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War HindII die erste Restriktionsendonuklease, die extrahiert wurde?

War HindII die erste Restriktionsendonuklease, die extrahiert wurde?


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Hintergrund:

Geleitet von Wikipedia und PMC fand ich dieses Papier von Hamilton O. Smith. und .Daniel Nathans.

Ein Restriktionsenzym ist eine Komponente eines Restriktions-Modifikationssystems einer bestimmten Spezifität innerhalb eines Organismus. Das R-MT-System besteht aus zwei enzymatischen Komponenten, einer Restriktionsendonuklease und einem Modifikationsenzym mit ähnlicher (oder identischer) Erkennungsspezifität. Wir möchten vorschlagen, dass die Gattungs-Art-Bezeichnung als R-M-Systemname nach den folgenden Regeln verwendet wird.

(1) Der Gattungs- und Artname des Wirtsorganismus wird durch den Anfangsbuchstaben der Gattung und die ersten beiden Buchstaben der Art zu einer dreibuchstabigen Abkürzung in Kursivschrift identifiziert. Zum Beispiel: E. coli, Eco und H. influenzae, Hin.

(2) Die Stamm- oder Typbezeichnung folgt der Gattungs-Arten-Abkürzung in nicht kursiv gedruckten Symbolen, z.B. EcoB oder EcoK. In Fällen, in denen das R-M-System durch ein Virus oder ein Pla,smid genetisch spezifiziert ist, wird die kursive Gattungs-Spezies-Abkürzung des Wirts angegeben und das Symbol für das extrachromosomale Element folgt in nicht-kursiver Schrift, z. EcoPl, EwRI usw. In gelegentlichen Fällen, in denen es notwendig sein könnte, den Wirtsstamm sowie das extrachromosomale Element anzugeben, kann das Stammidentifikationssymbol in Klammern eingefügt werden, z. Öko(B)Pl.

(3) Wenn ein bestimmter Wirtsstamm mehrere verschiedene R-M-Systeme aufweist, werden diese durch römische Ziffern identifiziert, somit wären die R-M-Systeme von H. injluenzae-Stamm d HindI, HindII, HindIII usw.

Hauptfrage:

Jetzt HindII war -

  1. extrahiert aus haemophilus influenzae
  2. der Stamm war Stamm Rd, also D
  3. und es war die 2. Enzym isoliert werden? Daher II.

Wie ist es also mit dem ersten Typ II RE?

H. O. Smith, K. W. Wilcox und T. J. Kelley, der 1968 an der Johns Hopkins University arbeitete, isolierte und charakterisierte die Erste Restriktionsnuklease, deren Funktion von einer spezifischen DNA-Nukleotidsequenz abhing. (Wiki)


Die Erklärung hier ist ganz einfach: HindI, obwohl ich vorher isoliert/entdeckt wurde HindII, ist a tippe I Restriktionsenzym, kein Typ II:

Ein Restriktionsenzym vom Typ I aus Haemophilus influenzae, Hind I, das Adenosin-5'-triphosphat und 5-Adenosylmethionin benötigt, wurde auf seine Aktivität bei der Transfektion und Transformation von Desoxyribonukleinsäure (DNA) untersucht [… ] Die meisten Restriktionsenzyme aus Hämophilus gehören nach dem von Boyer vorgeschlagenen Klassifikationssystem zu den Typ-II-Restriktionsenzymen. Diese Enzyme benötigen für ihre Wirkung nur Mg2+, im Gegensatz zu Typ-I-Enzymen, die Mg2+, Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und S-Adenosylmethionin (SAM) benötigen.

(Quelle: Biologische Eigenschaften eines Haemophilus influenzae-Restriktionsenzyms, Hind I)

Somit ist in der Tat HindII war der erste Typ II Restriktionsenzym isoliert/entdeckt, da gut dokumentiert.


PS: Als Bonus hier eine Tabelle mit den wichtigsten Unterschieden zwischen den RE-Typen I, II, III und IV (Quelle: Thermo Fisher Scientific):

Tippe I:

  • Multi-Untereinheiten-Protein mit sowohl Restriktions- als auch Methylierungsaktivitäten
  • ATP-Anforderung
  • Spaltstelle in variabler Entfernung von der Erkennungsstelle

Typ II:

  • Spezifische Erkennungssequenz
  • Spaltstelle innerhalb oder nahe der Erkennungssequenz
  • Erzeugt 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini an der Spaltstelle
  • Mg2+ Anforderung für die meisten

Typ III:

  • Zweiteilige Erkennungssequenz in inverser Orientierung
  • Spaltstelle in einem bestimmten Abstand von einer der Erkennungssequenzen
  • ATP-Anforderung

Typ IV:

  • Spaltung nur von methylierter DNA
  • Spaltstelle etwa 30 Basenpaare von der Erkennungsstelle entfernt

Erklären Sie die Methoden zur Gewinnung von DNA für molekulare Klonierungsexperimente und den Prozess zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls

  • Der Klonierungsvektor wird mit einer Restriktionsendonuklease behandelt, um die DNA an der Stelle zu spalten, an der Fremd-DNA eingefügt wird.
  • DNA für Klonierungsexperimente kann auch aus RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase (komplementäre DNA- oder cDNA-Klonierung) oder in Form von synthetischer DNA (künstliche Gensynthese) gewonnen werden.
  • Die Erzeugung rekombinanter DNA ist in vielerlei Hinsicht der einfachste Schritt des molekularen Klonierungsprozesses.

Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Wichtige Zusatzfragen Sehr kurzer Antworttyp

Frage 1.
Was ist Gentechnik?
Antworten:
Gentechnik. Es ist eine Technik, um DNA (Gene) künstlich und absichtlich an die menschlichen Bedürfnisse anzupassen. Es wird auch rekombinante DNA-Technologie oder DNA-Spleißen genannt. Es ist eine Art Biotechnologie.

Frage 2.
Definiere rekombinante DNA.
Antworten:
Rekombinante DNA. Sie sind DNA-Moleküle, die durch genetische Rekombinationsmethoden gebildet werden.

Frage 3.
Welche Rolle spielt die Restriktionsendonuklease?
Antworten:
Restriktionsendonukleasen sind spezifische Enzyme, die doppelsträngige DNA an der spezifischen Stelle spalten können.

Frage 4.
Was sind BACs und YACs? (CBSE-2016)
Antworten:
BACs und YACs sind künstliche Chromosomen aus Bakterien und Hefe, die für den Gentransfer effizient sind. Sie sind Vektoren.

Frage 5.
Nennen Sie das Bodenbakterium, das das Gen zur Produktion von Endotoxinen enthält.
Antworten:
Agrobacterium tumefaciens.

Frage 6.
Nennen Sie eine Technik, mit der DNA-Fragmente getrennt werden können. (CBSE-Delhi 2008)
Antworten:
Gelelektrophorese.

Frage 7.
Was ist das Prinzip der Gelelektrophorese?
Antworten:
DNA-Fragmente sind negativ geladen, sodass sie sich unter einem elektrischen Feld durch die Matrix (normalerweise Agarose) zur Anode bewegen. Dieses Matrixgel fungiert als Sieb und DNA-Fragmente werden entsprechend ihrer Größe aufgelöst.

Frage 8.
Benennen Sie die Verbindung, die zum Färben von DNA verwendet wird, die in der rekombinanten Technologie verwendet werden soll. Welche Farbe hat eine solche gefärbte DNA?
Antworten:
Die zum Färben von DNA verwendete Verbindung ist Ethidiumbromid. Gefärbte DNA wird orange.

Frage 9.
Nennen Sie die Technik für den vektorlosen direkten Gentransfer.
Antworten:
Gen Pistole.

Frage 10.
Welche Rolle spielt „Ori“ in jedem Plasmid?
Antworten:
Das Plasmid ist prokaryontische zirkuläre DNA, die eine Nukleotidsequenz aufweist, von der aus die Replikation beginnt. Dies wird als Replikationsursprung bezeichnet.

Die Rolle von Ori besteht darin, die Replikation zu starten. Auch die Kopienzahl der verknüpften DNA wird von Ori kontrolliert.

Frage 11.
Mach normale £. coli-Zellen eine Genresistenz gegen Antibiotika haben?
Antworten:
Nein.

Frage 12.
Welche Funktion hat TPA?
Antworten:
TPA (Tissue Plasminogen Activator) löst Blutgerinnsel nach einem Herzinfarkt und Schlaganfall.

Frage 13.
Nennen Sie ein Beispiel, in dem die rekombinante DNA-Technologie ein breites Spektrum an Werkzeugen bei der Diagnose von Krankheiten bereitgestellt hat.
Antworten:
Konstruktion von Sonden, bei denen es sich um kurze Segmente einzelsträngiger DNA handelt, die an einen radioaktiven oder fluoreszierenden Marker gebunden sind.

Frage 14.
Geben Sie die vollständige Form der PCR an. Wer hat es entwickelt? (CBSE-Delhi 2013)
Antworten:
PCR ist eine Polymerase-Kettenreaktion. Es wurde 1985 von Kary Mullis entwickelt.

Frage 15.
Was ist die Quelle der DNA-Polymerase, d. h. der Taq-Polymerase? (CBSE außerhalb von Delhi 2013)
Antworten:
Taq-Polymerase wird aus dem Bakterium Thermus Aquaticus isoliert.

Frage 16.
Definieren Sie „Schmelzen der Ziel-DNA“.
Antworten:
Die Ziel-DNA, die die zu amplifizierende Sequenz enthält, wird hitzedenaturiert (ca. 94°C für 15 Sekunden), um ihre komplementären Stränge zu trennen. Dieser Vorgang wird als Schmelzen der Ziel-DNA bezeichnet.

Frage 17.
Erweitern Sie ELISA. Schreiben Sie eine Bewerbung. (CBSE-Delhi 2013)
Antworten:
ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Essay. Wichtigkeit-lt wird für die Diagnose von AIDS verwendet.

Frage 18.
Was sind transgene Tiere? Nennen Sie ein Beispiel. (CBSE außerhalb von Delhi 2016)
Antworten:
Transgene Tiere: Die durch Gentechnik gewonnenen Tiere, die Transgene enthalten, werden als transgene Tiere bezeichnet.
Beispiel. Transgene Kuh ‘Rosie’.

Frage 19.
Wie viele PCR-Zyklen sind für eine ordnungsgemäße Amplifikation des DNA-Segments ausreichend?
Antworten:
20-30 Zyklen.

Frage 20.
Gentherapie definieren.
Antworten:
Gentherapie: Es ist der Ersatz eines fehlerhaften Gens durch ein normales gesundes funktionelles Gen.

Frage 21.
Welche Bedeutung hat die Genbank?
Antworten:
Sie stellt einen Vorrat bereit, aus dem Gene zur Verbesserung der Sorten oder zur Verwendung in der Gentechnik gewonnen werden können.

Frage 22.
Was kann die Quelle für thermostabile DNA sein?
Antworten:
Thermostabile DNA wird aus einem Bakterium Thermus Aquaticus gewonnen.

Frage 23.
Was sind auswählbare Marker?
Antworten:
Gene, die transformierte Zellen aus den nicht-rekombinanten Zellen selektieren können, werden als selektierbare Marker bezeichnet.

Frage 24.
Warum wird das Enzym Cellulase zur Isolierung von genetischem Material aus Pflanzenzellen und nicht aus tierischen Zellen verwendet? (CBSE-2010)
Antworten:
Cellulase wird zum Aufbrechen der Zellwand von Pflanzenzellen verwendet, während tierischen Zellen eine Zellwand fehlt. Die Zellwand besteht aus Zellulose, die durch Cellulase abgebaut werden kann.

Frage 25.
Geben Sie jeweils ein Beispiel für eine transgene Pflanze und ein transgenes Tier.
Antworten:

Frage 26.
Wie hoch wäre die molare Konzentration menschlicher DNA in einer menschlichen Zelle?
Antworten:
Der Mensch hat 3 M DNA pro Zelle, d. h. die molare Konzentration beträgt 3.

Frage 27.
Haben eukaryotische Zellen Restriktionsendonukleasen?
Antworten:
Ja, eukaryontische Zellen besitzen Restriktionsendonukleasen. Sie sind an der Bearbeitung (Korrektur) und DNA-Reparaturen während der DNA-Replikation beteiligt.

Frage 28.
Nennen Sie eine Technik, mit der DNA-Fragmente getrennt werden können. (CBSE-Delhi 2008)
Antworten:
Holen Sie sich Elektrophorese.

Frage 29.
Biotechnologische Techniken können helfen, den Erreger zu diagnostizieren, bevor die Krankheitssymptome beim Patienten auftreten. Schlagen Sie zwei solcher Techniken vor. (CBSE außerhalb von Delhi 2019)
Antworten:
PCR – Polymerase-Kettenreaktion
ELISA – Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Frage 30.
Warum ist es einer fremden DNA nicht möglich, irgendwo entlang ihrer Länge Teil des Chromosoms zu werden und sich zu replizieren? (CBSE 2014)
Antworten:
Um eine fremde DNA zu vermehren, muss sie Teil eines Chromosoms sein, das eine bestimmte Sequenz hat, die als Replikationsursprung bekannt ist.

Frage 31.
Erwähnen Sie die Art der Wirtszellen, die für die Genkanonen geeignet sind, um eine fremde DNA einzuführen. (CBSE-Delhi 2014)
Antworten:
Pflanzenzellen.

Frage 32.
Nennen Sie die Enzyme, die zur Isolierung von DNA aus Bakterien- und Pilzzellen für die rDNA-Technologie verwendet werden. (CBSE 2014)
Antworten:
Lysozym für Bakterienzelle und Chitinase für die Pilzzelle.

Frage 33.
Was ist EcoRI? Wie unterscheidet sich EcoRI von einer Exonuklease? (CBSE außerhalb von Delhi 2015)
Antworten:
EcoRI ist ein Endonuklease-Restriktionsenzym, das beide Stränge palindromischer DNA an einer bestimmten Position der Stickstoffbase 5′ (GAATTC) 3′ schneidet, während die Exonuklease Nukleotide von den Enden der DNA-Stränge entfernt.

Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Wichtige Zusatzfragen Kurzer Antworttyp

Frage 1.
(i) Während der Klonierung von Vektoren, welcher der beiden von Biotechnologen bevorzugt wird, Bakteriophagen oder Plasmide. Begründe mit Vernunft.
Antworten:
Biotechnologen bevorzugen Bakteriophagen zum Klonen gegenüber Plasmiden, da sie sehr hohe Kopienzahlen ihres Genoms innerhalb der Bakterienzellen aufweisen, während einige Plasmide nur eine oder zwei Kopien pro Zelle und andere 15-100 Kopien pro Zelle haben können. Phagenvektoren sind beim Klonieren großer DNA-Fragmente effizienter als Plasmide.

(ii) Nennen Sie die erste entwickelte transgene Kuh und geben Sie die Verbesserung der Qualität des von ihr erzeugten Produkts an. (CBSE-Musterpapier 2018-19)
Antworten:
Die transgene Kuh Rosie produzierte mit Humanprotein angereicherte Milch (2,4 Gramm pro Liter).

Frage 2.
Was sind die beiden Kerntechniken, die die Geburt der Biotechnologie ermöglicht haben?
Antworten:
Die beiden Kerntechniken, die die Geburt der modernen Biotechnologie ermöglicht haben, sind:

  1. Gentechnische Techniken, um die Chemie von genetischem Material (DNA und RNA) zu verändern, in Wirtsorganismen einzubringen und damit den Phänotyp des Wirtsorganismus zu verändern.
  2. Aufrechterhaltung einer sterilen (mikrobiell kontaminationsfreien) Umgebung in verfahrenstechnischen Prozessen, um das Wachstum nur der gewünschten Mikrobe/eukaryontischen Zelle in großen Mengen für die Herstellung biotechnologischer Produkte wie Antibiotika, Impfstoffe, Enzyme usw. zu ermöglichen.

Frage 3.
Erstellen Sie eine Liste mit Werkzeugen der rekombinanten DNA-Technologie. (CBSE Delhi, 2011)
Antworten:
Schlüsselwerkzeuge der rekombinanten DNA-Technologie:

  1. Restriktionsenzyme
  2. Polymerase-Enzyme
  3. Ligasen
  4. Vektoren
  5. Wirtsorganismus.

Frage 4.
Was bedeutet EcoRI? Wie wird sein Name abgeleitet?
Antworten:
EcoRI bezeichnet den Namen der Restriktionsendonuklease:

  1. Der erste Großbuchstabe des Namens, der aus der Gattung Escherichia stammt, ist „E“.
  2. Die zweiten beiden Kleinbuchstaben stammen von der Spezies Coli der prokaryontischen Zellen, aus der sie isoliert wurden, also „co“.
  3. Der Buchstabe R leitet sich vom Namen des Stammes ab, d. h. Escherichia coli Ry 13.
  4. Die römische Zahl gibt die Reihenfolge an, in der Enzyme aus diesem Bakterienstamm isoliert wurden.

Frage 5.
Was sind Erkennungssequenzen oder Erkennungsstellen?
Antworten:
Die von Restriktionsendonukleasen erkannten Stellen werden Erkennungsstellen genannt. Die Erkennungssequenzen sind unterschiedlich und spezifisch für die verschiedenen Restriktionsendonukleasen. Diese Sequenzen sind palindromischer Natur.

Frage 6.
Vektor definieren. Geben Sie die Eigenschaften eines „Guten Vektors“ an.
Antworten:
Ein Vektor ist ein DNA-Molekül, das die Fähigkeit besitzt, in einer geeigneten Wirtszelle zu replizieren, und in das das zu klonierende DNA-Fragment zur Klonierung integriert wird.

Ein guter Vektor muss die folgenden Eigenschaften haben:

  • Es sollte einen Replikationsursprung haben, damit es autonom replizieren kann.
  • Es sollte leicht zu isolieren und zu reinigen sein.
  • Es sollte leicht in die Wirtszellen eingeführt werden.

Frage 7.
Was ist der Unterschied zwischen Klonierungs- und Expressionsvektoren?
Antworten:
Alle Vektoren, die zur Vermehrung von DNA-Inserts in einem geeigneten Wirt verwendet werden, werden als Klonierungsvektoren bezeichnet. Wenn ein Vektor für die Expression, d. h. die Produktion des durch das DNA-Insert spezifizierten Proteins, entworfen wird, wird er als Expressionsvektor bezeichnet.

Frage 8.
Was verstehen Sie unter dem Begriff selektierbarer Marker?
Antworten:
Wählbarer Marker:

  1. Ein Marker ist ein Gen, das bei der Selektion jener Wirtszellen hilft, die den Vektor (Transformanten) enthalten, und die Nicht-Transformanten zu eliminieren. Es erlaubt selektiv das Wachstum von Transformanten.
  2. Übliche selektierbare Marker für E. coli umfassen die Gene, die Resistenz gegen Antibiotika wie Ampicillin kodieren. Chloramphenicol-Tetracyclin und Kanamycin oder das Gen für (i-Galactosidase, das durch eine Farbreaktion identifiziert werden kann. Normale E.Coli sind gegen keinen dieser Antikörper resistent.

Frage 9.
Erklären Sie das Prinzip, das bei der Trennung von DNA-Fragmenten in der Gelelektrophorese hilft. (CBSE Delhi 2009 C)
Antworten:
Get Elektrophorese ist eine Technik, bei der Moleküle wie DNA/RNA/Protein aufgrund ihrer Größe unter dem Einfluss des elektrischen Feldes so wandern, dass sie in Richtung der entgegengesetzt geladenen Elektrode wandern. Positiv geladene Moleküle bewegen sich zur Kathode (-ve-Elektrode) und umgekehrt. Diese Moleküle bewegen sich durch ein Medium oder eine Matrix und können anhand ihrer Größe getrennt werden.

Frage 10.
Geben Sie die Anwendungen der PCR-Technologie an. (CBSE, Delhi 2013)
Antworten:

  1. Amplifikation von DNA und RNA.
  2. Bestimmung von Orientierung und Lage von Restriktionsfragmenten relativ zueinander.
  3. Nachweis genetischer Erkrankungen wie Sichelzellenanämie, Phenylketonurie und Muskeldystrophie.

Frage 11.
Warum wird die „Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation“ in Pflanzen als natürlicher Gentechniker von Pflanzen bezeichnet? (CBSE Delhi 2011)
Antworten:
Agrobacterium tumefaciens ist ein pflanzenpathogenes Bakterium, das einen Teil seiner Plasmid-DNA übertragen kann, weil es Wirtspflanzen infiziert. Agrobacterium produziert in den meisten zweikeimblättrigen Pflanzen Kronengallen. Diese Bakterien enthalten große Tumor-induzierende Plasmide (Ti-Plasmide), die ihr tumorauslösendes Gen in das Genom der Wirtspflanze weitergeben. Der Gentransfer findet also in der Natur ohne menschliche Beteiligung statt, daher wird die Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation als natürliche Gentechnik in Pflanzen beschrieben.

Frage 12.
Unterscheiden Sie Gentherapie und Genklonen.
Antworten:
Unterschiede zwischen Gentherapie und Genklonen:

Gentherapie Klonen von Genen
Es ist der Ersatz und/oder die Veränderung von defekten Genen, die für Erbkrankheiten verantwortlich sind, durch normale Gene. Es ist die Technik, identische Kopien eines bestimmten DNA-Segments oder eines Gens zu erhalten.

Frage 13.
Können Sie aus dem, was Sie gelernt haben, sagen, ob Enzyme größer sind oder DNA eine größere Molekülgröße hat? Woher wusstest du das?
Antworten:
DNA-Moleküle sind größer als die Molekülgröße von Enzymen. Enzyme sind Proteine. Die Proteinsynthese erfolgt aus einem kleinen Teil der DNA, den Genen.

Frage 14.
Wie funktioniert die Restriktionsendonuklease? (CBSE Delhi 2013, 2014, Außerhalb Delhi 2019)
Oder
Was sind Molekularscheren? Erklären Sie ihre Rolle. (CBSE 2009)
Antworten:
Restriktionsendonukleaseenzyme werden molekulare Scheren genannt, die doppelsträngige DNA an bestimmten Stellen schneiden können.

Rolle der Restriktionsendonuklease:

  • Restriktionsendonuklease prüft die Länge der DNA-Sequenz.
  • Es findet eine spezifische Erkennungssequenz, d. h. eine palindromische Nukleotidsequenz in der DNA.
  • Diese Enzyme schneiden den DNA-Strang ein wenig vom Zentrum der palindromischen Stellen entfernt.
  • Somit hinterlassen Restriktionsendonukleasen an jedem Strang überhängende Abschnitte, die als klebrige Enden bezeichnet werden.

Frage 15.
Wie und warum wird das Bakterium Thermus Aquaticus in der rekombinanten DNA-Technologie eingesetzt? Erklären. (CBSE Delhi 2009)
Antworten:
Das Bakterium Thermus Aquaticus wird in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet, da es über eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq. Polymerase) verfügt, die während der hochtemperaturinduzierten Denaturierung eines PCR-Schritts aktiv bleibt.

Dieses Enzym wird während der Amplifikation von Genen unter Verwendung von PCR (Polymerase Chain Reaction) verwendet. Das amplifizierte Fragment kann verwendet werden, um mit einem Vektor zur weiteren Klonierung zu ligieren.

Frage 16.
Nennen Sie die Quelle der Taq-Polymerase. Erklären Sie seine Vorteile. (CBSE außerhalb von Delhi 2009)
Antworten:
Taq Polymerase wird aus thermostabilen Bakterien, nämlich Thermus Aquaticus, extrahiert. Es bleibt bei einer höheren Temperatur aktiv und wird zur Denaturierung von DNA während der PCR verwendet.

Frage 17.
Was sind rekombinante Proteine? Wie helfen Bioreaktoren bei ihrer Herstellung? (CBSE außerhalb von Delhi 2009, 2015)
Antworten:
Rekombinante Proteine. Wenn ein Protein-kodierendes Gen in einem heterologen Wirt exprimiert wird, wird es als rekombinantes Protein bezeichnet. Bioreaktoren helfen bei der Produktion rekombinanter Proteine ​​im großen Maßstab. Ein Bioreaktor bietet optimale Bedingungen, um das gewünschte rekombinante Protein durch biologische Verfahren zu erhalten.

Frage 18.
Was versteht man unter Genklonen?
Antworten:
Die Bildung mehrerer Kopien eines bestimmten Gens wird Genklonen genannt. Ein Gen wird abgetrennt und an ein vektorartiges Plasmid ligiert. Das rekombinante Plasmid wird durch Transformation in ein Plasmid-freies Bakterium eingeführt. Das transformierte Bakterium wird dazu gebracht, sich zu vermehren und eine Kolonie zu bilden. Jedes Bakterium der Kolonie besitzt eine Kopie des Gens.

Frage 19.
Sowohl der Weinmarker als auch ein Molekularbiologe, der einen rekombinanten Impfstoff entwickelt hat, behaupten, Biotechnologe zu sein. Wer hat Ihrer Meinung nach Recht?
Antworten:
Beide gelten als Biotechnologen. Wine Marker verwendet einen Hefestamm, der Wein durch Gärung produziert. Der Molekularbiologe verwendet ein geklontes Gen für das Antigen. Das Antigen wird als Impfstoff verwendet. Dies ermöglicht die Bildung von Antigen in großen Mengen. Beide erzeugen Produkte und Dienstleistungen mit lebenden Organismen, die für die Menschheit nützlich sind.

Frage 20.
Sie haben ein rekombinantes DNA-Molekül erzeugt, indem Sie ein Gen an einen Plasmidvektor ligiert haben. Aus Versehen fügt Ihr Freund dem Röhrchen mit der rekombinanten DNA ein Exonuklease-Enzym hinzu. Wie wird Ihr Experiment beeinflusst, wenn Sie jetzt die Transformation planen?
Antworten:
Das Experiment wird wahrscheinlich nicht beeinträchtigt, da das rekombinante DNA-Molekül zirkulär und geschlossen ist, ohne freie Enden. Daher ist es kein Substrat für das Exonuklease-Enzym, das Nukleotide von den freien Enden der DNA entfernt.

Frage 21.
Erklären Sie die Arbeit von Cohen und Boyer, die einen immensen Beitrag zur Biotechnologie geleistet hat. (CBSE2012)
Antworten:
Arbeiten von Cohen und Boyer:

  1. Entdeckung der Restriktionsendonuklease, einem Enzym von E. coli, das DNA an palindromischer Sequenz schneidet.
  2. Herstellung von rekombinanter DNA (Plasmid und DNA von Interesse.)
  3. Ihre Arbeit etablierte die rekombinante DNA (rDNA)-Technologie, die auch Gentechnik genannt wird.

Frage 22.
Wie entstehen „Sticky Ends“ an einem DNA-Strang? Warum werden diese so genannt? (CBSE-Delhi 2014)
Antworten:
1. Restriktionsenzyme schneiden den DNA-Strang etwas vom Zentrum der Palindrom-Stelle weg, aber zwischen denselben beiden Basen auf gegenüberliegenden Strängen. Als Ergebnis bleiben einzelsträngige Abschnitte an jedem Ende zurück. Diese überhängenden DNA-Abschnitte werden als „klebrige Enden“ bezeichnet.

2. Die Sticky-Enden werden so genannt, weil sie mit ihren komplementär geschnittenen Gegenstücken Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Die Klebrigkeit hilft bei der Wirkung der DNA-Ligase.

Frage 23.
Wie wird ein kontinuierliches Kultursystem in Bioreaktoren gepflegt und warum? (CBSE Delhi 2019)
Antworten:
Um ein kontinuierliches Kultursystem aufrechtzuerhalten, wird das gebrauchte Medium von einer Seite des Bioreaktors abgelassen und das frische Medium von einer Seite zugegeben. Diese Art von Kultivierungsverfahren erzeugt eine größere Biomasse, was zu höheren Ausbeuten des gewünschten Produkts führt.

Frage 24.
Das Galactosidase-Enzym gilt als besser selektierbarer Marker. Begründen Sie die Aussage. (CBSE Delhi 2019)
Antworten:
Rekombinante Stämme können unter Verwendung dieses selektierbaren Markers leicht von den nicht-rekombinanten unterschieden werden. Die Auswahl erfolgt anhand des Farbwechsels. Alle werden auf einer chromogenen Substanz angebaut. Nicht-Rekombinanten ändern sich von farblos zu blau, während in Rekombinanten eine Insertionsinaktivierung des Galactosidase-Gens auftritt.

Daher zeigten Rekombinanten keine Farbänderung. Dies ist ein einzelner Schritt, eine einfache Methode zur Auswahl.

Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Wichtige Zusatzfragen Typ mit langer Antwort

Frage 1.
Was ist Gentechnik? Erläutern Sie kurz die einzelnen Schritte, die allen Gentechnik-Technologien gemeinsam sind.
Oder
Zeigen Sie mit Hilfe von Diagrammen die verschiedenen Schritte bei der Bildung rekombinanter DNA durch die Wirkung der Restriktionsendonuklease. (CBSE 2011)
Antworten:
Gentechnik: Es ist eine Technik, um DNA (Gene) künstlich und gezielt an die menschlichen Bedürfnisse anzupassen. Es wird auch rekombinante DNA-Technologie oder DNA-Spleißen genannt.

Es ist eine Art Biotechnologie:

  1. Isolierung von genetischem Material, das das interessierende Gen aufweist.
  2. Ausschneiden des interessierenden Gens aus Genom und Vektor mit demselben Restriktionsendonuklease-Enzym. Amplifizierendes Gen von Interesse (PCR).
  3. Ligieren des interessierenden Gens und des Vektors unter Verwendung von DNA-Ligase, die rDNA bildet.
  4. Transformation von rDNA in die Wirtszelle.
  5. Vermehrung der Wirtszelle, um Klone zu erzeugen.


Diagramm mit verschiedenen Schritten der DNA-Rekombinationstechnologie zur Herstellung eines rekombinanten Proteins.

Frage 2.
Nennen Sie drei wichtige Merkmale, die für die Herstellung eines genetisch verändernden Organismus erforderlich sind.
Antworten:
Voraussetzungen für die Vorbereitung:

  1. Identifizierung von DNA mit wünschenswerten Genen.
  2. Einführung der identifizierten DNA in den Wirt.
  3. Erhaltung der eingeführten DNA im Wirt und Übertragung der DNA auf ihre Nachkommen.

Frage 3.
Wie werden Restriktionsendonuklease-Enzyme benannt? Schreiben Sie Beispiele. (CBSE 2014
Antworten:
Die Benennung von Restriktionsenzymen lautet wie folgt:

  1. Der erste Buchstabe des Namens stammt von der Gattung und die nächsten beiden Buchstaben vom Namen der Spezies der prokaryontischen Zelle, aus der sie isoliert wurden.
  2. Der nächste Buchstabe stammt vom Stamm des Prokaryoten.
  3. Die römischen Zahlen nach diesen vier Buchstaben geben die Reihenfolge an, in der die Enzyme aus diesem Stamm des Bakteriums isoliert wurden.
  1. EcoR I wird aus Escherichia coli RY 13 isoliert.
  2. Hind II stammt von Haemophilus influenza.
  3. Bam H I stammt von Bacillus amylotiquefaciens.
  4. Sal I stammt von Streptomyces Albus
  5. Pst I stammt aus Providencia stuartii.

Frage 4.
Erklären Sie drei beliebige Methoden des vektorlosen Gentransfers. (CBSE außerhalb von Delhi 2013)
Antworten:
Vektoren des Gentransfers. Im Folgenden sind übliche Verfahren des Vektorgentransfers aufgeführt.

  1. Mikroinjektion: Mikroinjektion ist der Prozess/die Technik der Einführung fremder Gene in eine Wirtszelle durch Injektion der DNA direkt in den Zellkern unter Verwendung einer Mikronadel oder einer Mikropipette.
  2. Elektroporation: Elektroporation ist der Prozess, bei dem vorübergehende Löcher in der Plasmamembran der (Wirts-)Zelle erzeugt werden, um das Eindringen von fremder DNA zu erleichtern.
  3. Gene Gun: Gene Gun ist die Technik, mit fremder DNA beschichtete Mikroprojektile (Gold- oder Wolframpartikel) mit großer Geschwindigkeit in die Zielzelle zu beschießen.

Frage 5.
Schreiben Sie eine Notiz zum Klonvektor.
Antworten:
Klonierungsvektoren:

  1. Plasmide und Bakteriophagen sind die am häufigsten verwendeten Vektoren
  2. Gegenwärtig werden auch gentechnisch hergestellte/synthetische Vektoren verwendet, um die Fremd-DNA leicht zu verknüpfen und Rekombinanten aus Nicht-Rekombinanten zu selektieren.
  3. Die folgenden Funktionen sind erforderlich, um das Klonen in einen Vektor zu erleichtern:
    (a) Ursprung der Replikation (Ori)
    (b) Wählbarer Marker
    (c) Klonierungs-(Erkennungs-)Site
    (d) Kleine Größe des Vektors.

Frage 6.
Was ist PCR? Nennen Sie die drei wichtigsten Schritte. Zeigen Sie die Schritte mit einer schematischen Skizze.
Antworten:

  1. PCR. Polymerase Kettenreaktion.
  2. Drei Schritte der PCR.
    (a) Denaturierung
    (b) Primer-Annealing und
    (c) Verlängerung von Primern.


Die drei Schritte der PCR

Frage 7.
Nennen Sie die verschiedenen Klonierungsvektoren und erklären Sie, wie ein Plasmid für die Gentechnik genutzt werden kann.
Antworten:
Klonierungsvektoren:

  • Plasmide
  • Bakteriophagen
  • Pflanzen- und Tiervektoren
  • Springende Gene (Transposons)
  • Künstliche Chromosomen von Bakterien, Hefen und Säugetieren (BAC, YAC).

Verwendung von Plasmiden als genetisches Material Plasmide werden aus Bakterien gewonnen. Sie werden mit einem Restriktionsendonuklease-Enzym behandelt, um die Fragmente des gewünschten Genoms zu erhalten. Sie dürfen mit Hilfe eines DNA-Ligase-Enzyms fusionieren. Die so gebildeten rekombinanten Plasmide werden als genetisches Material verwendet.

Frage 8.
Geben Sie verschiedene Mittel an, mit denen ein kompetenter Wirt für die rekombinante DNA-Technologie gebildet wird. Warum und wie können Bakterien „kompetent“ gemacht werden? (CBSE-Delhi 2013)
Antworten:
Eine Wirtszelle sollte kompetent genug sein, um das DNA-Molekül für die Transformation aufzunehmen, da die folgenden Verfahren verwendet werden können.

  1. Verwendung von zweiwertigen Kationen: Bakterien werden mit Ca 2+ usw. behandelt, damit DNA durch Poren in der Zellwand in das Bakterium gelangt.
  2. Hitzeschock: Zellen können auf Eis und dann bei 42 °C für einen Hitzeschock inkubiert und dann wieder auf Eis gelegt werden.
  3. Mikroinjektion: Rekombinante DNA wird direkt in den Zellkern einer tierischen Zelle injiziert.
  4. Biolistisch. Zellen, die mit Hochgeschwindigkeits-Mikropartikeln aus Gold oder Wolfram, die mit DNA beschichtet sind, beschossen werden, werden als Genkanone bezeichnet.

Frage 9.
Wie wird rekombinante DNA auf den Wirt übertragen?
Antworten:
Übertragung rekombinanter DNA in den Wirt:

  1. Die Bakterienzellen müssen für die DNA-Aufnahme kompetent gemacht werden. Dies geschieht durch Behandlung mit einer bestimmten Calciumkonzentration, die die Effizienz erhöht, mit der DNA durch die Poren der Zellwand in die Zelle eindringt.
  2. Rekombinante DNA kann dann in solche Zellen gezwungen werden, indem die Zellen mit rekombinanter DNA auf Eis inkubiert werden, dann bei 42 °C gelagert und dann wieder auf Eis gelegt werden (Hitzeschockbehandlung),
  3. Mikroinjektion ist ein Verfahren, bei dem die rekombinante DNA mit Hilfe von Mikronadeln oder Mikropipetten direkt in den Zellkern der tierischen Zelle injiziert wird.
  4. Gene Gun oder Biolistics ist eine für Pflanzenzellen geeignete Methode, bei der Zellen mit Hochgeschwindigkeits-Mikropartikeln aus Gold oder Wolfram, die mit DNA beschichtet sind, beschossen werden.
  5. Entwaffnete Krankheitserreger werden als Vektoren verwendet, wenn sie die Zelle infizieren dürfen, sie übertragen die rekombinante DNA in den Wirt.

Frage 10.
Warum kann DNA die Zellmembran nicht passieren? Wie können die Bakterien kompetent gemacht werden, um ein Plasmid aufzunehmen? Erklären Sie eine Methode zur Einführung fremder DNA in eine pflanzliche Wirtszelle. Nennen Sie einen Krankheitserreger, der als entwaffneter Vektor verwendet wird. (CBSE außerhalb von Delhi 2019)
Antworten:
DNA ist ein hydrophiles Molekül und kann daher die Zellmembran nicht passieren.

Bakterienzellen werden „kompetent“ gemacht, indem sie mit einer bestimmten Konzentration eines zweiwertigen Kations wie Calcium behandelt werden, um das Plasmid aufzunehmen. Das zweiwertige Kation erhöht die Effizienz, mit der DNA durch die Poren der Zellwand in das Bakterium eindringt.

Vorgehensweise: Rekombinante DNA wird in „kompetente“ bakterielle Wirtszellen durch Inkubation auf dem Eis gezwungen. Anschließend werden sie kurz bei 42 °C aufgestellt. Es wird als „Heizmaterial“-Behandlung bezeichnet. Wieder werden sie wieder auf Eis gelegt. Dieser Prozess ermöglicht es Bakterien, die rekombinante DNA aufzunehmen.

Gene Gun oder biolistic Methode wird verwendet, um fremde DNA in eine pflanzliche Wirtszelle einzubringen. Dabei werden die Pflanzenzellen mit Hochgeschwindigkeits-Mikropartikeln aus Gold oder Wolfram beschossen, die mit DNA beschichtet sind. Als entwaffneter Vektor können Agrobacterium tumefaciens oder Retroviren verwendet werden.

Frage 11.
Schreiben Sie eine Notiz zu Vektoren, die während der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden. (CBSE-Delhi 2008)
Antworten:
Als Träger zum Transferieren ausgewählter DNA in Zellen wird eine Vektor- oder Vehikel-DNA verwendet. Ein Plasmid mit seiner kleinen DNA aus einem Bakterium ist eine gute Wahl für den indirekten Gentransfer, da es sich von einer Zelle in eine andere bewegen und mehrere Kopien von sich selbst herstellen kann. Künstliche Chromosomen aus Bakterien und Hefen, die BACs bzw. YACs genannt werden, sind jedoch effizienter für eukaryotische Gentransfers.

Künstliches Plasmid und Hefe-Chromosom

Frage 12.
(i) Identifizieren Sie die Abbildungen A und B im Folgenden:
(ein)
(B)
Antworten:
A= 5′ GAATTC 3′
B-Markierungen für ORI (Ursprung der Replikation).

(ii) Schreiben Sie den A und C gegebenen Begriff und warum?
Antworten:
A stellt eine palindromische Nukleotidsequenz dar. C-klebriges Ende.

(iii) PCR erweitern. Erwähnen Sie seine Bedeutung in der Biotechnologie. (CBSE Delhi 2011)
Antworten:
PCR, Polymerase-Kettenreaktion. Es hilft bei der Genamplifikation.

Frage 13.
Schreiben Sie die Rolle der folgenden Stellen im Klonierungsvektor pBR322:
(a) rop
Antworten:
Rolle von rop, ori und selektierbarem Marker im pBR322-Klonierungsvektor.

Rolle von rop: Das Rop-Gen reguliert die Kopienzahl. Der Rop-Prozess ist an der Stabilisierung der Interaktion zwischen RNA I und RNA II beteiligt, was wiederum die Replikation von pBR322 verhindert.

(b) oder
Antworten:
Replikationsursprung (Ori):

  • Es ist eine spezifische Sequenz von DNA-Basen, die für die Initiierung der Replikation verantwortlich ist.
  • Eine fremde DNA für die Replikation sollte mit dem Replikationsursprung verknüpft werden.
  • Eine prokaryontische DNA hat normalerweise einen einzigen Replikationsursprung, während eukaryontische DNA mehr als einen Replikationsursprung haben kann.
  • Die Sequenz ist für die Kontrolle der Kopienzahl der verknüpften DNA verantwortlich.

(c) selektierbarer Marker (CBSE Delhi 2019 C)
Antworten:
Wählbarer Marker:

  • Ein Marker ist ein Gen, das bei der Selektion jener Wirtszellen hilft, die den Vektor (Transformanten) enthalten, und die Nicht-Transformanten zu eliminieren.
  • Übliche selektierbare Marker für E. coli umfassen die Gene, die Resistenz gegen Antibiotika wie Ampicillin kodieren. Chloramphenicol, Tetracyclin und Kanamycin oder das Gen für B-Galactosidase können durch eine Farbreaktion identifiziert werden.

Frage 14.
(i) Erklären Sie die Bedeutung der palindromischen Nukleotidsequenz bei der Bildung rekombinanter DNA.
Antworten:
Die palindromischen Sequenzen, d. h. die Sequenz der Basenpaare, lesen sich auf beiden DNA-Strängen gleich, wenn die Leserichtung gleich gehalten wird, z.
5’ – GAATTC – 3’
3’ — CTTAAG — 5’

Jede Endonuklease untersucht die gesamte DNA-Sequenz auf palindromische Erkennungssequenz.

(ii) Schreiben Sie die Verwendung der Restriktionsendonuklease im obigen Verfahren. (CBSE-2017)
Antworten:
Beim Auffinden des Palindroms bindet die Endonuklease an die DNA. Es schneidet die gegenüberliegenden DNA-Stränge, aber zwischen den gleichen Basen auf beiden Strängen und bildet klebrige Enden. Diese klebrigen Enden erleichtern die Wirkung des Enzyms DNA-Ligase und helfen bei der Bildung von Rekombinations-DNA.

Frage 15.
Beschreiben Sie die Rolle von Hitze, Primern und dem Bakterium Thermus Aquaticus im Prozess der PCR. (CBSE-2017)
Antworten:
Rolle der Hitze: Hitze hilft beim Denaturierungsprozess in der PCR. Die doppelsträngige DNA wird dabei auf sehr hohe Temperatur (95 °C) erhitzt, sodass sich beide Stränge trennen.

Rolle der Primer: Primer sind chemisch synthetisierte kleine Oligonukleotide von etwa 10-18 Nukleotiden. Diese sind komplementär zu einer Region der Template-DNA und helfen bei der Verlängerung der neuen Kette. Rotes Bakterium Thermus

Aquaticus: Aus diesem Bakterium wird eine thermostabile Taq-DNA-Polymerase isoliert, die hohe Temperaturen verträgt und neue Stränge bildet.

Frage 16.
Wie hat die Verwendung von Agrobacterium als Vektoren bei der Bekämpfung des Meloidogyne incognita-Befalls bei Tabakpflanzen geholfen? Erkläre in der richtigen Reihenfolge. (CBSE 2018, außerhalb von Delhi 2019)
Oder
(a) Schreiben Sie den Mechanismus auf, der es Agrobacterium tumefaciens ermöglicht, in ihrer zweikeimblättrigen Wirtspflanze Tumore zu entwickeln.
(b) Geben Sie an, wie Agrobacterium tumefaciens und einige Retroviren als nützliche Klonierungsvektoren modifiziert wurden. (CBSE Delhi 2019 C)
Antworten:
(a) Klonen
(b) Ein Nematode Meloidogyne incognita infiziert die Wurzeln von Tabakpflanzen und verursacht eine starke Ertragsminderung.

Um diesen Befall zu verhindern, wurde eine neue Strategie verfolgt, die auf dem Verfahren der RNA-Interferenz (RNAi) basiert.

Nematodenspezifische Gene wurden unter Verwendung von Agrobacterium-Vektoren in die Wirtspflanzen eingeführt. Die Einführung von DNA war so, dass sie in den Wirtszellen sowohl Sense- als auch Antisense-RNA produzierte. Diese beiden RNAs, die zueinander komplementär sind, bildeten eine doppelsträngige RNA (dsRNA), die RNAi initiierte und somit spezifische mRNA des Nematoden zum Schweigen brachte. Aus diesem Grund konnte der Parasit in einem transgenen Wirt nicht überleben, indem er spezifische interferierende RNA exprimierte. Die transgene Pflanze hat sich daher vor dem Parasiten geschützt.

Frage 17.
Erklären Sie die Rollen der folgenden mit Hilfe jeweils eines Beispiels in der rekombinanten DNA-Technologie:
(i) Restriktionsenzyme
Antworten:
Restriktionsenzyme :
(a) Restriktionsenzyme gehören zur Klasse der Nukleasen von Enzymen, die Nukleinsäuren durch Spaltung ihrer Phosphodiesterbindungen brechen.
(b) Da Restriktionsendonukleasen DNA an einer spezifischen Erkennungsstelle schneiden, werden sie verwendet, um die Donor-DNA zu schneiden, um das gewünschte Gen zu isolieren.
(c) Das gewünschte Gen hat klebrige Enden, die leicht an einen Klonierungsvektor ligiert werden können, der durch dieselben Restriktionsenzyme mit komplementären klebrigen Enden geschnitten wurde, um rekombinante DNA zu bilden.
(d) Ein Beispiel ist EcoR1, das aus dem E. coli-Bakterienstamm "R" erhalten wird, der DNA an einer spezifischen palindromischen Erkennungsstelle schneidet.
5‘ GAATTC 3‘
3‘ CTTAAG 5‘

(ii) Plasmide (CBSE 2018)
Antworten:
Plasmide: Plasmide sind autonome, extrachromosomale zirkuläre doppelsträngige DNA von Bakterien. Sie werden als Klonierungsvektoren in der Gentechnik verwendet, weil sie klein und selbstreplizierend sind. Einige Plasmide weisen Antibiotikaresistenzgene auf, die als Markergene verwendet werden können, um rekombinante Plasmide von nicht-rekombinanten zu identifizieren.

Um die gewünschten Produkte zu erhalten, werden Plasmide geschnitten und mit gewünschten Genen ligiert und zur Amplifikation in eine Wirtszelle transformiert. Ein Beispiel für künstlich modifizierte Plasmide ist pBR322 (konstruiert von Bolivar und Rodriguez) oder pUC (konstruiert an der University of California).

Frage 18.
Wenn das Genprodukt in großen Mengen benötigt wird, werden die transformierten Bakterien mit dem Plasmid im Inneren der Bakterien in großem Maßstab in einem industriellen Fermenter kultiviert, der dann das gewünschte Protein synthetisiert. Dieses Produkt wird für den kommerziellen Gebrauch aus dem Fermenter extrahiert.
(a) Warum wird das gebrauchte Medium von einer Seite abgelassen, während das frische Medium von der anderen zugegeben wird? Erklären.
Antworten:
Im Bioreaktor wird das gebrauchte Medium abgelassen und das frische Medium zugegeben, um die Zellen in ihrer physiologisch aktivsten log/experimentellen Phase zu halten,

(b) Listen Sie alle vier optimalen Bedingungen auf, um das gewünschte Produkt in einem Bioreaktor zu erhalten. (CBSE-Musterpapier 2020)
Antworten:
Voraussetzung für die Gewinnung des gewünschten Produkts in einem Bioreaktor:

Frage 19.
Listen Sie die Schritte bei der Bildung von rDNA auf.
Antworten:
Schritte bei der Bildung von rDNA:
Die rekombinierte DNA-Technologie umfasst die folgenden Schritte:

  1. Isolierung von DNA.
  2. Fragmentierung von DNA durch Restriktionsendonukleasen.
  3. Isolierung des gewünschten DNA-Fragments.
  4. Amplifikation des interessierenden Gens.
  5. Ligation des DNA-Fragments in einen Vektor unter Verwendung von DNA-Ligase.
  6. Übertragung des DNA-Fragments in den Vektor unter Verwendung von DNA-Ligase.

Frage 20.
Wie wird das isolierte interessierende Gen amplifiziert? (CBSE Delhi 2019, 2019 C)
Antworten:
Amplifikation der interessierenden DNA/Genes:

  1. Amplifikation bezieht sich auf den Prozess der Herstellung mehrerer Kopien des DNA-Segments in vitro.
  2. Es verwendet die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
  3. Der Prozess wurde von K. Mullis entworfen,
  4. Diese Technik umfasst drei Hauptschritte:
    (a) Denaturierung
    (b) Primer-Annealing und
    (c) Verlängerung von Primern.
  5. Die doppelsträngige DNA wird denaturiert, indem sie hohen Temperaturen ausgesetzt wird.
  6. Es werden zwei Sätze von Primern verwendet. Primer sind die chemisch synthetisierten kurzen DNA-Segmente (Oligonukleotide), die zu dem DNA-Segment (von Interesse) komplementär sind.
  7. DNA-Polymerase-Enzym (Taq-Polymerase) wird verwendet, um Kopien von DNA unter Verwendung von genomischer Template-DNA und Primer herzustellen.

Frage 21.
Listen Sie die Funktionen auf, die erforderlich sind, um das Klonen in einen Vektor zu erleichtern. Zeigen Sie mit einer Skizze den E. coli-Klonierungsvektor mit Restriktionsstellen.
Oder
Skizzieren Sie pBR322. (CBSE 2012, Außerhalb Delhi 2019)
Antworten:
Funktionen, die erforderlich sind, um das Klonen des Vektors zu erleichtern.

  1. Ursprung der Replikation (Ori)
  2. Wählbarer Marker
  3. Klonen von Websites
  4. Vektoren zum Klonen von Genen in Pflanzen und Tieren
    Klonierungsvektoren

E. coli Klonierungsvektor pBr322, der Restriktionsschnittstellen (HindIII, EcoRI, BamHI, Sal I, Pvu II, Pst I, ClaI), oriV und Antibiotikaresistenzgene (ampR und tetR) zeigt. Rop kodiert für die Proteine, die an der Replikation des Plasmids beteiligt sind.

Frage 22.
Zeigen Sie mit Hilfe einer einfachen Skizze die Wirkung des Restriktionsenzyms (EcoR1).
Antworten:
Die Wirkung des Restriktionsenzyms.

Ecol schneidet die DNA zwischen den Basen G und A nur dann, wenn die Sequenz GAATTC in der DNA vorhanden ist.

Frage 23.
Erklären Sie die Bedeutung von (a) ori, (b) ampR und (c) rop im E. colt-Vektor. (CBSE Außerhalb Delhi 2009, Außerhalb Delhi 2019)
Antworten:

  1. Bedeutung von ori: Dies ist eine Sequenz, von der aus die Replikation beginnt, und jedes DNA-Stück, wenn es mit dieser Sequenz verbunden ist, kann innerhalb der Wirtszellen repliziert werden, es ermöglicht mehrere Kopien pro Zelle.
  2. Bedeutung von ampR: Es ist das Antibiotikaresistenzgen für Ampicillin. Es hilft bei der Auswahl von Transformatorzellen.
  3. Bedeutung von rop: Es kodiert für die Proteine, die an der Replikation des Plasmids beteiligt sind.

Frage 24.
Nennen Sie zwei beliebige Klonierungsvektoren. Beschreiben Sie die Funktionen, die erforderlich sind, um das Klonen in einen Vektor zu erleichtern. (CBSE-Musterpapier)
Antworten:
Plasmide und Bakteriophagen sind zwei Beispiele für den Klonierungsvektor. Ein Vektor ist ein DNA-Molekül, das in einer geeigneten Wirtszelle replizieren kann und in das das zu klonierende DNA-Fragment zur Klonierung integriert wird.

Ein guter Vektor muss die folgenden Eigenschaften haben:

  • Es sollte in der Lage sein, sich autonom zu replizieren.
  • es sollte leicht zu isolieren und zu reinigen sein,
  • Es sollte leicht in die Wirtszellen eingeführt werden.

Klonierungsvektoren: Alle Vektoren, die zur Vermehrung von DNA-Inserts in einem geeigneten Wirt verwendet werden, werden als Klonierungsvektoren bezeichnet. Wenn ein Vektor für die Expression, d. h. die Produktion des durch das DNA-Insert spezifizierten Proteins, entworfen wird, wird er als Expressionsvektor bezeichnet.

Frage 25.
Was sind Bioreaktoren? Skizzieren Sie die beiden Arten von Bioreaktoren. Was ist der Nutzen? Welcher Typ von Bioreaktoren ist am häufigsten? (CBSE-Delhi 2013)
Oder
Wie helfen Bioreaktoren bei der Herstellung rekombinanter Proteine? (CBSE außerhalb von Delhi 2009)
Oder
(i) Wie hat die Entwicklung von Bioreaktoren in der Biotechnologie geholfen?
(ii) Nennen Sie den am häufigsten verwendeten Bioreaktor und beschreiben Sie seine Funktionsweise. (CBSE Delhi 2018, 2019 C)
Antworten:
Kulturen mit kleinem Volumen können keine nennenswerten Produktmengen liefern. Um diese Produkte in großen Mengen herstellen zu können, war die Entwicklung von „Bioreaktoren“ erforderlich, in denen große Kulturmengen (100-1000 Liter) verarbeitet werden können. So kann man sich Bioreaktoren als Gefäße vorstellen, in denen Rohstoffe mit mikrobiellen, pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Zellen oder einzelnen Enzymen biologisch in spezifische Produkte umgewandelt werden.

Rolle. Ein Bioreaktor bietet durch optimale Wachstumsbedingungen (Temperatur, pH, Substrat, Salze, Vitamine, Sauerstoff) die optimalen Bedingungen, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Einer der am häufigsten verwendeten Bioreaktoren ist vom Rührtyp.

Ein Rührkesselreaktor ist zylindrisch oder ein Behälter mit gewölbtem Boden, der das Mischen des Reaktorinhalts erleichtert. Der Rührer ermöglicht eine gleichmäßige Durchmischung und Sauerstoffverfügbarkeit im gesamten Bioreaktor. Alternativ kann Luft durch den Reaktor geleitet werden. Es besteht aus einem Rührsystem, einem Sauerstoffzufuhrsystem, einem Schaumkontrollsystem, einem Temperaturkontrollsystem, einem pH-Kontrollsystem und Probenahmeöffnungen, damit kleine Mengen der Kultur periodisch entnommen werden können.

(a) Einfacher Rührtank-Bioreaktor (b) Bespülter Rührtank-Bioreaktor, durch den sterile Luftblasen gespült werden

Frage 26.
Beschreiben Sie kurz Folgendes:
(i) Ursprung der Replikation (Ori).
Antworten:
(a) Es ist eine spezifische Sequenz von DNA-Basen, die für die Initiierung der Replikation verantwortlich ist.
(b) Eine fremde DNA für die Replikation sollte mit dem Replikationsursprung verknüpft werden.
(c) Eine prokaryontische DNA hat normalerweise einen einzigen Replikationsursprung, während eukaryontische DNA mehr als einen Replikationsursprung haben kann.
(d) Die Sequenz ist für die Kontrolle der Kopienzahl der verknüpften DNA verantwortlich.

(ii) Bioreaktor.
Antworten:
(a) Sie sind Gefäße, in denen Rohstoffe mit Hilfe von mikrobiellen, pflanzlichen oder menschlichen Zellen in bestimmte Produkte biologisch umgewandelt werden.
(b) Ein Bioreaktor bietet optimale Bedingungen, um das gewünschte Produkt zu erhalten, indem er optimale Wachstumsbedingungen, pH, Substratsalze, Vitamine, Sauerstoff usw. bereitstellt.
(c) Die üblicherweise verwendeten Bioreaktoren sind vom Rührtyp.
(d) Ein Rührkesselreaktor ist normalerweise zylindrisch oder hat einen gewölbten Boden, um das Mischen des Inhalts zu erleichtern.
(e) Der Rührer erleichtert das gleichmäßige Mischen und die Sauerstoffverfügbarkeit im gesamten Bioreaktor.
(f) Der Bioreaktor hat die folgenden Komponenten:

  • Ein Rührwerk.
  • Ein Sauerstoffversorgungssystem.
  • Ein Schaumkontrollsystem.
  • Ein Temperaturkontrollsystem.
  • pH-Kontrollsystem und
  • Sampling-Ports.

(iii) Nachgelagerte Verarbeitung.
Antworten:
(a) Er bezieht sich auf die Reihe von Prozessen, denen ein genetisch verändertes Produkt unterzogen werden muss, bevor es marktreif ist.
(b) Die Prozesse umfassen zwei Prozesse:

(c) Das Produkt muss mit geeigneten Konservierungsmitteln formuliert werden.
(d) Eine solche Formulierung muss im Fall von Arzneimitteln gründlichen klinischen Prüfungen unterzogen werden. Strenge Qualitätskontrollen sind ebenfalls erforderlich.
(e) Eine ordnungsgemäße qualitätskontrollierte Prüfung jedes Produkts ist ebenfalls erforderlich.

Frage 27.
Welche weiteren Vorteile haben Rührkesselbioreaktoren neben besseren Belüftungs- und Mischeigenschaften gegenüber Schüttelkolben?
Antworten:
Schüttelkolben sind die herkömmlichen Kolben für Fermentationsstudien während des Sekundärscreenings oder der Laborprozessentwicklung. So werden Rührkessel-Bioreaktoren verwendet, um das Produkt in großen Mengen herzustellen.

Außer Belüften und Mischen:

  1. es hilft auch bei der Bereitstellung optimaler Wachstumsbedingungen (Temperatur, pH, Substrat, Salze, Vitamine, Sauerstoff), um das gewünschte Produkt zu erzielen.
  2. kosteneffizient
  3. durch Leitbleche ist die Sauerstoffübertragungsrate sehr hoch
  4. die Kapazität von Fermentern ist mehr.

Frage 28.
Erklären Sie kurz Folgendes
(i) PCR
(ii) Restriktionsenzyme und DNA
(iii) Chitinase. (CBSE-2012)
Oder
Erklären Sie die drei Schritte einer Polymerase-Kettenreaktion. (CBSE Delhi 2018C)
Antworten:
(i) PCR-Polymerase-Kettenreaktion Es ist der Prozess, bei dem mehrere Kopien des interessierenden Gens oder DNA-Segments in vitro unter Verwendung von Primern und DNA-Polymerase synthetisiert werden.

Wirkmechanismus der PCR: Ein einzelner PCR-Amplifikationszyklus umfasst drei grundlegende Schritte: Denaturierung, Annealing und Extension (Polymerisation).
(a) Denaturierung. Im Denaturierungsschritt wird die Ziel-DNA auf eine hohe Temperatur (normalerweise 94 °C) erhitzt, was zur Trennung der beiden Stränge führt. Jeder einzelne Strang der Ziel-DNA fungiert dann als Matrize für die DNA-Synthese.

(b) Glühen (Glühen = Verbinden). In diesem Schritt binden (hybridisieren) die beiden Oligonukleotidprimer an jede der einzelsträngigen Matrizen-DNA, da die Sequenz der Primer komplementär zu den 3'-Enden der Matrizen-DNA ist. Dieser Schritt wird je nach Länge und Sequenz der Primer bei einer niedrigeren Temperatur durchgeführt.

(c) Primer-Extension (Polymerisation): Der letzte Schritt ist eine Extension, wobei die Taq-DNA-Polymerase (eines thermophilen Bakteriums Thermus aquatics) die Synthese der DNA-Region zwischen den Primern unter Verwendung von dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphaten) und Mg 2+ bewirkt. Das bedeutet, dass die Primer gegeneinander verlängert werden, sodass der zwischen den beiden Primern liegende DNA-Abschnitt kopiert wird.

Die optimale Temperatur für diesen Polymerisationsschritt beträgt 72 °C. Um den zweiten Zyklus zu beginnen, wird die DNA erneut erhitzt, um die gesamte neu synthetisierte DNA in Einzelstränge umzuwandeln, von denen jeder nun als Matrize für die Synthese weiterer neuer DNA dienen kann. Somit kann das Verlängerungsprodukt eines Zyklus als Matrize für nachfolgende Zyklen dienen und jeder Zyklus verdoppelt im Wesentlichen die DNA-Menge des vorherigen Zyklus. Als Ergebnis ist es möglich, aus einem einzigen Template-Molekül nach n Zyklen 2 n Moleküle zu erzeugen.

  • Diagnose des Erregers
  • Diagnose der spezifischen Mutation
  • DNA-Fingerabdruck-Methode
  • Nachweis von Pflanzenpathogenen
  • Klonen von DNA-Fragmenten aus mumifizierten Überresten von Menschen und ausgestorbenen Tieren.

(ii) Restriktionsenzyme:
(a) Sie werden „molekulare Schere“ oder chemische Skalpelle genannt.
(b) Restriktionsenzyme, die von Mikroorganismen als Abwehrmechanismus synthetisiert werden, sind spezifische Endonukleasen, die doppelsträngige DNA spalten können.
(c) Restriktionsenzyme gehören zu einer Klasse von Enzymen, die Nukleasen genannt werden.
(d) Es gibt zwei Arten:

  • Exonukleasen, die Nukleotide von den Enden der DNA entfernen.
  • Endonukleasen, die die DNA an bestimmten Positionen irgendwo in ihrer Länge (innerhalb) schneiden.

(e) Die Erkennungssequenz ist ein Palindrom, bei dem die Sequenz der Basenpaare auf beiden DNA-Strängen gleich ist, wenn die Leserichtung gleich bleibt, dh 5′ → 3′ Richtung oder 3′ → 5&# 8242 Richtung.
z.B. 5′ – GAATTC – 3′
3′ – CTTAAG – 5′

(f) Jede Restriktionsendonuklease funktioniert durch Inspizieren der Länge einer DNA-Sequenz und bindet an die DNA an der Erkennungssequenz.
(g) Es schneidet die beiden Stränge der Doppelhelix an bestimmten Punkten in ihren Zucker-Phosphat-Rückgraten, etwas entfernt von der Mitte der Palindromstellen, aber zwischen den gleichen beiden Basen auf beiden Strängen.
(h) Als Ergebnis werden an den Enden der DNA einzelsträngige Abschnitte erzeugt, die als klebrige Enden bezeichnet werden. Diese Klebrigkeit des Endes erleichtert die Wirkung des Enzyms DNA-Ligase.

  1. Wenn sie mit derselben Restriktionsendonuklease geschnitten werden, ergeben die DNA-Fragmente (sowohl des Spenders als auch des Wirts/Empfängers) die gleiche Art von „klebrigen Enden“, die durch DNA-Ligasen Ende an Ende verbunden werden können.
  2. Chitinase. Diese Zellwand bei Pilzen besteht aus Chitin. Das Enzym wird in Pilzen verwendet, um die Zelle aufzubrechen, um DNA zusammen mit ihren Makromolekülen wie RNA-Proteinen, Lipiden und Polysacchariden freizusetzen.

Frage 29.
Besprechen Sie mit Ihrem Lehrer und finden Sie heraus, wie Sie unterscheiden können
(i) Plasmid-DNA und chromosomale DNA
Antworten:
Unterschiede zwischen Plasmid-DNA und chromosomaler DNA:

Plasmid-DNA Chromosomale DNA
1. Es ist ein selbstreplizierendes DNA-Molekül, das natürlich in vielen Bakterien und Hefen vorkommt. 1. Chromosomale DNA, die in den Chromosomen aller Organismen vorhanden ist.
2. Es ist für normales Wachstum und Teilung nicht unbedingt erforderlich. 2. Es ist wichtig für Wachstum und Teilung.
3. Es enthält Informationen zu einigen Merkmalen. 3. Es enthält Informationen zu allen Merkmalen.

(ii) Exonuklease und Endonuklease (CBSE, Delhi 2013)
Antworten:
Unterschiede zwischen Exonuklease und Endonuklease:

Endonuklease Exonuklease
Es schneidet die DNA an einer bestimmten Position von Stickstoffbasen irgendwo innerhalb der DNA-Länge außer den Enden. Dieses Enzym entfernt Nukleotide von den Enden der 5’- oder 3’-Enden von DNA-Molekülen.

Frage 30.
Sammeln Sie die Beispiele palindromischer Sequenzen, indem Sie sich an Ihren Lehrer wenden. Versuchen Sie besser, eine palindromische Sequenz zu erstellen, indem Sie den Basenpaarregeln folgen.
Antworten:

Frage 31.
Können Sie 10 rekombinante Proteine ​​aufzählen, die in der medizinischen Praxis verwendet werden? Finden Sie heraus, wo sie als Therapeutika verwendet werden (benutzen Sie das Internet).
Antworten:

Rekombinantes Protein Therapeutische Anwendung
1. Insulin Zur Behandlung von Diabetes Mellitus
2. Menschliches Wachstumshormon Zur Behandlung von Zwergwuchs
3. Interferone Zur Behandlung von Viruserkrankungen, Krebs und AIDS.
4. Streptokinase Zur Behandlung von Thrombosen.
5. Tumornekrosefaktor Zur Behandlung von Sepsis und Krebs
6. Interleukine Zur Behandlung verschiedener Krebsarten.
7. Hepatitis-B-Oberflächenantigen Der Impfstoff gegen Hepatitis B
8. Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor Zur Behandlung von Krebs und AIDS und bei der Knochenmarktransplantation
9. Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor Zur Behandlung von Krebs und AIDS
10. Rinderwachstumshormon Zur Steigerung der Milchleistung.

Frage 32.
Wie wird DNA in gereinigter Form isoliert? (CBSE außerhalb von Delhi 2009)
Antworten:
Isolierung von DNA in gereinigter Form:

  1. Für die Wirkung von Restriktionsenzymen muss DNA in reiner Form isoliert werden.
  2. DNA kann aus den Zellen freigesetzt werden, indem die Zellhülle durch die Verwendung von Enzymen wie Lysozym für Bakterienzellen, Chitinase für Pilzzellen und Cellulase für Pflanzenzellen verdaut wird.
  3. Da DNA mit Histonproteinen und RNAs verflochten ist, werden Proteine ​​durch Behandlung mit Proteasen und RNAs durch Ribonukleasen entfernt.
  4. Andere Verunreinigungen werden durch Anwendung geeigneter Behandlungen entfernt.
  5. Die gereinigte DNA wird durch Zugabe von gekühltem Ethanol ausgefällt. Es wird als feine Fäden in Suspension gesehen.

Frage 33.
Wie erfolgt die Isolierung und Fragmentierung von DNA von Interesse in der rekombinanten DNA-Technologie? (CBSE außerhalb von Delhi 2009, 2019)
Antworten:
1. DNA-Fragmentierung: Die DNA-Fragmentierung erfolgt durch Inkubation der gereinigten DNA-Moleküle mit geeigneten Restriktionsenzymen bei optimalen Temperatur- und pH-Bedingungen.

2. Isolierung von DNA (Gen) von Interesse:
(a) Die DNA-Fragmente werden durch eine Technik namens Gelelektrophorese getrennt.
(b) Die DNA wird durch Restriktionsendonukleasen in Fragmente geschnitten.
(c) Diese Fragmente werden durch eine Technik namens Gelelektrophorese getrennt.
(d) Als Matrix wird Agarose, das aus Algen gewonnene natürliche Polymer, verwendet.
(e) DNA-Fragmente, die negativ geladen sind, werden getrennt, indem sie gezwungen werden, sich unter einem elektrischen Feld durch die Matrix in Richtung der Anode zu bewegen.
(f) Die DNA-Fragmente werden entsprechend ihrer Größe getrennt/aufgelöst.
(g) Die getrennten Moleküle werden mit Ethidiumbromid gefärbt und durch Bestrahlung mit UV-Strahlung als leuchtend orangefarbene Banden sichtbar gemacht.
(h) Die getrennten DNA-Banden (auf dem Gel) werden aus dem Gel ausgeschnitten und aus dem Gelstück extrahiert (Elution).
(i) Solche DNA-Fragmente werden gereinigt und zur Konstruktion rekombinanter DNA verwendet, indem sie mit Klonierungsvektoren verbunden werden.


HincII (HindII) Restriktionsenzym

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A. P. und W. W. danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Unterstützung. G. W. dankt Don Comb und Jim Ellard für die jahrelange Unterstützung der Restriktionsenzymforschung, Rich Roberts und Bill Jack für die Ermutigung und den Mitgliedern der RE-Forschungsabteilung für zahlreiche Diskussionen. Wir danken unseren Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen Beiträge auf dem Gebiet der Restriktion und Modifikation, insbesondere denen, deren Arbeiten wir aus Platzgründen nicht zitiert haben. Wir danken den anonymen Gutachtern früher Versionen dieses Artikels, deren Kommentare und Vorschläge ihn stark verbessert haben.

† Die Autoren möchten wissen, dass ihrer Meinung nach die ersten beiden Autoren als gemeinsame Erstautoren anzusehen sind.


Restriktionsenzyme sind heute ein unverzichtbares Werkzeug für die Biotechnologie. Der Vorteil solcher Enzyme besteht darin, dass sie die Möglichkeit bieten, einen DNA-Doppelstrang sehr präzise zu durchtrennen. Bis heute wurden über 19.000 restriktive Enzyme identifiziert. Jedes dieser Enzyme erkennt ein spezifisches Nukleotidmuster in einer DNA-Sequenz. Es gibt vier Haupttypen von restriktiven Enzymen. Von diesen haben restriktive Enzyme vom Typ II aufgrund ihrer Nützlichkeit als Werkzeuge für die rekombinante DNA-Technologie die meiste Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Kommerziell sind derzeit über 300 Restriktionsenzyme vom Typ II mit über 200 verschiedenen Sequenzspezifitäten erhältlich. Es wurden weit weniger Restriktionsenzyme vom Typ I, III und IV charakterisiert, aber Studien mit diesen Enzymen liefern umfangreiche Informationen über DNA-Protein-Wechselwirkungen und -Katalyse, Proteinfamilienbeziehungen, Kontrolle der Restriktionsaktivität und Plastizität von Proteindomänen.

Im Jahr 1952 stellten Salvador Luria und seine Doktorandin Mary Human von der University of Illinois ein seltsames Phänomen fest, als sie Experimente zur Untersuchung des DNA-Aufbruchs in mit Phagen infizierten Bakterien durchführten. Sie hatten ihre Arbeit mit Escherichia coli begonnen und wechselten dann nach einem versehentlichen Zerbrechen ihres Reagenzglases voller phagenempfindlicher Escherichia coli-Kultur auf die Verwendung von Shigella-Bakterien. Zu ihrer Überraschung stellten sie fest, dass die Exposition gegenüber Shigella das Wachstum der Phagen (Viren) in Escherichia coli verhinderte, aber nicht in anderen Bakterienarten. In einer Reihe weiterer Experimente mit anderen Phagen und einer Reihe von Escherichia coli- und Shigella-Wirten stellten sie fest, dass einige Phagen verschwanden und dann wieder auftauchten, wenn sie mit anderen Bakterien kultiviert wurden, und dass die Phagen eine Generation später wieder im ursprünglichen Wirt wachsen konnten. Was auch immer die Veränderung in den Viren verursacht hatte, schlossen sie, war keine genetische Mutation, weil es sich nicht um eine dauerhafte Veränderung handelte. Vielmehr schien es durch die Wirtsbakterien verursacht zu werden.Sie bezeichneten den Prozess als "Wirtsinduzierte" genetische Variation, die später als Restriktionsmodifikationsphänomen bezeichnet wurde. Innerhalb eines Jahres berichteten auch andere Wissenschaftler, E. S. Anderson und A. Felix vom Central Enteric Reference Laboratory in London und Joe Bertani und Jean Weigle von der University of Illinois, über Beobachtungen der wirtskontrollierten Variation bei bakteriellen Viren. 1962 schlugen Werner Arber und seine Doktorandin Daisy Dussoix auf der Grundlage von Experimenten mit Lambda-Phagen vor, dass das Phänomen durch Restriktions- und Modifikationsenzyme erklärt werden könnte, die von Bakterien produziert werden, um sich gegen eindringende Viren zu verteidigen. Arber stellte die Hypothese auf, dass Bakterien ein Verdauungsenzym produzieren, das virale DNA an bestimmten Stellen in kleinere Stücke schneidet, und ein Enzym, das die Methylierung oder Modifikation ihrer eigenen DNA katalysiert, um sie vor dem restriktiven Enzym zu schützen. 1965 argumentierte Arber, dass, sollte es möglich sein, Restriktionsenzyme zu isolieren und zu charakterisieren, sie als Laborwerkzeug zur Spaltung von DNA verwendet werden könnten. Drei Jahre später identifizierten Werber und sein Postdoktorand Stuart Linn das erste Restriktionsenzym (EcoB) in Escherichia coli und zeigten seine Wirkung. Im selben Jahr identifizierten Matthew Meselson und sein Postdoktorand Robert Yuan von der Harvard University ein weiteres Restriktionsenzym, EcoK, aus Escherichia coli. Kurz darauf, im Juli 1970, gaben Hamilton Smith und Kent Wilcox bekannt, dass sie ein Restriktionsenzym (HindII) in einer zweiten Bakterienart, Haemophilus influenza, isoliert und charakterisiert und nachgewiesen haben, dass es die DNA eines fremden Phagen abbaut. Kurz darauf bestimmten Smith und sein Postdoktorand Thomas Kelly die Nukleotidsequenz der spezifischen Stelle, an der HindII die DNA spaltete. Dies bestätigte Arbers Hypothese, dass restriktive Enzyme sehr selektiv sind, wo sie ihre Schnitte vornehmen. Innerhalb kurzer Zeit wurde die grundlegende Wirkung von Restriktionsenzymen verstanden und 1971 demonstrierten Smiths Kollege Daniel Nathans und seine Doktorandin Kathleen Danna die HindII-gespaltene DNA des SV40-Virus in 11 wohldefinierte Fragmente und wie man diese Fragmente zusammenfügt, um die vollständige genetische Karte der SV40-DNA. Dies legte den Grundstein für die Einführung von Restriktionsenzymen für die DNA-Forschung.


Alles, was Sie schon immer über Restriktionsenzyme vom Typ II wissen wollten

Wofür werden Restriktionsenzyme vom Typ II verwendet?

Restriktionsenzyme vom Typ II sind die bekannten, die für alltägliche molekularbiologische Anwendungen wie Genklonierung und DNA-Fragmentierung und -Analyse verwendet werden. Diese Enzyme spalten DNA an festen Positionen in Bezug auf ihre Erkennungssequenz, wodurch reproduzierbare Fragmente und unterschiedliche Gelelektrophoresemuster erzeugt werden. Über 3.500 Typ-II-Enzyme wurden entdeckt und charakterisiert, die etwa 350 verschiedene DNA-Sequenzen erkennen. Tausende weitere &lsquoputative&rsquo Typ-II-Enzyme wurden durch die Analyse sequenzierter Bakterien- und Archaeengenome identifiziert, bleiben aber uncharakterisiert.

Wie werden Restriktionsenzyme vom Typ II benannt?

Restriktionsenzyme werden nach dem Mikroorganismus benannt, in dem sie entdeckt wurden. Das Restriktionsenzym &lsquoHindIII&rsquo ist beispielsweise die dritte von mehreren Endonuklease-Aktivitäten, die im Bakterium Haemophilus influenzae Serotyp d gefunden werden. Das Präfix &lsquoR.&rsquo wird manchmal hinzugefügt, um Restriktionsenzyme von den Modifikationsenzymen zu unterscheiden, mit denen sie in vivo zusammenarbeiten. Somit bezieht sich &lsquoR.HindIII&rsquo spezifisch auf das Restriktionsenzym und &lsquoM.HindIII&rsquo auf das Modifikationsenzym. Wenn keine Mehrdeutigkeit vorliegt, wird das Präfix &lsquoR.&rsquo weggelassen.

Eigenschaften von Restriktionsenzymen vom Typ II

Restriktionsenzyme vom Typ II sind hinsichtlich Aminosäuresequenz, Größe, Domänenorganisation, Zusammensetzung der Untereinheiten, Anforderungen an Cofaktoren und Wirkungsweisen sehr unterschiedlich. Sie werden nach ihrem enzymatischen Verhalten grob in etwa ein Dutzend Untertypen eingeteilt. Dies ist eine praktische Klassifizierung, die eher ihre Eigenschaften als ihre Phylogenie widerspiegelt. Es spiegelt nicht unbedingt evolutionäre oder strukturelle Beziehungen wider, und die Subtypen schließen sich nicht gegenseitig aus. Ein Enzym kann mehreren Subtypen angehören, wenn es jedes ihrer definierenden Merkmale aufweist. Wir besprechen diese Subtypen in ihrer Wichtigkeitsreihenfolge, die vier wichtigsten sind Typ IIP, IIS, IIC und IIT.


Anwendungen von Restriktionsenzymen (Bedeutung und Anwendung von Restriktionsendonukleasen in der Biotechnologie)

Restriktionsendonukleasen (auch als molekulare Schere bezeichnet) sind eine Klasse von Nukleaseenzymen, die den DNA-Strang an genauen Stellen schneiden. Sie sind spezifische Endonuklease-Enzyme in den Zellen, die zuerst die spezifische Sequenz (sogenannte Restriktionsstellen) innerhalb des DNA-Strangs erkennen und das Phosphodiester-Rückgrat der DNA an bestimmten Stellen spalten.

Den Nobelpreis 1978 (für Physiologie und Medizin) teilten sich Werner Arbor, Daniel Nathans und Hamilton Smith für die Entdeckung von Restriktionsenzymen und deren Anwendungen in der Molekulargenetik. Restriktionsenzyme sind heute ein unvermeidliches Werkzeug für die Manipulation von DNA in verschiedenen Rekombinationsstudien sowohl in vitro und in vivo. Die Hauptanwendungen von Restriktionsenzymen sind:

(1). Erstellung von Restriktionskarten

(2). Konstruktion von DNA-Fingerabdrücken

(3). Rekombinante DNA-Technologie (rDNA-Technologie)

(1). Erstellung von Restriktionskarten:

Ö Beschränkungskarte: ein Diagramm oder eine Karte des DNA-Moleküls eines Organismus, die spezifische Spaltungsstellen (Restriktionsstellen) zeigt.
Ø Die Konstruktion von Restriktionskarten war eine der ersten beschriebenen Verwendungen von Restriktionsenzymen.
Ø Restriktionskarten werden verwendet, um DNA-Fragmente zu identifizieren, die spezifische Gene enthalten.
Ø Die Daten vieler Restriktionsverdaus einer gemeinsamen DNA-Probe werden kombiniert, um eine vollständige und genaue Restriktionskarte zu erstellen.
Ø Restriktionskarten sind auch Design- und Engineering-Klonierungsvektoren und -Plasmide.

Wie erstellt man eine Restriktionskarte?

& Nehmen Sie die Proben-DNA in 'x' Anzahl von Fläschchen.
& 'x' ist die Anzahl der Restriktionsenzyme, die wir haben (Beispiel 5).
& Behandeln Sie die Proben-DNA separat mit dem spezifischen Restriktionsenzym.
& Nach dem Restriktionsverdau die DNA-Probe auf einem 2% Agarosegel zusammen mit dem DNA-Marker zur Trennung von DNA-Fragmenten laufen lassen.

& Auf Agarosegel bewegt sich das kleinste Fragment am schnellsten und befindet sich am unteren Rand des Gels.

& Dann ermitteln Sie die Größe jedes Fragments und zeichnen Sie eine Karte entsprechend der Größe der Fragmente und der Gesamtgröße der intakten DNA wie in der folgenden Abbildung.

2. Konstruktion von DNA-Fingerabdrücken:

Ø DNA-Fingerprinting ist eine forensische Technik, die verwendet wird, um Personen anhand der Variationen ihrer DNA-Sequenzen zu identifizieren.
Ø Für den DNA-Fingerabdruck stehen mittlerweile viele Methoden zur Verfügung, und die genaueste sind Methoden, die auf der DNA-Sequenzierung basieren.
Ø Restriktionsenzyme können auch verwendet werden, um DNA-Fingerabdrücke zu konstruieren.
Ø DNA-Fingerprinting mit Restriktionsenzymen ist eigentlich eine erweiterte Version von DNA-Restriktionskarten.

Ø Das Prinzip des DNA-Fingerprintings besteht darin, dass die verschiedenen Stämme oder Spezies der DNA-Proben leicht unterschiedliche Restriktionskarten haben.

Ø Dieser Unterschied in den Restriktionskarten ist auf ihren Unterschied in den DNA-Sequenzen zurückzuführen.

Ø Da Restriktionsenzyme in ihrer Wirkung sequenzspezifisch sind, werden auch die erhaltenen Restriktionskarten je nach Ausmaß der DNA-Sequenzunterschiede erhebliche Schwankungen aufweisen.

Ø Die DNA-Regionen in einem Organismus, die beim Restriktionsverdau sehr variabel sind, erzeugen einzigartige DNA-Fingerabdrücke.

Ø Diese Funktion wird beim DNA-Fingerprinting zur Identifizierung von Mutationen oder Variationen innerhalb des Genoms einer Population verwendet.

Ø Variationen in den DNA-Fingerabdrücken können verwendet werden, um Individuen in einer großen heterogenen Population zu identifizieren.

Ø Solche DNA-Fingerabdrücke werden häufig bei der Lösung von Vaterschaftsstreitigkeiten, der Identifizierung von Verdächtigen in der Forensik usw. verwendet.

Wie konstruiere ich einen DNA-Fingerabdruck?

Hier verwenden wir die DNA-Probe aus einer forensischen Untersuchung (ein Vergewaltigungsfall)

$ DNA wird von (1) dem Opfer, (2) dem Beweismaterial (wie Sperma, Blut oder Haaren) und (3) dem/den Verdächtigen(n) isoliert.

$ Anschließend wird die DNA-Probe mit einem bestimmten Restriktionsenzym verdaut.

$ Fragmente nach Restriktionsverdau werden auf einem Agarosegel aufgetrennt.

$ Nach der Elektrophorese werden die DNA-Fragmente mittels Southern-Blotting-Technik auf eine Nylonmembran geblottet (übertragen).

$ Die gebundene DNA wird dann denaturiert und anschließend mit radioaktiv markierten Sonden behandelt.

$ Die markierten DNA-Sonden hybridisieren spezifisch an die Restriktionsfragmente auf der Nylonmembran, die aus dieser Region stammen.

$ Die markierten Fragmente werden dann durch Autoradiographie identifiziert.

$ Nachfolgend finden Sie eine schematische Darstellung des Autoradiogramms.

$ Aus den Ergebnissen geht hervor, dass der Verdächtige EIN “ ist der eigentliche Kriminelle in den Ermittlungen.

$ Um die Ergebnisse zu bestätigen, können verschiedene Restriktionsenzyme und entsprechende DNA-Sonden verwendet werden.

$ Vorteil des DNA-Fingerprintings in der Forensik:

@ Genaue Identifizierung des Täters mit molekularen Beweisen.

@ Durch die Kombination von PCR-Techniken kann sogar die winzige DNA-Probe, die am Tatort gewonnen wurde, zur Generierung von DNA-Fingerabdrücken verwendet werden.

3. Rekombinante DNA-Technologie (rDNA-Technologie)

Ø Die Rekombinationstechnologie ist eine künstliche Technik zur Herstellung rekombinierter DNA-Moleküle verschiedener Organismen durch Zusammenfügen oder Rekombinieren der DNA-Fragmente, die durch Restriktionsenzymbehandlung erzeugt wurden.

Ø Die erste rekombinante DNA wurde 1973 von Stanley N. Cohen und Herbert Boyer hergestellt.

Ø In ihrem Experiment kombinierten sie zwei Plasmide pSC-101 und pSC-102 (jeweils mit zwei separaten antibiotikaresistenten Genen) und die neu erzeugte rekombinierte DNA wurde in E. coli eingebaut.

Ø Das pSC-101 enthält das Gen für Tetracyclinresistenz.

Ø Das pSC-102 enthält das Gen für Kanamycinresistenz.

Ø Die transformierten Bakterien zeigen nach der Rekombination Resistenz gegen diese beiden Antibiotika.

Ø Viele verschiedene Techniken sind jetzt in der rekombinanten DNA-Technologie verfügbar.

Ø Die grundlegende rekombinante Technologie ist jedoch sehr einfach, wie im Folgenden erläutert:

Schritte in der rekombinanten DNA-Technologie

$ Der erste Schritt ist die Extraktion der Gesamt-DNA des Organismus, die das gewünschte interessierende Gen enthält.

$ Der nächste Schritt ist die Erzeugung von Fragmenten der obigen DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym.

$ Dann wird das DNA-Fragment, das das interessierende Gen enthält, in einen Klonierungsvektor eingefügt, um eine rekombinante oder chimäre DNA zu erzeugen. Der Klonierungsvektor kann ein Plasmid, ein Bakteriophage, ein Virus oder kleine künstliche Chromosomen wie YAS und BAC sein.

$ Führen Sie nach dem Klonen den rekombinierten Vektor in eine Wirtszelle wie ein Bakterium (E. coli) ein. Die meisten Klonierungsvektoren enthalten Sequenzen, die es ihnen ermöglichen, innerhalb der kompetenten Wirtszelle autonom zu replizieren.

$ Dann induzieren Sie die Expression des interessierenden Gens in der Wirtszelle, um das gewünschte Produkt zu produzieren.

$ Das Produkt kann durch geeignete nachgelagerte Verarbeitungstechniken aus dem Medium extrahiert werden.

(Bildquelle cc Wikipedia)

Restriktionsstelle in den Klonierungsvektoren

Ø Alle Klonierungsvektoren besitzen eine einzigartige Klonierungsstelle.

Ø Diese Klonierungsstelle enthält die Zielsequenz der spezifischen Restriktionsendonuklease, um eine ortsspezifische Insertion von Fremd-DNA zu ermöglichen.

Ø Die üblicherweise verwendeten Plasmidvektoren besitzen mehrere solcher Restriktionsstellen an der Klonierungsstelle und eine solche Stelle im Vektor wird multiple Klonierungsstelle oder Polylinker genannt.

Ø Restriktionsendonukleasen, die in der Rekombinationstechnologie verwendet werden, produzieren DNA-Fragmente mit einzelsträngigen Überhängen an ihren 3’- oder 5’-Enden.

Ø Diese Überhänge werden als klebrige Enden oder versetzte Enden bezeichnet.

Ø Diese klebrigen Überhänge können sehr einfach und spezifisch vorübergehend Basenpaare mit komplementären klebrigen Enden der gewünschten DNA-Fragmente bilden.

Ø Somit wird bei der einfachsten Art der Rekombination ein einziges Restriktionsenzym verwendet, um den Klonierungsvektor und das interessierende Gen zu schneiden.

Ø Aufgrund der Ähnlichkeit in der Sequenzkomplementarität kann die Verwendung eines einzelnen Restriktionsenzyms zwei Probleme verursachen: (1). Ligation des Vektors ohne Insertion und (2) die Orientierung des inserierten interessierenden Gens wird invertiert.

Ø Die Verwendung von zwei separaten Restriktionsenzymen kann dieses Problem überwinden.

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Es gibt drei Hauptgruppen von Restriktionsendonukleasen (REasen), die als Typ I, II und III bezeichnet werden (1, 2). Seit 1973 werden REasen und DNA-Methyltransferasen (MTasen) nach einem ursprünglichen Vorschlag von Smith und Nathans benannt (3). Sie schlugen vor, dass die Enzymnamen mit einem aus drei Buchstaben bestehenden Akronym beginnen sollten, wobei der erste Buchstabe der erste Buchstabe der Gattung ist, aus der das Enzym isoliert wurde, und die nächsten beiden Buchstaben die ersten beiden Buchstaben des Artnamens sind. Zusätzliche Buchstaben oder Zahlen können hinzugefügt werden, um einzelne Stämme oder Serotypen anzuzeigen. Somit ist das Enzym HindII war eines von vier Enzymen, die aus isoliert wurden h aemophilus in fluenzae Serotyp d. Die ersten drei Buchstaben des Namens wurden kursiv gedruckt. Später wurde ein formaler Vorschlag zur Benennung der Gene, die für REasen und MTasen kodieren, angenommen (4). Als nur eine Handvoll Enzyme bekannt waren, waren diese Schemata sehr nützlich, aber als mehr Enzyme gefunden wurden, oft aus verschiedenen Gattungen und Spezies mit Namen, deren dreibuchstabige Akronyme identisch wären, trat eine beträchtliche Nachlässigkeit bei den Namenskonventionen auf. Außerdem wissen wir jetzt, dass jeder Haupttyp von Enzymen Untertypen enthalten kann. Dies gilt insbesondere für die Typ-II-Enzyme, von denen mehr als 3500 charakterisiert wurden (5). In diesem Artikel gehen wir die Namenskonventionen noch einmal durch und skizzieren ein aktualisiertes Schema, das das aktuelle Wissen über die Komplexität dieser Enzyme einbezieht. Wir beschreiben eine Reihe von Namenskonventionen für REasen und ihre zugehörigen MTasen. Da die Homing-Endonukleasen (6) in analoger Weise benannt wurden, schlagen wir vor, ähnliche Richtlinien auf diese Enzymgruppe anzuwenden. Schließlich ist es wichtig zu erkennen, dass das Ziel dieses Dokuments darin besteht, eine Nomenklatur für diese Enzyme bereitzustellen, nicht eine rigorose Klassifikation.

Zunächst stellen wir eine Reihe allgemeiner Änderungen, Standardabkürzungen und Definitionen vor, die für die Verwendung empfohlen werden.

1. „Restriktionsenzym“ und „Restriktionsendonuklease“ sollten als Synonyme betrachtet werden und die Abkürzung REase (oder in einigen Fällen R) wird bevorzugt. Es kann jedoch auch die häufig verwendete Abkürzung ENase verwendet werden. Alternative Bezeichnungen wie Restriktionen sollten vermieden werden. Zur Restriktionsmodifikation sollte die Abkürzung R‐M verwendet werden. Homing-Endonuklease sollte mit HEase abgekürzt werden.

2. Methyltransferase ist der bevorzugte Name, da er die Aktivität richtig beschreibt. Methylase wird zwar allgemein verwendet, ist aber nicht genau richtig und sollte im Druck vermieden werden. Die Abkürzung MTase (oder in einigen Fällen M) sollte der Standard sein.

3. Kursivschrift wird nicht mehr für das erste aus drei Buchstaben bestehende Akronym des REase- oder MTase-Namens verwendet. Viele Zeitschriften vermeiden bereits Kursivschrift, und die Beibehaltung der Kursivschrift lässt sich nicht leicht auf Computer übertragen und erfüllt keinen wesentlichen Zweck. Die Konvention, verschiedene Enzyme aus demselben Isolat desselben Organismus mit steigenden römischen Ziffern zu benennen, wird fortgesetzt.

4. Namen von Restriktionsenzymen dürfen kein Leerzeichen zwischen dem Hauptakronym und der römischen Zahl enthalten. Diese Vorgehensweise, die verwendet wurde, um das unelegante Aussehen zu vermeiden, das verursacht wird, wenn Zeichen in kursiven Schriftarten neben Zeichen in einer normalen Schriftart nebeneinandergestellt werden, ist falsch. Da Kursivschrift in Namen nicht mehr verwendet wird, gibt es keinen Grund, diese Praxis fortzusetzen. Das bisherige Schema, einen erhabenen Punkt nach dem Präfix zu verwenden, wird aufgegeben und ein normaler Punkt (Punkt) sollte verwendet werden. Außer dem einzelnen Punkt oder Bindestrich (bei Homing-Endonukleasen), der verwendet wird, um das Präfix vom Hauptteil des Namens zu trennen, sollten in REase oder MTase keine Satzzeichen wie Klammern, Punkte, Kommas oder Schrägstriche verwendet werden Namen. Es sollten nur alphanumerische Zeichen erscheinen. Schon die Enzyme aus Nostoc Spezies C wurden von ihrem ursprünglichen Nsp(7524)I zu NspI geändert und viele andere haben sich ebenfalls geändert. Das neueste ist Bst4.4I, das in Bst44I geändert wurde.

5. Die Bezeichnung der drei Haupttypen von REasen als Typ I, Typ II und Typ III wird fortgesetzt, wobei das große „T“ bevorzugt wird. Sie werden jedoch wie unten angegeben in Untertypen unterteilt. Ein neuer REase-Typ wird hinzugefügt. Dies ist Typ IV, der diejenigen Systeme einschließt, die nur methylierte DNA als Substrat spalten und nur eine schwache Spezifität aufweisen, wie die McrA-, McrBC- und Mrr-Systeme von Escherichia coli.

6. Die Sequenzdatenbanken enthalten viele Gene, die aufgrund der Sequenzähnlichkeit ausgezeichnete Kandidaten für die Kodierung von DNA-MTasen und -REasen sind. Diese werden nach denselben Richtlinien benannt, die für biochemisch charakterisierte Enzyme verwendet werden, tragen jedoch das Suffix P, um ihre mutmaßliche Natur anzuzeigen. Sobald sie biochemisch charakterisiert und als aktiv nachgewiesen wurden, wird das P weggelassen und ihre Namen werden in einen regulären Namen mit der nächsten passenden römischen Zahl geändert.

7. Die derzeitige Konvention, R‐M‐Enzyme mit einem Präfix M, R usw. zu benennen, wird erweitert, um Proteinprodukte verwandter Gene wie die kontrollierenden Proteine ​​(z. B. C.BamHI) und die Nicking‐Enzyme, die G/ spalten, einzuschließen. T‐Fehlpaarungen (zB V.HpaII für das vsr‐ähnliche Enzym, das mit dem HpaII‐System assoziiert ist) und N.BstNBI für die regulären Nicking‐Enzyme. Darüber hinaus sind bis zu zwei Zeichen im Präfix zulässig. Dies wird es ermöglichen, dass Enzyme wie Eco57I, bei denen sowohl REase-Aktivität als auch MTase-Aktivität in einem einzigen Protein fusioniert sind, als RM.Eco57I bezeichnet werden. Seine begleitende MTase würde als M.Eco57I verbleiben. Beachten Sie, dass die derzeitige Konvention, die es erlaubt, die REase entweder mit oder ohne das Präfix „R“ zu benennen, fortgesetzt wird. Somit werden R.EcoRI und EcoRI ebenso wie RM.Eco57I und Eco57I als synonym betrachtet.Bei bestimmten Nicking-Enzymen, die aus Typ-IIT-Enzymen erhalten wurden, bei denen eine der beiden heterodimeren Untereinheiten inaktiviert wurde, sollten die resultierenden mutierten Nicking-Enzyme als Nt.BbvCI oder Nb.BbvCI bezeichnet werden, wobei das „t“ und das „b“ zeigen die Spaltung des oberen oder unteren Strangs der normalen Erkennungssequenz an.

8. Wenn zwei REase- oder MTase-Gene vorhanden und mit einem einzigen R‐M‐System assoziiert sind, sollte auf sie Bezug genommen werden, wobei das zweite Zeichen des Präfixes eine arabische 1 oder 2 ist. Somit sind die beiden M‐Genprodukte des HphI R‐ M-System wäre M1.HphI und M2.HphI.

9. Die Standardabkürzungen für methylierte Basen sollten 5‐Methylcytosin (m5C), N4‐Methylcytosin (m4C) und N6‐Methyladenin (m6A) lauten. Es ist nicht erforderlich, eine hochgestellte Zahl für die Zahl zu verwenden.

10. Isoschizomere sind REasen, die dieselbe Sequenz erkennen. Das erste entdeckte Beispiel wird als Prototyp bezeichnet und alle nachfolgenden Enzyme, die dieselbe Sequenz erkennen, sind Isoschizomere des Prototyps. Neoschizomere sind die Untergruppe von Isoschizomeren, die dieselbe Sequenz erkennen, aber an unterschiedlichen Positionen vom Prototyp abspalten. So sind AatII (Erkennungssequenz: GACGT↓C) und ZraI (Erkennungssequenz: GAC↓GTC) Neoschizomere voneinander, während HpaII (Erkennungssequenz: C↓CGG) und MspI (Erkennungssequenz: C↓CGG) Isoschizomere sind, aber keine Neoschizomere. Analoge Bezeichnungen sind für MTasen nicht geeignet, bei denen die Unterschiede zwischen den Enzymen nicht so einfach zu definieren und in der Regel nicht gut charakterisiert sind.

11. Die solitären MTasen (d. h. nicht mit einer REase assoziiert) wie die Dam- und Dcm-MTasen von E coli und die eukaryontischen MTasen wie Dnmt1 und Dnmt3a werden systematisch nach den allgemeinen Regeln benannt, die für die prokaryontischen Enzyme aufgestellt wurden. Der systematische Name für die Dam-MTase von E coli K12 wird M.EcoKDam sein und die murine Erhaltungs-MTase wird M.MmuDnmt1 sein. Es ist jedoch akzeptabel, auf sie mit ihren häufiger verwendeten Trivialnamen Dam, Dcm, Dnmt1 usw. erscheint auch zumindest zunächst in einer Veröffentlichung. Solitäre MTasen, die durch Phagen oder Viren übertragen werden, werden auch mit dem Präfix M und dem Namen des Phagen oder Virus bezeichnet, der sie trägt. Optional kann der Hostname enthalten sein. Somit ist die MTase, die von der Phagen-SPR von kodiert wird, Bacillus subtilis heißt M.SPRI (7) und die MTase, die vom Archaeenvirus ϕCh1 of . kodiert wird Natrialba magadii heißt M.NmaPhiCh1I (8).

12. Die Regeln für die Benennung von Genen von Typ II R‐M‐Systemen sollten den Vorschlägen von Szybalski . entsprechen et al. (4) mit den offensichtlichen Erweiterungen, um C-, V- und N-Gene aufzunehmen. Daher sollte der gesamte Name kursiv geschrieben werden, der erste Buchstabe wird klein geschrieben und der oder die Großbuchstaben, die als Präfix für das Protein verwendet werden, werden zum Suffix für das Gen. Das Gen für EcoRI wird somit zu ecoRIR und das für seine MTase ist ecoRIM. Bei Genen mit zwei Präfixen im Proteinnamen würde der Genname beide Buchstaben des Präfixes enthalten. Somit würde das Gen für RM.Eco57I zu eco57IRM. Bei Typ-I-Enzymen sollten einem Akronym für den Quellorganismus die traditionellen Genbezeichnungen hsdS, hsdR und hsdM folgen. Somit wären die drei Gene des EcoKI Restriktionssystems ecoKIhsdM, ecoKIhsdR und ecoKIhsdS. Es ist jedoch akzeptabel, die ecoKI gegebenenfalls.

13. Es kommt manchmal vor, dass für eine einzelne Enzymaktivität zwei Gene benötigt werden, die effektiv zwei Untereinheiten kodieren. In diesen Situationen sollten die beiden Gene und ihre Produkte ein Suffix A und B tragen. BbvCI ist beispielsweise eine heterodimere REase. Die beiden Genprodukte würden R.BbvCIA (oder einfach BbvCIA) und R.BbvCIB (oder einfach BbvCIB) genannt, und das aktive Holoenzym wäre BbvCI. Beachten Sie, dass die beiden separaten MTasen dieses Systems M1.BbvCI und M2.BbvCI sind. Für Enzyme wie Eco57I, die sowohl Endonuklease- als auch MTase-Aktivität in derselben Polypeptidkette aufweisen, würde die Endonuklease als RM.Eco57I bezeichnet, aber die zweite MTase-Aktivität, die mit diesem System verbunden ist, würde als M.Eco57I bezeichnet. Ein Beispiel für MTasen ist M.AquI, bei dem ein Gen die N‐terminale Region bis zur Mitte der variablen Region dieser m5C‐MTase kodiert und ein zweites Gen die restliche C‐terminale Region kodiert (9). In diesem Fall sollten die beiden Teile dieses Proteins als M.AquIA und M.AquIB bezeichnet werden und die Gene als aquIAM und aquIBM.


CBSE Class 12 Biology Revision Notes Kapitel 11 – Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse

Kostenloser PDF-Download von Klasse 12 Biologie Kapitel 11 – Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Revisionshinweise und kurze Key-Notes, die von erfahrenen Biologielehrern aus der neuesten Ausgabe der CBSE(NCERT)-Bücher erstellt wurden.

Prinzipien der Biotechnologie und Werkzeuge der DNA-Rekombinationstechnologie:
1. Biotechnologie kann definiert werden als die Verwendung von Mikroorganismen, Pflanzen oder tierischen Zellen oder deren Bestandteilen zur Herstellung von Produkten und Verfahren, die für den Menschen nützlich sind. Biotechnologie ist laut European Federation of Biotechnology (EFB) die Integration von Naturwissenschaften und Organismen, Zellen, Teilen davon und molekularen Analoga für Produkte und Dienstleistungen. Der Begriff Biotechnologie wurde 1919 von Karl Ereky geprägt.
2. Die Prinzipien der Biotechnologie basieren auf dem Konzept der folgenden Techniken:
(i) Gentechnik ist die Technik, die Chemie von genetischem Material (DNA/RNA) zu verändern, diese in andere Organismen einzuführen und somit den Phänotyp des Wirtsorganismus zu verändern.
(ii) Angemessene Aufrechterhaltung steriler Bedingungen, um das Wachstum nur der gewünschten Mikroben/eukaryontischen Zellen in großen Mengen für die Herstellung biotechnologischer Produkte wie Antibiotika, Impfstoffe, Enzyme usw. zu unterstützen.
3. Zu den Techniken der Gentechnik gehören:
(i) Erzeugung rekombinanter DNA durch Kombinieren gewünschter Gene.
(ii) Gentransfer.
(iii) Erhaltung der DNA bei der Wirts- und Genklonierung.
Die grundlegenden Schritte der Gentechnik lassen sich wie folgt zusammenfassen:
(i) Identifizierung von DNA mit wünschenswerten Genen.
(ii) Einführung der identifizierten DNA in den Wirt.
(iii) Erhaltung der eingeführten DNA in den Wirt, hrtd-Transfer der DNA auf ihre Nachkommen.
4. Konstruktion der ersten künstlichen rekombinanten DNA
(i) Es wurde erreicht, indem ein Gen, das eine Antibiotikaresistenz codiert, mit einem nativen Plasmid (einer autonom replizierenden zirkulären extrachromosomalen DNA) von Salmonella typhimurium verknüpft wurde.
(ii) Stanley Cohen und Herbert Boyer gelang dies 1972.
(iii) Sie isolierten das Antibiotikaresistenz-Gen, indem sie ein DNA-Stück aus einem Plasmid herausschneiden.
(iv) Das Schneiden von DNA an spezifischen Stellen erfolgte durch molekulare Scheren, d. h. Restriktionsenzyme.
(v) Das geschnittene DNA-Stück wurde dann mit dem Enzym DNA-Ligase an die Plasmid-DNA gebunden. Die Plasmid-DNA fungiert als Vektoren, um das daran befestigte DNA-Stück zu übertragen.
(vi) Wenn diese DNA in E. coli übertragen wird, könnte sie sich unter Verwendung des DNA-Polymerase-Enzyms des neuen Wirts replizieren und mehrere Kopien erstellen.
(vii) Diese Fähigkeit, Kopien des Antibiotikaresistenzgens in E. coli zu vermehren, wurde Klonen des Antibiotikaresistenzgens in E. coli genannt.
5. Werkzeuge der rekombinanten DNA-Technologie sind wie folgt:
(i) Restriktionsenzyme (ii) Polymerase-Enzyme
(iii) Ligasen (iv) Vektoren
(v) Kompetenter Wirtsorganismus.
6. Zum Schneiden von DNA werden Restriktionsenzyme oder „molekulare Scheren“ verwendet.
(i) 1963 wurden zwei Enzyme aus E. coli isoliert, die für die Einschränkung des Bakteriophagenwachstums verantwortlich waren. Eines davon fügte der DNA eine Methylgruppe hinzu und das andere schnitt DNA in Segmente. Letztere wurde als Restriktionsendonuklease bezeichnet.
(ii) Die erste Restriktionsendonuklease Hind II wurde von Smith Wilcox und Kelley (1968) isoliert. Sie fanden heraus, dass es DNA-Moleküle immer an einer bestimmten Stelle schneidet, indem es eine bestimmte Sequenz von sechs Basenpaaren, die als Erkennungssequenz bekannt ist, erkennt.
(iii) Außer Hind II wurden inzwischen mehr als 900 Restriktionsenzyme aus über 230 Bakterienstämmen isoliert, von denen jeder unterschiedliche Erkennungssequenzen erkennt.
(iv) Benennung von Restriktionsenzymen
(a) Der erste Buchstabe leitet sich vom Gattungsnamen ab und die nächsten beiden Buchstaben vom Artnamen der prokaryontischen Zelle, aus der Enzyme extrahiert werden.
(b) Die römischen Zahlen hinter dem Namen geben die Reihenfolge an, in der die Enzyme aus dem Bakterienstamm isoliert wurden.
Eco RI stammt beispielsweise aus Escherichia coli RY13 und Eco RII stammt aus E. coli R 245 usw.
(v) Restriktionsenzyme gehören zu einer Klasse von Enzymen, die Nukleasen genannt werden.
Es gibt zwei Arten von Nukleasen:
Exonukleasen Sie entfernen Nukleotide von den Enden.
Endonukleasen Sie schneiden an bestimmten Stellen innerhalb der DNA.
(a) Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische palindromische Nukleotidsequenz in der DNA.
(b) Palindrom in DNA ist a. Sequenz von Basenpaaren, die auf den beiden Strängen gleich liest, wenn die Leserichtung gleich bleibt.
Zum Beispiel liest sich die folgende Sequenz auf den beiden Strängen in 5'-> 3'-Richtung sowie in 3'-> 5'-Richtung gleich.
5′ — GAATTC — 3′
3′ — CTTAAG — 5′
(vi) Wirkmechanismus von Restriktionsenzymen

(a) Restriktionsenzyme schneiden den DNA-Strang etwas von der Mitte der Palindrom-Stellen weg, aber zwischen denselben beiden Basen auf den gegenüberliegenden Strängen.
(b) Dies hinterlässt einzelsträngige Abschnitte an den Enden.
(c) Es gibt überhängende Abschnitte, die als klebrige Enden bezeichnet werden, an jedem Strang, wie in der obigen Abbildung gezeigt. Diese werden so genannt, weil sie mit ihren komplementär geschnittenen Gegenstücken Wasserstoffbrückenbindungen bilden.
(d) Die Klebrigkeit der Enden erleichtert die Wirkung des Enzyms DNA-Ligase.
(e) Restriktionsendonukleasen werden in der Gentechnik verwendet, um rekombinante DNA-Moleküle zu bilden, die aus DNA aus unterschiedlichen Quellen/Genomen bestehen.
(f) Diese klebrigen Enden sind zueinander komplementär, wenn sie durch das gleiche Restriktionsenzym geschnitten werden, und können daher unter Verwendung von DNA-Ligasen (Ende-zu-Ende) miteinander verbunden werden.
7. Trennung und Isolierung von DNA-Fragmenten
(i) Das Schneiden von DNA durch Restriktionsendonukleasen führt zu DNA-Fragmenten.
(ii) Die Technik, die DNA-Fragmente nach ihrer Größe trennt, wird Gelelektrophorese genannt.
(iii) DNA-Fragmente sind negativ geladene Moleküle. Sie können getrennt werden, indem sie gezwungen werden, sich unter einem elektrischen Feld durch ein Medium/eine Matrix in Richtung der Anode zu bewegen.
(iv) Das am häufigsten verwendete Medium ist Agarose, ein natürliches Polymer, das aus Meeresalgen extrahiert wird.
(v) Die DNA-Fragmente werden nach ihrer Größe durch Siebwirkung des Agarosegels getrennt (aufgelöst). Je kleiner die Fragmentgröße, desto weiter bewegt es sich.

(vi) Die getrennten DNA-Fragmente können nur sichtbar gemacht werden, nachdem die DNA mit einer als Ethidiumbromid bekannten Verbindung gefärbt und anschließend UV-Strahlung ausgesetzt wurde.
(vii) Die DNA-Fragmente können als leuchtend orangefarbene Banden gesehen werden. Diese getrennten Banden werden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aus dem Gelstück extrahiert. Dies wird Elution genannt.
(viii) Die gereinigten DNA-Fragmente können beim Konstruieren rekombinanter DNA verwendet werden, indem sie mit Klonierungsvektoren verbunden werden.
8. Klonierungsvektoren sind die DNA-Moleküle, die ein fremdes DNA-Segment in die Wirtszelle tragen können.
(i) Die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendeten Vektoren können sein:
(a) Plasmide Autonom replizierende zirkuläre extrachromosomale DNA.
(b) Bakteriophagen Viren, die Bakterien infizieren.
(c) Cosmide Hybridvektoren, abgeleitet von Plasmiden, die die cos-Stelle des X-Phagen enthalten.
(ii) Die Kopienzahl kann als die Anzahl der Kopien von Vektoren definiert werden, die in einer Zelle vorhanden sind.
(iii) Bakteriophagen haben eine hohe Anzahl pro Zelle, so dass ihre Kopienzahl auch im Genom hoch ist.
(iv) Plasmide haben nur eine oder zwei Kopien pro Zelle.
(v) Die Kopienanzahl kann von 1-100 oder mehr als 100 Kopien pro Zelle variieren.
(vi) Wenn ein fremdes DNA-Stück mit Bakteriophagen- oder Plasmid-DNA verknüpft ist, kann seine Anzahl gleich der Kopienzahl des Plasmids oder Bakteriophagen multipliziert werden.
(vii) Erforderliche Funktionen zum Erleichtern des Klonens in Vektor
(a) Replikationsursprung (Ori) (b) selektierbarer Marker
(c) Klonierungsstellen (d) Vektoren zum Klonen von Genen in Pflanzen und Tieren.
(a) Der Replikationsursprung (Ori) ist eine Sequenz, von der aus die Replikation beginnt.
• Jedes DNA-Stück, wenn es mit dieser Sequenz verbunden ist, kann dazu gebracht werden, innerhalb der Wirtszellen zu replizieren.
Die Sequenz ist auch für die Kontrolle der Kopienzahl der verknüpften DNA verantwortlich.
(ii) Ein selektierbarer Marker hilft bei der Identifizierung und Eliminierung von Nicht-Transformanten und erlaubt selektiv das Wachstum der Transformanten.
• Transformation ist ein Prozess, bei dem ein DNA-Stück in ein Wirtsbakterium eingeführt wird.
• Die Gene, die Resistenzen gegen Antibiotika wie Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracyclin oder Kanamycin usw. kodieren, sind einige nützliche Selektionsmarker für E. coli.

• Die Ligation fremder DNA erfolgt an einer Restriktionsstelle, die in einem der beiden Antibiotikaresistenzgene vorhanden ist. Ein Beispiel ist das Ligieren einer Fremd-DNA an der BamHI-Stelle des Tetracyclin-Resistenzgens in den Vektor pBR322.
-» Die rekombinanten Plasmide verlieren durch die Insertion fremder DNA die Tetracyclinresistenz. Es kann jedoch immer noch aus nicht-rekombinanten ausgewählt werden, indem die Transformanten auf Ampicillin enthaltendes Medium ausplattiert werden.
-» Die auf Ampicillin-enthaltendem Medium wachsenden Transformanten werden dann auf ein Tetracyclin-enthaltendes Medium übertragen.
-» Die Rekombinanten wachsen in Ampicillin-haltigem Medium, jedoch nicht auf Tetracyclin-haltigem.
Die Nicht-Rekombinanten wachsen auf dem Medium, das beide Antibiotika enthält.
In diesem Beispiel hilft ein Antibiotikaresistenzgen bei der Selektion der Transformanten, während das andere Antibiotikaresistenzgen durch die Insertion fremder DNA „inaktiviert“ wird und bei der Selektion von Rekombinanten hilft.
* Die Auswahl von Rekombinanten aufgrund der Inaktivierung von Antibiotika ist ein mühsames Verfahren, daher werden alternative selektierbare Marker entwickelt, die Rekombinanten von Nicht-Rekombinanten auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, in Gegenwart eines chromogenen Substrats Farbe zu erzeugen, unterscheiden.
-» Bei dieser Methode wird eine rekombinante DNA in die kodierende Sequenz eines Enzyms J3-Galactosidase eingefügt.
-» Dies führt zur Inaktivierung des Enzyms P-Galactosidase (Insertionsinaktivierung).
-> Die Bakterienkolonien, deren Plasmide kein Insert haben, produzieren eine blaue Farbe, andere jedoch keine Farbe, wenn sie auf einem chromogenen Substrat gezüchtet werden.
(c) Klonierungsstellen sind erforderlich, um die fremde DNA mit dem Vektor zu verknüpfen.
• Der Vektor benötigt sehr wenige oder einzelne Erkennungsstellen für die üblicherweise verwendeten Restriktionsenzyme.
• Das Vorhandensein von mehr als einer Erkennungsstelle innerhalb des Vektors erzeugt mehrere Fragmente, was zu Komplikationen bei der Genklonierung führt.
(d) Es gibt viele Vektoren zum Klonen von Genen in Pflanzen und Tieren, die verwendet werden, um Gene in Pflanzen und Tieren zu klonen.
• In Pflanzen wird das Tumor-induzierende (Ti)-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens als Klonierungsvektor verwendet.
-» Agrobacterium tumefaciens ist ein Krankheitserreger mehrerer zweikeimblättriger Pflanzen.
-» Es liefert ein DNA-Stück namens T-DNA im Ti-Plasmid, das normale Pflanzenzellen in Tumorzellen umwandelt, um Chemikalien zu produzieren
von Krankheitserregern benötigt.
• Retrovirus, Adenovirus und Papillomavirus werden jetzt auch als Klonierungsvektoren bei Tieren verwendet, da sie normale Zellen in Krebszellen umwandeln können.
9. Kompetenter Wirtsorganismus (zur Transformation mit rekombinanter DNA) ist erforderlich, da DNA als hydrophiles Molekül die Zellmembranen nicht passieren kann. Daher sollten die Bakterien kompetent gemacht werden, um die DNA-Moleküle aufzunehmen.
(i) Kompetenz ist die Fähigkeit einer Zelle, fremde DNA aufzunehmen.
(ii) Verfahren, um eine Zelle kompetent zu machen, sind wie folgt.
(a) Chemisches Verfahren Bei diesem Verfahren wird die Zelle mit einer spezifischen Konzentration von | . behandelt ein zweiwertiges Kation wie Calcium, um die Porengröße in der Zellwand zu erhöhen.
Anschließend werden die Zellen mit rekombinanter DNA auf Eis inkubiert, anschließend kurz bei 42 °C platziert und dann wieder auf Eis gelegt. Dies wird als Hitzeschockbehandlung bezeichnet.
• Dadurch können die Bakterien die rekombinante DNA aufnehmen.
(b) Physikalische Verfahren Bei diesem Verfahren wird eine rekombinante DNA direkt durch ein Mikroinjektionsverfahren in den Kern einer tierischen Zelle injiziert.
• In Pflanzen werden Zellen mit Hochgeschwindigkeits-Mikropartikeln aus Gold oder Wolfram, die mit DNA beschichtet sind, beschossen, was als Biolistik- oder Gen-Gun-Methode bezeichnet wird.
(c) Entwaffnete Krankheitserregervektoren, wenn sie die Zelle infizieren dürfen, übertragen die rekombinante
DNA in den Wirt.


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