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4.8: Enzymparameter - Biologie

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(V_{max}) & (K_{Katze})

Auf einem Diagramm der Geschwindigkeit gegen die Substratkonzentration (V vs. [S]) ist die maximale Geschwindigkeit (bekannt als Vmax) der Wert auf der Y-Achse, dem sich die Kurve asymptotisch nähert. Es sollte beachtet werden, dass der Wert von V max von der Menge des in einer Reaktion verwendeten Enzyms abhängt. Doppelte Enzymmenge, doppelte Vmax. Wenn man die Geschwindigkeiten zweier verschiedener Enzyme vergleichen wollte, müsste man bei den verschiedenen Reaktionen, die sie katalysieren, die gleichen Enzymmengen verwenden. Es ist wünschenswert, ein Maß für die Geschwindigkeit zu haben, das von der Enzymkonzentration unabhängig ist. Dazu definieren wir den Wert Kcat , auch Umsatzzahl genannt. Mathematisch,

[ ext{Kcat} = frac{V_{max}}{ [Enzym]} ag{4.7.1}]

Um Kcat zu bestimmen, muss man natürlich die Vmax bei einer bestimmten Enzymkonzentration kennen, aber das Schöne an dem Begriff ist, dass er dank des Begriffs im Nenner ein von der Enzymkonzentration unabhängiges Maß für die Geschwindigkeit ist. Kcat ist somit eine Konstante für ein Enzym unter gegebenen Bedingungen. Die Einheiten von K cat sind ( ext{time}^{-1}). Ein Beispiel wäre 35/Sekunde. Dies würde bedeuten, dass jedes Enzymmolekül die Bildung von 35 Produktmolekülen pro Sekunde katalysiert. Obwohl dies wie ein hoher Wert erscheinen mag, gibt es bekannte Enzyme (z. B. Carboanhydrase), die Kcat-Werte von (10^6)/Sekunde haben. Diese erstaunliche Zahl zeigt deutlich, warum Enzyme in ihrer Wirkung fast magisch wirken.

(K_M)

Ein weiterer nützlicher Parameter eines Enzyms ist als KM bekannt, die Michaelis-Konstante. Einfach ausgedrückt misst es die Affinität eines Enzyms zu seinem Substrat. Die Affinitäten von Enzymen zu Substraten variieren erheblich, daher hilft uns die Kenntnis von KM zu verstehen, wie gut ein Enzym für das verwendete Substrat geeignet ist. Die Messung von KM hängt von der Messung von Vmax ab. In einem V vs. [S]-Diagramm wird KM als der x-Wert bestimmt, der Vmax/2 ergibt. Ein häufiger Fehler, den Studenten bei der Beschreibung von V max machen, ist zu sagen, dass KM = Vmax/2 ist. Das stimmt natürlich nicht. KM ist eine Substratkonzentration und ist die Substratmenge, die ein Enzym benötigt, um Vmax/2 zu erreichen. Andererseits ist Vmax/2 eine Geschwindigkeit und nichts anderes. Der Wert von KM steht in umgekehrter Beziehung zur Affinität des Enzyms zu seinem Substrat. Hohe KM-Werte entsprechen einer geringen Enzymaffinität für das Substrat (es braucht mehr Substrat, um Vmax zu erreichen). Niedrige KM-Werte für ein Enzym entsprechen einer hohen Affinität zum Substrat.


PCR-Cycling-Parameter&ndashSechs Schlüsselüberlegungen für den Erfolg

Die PCR-Zyklus- und Laufparameter müssen für eine effiziente Amplifikation eingestellt werden, sobald die entsprechenden Mengen an DNA-Input und PCR-Komponenten bestimmt wurden. Die Eigenschaften der DNA-Polymerasen, die Typen der PCR-Puffer und die Komplexität der Matrizen-DNA werden alle die Einstellung dieser Reaktionsbedingungen beeinflussen. In den Abschnitten auf dieser Seite werden allgemeine Überlegungen zu den PCR-Zyklusparametern erörtert, beginnend mit einer Veranschaulichung der wichtigsten Schritte des PCR-Prozesses (Abbildung 1).

Auf dieser Seite:

Abbildung 1. Illustration der Hauptschritte bei der PCR – Denaturierung, Annealing, Extension – zur Amplifikation der Zielsequenz von einer Template-DNA.

Video: Prinzipien der PCR

Die PCR beruht auf drei thermischen Zyklenschritten, um eine Ziel-DNA-Sequenz zu amplifizieren. Dieses Video erklärt, wie diese drei Schritte in der PCR funktionieren.


Normalbereiche einiger blutchemischer Parameter bei ausgewachsenem Atlantischen Zuchtlachs, Salmo salar

Blutproben von gesunden erwachsenen Atlantischen Lachsen, die mit einer optimalen Ernährung in Netzpferchen gefüttert wurden, wurden in Intervallen von Oktober bis Mai gesammelt. An 20 Fischen in sieben Proben wurden hämatologische Bestimmungen und biochemische Serumanalysen durchgeführt. Die Bereiche der hämatologischen Werte für die Probenmittelwerte waren: Hämatokrit 44–49 %, Hämoglobin 8,9–10,4 g 100 ml −1 , Erythrozytenzahl 0,85–1,10 × 10 12 l −1 , MCV 441–553 × 10 −15 1 , MCH 94–106 × 10 –6 g, MCHC 19,4–21,7 g 100ml –1 und Leukokrit 0,43–0,96 %. Die Bereiche der Enzymaktivitäten im Serum waren für Probenmittelwerte: alkalische Phosphatase 647–988 ul –1 , Aspartataminotransferase 202–351 ul –1 und Alaninaminotransferase 4–8 ul –1 . Die Bereiche der anderen im Serum analysierten Parameter waren: Gesamtprotein 41,6–56,6 gl −1 , Albumin 18,3–24,3 gl −1 , Albumin/Gesamtproteinverhältnis 39,3–44,0 %, Kreatinin 26–46 µmol, Triglyceride 2,53–4,98 µmol und Cholesterin 9,3–12,8 μmol. Diese Werte gelten als normale Bereiche bei gesunden Fischen. Variationen aufgrund saisonaler Veränderungen und die klinische Bedeutung der ausgewählten Parameter werden diskutiert. Es werden Daten präsentiert, die die Reproduzierbarkeit der biochemischen Analysen im Serum zeigen.


BESCHREIBUNG UND ENTWICKLUNG DES MODELLS

Das einfachste Modell eines enzymkatalysierten Reaktionsmechanismus ist in Abb. 1 dargestellt. Der Mechanismus besteht aus zwei Schritten, der erste ist die Bindung des Enzyms an das Substrat und der zweite umfasst sowohl die Katalyse der Reaktion als auch die Freisetzung des Produkt. Die Bindung des Substrats an das Enzym wird durch die Affinitätskonstante bestimmt KEIN = k1/k−1 die Michaelis-Konstanten sind KS = (k2 + k−1)/k1 für den Untergrund und KP = (k2 + k−1)/k−2 für das Produkt. Die maximale Geschwindigkeit für die Hinreaktion ist Vmax = k2eT, wo eT die Gesamtmenge an Enzym ist, und k2 ist die katalytische Geschwindigkeitskonstante, die auch als bezeichnet wird kKatze.

Untersuchen wir nun den Effekt der Änderung der Werte bestimmter Geschwindigkeitskonstanten, um zu zeigen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit eine optimierbare Größe ist. Das in Abb. 1 gezeigte Modell ist wirklich viel komplizierter, als es den Anschein hat, weil es sechs unabhängige Parameter, vier Geschwindigkeitskonstanten und S- und P-Konzentrationen umfasst, oder fünf, wenn es sich um eine chemische Reaktion mit einer festen Gleichgewichtskonstante handelt. Um einen einfachen Fall darzustellen, der leicht analysiert werden kann, lassen Sie uns daher die Werte einiger Parameter zusätzlich zu Keq, sagen S und P (die Substrat- und Produktkonzentrationen), k1 (das ist die Geschwindigkeitskonstante der Enzym-Substrat-Bindung) und k2 (was die katalytischen und die Produktfreisetzungskonstanten beinhaltet). Diese Wahl hat eine klare chemische Bedeutung, da sowohl die Bindung des Enzyms an das Substrat als auch die Katalysegeschwindigkeit durch chemische Beschränkungen des aktiven Zentrums und der Substratstruktur begrenzt sind. Somit kann die Entwicklung des Enzyms zu einem optimalen Satz von Werten von Geschwindigkeitskonstanten wie folgt zusammengefasst werden.

Stellen wir uns eine hypothetische Abfolge von Evolutionsschritten für ein Enzym mit festen Werten von . vor k1 und k2 (siehe Abb. 2). In einer ersten Stufe hat das Enzym eine sehr geringe Affinität für das Substrat, was offensichtlich eine sehr niedrige Reaktionsgeschwindigkeit ergibt, und danach arbeiten Evolution und natürliche Selektion, wobei die Affinität des Enzyms für sein Substrat durch Verringerung verbessert wird k−1. Da die Gleichgewichtskonstante der Reaktion Keq = (k1 · k2)/(k−1 · k−2) ist fest, ebenso wie k1 und k2 in diesem Fall die Abnahme von k−1 muss mit einer Erhöhung um einhergehen k−2. Dieser letzte Effekt ist im Prinzip ungünstig für die gesamte Aktivität, aber da die erste Stufe eine sehr niedrige Reaktionsgeschwindigkeit ergab, ist der positive Effekt einer Verringerung der k−1 ist wichtiger als das Negative einer Zunahme der k−2, und das globale Ergebnis ist, dass die zweite Stufe (Abb. 2) eine Nettozunahme der Reaktionsgeschwindigkeit hat. Stellen wir uns nun vor, dass die Affinität durch weitere Abnahmen von . zusätzlich erhöht wird k−1, wiederum mit einem entsprechenden Anstieg von k−2. In diesem Stadium wurde die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat stark erhöht, aber anstatt die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen, verringert es jetzt die katalytische Effizienz. Der Preis, den man für eine so hohe Affinität zum Substrat zahlen muss, ist eine hohe Affinität zum Produkt, da das Enzym das Substrat fest bindet, aber auch das Produkt fest bindet. Da das Produkt nur langsam freigesetzt wird, weist das System nun eine schlechte Nettoreaktionsgeschwindigkeit auf. Diese einfache Argumentation zeigt, dass der Wert der Affinitätskonstante einen optimalen Wert hat, um die maximale Aktivität des Enzyms zu erhalten. Mit anderen Worten, die mathematische Funktion, die die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Satz von Geschwindigkeitskonstantenwerten des Enzyms in Beziehung setzt, ist eine optimierbare Funktion und somit ein klares Ziel der natürlichen Selektion.


Was verursacht eine „falsche“ Erhöhung von Biomarkern?

Nicht alle Erhöhungen der kardialen Biomarker weisen auf einen Herzinfarkt hin.

Der Kreatinkinase-Spiegel kann bei jeder Muskelverletzung oder bei einer Schädigung des Gehirns oder der Lunge oder bei Leber- oder Nierenerkrankungen erhöht sein.

Erhöhungen des Troponin-Blutspiegels sind wirklich sehr spezifisch für Herzzellschädigungen, daher gibt es streng genommen keine „falschen“ Erhöhungen von Troponin. Eine Schädigung der Herzzellen kann jedoch aus anderen Gründen als einem akuten Herzinfarkt auftreten. Diese Zustände können Herzinsuffizienz, Myokarditis, schnelles Vorhofflimmern, Sepsis, Koronararterienspasmus, Aortendissektion, Stresskardiomyopathie oder schwere Lungenembolie umfassen.

Die Diagnose eines Herzinfarkts beruht nicht auf einem einzigen Bluttest, sondern auch auf klinischen Symptomen, EKG-Veränderungen und (oft) auf einem Muster von Biomarker-Erhöhungen, die auf eine akute Herzzellschädigung hindeuten.


Bewertung der Denaturierung von Template-DNA

Der anfängliche Denaturierungsschritt wird zu Beginn der PCR durchgeführt, um die doppelsträngige Template-DNA in Einzelstränge aufzutrennen, damit die Primer an die Zielregion binden und die Verlängerung einleiten können. Die vollständige Denaturierung der Eingangs-DNA trägt dazu bei, eine effiziente Amplifikation der Zielsequenz während des ersten Amplifikationszyklus sicherzustellen. Darüber hinaus hilft die hohe Temperatur in diesem Schritt bei der Inaktivierung hitzelabiler Proteasen oder Nukleasen, die in der Probe vorhanden sein können, mit minimalem Einfluss auf thermostabile DNA-Polymerasen. Bei Verwendung einer Hot-Start-DNA-Polymerase dient dieser Schritt auch der Aktivierung des Enzyms, obwohl vom Enzymlieferanten ein separater Aktivierungsschritt empfohlen werden kann.

Der anfängliche Denaturierungsschritt wird üblicherweise bei 94–98 °C für 1–3 Minuten durchgeführt. Die Zeit und Temperatur dieses Schrittes kann je nach Art der Matrizen-DNA und Salzkonzentrationen des Puffers variieren. Zum Beispiel kann genomische DNA von Säugetieren längere Inkubationszeiten erfordern als Plasmide und PCR-Produkte, basierend auf DNA-Komplexität und -Größe. In ähnlicher Weise erfordert DNA mit hohem GC-Gehalt (z. B. >65%) oft eine längere Inkubation oder eine höhere Temperatur zur Denaturierung (Figur 2). Puffer mit hohem Salzgehalt (wie von einigen DNA-Polymerasen benötigt) benötigen im Allgemeinen höhere Denaturierungstemperaturen (z. B. 98°C), um doppelsträngige DNA (Figur 3).

Abbildung 2. Eine Verlängerung der anfänglichen Denaturierungszeit verbessert die PCR-Ausbeute eines GC-reichen 0,7-kb-Fragments, das aus einer humanen gDNA-Probe amplifiziert wurde. Die anfänglichen Denaturierungsschritte wurden auf 0, 0,5, 1, 3 bzw. 5 Minuten eingestellt.

Einige DNA-Polymerasen wie Taq DNA-Polymerase kann bei längerer Inkubation über 95 °C leicht denaturiert werden. Um die verringerte Aktivität in diesem Szenario zu kompensieren, können nach dem anfänglichen Denaturierungsschritt mehr Enzyme oder zu Beginn eine höhere als die empfohlene Menge an DNA-Polymerase zugegeben werden. Hoch thermostabile Enzyme, wie sie aus Archaeen sind in der Lage, längere Zeit hohen Temperaturen standzuhalten und während der gesamten PCR aktiv zu bleiben (erfahren Sie mehr über die Eigenschaften der DNA-Polymerase).


KURZE BESCHREIBUNG DES PROGRAMMS

Das Programm läuft unter Matlab 6.1 (The MathWorks Inc., Natick, MA) auf dem PC.

Generierung pseudo-experimenteller Daten—

Das Modell, das die pseudo-experimentellen Daten generiert, verwendet die Differentialgleichung 1, wobei Km eine stetige Funktion des pH-Wertes ist, und kP ist eine kontinuierliche Funktion von pH, Temperatur und Zeit, um die Änderungen der Enzymaktivität in einem diprotischen Enzymmodell mit einem ionisierbaren Substrat und die zeitabhängige Hitzedenaturierung des Enzyms zu berücksichtigen [ 9 ]. Die Pseudomessdaten werden durch Integration der Gleichung 1 für benutzerdefinierte Zeitintervalle mit der Matlab-Funktion „ode15s“ generiert. Neben der kontinuierlichen Abhängigkeit von Km und kP bei pH-Wert und Temperatur wird die pseudo-reale Natur der generierten Daten durch die zufällige Einbeziehung von drei Fehlerarten bei jeder Wiederholung der Experimente sichergestellt. Die biologischen Variationen der Enzympräparate werden durch gleichmäßig verteilte relative Abweichungen von simuliert Km und kP. Die Fehler des Experimentators werden durch normalverteilte Variationen der simuliert ET und S0 Konzentrationen, deren relative Werte linear mit der Zunahme von ET und S0. Die Fehler in der Probenahmeinstrumentierung werden durch die normalverteilten Variationen in . nachgeahmt P, deren relative Werte linear mit der Zunahme des Logarithmus von abnehmen P. Somit werden die pseudo-gemessenen Daten mit akzeptablem Rauschen erzeugt.

Identifizierung der kinetischen Parameter—

Die kinetischen Parameter werden unter Minimierung der quadratischen Reste in Modellgleichung 1 unter Verwendung der pseudo-gemessenen Daten und der Matlab-Funktion „lsqnonlin“ identifiziert.

Schätzung der Parameterverteilung—

Zur Auswertung der Parameterverteilung stehen zwei Methoden zur Verfügung. Das Monte-Carlo-Verfahren baut die synthetische Stichprobe durch zufällige Entnahme von Daten aus einer normalverteilten Menge mit Mittel- und Varianzwerten auf, die mit den jeweiligen Werten der pseudo-gemessenen Stichprobe übereinstimmen. Das Bootstrap-Verfahren erzeugt die synthetische Stichprobe mit zufälliger Ziehung mit Ersatz direkt aus der pseudo-gemessenen Stichprobe (nur anwendbar, wenn diese eine ausreichend hohe Punktzahl enthält). Die Konfidenzbereiche werden auf der Grundlage des χ 2 -Diskrepanzmaßes definiert, wie oben in Bezug auf Abb. 4 [ 10 ] diskutiert.

Grafik und Schnittstelle—

Zur Visualisierung der experimentellen Simulationen werden die grafischen Möglichkeiten von Matlab verwendet. Die Benutzeroberfläche des Programms ermöglicht den Zugang mit einer eindeutigen persönlichen Identifikationsnummer, wodurch die einzelnen Sitzungen gespeichert werden und die Studierenden bei Bedarf ihre Arbeit zu einem späteren Zeitpunkt an der erreichten Stufe fortsetzen können.

Anpassung der stationären Versuchsbedingungen. EIN, ein Experiment, bei dem die stationäre Bedingung nicht erfüllt ist (die ES in der zweiten Hälfte der ausgewerteten Inkubationszeit abnimmt). B, ein Experiment, das die Anforderungen des stationären Zustands erfüllt. Die Studierenden können die Gültigkeit der empirischen „Kriterien“ für das stationäre Modell visuell überprüfen (ΔS < 0,1S0, ETKm + S0), die ansonsten mit komplexen mathematischen Verfahren nachgewiesen werden sollten [ 8 ].

Rahmenbedingungen für eine optimale Enzymwirkung. EIN, kontinuierliche Überwachung der Produktbildung im Verlauf der enzymkatalysierten Reaktion bei verschiedenen Temperaturen. Der kontinuierliche Assay veranschaulicht auch die intrinsischen Fehler des Probenahmeverfahrens, die eine wiederholte Probenahme erforderlich machen. B, Endpunkt-Enzymaktivitätsassay für verschiedene Probenahmezeiten. Die Daten sind ein Querschnitt des kontinuierlichen Assays in EIN für 1- und 10-minütige Inkubationen. Der Vergleich der beiden Kurven verdeutlicht die offensichtliche Natur der „optimalen“ Temperatur, die durch die Zeitabhängigkeit der Hitzedenaturierung verursacht wird.

Identifizierung von Parametern mit nichtlinearer Regressionsanalyse. EIN, nichtlineare Regressionsanalyse der experimentellen Daten mit der Methode der kleinsten Quadrate. B, Modell der experimentellen Fehler. Die Abhängigkeit der Standardabweichung (σ) wird als Funktion der mittleren Messwerte (μ) modelliert.


Danksagung

Wir danken Prof. Patricia Burkhardt-Holm für ihre kontinuierliche Unterstützung und Ermutigung. Wir danken Bernd Egger, Astrid Böhne, Philipp Hirsch und Patricia Burkhardt-Holm für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir danken Fabio Cortesi für seine aufschlussreichen Kommentare und dem Center for Marine Evolutionary Biology für das Hosten eines Blast-Servers und eines Genom-Browsers. Rechenressourcen wurden vom CESNET LM2015042 und der CERIT Scientific Cloud LM2015085 bereitgestellt, die im Rahmen des Programms „Projekte großer Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsinfrastrukturen“ bereitgestellt werden. Wir danken Maria Leptin für ihre hilfreichen Kommentare und Ratschläge bei der Annotation der Inflammasom-Komponenten.

Berechtigungen

Die für diese Arbeit verwendeten Fische wurden gemäss der Bewilligung 2-3-6-4-1 des Kantonalen Amtes für Umwelt und Energie Basel-Stadt gefangen.


Danksagung

Wir danken Alvaro Cuevas von Hamilton Robotics für seine Beispiele, Anleitung und Unterstützung bei der Nutzung der Original Equipment Manufacturer (OEM)-Schnittstelle, zusammen mit dem Rest von Hamilton Robotics. Wir danken Jason Yang, Stephen Von Stetina, Ethan Alley, Brian Wang, Samantha Shepherd, Timothy Erps und den drei Rezensenten für nachdenkliche Kommentare und Diskussionen. EAD wurde vom National Institute for Allergy and Infectious Diseases (F31 AI145181-01) unterstützt. EJC wurde durch das Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship des National Cancer Institute (F32 CA247274-01) unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt vom MIT Media Lab, einem Alfred P. Sloan Research Fellowship (an KME), Geschenken des Open Philanthropy Project und der Reid Hoffman Foundation (an KME), dem National Institute of Digestive and Kidney Diseases (R00 DK102669- 01 an KME), den Burroughs Wellcome Fund (IRSA 1016432 an KME) und das DARPA Safe Genes Program (N66001-17-2-4054 ​​an KME). Die geäußerten Ergebnisse, Ansichten und/oder Meinungen sind die der Autoren und sollten nicht als offizielle Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung interpretiert werden.


Schau das Video: factors affecting enzyme activity part 2 العوامل المؤثرة على سرعه التفاعل الإنزيمى د. أمانى جابر (August 2022).