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Konstante oder variable Anzahl von Chiasmata während der Rekombination?

Konstante oder variable Anzahl von Chiasmata während der Rekombination?



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Ist die Anzahl der Chiasmata während der Rekombination für jeden Gameten konsistent und sind die Chiasmata-Regionen innerhalb eines einzelnen Organismus konsistent?


Es gibt große Unterschiede in der Verteilung und Anzahl von Chiasmata oder Crossing Overs (COs). Die Gesamtzahl der Chiasmata pro Zelle kann innerhalb desselben Organismus variieren. Wo Chiasmata entlang des Chromosoms auftreten, ist auch nicht von Zelle zu Zelle konsistent. Hotspots sind 1-2kb-Regionen, die im Vergleich zu benachbarten genomischen Regionen eine erhöhte Rekombination erfahren. Man kann sich die Verteilung von COs vorstellen, dass ~80% der Rekombination in Hotspots stattfindet, die ~10% des Genoms ausmachen.

Die Rekombination hängt vom Chromatinkontext ab, so dass Chiasmata in der Nähe des Zentromers selten sind und eine positive Interferenz dazu führt, dass die Chiasmata entlang des Chromosoms verteilt sind. Eine gute Vorhersage der Gesamtzahl der Chiasmata pro Zelle ist mindestens 1 pro Chromosom. Einige Forscher argumentieren, dass ein CO pro Chromosomenarm genauer ist.

Unten finden Sie einen Link zu einem guten Artikel, der einige der Unterschiede bei der Rekombination beim Menschen erläutert. http://www.nature.com/nrg/journal/v8/n1/abs/nrg1947.html


Chiasmata und die Kinetochorkomponente Dam1 sind entscheidend für die Beseitigung fehlerhafter Chromosomenanlagerungen und Zentromeroszillation bei der Meiose I

Die Etablierung der richtigen Chromosomenanlagerungen an die Spindel erfordert die Beseitigung fehlerhafter Anlagerungen, aber der Mechanismus dieses Prozesses ist nicht vollständig verstanden. Während der Meiose I heften sich Schwesterchromatiden an denselben Spindelpol (monoorientierte Bindung), während homologe Chromosomen an entgegengesetzte Pole anlagern (biorientierte Bindung), was zu einer homologen Chromosomensegregation führt. Hier zeigen wir, dass Chiasmata, die homologe Chromosomen und die Kinetochorkomponente Dam1 verbinden, entscheidend für die Beseitigung fehlerhafter Anlagerungen und die Oszillation von Zentromeren zwischen den Spindelpolen bei Meiose I in Spalthefe sind. In chiasmabildenden Zellen verursachten Mad2 und Aurora B-Kinase, die Zeit für die Korrektur der Anheftung bereitstellt bzw Anhänge. In chiasmabildenden Zellen wurde zusätzlich die homologe Zentromeroszillation koordiniert. Darüber hinaus trug Dam1 zur Eliminierung von Bindungen sowohl in chiasmabildenden als auch in chiasmaarmen Zellen bei und trieb die Zentromeroszillation an. Diese Ergebnisse zeigen, dass Chiasmata die Bindungskorrekturmuster verändern, indem sie Fehlerkorrekturfaktoren ermöglichen, um die bi-orientierte Bindung von Schwesterchromatiden zu eliminieren, und legen nahe, dass Dam1 die Beseitigung fehlerhafter Bindungen induziert. Der zufällige Beitrag von Chiasmata und Dam1 zur Zentromer-Oszillation deutet auch auf eine mögliche Verbindung zwischen Zentromer-Oszillation und Attachment-Eliminierung hin.

1. Einleitung

Eine zuverlässige Trennung der Chromosomen während der Zellteilung ist für die Integrität des Genoms unerlässlich. Bei der Teilung einer Körperzelle (Mitose) heften sich duplizierte Chromosomen (Schwesterchromatiden) über Mikrotubuli (MTs) an gegenüberliegende Spindelpole (bi-orientierte Anheftung) und trennen sich voneinander (gleichmäßige Segregation). Eine solche Teilung erzeugt zwei genetisch identische Tochterzellen (Abbildung 1ein, Mitose) [2]. Im Gegensatz dazu heften sich während der ersten von zwei aufeinanderfolgenden Teilungen einer Keimzelle (Meiose) homologe Chromosomen an entgegengesetzte Pole und segregieren, was zur Bildung von Gameten führt, die die Hälfte der ursprünglichen Chromosomenzahl enthalten (Abbildung 1ein, Meiose I).

Abbildung 1. Die Auswirkungen der Fehlerkorrekturbeeinträchtigung auf die Schwesterchromatid-Segregation bei Meiose I. (ein) Organisation, Spindelanheftung und Segregation der Chromosomen in Mitose und Meiose I sind dargestellt. (B) Hypothese über die Rolle des Fehlerkorrekturmechanismus bei der Spindelanheftung von Schwesterchromatiden in Gegenwart und Abwesenheit von Chiasmata. Gepunktete Kreise, durch den Fehlerkorrekturmechanismus korrigierte Anhänge. (C) Segregationsmuster von GFP-visualisierten Zentromeren von Schwesterchromatiden in Zygoten und pat1 haploide Zellen. (D,e) Gleichmäßige Segregationshäufigkeiten bei Meiose I in rec12 + (D) und rec12Δ Zellen (e). (F) Gleichmäßige Segregation von Chromosom 2 bei Meiose I in pat1 haploide Zellen. Die pat1 haploide Zellen wurden durch die Aktivierung des Paarungspheromon-Signalwegs und die anschließende Inaktivierung der Pat1-Kinase bei der restriktiven Temperatur in die Meiose gezwungen, die beide für die Induktion der reduktionsähnlichen Segregation von Schwesterchromatiden in haploiden Zellen erforderlich sind [1]. In (DF), wurde die Chromosomensegregation in mehr als 50 Zellen analysiert, und Balken zeigen Durchschnittswerte von mehr als drei unabhängigen Experimenten. cen1, Chromosom 1 cen2, Chromosom 2 +, keine anderen Mutationen. Gepunktete Linien in (D,e) unterscheiden Ergebnisse für cen1 und cen2. Fehlerbalken zeigen Standardfehler. *P < 0,05 **P < 0,005 (Studenten T-Prüfung). Statistische Analyse von Fehlerkorrektur-kompetent (+) und Fehlerkorrektur-mangelhaft (verrückt2Δ und ark1-so) sgo1Δ Zellen angezeigt.

Die richtigen Bindungen werden durch einen dynamischen Prozess hergestellt [3–6]. Chromosomen heften sich zufällig über Kinetochore an die Spindel, bei denen es sich um Proteinkomplexe handelt, die sich an Zentromeren anordnen [7–9]. Kinetochore heften sich anfangs an Spindel-MTs an ihrer lateralen Seite und anschließend an ihren Enden an. Jüngste Studien zeigten, dass Ndc80 und die Dam1/DASH-Komplexe (Ska-Komplex bei Wirbeltieren) End-on-Anhaftungen bilden und die MT-Demontage an die Zentromerbewegung koppeln. Aufgrund der zufälligen Natur der anfänglichen Anheftung heften sich Schwesterchromatiden oder homologe Chromosomen in der Mitose bzw. Meiose I oft fälschlicherweise an denselben Pol (monoorientierte Anheftung). Diese fehlerhaften monoorientierten Anhaftungen sind instabil und werden letztendlich von den Chromosomen eliminiert, dann wiederholen Sie die Anhaftungs- und Ablöseprozesse, bis sie richtig an der Spindel anhaften. Darüber hinaus bewegen sich Zentromere während der Befestigung ständig zwischen den Spindelpolen hin und her durch Kräfte, die durch die MT-Demontage an den Kinetochoren erzeugt werden [4–6,10]. Es bleibt jedoch unklar, wie fehlerhafte Anlagerungen während der Oszillation von Zentromeren selektiv eliminiert werden.

Es wird allgemein angenommen, dass die richtige Bindung durch Spannung hergestellt wird [11,12]. Während der Mitose werden bi-orientierte Schwesterchromatiden zu entgegengesetzten Polen gezogen, und die Zugkräfte erzeugen Spannung, weil die Schwestern durch einen Proteinkomplex namens Cohesin zusammengehalten werden [13]. Im aktuellen Modell bewirkt diese Spannung eine Stabilisierung der bi-orientierten Bindung, während die spannungslose mono-orientierte Bindung instabil ist und einer Elimination unterliegt. Ebenso erzeugt bei der Meiose I, da die homologen Chromosomen durch Rekombinationsprodukte, genannt Chiasmata, verbunden sind, ihre bi-orientierte Anheftung eine Spannung, von der angenommen wird, dass sie die Anheftungen stabilisiert [2,11,12].

Mehrere Faktoren wurden als Komponenten des Mechanismus identifiziert, der fehlerhafte Anbringungen korrigiert. Die Faktoren des Spindle Assembly Checkpoint (SAC) hemmen das Einsetzen der Anaphase und bieten Zeit für die Korrektur fehlerhafter Attachments (z. B. [14]), und Aurora B-Kinase destabilisiert fehlerhafte Attachments durch Phosphorylierung von Kinetochorkomponenten einschließlich Ndc80 und Dam1 [3,15–17] . Konsequenterweise erhöht eine Beeinträchtigung des SAC-Signalwegs oder der Aurora-B-Kinase die Häufigkeit fehlerhafter Anlagerungen sowohl in der Mitose als auch in der Meiose I [18–26]. Die Anreicherung der Aurora B-Kinase in der inneren Zentromerregion unter dem äußeren Kinetochor legt nahe, dass eine spannungsabhängige räumliche Trennung der äußeren Kinetochore vom inneren Zentromer die Aurora-abhängige Phosphorylierung der äußeren Kinetochore behindert und dadurch die Bindungen stabilisiert [3,19,27 ].

Obwohl die spannungsabhängige Stabilisierung derzeit das weithin akzeptierte Modell für die Bindungsselektion ist, kann sie die Bindungsselektion bei der Meiose nicht ohne weiteres erklären. Bei der Meiose I sind homologe Chromosomen an entgegengesetzten Polen befestigt, während Schwesterchromatiden an demselben Pol befestigt sind. Die monoorientierte Anlagerung von Schwesterchromatiden ist auch für die homologe Chromosomensegregation entscheidend. In der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, Schwester-Zentromere sind oft bi-orientiert und unterliegen einer vorübergehenden Aufspaltung [28]. Obwohl diese Eigensinne Spannungen erzeugen sollen, werden sie schließlich beseitigt. Darüber hinaus korreliert in Maus-Oozyten die Etablierung korrekter Attachments nicht mit der an den Kinetochoren erzeugten Spannung, außerdem scheint die Spannung keine räumliche Trennung der Kinetochore von der mit Aurora angereicherten Region zu bewirken [20]. Daher ist die Bindungsselektion bei Meiose I noch rätselhaft.

Bei der Meiose I sind Chiasmata entscheidend für die bi-orientierte Anlagerung homologer Chromosomen. Wir haben jedoch zuvor berichtet, dass in S. pombe, Chiasmata tragen auch zur monoorientierten Bindung von Schwesterchromatiden bei, indem sie deren bi-orientierte Bindung verhindern [28]. Es bleibt unklar, wie Chiasmata die bi-orientierte Anheftung von Schwesterchromatiden verhindern. Hier untersuchten wir die chiasmaabhängige Verhinderung der bi-orientierten Anheftung genauer und fanden heraus, dass Chiasmata Fehlerkorrekturfaktoren ermöglichten, um die bi-orientierte Anheftung von Schwesterchromatiden und die koordinierte homologe Zentromeroszillation zu eliminieren. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass das Kinetochorprotein Dam1 zur Attachmentkorrektur beiträgt und für die Zentromeroszillation essentiell ist. Diese Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Chromosomenorganisation und der Kinetochoraktivität bei der Eliminierung fehlerhafter Bindungen und zeigen einen möglichen Zusammenhang zwischen Zentromeroszillation und Bindungseliminierung.

2. Ergebnisse

2.1. Chiasmata verändern die Auswirkungen des Fehlerkorrekturmechanismus auf die Schwesterchromatid-Segregation

Wir haben zuvor berichtet, dass Schwesterchromatiden häufig an gegenüberliegenden Spindelpolen anhaften und dass Chiasmata diese Bindungen verhindern [28]. Wir stellten die Hypothese auf, dass Chiasmata die Bindungstypen ändern, die durch den Fehlerkorrekturmechanismus eliminiert werden, so dass in Gegenwart von Chiasmata der Mechanismus selektiv die biorientierte Bindung von Schwesterchromatiden eliminiert, wodurch die monoorientierte Bindung im Gegensatz zur Situation bei der Mitose beibehalten wird (Abbildung 1B, mit Chiasmata). Wenn dies der Fall ist, sollte eine Beeinträchtigung des Fehlerkorrekturmechanismus die Häufigkeit der bi-orientierten Anlagerung in chiasmabildenden Zellen aufgrund einer fehlerhaften Elimination erhöhen. Umgekehrt würde der Fehlerkorrekturmechanismus in Zellen ohne Chiasmata die monoorientierte Anheftung von Schwesterchromatiden selektiv beseitigen, wie bei der Mitose (Abbildung 1 .).B, ohne Chiasmata) und Fehlerkorrekturbeeinträchtigung sollten ihre monoorientierte Bindung verstärken.

Um diese Idee zu testen, haben wir den Fehlerkorrekturmechanismus kompromittiert und die Spindelanlagerungen von Schwesterchromatiden in chiasmabildenden und chiasmaarmen Zellen untersucht. Um den Fehlerkorrekturmechanismus zu kompromittieren, haben wir die verrückt2Δ Mutation oder die ark1-so Mutation, die den meiotischen Ausdruck der Arche1 Gen, das die Aurora B-Kinase der Spalthefe kodiert [25]. Die verrückt2Δ Es wird angenommen, dass die Mutation die Zeit verkürzt, die für die Korrektur falscher Bindungen verfügbar ist, indem sie den SAC-Pfad kompromittiert, während die ark1-so Mutation beeinträchtigt die Elimination von Bindungen und verhindert die Aktivierung von SAC. Um die Bindungen zu bewerten, untersuchten wir die Schwesterchromatid-Segregation, indem wir den Zentromer-proximalen Locus eines der Homologen von Chromosom 1 (cen1) oder 2 (cen2) unter Verwendung des lacI/lacO-Erkennungssystems (Abbildung 1C) [1,29]. In dieser Analyse haben wir die sgo1 Gen, das eines von zwei Shugoshin-Proteinen der Spalthefe kodiert, das während der Meiose spezifisch als Zentromer-Kohäsionsschützer fungiert und die Trennung von Schwesterchromatiden verhindert, die an entgegengesetzten Polen befestigt sind [28,30–33].

Die Segregation von Schwesterchromatiden zu den entgegengesetzten Polen (Gleichungssegregation) war in allen Zelltypen der sgo1 + Hintergrund (Abbildung 1D), was bestätigt, dass Sgo1 die Trennung von Schwesterchromatiden verhindert [28,31,32]. Im Gegensatz dazu in der sgo1Δ Hintergrund, obwohl die Gleichungssegregation in chiasmabildenden Zellen selten war (Abbildung 1D), war es sehr häufig in diploiden rec12Δ Zellen [28], die aufgrund des Fehlens von Rec12 (einem Spo11-Homolog in Spalthefe), einem Faktor, der für die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen erforderlich ist, keine Chiasmata bilden (Abbildung 1e, +) [34]. Die häufige Gleichungssegregation wurde nicht durch einen Verlust von Rec12-Funktionen verursacht, wie die Beobachtung zeigt, dass die Gleichungssegregation auch in haploiden meiotischen Zellen, die keine Chiasmata bilden, häufig auftrat (Abbildung 1C und F, +) [28]. Wichtig ist, in der sgo1Δ Hintergrund, Einführung in die verrückt2Δ oder ark1-so Mutation erhöhte die Prozentsätze der Gleichungssegregation in Chiasma-bildenden diploiden Zellen signifikant (Abbildung 1D), aber verringerte die Segregationsprozentsätze bei Diploiden ohne Chiasma rec12Δ (Abbildung 1e) oder haploide meiotische Zellen (Abbildung 1F). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Fehlerkorrekturmechanismus die bi-orientierte Bindung von Schwesterchromatiden in Gegenwart von Chiasmata verringert, aber umgekehrt die bi-orientierte Bindung erhöht (wodurch die mono-orientierte Bindung verringert wird) in Abwesenheit von Chiasmata. In unserer vorherigen Studie wurden die Gleichungssegregationsfrequenzen von cen1 waren etwas höher im rec12Δ Hintergrund [28], obwohl der Grund dafür unbekannt ist. Allerdings ist die verrückt2Δ Mutation verringerte in ähnlicher Weise die Gleichungssegregation, was mit unseren aktuellen Ergebnissen übereinstimmt.

2.2. Chiasmata verändern die Auswirkungen des Fehlerkorrekturmechanismus auf die Aufspaltung des Schwesterzentromers in der Metaphase

Als nächstes versuchten wir, die bi-orientierte Bindung von Schwesterchromatiden direkter zu beurteilen, indem wir die vorübergehende Aufspaltung von Schwester-Zentromeren untersuchten, ein wahrscheinliches Ergebnis ihrer bi-orientierten Bindung, die oft unabhängig von der Chiasmabildung auftritt [28]. Um die Schwester-Zentromer-Aufspaltung während der Metaphase genau zu bewerten, haben wir das Metaphase-Stadium durch Visualisierung spezifiziert S. pombe Securin Cut2, ein biochemischer Marker des Prä-Anaphase-Stadiums, der an der Prometa-/Metaphase-Spindel lokalisiert ist (Abbildung 2ein) [35]. Um der feinen Zentromerdynamik zu folgen, haben wir außerdem die dreidimensionalen Positionen von cen2 auf der Spindel mit hoher zeitlicher Auflösung durch Aufnahme von Bildern von cen2 und der Spindelpolkörper (SPB das Pilzzentrosom) in mehreren verschiedenen Fokusebenen alle ca. 3 s (Abbildung 2B). Wir visualisierten den SPB mit einer GFP-markierten SPB-Komponente, Sid4 (Sid4-GFP) [36], ließen jedoch eine Kopie von Sid4 in diploiden Zellen unmarkiert, da in unseren Lebendzellanalysen Zellen, die zwei Kopien von GFP-markiertem Sid4 enthielten, hohe Häufigkeiten der Gleichungssegregation von Schwesterchromatiden sogar in der sgo1 + Hintergrund (Daten nicht gezeigt), der wahrscheinlich aus einer Beeinträchtigung der Funktion von Sid4 bei der Regulation des Anaphase-Exit resultierte [37,38]. Das Zurücklassen einer Kopie von unmarkiertem Sid4 eliminierte die Segregationsanomalien weitgehend, wie durch Schwesterchromatid-Segregationsmuster in Zellen gezeigt, die eine Kopie von unmarkiertem Sid4 enthielten, die denen ähnlich waren, die in Zellen ohne Sid4-Tagging beobachtet wurden (elektronisches Zusatzmaterial, Abbildung S1).

Abbildung 2. Zentromer- und SPB-Dynamik in der Metaphase I. (ein) Lokalisierung von GFP-visualisierten Zentromeren und SPBs und RFP-visualisierten Cut2 in der Metaphase I (links) und ein vergrößertes Bild der Zentromere und der SPBs (rechts), dargestellt durch das weiße Kästchen im linken Bild. Balken, 2 µm. (B) Zentromer- und SPB-Dynamik in der Metaphase I in Wildtypzellen. Maximale Projektionsbilder von Zentromeren und SPBs, die alle ungefähr 3 s aufgenommen wurden, wurden von links nach rechts angeordnet. Pfeilspitzen zeigen aufspaltende Schwester-Zentromere an. Balken, 2 µm. (C) Veränderungen der Zentromer- und SPB-Positionen in der Metaphase I in verschiedenen Zellen. Linke Bilder zeigen Kymograph von Zentromeren (cen2) und SPBs und rechte Graphen zeigen Änderungen der Zentromer-SPB- und SPB-SPB-Abstände. Vertikale und horizontale Balken der Kymographen zeigen 2 µm bzw. 30 s. Pfeile zeigen die Co-Lokalisierung von Zentromeren mit dem SPB an. (D) Mittlere Beobachtungshäufigkeit der Zentromerspaltung pro Zentromer, erhalten nach der Bootstrap-Methode. Grafik zeigt die mittleren Frequenzen pro Zentromer. Die gestrichelte Linie unterscheidet die Ergebnisse von rec12 + und rec12Δ Zellen. Zahlen in Klammern am oberen Rand des Diagramms geben die Anzahl der untersuchten Zentromere an. Fehlerbalken zeigen 95 %-Konfidenzintervalle an. *P < 0,05 **P < 0,01 (Studentisierte Bootstrap-Analyse). k.A., nicht signifikant. P-Werte > 0,05 und kleiner als 0,1 sind in Klammern angegeben.

Während der Metaphase I oszillierten Zentromere zwischen den Spindelpolen sowohl beim chiasmabildenden Wildtyp als auch beim chiasmalosen rec12Δ diploide Zellen, wie bereits berichtet (Abbildung 2C elektronisches Begleitmaterial, Filme S1 und S2) [28]. In beiden Zelltypen durchliefen Schwester-Zentromere oft eine vorübergehende Aufspaltung, was unseren früheren Befund bestätigt, dass eine bi-orientierte Anlagerung von Schwesterchromatiden unabhängig von der Chiasma-Bildung auftritt (Abbildung 2 .).b, c) [28]. Die Häufigkeiten der Schwester-Zentromer-Aufspaltung variierten (elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S2A), aber die mit der Bootstrap-Methode erhaltenen mittleren Aufspaltungsfrequenzen pro Zentromer waren signifikant höher in rec12Δ Zellen als in rec12 + Zellen (der Unterschied war auch bei den üblichen T-Prüfung, P < 0,01 Ziffer 2D, +). In unserem vorherigen Bericht waren die mittleren Aufteilungshäufigkeiten nicht signifikant unterschiedlich [28] diese Diskrepanz könnte auf das Vorhandensein einer ungetaggten Kopie von Sid4 in dieser Studie zurückzuführen sein. Die erhöhte Häufigkeit der Schwesterzentromerspaltung in Zellen ohne Chiasma bestätigt, dass Chiasmata die bi-orientierte Anlagerung von Schwesterchromatiden verhindern.

In ark1-so rec12 + Zellen war die mittlere Aufspaltungshäufigkeit signifikant höher als in rec12 + Zellen, was die Annahme stützt, dass die bi-orientierte Anheftung von Schwesterchromatiden in diesen Zellen erhöht war (Abbildung 2D). Obwohl die Unterschiede in anderen nicht signifikant waren, verrückt2Δ oder ark1-so Zellen waren die mittleren Teilungsfrequenzen tendenziell höher in den rec12 + Hintergrund und unten in der rec12Δ Hintergrund (Abbildung 2D elektronisches Begleitmaterial, Filme S3–S6). Diese Tendenzen stimmten mit der Idee überein, dass, wenn der Fehlerkorrekturmechanismus beeinträchtigt ist, die bi-orientierte Anlagerung von Schwesterchromatiden in chiasmabildenden Zellen zunimmt, aber umgekehrt in Zellen ohne Chiasma abnimmt. Der Mechanismus, der die Zentromerbewegung antreibt, ist in diesen mutierten Zellen intakt, wie durch das Fehlen signifikanter Unterschiede bei den mittleren Zentromergeschwindigkeiten, den mittleren Standardabweichungen der Zentromerpositionen und den Diagrammen der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD) von Zentromeren (elektronisches Ergänzungsmaterial) gezeigt wird , Abbildung S2B–D).

Zusätzliche Unterstützung für eine höhere Häufigkeit der bi-orientierten Anlagerung von Schwesterchromatiden in fehlerkorrekturdefekten, chiasmabildenden Zellen ergab eine Analyse der homologen Zentromerpositionen (Abbildung 3 .).ein). In Wildtypzellen waren homologe Zentromere meist nahezu parallel zur Spindelachse positioniert (in Winkeln von weniger als 10° relativ zur Spindelachse), während in verrückt2Δ oder ark1-so Zellen, ihre Positionen waren oft geneigt und nicht parallel (größer oder gleich 10° Abbildung 3B). Darüber hinaus neigten homologe Zentromere dazu, näher positioniert zu sein, was durch eine Verringerung der mittleren homologen Zentromerabstände gezeigt wurde (Abbildung 3b, c). Bemerkenswerterweise wurde eine homologe Zentromer-Kolokalisation während 9,2 % der gesamten Beobachtungszeit in . beobachtet ark1-so Zellen, wurde aber nie in Wildtypzellen beobachtet (Abbildung 3D elektronisches Zusatzmaterial, Tabelle S1). Diese Phänotypen weisen auf eine Verringerung der entgegengesetzten polwärts gerichteten Kräfte hin, die auf die homologen Zentromere ausgeübt werden, was wahrscheinlich eine Zunahme der Häufigkeit der bi-orientierten Anlagerung von Schwesterchromatiden widerspiegelt. Um diese Ansicht zu untermauern, wechselten die homologen Zentromere gelegentlich ihre Position relativ zum SPB, indem sie unabhängig voneinander in oszillierten ark1-so Zellen (6 Schaltvorgänge während 1643 s Beobachtungszeit) (Abbildung 3D elektronisches Zusatzmaterial, Tabelle S1), das die direkte Ausübung entgegengesetzter Kräfte auf jedes der homologen Zentromere anzeigt.

Abbildung 3. Homologe Zentromerwinkel und -abstände und aufspaltende Schwester-Zentromerwinkel. (ein) Winkel der homologen Zentromere relativ zur Spindel und der Abstand zwischen ihnen. Foto zeigt das repräsentative Bild von geneigten homologen Zentromeren. Weiße und rote gestrichelte Linien im Foto zeigen die Achsen der Spindel bzw. der homologen Zentromere. (B) Verteilung der homologen Zentromerwinkel relativ zur Spindel (obere Graphen) und 2D-Diagramme der mittleren Winkel und Abstände der homologen Zentromere in jeder Zelle (untere Graphen). (C) Mittelwerte der mittleren Abstände zwischen homologen Zentromeren pro Zelle. Balken zeigen Mittelwerte der mittleren Distanzen in jeder Zelle. Zeichnungen zeigen die vorhergesagte Beziehung zwischen Bindungen und dem homologen Zentromerabstand. Schwarze Pfeile zeigen Kräfte an, die auf Chromosomen ausgeübt werden. *P < 0,05 (Studenten T-Prüfung). k.A., nicht signifikant (Zahl in Klammern zeigt P-Wert). Zahlen in Klammern am oberen Rand des Diagramms zeigen die Anzahl der untersuchten Zellen. Fehlerbalken zeigen Standardfehler an. (D) Kolokalisation und Positionswechsel homologer Zentromere in ark1-so Zellen. Fotos zeigen Kymographien homologer Zentromere (cen2) und die SPBs. Das rot gepunktete Quadrat im linken Foto zeigt die Kolokalisation von Zentromeren an. Rote Pfeile im rechten Foto zeigen die Vertauschung der homologen Zentromerpositionen relativ zu den SPBs. Horizontaler Balken: 30 s Vertikaler Balken: 1 µm. Beachten Sie, dass SPB#2 gegen Ende der Beobachtung auf dem rechten Foto unscharf war. (e) Spaltungswinkel der Schwesterzentromere und der Abstand zwischen ihnen. Das Bild zeigt sich teilende Schwesterzentromere (Pfeilspitzen) und die SPBs. Gepunktete Linien zeigen Achsen der Spindel (weiß) und der sich teilenden Zentromere (gelb und rot). Balken, 1 µm. Die obere Zeichnung zeigt den Winkel der sich teilenden Zentromere zur Spindelachse, ‘θ’. Die untere Zeichnung zeigt vorhergesagte MT-Anlagerungen von geneigten, sich aufspaltenden Schwesterzentromeren. (F) Verteilung der Winkel von aufspaltenden Schwesterzentromeren. (g) Erhöhte Neigung von sich teilenden Schwesterzentromeren in ark1-so Zellen. Grüne Balken: 0° ≤ θ < 20° braune Balken: 20° ≤ θ < 60° blaue Balken: 60° ≤ θ 90°. +, keine anderen Mutationen. Sechzig, 58, 132, 169, 22 und 109 spaltende Schwester-Zentromere wurden in Wildtyp-, mad2Δ, ark1-so, rec12Δ, mad2Δ rec12Δ und ark1-so rec12Δ Zellen bzw.

Zusätzlich zu diesen Befunden ergab die Analyse der Positionen von sich teilenden Schwesterzentromeren die Möglichkeit, dass zusätzlich zu den Schwesterchromatiden häufig ein einzelnes Chromatid an beiden Polen haftet. Wir stellten fest, dass sich teilende Schwesterzentromere häufig in verschiedene Richtungen geneigt waren, manchmal fast senkrecht zur Spindelachse in beiden rec12 + und rec12Δ Zellen (Abbildung 3z.B elektronisches Zusatzmaterial, Abbildung S3), was darauf hindeutet, dass sich die Spindelbefestigungen dieser Zentromere häufig von der einfachen bi-orientierten Befestigung unterscheiden. Einführung der ark1-so Mutation erhöhte den Anteil der sich teilenden Schwesterzentromere, die in beiden Richtungen in einen senkrechten Winkel relativ zur Spindelachse geneigt waren rec12 + und rec12Δ Zellen (Abbildung 3f, g elektronisches Zusatzmaterial, Abbildung S3), was darauf hindeutet, dass der Fehlerkorrekturmechanismus zur Beseitigung dieser Anhaftungen unabhängig von der Chiasmabildung beiträgt. Angesichts der Korrelation zwischen der geneigten Positionierung homologer Zentromere und der bi-orientierten Anlagerung von Schwester-Zentromeren spiegelten die geneigten Positionen der sich spaltenden Schwester-Zentromere wahrscheinlich die bi-orientierte Anlagerung eines einzelnen Zentromers (merotelische Anlagerung) zusammen mit der bi-orientierten Anlagerung von Schwester-Zentromeren wider (Abbildung 3e, untere Zeichnung).

Unter Berücksichtigung all dieser Ergebnisse kamen wir zu dem Schluss, dass Chiasmata die Bindungskorrekturmuster verändern, indem sie Fehlerkorrekturfaktoren ermöglichen, um die bi-orientierte Bindung von Schwesterchromatiden zu eliminieren.

2.3. Chiasmata-koordinierte homologe Zentromeroszillation

Da davon ausgegangen wird, dass spannungslose Attachments durch die Fehlerkorrekturfaktoren eliminiert werden, versuchten wir zu bestimmen, ob Chiasmata die Spannung über Schwesterzentromere verringern, indem wir die auf die Spindelachse projizierten Zentromerabstände zwischen den Schwestern messen, die wahrscheinlich die Spannung widerspiegeln, die durch polwärts gerichtete Zugkräfte erzeugt wird (elektronische Ergänzung). Material, Abbildungen S3 und S4). Die projizierten Distanzen in Wildtypzellen zeigten zwei unterschiedliche Verteilungsgruppen, die unterschiedliche Distanzbereiche abdeckten, während die Distanzen in rec12Δ Zellen ergaben eine einzige Verteilergruppe (elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S4C). Die Verteilungsgruppe, die den größeren Entfernungsbereich in Wildtypzellen abdeckte, stammte größtenteils aus einem Datensatz einer einzelnen Zelle, wie in Abbildung 2 gezeigt (elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S4C, WT w/o). Ungeachtet des Vorhandenseins oder Fehlens dieses bestimmten Datensatzes unterschied sich der mittlere projizierte Abstand in Wildtyp-Zellen jedoch nicht signifikant von dem von rec12Δ Zellen (elektronisches Zusatzmaterial, Abbildung S4D). Daher konnten wir keine Schlussfolgerung darüber ziehen, ob die Spannung zwischen Schwester-Zentromeren durch Chiasmata verändert wird.

Da Spannungsänderungen in unseren Analysen nicht bewertet werden konnten, untersuchten wir als nächstes die Zentromerdynamik genauer, um einen Hinweis auf die chiasmaabhängige Eliminierung der bi-orientierten Anlagerung von Schwesterchromatiden zu erhalten. Wir stellten fest, dass homologe Zentromere in chiasmabildenden Wildtypzellen dazu neigten, sich in die gleiche Richtung zu bewegen und Bewegungen auf koordinierte Weise umzukehren, während diese Tendenz bei chiasma-fehlenden Zellen nicht offensichtlich war rec12Δ Zellen. Tatsächlich bewegten sich homologe Zentromere während 66,2% und 46,7% der Beobachtungszeit in Wildtyp- und rec12Δ Zellen bzw. (Abbildung 4ein) liegt der letztgenannte Prozentsatz nahe bei der zufälligen Bewegung. Darüber hinaus in ark1-so Zellen erreichten die Zentromere oft den SPB, ohne ihre Bewegungen umzukehren, und kolokalisierten sich mit ihm (Kolokalisierung wurde während 6,4% der Beobachtungszeit in . beobachtet). ark1-so Zellen, aber niemals in Wildtyp-Zellen Abbildung 2C, ark1-so, Pfeile), was darauf hinweist, dass die Zentromerumkehr durch verringerte Aurora B-Aktivitäten beeinflusst wird. Diese Beobachtungen legen einen Zusammenhang zwischen Zentromeroszillation und Attachmentkorrektur nahe.

Abbildung 4. Beziehung zwischen homologen Zentromerbewegungen und Korrelationsanalyse der Zentromerdynamik in der Metaphase I. (ein) Bewegungsrichtung homologer Zentromere. Blaue und gelbe Balken zeigen die Proportionen eines Paares homologer Zentromere an, die sich in die gleiche bzw. entgegengesetzte Richtung bewegen. (B) Autokorrelation (AC) und Kreuzkorrelation (CC) der Zentromergeschwindigkeiten. Die Beziehung zwischen Korrelationswerten (AC oder CC) und Zentromerbewegungen wird gezeigt. Pfeile über den Chromosomen zeigen die Richtung der Zentromerbewegungen an. (C) ACF und CCF der Zentromergeschwindigkeiten in Wildtyp und rec12Δ Zellen. Blaue Linien bzw. rot gepunktete Linien zeigen die mittleren Korrelationswerte und 95 %-Konfidenzintervalle an, die mit der Bootstrap-Methode ermittelt wurden. (D) P-Werte von ACF- und CCF-Werten zu den angegebenen Zeitpunkten. (e) P-Werte zwischen CCF-Werten von Wildtyp und rec12Δ Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten. Sternchen in (D,e) weisen auf signifikante Unterschiede hin. Die Anzahl der untersuchten Zellen und die Gesamtbeobachtungszeiten (in Klammern gezeigt) sind die folgenden. Wildtyp: 14 Zellen (1326,8 s) rec12Δ: 11 Zellen (1193,4 s).

Um die Chiasma-abhängige Koordination der homologen Zentromer-Oszillation zu bestätigen, haben wir die Zentromer-Bewegungen quantitativ mit der Korrelationsfunktion charakterisiert, die zur Charakterisierung der Zentromer-Oszillation nützlich ist (z. B. [39–41]). Insbesondere haben wir die Zentromergeschwindigkeiten relativ zum SPB von allen beobachteten Zellen gesammelt und die Korrelationskoeffizienten zwischen den Geschwindigkeiten, die durch verschiedene Verzögerungszeiten getrennt sind, berechnet (Abbildung 4B). Das Autokorrelationsdiagramm von Wildtypzellen nahm ab und erreichte einen negativen Wert, wenn auch klein, der negative Wert war nach etwa 35 s statistisch signifikant (Abbildung 4 .).CD, WT). Dies deutet darauf hin, dass sich die Zentromerbewegungen in chiasmabildenden Wildtypzellen nach etwa 35 s umkehren (Abbildung 4B, oben rechts). Die Autokorrelationsdiagramme von rec12Δ Zellen zeigten ebenfalls ein ähnliches Muster, was darauf hindeutet, dass Zentromere bei Chiasma-Mangel oszillieren rec12Δ Zellen in ähnlicher Weise (Abbildung 4C,D, rec12Δ). Somit oszillieren Zentromere zwischen den beiden SPBs mit einer schwachen, aber signifikanten Periodizität in einer chiasmaunabhängigen Weise.

Als nächstes untersuchten wir die Korrelation zwischen den Geschwindigkeiten homologer Zentromere durch Kreuzkorrelationsanalyse. Das Kreuzkorrelationsdiagramm von Wildtypzellen stieg von einem negativen Wert an und erreichte bei einem positiven Wert nach etwa 35 s einen Höchstwert (Abbildung 4 .).C), und sowohl die negativen als auch die positiven Werte waren statistisch signifikant (Abbildung 4D, WT). Dies zeigt, dass homologe Zentromere dazu neigen, sich in die gleiche Richtung zu bewegen (Abbildung 4B, unten links) und kehren ihre Bewegungen alle ca. 35 s um (Abbildung 4B, rechts unten). Somit wird die homologe Zentromeroszillation koordiniert. Im Gegensatz dazu ist die Handlung von rec12Δ Zellen unterschieden sich signifikant vom Wildtyp-Plot und zeigten keine signifikante Korrelation zu irgendwelchen Verzögerungszeiten (Abbildung 4Ce, rec12Δ). Dieses Ergebnis weist auf einen Mangel an Koordination bei homologen Zentromerbewegungen hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass Chiasmata die homologe Zentromeroszillation koordinieren.

Wir haben auch Zentromerbewegungen charakterisiert in ark1-so Zellen. Der Kreuzkorrelationswert bei 0 s war wie in Wildtypzellen negativ, was darauf hindeutet, dass sich homologe Zentromere tendenziell in die gleiche Richtung bewegen (elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S5A,B). Allerdings ging die statistische Signifikanz der Korrelationswerte der Auto- und Kreuzkorrelationsplots nach etwa 35 s verloren (elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S5A–C). Diese Beobachtung deutet auf eine abgeschwächte Periodizität der Zentromeroszillation hin und steht im Einklang mit einer veränderten Zentromerumkehr in ark1-so Zellen. Im Gegensatz dazu wurde keine solche Veränderung beobachtet in verrückt2Δ Zellen, deren Hauptdefekt in der SAC-abhängigen Hemmung des vorzeitigen Beginns der Anaphase liegt (elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S5D–F). Die Tatsache, dass Chiasmata die homologe Zentromer-Oszillation koordinieren und dass die Oszillationsdynamik verändert wird in ark1-so Zellen werfen die Möglichkeit auf, dass die Zentromeroszillation mit der Eliminierung von Anhaftungen verbunden ist.

2.4. Dam1 wird für die chiasmaabhängige Attachmentkorrektur benötigt

Um die Beziehung zwischen Bindungsbeseitigung und Zentromeroszillation weiter zu untersuchen, suchten wir als nächstes nach Kinetochormutanten, die bei der chiasmaabhängigen Bindungsbeseitigung defekt sind. Unter den Kinetochorproteinen vermuteten wir, dass Dam1 zur Attachmentkorrektur und Zentromeroszillation beitragen könnte, da Dam1 ein Aurora B-Substrat und eine Komponente des Dam1/DASH-Komplexes ist, von dem angenommen wird, dass er die Chromosomensegregation durch die Kopplung der MT-Verkürzung mit Kinetochorbewegungen vorantreibt [42–50 ] fanden wir, dass die chiasmaabhängige Bindungsbeseitigung in Zellen, die das damm1 Löschung (dam1Δ).

dam1Δ cells exhibited largely normal spore formation and only a slight decrease in spore viability (electronic supplementary material, figure S6A,B). This observation indicates that meiotic chromosome segregation is not severely impaired in dam1Δ cells, being consistent with the fact that Dam1 is not essential for chromosome segregation in mitosis [51]. In addition, both crossover and non-crossover recombination occurred at a wild-type level in dam1Δ cells (electronic supplementary material, figure S6C), indicating that recombination-dependent chiasma formation is normal in dam1Δ Zellen.

Wichtig ist die dam1Δ mutation impaired disjunction of homologous chromosomes (figure 5ein), as seen in mad2Δ und ark1-so mutants [25,52]. Furthermore, the dam1Δ mutation increased equational segregation of sister chromatids in rec12 + cells (figure 5B, left) but it decreased equational segregation in sgo1Δ rec12Δ or haploid meiotic sgo1Δ cells (figure 5B,C). Consistent with the equational segregation frequencies, the mean splitting frequencies of sister centromeres decreased in dam1Δ rec12Δ cells, and although the difference was not significant, the mean splitting frequencies tended to be higher in dam1Δ cells (figure 5D,e electronic supplementary material, figure S2A). In addition, opposing forces exerted on homologous centromeres decreased, as demonstrated by the increase in tilted, non-parallel positioning of homologous centromeres and the reduction in their distances (figure 5F,g). These phenotypes mirror those of error correction-defective mad2Δ und ark1-so mutants (figure 3B,C). Furthermore, as seen in ark1-so cells, the proportion of splitting sister centromeres that were tilted towards a perpendicular direction increased irrespective of chiasma formation (figure 5h,i electronic supplementary material, figure S3). These similarities to error correction-defective mutants strongly suggest that attachment correction is defective in dam1Δ Zellen. Die dam1Δ mutation significantly shortened the mean projected distances (electronic supplementary material, figure S4C,D), suggesting a reduction in opposing forces exerted on sister centromeres.

Figure 5. Effects of the dam1Δ mutation on chromosome attachment to the spindle at meiosis I. (ein) Frequencies of non-disjunction of homologous chromosomes (cen2). (b,c) Equational segregation frequencies of sister chromatids (cen2) in diploid (B) und pat1 haploid cells (C) at meiosis I. In (a–c), chromosome segregation was analysed in more than 50 cells, and bars show averages of more than three independent experiments. Error bars show standard errors. *P < 0.01 **P < 0.005 ***P < 0.0001 (Student's T-test). (D) Separated sister centromeres in dam1Δ Zellen. Maximum projection images of centromeres and SPBs taken every approximately 3 s were arranged from left to right. Arrowheads show separated sister centromeres. Bar, 2 µm. (e) Observation frequencies of centromere splitting obtained by the bootstrap method. Graph shows the mean frequencies per centromere. *P < 0,05 **P < 0.01 n.s., not significant (P-value is shown in parentheses). Error bars show 95% confidence intervals. Numbers in parentheses at the top of the graph indicate the numbers of centromeres examined. +, no other mutations. Means of wild-type and rec12Δ cells were adopted from figure 2. Dotted line distinguishes results of rec12 + und rec12Δ Zellen. (F) Distribution of angles of homologous centromeres relative to the spindle (upper graph), and 2D plots of the mean angles and distances of homologous centromeres in each cell (lower graph). (g) Distances between homologous centromeres. Graph shows means of the mean distances in each cell. Drawings show the predicted relationship between attachments and homologous centromere distances. Black arrows indicate forces exerted on chromosomes. Numbers in parentheses indicate the number of cells examined. *P < 0.001 (Student's T-test). Error bars indicate standard errors. (h) Distribution of angles of splitting sister centromeres. Dotted red lines show the distributions of wild-type and rec12Δ Zellen. (ich) Increased tilting of splitting sister centromeres in dam1Δ Zellen. Green bars: 0° ≤ θ < 20° brown bars: 20̊ ≤ θ < 60° blue bars: 60° ≤ θ ≤ 90°. +, no other mutations. Eighty-three and 56 splitting sister centromeres were examined for dam1Δ und dam1Δ rec12Δ cells, respectively.

The attachment changes did not result from premature anaphase onset or impaired Aurora B localization, as dam1Δ cells exhibited delayed anaphase onset (metaphase duration: 11.4 ± 0.7 min in wild-type cells (n = 10) and 31.5 ± 2.3 min in dam1Δ cells (n = 6)) and Aurora B localization patterns similar to those seen in wild-type cells (pre-anaphase punctate localization adjacent to kinetochores and anaphase spindle localization electronic supplementary material, figure S7A,B).

2.5. Dam1 is required for metaphase centromere oscillation and anaphase A

We also found that centromere oscillation was abolished in dam1Δ Zellen. At metaphase I in both dam1Δ und dam1Δ rec12Δ cells, spindle length tended to increase (electronic supplementary material, figure S8A), perhaps reflecting the loss of inward pulling forces generate by kMT depolymerization [53], and although centromeres were on the spindle, as in wild-type cells, they remained largely still without undergoing oscillation (figure 6ein,B electronic supplementary material, Movies S7–S11). Accordingly, centromere velocities and the standard deviation of centromere positions decreased markedly, and the MSD plots shifted downward (figure 6C electronic supplementary material, figure S8B,C). The auto- and cross-correlation plots exhibited different patterns from those in wild-type and rec12Δ cells (electronic supplementary material, figure S8D–F).

Figure 6. Centromere and spindle dynamics at meiosis I in dam1Δ Zellen. (ein) Behaviour of centromeres (cen2) and the spindle at meiosis I. Green indicates cen2 and SPB, and magenta indicates the spindle. Numbers indicate time (in minutes). Arrows and arrowheads indicate the SPB and cen2, bzw. White lines indicate cell outlines. Bar, 5 µm. (B) Changes in centromere and SPB positions at metaphase I in dam1Δ und dam1Δ rec12Δ Zellen. Left images show kymograph of centromeres (cen2) and SPBs and right graphs show changes in centromere–SPB and SPB–SPB distances. Vertical and horizontal bars of kymographs show 2 µm and 30 s, respectively. (C) Mean centromere velocities. Dotted lines distinguish results of rec12 + and rec12Δ Zellen. (D) Changes in centromere–SPB and SPB–SPB distances during anaphase I. (e) Loss of anaphase A centromere movements in dam1Δ Zellen. Photos show changes in centromere positions during anaphase I. Numbers show time in minutes from the start of anaphase. Dotted lines and arrowheads in photos show positions of SPB and cen2, bzw. Bar, 2 µm. Graph shows the mean centromere–SPB distances during metaphase I (Meta) and anaphase I (Ana). Numbers of centromeres examined are shown in parentheses. A dotted line in graph distinguishes results of wild-type and dam1Δ Zellen. Error bars show standard error. *P < 0,05 **P < 0.01 ***P < 0.0005 n.s., not significant (Student's T-test).

In addition to centromere oscillation, anaphase poleward centromere movements were impaired in dam1Δ Zellen. Upon anaphase onset, homologous centromeres normally separate from each other by poleward movements (anaphase A), and then by spindle elongation (anaphase B) (figure 6ein,D,e, WT) [23]. In dam1Δ cells, however, anaphase poleward centromere movements rarely occurred, and their distances from the nearest SPBs were largely unchanged (figure 6a,d,e electronic supplementary material, figure S8G,H). Nonetheless, homologous centromeres successfully separated from each other as the spindle elongated (figure 6ein,D), indicating that homologous centromeres undergo anaphase B without undergoing anaphase A. Notably in this regard, anaphase A movements were impaired in rec12Δ cells due to bi-oriented attachment of sister chromatids (electronic supplementary material, figure S8H) [28]. The lack of centromere oscillation and anaphase A are consistent with previously reported dam1Δ phenotypes: kinetochores remain at the MT ends for a long time (more than 20 min) and inhibit MT disassembly after kinetochore attachment to the MT ends [43,54], and chromosomes frequently fail to reach the SPB during mitotic anaphase [51,55]. The coincidental impairment of centromere oscillation, together with the attachment correction defect, provides further support for a link between attachment correction and centromere oscillation.

3. Discussion

3.1. Roles of chiasmata and Dam1 in attachment correction

In this study, we investigated whether chiasmata cause elimination of bi-oriented attachment via the error correction mechanism by analysing the attachments in mad2Δ oder ark1-so cells forming or lacking chiasmata. Analysis of sister chromatid segregation, transient sister centromere splitting and homologous centromere positioning collectively revealed that in the mad2Δ und ark1-so backgrounds, bi-oriented attachment of sister chromatids increased in chiasma-forming cells, but mono-oriented attachment increased in chiasma-lacking cells. Presumably, sister chromatids are initially frequently bi-oriented irrespectively of chiasma formation, but the error correction mechanism eliminates bi-oriented attachment specifically in chiasma-forming cells. Less prominent impacts of the mad2Δ mutation on attachments than those of the ark1-so mutation probably resulted from distinct mutation-dependent defects. Die mad2Δ mutation decreases the time available for correction but does not compromise attachment elimination unlike the ark1-so Mutation in mad2Δ cells, despite attachment elimination, the shortage of the correction time probably resulted in incomplete attachment correction. Together, these observations indicate that chiasmata enable error correction factors to eliminate bi-oriented attachment of sister chromatids that are otherwise not eliminated.

A previous study reported that mad2 und ark1 mutations increased bi-oriented attachment of sister chromatids in the absence of chiasmata [31], contradicting the results of this study. Die ark1-as mutation and a different centromere marker used in that previous study may have affected attachments. In addition, it is important to note that pairing of homologous centromeres, which occurs during meiotic prophase, may affect the initial kinetochore–MT interaction. However, the contribution of centromere pairing to the observed differences between chiasma-forming and chiasma-lacking cells is probably negligible because centromere pairing occurs at a largely normal level in rec12Δ cells [56] and equational segregation frequencies in haploid meiotic cells, which lack pairing, were almost the same as those in rec12Δ cells (figure 1e,F).

In addition to bi-oriented attachment of sister chromatids, our analysis of sister centromere tilting suggested frequent occurrence of merotelic attachment and its elimination by the error correction mechanism, irrespective of chiasma formation. Indeed, merotelic attachment is frequently observed in chiasma-forming meiotic cells as well as in chiasma-lacking mitotic cells [57,58]. Tilted centromere positioning may have resulted from only one of the sister centromeres interacting with MT (monotelic attachment) or from detachment of sister centromeres from MTs after separation. However, given the active mobilities of splitting sister centromeres (electronic supplementary material, figure S2B–D) and the stable end-on attachment seen in dam1Δ cells [43,54], these events are likely to be rare. It is also possible that both sister centromeres interact with MTs extending from the same pole (syntelic attachment), one laterally and the other at the ends, as in vertebrate cells [59], and that bi-directional lateral sliding of one of the centromeres causes tilted positioning. However, the consistency of the frequencies of sister centromere splitting with those of equational segregation suggests that syntelic attachment is probably transient, if it occurs at all.

We also found that the dam1Δ mutation increased bi-oriented attachment of sister chromatids in chiasma-forming cells and increased mono-oriented attachment in chiasma-lacking cells. This suggests that Dam1 plays a crucial role in the attachment correction. The increased tilting of splitting sister centromeres seen in rec12 + dam1Δ cells further supports this notion. Weil dam1Δ cells exhibited delayed anaphase onset, Dam1 must contribute to attachment elimination via an SAC-independent pathway. Given that Dam1 plays a crucial role in kinetochore–MT interaction and is a substrate of Aurora B [42,51,60], we speculate that the Dam1 complex is directly involved in the attachment elimination process as a component of the Aurora B regulatory pathway.

3.2. Functions of chiasmata and Dam1 in centromere oscillation

Using the correlation functions, we showed that centromeres oscillated irrespectively of chiasma formation and that chiasmata coordinated homologous centromere oscillation. Various experimental- and/or simulation-based studies demonstrated that coordinated oscillation of sister chromatids depends on the tension generated by sister centromere cohesion [10,61–71]. Given this notion, it is likely that coordinated homologous centromere oscillation similarly depends on tension generated by chiasmata. During oscillation of mitotic sister centromeres, kinetochore-interacting MT bundles (kMTs) extending forward of the moving centromeres (leading kMTs) drive centromere movements by their disassembly, whereas those extending rearward (trailing kMTs) assemble (electronic supplementary material, figure S9A, centromere movement and kMT dynamics) [4–6,10], and switching of either the leading or trailing kMTs induces reversal of centromere movements (electronic supplementary material, figure S9A, centromere movement and kMT dynamics) [72]. In fission yeast, Kinesin-8 motors, Klp5 and Klp6, that promote disassembly of longer kMTs induce kMT switching in the proximity of the equator [41,71,73,74]. The kMT switching causes transient centromere relaxation or stretching (electronic supplementary material, figure S9A, mitosis, transition state), which likely induces coordinated assembly/disassembly switching of the other kMTs through force-dependent changes in MT dynamics [75–78]. During homologous centromere oscillation, the kMTs probably undergo assembly and disassembly in a similar manner, and the chiasma-dependent link generates a temporal tensile change that coordinates assembly/disassembly switching of the kMTs (electronic supplementary material, figure S9A, meiosis I).

We also found that Dam1 was essential for centromere oscillation and anaphase A poleward centromere movements. This finding indicates that centromere oscillation and anaphase A depend on the same mechanism. The Dam1 complex probably drives centromere movements by coupling MT disassembly to centromere movement [49,50]. It may also promote MT disassembly, as kMT shortening is inhibited after kinetochore capture in dam1Δ cells [43,54,79]. Despite the lack of centromere oscillation and anaphase A, kinetochore–MT interactions were not eliminated in dam1Δ cells, as demonstrated by sister centromere splitting and anaphase B centromere movements. Therefore, a factor(s) in addition to Dam1 may cooperatively drive centromere movement. The factors that are likely to mediate kinetochore–MT interaction in dam1Δ cells include the Ndc80 complex, a distinct kinetochore–MT interface factor and the Klp5/Klp6 complex, which can couple MT disassembly to cargo movement like the Dam1 complex and play crucial roles in centromere oscillation and/or chromosome segregation [71,73,74,80–87]. Indeed, kinesin-8 motors are essential in dam1Δ cells [51] and contribute to stable kinetochore–MT interaction during centromere oscillation [73].

3.3. Functions of chiasma and Dam1 in attachment elimination

The precise mechanism of chiasma-dependent attachment elimination and the mechanism of Dam1-dependent attachment elimination itself remain unclear. It was previously proposed that chiasmata eliminate bi-oriented attachment of sister chromatids by generating a chromosome configuration that arranges sister kinetochores outward and the Aurora B-enriched region inward [31,88]. In this model, poleward pulling brings improper attachment sites close to the Aurora B-enriched region, leading to the elimination of the attachments. However, this configuration requires firm association of sister centromeres. When sister centromeres separate as seen in our study, improper attachment sites would barely approach the Aurora B-enriched region (electronic supplementary material, figure S9B). Therefore, the validity of this model remains debatable.

It is possible that chiasmata eliminate bi-oriented attachments by reducing tension across sister centromeres. Indeed, although we could not observe significant difference between projected inter-sister centromere distances of rec12 + und rec12Δ cells, a subset of the distances in the rec12 + cells covered a slightly shorter distance range than those covered in rec12Δ cells, suggesting a reduction in tension. However, in a rec12 + cell shown in figure 2, the projected centromere distances were comparable to or greater than those in rec12Δ cells (electronic supplementary material, figure S4C), suggesting that at least in this particular cell, tension was probably not reduced. Nonetheless, the bi-oriented attachment was eliminated as demonstrated by re-association of the splitting sister centromeres (figure 2B,C, WT). Therefore, we speculate that chiasma-dependent attachment elimination is not solely dependent on the reduction in overall tension.

Our finding that both chiasmata and Dam1 contribute to centromere oscillation raises the possibility that attachment elimination is coupled to centromere oscillation. This possibility is supported by our finding that homologous centromere oscillation dynamics are altered in the error correction-defective ark1-so Mutant. One possible explanation is that centromere oscillation causes elimination of erroneous attachments. In chiasma-forming cells, when improperly attached homologous centromeres undergo oscillation via coordinated disassembly and assembly of the leading and the trailing kMTs (electronic supplementary material, figure S9C, Meiosis I), stochastic and/or length-dependent initiation of assembly/disassembly MT switching may give assembling kMT ends a chance to experience a chiasma-dependent minus end-directed load at improper attachment sites. The minus end-directed load applied to the assembling kMT ends may bring attachment sites close to the inner centromere region, inducing Aurora kinase-dependent kMT detachment. Alternatively, the minus end-directed load may cause kMT detachment due to the intrinsically weak resistance of the interaction between assembling MTs and the kinetochore to a minus end-directed load. Indeed, attachment of Stu2, a XMAP215/Dis1 family kinetochore component in budding yeast, to assembling MT ends can withstand a tensile force of approximately 4 pN under plus end-directed load [89], whereas attachment of Xenopus XMAP215 can withstand a force of only approximately 1 pN force under minus end-directed load [90]. In this model, chromosome oscillation actively eliminates improper attachments by applying a load to the improper attachment sites, and the lack of chiasmata or centromere oscillation impairs attachment elimination.

An alternative, but not mutually exclusive, possibility is that attachment elimination requires an attachment property that enables centromere oscillation. We found that centromere oscillation is impaired in ark1-so Zellen. In addition, expression of mutant forms of the kinetochore component Ndc80 that cannot be phosphorylated by Aurora B inhibits centromere oscillation [81,83]. These observations indicate that centromere oscillation requires Aurora B-dependent kinetochore phosphorylation. In addition, variants of Dam1 or Ndc80 bearing Aurora B-phosphomimetic mutations form diffusible attachment to the MT lattice and exhibit diffusion-like movements on the MT [44,46,91]. Therefore, centromere oscillation probably depends on Aurora B-dependent diffusible attachment. Because diffusion activities of kinetochore components increase as their MT affinities decrease, only diffusible attachments may allow attachment elimination. In the absence of Dam1, attachment may become non-diffusible and non-eliminable, resulting in impairment of both centromere oscillation and elimination of erroneous attachments. Further close investigation of the effects of the phospho-mutant forms of Dam1/Ndc80 on attachment correction and centromere oscillation would be important to verify this possibility.

The chromosome oscillation-dependent mechanism can also account for the elimination of merotelic attachment of a single chromatid in a chiasma-independent manner and in both mitosis and meiosis. Perhaps, cohesin-dependent coordinated oscillation of sister chromatids eliminates merotelic attachment in the same way that coordinated homologous chromosome oscillation eliminates bi-oriented attachment of sister chromatids (electronic supplementary material, figure S9C, mitosis). Consistently, a loss of sister chromatid cohesion causes merotelic attachment in mitosis [92,93], and in dam1Δ cells, impaired centromere oscillation was accompanied by increased sister centromere tilting, a probable outcome of merotelic attachment, irrespectively of chiasma formation (figure 5ich). Furthermore, the oscillation-dependent mechanisms likely contribute to attachment elimination in vertebrates, although the mechanisms are not completely the same, as demonstrated by additional contribution of Aurora A kinase to centromere oscillation and attachment correction [94,95].

The oscillation-dependent mechanism does not deny the importance of overall tension across sister centromeres in attachment elimination. It is clear that as the number of properly attached kMTs increases, tension across sister centromeres increases. Gradual elevation of tension may incrementally decrease kinetochore phosphorylation levels, resulting in an incremental increase in MT binding affinity of kinetochores, as in the case of Ndc80 phosphorylation [91]. An alternative, but not mutually exclusive, possibility is that tension greater than some threshold alters the kinetochore phosphorylation state. Kinetochore phosphorylation is regulated by phosphatases in addition to Aurora B [96], and the antagonistic actions of these enzymes may robustly maintain the kinetochore phosphorylation state during metaphase, as suggested for antagonistic regulatory systems [97]. However, once tension exceeds the threshold, the kinetochores may be completely dephosphorylated by the kinetochore regulatory system [96,98,99]. In either case, tension converts the metaphase-type diffusible, correctable attachments to the anaphase-type non-diffusible, non-correctable attachments, linking establishment of proper attachments with the metaphase-to-anaphase transition. This scenario is consistent with the well-established relationship between tension and loss of Aurora-dependent phosphorylation and attachment stabilization (e.g. [12,27,100, 101]). In addition, in this scenario, a reduction in tension leads to an increase in kinetochore phosphorylation, making the kinetochore state preferable for attachment correction this can account for correction of merotelic attachment induced by reduced tension [102].

In this study, we showed that chiasmata and Dam1 differentially contribute to the elimination of erroneous attachments and centromere oscillation. These findings raise the possibility that attachment elimination is coupled with centromere oscillation. The precise mechanisms of chiasma-dependent or Dam1-dependent attachment elimination, as well as the relationship between centromere oscillation with attachment elimination, remain to be elucidated. However, our findings and the suggested relationship will undoubtedly shed new light on understanding of the mechanisms of attachment correction and centromere oscillation. Because chromosome missegregation is associated with various diseases or disorders, including tumorigenesis and birth-related Down's syndrome, our findings may be of clinical importance.

4. Material and methods

4.1. Yeast strains, media and basic genetical methods

Strains used in this study are shown in electronic supplementary material, tables S2 and S3. Media and basic genetical methods used in this study were described previously [103]. Die dam1 deletion strain was generated by replacing the entire dam1 gene with the G418-resistance gene by a PCR-based method [104,105].


Einführung

Although the number of reciprocal recombination events at meiosis is similar for organisms with widely different genome sizes such as the mouse and lily (which have between 20 and 50 events), the number of DNA-DNA interactions that are recognized by RAD51/DMC1p immunocytology at prophase of meiosis is much higher (250 for the mouse and more than 2000 for lily)(Anderson et al., 2001). It follows that most or all of these early interactions do not necessarily function in the formation of reciprocal events. Conceivably, the numbers relate to genome size, 3.3 pg for the mouse and 141 pg for lily. However, the genome sizes differ by a factor of 43, whereas the number of RAD51/DMC1 foci in the mouse differs only by a factor of 10 from the lily. A better correlate appears to be the length of paired prophase chromosomes, as measured by the total length per nucleus of the synaptonemal complexes, SCs, which are the axes of the bivalents (about 200 μm for the mouse and about 3000 μm for lily). The tentative conclusion is that these foci, which are associated with the chromosome cores and SCs, function in SC formation(Anderson et al., 2001). Synaptic failure in the absence of RAD51/DMC1 foci in SPO11 -/- mice also suggests a role for early nodules in synapsis(Baudat et al., 2000Romanienko and Camerini-Otero,2000).

Molecular models for the resolution of DNA-DNA interactions without reciprocal recombination have been discussed by Gilbertson and Stahl(Gilbertson and Stahl, 1996)and involve helicase-topoisomerase activity to resolve joint molecules. The acquisition of replication protein A, RPA and Bloom mutated protein, BLM, at the RAD51/DMC1 sites might be the physical manifestation of the models —RPA may stimulate BLM-RecQ helicase activity(Brosh et al., 2000) in concert with topoisomerase IIIa (Johnson et al., 2000) to resolve the early DNA-DNA interactions at the RAD51/DMC1 sites.

The development of reciprocal genetic exchange events at meiosis in many fungi, plants and animals can be monitored at several levels: (1) at the chromosomal level by chiasmata, which are the sites of reciprocal recombination (Jones, 1987)(2) by the recombination nodules, RNs, which correlate with genetic and cytological patterns of recombination(Carpenter, 1975Carpenter, 1979Albini and Jones, 1988) and(3) by the MLH1p sites, which are associated with crossover sites(Anderson et al., 1999)

Nodules are SC-associated, electron-microscope-defined structures that have been reported in the meiocytes of protists, fungi, plants and animals. In early meiotic prophase, `nodules' refer to the several hundreds of small dense bodies about 100 nm in diameter that are associated with chromosome cores and SCs and contain the RAD51/DMC1 proteins in lily(Anderson et al., 1997), mouse and human (Haaf et al., 1995Moens et al., 1997Barlow et al., 1997). Since the correlation of these structures with reciprocal recombination is tenuous, they are usually referred to as `early nodules', EN. The late RNs, as originally defined by Carpenter (Carpenter,1975) in Drosophila melanogaster oocyte SCs, correspond in number and location to reciprocal recombinant events in normal and mutant D. melanogaster. In the rat, `late RNs' are well defined electron-dense bodies of variable shape and size, 100 to 200 nm, located on the mature SC at pachytene stage VII of the spermatogenic pathway but not in earlier pachytene stages I to V (Clermont,1972 Moens,1978). Cross-sectioned SCs and whole-mount, shadow-cast EM preparations show that RNs are located on the surface of the SC either along the central element or obliquely across the SC(Fig. 7). The reported number of late RNs (19 to 22 per nucleus) in complete EM-reconstructed rat-pachytene nuclei, their non-random distribution and their association with MLH1 (Mut L homolog) protein in rat and mouse (this report), agree with their proposed function in reciprocal recombination by Carpenter(Carpenter, 1975Carpenter, 1979). A number of publications have assigned various proteins to RNs but the assignments have not previously been verified by EM demonstration of these proteins on the RNs.

Definition of a rat recombination nodule, RN, in a shadow-cast preparation of an SC. (A) The SC consists of two lateral elements, le, and a median central element. (B) Occasionally RPA can be detected at these RNs. Mouse RNs are somewhat smaller and less distinct and are therefore visualized with PTA in the other illustrations. The width of the SC is about 200 nm.

Definition of a rat recombination nodule, RN, in a shadow-cast preparation of an SC. (A) The SC consists of two lateral elements, le, and a median central element. (B) Occasionally RPA can be detected at these RNs. Mouse RNs are somewhat smaller and less distinct and are therefore visualized with PTA in the other illustrations. The width of the SC is about 200 nm.

We report the events in individual mouse and rat spermatocyte nuclei from early to late meiotic prophase in terms of chromosome core behavior and associated protein complexes. The immunofluorescence observations are refined and detailed by immunoelectron microscopy of the recombination-related proteins and by EM visualization of RNs. These observations are interpreted in the context of the chromosome synapsis and reciprocal recombination and discussed in relation to reports by others on these events.


Perspectives and Future Aims

The mechanisms behind inverted meiosis in holocentric organisms are currently unknown. The occurrence of inverted meiosis demands modification in the conserved mechanisms of meiotic cohesion and chromosome segregation. New adaptations and differential regulation of meiotic cohesions such as REC8 and centromere cohesion guardians such as shugoshins are expected to have happened. Additionally, modification of the spindle attachment machinery also should be expected due to an alternative centromeric organization. Furthermore, the observed chiasmata formation between holocentric chromosomes demands adaptations of the mechanisms that prevent recombination at or around centromeres. The limited knowledge of holocentromeres and close relatives of Cyperaceae limits us to speculate about what to expect in terms of adaptations of the meiotic recombination machinery to holocentricity. Future studies aiming the molecular characterization of such mechanisms will be of interest for evolutionary and comparative biology studies.


Mitgliedschaften

Division of Evolutionary Biology, LMU Munich, Planegg-Martinsried, Germany

Joshua V. Peñalba & Jochen B. W. Wolf

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Beiträge

J.V.P. wrote the manuscript. J.B.W.W. edited the manuscript before submission. Both authors researched data for the article and substantially contributed to the discussion of content.

Corresponding authors


Variability of Chiasma Frequencies in Different Tomato Species

This article presents the results of comparative studies of the frequency and distribution of chiasmata in pollen mother cells (PMCs) in five diploid tomato species, Solanum lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. habrochaites, und S. neorickii, and one autotetraploid species, S. pimpinellifolium. It was established that under the same growing conditions, the total chiasma frequency in the cell depended on the species. At the same time, the green-fruited species S. peruvianum, S. neorickii, und S. habrochaites differed in distal chiasma frequency, while the red-fruited species S. lycopersicum und S. pimpinellifolium differed in interstitial chiasma frequency. It was shown that the total chiasma frequency in PMCs of plants of one species is a stable index of recombination potential that does not depend on the growing conditions. The redistribution between distal and interstitial chiasmata was found to be more variable, depending on the species, year, geographic growth conditions. In autotetraploid, the chiasma frequency per bivalent was lower than that in diploid S. pimpinellifolium plants, primarily due to interstitial chiasmata, the frequency of which remained at the level characteristic for diploid plants. It was concluded that the recombination plasticity of the tomato genomes was due to the redistribution of chiasmata along bivalents, and not to the change in their number in the cell.


Einführung

Historically, chromosomal rearrangements have long been recognized as a major driving force promoting divergence (White, 1978), but it was only recently that the role of rearrangements as recombination modifiers has been recognized and formalized in the recombination suppression models of chromosomal speciation (Noor et al., 2001 Rieseberg, 2001 Navarro and Barton, 2003 Ayala and Coluzzi, 2005). Thus, the emphasis is no longer on the decrease in fitness of chromosomal hybrids, but on the suppression of recombination between the rearranged chromosomes, resulting in a partial barrier to gene flow between populations. The association with speciation events lies in the tight linkage between the rearrangements and reproductive isolation or locally adaptive genes owing to the suppression of recombination in chromosomal heterozygotes. Thus, rearrangements can contribute to the persistence of reproductive isolation genes in the face of gene flow for a longer time than if they were absent (Noor et al., 2001), and extend the action of linked isolation genes over larger genomic regions than if no rearrangements were present (Rieseberg, 2001 Butlin, 2005). The emergence of the recombination suppression models stimulated a considerable amount of both empirical (for example, Lowry and Willis, 2010 Ayala et al., 2011 MacGaugh and Noor, 2012 Farré et al., 2013) and theoretical (for example, Kirkpatrick and Barton, 2006 Feder and Nosil, 2009 Faria and Navarro, 2010) studies exploring the operational conditions, mechanisms and processes involved. Most, if not all, of these analyses have focused on inversions and reciprocal translocations, whereas the most widespread rearrangement, Robertsonian (Rb) fusion/fission, has received considerably less attention (King, 1993).

The aim of the present study is to assess the effect of heterozygosity for Rb fusions on recombination patterns. These rearrangements consist of the joining of two nonhomologous acrocentric chromosomes by the centromere to form one biarmed chromosome. The house mouse, Mus musculus domesticus, was chosen as the biological model for several reasons. First, extensive chromosomal diversity through fixation of Rb fusions occurs throughout its distribution and all chromosomes, except the sex pair, are involved in Rb fusions in wild populations (Piálek et al., 2005). Second, underdominance levels of simple Rb heterozygotes, that is, carrying trivalents formed by the pairing of Rb fusions with the two homologous acrocentrics, are well documented in this subspecies. In particular, the data indicate that heterozygosity for a single-Rb fusion has a limited effect on hybrid fitness (Hauffe and Searle, 1998 Sans-Fuentes et al., 2010) in this case, there will be almost no constraint on its fixation probability, but conversely, its contribution to postmating isolation will be extremely reduced unless it is associated with changes in recombination pattern. Finally, several studies have indicated a reduction in crossover rates in wild homozygous Rb vs standard mice in the proximal centromeric regions (Bidau et al., 2001, Castiglia and Capanna, 2002 Dumas and Britton-Davidian, 2002 Merico et al., 2003, 2013). Analyses of recombination rates in wild Rb heterozygotes have also been assessed but involve, in most cases, polymorphic individuals, that is, carrying variable numbers of Rb bivalents and trivalents, making it difficult to disentangle the effect of each meiotic type of configuration (Wallace et al., 1992 Bidau et al., 2001 Castiglia and Capanna, 2002 Capilla et al., 2014). In contrast, extensive analyses of recombination patterns in single-Rb heterozygotes have been performed by genetic assays in crosses between different laboratory strains (Davisson and Akeson, 1993). Recombination suppression was recorded in almost all of the Rb fusions tested, but the extent of the suppression varied between chromosomes and crosses, suggesting an influence of the genetic background on this trait. The present analysis is performed on male and female laboratory-bred F1 hybrids (2n=31) between two chromosomal races of the house mouse (2n=40 and 2n=22) from Tunisia, as well as wild-caught mice spanning the hybrid zone between two North Italian races (2n=40 and 2n=22). In both cases, structural genomic differences exist between races, as all chromosomes except two pairs (a small acrocentric pair and the sex chromosomes) are involved in Rb fusions. The Tunisian F1 hybrids exhibit a homogeneous meiotic architecture in which all Rb chromosomes are present as trivalents, whereas the number of Rb fusions (heterozygous and homozygous) was variable in the Italian mice. Although recent cytogenetic estimates of recombination rely on the analysis of MLH1 foci (mismatch repair protein) on synaptonemal complexes (Anderson et al., 1999), recombination was assessed in the present study by meiotic chiasma analyses permitting direct comparisons with previously published data (Dumas and Britton-Davidian, 2002). The effects of Rb heterozygosity on recombination patterns were identified by comparing the chiasma-based assessment of the Tunisian F1 mice with those previously recorded for the Tunisian parental standard and Rb races from which they originated (Dumas and Britton-Davidian, 2002). An estimate of variation in recombination rates was approached by comparison with the data from the Italian samples. From this, we infer the extent and genomic distribution of the barrier to gene flow between chromosomal races and discuss the relevance of Rb rearrangements to reproductive isolation and divergence processes.


Genome and Gene Structure∗

4.2.4 Meiotic Recombination

Meiotic recombination [1] refers to the reciprocal physical exchange of chromosomal DNA between the parental chromosomes and occurs at meiosis during spermatogenesis and oogenesis, serving to ensure proper chromosome segregation. During the four-strand stage of meiosis, two duplex DNA molecules (one from each parent) form a hybrid, and a single strand of one duplex is paired with its complement from the other duplex. Single-stranded DNA is exchanged between the homologous chromosomes, and the process involves DNA strand breakage and resealing, resulting in the precise recombination and exchange of DNA sequences between the two homologous chromosomes. This process is highly efficient and does not usually result in mutations at the sites of recombination. Recombination thus shuffles genetic material between homologous chromosomes, generating much of the genetic diversity that characterizes differences between individuals, even within the same family.

The frequency of recombination between two loci along a chromosome is proportional to the physical distance between them, and historically, this provided the basis for defining the genetic distance between loci, allowing genetic maps to be constructed. The genetic proximity of two loci is measured by the percentage of recombination between them a map distance of 1 centimorgan (cM) indicates 1% recombination frequency between the two loci. The human genome sequence has made it possible to compare genetic and physical distances and to analyze variations in recombination frequency in different chromosomal regions. On average, 1 million bp (1 Mb) correspond to 1 cM (1% recombination frequency). However, there is a tremendous local variation between individual chromosomes and among particular chromosomal regions. For example, the average recombination rate is higher in the short arms of chromosomes and at the distal segments of the arms but overall is suppressed near the centromeres. There is also a significant variation in the recombination rates between the sexes, with 1.6-fold more recombination on average in females relative to males. On average, female recombination is higher at the centromeres and male recombination is higher at the telomeres [2] .


Antikörpervariation

In B-Zellen weist die variable Region des Gens der leichten Kette 40 variable (V) und fünf verbindende (J) Segmente auf. Ein Enzym namens DNA-Rekombinase schneidet die meisten dieser Segmente zufällig aus dem Gen heraus und spleißt ein V-Segment mit einem J-Segment. Während der RNA-Verarbeitung werden alle bis auf ein V- und J-Segment herausgespleißt. Rekombination und Spleißen können zu über 10 6 möglichen VJ-Kombinationen führen. Als Ergebnis hat jede differenzierte B-Zelle im menschlichen Körper typischerweise eine einzigartige variable Kette. Die konstante Domäne, die nicht an einen Antikörper bindet, ist für alle Antikörper gleich. Die große Vielfalt der Antikörperstruktur führt zu einer großen Vielfalt von Antigenen, die Antikörper binden und erkennen können.

Ähnlich wie bei TCRs (T-Zell-Rezeptoren) und BCRs (B-Zell-Rezeptoren) wird die Antikörperdiversität durch die Mutation und Rekombination von etwa 300 verschiedenen Gensegmenten erzeugt, die die variablen Domänen der leichten und schweren Kette in Vorläuferzellen kodieren, die dazu bestimmt sind, B-Zellen zu werden. Die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten interagieren, um die Bindungsstelle zu bilden, durch die ein Antikörper ein spezifisches Epitop auf einem Antigen binden kann. Die Anzahl der wiederholten konstanten Domänen in Ig-Klassen (unten diskutiert) ist für alle Antikörper, die einer spezifischen Klasse entsprechen, gleich. Antikörper sind strukturell der extrazellulären Komponente der BCRs ähnlich. Die Reifung von B-Zellen zu Plasmazellen erfolgt, wenn die Zellen die Fähigkeit erlangen, den Antikörperanteil ihres BCR in großen Mengen zu sezernieren.


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