Sie Phasenkontrastexperimente mit einem Kondensor mit sowohl einem Phasenring als auch einer Aperturblende durchführen, stellen Sie sicher, dass die Irisblende weiter geöffnet ist als der Umfang des Phasenrings. Im Gegensatz zum differentiellen Interferenzkontrast und dem Hoffman-Modulationskontrast ermöglicht die kreisförmige Geometrie der Phasenkontrastbeleuchtung und -detektion eine Probenbeobachtung ohne orientierungsabhängige Artefakte. Der Phasenkontrast ist außerdem unempfindlich gegenüber Polarisations- und Doppelbrechungseffekten, was ein großer Vorteil bei der Untersuchung lebender Zellen ist, die in Kulturgefäßen aus Kunststoffgewebe wachsen.

Bei der Köhlerschen Beleuchtung werden Umgebungslichtwellen, die nicht mit der Probe wechselwirken, als heller Ring in der hinteren Brennebene des Objektivs (der Beugungsebene) fokussiert. Unter diesen Bedingungen ist die hintere Brennebene des Objektivs zur vorderen Aperturebene des Kondensors konjugiert, so dass nicht gebeugte Lichtwellen (nullter Ordnung) ein helles Bild des Kondensorrings an der hinteren Apertur des Objektivs bilden (überlagert über das Bild der Phasenplatte). Die sphärische Wellenfront, die von der Probe gebeugt wird (die D Wellen) durchläuft die Beugungsebene an verschiedenen Stellen über die gesamte hintere Objektivöffnung. Die Verteilung (Menge und Ort) des gebeugten Lichts hängt von der Anzahl, Größe und Brechungsindexdifferenz der lichtstreuenden Objekte in der Probe ab. Bei den meisten Proben wird nur ein kleiner Teil der einfallenden Lichtwellen gebeugt, und ein Großteil des Lichts geht ungehindert hindurch, um schließlich die gesamte Bildebene zu beleuchten.

Im Gegensatz dazu nimmt die umgebende planare Wellenfront einen kleineren Anteil der hinteren Objektivöffnung ein, was der Konjugierten des Kondensorrings entspricht. Somit überlappen sich die beiden Wellenfronten nicht in signifikantem Ausmaß und nehmen unterschiedliche Abschnitte der hinteren Brennebene des Objektivs ein. Da das direkte Licht nullter Ordnung und das gebeugte Licht in der Beugungsebene räumlich getrennt sind, ist die Phase jeder Wellenkomponente (Umgebung, S oder gebeugt, D) kann selektiv manipuliert werden, ohne den anderen zu stören.

Interaktives Tutorial - Optische Pfade im Phasenkontrastmikroskop

Untersuchen Sie die Lichtwege durch ein Phasenkontrastmikroskop und erfahren Sie, wie diese Systeme die einfallende elektromagnetische Welle in eine umgebende (S), gebeugte (D) und resultierende Teilchenkomponente (P) zerlegen.

EIN Phasenplatte in oder in der Nähe der hinteren Brennebene des Objektivs montiert ist (siehe Abbildungen 4 und 5), um selektiv die Phase und Amplitude des umgebenden (oder ungestörten) Lichts zu ändern, das durch die Probe tritt. Bei einigen Phasenkontrastobjektiven enthält die dünne Phasenplatte einen in das Glas geätzten Ring mit reduzierter Dicke, um die Phase der Umgebung unterschiedlich vorzurücken (S) Welle um eine Viertelwellenlänge. Oft ist der Ring auch mit einem teilweise absorbierenden Metallfilm beschichtet, um die Umgebungslichtamplitude um 60-90 Prozent zu reduzieren. Da sich die hintere Brennebene normalerweise in der Nähe eines internen Linsenelements befindet, werden einige Phasenkontrastobjektive durch tatsächliches Ätzen in die Oberfläche einer Linse hergestellt. Unabhängig davon, wie das Objektiv hergestellt wird, ist der wichtigste Punkt, den Sie beachten sollten, dass jedes Phasenkontrastobjektiv so modifiziert wird, dass es die Phasenplatte enthält, ein Merkmal, das bei allen anderen Mikroskopobjektiven fehlt.

Da die resultierende Teilchenwelle ausschließlich durch Interferenz der umgebenden und gebeugten Wellenfronten erzeugt wird, erzeugt die Interferenz zwischen den in der Bildebene ankommenden Wellenfronten ein Teilchen (P) Welle mit einer Amplitude, die jetzt erheblich kleiner ist als die der Umgebung, wenn die neutrale Beschichtung aufgebracht wird. Der Nettoeffekt besteht darin, die von der Probe eingeführte relative Phasendifferenz in eine Differenz der Amplitude (Intensität) des aus der Bildebene austretenden Lichts umzuwandeln. Da das menschliche Auge Intensitätsunterschiede als Kontrast interpretiert, ist die Probe nun in den Mikroskopokularen sichtbar und kann auch mit einem herkömmlichen Kamerasystem oder digital mit einem CCD- oder CMOS-Gerät auf Film festgehalten werden. Alle positiv Phasenkontrastsysteme verschieben selektiv die Phase des linearen Surround (S) Wellenfront relativ zu der der sphärischen gebeugten (D) Wellenfront. Alternative, Negativ Phasenkontrast verzögert die umgebende Wellenfront in Bezug auf die von der Probe gebeugten Lichtwellen.

Im Allgemeinen erscheinen Proben mit einem höheren Brechungsindex als das umgebende Medium auf einem neutralen grauen Hintergrund dunkel, während diejenigen Proben, die einen niedrigeren Brechungsindex als das Bademedium haben, heller als der graue Hintergrund erscheinen. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da spezialisierte Phasenkontrastobjektive mit höheren neutralen Dichten gekoppelt mit niedrigeren Verzögerungswerten (ein-acht einer Wellenlänge oder weniger) in dickeren Proben eine Kontrastumkehrung erzeugen können. Das Nettoergebnis ist, dass Bereiche mit sehr hohen optischen Wegunterschieden beginnen, hell zu erscheinen.

Um die Phase und Amplitude der räumlich getrennten umgebenden und gebeugten Wellenfronten in optischen Phasenkontrastsystemen zu modifizieren, wurde eine Anzahl von Phasenplattenkonfigurationen eingeführt. Da die Phasenplatte in oder sehr nahe der hinteren Brennebene des Objektivs (der Beugungsebene) positioniert ist, muss alles Licht, das durch das Mikroskop geht, durch diese Komponente laufen. Der Teil der Phasenplatte, auf den der Kondensatorring fokussiert ist, wird als bezeichnet Bereich konjugieren, während die verbleibenden Regionen kollektiv als bezeichnet werden ergänzender Bereich. Der konjugierte Bereich enthält das Material, das für die Änderung der Phase des umgebenden (ungebeugten) Lichts um entweder plus oder minus 90 Grad in Bezug auf die der gebeugten Wellenfronten verantwortlich ist. Im Allgemeinen ist der konjugierte Bereich der Phasenplatte breiter (um etwa 25 Prozent) als der Bereich, der durch das Bild des Kondensorrings definiert wird, um die Menge an Umgebungslicht zu minimieren, die sich in den komplementären Bereich ausbreitet.

Abbildung 5 - Objektive Blenden und Phasenkontrastoptiken

Eine typische Serie von Phasenkontrastobjektiven mit zunehmender Vergrößerung und ihre entsprechenden Kondensorringe sind in dargestellt Abbildung 5. Als allgemeine Regel gilt, wenn die numerische Apertur und die Vergrößerung des Objektivs erhöht werden, nehmen sowohl die Breite als auch der Durchmesser der Phasenplatte ab. Im Gegensatz dazu nimmt die Kondensorringgröße mit der Objektivvergrößerung zu. Auch abgebildet in Abbildung 5 sind aufgeschnittene Diagramme, die die grundlegenden Konzepte hinter der Konstruktion von Platten mit positiver und negativer Phase zeigen. Die positive Phasenplatte erzeugt einen dunklen Kontrast und enthält einen teilweise absorbierenden Film, der die Amplitude der umgebenden Wellenfront reduzieren soll. Darüber hinaus enthält diese Platte phasenverzögerndes Material, das dazu bestimmt ist, die Phase des gebeugten Lichts um 90 Grad zu verschieben (zu verzögern). Die negative Phasenplatte enthält auch sowohl phasenverzögernde als auch teilweise absorbierende Materialien. In diesem Fall sind jedoch beide Materialien innerhalb der Phasenplatte sandwichartig angeordnet, so dass die ungebeugte umgebende Wellenfront die einzige betroffene Spezies ist (abgeschwächt und um 90 Grad phasenverzögert).

Die meisten der von modernen Mikroskopherstellern erhältlichen Phasenplatten werden durch Vakuumabscheidung dünner dielektrischer und metallischer Filme auf eine Glasplatte oder direkt auf eine der Linsenoberflächen innerhalb des Mikroskopobjektivs hergestellt. Die Rolle des dielektrischen Dünnfilms besteht darin, die Phase des Lichts zu verschieben, während der Metallfilm die ungebeugte Lichtintensität dämpft. Einige Hersteller verwenden mehrere Antireflexbeschichtungen in Kombination mit den dünnen Filmen, um die Menge an Blendung und Streulicht zu reduzieren, die in das optische System zurückreflektiert wird. Wenn die Phasenplatte nicht auf der Oberfläche einer Linse gebildet ist, wird sie normalerweise zwischen aufeinanderfolgenden Linsen verkittet, die sich in der Nähe der hinteren Brennebene des Objektivs befinden. Die Dicke und Brechungsindizes der dielektrischen, metallischen und antireflektierenden Filme sowie die des optischen Kitts werden sorgfältig ausgewählt, um die notwendige Phasenverschiebung zwischen den komplementären und konjugierten Bereichen der Phasenplatte zu erzeugen. In der optischen Terminologie werden Phasenplatten genannt, die die Phase des Umgebungslichts relativ zum gebeugten Licht um 90 Grad (entweder positiv oder negativ) ändern Viertelwellenlänge Platten wegen ihres Einflusses auf den optischen Gangunterschied.

Der Kontrast wird durch Variieren der Eigenschaften der Phasenplatte moduliert, einschließlich der Absorption des Metallfilms (oder der Antireflexbeschichtungen), des Brechungsindex des phasenverzögernden Materials und der Dicke der Phasenplatte. Mehrere Mikroskophersteller bieten eine Vielzahl von Phasenkontrastobjektiven mit progressiven Kontrastgraden an. Zum Beispiel umfasst die Nikon-Produktpalette fünf Arten von Phasenkontrastobjektiven. Die DL (Dunkel niedrig) Objektivserie erzeugt einen dunklen Bildumriss auf hellgrauem Hintergrund. Diese Objektive sind so konzipiert, dass sie in Proben mit einem signifikanten Unterschied im Brechungsindex gegenüber dem umgebenden Medium, wie beispielsweise Gewebekulturzellen, einen positiven Kontrast liefern. Ein Objektiv mit etwas geringerem Kontrast, das DLL (Dunkel Niedrig Niedrig), liefert bei Hellfeldbeleuchtung bessere Bilder als die DL-Objektive und wird als universelles Objektiv für kombinierte Beobachtungen in Fluoreszenz, Hellfeld, Dunkelfeld und differentiellem Interferenzkontrast verwendet.

Nikon produziert auch apodisiert Phasenkontrastobjektive mit einem sekundären Neutraldichtering zur Reduzierung von Halo-Artefakten auf beiden Seiten des zentralen Phasenrings. Proben mit sehr kleinen Phasenunterschieden sind ideale Kandidaten für die Bildgebung mit Nikons DM (Dunkel mittel) positive Phasenkontrastobjektive, die einen dunklen Bildumriss auf einem mittelgrauen Hintergrund erzeugen. Für negativen Phasenkontrast bietet Nikon die BM (Helles Mittel) Objektiv, das sich besonders für die visuelle Untersuchung von bakteriellen Flagellen, Protozoen, Fibrinfasern, winzigen Kügelchen und Blutzellen eignet. Helle Objektive mit mittlerem Phasenkontrast erzeugen helle Bilder auf einem mittelgrauen Hintergrund. Nikon bietet zusätzlich für bestimmte inverse Mikroskopmodelle ein externes Phasenkontrastmodul an, das es Benutzern ermöglicht, Phasenkontrastaufnahmen mit leistungsstarken Nicht-Phasenkontrastobjektiven durchzuführen. Dieses Modul ermöglicht das Einfügen eines Phasenrings in einer Ebene, die zur hinteren Apertur des Objektivs konjugiert ist.

In den meisten Fällen reicht das bloße Vorrücken der relativen Phase der umgebenden Wellenfront allein nicht aus, um kontrastreiche Bilder im Mikroskop zu erzeugen. Dies liegt daran, dass die Amplitude der umgebenden Wellen deutlich größer ist als die der gebeugten Wellen und die durch Interferenz erzeugten resultierenden Bilder nur von einem kleinen Teil der Gesamtzahl der Wellen unterdrückt werden. Um die Amplitude der umgebenden Wellenfront auf einen Wert näher an der der gebeugten Welle zu reduzieren (und die Interferenz in der Bildebene zu erzwingen), wird die Phasenplatte im Objektiv durch Aufbringen eines halbtransparenten Metalls (neutral Dichte) Beschichtung. Umgebungslichtwellen, die im Phasenkontrastmikroskop konstruktionsbedingt fast ausschließlich durch die Phasenplatte gehen, werden durch die undurchsichtige Phasenplatte in ihrer Amplitude drastisch auf einen Wert zwischen 10 und 30 Prozent der ursprünglichen Intensität verringert.

Die Phasenplattenkonfigurationen, Wellenbeziehungen und Vektordiagramme, die mit der Erzeugung von Bildern mit positivem und negativem Phasenkontrast verbunden sind, werden in dargestellt Abbildung 6. Darüber hinaus werden auch Beispiele von durch diese Techniken abgebildeten Proben veranschaulicht. Wie zuvor erörtert, wird die sphärische Wellenfront des aus der Probenebene austretenden gebeugten Lichts um eine Viertelwellenlänge relativ zur Phase der ebenen umgebenden (oder ungebeugten) Wellenfront verzögert. In der optischen Konfiguration mit positivem Phasenkontrast (obere Bildreihe in Abbildung 6), die Umgebung (S) wird die Wellenfront beim Durchqueren der Phasenplatte um eine Viertelwellenlänge phasenverschoben, um eine Nettophasenverschiebung von 180 Grad (eine halbe Wellenlänge) zu erzeugen. Die fortschrittliche Surround-Wellenfront kann nun an der destruktiven Interferenz mit dem gebeugten (D) Wellen in der Zwischenbildebene.

Abbildung 6 - Positiv- und Negativphasenkontrastsysteme

Eine Übersicht über den positiven Phasenkontrast finden Sie im oberen Teil von Abbildung 6. Positive Phasenkontrastplatten (linke Seite von Abbildung 6) rücken die umgebende Welle um eine Viertelwellenlänge vor aufgrund des geätzten Rings in der Glasplatte, der den physikalischen Weg verringert, den die Wellen durch die Platte mit hohem Brechungsindex nehmen. Da die gebeugten Probenstrahlen (DWellen) bei Wechselwirkung mit der Probe um eine viertel Wellenlänge verzögert werden, beträgt der optische Gangunterschied zwischen den umgebenden und gebeugten Wellen beim Austritt aus der Phasenplatte eine halbe Wellenlänge. Das Nettoergebnis ist ein optischer Wegunterschied von 180 Grad zwischen den umgebenden und gebeugten Wellen, was zu einer destruktiven Interferenz für eine Probe mit hohem Brechungsindex in der Bildebene führt. Die Amplitudenprofile der destruktiv interferierenden Wellen für positiven Phasenkontrast sind in der oberen Grafik von dargestellt Abbildung 6. Die Amplitude des resultierenden Teilchens (P) Welle ist niedriger als die Surround (S) Welle, wodurch das Objekt relativ dunkler erscheint als der Hintergrund, wie durch das Bild von . veranschaulicht Zygnema Grünalgen ganz rechts (beschriftet POS). Zwischen dem Graphen und dem Bild in Abbildung 6.

Es ist auch möglich, Mikroskopoptiken mit negativem Phasenkontrast herzustellen, wie im unteren Teil von dargestellt Abbildung 6. In diesem Fall ist die Umgebung (S) Welle ist um eine Viertelwellenlänge relativ zur gebeugten (D) Welle. Das Ergebnis ist, dass Proben mit hohem Brechungsindex vor einem dunkleren grauen Hintergrund hell erscheinen (siehe Bild mit der Bezeichnung NEG im unteren Teil von Abbildung 6). Bei negativem Phasenkontrast enthält die Objektivphasenplatte einen erhöhten Ring, der die Phase der Umgebungswelle nullter Ordnung um eine Viertelwellenlänge relativ zur Phase der gebeugten Welle verzögert (anstatt die Phase vorzurücken wie bei positivem Phasenkontrast). Da die gebeugte Welle beim Durchgang durch die Probe bereits um eine Viertelwellenlänge verzögert ist, wird der optische Gangunterschied zwischen der umgebenden und gebeugten Welle eliminiert und es tritt konstruktive Interferenz für eine Probe mit hohem Brechungsindex in der Bildebene auf. Beachten Sie, dass das resultierende Partikel (P) Welle hat eine höhere Amplitude als die Umgebung (S) Welle im negativen Phasenkontrast (siehe untere Grafik in Abbildung 6). Ebenfalls dargestellt ist das Vektordiagramm für negativen Phasenkontrast, bei dem der Surround-Wellenvektor eine 90-Grad-Drehung im Uhrzeigersinn erfährt.

Interaktives Tutorial - Positiver und negativer Phasenkontrast

Dieses interaktive Tutorial untersucht die Beziehungen zwischen der Umgebung (S), gebeugten (D) und resultierenden Partikelwellen (P) im Hellfeld sowie in der Mikroskopie mit positivem und negativem Phasenkontrast.

Es ist wichtig anzumerken, dass das an der hinteren Brennebene des Objektivs gebildete Beugungsmuster die Fourier-Transformation aller räumlichen Frequenzen ist, die von der Probe im Phasenkontrast und allen anderen Formen der optischen Mikroskopie abweichen und gestreut werden. Folglich stellen das in der Zwischenbildebene erzeugte Bild und das durch die Okulare beobachtete (oder von einem Detektor aufgezeichnete) endgültige Bild inverse Fourier-Transformationen der Beugungsmuster dar, die in der hinteren Brennebene des Objektivs und dem Augenpunkt (schwebend über der Okularvorderlinse) gebildet werden ), bzw. Die Phasenkontrastmikroskopie nutzt diese optisch konjugierten Eigenschaften, um den Bildkontrast zu verbessern, indem die Mikroskop-Aperturfunktion modifiziert wird, um ein räumliche Filterung von bestimmten Bildinformationen. Die Einführung einer Phasenplatte (Filter) in der hinteren Beugungsebene des Objektivs ermöglicht die Umwandlung von Phasenvariationen der Probe in Intensitätsvariationen, die im endgültigen Bild beobachtet werden können.

Interpretation von Phasenkontrastbildern

Durch Phasenkontrastmikroskopie erzeugte Bilder sind relativ einfach zu interpretieren, wenn die Probe dünn und gleichmäßig auf dem Substrat verteilt ist (wie es bei lebenden Zellen der Fall ist, die in Monolayer-Gewebekultur gezüchtet werden). Wenn dünne Proben mit einer Optik mit positivem Phasenkontrast untersucht werden, die von den meisten Herstellern traditionell hergestellt wird, erscheinen sie dunkler als das umgebende Medium, wenn der Brechungsindex der Probe den des Mediums überschreitet. Phasenkontrastoptiken verstärken den Kontrast in der Nähe der Kanten, die ausgedehnte Proben umgeben, wie der Grenze zwischen einer Zellmembran und dem badenden Nährmedium, unterschiedlich und erzeugen insgesamt kontrastreiche Bilder, die grob als Dichtekarten interpretiert werden können. Da die Amplitude und Intensität eines Probenbildes im Phasenkontrast mit dem Brechungsindex und der optischen Weglänge zusammenhängt, kann die Bilddichte als Maß für die Annäherung der Beziehungen zwischen verschiedenen Strukturen verwendet werden. Tatsächlich wird eine Reihe von inneren zellulären Organellen mit zunehmender Dichte, wie Vakuolen, Zytoplasma, der Interphase-Nukleus und der Nukleolus (oder mitotische Chromosomen) typischerweise als zunehmend dunklere Objekte relativ zu einer festen Referenz, wie etwa dem Hintergrund, visualisiert. Es sollte auch beachtet werden, dass in allen Phasenkontrastbildern zahlreiche optische Artefakte vorhanden sind und große, ausgedehnte Proben oft erhebliche Schwankungen in Kontrast und Bildintensität aufweisen. Symmetrie kann auch ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung sein, wie sowohl große als auch kleine Proben im Phasenkontrastmikroskop erscheinen.

Eine sinnvolle Interpretation von Phasenkontrastbildern erfordert eine sorgfältige Prüfung und Prüfung, um sicherzustellen, dass Artefakte nicht fälschlicherweise wichtigen Strukturmerkmalen zugeordnet werden. Zum Beispiel haben einige innere Zellorganellen und Komponenten oft einen niedrigeren Brechungsindex als das umgebende Zytoplasma, während andere einen höheren Brechungsindex haben. Aufgrund der unterschiedlichen Brechungsindizes dieser zahlreichen intrazellulären Strukturen kann das Innere lebender Zellen bei Betrachtung in einem Mikroskop mit positivem Phasenkontrast eine Reihe von Intensitäten aufweisen, die von sehr hell bis extrem dunkel reichen. Zum Beispiel haben pinocytotische Vesikel, Lipidtröpfchen und Luftvakuolen, die in Pflanzen und einzelligen Protozoen vorhanden sind, einen niedrigeren Brechungsindex als das Zytoplasma und erscheinen daher heller als andere Komponenten. Im Gegensatz dazu erscheinen, wie oben diskutiert, Organellen mit hohen Brechungsindizes (Kerne, Ribosomen, Mitochondrien und der Nukleolus) im Mikroskop dunkel. Wenn die durch die Probe eingeführte Phasenverzögerung groß genug ist (eine Phasenverschiebung der gebeugten Welle um ungefähr eine halbe Wellenlänge), wird die Interferenz zwischen den gebeugten Wellen und den umgebenden Wellen konstruktiv, wodurch diese Proben heller werden als der umgebende Hintergrund.

Um Verwechslungen bezüglich Hell-Dunkel-Kontrast in Phasenkontrastbildern zu vermeiden, sollten die innerhalb der Probenpräparation auftretenden optischen Gangunterschiede sorgfältig berücksichtigt werden. Wie oben erörtert, wird die optische Wegdifferenz aus dem Produkt des Brechungsindex und der Dicke der Probe (Objekt) abgeleitet und steht in Beziehung zur relativen Phasenverschiebung zwischen der Probe und den Hintergrundwellen (gebeugt und umgeben). Es ist unmöglich, in einem Phasenkontrastbild zwischen Komponenten mit hohem und niedrigem Brechungsindex zu unterscheiden, ohne Informationen bezüglich der relativen Dicke der Komponenten. Beispielsweise kann eine kleine Probe mit einem hohen Brechungsindex einen identischen optischen Wegunterschied aufweisen wie eine größere Probe mit einem niedrigeren Brechungsindex. Die beiden Proben haben bei Betrachtung durch ein optisches Phasenkontrastsystem ungefähr die gleiche Intensität. In vielen biologischen Experimenten können Bedingungen, die ein Schrumpfen oder Anschwellen von Zellen oder Organellen bewirken, zu erheblichen Kontrastschwankungen führen. Das externe Medium kann auch durch ein anderes ersetzt werden, das entweder einen höheren oder einen niedrigeren Brechungsindex hat, um Änderungen im Probenbildkontrast zu erzeugen. Tatsächlich bildet die Auswirkung von Brechungsindexänderungen im umgebenden Medium auf den Bildkontrast die Grundlage der Technik, die als bekannt ist Immersionsrefraktometrie.

Abbildung 7 - Proben im positiven und negativen Phasenkontrast

Vorgestellt in Abbildung 7 sind mehrere halbtransparente Proben, die mit optischen Systemen mit positivem und negativem Phasenkontrast abgebildet wurden. Die Abbildungen 7(a) und 7(b) veranschaulichen eine ctenoide Fischschuppe im positiven Phasenkontrast (Abbildung 7(a)) und negativer Phasenkontrast (Abbildung 7(b)) bei relativ hoher Vergrößerung (200x). Diese Skalen finden sich häufig in den meisten knochig Fische (bezeichnet als die Teleostei). Der vordere (oder vordere) Teil jeder Schuppen ist normalerweise hinter dem hinteren Teil der vorhergehenden Schuppen versteckt. Wenn der Fisch wächst, wachsen auch die Schuppen, was zu einem Muster von konzentrischen Wachstumsringen führt, deren Zahl mit der Schuppengröße zunehmen und denen im Querschnitt von Baumstämmen ähnlich erscheinen. In einigen Fällen werden Ctenoid-Schuppenwachstumsmuster verwendet, um das Alter eines Fisches abzuschätzen. Die Wachstumsringe erscheinen dunkel umgeben von hellgrauen Halo-Regionen im positiven Phasenkontrast (Abbildung 7(a)), aber viel heller dargestellt und von dunklen Mulden mit negativem Phasenkontrast umgeben (Abbildung 7(b)).

Eine Kultur lebender Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters erscheint im Hellfeldbeleuchtungsmodus transparent, wenn sie in Wachstumsmedium gebadet wird, und die Zellen haben einen Brechungsindex, der dem Nährsalzpuffer sehr nahe kommt. Im positiven Phasenkontrast (Abbildung 7(c)) können interne zelluläre Details, einschließlich des Zellkerns und der Organellen, leicht visualisiert werden. Bei einer Untersuchung unter negativer Phasenkontrastbeleuchtung werden die Zellumrisse jedoch schwer zu unterscheiden und interne Details werden mit Ausnahme der Organellen mit hohem Brechungsindex, die sehr hell werden, weitgehend verdeckt (Abbildung 7(d)). Schließlich erscheinen menschliche Erythrozyten als dunkelgraue, abgeflachte Ellipsoide mit einer Donut-Kontur und hellen Zentren im positiven Phasenkontrast (Abbildung 7(e)), aber dieselben Zellen sind hell mit dunklen Zentren (Abbildung 7(f)) und heben sich im negativen Phasenkontrast scharf vom Hintergrund ab.

Zwei sehr häufige Effekte in Phasenkontrastbildern sind die Charakteristik Heiligenschein und Schatten-off Kontrastmuster, bei denen die beobachtete Intensität nicht direkt dem optischen Wegunterschied (Brechungsindex- und Dickenwerte) zwischen der Probe und dem umgebenden Medium entspricht. Obwohl diese Muster als natürliches Ergebnis des optischen Phasenkontrastsystems auftreten, werden sie oft als Phasenartefakte oder Bildverzerrungen bezeichnet. In allen Formen von positivem Phasenkontrast, hell Phasenhalos umgeben normalerweise die Grenzen zwischen großen Probenmerkmalen und dem Medium. Identische Halos erscheinen bei optischen Systemen mit negativem Phasenkontrast dunkler als die Probe. Diese Effekte werden durch optische Gangunterschiedsschwankungen weiter verstärkt, die helle Halos bei positivem Phasenkontrast dunkel und dunkle Halos bei negativem Phasenkontrast hell machen können.

Halos treten in der Phasenkontrastmikroskopie auf, weil der kreisförmige phasenverzögernde (und neutrale Dichte) Ring, der sich in der Phasenplatte des Objektivs befindet, auch einen geringen Grad an gebeugtem Licht von der Probe durchlässt (er ist nicht auf das Passieren von Umgebungswellen allein beschränkt). Das Problem wird durch die Tatsache verschlimmert, dass die Breite der umgebenden Wellenfront nullter Ordnung, die durch den Kondensatorring auf die Phasenplatte projiziert wird, kleiner ist als die tatsächliche Breite des Phasenplattenrings. Der Breitenunterschied zwischen dem Phasenplattenring und der umgebenden Wellenfront beträgt normalerweise etwa 25 bis 40 Prozent, ist jedoch aufgrund von Einschränkungen und Anforderungen des optischen Designs erforderlich. Aufgrund der räumlichen Lage des kreisförmigen phasenändernden Rings in der Beugungsebene des Objektivs passieren nur diejenigen Wellenfronten, die den von der Probe gebeugten niedrigen Ortsfrequenzen entsprechen, den Ring der Phasenplatte. Somit bleiben die gebeugten Probenwellen, die die Phasenplatte passieren, um 90 Grad (eine Viertelwellenlänge) phasenverschoben relativ zum Licht nullter Ordnung (unverzerrt oder umgebend). Das resultierende Phasenkontrast-Halo-Artefakt ist auf die Abschwächung der Information niedriger Ortsfrequenz zurückzuführen, die von der Probe durch einen sehr flachen Winkel in Bezug auf die umgebenden Wellenfronten nullter Ordnung gebeugt wird. Tatsächlich erzeugt das Fehlen einer destruktiven Interferenz zwischen niederfrequenten Wellenfronten, die von der Probe gebeugt werden, und ungestörten Lichtwellen eine lokalisierte Kontrastumkehr (manifestiert durch den Halo), die die Probe umgibt. Um eine scharfe Kante im Bild zu erzeugen, müssen alle von der Probe gebeugten Ortsfrequenzen im endgültigen Bild dargestellt werden.

Interaktives Tutorial - Shade-Off- und Halo-Phasenkontrastartefakte

Untersuchen Sie Abschattungs- und Halo-Artefakte, bei denen die beobachtete Intensität nicht direkt dem optischen Wegunterschied (Brechungsindex- und Dickenwerte) zwischen der Probe und dem umgebenden Medium entspricht.

Phasenkontrast-Halos sind um große Objekte mit niedriger räumlicher Frequenz wie Kerne, Diatomeen und ganze Zellen besonders auffällig und auffällig. Ein weiterer Faktor, der zum Halo-Artefakt beiträgt, ist die Umverteilung der Lichtenergie in der Bildebene von Bereichen, in denen sie destruktiv ist, zu Bereichen, in denen sie konstruktiv ist. Große Lichthöfe mit hohem Kontrast können verwirrende Bilder für Proben erzeugen, die große optische Wegunterschiede erzeugen, wie Erythrozyten, Schimmelpilze, Protozoen, Hefezellen und Bakterien. Auf der anderen Seite können Halo-Effekte häufig Kontrastunterschiede zwischen der Probe und dem umgebenden Hintergrund hervorheben und die Sichtbarkeit von dünnen Kanten und Randdetails in vielen Proben erhöhen. Dieser Effekt ist besonders hilfreich bei negativem Phasenkontrast, der einen dunklen Lichthof erzeugt, der niederfrequente Bilddetails umgibt. In vielen Fällen ist es möglich, den Grad der Phasenverschiebung und Beugung zu reduzieren, was zu einer verringerten Halogröße um die Probe herum führt. Das einfachste Mittel zum Entfernen oder Abschwächen der Intensität von Halos besteht darin, den Brechungsindex des Beobachtungsmediums mit Komponenten mit höherem Brechungsindex wie Glycerin, Mannit, Dextran oder Serumalbumin zu modifizieren. In einigen Fällen kann eine Änderung des Brechungsindex des Mediums sogar eine Umkehr des Bildkontrasts bewirken, wodurch dunkle Objektmerkmale hell werden, ohne die Hintergrundintensität signifikant zu stören.

Der Halo-Effekt kann auch erheblich reduziert werden, indem speziell konstruierte Phasenobjektive verwendet werden, die einen kleinen Ring aus neutraldichtem Material enthalten, der das zentrale Phasenringmaterial nahe der hinteren Objektivöffnung umgibt. Diese Ziele werden als apodisierter Phasenkontrast Objektive und ermöglichen das Betrachten und Fotografieren von Strukturen von Phasenobjekten mit großen Phasenunterschieden mit hervorragender Klarheit und Detailschärfe. In den meisten Fällen können subzelluläre Merkmale (wie Nukleolen) mit apodisierten Objektiven klar als dunkle Kontraste unterschieden werden, aber dieselben Merkmale haben helle Lichthöfe oder werden mit herkömmlichen Phasenkontrastoptiken als helle Flecken abgebildet. Bei der apodisierten Optik wird der Kontrast aufgrund der großen Amplitude des gebeugten Lichts relativ zu der des direkten Lichts umgekehrt, das durch die Probe tritt.

In der Praxis kann eine Halo-Reduktion und eine Erhöhung des Probenkontrasts bei apodisierten optischen Systemen durch den Einsatz von selektiven Amplitudenfiltern erreicht werden, die sich neben dem Phasenfilm in den in das Objektiv in der hinteren Brennebene eingebauten Phasenplatten befinden. Diese Amplitudenfilter bestehen aus Dünnfilmen neutraler Dichte, die auf die den Phasenfilm umgebende Phasenplatte aufgebracht werden. Die Durchlässigkeit des Phasenschieberrings in der klassischen Phasenplatte beträgt ungefähr 25 Prozent, während das Paar benachbarter Ringe, die den Phasenschieberring in der apodisierten Platte umgeben, eine neutrale Dichte mit 50 Prozent Durchlässigkeit hat. Die Breite des Phasenfilms in beiden Platten ist gleich. Diese Werte stimmen mit den Durchlässigkeitswerten von phasenschiebenden Dünnfilmen überein, die auf Standardplatten in Phasenkontrastmikroskopen aufgebracht werden.

Abbildung 8 - Shade-Off im positiven und negativen Phasenkontrast

Shade-Off ist ein weiteres sehr häufiges optisches Artefakt in der Phasenkontrastmikroskopie und wird oft am leichtesten in großen Proben mit ausgedehnter Phase beobachtet. Normalerweise würde man erwarten, dass das Bild einer Probe mit großer Phase mit einer konstanten optischen Weglänge über den Durchmesser im Mikroskop gleichmäßig dunkel oder hell erscheinen würde. Leider steht die Intensität von Bildern, die von einem Phasenkontrastmikroskop erzeugt werden, nicht immer in einer einfachen linearen Beziehung zu dem von der Probe erzeugten optischen Wegunterschied. Andere Faktoren, wie die Absorption an der Phasenplatte und das Ausmaß der Phasenverzögerung oder -voreilung sowie die relative Überlappungsgröße von Phasenplatte und Kondensatorring spielen ebenfalls eine kritische Rolle. Das Intensitätsprofil einer großen, gleichmäßig dicken Probe mit positivem Phasenkontrast nimmt häufig von den Rändern zur Mitte hin allmählich zu, wobei sich die Lichtintensität im mittleren Bereich der des umgebenden Mediums annähern kann (das Gegenteil gilt für Proben mit negativer Phase). Dieser Effekt wird als Shade-Off bezeichnet und wird häufig bei der Untersuchung ausgedehnter planarer Proben beobachtet, wie z. B. Materialplatten (Glas oder Glimmer), Repliken, abgeflachte Gewebekulturzellen und große Organellen.

Die Auswirkungen von Halo- und Shade-Off-Artefakten sowohl im positiven als auch im negativen Phasenkontrast sind in . dargestellt Abbildung 8 für eine hypothetische Probe mit verlängerter Phase mit rechteckiger Geometrie und einem höheren Brechungsindex als das umgebende Medium (Abbildung 8(a)). Das über einen zentralen Bereich der Probe aufgenommene Intensitätsprofil ist in dargestellt Abbildung 8(b). Im positiven Phasenkontrast (Abbildung 8(c)), weist das Probenbild einen auffallend hellen Lichthof auf und zeigt einen dramatischen Abschattungseffekt, der sich in einer fortschreitend ansteigenden Intensität beim Durchlaufen von den Rändern zum zentralen Bereich der Probe manifestiert (siehe Intensitätsprofil in Abbildung 8(d)). Die Halo- und Shade-Off-Effekte haben umgekehrte Intensitäten im negativen Phasenkontrast (Abbildung 8(e) und 8(f)). Ein dunkler Lichthof umgibt das Probenbild bei Betrachtung mit einer Optik mit negativem Phasenkontrast (Abbildung 8(e)) und der Abschattungsübergang reicht von hell an den Rändern bis hin zu dunkleren Graustufen in der Mitte. Außerdem wird das Intensitätsprofil (Abbildung 8(f)) ist umgekehrt zu der mit positivem Phasenkontrast beobachteten.

Das Abschattungsphänomen wird auch allgemein als bezeichnet Wirkungszone, da zentrale Zonen mit einheitlicher Dicke in der Probe Licht anders beugen als die hochbrechenden Zonen an Kanten und Grenzen. In den zentralen Bereichen einer Probe werden sowohl die relativen Winkel als auch die Menge des gebeugten Lichts im Vergleich zu den Kanten drastisch reduziert. Da gebeugte Wellenfronten, die von den zentralen Probenbereichen ausgehen, nur eine geringe räumliche Abweichung von den nicht abgelenkten Umgebungswellenfronten nullter Ordnung aufweisen (aber noch um eine Viertelwellenlänge phasenverzögert sind), werden sie von der Phasenplatte in der Objektivrückseite erfasst Brennebene, zusammen mit dem Umgebungslicht. Dadurch bleibt die Intensität des mittleren Probenbereichs im Wesentlichen identisch mit der des Hintergrunds.Das Auftreten von Abschattungseffekten in relativ flachen ebenen Probenbereichen zusammen mit dem übermäßig hohen Kontrast, der durch Kanten und Grenzen erzeugt wird, liefert einen starken Beweis dafür, dass der Phasenkontrastmechanismus hauptsächlich durch die kombinierten Phänomene von Beugung und Streuung gesteuert wird.

Halo- und Abschattungsartefakte hängen sowohl von den geometrischen als auch den optischen Eigenschaften der Phasenplatte und der untersuchten Probe ab. Insbesondere die Breite und das Transmissionsvermögen des Phasenplattenmaterials spielen eine kritische Rolle bei der Kontrolle dieser Effekte (die Phasenplattenbreite beträgt typischerweise etwa ein Zehntel der gesamten Aperturfläche des Objektivs). Breitere Phasenplatten mit verringerter Durchlässigkeit neigen dazu, Halos und Schatten mit höherer Intensität zu erzeugen, während der Ringdurchmesser einen geringeren Einfluss auf diese Effekte hat. Für ein bestimmtes Phasenobjektiv (entweder positiv oder negativ) haben der optische Wegunterschied und die Probengröße, -form und -struktur einen signifikanten Einfluss auf die Schwere von Halo- und Schatteneffekten. Außerdem werden diese Effekte stark von der Objektivvergrößerung beeinflusst, wobei niedrigere Vergrößerungen bessere Bilder liefern.

Schlussfolgerungen

Der Phasenkontrast ist eine hervorragende Methode zur Kontrastverstärkung dünner, transparenter Proben ohne Auflösungsverlust und hat sich als wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung dynamischer Ereignisse in lebenden Zellen erwiesen. Vor der Einführung optischer Phasenkontrastsysteme wurden Zellen und andere halbtransparente Proben in der Hellfeldmikroskopie durch künstliche Färbetechniken sichtbar gemacht. Obwohl diese Proben mit Dunkelfeld- und Schrägbeleuchtung oder durch Defokussierung eines Hellfeldmikroskops beobachtet und aufgezeichnet werden können, hat sich diese Methodik als unzuverlässig erwiesen, um wichtige Informationen über die Zellstruktur und -funktion zu liefern.

Die Technik des Phasenkontrasts wird in der biologischen und medizinischen Forschung weit verbreitet angewendet, insbesondere in den Bereichen Zytologie und Histologie. Als solche wird die Methodik verwendet, um lebende Zellen, Gewebe und Mikroorganismen zu untersuchen, die unter Hellfeldbeleuchtung transparent sind. Der Phasenkontrast ermöglicht die einfache Visualisierung interner zellulärer Komponenten wie Membran, Kerne, Mitochondrien, Spindeln, mitotischer Apparat, Chromosomen, Golgi-Apparat und zytoplasmatischer Granula sowohl von pflanzlichen als auch tierischen Zellen und Geweben. Darüber hinaus wird die Phasenkontrastmikroskopie häufig bei der Diagnose von Tumorzellen und dem Wachstum, der Dynamik und dem Verhalten einer Vielzahl lebender Zellen in Kultur eingesetzt. Für inverse Mikroskope, die für Gewebekulturuntersuchungen eingesetzt werden, wurden spezielle optische Phasenkontrastsysteme mit großem Arbeitsabstand entwickelt. Andere Bereiche im biologischen Bereich, die von der Phasenkontrastbeobachtung profitieren, sind Hämatologie, Virologie, Bakteriologie, Parasitologie, Paläontologie und Meeresbiologie.

Industrielle und chemische Anwendungen für den Phasenkontrast umfassen Mineralogie, Kristallographie und Polymermorphologieuntersuchungen. Farblose Mikrokristalle, Pulver, partikuläre Feststoffe und kristalline Polymere mit einem Brechungsindex, der sich nur geringfügig von dem der umgebenden Immersionsflüssigkeit unterscheidet, werden häufig unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie leicht beobachtet. Tatsächlich wird quantitative Refraktometrie oft verwendet, um Brechungsindexwerte zu erhalten und zu Identifizierungszwecken. Andere kommerzielle Produkte, die durch optische Phasenkontrasttechniken untersucht werden, umfassen Tone, Fette, Öle, Seifen, Farben, Pigmente, Nahrungsmittel, Medikamente, Textilien und andere Fasern.

Die Phasenkontrastmikroskopie mit einfallendem Licht ist, obwohl sie weitgehend durch differentielle Interferenzkontrasttechniken ersetzt wird, nützlich für die Untersuchung von Oberflächen, einschließlich integrierter Schaltungen, Kristallversetzungen, Defekte und Lithographie. Ein gutes Beispiel sind die Stapelfehler in Silizium-Epitaxiewafern, die für die Halbleiterindustrie von enormer Bedeutung sind. Bei Auflicht-Phasenkontrastsystemen wird ein Bild des Beleuchtungsrings in die hintere Brennebene des Objektivs projiziert, wo sich normalerweise die Phasenplatte befindet. Außerdem ist die Phasenplatte nicht innerhalb des Objektivs positioniert, sondern ein Bild der hinteren Brennebene wird durch ein Hilfslinsensystem erzeugt, das Reflexionen und Streuung vermeidet, die von der Phasenplatte erzeugt werden. Es sollte beachtet werden, dass bei der Auflicht-Phasenkontrastmikroskopie Phasenunterschiede eher aus Reliefs auf den Probenoberflächen als aus Phasengradienten innerhalb der Probe resultieren.

Die Reduzierung von Halo- und Shading-off-Artefakten bleibt ein Hauptanliegen in der Phasenkontrastmikroskopie. Apodisierte Phasenplatten sind nützlich, um die Schwere von Lichthöfen zu reduzieren, und spezialisierte variable Phasenkontrastsysteme können fein abgestimmt werden, um diese Effekte zu kontrollieren, um die Bildqualität und die Genauigkeit der durch die Technik erhaltenen Informationen zu optimieren. Es besteht auch ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung fortschrittlicher Phasenkontrastsysteme, die genaue Messungen von Phasenproben mit großen optischen Wegunterschieden sowie kombinierte Beobachtungen mit anderen kontrastverstärkenden Techniken ermöglichen. Insbesondere wird der Phasenkontrast häufig bei der Fluoreszenzbildgebung verwendet, um die Lage von Fluorophoren zu bestimmen, und verspricht eine Verbesserung des Kontrasts in der optischen Rastermikroskopie.

Beitragende Autoren

Douglas B. Murphy - Department of Cell Biology and Anatomy and Microscope Facility, Johns Hopkins University School of Medicine, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Ron Oldfield - Department of Biological Sciences, Division of Environmental and Life Sciences, Macquarie University, New South Wales 2109, Australien.

Stanley Schwartz - Abteilung für Biowissenschaften, Nikon Instruments, Inc., 1300 Walt Whitman Road, Melville, New York 11747.

Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


Phasenkontrastmikroskop: Kurze Hinweise zum Phasenkontrastmikroskop

In den letzten Jahren wurden bemerkenswerte Fortschritte bei der Untersuchung lebender Zellen (ungefärbt) durch die Entwicklung spezieller optischer Techniken wie Phasenkontrast- und Interferenzmikroskopie erzielt.

Die biologischen Proben sind für sichtbares Licht hochtransparent und verursachen Phasenänderungen in der transmittierten Strahlung.

Das Phasenkontrastmikroskop hat das gleiche Auflösungsvermögen wie das gewöhnliche Lichtmikroskop, ermöglicht jedoch die Visualisierung verschiedener Teile der Zelle aufgrund von Unterschieden in ihrem Brechungsindex (der Brechungsindex ist definiert als das Verhältnis der Lichtgeschwindigkeit im Vakuum zu seiner Geschwindigkeit in einem Übertragungsmedium).

Da Licht durch eine Struktur mit einer Geschwindigkeit übertragen wird, die umgekehrt proportional zum Brechungsindex der Struktur ist, sind Lichtwellen, die aus Strukturen mit unterschiedlichem Brechungsindex austreten, zueinander phasenverschoben.

Das Phasenkontrastmikroskop ist in der Lage, diese Phasenunterschiede in Lichtintensitätsunterschiede umzuwandeln und so ein kontrastreiches Bild zu erzeugen. Das Phasenkontrastmikroskop nutzt die Interferenz zwischen zwei Lichtstrahlen.

Im Phasenkontrastmikroskop werden die kleinen Phasenunterschiede verstärkt. Das durch die Objektivlinse des Mikroskops am weitesten seitliche Licht wird durch eine ringförmige Phasenplatte, die eine 1/4-Wellenlängenvariation in der hinteren Brennebene des Objektivs.

Zusätzlich ist im Unterstufenkondensator eine Ringmembran angeordnet. Der Phaseneffekt resultiert aus der Interferenz zwischen dem direkten geometrischen Bild, das durch den mittleren Teil des Objektivs gegeben wird, und dem seitlich gebeugten Bild, das auf insgesamt 1/2 Wellenlänge verzögert oder vorgezogen wurde.

Bei hellem oder negativem Kontrast werden die beiden Strahlenbündel addiert und das Objekt erscheint heller als die Umgebung. Bei dunklem oder positivem Kontrast werden die beiden Strahlenbündel subtrahiert, wodurch das Bild des Objekts dunkler wird als die Umgebung. Aufgrund dieser Interferenz werden die winzigen Phasenänderungen innerhalb des Objekts verstärkt und intensiviert.

Ein transparentes Objekt erscheint somit in verschiedenen Graustufen, abhängig von der Dicke des Objekts und dem Unterschied zwischen den Brechungsindizes des Objekts und des Mediums.

Phasenmikroskopie wird verwendet, um lebende Zellen und Gewebe zu beobachten. Es ist besonders wertvoll für die Beobachtung der in vitro kultivierten Zellen während der Mitose.

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Prinzip des Phasenkontrastmikroskops:

Dies dient dazu, kleine Phasenunterschiede in visuell erkennbare Kontrastunterschiede umzuwandeln. Eine ringförmige Phasenplatte wird in das Objektiv des Mikroskops und eine ringförmige Blende in den Kondensor eingesetzt, wie in Abbildung 2 gezeigt. Wenn das Licht durch die Linsen durchgelassen wird, passieren einige der Strahlen auf direktem Weg, während andere gebeugt werden seitlich. Gebeugte Lichtstrahlen sind somit phasenverschoben zum direkten Licht, und es entsteht ein Bild mit starken Kontrasten.

Die ringförmige Blende beleuchtet das Objekt mit einem schmalen Lichtkegel, und die ringförmige Phasenplatte erzeugt eine Variation von 1/4 A zwischen dem gebeugten Seitenlicht und dem direkten Licht. Der Phaseneffekt ist das Ergebnis der Interferenz zwischen dem direkten Bild in der Mitte des Objektivs und dem gebeugten seitlichen Bild.

Wird das gebeugte Bild retardiert, ergibt sich ein negativer Kontrast, wohingegen ein vorgezogenes, positives Kontrastergebnis resultiert. Wenn der Brechungsindex des Mediums größer als der des Objekts ist, ist das Objekt dunkel, und wenn der Brechungsindex des Mediums kleiner als der des Objekts ist, ist das Objekt hell.


Talk-Übersicht

Diese Vorlesung beschreibt die Prinzipien der Dunkelfeld- und Phasenkontrastmikroskopie, zwei Möglichkeiten, Kontraste in einer Probe zu erzeugen, die im Hellfeld schwer zu erkennen ist. Die Vorlesung beschreibt, wie die Phasenringe funktionieren, um Interferenzen zwischen dem gebeugten und ungebeugten Licht zu erzeugen.

Fragen

  1. Als Zernicke das Beleuchtungslicht an der hinteren Öffnung des Objektivs blockierte, sah er
    1. Sowohl das Feld als auch die Partikel (Probe) waren hell
    2. Das Feld war dunkel und die Partikel waren hell.
    3. Das Feld war hell und die Partikel waren dunkel.
    4. Sowohl das Feld als auch die Partikel (Probe) waren dunkel
    1. Eine Säugetier-Gewebekulturzelle
    2. Ein dünner histologischer Schnitt der Leber
    3. 25 nm Mikrotubuli in vitro polymerisiert
    4. Pollenkörner
    1. Schlechte Schärfentiefe
    2. Ist im Allgemeinen eine Technik mit höherer Auflösung als Phasenmikroskopie
    3. Benötigt eine sehr helle Lichtquelle
    4. Kann sowohl Trocken- als auch Ölkondensatoren und Objektive verwenden
    1. Abschwächen und ¼ l Phasenverzögerung des Beleuchtungslichts erzeugen
    2. Erhöhen Sie die relative Helligkeit und erzeugen Sie eine ¼ l Phasenverzögerung des Beleuchtungslichts
    3. Abschwächen und ¼ l Phasenvorlauf des Beleuchtungslichts erzeugen
    4. Abschwächen und eine l Phasenvoreilung des Beleuchtungslichts erzeugen
    1. Der Phasenring verzögert oder beschleunigt die Phase des Beleuchtungslichts relativ zum Streulicht um eine halbe Wellenlänge.
    2. Der Phasenring reduziert die Intensität des Beleuchtungslichts
    3. Phasenringe sind in das Objektiv eingebaut
    4. Die Phasenmikroskopie erfordert einen passenden Ringraum im Kondensorrevolver.

    Antworten

    1. B
    2. Wahr
    3. C: Dunkelfeld, das gebeugtes Licht sammelt und auf einen dunklen Hintergrund fokussiert, erzeugt in vitro sehr schöne kontrastreiche Bilder von Mikrotubuli, die kleine, aber einfache Objekte sind. Die anderen Objekte sind komplexer und dicker und erzeugen eine enorme Streulichtmenge, die ein helles, aber informationsarmes Bild von Zellen oder Geweben erzeugt.
    4. B: Dunkelfeld hat eine begrenzte Auflösung, da die NA des Objektivs niedriger sein muss als die NA des Kondensors. In der Praxis bedeutet dies, Objektive mit einer NA unter 1 zu verwenden. Ein Phasenobjektiv hat keine solchen Einschränkungen und man kann Objektive mit höherer NA verwenden.
    5. C: In der Phasenmikroskopie soll das Licht, das durch die transparente Probe wandert, mit dem Beleuchtungslicht interferieren, um einen Kontrast zu erzeugen. Eine dünne Probe erzeugt typischerweise eine ¼ l Phasenverzögerung des Beleuchtungslichts. Wenn das Beleuchtungslicht um ¼ l phasenverschoben wird, sind Probe und Beleuchtungslicht um ½ l phasenverschoben, was zu destruktiver Interferenz und einem dunkleren Bild als der Hintergrund führt. Das Beleuchtungslicht wird auch abgeschwächt, um es in seiner Intensität dem schwächer gebeugten Licht von der Probe anzunähern und somit einen besseren Kontrast zu erzeugen.
    6. Falsch: Sie benötigen einen bestimmten Ring am Kondensor, der dem Phasenring jedes Objektivs entspricht. Dann wird das Beleuchtungslicht auf den Phasenring beschränkt und von diesem modifiziert. Außerdem muss der Kondensorring (mit Stellschrauben) so eingestellt werden, dass er im Strahlengang mit dem Phasenring des Objektivs ausgerichtet ist.
    7. Gebeugtes Licht der Probe trifft auf den Ring des Phasenrings.
    8. Damit der Kegelwinkel des Beleuchtungslichts (dieser Winkel wird durch die N.A. des Kondensors bestimmt) nicht vom Objektiv erfasst wird. Dann erscheint das Feld dunkel, weil das Beleuchtungslicht nicht abgebildet wird. Ein Teil des von der Probe gebeugten Lichts wird jedoch vom Objektiv gesammelt.
    9. Ein Teil des Fluoreszenzlichts der Probe wird durch den Phasenring des Objektivs abgeschwächt, wodurch wertvolle Photonen verloren gehen, wenn das Bild schwach ist. Auch der Phasenring spreizt die Airy-Scheibe leicht.
    10. EIN

    Definition der Phasenkontrastmikroskopie

    Ein Phasenkontrastmikroskop wandelt geringfügige Unterschiede im Brechungsindex und in der Zelldichte in leicht erkennbare Variationen der Lichtintensität um, um lebende Zellen zu beobachten.

    Dieses Mikroskop wird zur Visualisierung von Zellkulturen und lebenden Zellen verwendet. Lebende Zellen können ohne Färbung beobachtet werden.

    Ungefärbte Präparate haben kein Licht absorbiert, dadurch entstehen extrem kleine Unterschiede in der Intensitätsverteilung im Bild. Daher wird die Probe in einem Hellfeldmikroskop nicht klar visualisiert.

    Denn beim Durchdringen von Proben, die wir mit unseren Augen nicht sehen können, traten kleine Phasenverschiebungen auf.

    In einer Phasenkontrastmikroskopie werden diese Phasenverschiebungen in Amplitudenänderungen umgewandelt, die als Bildkontrastunterschiede beobachtet werden können.

    1934 beschrieb der niederländische Physiker Frits Zernike erstmals die Phasenkontrastmikroskopie. 1953 erhielt er den Nobelpreis für Physik. 1942 wurde in Deutschland die kommerzielle Produktion von Phasenkontrastmikroskopen aufgenommen.


    Auf jeden Fall ist ein inverses Mikroskop eines, bei dem die Optik unter der Probe und die Lichtquelle darüber positioniert ist, was eine optimale Situation für die Betrachtung einer lebenden Kultur bietet. Die Phasenringe, die das Licht verschieben, kommen kurz nach der Lichtquelle. Für die Phase spielt die Ausrichtung keine Rolle, nur die Reihenfolge:

    Aufrechtes Mikroskop

    Auge-->Phasenkompatibles Objektiv-->Probe-->Phasenscheibe-->Lichtquelle

    Inverses Mikroskop

    Auge --> phasenkompatibles Objektiv --> Probe --> Phasenscheibe --> Lichtquelle

    Nicht alle Mikroskope haben Phase-Nr., sie sind eine wichtige und teure Ergänzung zu einem Mikroskop. Das Hinzufügen der Phase erforderte nicht nur die Phasenscheibe, sondern auch ein phasenkompatibles Objektiv.


    Zusammenfassung

    Phasenkontrast ist eine Technik, die auf einem herkömmlichen Hellfeldmikroskop unter Hinzufügung von zwei Komponenten, passend Phasenplatte im Kondensator und Kondensatorring, normalerweise in einem Phasenkontrastobjektiv. Bei richtiger Konfiguration bietet der Phasenkontrast eine hervorragende Methode, um ansonsten transparente Proben zu visualisieren, die bei der herkömmlichen Hellfeld-Bildgebung fast unsichtbar wären.

    Die Phasenabbildung überwindet die der Absorptionsabbildung innewohnenden Beschränkungen bei der Visualisierung subzellulärer Komponenten mit hohem Kontrast, ohne dass eine spezifische Markierung erforderlich ist. Phasenkontrast kann aufgrund der unterschiedlichen optischen Konfigurationen auch zur Ergänzung der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.

    Der Phasenkontrast weist einige Einschränkungen auf, wie beispielsweise optische Phasenartefakte und Nichtlinearität. Insgesamt hat die Technik als optisches Abbildungsverfahren einen wesentlichen Beitrag geleistet und ist weiterhin für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen von entscheidender Bedeutung.


    1 Antwort 1

    Jedes grüne, weiche Blatt einer ungiftigen Pflanze ist ein guter Anfang. Schneiden Sie eine dünne Scheibe vom Blatt ab (entweder um den Querschnitt oder die Oberfläche zu betrachten). Probieren Sie verschiedene Blätter mit unterschiedlichen Farben aus - es könnten Farben im Zytosol und/oder in Chromoplasten vorhanden sein.

    Konkretes Beispiel für dynamische Strukturen:

      Blätter: Sie bestehen aus nur zwei Zellschichten und können ohne weitere Vorbereitung unter dem Mikroskop betrachtet werden. Halten Sie das Blatt in Wasser und bedecken Sie es mit einem Deckglas, bevor Sie es unter dem Mikroskop betrachten, und fügen Sie Wasser hinzu, wenn es zu trocknen beginnt. Die grünen Chloroplasten in den Pflanzenzellen bewegen sich, solange die Zelle lebt.

    Sie können Elodea entweder in einem Teich oder in einem Geschäft finden, das Aquarienfische und ähnliches verkauft. Sie können Elodea am Leben erhalten und an einem sonnigen Ort in nahrhaftem Wasser anbauen.


    Campylobacter jejuni und verwandte Arten

    Direkte Untersuchung von Kot

    Die Untersuchung von Durchfall-Kotproben durch Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie innerhalb von 2 Stunden nach der Passage kann eine schnelle Verdachtsdiagnose von Campylobacter Enteritis, wenn die charakteristische rasende Motilität des Campylobacter Organismus gesehen wird. 149.227 Dieser Test ist besonders in der akuten Phase der Erkrankung sinnvoll. Ebenso ist das Vorliegen von Vibrioformen in gramgefärbten Stuhlproben ein sehr spezifisches diagnostisches Merkmal, obwohl die Sensitivität dieses Befundes bei 50 bis 75 % liegt ( Abb. 218-3 ). 228 Die direkte Mikroskopie ist auch für den Nachweis von roten Blutkörperchen und Neutrophilen wertvoll, die im Stuhl von 75 % der Patienten mit Campylobacter Enteritis. 59,147 Der Einsatz von PCR-Techniken zum direkten Nachweis von Organismen war in Forschungsstudien erfolgreich, wurde jedoch noch nicht im klinischen Umfeld angewendet. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, eine mikroskopische Methode, die fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden verwendet, die in mehreren an einzigartige Zielstellen auf ribosomaler RNA binden Campylobacter spp., kann ein weiteres Mittel zur schnellen Identifizierung von Campylobacter isoliert. 229