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Wird die gesamte DNA von den Genen verwendet (die DNA kodiert)?

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Meine Intuition sagt mir nein, da nur 1,5-2% aus Exons bestehen, daher wäre diese Aussage falsch. Die richtige Aussage müsste lauten: Nur etwa 1,5-2% der gesamten DNA werden von Genen (kodierende DNA) verwendet.

Liege ich mit dieser Annahme richtig?


Das ENCODE-Konsortium klassifiziert Genomelemente von Mensch und Maus, um genau diese Frage zu beantworten.

Arbeiten von ENCODE legten nahe, dass bis zu 80 % des Genoms in irgendeiner Weise funktionsfähig sind. Mit anderen Worten, nach dieser Messung der oberen Grenze spielt die Rolle der DNA in der Biologie offenbar mehr als nur die Kodierung von Genen eine Rolle – unter der Haube passiert viel.

Fall für reichlich funktionelle genomische Elemente.

Genomweite biochemische Studien, einschließlich neuerer Berichte von ENCODE, haben eine durchdringende Aktivität über einen unerwartet großen Anteil des Genoms gezeigt, einschließlich nicht kodierender und nicht konservierter Regionen und Wiederholungselemente (58⇓-60). Solche Ergebnisse erhöhen die Schätzungen der oberen Schranken von funktionellen Kandidatensequenzen stark ( 2 und S2). Viele menschliche Genomregionen, die früher als nicht funktionsfähig galten, strotzen vor kurzem vor biochemischer Aktivität, einschließlich Teilen von Wiederholungselementen, die durch Transkriptionsfaktoren gebunden und transkribiert werden können (79, 80), und man nimmt an, dass sie manchmal in neue umgewandelt werden Regulierungsregionen (81⇓⇓-84). Außerhalb der 1,5% des Genoms, die von der proteinkodierenden Sequenz bedeckt sind, sind 11% des Genoms mit Motiven in Transkriptionsfaktor-gebundenen Regionen oder hochauflösenden DNase-Fußabdrücken in einem oder mehreren Zelltypen assoziiert (Abb. 2), was auf direktes hinweist Kontakt durch regulatorische Proteine. Transkriptionsfaktor-Belegung und Nukleosomenauflösungs-DNase-Überempfindlichkeitskarten überlappen sich stark und decken jeweils etwa 15% des Genoms ab. Insgesamt markieren Histonmodifikationen, die mit Promotoren oder Enhancern verbunden sind, 20% des Genoms, während ein Drittel des Genoms durch Modifikationen gekennzeichnet ist, die mit der Transkriptionsverlängerung verbunden sind. Mehr als die Hälfte des Genoms weist mindestens eine repressive Histonmarkierung auf. In Übereinstimmung mit früheren Befunden der pervasiven Transkription (85, 86) decken ENCODE-Karten polyadenylierter und Gesamt-RNA insgesamt mehr als 75 % des Genoms ab. [emp. hinzugefügt]

Personen außerhalb des ENCODE-Konsortiums haben diese Forschung jedoch mit sehr starker Sprache kritisiert, wie in diesem Artikel des bekannten Kritikers Dan Graur:

Tatsächlich hätten die ENCODE-Autoren jeden beliebigen Prozentsatz als „funktional“ wählen können, und … sie taten es! In ihren wissenschaftlichen Veröffentlichungen förderte ENCODE die Idee, dass 80 % des menschlichen Genoms funktionsfähig seien. Die wissenschaftlichen Kommentatoren folgten und verkündeten, dass mindestens 80 % des Genoms „aktiv und benötigt“ seien (Kolata 2012). Anschließend gab einer der Hauptautoren von ENCODE zu, dass die Pressekonferenz die Menschen irreführte, indem sie behauptete, 80% unseres Genoms seien „wesentlich und nützlich“. Er bezifferte diese Zahl auf 40 % (Gregory 2012), obwohl ein anderer Erstautor den Anteil des Genoms, der der Funktion gewidmet ist, auf lediglich 20 % reduzierte (Hall 2012). Interessanterweise bestand ein Hauptautor von ENCODE, selbst als er den funktionellen Genomanteil auf 20 % reduzierte, weiterhin darauf, dass der Begriff „Junk-DNA“ „völlig aus dem Lexikon gestrichen“ werden muss und erfand eine neue Arithmetik, nach der 20 % > 80%. Die Zeitschrift Nature hat in ihrer Zusammenfassung des Jahres 2012 die bescheidenere Schätzung angenommen und die Ergebnisse von ENCODE mit der Aussage zusammengefasst, dass „mindestens 20 % des Genoms die Genexpression beeinflussen können“ (Van Noorden 2012). Die Wissenschaft hielt an ihren maximalistischen Geschützen fest, und ihre Zusammenfassung von 2012 wiederholte die Behauptung, dass der „funktionelle Teil“ des menschlichen Genoms 80 % beträgt (Anonym 2012). Leider basieren weder 80 % noch 20 % auf tatsächlichen Beweisen.

Andere Kritiker, darunter Sean Eddy, konzentrieren sich stark auf das sogenannte C-Wert-Paradoxon: Wenn ein Genom einer bestimmten Größe gegeben ist, wäre alles funktionsfähig – oder ein Großteil davon funktionsfähig, wie das ENCODE-Konsortium behauptet hat – dann es wäre alles unter evolutionärem Druck, d.h., würden Sie erwarten, dass bestimmte Mutationsraten auftreten, aber sie tun es nicht. Die Evolutionsbiologie würde sagen, dass etwa 5-10% funktionsfähig sind, glaube ich, basierend darauf, wie viel Selektion stattfindet und wo. Diese Kritiker würden also viele negative Dinge über die von ENCODE gemeldeten Ergebnisse sagen (und haben dies tatsächlich gesagt).

Ich vermute, dass die wahre Antwort, wenn es eine gibt, davon abhängt, was man als funktional und als evolutionär konserviert definiert, mit welchen Mitteln man es misst und wie die Balance zwischen Funktionalität und Konservierung ist. Sie wählen Ihre Definitionen und Prozesse und akzeptieren die Kompromisse und Einschränkungen, die mit diesen Entscheidungen einhergehen.

Vorbehalt: Ich bin ein mitwirkender Autor für ENCODE-Papiere, die in . veröffentlicht wurden Natur in 2012.


Durchbruchstudie widerlegt Theorie der 'Junk-DNA' im Genom

Lange DNA-Abschnitte, die zuvor als „Schrott“ abgetan wurden, sind tatsächlich entscheidend für die Funktionsweise unseres Genoms, sagte ein internationales Forscherteam am Mittwoch.

Es ist die bedeutendste Veränderung im Verständnis der Wissenschaftler über die Funktionsweise unserer DNA seit der Sequenzierung des menschlichen Genoms im Jahr 2000, als entdeckt wurde, dass unser Körper von weit weniger Genen gebaut und kontrolliert wird als erwartet. Jetzt hat die nächste Generation von Genetikern dieses Bild aktualisiert.

Die Ergebnisse des internationalen Encode-Projekts werden einen großen Einfluss auf Genetiker haben, die versuchen herauszufinden, wie Gene funktionieren. Die Ergebnisse werden auch Wissenschaftlern neue Hinweise liefern, die nach Behandlungen für Erkrankungen wie Herzkrankheiten, Diabetes und Morbus Crohn suchen, die ihre Wurzeln teilweise in Störungen in der DNA haben. Bisher lag der Fokus hauptsächlich auf der Suche nach Fehlern in den Genen selbst, aber die Encode-Forschung wird uns bei der Suche nach Problembereichen helfen, die an anderer Stelle in unserer DNA-Sequenz liegen.

Dr. Ewan Birney vom European Bioinformatics Institute in der Nähe von Cambridge, einer der Hauptforscher des Encode-Projekts, sagte: "Im Jahr 2000 haben wir den Entwurf des menschlichen Genoms veröffentlicht und 2003 das fertige menschliche Genom und das wussten wir immer war ein Ausgangspunkt. Wir wussten immer, dass Protein-kodierende Gene nicht die ganze Geschichte sind."

Jahrelang wurden die riesigen DNA-Stränge zwischen unseren etwa 20.000 proteinkodierenden Genen – mehr als 98% der genetischen Sequenz in jeder unserer Zellen – als „Junk“-DNA abgeschrieben. Dieses Konzept, das in den letzten Jahren bereits in Ungnade gefallen war, wird nun mit der Arbeit von Encode in die Geschichtsbücher eingehen.

Encode ist die größte Einzelaktualisierung der Daten des menschlichen Genoms seit der Veröffentlichung des endgültigen Entwurfs im Jahr 2003 und der erste systematische Versuch, herauszufinden, was die DNA außerhalb der proteinkodierenden Gene tut. Die Forscher fanden heraus, dass es alles andere als nutzlos ist: In diesen Regionen haben sie mehr als 10.000 neue "Gene" identifiziert, die für Komponenten kodieren, die die Funktionsweise der bekannteren proteinkodierenden Gene steuern. Bis zu 18% unserer DNA-Sequenz sind an der Regulierung von weniger als 2% der DNA beteiligt, die für Proteine ​​kodiert. Insgesamt können laut Encode-Wissenschaftlern etwa 80 % der DNA-Sequenz einer biochemischen Funktion zugeordnet werden.

Wissenschaftler wissen, dass die meisten Zellen in unserem Körper zwar unseren gesamten genetischen Code enthalten, aber nicht alle proteincodierenden Gene aktiv sind. Eine Leberzelle enthält Enzyme, die verwendet werden, um Alkohol und andere Toxine zu verstoffwechseln, während Haarzellen das Protein Keratin herstellen. Durch einen Mechanismus, der ihre Gene reguliert, weiß die Haarzelle, dass sie eher Keratin als Leberenzyme herstellen sollte, und die Leberzelle weiß, dass sie die Leberenzyme und nicht die Haarproteine ​​​​bilden sollte.

„Diese Kontrolle muss irgendwo im Genom gewesen sein, und wir wussten immer, dass es – bei einigen einzelnen Genen – ein Element ist, das manchmal ziemlich weit vom Gen entfernt ist“, sagte Birney. "Aber wir hatten keine genomweite Sicht darauf. Also machten wir uns daran, herauszufinden, wie wir diese Elemente entdecken können."

Die Ergebnisse des fünfjährigen Encode-Projekts werden am Mittwoch in 30 Artikeln in den Zeitschriften Nature, Science, Genome Biology und Genome Research veröffentlicht. Die Forscher haben 4 Millionen Schalter in der einst als Junk-DNA angesehenen DNA kartiert regulatorische Elemente.

"Regulatorische Elemente sind die Dinge, die Gene ein- und ausschalten", sagt Professor Mike Snyder von der Stanford University, der einer der Hauptforscher des Encode-Konsortiums war. "Ein Großteil der Unterschiede zwischen den Menschen ist auf die Unterschiede in der Effizienz dieser regulatorischen Elemente zurückzuführen. Wir glauben, dass es bei den regulatorischen Elementen mehr Varianten gibt als in den Genen selbst."

Ohne diese regulatorischen Elemente können Gene nicht funktionieren. Wenn die Regulierung fehlschlägt, können fehlerhafte Gene Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose, Typ-2-Diabetes, Schuppenflechte und Morbus Crohn verursachen. Es wird zum Beispiel angenommen, dass Fehler in der Regulation eines Gens, das als Sonic Hedgehog bekannt ist, einigen Fällen von menschlicher Polydaktylie zugrunde liegt, bei denen Individuen zusätzliche Zehen oder Finger haben.

Prof. Anne Ferguson-Smith von der Universität Cambridge sagte: „Sie haben auch wichtige Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung von Embryonen und Föten während der Schwangerschaft. Dies sind die Arten von Elementen, die Ihr Gewebe und Ihre Organe zum richtigen Zeitpunkt und zur richtigen Zeit richtig wachsen lassen Platz und die richtigen Arten von Zellen enthalten."

Encode-Wissenschaftler fanden heraus, dass 9 % der menschlichen DNA an der Codierung der regulatorischen Schalter beteiligt sind, obwohl Birney glaubt, dass die wahre Zahl bei etwa 20 % liegen könnte. "Eine der großen Überraschungen ist, dass wir viel mehr [regulatorische] Elemente sehen, als ich erwartet hatte", sagte er.

Das Projekt hat etwa 10.000 DNA-Abschnitte identifiziert, die die Encode-Wissenschaftler als nicht-kodierende Gene bezeichnet haben, die keine Proteine, sondern eine Art RNA herstellen – das einzelsträngige Äquivalent der DNA. Es gibt viele Arten von RNA-Molekülen in Zellen, von denen jede eine spezifische Rolle hat, wie das Übertragen von Nachrichten oder das Transkribieren des DNA-Codes im ersten Schritt der Herstellung eines Proteins. Die 10.000 nicht-kodierenden Gene tragen jedoch Anweisungen zum Aufbau der großen und kleinen RNA-Moleküle, die erforderlich sind, um die Aktionen der 20.000 Protein-kodierenden Gene zu regulieren.

Die Ergebnisse haben bereits Aufschluss über frühere, massive Studien zu genetischen Daten gebracht. In den letzten Jahren haben Wissenschaftler den genetischen Code von Tausenden von Menschen mit einer bestimmten Krankheit (wie Diabetes, bipolare Störung, Morbus Crohn oder Herzerkrankungen) mit dem DNA-Code Tausender gesunder Menschen verglichen, um Mutationen zu lokalisieren, die einen Teil des Risikos der Entwicklung dieser Krankheit ausmachen. Diese sogenannten genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) haben eine Vielzahl von Stellen in der DNA identifiziert, die das Risiko einer Person für eine Krankheit zu erhöhen scheinen – aber die überwiegende Mehrheit ist nicht annähernd proteinkodierende Gene. Das macht Sinn, wenn Regionen, die früher als "Junk" galten, tatsächlich für die Kontrolle der Expression proteinkodierender Gene wichtig sind.

Tatsächlich gibt es eine große Überschneidung zwischen den von GWAS identifizierten Standorten und den in Encode identifizierten Regulierungsschaltern. „Als ich dieses Ergebnis zum ersten Mal sah, dachte ich, es sei zu schön, um wahr zu sein. Wir haben die Analyse jetzt auf fünf verschiedene Arten durchgeführt und sie hält immer noch“, sagt Birney.

Das Verständnis einiger dieser regulatorischen Elemente könnte helfen, einige der Umweltauslöser für verschiedene Krankheiten zu erklären.

Morbus Crohn zum Beispiel ist eine Langzeiterkrankung, die eine Entzündung der Schleimhaut des Verdauungssystems verursacht und von der bis zu 60.000 Menschen in Großbritannien betroffen sind, aber Wissenschaftler können nicht vollständig erklären, warum einige Menschen darunter leiden und andere nicht, selbst wenn sie alle haben die genetischen Mutationen, die mit einem erhöhten Risiko verbunden sind. Eine Hypothese ist, dass die Krankheit durch eine bakterielle Infektion ausgelöst werden könnte. „Vielleicht gibt es einen Ort mitten im Nirgendwo [in der DNA], nicht in der Nähe eines proteinkodierenden Gens, an dem man bei einer Variante empfindlicher auf dieses Bakterium reagiert, bei einer anderen Variante weniger empfindlich “, sagt Birney. "Sie bekommen also Morbus Crohn wahrscheinlich, weil Sie den empfindlicheren Typ haben und diese spezielle bakterielle Infektion zu einer Zeit aufgetreten ist, als Sie anfällig waren."

Die 442 Forscher des Encode-Konsortiums, die in 32 Instituten auf der ganzen Welt angesiedelt sind, haben 300 Jahre Computerzeit und fünf Jahre im Labor gebraucht, um ihre Ergebnisse zu erhalten. Sie untersuchten insgesamt 147 Gewebearten – darunter Krebszellen, Leberextrakte, Endothelzellen aus Nabelschnüren und Stammzellen aus Embryonen – und unterwarfen sie rund hundert verschiedenen Experimenten, um aufzuzeichnen, welche Teile des DNA-Codes aktiviert wurden welche Zellen zu welchen Zeiten.

Die aktuellen und zukünftigen Phasen von Encode werden sich nicht nur für Wissenschaftler als nützlich erweisen, sondern auch für diejenigen, die in den kommenden Jahrzehnten einen personalisierteren Ansatz in der Medizin wünschen. „Wir befinden uns in einer Ära, in der Menschen beginnen, ihre Genome sequenzieren zu lassen. Mit Encode-Daten könnten wir damit beginnen, regulatorische Informationen zu kartieren“, sagt Snyder.

Dadurch können die individuellen Unterschiede der Erkrankungen der Menschen gezielter behandelt werden. "Krankheiten wurden durch die Beobachtung von Symptomen durch Ärzte definiert", sagt Dr. Tim Hubbard vom Wellcome Trust Sanger Institute in Cambridge. „[Aber] wir wissen zum Beispiel, dass Brustkrebs nicht eine einzige Krankheit ist, sondern es gibt mehrere Arten von Brustkrebs mit allen möglichen verschiedenen mechanistischen Prozessen, die schief gehen.

„Ein bestimmtes Medikament wirkt nur bei etwa einem Drittel der Menschen, denen Sie es geben, aber Sie wissen nicht, welches Drittel. Vieles davon hat mit Genomik zu tun. Wenn Sie also die Beziehung zwischen dem Genom einer Person und den Wirkstoffen kennen würden für sie und welche sie nicht einnehmen sollten, weil sie Nebenwirkungen haben, die die Medizin verbessern würden."

Auch für zukünftige Stammzelltherapien wird es hilfreich sein, genau zu verstehen, wie jeder Zelltyp im Körper funktioniert – also welche Gene in verschiedenen Stadien seiner Funktion an- oder ausgeschaltet werden. Wenn Ärzte beispielsweise Leberersatzgewebe anbauen möchten, können sie die Unbedenklichkeit überprüfen, indem sie die DNA-Funktionen ihrer hergestellten Zellen mit Daten von normalen Leberzellen vergleichen.

Birney sagt, dass das Jahrzehnt seit der Veröffentlichung des ersten Entwurfs des menschlichen Genoms gezeigt hat, dass die Genetik viel komplexer ist, als irgendjemand hätte vorhersagen können. „Wir hatten das Gefühl, dass das Leben vorher vielleicht einfacher und bequemer war, weil wir einfach nur unwissender waren. Das Wichtigste, was passiert, ist, dass wir einen Teil unserer Unwissenheit verlieren, und tatsächlich ist es sehr kompliziert“, sagt er. „Man muss bedenken, dass diese Genome eines der kompliziertesten Dinge sind, die wir selbst kennen. Die Vorstellung, dass das Rezeptbuch leicht zu verstehen wäre, ist eine Art Hybris. Ich denke immer noch, wir stehen am Anfang dieser Reise , wir sind noch im Warm-up, die ersten paar Meilen dieses Marathons."


Genetisch kodierte und biologisch hergestellte All-DNA-Nanomedizin basierend auf dem One-Pot-Assembly von DNA-Dendrimeren für eine gezielte Genregulation

Rein-DNA-Nanomedikamente haben sich als potenzielle Anti-Tumor-Medikamente herausgestellt. DNA-Nanotechnologie bietet reinen DNA-Nanomedizin unbegrenzte Möglichkeiten bei der Kontrolle der Diversifizierung von Größe, Form und Menge der therapeutischen Motive. Da es sich bei DNA um ein biologisches Polymer handelt, ist es möglich, die aus DNA bestehenden Nanoarzneimittel in lebenden Bakterien genetisch zu kodieren und zu produzieren. Hier sind DNA-Dendrimer-basierte Nanomedikamente so konzipiert, dass sie sich an die biologische Produktion anpassen, die aus den flexiblen 3-Arm-Bausteinen aufgebaut ist, um eine hocheffiziente Eintopf-DNA-Assemblierung zu ermöglichen. Zum ersten Mal wird ein DNA-Nanomedikament, D4-3-As-DzSur, erfolgreich genetisch kodiert, biotechnologisch hergestellt und direkt selbst zusammengesetzt. Die Leistung des biologisch hergestellten D4-3-As-DzSur bei der gezielten Genregulation wurde durch in vitro- und in vivo-Studien bestätigt. Die biologische Produktionsfähigkeit wird die kostengünstige und großtechnische Produktion von reinen DNA-Nanoarzneimitteln erfüllen und klinische Anwendungen fördern.

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Inhalt

DNA-Impfstoffe sind sogenannte "Impfstoffe der dritten Generation". „Seit über hundert Jahren wird die Impfung durch einen von zwei Ansätzen beeinflusst: entweder die Einführung spezifischer Antigene, gegen die das Immunsystem direkt reagiert, oder die Einführung von lebenden, attenuierten Infektionserregern, die sich im Wirt replizieren, ohne eine Krankheit zu verursachen [und die] die Antigene synthetisieren können die anschließend das Immunsystem stärken." [3] "Vor kurzem wurde ein radikal neuer Impfansatz entwickelt." [3]

DNA-Impfstoffe enthalten DNA, die für bestimmte Proteine ​​(Antigene) eines Krankheitserregers kodiert. Die DNA wird in den Körper injiziert und von Zellen aufgenommen, deren normale Stoffwechselprozesse Proteine ​​basierend auf dem genetischen Code des aufgenommenen Plasmids synthetisieren. Da diese Proteine ​​Bereiche mit für Bakterien oder Viren charakteristischen Aminosäuresequenzen enthalten, werden sie als fremd erkannt und wenn sie von den Wirtszellen verarbeitet und auf ihrer Oberfläche präsentiert werden, wird das Immunsystem alarmiert, das dann Immunantworten auslöst. [6] [7] Alternativ kann die DNA in Protein eingekapselt werden, um den Zelleintritt zu erleichtern. Wenn dieses Kapsidprotein in der DNA enthalten ist, kann der resultierende Impfstoff die Wirksamkeit eines Lebendimpfstoffs ohne Reversionsrisiken kombinieren.

1983 entwickelten Enzo Paoletti und Dennis Panicali vom New Yorker Gesundheitsministerium eine Strategie zur Herstellung rekombinanter DNA-Impfstoffe, indem sie mithilfe von Gentechnik gewöhnliche Pockenimpfstoffe in Impfstoffe umwandelten, die möglicherweise andere Krankheiten verhindern können.[8] Sie veränderten die DNA des Kuhpockenvirus, indem sie ein Gen aus anderen Viren (nämlich Herpes-simplex-Virus, Hepatitis B und Influenza) inserierten. [9] [10] 1993 zeigten Jeffrey Ulmer und Mitarbeiter der Merck Research Laboratories, dass die direkte Injektion von Plasmid-DNA, die ein Grippeantigen codiert, in Mäuse die Tiere vor einer anschließenden experimentellen Infektion mit dem Influenzavirus schützte. [11] Im Jahr 2016 wurde ein DNA-Impfstoff gegen das Zika-Virus an den National Institutes of Health am Menschen getestet. An der Studie sollten bis zu 120 Probanden im Alter zwischen 18 und 35 Jahren teilnehmen. Unabhängig davon begannen Inovio Pharmaceuticals und GeneOne Life Science in Miami mit Tests eines anderen DNA-Impfstoffs gegen Zika. Der NIH-Impfstoff wird unter hohem Druck in den Oberarm injiziert. Die mengenmäßige Herstellung der Impfstoffe blieb bis August 2016 ungelöst. [4] Klinische Studien für DNA-Impfstoffe zur HIV-Prävention sind im Gange. [12]

In den USA sind keine DNA-Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch zugelassen. Nur wenige experimentelle Studien haben eine Reaktion hervorgerufen, die stark genug ist, um vor Krankheiten zu schützen, und die Nützlichkeit der Technik muss beim Menschen noch nachgewiesen werden. Ein Veterinär-DNA-Impfstoff zum Schutz von Pferden vor dem West-Nil-Virus wurde zugelassen.[12][13] Auch die DNA-Immunisierung wird als Mittel zur Entwicklung von Gegengiftseren untersucht.[14] Die DNA-Immunisierung kann als Technologieplattform für die Induktion monoklonaler Antikörper verwendet werden.[15]

  • Kein Infektionsrisiko [7]
  • Antigenpräsentation sowohl durch MHC-Klasse-I- als auch durch Klasse-II-Moleküle [7]
  • Polarisieren Sie die T-Zell-Antwort in Richtung Typ 1 oder Typ 2 [7]
  • Immunantwort konzentriert sich auf das interessierende Antigen
  • Einfache Entwicklung und Produktion [7]
  • Stabilität für Lagerung und Versand
  • Kosteneffektivität
  • Vermeidet die Notwendigkeit einer Peptidsynthese, Expression und Reinigung rekombinanter Proteine ​​und der Verwendung toxischer Adjuvantien [13]
  • Langfristige Persistenz des Immunogens [6]
  • In vivo Expression stellt sicher, dass das Protein der normalen eukaryontischen Struktur stärker ähnelt, mit begleitenden posttranslationalen Modifikationen [6]
  • Beschränkt auf Proteinimmunogene (nicht nützlich für Antigene, die nicht auf Proteinen basieren, wie z. B. bakterielle Polysaccharide)
  • Potenzial für atypische Verarbeitung von Bakterien- und Parasitenproteinen [7]
  • Potenzial bei der Verwendung von Nasenspray-Verabreichung von Plasmid-DNA-Nanopartikeln zur Transfektion von Nicht-Zielzellen, wie z. B. Gehirnzellen [14]
  • Kreuzkontamination bei der Herstellung verschiedener Arten von Lebendimpfstoffen in derselben Anlage

Vektordesign

DNA-Impfstoffe rufen die beste Immunantwort hervor, wenn hochaktive Expressionsvektoren verwendet werden. Dies sind Plasmide, die normalerweise aus einem starken viralen Promotor bestehen, um die in vivo-Transkription und Translation des interessierenden Gens (oder der komplementären DNA) voranzutreiben. [15] Intron A kann manchmal eingeschlossen werden, um die mRNA-Stabilität zu verbessern und somit die Proteinexpression zu erhöhen. [16] Plasmide umfassen auch ein starkes Polyadenylierungs-/Transkriptionsterminationssignal, wie etwa Rinderwachstumshormon- oder Kaninchen-beta-Globulin-Polyadenylierungssequenzen. [6] [7] [17] Polycistronische Vektoren (die sich an mehreren Genomstellen befinden) werden manchmal konstruiert, um mehr als ein Immunogen zu exprimieren oder um ein Immunogen und ein immunstimulatorisches Protein zu exprimieren. [18]

Da das Plasmid das „Vehikel“ ist, aus dem das Immunogen exprimiert wird, ist die Optimierung des Vektordesigns für eine maximale Proteinexpression unerlässlich. [18] Eine Möglichkeit zur Steigerung der Proteinexpression besteht darin, die Codon-Nutzung pathogener mRNAs für eukaryontische Zellen zu optimieren. Pathogene haben oft andere AT-Gehalte als die Zielspezies, so dass eine Änderung der Gensequenz des Immunogens, um die in der Zielspezies häufiger verwendeten Codons widerzuspiegeln, seine Expression verbessern kann. [19]

Ein weiterer Aspekt ist die Wahl des Promoters. Der SV40-Promotor wurde konventionell verwendet, bis die Forschung zeigte, dass Vektoren, die vom Rous-Sarkom-Virus (RSV)-Promotor angetrieben wurden, viel höhere Expressionsraten aufwiesen. [6] In jüngerer Zeit wurden Expression und Immunogenität in Modellsystemen durch die Verwendung des Immediate-Early-Promotors des Cytomegalovirus (CMV) und eines retroviralen cis-wirkenden Transkriptionselements weiter erhöht. [20] Zusätzliche Modifikationen zur Verbesserung der Expressionsraten umfassen die Insertion von Enhancer-Sequenzen, synthetischen Introns, Adenovirus Tripartite Leader (TPL)-Sequenzen und Modifikationen der Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationssequenzen. [6] Ein Beispiel für ein DNA-Impfstoff-Plasmid ist pVAC, das den SV40-Promotor verwendet.

Strukturelle Instabilitätsphänomene sind von besonderer Bedeutung für die Plasmidherstellung, DNA-Impfung und Gentherapie. [21] Akzessorische Regionen des Plasmidrückgrats können an einer Vielzahl von strukturellen Instabilitätsphänomenen beteiligt sein. Bekannte Katalysatoren genetischer Instabilität umfassen direkte, invertierte und Tandem-Repeats, die in vielen kommerziell erhältlichen Klonierungs- und Expressionsvektoren auffallen. Daher würde die Reduktion oder vollständige Eliminierung von fremden nichtkodierenden Rückgratsequenzen die Neigung zum Auftreten solcher Ereignisse und folglich das rekombinogene Potenzial des gesamten Plasmids deutlich reduzieren. [22]

Mechanismus von Plasmiden

Sobald sich das Plasmid in den transfizierten Zellkern einfügt, kodiert es für eine Peptidkette eines fremden Antigens. Auf ihrer Oberfläche zeigt die Zelle das Fremdantigen sowohl mit Molekülen des Histokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I als auch der Klasse II. Die Antigen-präsentierende Zelle wandert dann zu den Lymphknoten und präsentiert das von der T-Zelle signalisierte Antigenpeptid und das kostimulatorische Molekül, wodurch die Immunantwort eingeleitet wird. [23]

Design des Impfstoffeinsatzes

Immunogene können auf verschiedene Zellkompartimente gerichtet werden, um Antikörper- oder zytotoxische T-Zell-Antworten zu verbessern. Sekretierte oder an die Plasmamembran gebundene Antigene sind bei der Induktion von Antikörperreaktionen wirksamer als zytosolische Antigene, während zytotoxische T-Zell-Antworten verbessert werden können, indem Antigene für den zytoplasmatischen Abbau und den anschließenden Eintritt in den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse-I-Weg gezielt werden. [7] Dies wird normalerweise durch die Addition von N-terminalen Ubiquitin-Signalen erreicht. [24] [25] [26]

Die Konformation des Proteins kann auch die Antikörperantworten beeinflussen. „Geordnete“ Strukturen (wie virale Partikel) sind effektiver als ungeordnete Strukturen. [27] Strings von Minigenen (oder MHC-Klasse-I-Epitopen) von verschiedenen Pathogenen lösen zytotoxische T-Zell-Reaktionen auf einige Pathogene aus, insbesondere wenn auch ein TH-Epitop enthalten ist. [7]

DNA-Impfstoffe wurden durch mehrere Verfahren in Tiergewebe eingeführt. Die beiden beliebtesten Ansätze waren 1999 die Injektion von DNA in Kochsalzlösung: unter Verwendung einer Standard-Injektionsnadel oder unter Verwendung einer Genkanone. [28] Mehrere andere Techniken wurden in der Zwischenzeit dokumentiert.

Injektion von Kochsalzlösung

Die Injektion in Kochsalzlösung wird normalerweise intramuskulär (IM) in den Skelettmuskel oder intradermal (ID) durchgeführt, wobei DNA in extrazelluläre Räume abgegeben wird. Dies kann unterstützt werden entweder 1) durch Elektroporation [29] 2) durch vorübergehende Schädigung von Muskelfasern mit Myotoxinen wie Bupivacain oder 3) durch Verwendung hypertoner Kochsalz- oder Saccharoselösungen. [6] Die Immunantwort auf diese Methode kann durch Faktoren wie Nadeltyp, [13] Nadelausrichtung, Injektionsgeschwindigkeit, Injektionsvolumen, Muskeltyp sowie Alter, Geschlecht und physiologischer Zustand des Empfängers beeinflusst werden. [6]

Gen-Waffe

Gene Gun Delivery beschleunigt ballistisch Plasmid-DNA (pDNA), die auf Gold- oder Wolfram-Mikropartikeln absorbiert wurde, in die Zielzellen, wobei komprimiertes Helium als Beschleuniger verwendet wird. [6] [18]

Schleimhautabgabe

Alternativen umfassten die Aerosol-Instillation von nackter DNA auf Schleimhautoberflächen wie der Nasen- und Lungenschleimhaut [18] und die topische Verabreichung von pDNA an das Auge [30] und die Vaginalschleimhaut. [18] Die Abgabe an die Schleimhautoberfläche wurde auch mit kationischen Liposom-DNA-Präparaten erreicht, [7] biologisch abbaubaren Mikrokügelchen, [31] [18] abgeschwächt Salmonalla, [32] Shigella oder Listerien Vektoren zur oralen Verabreichung an die Darmschleimhaut [33] und rekombinante Adenovirus-Vektoren. [18]

Polymerfahrzeug

Ein Hybridvehikel, das aus Bakterienzellen und synthetischen Polymeren besteht, wurde für die DNA-Impfstoffabgabe verwendet. Ein E coli innerer Kern und äußere Poly(beta-aminoester)-Hülle wirken synergistisch, um die Effizienz zu steigern, indem Barrieren angegangen werden, die mit der Abgabe von Genen in Antigen-präsentierenden Zellen verbunden sind, die zelluläre Aufnahme und Internalisierung, phagosomales Entweichen und intrazelluläre Ladungskonzentration umfassen. Bei Mäusen wurde festgestellt, dass der Hybridvektor eine Immunantwort induziert. [34] [35]

ELI-Impfung

Ein weiterer Ansatz zur DNA-Impfung ist die Expressionsbibliotheksimmunisierung (ELI). Mit dieser Technik können potenziell alle Gene eines Pathogens gleichzeitig zugeführt werden, was für Pathogene nützlich sein kann, die schwer abzuschwächen oder zu kultivieren sind. [6] ELI kann verwendet werden, um zu identifizieren, welche Gene eine Schutzreaktion auslösen. Dies wurde getestet mit Mycoplasma pulmonis, einem murinen Lungenpathogen mit einem relativ kleinen Genom. Sogar partielle Expressionsbibliotheken können einen Schutz vor einer nachfolgenden Herausforderung induzieren. [36]

Hilfreicher tabellarischer Vergleich

  • Kein spezieller Liefermechanismus
  • Permanenter oder semipermanenter Ausdruck
  • pDNA breitet sich schnell im ganzen Körper aus
  • Ineffiziente Aufnahmestelle aufgrund der Morphologie des Muskelgewebes
  • Relativ große DNA-Mengen verwendet
  • Th1-Antwort ist möglicherweise nicht die erforderliche Antwort
  • DNA direkt in Zellen bombardiert
  • Kleine Mengen DNA
  • Th2-Antwort ist möglicherweise nicht die erforderliche Antwort
  • Benötigt inerte Partikel als Träger
  • Keine Partikel erforderlich
  • DNA kann an Zellen mm bis cm unter der Hautoberfläche abgegeben werden
  • Signifikante Scherung der DNA nach Hochdruckaustreibung
  • 10-fach niedrigere Expression und geringere Immunantwort
  • Benötigt große Mengen an DNA (bis zu 300 µg)
  • Hohe Immunantwort kann erzeugt werden
  • Kann die Transfektion von intravenös verabreichter pDNA erhöhen
  • Intravenös verabreichte Liposom-DNA-Komplexe können potenziell alle Gewebe transfizieren
  • Intranasal zugeführte Liposom-DNA-Komplexe können zur Expression in der distalen Schleimhaut sowie in der Nasenschleimhaut und zur Bildung von IgA-Antikörpern führen
  • Toxizität
  • Unwirksamkeit im Serum
  • Gefahr von Krankheiten oder Immunreaktionen

Die Verabreichungsmethode bestimmt die Dosis, die erforderlich ist, um eine wirksame Immunantwort hervorzurufen. Kochsalzinjektionen erfordern variable DNA-Mengen von 10 µg bis 1 mg, während Gen-Gun-Lieferungen 100- bis 1000-mal weniger erfordern. [37] Im Allgemeinen werden 0,2 μg – 20 μg benötigt, obwohl Mengen von nur 16 ng berichtet wurden. [6] Diese Mengen variieren je nach Art. Mäuse benötigen beispielsweise etwa 10 Mal weniger DNA als Primaten. [7] Kochsalzinjektionen erfordern mehr DNA, da die DNA in die extrazellulären Räume des Zielgewebes (normalerweise Muskel) abgegeben wird, wo sie physikalische Barrieren (wie die Basallamina und große Mengen an Bindegewebe) überwinden muss, bevor sie eingenommen wird durch die Zellen, während Genkanonen-Lieferungen DNA direkt in die Zellen treiben/zwingen, was zu weniger „Verschwendung“ führt. [6] [7]

Antworten von T-Helferzellen

DNA-Immunisierung kann mehrere T . erhöhenh Reaktionen, einschließlich Lymphoproliferation und die Erzeugung einer Vielzahl von Zytokinprofilen. Ein großer Vorteil von DNA-Impfstoffen ist die Leichtigkeit, mit der sie manipuliert werden können, um die Art der T-Zell-Hilfe in Richtung einer TH1- oder TH2-Antwort zu beeinflussen. [38] Jeder Typ hat charakteristische Muster der Lymphokin- und Chemokin-Expression, spezifische Typen von Immunglobulinen, Muster des Lymphozytentransports und Typen angeborener Immunantworten.

Andere Arten von T-Zell-Hilfe

Die Art der erzeugten T-Zell-Hilfe wird durch die Verabreichungsmethode und die Art des exprimierten Immunogens sowie durch das Targeting verschiedener lymphoider Kompartimente beeinflusst. [6] [39] Im Allgemeinen neigen Injektionen mit Kochsalzlösung (entweder IM oder ID) dazu, TH1-Reaktionen zu induzieren, während die Verabreichung von Genwaffen die TH2-Reaktionen erhöht. [38] [39] Dies gilt für intrazelluläre und Plasmamembran-gebundene Antigene, jedoch nicht für sekretierte Antigene, die unabhängig von der Verabreichungsmethode TH2-Antworten zu erzeugen scheinen. [40]

Im Allgemeinen ist die Art der erzeugten T-Zell-Hilfe im Laufe der Zeit stabil und ändert sich nicht, wenn sie herausgefordert wird oder nach nachfolgenden Immunisierungen, die normalerweise die entgegengesetzte Art von Reaktion in einer naiven Probe ausgelöst hätten. [38] [39] Mor et al.. (1995) [15] immunisierte und verstärkte Mäuse mit pDNA, die für das Circumsporozoiten-Protein des Malariaparasiten der Maus kodiert Plasmodium yoelii (PyCSP) und fanden heraus, dass sich die anfängliche TH2-Reaktion nach dem Boosten in eine TH1-Reaktion änderte.

Basis für verschiedene Arten der T-Zell-Hilfe

Wie diese verschiedenen Methoden funktionieren, die Formen der exprimierten Antigene und die unterschiedlichen Profile der T-Zell-Hilfe sind nicht verstanden. Es wurde angenommen, dass die relativ großen DNA-Mengen, die bei der IM-Injektion verwendet werden, für die Induktion von TH1-Antworten verantwortlich sind. Die Evidenz zeigt jedoch keine dosisabhängigen Unterschiede beim TH-Typ. [38] Die Art der erzeugten T-Zell-Hilfe wird durch den differenzierten Zustand der Antigen-präsentierenden Zellen bestimmt. Dendritische Zellen können sich differenzieren, um IL-12 (das die TH1-Zellentwicklung unterstützt) oder IL-4 (das TH2-Antworten unterstützt) zu sezernieren. [41] Mit einer Nadel injizierte pDNA wird in die dendritische Zelle endozytiert, die dann zur Differenzierung zur TH1-Zytokinproduktion stimuliert wird, [42] während die Genkanone die DNA direkt in die Zelle bombardiert und so die TH1-Stimulation umgeht.

Praktische Anwendungen der polarisierten T-Zell-Hilfe

Die Polarisation in der T-Zell-Hilfe ist nützlich, um allergische Reaktionen und Autoimmunerkrankungen zu beeinflussen. Bei Autoimmunerkrankungen besteht das Ziel darin, die selbstzerstörerische TH1-Antwort (mit der damit verbundenen zytotoxischen T-Zell-Aktivität) in eine nicht-destruktive TH2-Antwort zu verschieben. Dies wurde in präklinischen Modellen erfolgreich beim Prädisease-Priming für den gewünschten Ansprechtyp angewendet [7] und ist einigermaßen erfolgreich bei der Verschiebung des Ansprechens auf eine etablierte Krankheit. [43]

Zytotoxische T-Zell-Antworten

Einer der Vorteile von DNA-Impfstoffen besteht darin, dass sie zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) ohne das inhärente Risiko von Lebendimpfstoffen induzieren können. CTL-Antworten können gegen immundominante und immunrezessive CTL-Epitope [44] sowie gegen subdominante CTL-Epitope [31] in einer Weise hervorgerufen werden, die eine natürliche Infektion zu imitieren scheint. Dies kann sich als nützliches Werkzeug bei der Beurteilung von CTL-Epitopen und ihrer Rolle bei der Bereitstellung von Immunität erweisen.

Zytotoxische T-Zellen erkennen kleine Peptide (8-10 Aminosäuren), die an MHC-Klasse-I-Moleküle komplexiert sind. [45] Diese Peptide stammen von endogenen zytosolischen Proteinen, die abgebaut und an das entstehende MHC-Klasse-I-Molekül im endoplasmatischen Retikulum (ER) abgegeben werden. [45] Die direkte Ausrichtung von Genprodukten auf das ER (durch Hinzufügen einer aminoterminalen Insertionssequenz) sollte daher die CTL-Antworten verstärken. Dies wurde mit rekombinanten Vacciniaviren, die Influenzaproteine ​​exprimieren, erfolgreich demonstriert, [45] aber das Prinzip sollte auch auf DNA-Impfstoffe anwendbar sein. Es wurde gezeigt, dass das Targeting von Antigenen für den intrazellulären Abbau (und damit den Eintritt in den MHC-Klasse-I-Weg) durch das Hinzufügen von Ubiquitin-Signalsequenzen oder die Mutation anderer Signalsequenzen bei der Erhöhung der CTL-Antworten wirksam ist. [25]

CTL-Antworten können durch Co-Inokulation mit kostimulatorischen Molekülen wie B7-1 oder B7-2 für DNA-Impfstoffe gegen Influenza-Nukleoprotein [44] [46] oder GM-CSF für DNA-Impfstoffe gegen das Maus-Malaria-Modell verstärkt werden P. yoelii. [47] Es wurde gezeigt, dass die Co-Inokulation mit Plasmiden, die die co-stimulatorischen Moleküle IL-12 und TCA3 kodieren, die CTL-Aktivität gegen HIV-1- und Influenza-Nukleoprotein-Antigene erhöht. [46] [48]

Humorale (Antikörper-)Reaktion

Durch DNA-Impfungen hervorgerufene Antikörperreaktionen werden durch mehrere Variablen beeinflusst, einschließlich der Antigen-Lokation des Antigentyps (d. h. intrazellulär vs. sezerniert), Anzahl, Häufigkeit und Immunisierungsdosisstelle und Methode der Antigenabgabe.

Kinetik der Antikörperantwort

Humorale Reaktionen nach einer einzelnen DNA-Injektion können viel länger dauern als nach einer einzelnen Injektion mit einem rekombinanten Protein. Antikörperreaktionen gegen das Hüllprotein (HBsAg) des Hepatitis-B-Virus (HBV) wurden bis zu 74 Wochen lang ohne Boost aufrechterhalten, während bei Mäusen nach Gen-Gun-Verabreichung eine lebenslange Aufrechterhaltung der schützenden Reaktion auf Influenza-Hämagglutinin nachgewiesen wurde. [49] Antikörper-sezernierende Zellen wandern zur langfristigen Antikörperproduktion in das Knochenmark und die Milz und lokalisieren dort im Allgemeinen nach einem Jahr. [49]

Vergleiche von Antikörperreaktionen, die durch natürliche (virale) Infektion, Immunisierung mit rekombinantem Protein und Immunisierung mit pDNA erzeugt werden, sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Durch DNA ausgelöste Antikörperreaktionen steigen viel langsamer an, als wenn eine natürliche Infektion oder Immunisierung mit rekombinantem Protein auftritt. Bei Mäusen können bis zu 12 Wochen benötigt werden, um Spitzentiter zu erreichen, obwohl eine Auffrischung das Intervall verkürzen kann. Diese Reaktion ist wahrscheinlich auf die über mehrere Wochen exprimierten niedrigen Antigenspiegel zurückzuführen, die sowohl die primäre als auch die sekundäre Phase der Antikörperreaktion unterstützen. Ein DNA-Impfstoff, der HBV-Small- und Middle-Hüllprotein exprimiert, wurde Erwachsenen mit chronischer Hepatitis injiziert. Der Impfstoff führte zu einer spezifischen Interferon-Gamma-Zellproduktion. Auch wurden spezifische T-Zellen für Mittelhüllprotein-Antigene entwickelt. Die Immunantwort der Patienten war nicht robust genug, um eine HBV-Infektion zu kontrollieren [50]

Tabelle 4. Vergleich der T-abhängigen Antikörperreaktionen durch DNA-Immunisierungen, Protein-Impfungen und Virusinfektionen
Methode der Immunisierung
DNA-Impfstoff Rekombinantes Protein Natürliche Infektion
Menge des induzierenden Antigens ng μg ? (ng-μg)
Dauer der Antigenpräsentation einige Wochen < 1 Woche einige Wochen
Kinetik der Antikörperantwort langsamer Anstieg schneller Anstieg schneller Anstieg
Anzahl der Impfungen, um IgG mit hoher Avidität und Migration von ASC in das Knochenmark zu erhalten einer zwei einer
Ab Isotyp (Mausmodelle) C’-abhängig oder C’-unabhängig C’-abhängig C’-unabhängig

Außerdem sind die Titer spezifischer Antikörper, die durch eine DNA-Impfung erzeugt wurden, niedriger als die, die nach einer Impfung mit einem rekombinanten Protein erhalten wurden. DNA-Immunisierungs-induzierte Antikörper zeigen jedoch eine größere Affinität zu nativen Epitopen als rekombinante Protein-induzierte Antikörper. Mit anderen Worten, die DNA-Immunisierung induziert eine qualitativ überlegene Reaktion. Antikörper können nach einer Impfung mit DNA induziert werden, während Impfungen mit rekombinanten Proteinen in der Regel einen Boost erfordern. DNA-Immunisierung kann verwendet werden, um das TH-Profil der Immunantwort und damit den Antikörper-Isotyp zu beeinflussen, was weder bei einer natürlichen Infektion noch bei einer Immunisierung mit rekombinanten Proteinen möglich ist.Durch DNA erzeugte Antikörperantworten sind als präparatives Werkzeug nützlich. Beispielsweise können polyklonale und monoklonale Antikörper zur Verwendung als Reagenzien erzeugt werden.

DNA-Aufnahmemechanismus

Als die DNA-Aufnahme und anschließende Expression erstmals nachgewiesen wurde in vivo in Muskelzellen [51] wurde angenommen, dass diese Zellen aufgrund ihres ausgedehnten Netzwerks von T-Tubuli einzigartig sind. Unter Verwendung von Elektronenmikroskopie wurde vorgeschlagen, dass die DNA-Aufnahme durch Caveolae (oder nicht mit Clathrin beschichtete Gruben) erleichtert wird. [52] Spätere Untersuchungen ergaben jedoch, dass auch andere Zellen (wie Keratinozyten, Fibroblasten und epitheliale Langerhans-Zellen) DNA internalisieren können. [43] [53] Der Mechanismus der DNA-Aufnahme ist nicht bekannt.

Zwei Theorien dominieren – das in vivo die Aufnahme von DNA erfolgt unspezifisch, in einem der Phago- oder Pinozytose ähnlichen Verfahren [18] oder über spezifische Rezeptoren. [54] Diese könnten einen 30-kDa-Oberflächenrezeptor oder Makrophagen-Scavenger-Rezeptoren umfassen. Der 30-kDa-Oberflächenrezeptor bindet spezifisch an 4500-bp-DNA-Fragmente (die dann internalisiert werden) und findet sich auf professionellen APCs und T-Zellen. Makrophagen-Scavenger-Rezeptoren binden an eine Vielzahl von Makromolekülen, einschließlich Polyribonukleotiden, und sind somit Kandidaten für die DNA-Aufnahme. [54] [55] Die Rezeptor-vermittelte DNA-Aufnahme könnte durch die Anwesenheit von Polyguanylat-Sequenzen erleichtert werden. Gene-Gun-Verabreichungssysteme, kationische Liposomenverpackungen und andere Verabreichungsmethoden umgehen diese Einstiegsmethode, aber ihr Verständnis kann zur Kostensenkung (z.

Antigenpräsentation durch aus Knochenmark stammende Zellen

Studien mit chimären Mäusen haben gezeigt, dass das Antigen von aus dem Knochenmark stammenden Zellen präsentiert wird, zu denen dendritische Zellen, Makrophagen und spezialisierte B-Zellen, die sogenannten professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC), gehören. [46] [56] Nach der Gen-Pistole-Inokulation der Haut wandern transfizierte Langerhans-Zellen in den drainierenden Lymphknoten, um Antigene zu präsentieren. [7] Nach IM- und ID-Injektionen präsentieren dendritische Zellen Antigen in den drainierenden Lymphknoten [53] und transfizierte Makrophagen wurden im peripheren Blut gefunden. [57]

Neben der direkten Transfektion von dendritischen Zellen oder Makrophagen erfolgt Cross-Priming nach IM-, ID- und Gen-Gun-DNA-Lieferungen. Cross-Priming tritt auf, wenn eine vom Knochenmark abgeleitete Zelle Peptide von Proteinen präsentiert, die in einer anderen Zelle im Kontext der MHC-Klasse 1 synthetisiert wurden. Dies kann zytotoxische T-Zell-Antworten auslösen und scheint für eine vollständige primäre Immunantwort wichtig zu sein. [7] [58]

Ziel-Site-Rolle

IM- und ID-DNA-Lieferung initiieren Immunantworten unterschiedlich. In der Haut nehmen Keratinozyten, Fibroblasten und Langerhans-Zellen Antigene auf und exprimieren diese und sind für die Induktion einer primären Antikörperantwort verantwortlich. Transfizierte Langerhans-Zellen wandern aus der Haut (innerhalb von 12 Stunden) in den drainierenden Lymphknoten, wo sie sekundäre B- und T-Zell-Antworten auslösen. In der Skelettmuskulatur werden quergestreifte Muskelzellen am häufigsten transfiziert, scheinen aber für die Immunantwort unwichtig zu sein. Stattdessen „wäscht“ sich IM-geimpfte DNA innerhalb von Minuten in den entwässernden Lymphknoten, wo distale dendritische Zellen transfiziert werden und dann eine Immunantwort initiieren. Transfizierte Myozyten scheinen als „Reservoir“ von Antigenen für den Handel mit professionellen APCs zu fungieren. [18] [51] [58]

Aufrechterhaltung der Immunantwort

Die DNA-Impfung erzeugt ein wirksames Immungedächtnis durch die Präsentation von Antigen-Antikörper-Komplexen auf follikulären dendritischen Zellen (FDC), die potente B-Zell-Stimulatoren sind. T-Zellen können durch ähnliche dendritische Zellen des Keimzentrums stimuliert werden. FDC sind in der Lage, ein Immungedächtnis zu erzeugen, da die Antikörperproduktion die langfristige Expression des Antigens „überlappt“, sodass Antigen-Antikörper-Immunkomplexe gebildet und von FDC präsentiert werden können. [7]

Interferone

Sowohl Helfer- als auch zytotoxische T-Zellen können virale Infektionen durch die Sekretion von Interferonen kontrollieren. Zytotoxische T-Zellen töten normalerweise viral infizierte Zellen. Sie können jedoch auch zur Sekretion antiviraler Zytokine wie IFN-γ und TNF-α stimuliert werden, die die Zelle nicht abtöten, aber die Virusinfektion durch Herunterregulieren der Expression viraler Komponenten begrenzen. [59] DNA-Impfungen können verwendet werden, um Virusinfektionen durch zerstörungsfreie IFN-vermittelte Kontrolle einzudämmen. Dies wurde für Hepatitis B nachgewiesen. [60] IFN-γ ist von entscheidender Bedeutung bei der Kontrolle von Malariainfektionen [61] und wird für Anti-Malaria-DNA-Impfstoffe in Erwägung gezogen.

Zytokin-Modulation

Ein wirksamer Impfstoff muss eine geeignete Immunantwort für einen bestimmten Krankheitserreger induzieren. DNA-Impfstoffe können T-Zell-Hilfe in Richtung TH1- oder TH2-Profil polarisieren und bei Bedarf CTL und/oder Antikörper erzeugen. Dies kann durch Modifikationen der Form des exprimierten Antigens (d. h. intrazellulär vs. sekretiert), des Verabreichungsverfahrens und -weges oder der Dosis erreicht werden. [38] [39] [62] [63] [64] Es kann auch durch die gleichzeitige Verabreichung von Plasmid-DNA erreicht werden, die immunregulatorische Moleküle kodiert, d. h. Zytokine, Lymphokine oder kostimulatorische Moleküle. Diese „genetischen Adjuvantien“ können verabreicht werden als:

  • Mischung aus 2 Plasmiden, eines kodiert das Immunogen und das andere kodiert das Zytokin
  • einzelner bi- oder polycistronischer Vektor, getrennt durch Spacer-Regionen
  • Plasmid-kodierte Chimäre oder Fusionsprotein

Im Allgemeinen erhöht die gleichzeitige Verabreichung von proinflammatorischen Wirkstoffen (wie verschiedene Interleukine, Tumornekrosefaktor und GM-CSF) plus TH2-induzierende Zytokine die Antikörperreaktionen, während proinflammatorische Wirkstoffe und TH1-induzierende Zytokine die humoralen Reaktionen verringern und erhöhen zytotoxische Reaktionen (wichtiger beim Virusschutz). Co-stimulatorische Moleküle wie B7-1, B7-2 und CD40L werden manchmal verwendet.

Dieses Konzept wurde bei der topischen Verabreichung von pDNA angewendet, die für IL-10 kodiert. [30] Plasmid, das für B7-1 (ein Ligand auf APCs) kodiert, verstärkte erfolgreich die Immunantwort in Tumormodellen. Mischen von Plasmiden, die für GM-CSF und das Circumsporozoit-Protein von kodieren P. yoelii (PyCSP) verstärkte den Schutz gegen nachfolgende Herausforderung (während Plasmid-kodiertes PyCSP allein dies nicht tat). Es wurde vorgeschlagen, dass GM-CSF dendritische Zellen veranlasst, Antigene effizienter zu präsentieren und die IL-2-Produktion und die TH-Zell-Aktivierung zu erhöhen, wodurch die Immunantwort gesteigert wird. [47] Dies kann weiter verstärkt werden, indem zuerst mit einem pPyCSP- und pGM-CSF-Gemisch geprimt wird, gefolgt von einem Boosten mit einem rekombinanten Pockenvirus, das PyCSP exprimiert. [65] Die Koinjektion von Plasmiden, die für GM-CSF (oder IFN-γ oder IL-2) kodieren, und ein Fusionsprotein von P. chabaud Merozoit-Oberflächenprotein 1 (C-Terminus)-Hepatitis-B-Virus-Oberflächenprotein (PcMSP1-HBs) hob den Schutz gegen die Herausforderung auf, verglichen mit dem Schutz, der durch die Zufuhr von pPcMSP1-HBs allein erlangt wurde. [27]

Die Vorteile genetischer Adjuvantien sind ihre geringe Kosten und einfache Verabreichung sowie die Vermeidung von instabilen rekombinanten Zytokinen und potenziell toxischen, „konventionellen“ Adjuvantien (wie Alaun, Calciumphosphat, Monophosphoryllipid A, Cholera-Toxin, kationische und mannanbeschichtete Liposomen , QS21, Carboxymethylcellulose und Ubenimix). [7] [18] Die potenzielle Toxizität einer verlängerten Zytokinexpression ist jedoch nicht nachgewiesen. In vielen kommerziell wichtigen Tierarten wurden Zytokin-Gene nicht identifiziert und isoliert. Darüber hinaus modulieren verschiedene Plasmid-kodierte Zytokine das Immunsystem je nach Lieferzeit unterschiedlich. Zum Beispiel werden einige Zytokin-Plasmid-DNAs am besten nach der Immunogen-pDNA abgegeben, da eine Prä- oder Co-Lieferung spezifische Reaktionen vermindern und unspezifische Reaktionen verstärken kann. [66]

Immunstimulatorische CpG-Motive

Plasmid-DNA selbst scheint eine adjuvante Wirkung auf das Immunsystem zu haben. [6] [7] Bakteriell gewonnene DNA kann angeborene Immunabwehrmechanismen, die Aktivierung dendritischer Zellen und die Produktion von TH1-Zytokinen auslösen. [42] [67] Dies ist auf die Erkennung bestimmter immunstimulatorischer CpG-Dinukleotidsequenzen zurückzuführen. [63] [68] CpG-stimulierende (CpG-S)-Sequenzen kommen in bakterieller DNA zwanzigmal häufiger vor als in Eukaryoten. Dies liegt daran, dass Eukaryoten eine „CpG-Suppression“ aufweisen – d. h. CpG-Dinukleotidpaare treten viel seltener auf als erwartet. Außerdem sind CpG-S-Sequenzen hypomethyliert. Dies tritt häufig in bakterieller DNA auf, während in Eukaryoten vorkommende CpG-Motive am Cytosinnukleotid methyliert sind. Im Gegensatz dazu sind Nukleotidsequenzen, die die Aktivierung einer Immunantwort (als CpG neutralisierend oder CpG-N bezeichnet) hemmen, in eukaryontischen Genomen überrepräsentiert. [69] Die optimale immunstimulatorische Sequenz ist ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid, flankiert von zwei 5’-Purinen und zwei 3’-Pyrimidinen. [63] [67] Außerdem müssen flankierende Regionen außerhalb dieses immunstimulatorischen Hexamers guaninreich sein, um die Bindung und Aufnahme in die Zielzellen sicherzustellen.

Das angeborene System arbeitet mit dem adaptiven Immunsystem zusammen, um eine Reaktion gegen das DNA-kodierte Protein zu bewirken. CpG-S-Sequenzen induzieren die polyklonale B-Zell-Aktivierung und die Hochregulierung der Zytokin-Expression und -Sekretion. [70] Stimulierte Makrophagen sezernieren IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN-β und IFN-γ, während stimulierte B-Zellen IL-6 und etwas IL-12 sezernieren. [18] [70] [71]

Die Manipulation von CpG-S- und CpG-N-Sequenzen im Plasmidrückgrat von DNA-Impfstoffen kann den Erfolg der Immunantwort auf das codierte Antigen sicherstellen und die Immunantwort in Richtung eines TH1-Phänotyps treiben. Dies ist nützlich, wenn ein Pathogen zum Schutz eine TH-Antwort benötigt. CpG-S-Sequenzen wurden auch als externe Adjuvantien sowohl für die DNA- als auch für die rekombinante Protein-Impfung mit unterschiedlichen Erfolgsraten verwendet. Andere Organismen mit hypomethylierten CpG-Motiven haben die Stimulierung der polyklonalen B-Zell-Expansion gezeigt. [ Zitat benötigt ] Der Mechanismus dahinter kann komplizierter sein als die einfache Methylierung – es wurde keine Immunantwort von hypomethylierter Maus-DNA gefunden.

Die meisten Beweise für immunstimulatorische CpG-Sequenzen stammen aus Studien an Mäusen. Die Extrapolation dieser Daten auf andere Spezies erfordert Vorsicht – einzelne Spezies können unterschiedliche flankierende Sequenzen erfordern, da die Bindungsspezifitäten der Scavenger-Rezeptoren von Spezies zu Spezies variieren. Darüber hinaus können Arten wie Wiederkäuer aufgrund ihrer großen gastrointestinalen Belastung gegenüber immunstimulatorischen Sequenzen unempfindlich sein.

Alternative Boosts

DNA-geprimte Immunantworten können durch die Verabreichung von rekombinantem Protein oder rekombinanten Pockenviren verstärkt werden. "Prime-Boost"-Strategien mit rekombinantem Protein haben erfolgreich sowohl den neutralisierenden Antikörpertiter als auch die Antikörper-Avidität und -Persistenz für schwache Immunogene, wie das HIV-1-Hüllprotein, erhöht. [7] [72] Rekombinante Virus-Boosts haben sich als sehr effizient bei der Verstärkung von DNA-geprimten CTL-Antworten erwiesen. Das Priming mit DNA fokussiert die Immunantwort auf das erforderliche Immunogen, während das Boosten mit dem rekombinanten Virus eine größere Menge an exprimiertem Antigen liefert, was zu einem starken Anstieg der spezifischen CTL-Reaktionen führt.

Prime-Boost-Strategien waren in einer Reihe von Studien erfolgreich, um einen Schutz vor einer Malaria-Herausforderung zu induzieren. Geprimte Mäuse mit Plasmid-DNA-Kodierung Plasmodium yoelii Circumsporozoiten-Oberflächenprotein (PyCSP), dann geboostet mit einem rekombinanten Vacciniavirus, das das gleiche Protein exprimiert, wies signifikant höhere Antikörperspiegel, CTL-Aktivität und IFN-&ggr; [73] Dies kann durch Priming mit einer Mischung von Plasmiden, die für PyCSP und Maus-GM-CSF kodieren, vor dem Boosten mit rekombinantem Vacciniavirus weiter verstärkt werden. [65] Eine effektive Prime-Boost-Strategie für das Affen-Malaria-Modell P. Wissen wurde auch nachgewiesen. [74] Rhesusaffen wurden mit einem mehrkomponentigen, mehrstufigen DNA-Impfstoff geprimt, der zwei Antigene im Leberstadium kodiert – das Circumsporozoit-Oberflächenprotein (PkCSP) und das Sporozoiten-Oberflächenprotein 2 (PkSSP2) – und zwei Blutstadium-Antigene – das apikale Merozoiten-Oberflächenprotein 1 ( PkAMA1) und Merozoiten-Oberflächenprotein 1 (PkMSP1p42). Sie wurden dann mit einem rekombinanten Kanarienpockenvirus geboostet, das alle vier Antigene (ALVAC-4) kodiert. Immunisierte Affen entwickelten Antikörper gegen Sporozoiten und infizierte Erythrozyten sowie IFN-γ-sekretierende T-Zell-Antworten gegen Peptide von PkCSP. Ein partieller Schutz gegen Sporozoiten-Challenge wurde erreicht und die mittlere Parasitämie wurde im Vergleich zu Kontrollaffen signifikant reduziert. Diese Modelle sind zwar nicht ideal für eine Extrapolation auf P. falciparum beim Menschen, wird in präklinischen Studien wichtig sein.

Stärkung der Immunantwort

Die Effizienz der DNA-Immunisierung kann verbessert werden, indem DNA gegen Abbau stabilisiert wird und die Effizienz der DNA-Zufuhr in Antigen-präsentierende Zellen erhöht wird. [7] Dies wurde durch die Beschichtung biologisch abbaubarer kationischer Mikropartikel (wie Poly(lactid-co-glycolid) formuliert mit Cetyltrimethylammoniumbromid) mit DNA gezeigt. Solche DNA-beschichteten Mikropartikel können bei der CTL-Erzeugung genauso wirksam sein wie rekombinante Viren, insbesondere wenn sie mit Alaun gemischt werden. Partikel mit einem Durchmesser von 300 nm scheinen für die Aufnahme durch Antigen-präsentierende Zellen am effizientesten zu sein. [7]

Alphavirus-Vektoren

Rekombinante Vektoren auf Alphavirus-Basis wurden verwendet, um die Effizienz der DNA-Impfung zu verbessern. [7] Das Gen, das das interessierende Antigen kodiert, wird in das Alphavirus-Replikon eingefügt, wobei es strukturelle Gene ersetzt, aber nicht-strukturelle Replikase-Gene intakt lässt. Das Sindbis-Virus und das Semliki-Forest-Virus wurden verwendet, um rekombinante Alphavirus-Replikons aufzubauen. Im Gegensatz zu herkömmlichen DNA-Impfungen töten Alphavirus-Vektoren transfizierte Zellen ab und werden nur vorübergehend exprimiert. Alphavirus-Replicase-Gene werden zusätzlich zum Impfstoff-Insert exprimiert. Es ist nicht klar, wie Alphavirus-Replikons eine Immunantwort auslösen, aber es kann an den hohen Proteinspiegeln liegen, die von diesem Vektor exprimiert werden, an Replikon-induzierten Zytokin-Reaktionen oder an Replikon-induzierter Apoptose, die zu einer verstärkten Antigenaufnahme durch dendritische Zellen führt.


Die MET1b Gen, das eine Erhaltungs-DNA-Methyltransferase kodiert, ist für die normale Entwicklung von Reis unentbehrlich

Während Arabidopsis trägt nur einen MET1 Gen, das für die DNA-Methyltransferase kodiert, die hauptsächlich für die Aufrechterhaltung der CG-Methylierung nach der DNA-Replikation verantwortlich ist, trägt Reis zwei MET1 Gene, MET1a und MET1b, exprimiert in sich aktiv replizierenden und sich teilenden Zellen, und MET1b ist reichlicher ausgedrückt als es ist MET1a. EIN met1a Null-Mutante zeigte keine offensichtlichen Phänotypen, was darauf hindeutet, dass MET1b eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung spielen muss. Hier haben wir zwei angestellt met1b Null-Mutanten, erzeugt durch homologe Rekombinations-vermittelte Knock-in-Targeting und Insertion von endogenem Retrotransposon Tos17. Diese MET1a/MET1a met1b/met1b Homozygote wiesen abnorme Samen-Phänotypen auf, die entweder mit einer viviparen Keimung oder einer frühen embryonalen Letalität verbunden sind. Sie zeigten auch eine verminderte DNA-Methylierung bei repetitiven CentO-Sequenzen und bei der FIE1 Genort in den Embryonen. Darüber hinaus isolierte Knock-in-Targeting-Pflanzen, bei denen die promotorlosen GUS Reportergen wurde mit dem endogenen . fusioniert MET1b Promotor, zeigte die reproduzierbaren, dosisabhängigen und raumzeitlichen Expressionsmuster von GUS. Die Genotypisierungsanalyse von selbstbesessenen Nachkommen von heterozygoten met1a met1b Null-Mutanten zeigten, dass schwach aktives MET1a als genetischer Backup-Mechanismus in Reis zu dienen scheint met1b Gametophyten, obwohl die stochastische und unkoordinierte Aktivierung epigenetischer Backup-Mechanismen weniger effizient im met1b Homozygoten von Reis als in der met1 Homozygoten von Arabidopsis. Darüber hinaus ist eine passive Depletion der CG-Methylierung während der postmeiotischen DNA-Replikation in den haploiden Kernen des met1a met1b Gametophyten in Reis führt zu einer frühen embryonalen Letalität. Diese Situation ähnelt ein wenig der der met1 Gametophyten in Arabidopsis.

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Nutzung einzigartiger DNA-Sequenzen

Das Vorhandensein einzigartiger DNA-Sequenzen ermöglicht es Wissenschaftlern, Signatursequenzen zu identifizieren, die später als Sonden zum Nachweis einzelner Organismen oder zum Nachweis eines bestimmten Gens verwendet werden können. Veränderungen sogar eines Basenpaares können durch die meisten Hybridisierungstechniken und durch Sequenzierung leicht nachgewiesen werden. Signatursequenzen sind besonders wichtig für die Diagnose von Viren, also den Erregern, denen ribosomale oder mitochondriale Gene fehlen. Ihr Nachweis und ihre Identifizierung wird durch die Verwendung dieser Sequenzen stark vereinfacht, da herkömmliche Methoden bis zu einigen Wochen dauern können.

Die einzigartigen DNA-Sequenzen können auch verwendet werden, um Primer (kurze DNA-Fragmente, die benötigt werden, um die DNA-Amplifikation zu initiieren) für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu entwerfen. Es gibt ausreichende Unterschiede zwischen allen Genen innerhalb eines Organismus sowie zwischen Organismen verschiedener Spezies, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Primer die Zielsequenz auch dann nur amplifizieren, wenn eine Mischung verschiedener DNA-Moleküle vorhanden ist. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, Diagnose- und Identifizierungstests für die häufigsten Krankheitserreger und Krankheiten sowie für Teile des Genoms des Krankheitserregers zu entwickeln.

Identifizierung von Personen. Obwohl jede Person eine einzigartige DNA hat (mit Ausnahme der eineiigen Zwillinge), basiert die Identifizierung von Personen nicht auf der Sequenzierung des Genoms einer Person. Stattdessen wird zur Identifizierung die Analyse mitochondrialer DNA in einem Bereich eines Displacement-Loops (D-Loop oder Kontrollbereich) oder von Short Tandem Repeats (STRs) verwendet. Die D-Loop-Analyse dient der Personenidentifikation in der forensischen Analyse. Dies ist aufgrund der Polymorphismen solcher Sequenzen möglich, die aus Substitutionen von Basenpaaren während des DNA-Replikationsprozesses resultieren (beispielsweise baut DNA-Polymerase anstelle von A T ein).

Die D-Loop-Region ist 1274 Basenpaare lang und befindet sich zwischen den Genen, die für die Transfer-RNA (tRNA) für Prolin und tRNA für Phenylalanin kodieren, und enthält die regulatorischen Regionen der für die Replikation anderen Gene.

Die Hauptmethode zur Identifizierung der Veränderungen in dieser Region ist die PCR-Amplifikation und Sequenzierung. Neue Microarray-Ansätze sind jedoch in der Entwicklung.

Verschlüsseln von geheimen Nachrichten. DNA-Sequenzen bieten eine einzigartige Methode zum Verschlüsseln von Nachrichten oder zum Verbergen von Informationen. Eine eine Botschaft codierende DNA-Sequenz wird an den Stellen von Primern flankiert, die später zur Amplifikation durch PCR und Sequenzierung verwendet werden.Ein Verschlüsselungscode wird von einer Gruppe ausgewählt, die das System verwendet, zum Beispiel können jedem Buchstaben und jeder Zahl drei Basenpaare zugewiesen werden. Der DNA-Strang mit einer Nachricht wird präpariert und mit menschlicher genomischer DNA gemischt, die auf die gleiche Größe wie die Nachricht fraktioniert wird. Um die DNA weiter vor einem Feind zu verbergen, kann DNA einer anderen Spezies hinzugefügt werden. Ein beabsichtigter Empfänger der Nachricht kann sie durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung entschlüsseln. Das Versenden einer solchen Nachricht ist so einfach wie das Schreiben eines Briefes und das Einfügen der DNA-codierten Nachricht als Mikropunkt. Sobald der DNA-Mix vorbereitet ist, wird er über einem Punkt auf Papier getüpfelt, aus dem die Mikropunkte ausgeschnitten und an den Punkten im Brief angebracht werden. Wenn ein solcher Brief in die falschen Hände gerät, wird es äußerst schwierig, eine Nachricht zu finden, da sie unter Millionen von anderen begraben wird und das Lesen ohne die Primersequenzen und den Verschlüsselungscode unmöglich ist.

DNA-verschlüsselte Nachrichten können zur sicheren Aufbewahrung wichtiger Informationen, aber auch zur Weitergabe von Spionageinformationen verwendet werden. Obwohl das Verfahren einfach ist, erfordert es eine molekularbiologische Ausrüstung zum Entschlüsseln und kann für den täglichen Gebrauch zu mühsam sein.


Ergebnisse

Populationsunterschiede in den DNA-Methylierungsprofilen von primären Monozyten

Um Populationsunterschiede in der DNA-Methylierung eines gereinigten angeborenen Immunzelltyps zu bewerten, haben wir die DNA-Methylierungsvariation an > 850.000 CpG-Stellen im gesamten Genom in Monozyten charakterisiert, die von 156 männlichen gesunden Freiwilligen stammten: 78 afrikanischer Abstammung (AFB, Durchschnittsalter = 30,9 Jahre .). ) und 78 europäischer Abstammung (EUB, Medianalter = 25,9 Jahre), die alle in Belgien leben. Beachten Sie, dass AFB-Personen im Alter von 6 bis 45 Jahren nach Belgien gezogen sind (Medianalter = 29 Jahre). Nach Normalisierung und Filterung (siehe „Materialien und Methoden“) behielten wir einen endgültigen Datensatz von 552.141 Methylierungsstellen bei den 156 Individuen (zusätzliche Datei 1: Abbildung S1). Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der DNA-Methylierung trennte AFB und EUB entlang der ersten beiden PCs deutlich, was zusammen 11,6% der Gesamtvarianz erklärte (Abb. 1a). Bei einer False Discovery Rate (FDR) = 1 % identifizierten wir 77.857 Stellen (14,1 % der Gesamtzahl), die einen signifikanten Unterschied zwischen AFB und EUB in ihrem mittleren DNA-Methylierungsgrad aufwiesen, nach Anpassung an Alter und Ersatzvariablen. Wenn wir unsere Analysen auf CpGs beschränken, die eine mittlere Differenz von > 5 % (gemessen an den β [68], siehe „Materialien und Methoden“), identifizierten wir insgesamt 12.050 differentiell methylierte Stellen zwischen Populationen (DMS), die auf 4818 Gene kartiert wurden. Da sich die Altersverteilungen von AFB- und EUB-Individuen signifikant unterscheiden (Wilcoxon P Wert = 10 −4 Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2), und das Alter könnte einen nichtlinearen Effekt auf die DNA-Methylierung haben [69], haben wir auch mit ANOVA untersucht, inwieweit die DNA-Methylierung in unserem Datensatz nichtlinear vom Alter beeinflusst wird . Unsere Analysen zeigten, dass solche Effekte wenig bis gar keinen Einfluss auf die Populationsunterschiede bei der festgestellten DNA-Methylierung hatten (Zusatzdatei 2: Ergänzende Anmerkung 1).

Populationsunterschiede in DNA-Methylierungsprofilen. ein Hauptkomponentenanalyse (PCA) von DNA-Methylierungsprofilen für alle 156 Personen. Rote und blaue Kreise repräsentieren afrikanische (AFB) bzw. europäische (EUB) Individuen. Die durch PC1 und PC2 erklärten Varianzanteile sind angegeben. B Genomische Lokalisierung von differentiell methylierten Stellen (DMS), für CpG-Stellen hypermethyliert in AFB (rot) und in EUB (blau). Odds Ratio und 95 % Konfidenzintervalle werden für AFB-DMS und EUB-DMS angezeigt und vergleichen ihre Lokalisierung in verschiedenen genomischen Positionen, wie von Illumina bereitgestellt (TSS1500, TSS200, 5′UTR, 1stExon, Body, Exongrenzen [ExonBnd] und 3 ′UTR) und in Enhancer- und Promotor-Regionen, die spezifisch in Monozyten durch ChromHMM-Phase 15 nachgewiesen wurden (siehe Lit. [110, 111]). Odds Ratios wurden gegen die allgemeine Verteilung der 552.141 CpGs unseres Datensatzes berechnet. C Anteil von DMS, die entweder bei AFB (rot) oder bei EUB (blau) Personen hypermethyliert sind. Die Dichte von β Die Werte einer CpG-Stelle nach Kategorie werden zur Veranschaulichung der Populationsunterschiede angegeben, wobei rote und blaue Linien die Methylierungsdichte in AFB bzw. EUB darstellen. D Gene Ontology (GO) Anreicherungsanalysen von AFB- und EUB-DMS. Für beide Gruppen werden die Top-GO-Kategorien mit 5 % FDR angezeigt, zusammen mit der Anzahl der Gene pro Kategorie und dem Log10-transformierte FDR-angepasste Anreicherung P Werte

Die genomische Verteilung von DMS, die in Enhancer-Regionen stark angereichert waren (Odds Ratio (OR)

2.6, P = 1,42 × 10 –224 ), war unabhängig von der Population, bei der eine Hypermethylierung beobachtet wurde (Abb. 1b). Von den 12.050 DMS waren jedoch 76,3 % in AFB stärker methyliert als in EUB, im Vergleich zu den beobachteten 54 % bei Berücksichtigung aller CpGs (Fisher’s P < 2,2 × 10 –16 ) (Abb. 1c). Die entsprechenden Gene wurden in den Kategorien der Geneontologie (GO) angereichert, die sich auf die Zellperipherie und die Plasmamembran beziehen (Abb. 1d). Die verbleibenden 23,7%, die in EUB hypermethyliert waren, waren an Stellen angereichert, die in Genen lokalisiert waren, die größtenteils mit der Regulation der Immunantwort und Reaktionen auf externe Stimuli assoziiert sind (Abb. 1c, d Zusätzliche Datei 3: Tabelle S1). Diese Ergebnisse können nicht durch Populationsunterschiede in Monozyten-Subpopulationen (d. h. CD14 .) erklärt werdenhoch/CD16negativ [Klassik], CD14hoch/CD16niedrig [Mittel] und CD14niedrig/CD16hoch [Non-Classical]), da das Hinzufügen dieser Subpopulationen als Kovariaten im Modell unsere Ergebnisse nicht veränderte (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3). Darüber hinaus fanden wir keine CpG-Stellen, deren Methylierungsgrad signifikant mit Monozyten-Subtypen korreliert (FDR = 5%), was darauf hindeutet, dass die Auswirkungen von Monozyten-Subpopulationen auf die DNA-Methylierung auf epigenomweiter Ebene vernachlässigbar sind. Zusammengenommen zeigen diese Analysen Gene und Funktionen, die im Zusammenhang mit primären Monozyten große Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Individuen afrikanischer und europäischer Abstammung aufweisen.

Genetische Faktoren treiben die meisten abstammungsbezogenen DNA-Methylierungsvariationen an

Als nächstes untersuchten wir die genetischen Determinanten der beobachteten Populationsunterschiede in der DNA-Methylierung und kartierten quantitative Methylierungs-Trait-Loci (meQTLs). Wir testeten zuerst auf lokale Assoziationen zwischen DNA-Methylierungsvariationen bei CpGs und SNPs, die sich innerhalb eines 100-kb-Fensters befinden (cis-meQTLs), unter Verwendung von MatrixEQTL [70] (siehe „Materialien und Methoden“). Wir haben einen FDR-Schwellenwert von 5 % festgelegt, wobei wir eine Assoziation pro CpG-Site berücksichtigen und 100 Permutationen verwenden (P < 1 × 10 –5 ). Wir adjustierten für das Alter, zwei Surrogatvariablen (unter Berücksichtigung von Batch-Effekten und unbekannten Confoundern, siehe „Materialien und Methoden“) und die ersten beiden PCs der genetischen Daten (Zusatzdatei 1: Abbildung S4), um die Bevölkerungsstratifizierung zu berücksichtigen. Um subtile Effekte zu erkennen, haben wir alle Individuen zusammengeführt und die Abstammung als Kovariate eingeschlossen, aber gleichzeitig analysierten wir die beiden Populationen getrennt, um mutmaßliche populationsspezifische Effekte zu erkennen. Für alle nachfolgenden Analysen präsentieren wir die signifikanten Ergebnisse dieser beiden Ansätze kombiniert, sofern nicht anders angegeben.

Wir identifizierten 69.702 CpGs, die mit mindestens einer genetischen Variante in mindestens einer Population assoziiert sind (

12,6 % aller Standorte, bezeichnet als meQTL-CpGs). Da mehrere verknüpfte SNPs mit demselben CpG assoziiert werden können, haben wir für jedes meQTL-CpG den am besten assoziierten SNP beibehalten. Wir verwendeten jedoch auch einen Fine-Mapping-Ansatz [51], um unabhängige SNPs zu erkennen, die mit jedem CpG assoziiert sind (siehe „Materialien und Methoden“). Dabei entdeckten wir 9826 zusätzliche meQTLs (Zusatzdatei 1: Abbildung S5), was einen genaueren Überblick über den Beitrag benachbarter genetischer Varianten zur DNA-Methylierungsvariation liefert. Der mediane Abstand zwischen einem CpG und seinem zugehörigen SNP war

3,8 kb (Zusatzdatei 1: Abbildung S6), die die enge genetische Kontrolle der DNA-Methylierung unterstützt [22, 28, 41, 65]. Darüber hinaus fanden wir eine 2,2-fache Anreicherung von meQTL-CpGs in Enhancern (P < 1 × 10 –326 ), ein Trend, der bei meQTLs noch ausgeprägter war, die mit Populationsunterschieden in der DNA-Methylierung assoziiert sind (meQTL-DMS OR

2.8, P = 6,8 × 10 -317 , Zusatzdatei 1: Abbildung S7).

Wir haben uns auf die Unterschiede im Zusammenhang mit der Abstammung konzentriert und festgestellt, dass

70,2 % der DMS enthalten einen signifikanten meQTL im Vergleich zu den 12,6 %, die genomweit nachgewiesen wurden (Fisher’s P < 2,2 × 10 -16 Abb. 2a). Es wurde festgestellt, dass diese meQTLs im Durchschnitt für

58 % der beobachteten Populationsunterschiede in der DNA-Methylierung (Zusatzdatei 1: Abbildung S8, siehe „Materialien und Methoden“). Darüber hinaus zeigten meQTLs in Abhängigkeit von Populationsunterschieden in der Allelhäufigkeit entgegengesetzte Wirkungen auf die DNA-Methylierung, dh ein abgeleitetes Allel mit höherer Häufigkeit bei Afrikanern war im Allgemeinen mit einer hohen DNA-Methylierung verbunden, während ein abgeleitetes Allel mit höherer Häufigkeit bei Europäern hauptsächlich assoziiert mit niedriger DNA-Methylierung (Abb. 2b). Diese Beobachtung liefert eine genetische Erklärung für die bei DMS beobachteten unausgewogenen Hypermethylierungsmuster zwischen Afrikanern und Europäern (Abb. 1c).

Genetische Kontrolle von Populationsunterschieden im DNA-Methylierungsniveau. ein Anteile von CpGs und DMS im Zusammenhang mit genetischen Varianten, die in den drei meQTL-Studien identifiziert wurden: Zusammenführung der beiden Populationen (Grautöne), Kartierung nur in AFB (Rottöne) und nur in EUB (Blautöne). Für jede Kartierung werden die Anteile zwischen allen 552.141 getesteten CpG-Stellen und unter DMS in hellen bzw. dunklen Farben angezeigt. ***Fischer ist genau P < 2,2 × 10 –16 . B Konturdiagramm der meQTL-Effekte auf DMS als Funktion ihres Unterschieds in abgeleiteten Allelfrequenzen (DAF) zwischen Populationen. Für jedes der 8459 DMS, für die wir mindestens einen meQTL nachgewiesen haben, haben wir eine Kerneldichteschätzung verwendet, um das Konturdiagramm der Wirkung des abgeleiteten Allels des meQTL auf die Methylierung (Beta, Ja Achse) nach dem ΔDAF (DAFEUB – DAFAFB, x Achse). Der Koeffizient und P Wert des Korrelationstests nach Pearson werden angezeigt. Die Randverteilung der beiden Variablen wird angezeigt: oben für ΔDAF und rechts für Beta. C, D Beispiele für meQTLs, die in dieser Studie entdeckt wurden. Boxplots repräsentieren die Verteilung von β Werte als Funktion des Genotyps für AFB (rot) und EUB (blau) Individuen. Die Nebenallelfrequenz jedes meQTL ist für jede Population oben angegeben. Graue Linien zeigen das angepasste lineare Regressionsmodell für β Wert

Genotyp für jede Population. e Faltenanreicherung von meQTLs im Zusammenhang mit DMS in GWAS-Treffern. Für jede der 17 elterlichen EFO-Kategorien die fache Anreicherung, die durch Bootstrap erhaltenen 95-%-Konfidenzintervalle und die damit verbundenen P Werte werden angezeigt

Lokale meQTLs können a priori zu Populationsunterschieden in der DNA-Methylierung nach zwei Hauptmodellen führen: (i) der meQTL hat eine ähnliche Wirkung in beiden Populationen, weist jedoch unterschiedliche Allelfrequenzen auf (Abb. 2c) oder (ii) der meQTL ist vorhanden mit ähnlichen Häufigkeiten, zeigen jedoch populationsspezifische Effekte, die komplexere Wechselwirkungen aufdecken (Abb. 2d). Wir untersuchten daher die Populationsspezifität der 69.702 nachgewiesenen meQTL-CpGs mit einem Modellauswahlansatz (siehe „Materialien und Methoden“). Wir fanden 2868 (4,1 %) signifikante populationsspezifische Effekte (1337 AFB-spezifisch und 1531 EUB-spezifisch), was auf das Auftreten von G × E- oder G × G-Effekten hindeutet.

Abstammungsbezogene meQTLs werden in Verbindung mit komplexen Merkmalen und Krankheiten angereichert

Da angenommen wird, dass ein großer Teil der genetischen Varianten, die durch GWAS identifiziert wurden, die Genregulation beeinflusst [71,72,73,74], untersuchten wir den mutmaßlichen funktionellen Einfluss der nachgewiesenen meQTLs auf letztendlich komplexe Phänotypen. In der Praxis haben wir in unserem Set von 79.528 meQTLs nach Anreicherungen in GWAS-Treffern gesucht, um das Kopplungsungleichgewicht zu korrigieren (siehe „Materialien und Methoden“). Mit Fokus auf die 17 Elternklassen der Experimental Factor Ontology (EFO)-Klassifikation [75] stellten wir fest, dass meQTLs in allen diesen Funktionskategorien in signifikanten Treffern angereichert waren (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S9, OR

2.1–5.5, P < 4,1 × 10 –10). Stärkere Anreicherungen wurden für meQTLs festgestellt, die mit Populationsunterschieden in der DNA-Methylierung (OR

2.7–9.8, P < 2,9 × 10 –3 ), insbesondere für Phänotypen im Zusammenhang mit hämatologischen Messungen, neurologischen Störungen, Störungen des Immunsystems, entzündlichen Messungen und Störungen des Verdauungssystems (Abb. 2e).

Da gezeigt wurde, dass DNA-Methylierung und meQTLs weitgehend zell- oder gewebeabhängig sind [23, 76,77,78,79,80,81], suchten wir als nächstes nach den spezifischen Merkmalen, die für die Signale verantwortlich sind, die in der Elternkategorie „Immun“ nachgewiesen wurden Systemstörung“, da wir uns auf primäre Monozyten konzentrieren. Wir fanden heraus, dass meQTLs Varianten überlappten, die mit Krankheiten wie Osteoarthritis, Psoriasis, systemischem Lupus erythematodes, entzündlichen Hauterkrankungen oder Typ-1-Diabetes assoziiert sind (Zusatzdatei 1: Abbildung S10). Zum Beispiel weist der meQTL SNP rs629953 deutlich unterschiedliche Frequenzen zwischen AFB und EUB auf (DAF AFB 7,5% gegenüber DAF EUB 62%), was zu einer variablen DNA-Methylierung auf Populationsebene bei führt TNFAIP3 (cg06987098) und wurde mit der Anfälligkeit für Psoriasis in Verbindung gebracht [82, 83]. Zusammen unterstützen unsere Analysen, dass komplexe Merkmale und variable DNA-Methylierung pleiotrop mit genetischer Variation assoziiert sind [39, 60, 63, 64], erweitern diese Assoziationen jedoch auf Varianten, die die ahnenbezogene epigenetische Variation im Kontext eines Zelltyps der angeborenen Immunität beeinflussen.

Erforschung der genetischen Fernsteuerung von DNA-Methylierungsvariationen

Anschließend suchten wir nach den Auswirkungen entfernter genetischer Varianten auf die DNA-Methylierungsvariation (trans-meQTLs). Um die Belastung durch Mehrfachtests zu begrenzen, und weil trans-meQTLs sind angereichert in cis-eQTLs für Gene, die für Transkriptionsfaktoren (TF) kodieren [65], konzentrierten wir uns auf zwei nicht unabhängige Untergruppen genetischer Varianten: (i) die 4037 SNPs, die als cis-eQTLs für eines von 600 TF-kodierenden Genen und allgemeiner (ii) die 73.561 SNPs, die sich in der Nähe (± 10 kb) des TSS dieser Gene befinden. Es wurden nur Assoziationen berücksichtigt, bei denen der SNP-CpG-Abstand größer als 1 Mb war, bei einer FDR von 5 % (P < 1 × 10 –9 ). Angesichts der im Allgemeinen geringen Leistung für die Zuordnung trans-Assoziationen führten wir diese Analyse durch, indem wir alle Individuen zusammen betrachteten und die Abstammung als Kovariate einschlossen.

Wir identifizierten 133 CpG-Stellen, die mit mindestens einem entfernten SNP assoziiert sind, für insgesamt 672 trans-meQTLs mit 91 unabhängigen Loci (Zusätzliche Datei 4: Tabelle S2). Unter diesen entdeckten wir eine Reihe von Knotenpunkten der genetischen Fernkontrolle der DNA-Methylierungsvariation, darunter sechs TFs (ZNF429, CTCF, FOXI1, ZBTB25, MKL2, und NFATC1) bei denen lokale genetische Variation mit mindestens 10 verschiedenen CpGs in assoziiert war trans. Hervorheben eines relevanten Beispiels, einer einzelnen genetischen Variante (rs7203742) in der Nähe CTCF—kodiert einen Transkriptionsregulator mit 11 hochkonservierten Zinkfingerdomänen—kontrolliert den Grad der DNA-Methylierung an 30 CpG-Stellen,

29,4 % aller regulierten CpGs in trans. Darüber hinaus ist der 21 trans-regulierte CpGs, die als DMS erkannt wurden, 12 wurden durch dasselbe kontrolliert CTCF Variante. Dass diese Variante (T → C) eine hohe Populationsdifferenzierung aufweist (DAF AFB 24% vs. EUB 88%, FNS = 0,59 in den 1 % der genomweiten Verteilung) legt die Wirkung einer positiven Selektion nahe, die auf das abgeleitete Allel bei Europäern abzielt. Diese Beobachtung macht aus CTCF nicht nur ein Hauptregulator der DNA-Methylierung, wie zuvor beobachtet [65], sondern auch ein wichtiger Beitrag zu den Unterschieden in der DNA-Methylierung zwischen menschlichen Populationen.

Analyse der mechanistischen Beziehungen zwischen DNA-Methylierung und Genexpression

Wir nutzten die Verfügbarkeit von RNA-Sequenzierungsdaten von denselben Individuen [48], um neue Einblicke in die mechanistischen Beziehungen zwischen DNA-Methylierung und Genexpressionsvariation bei afrikanischen und europäischen Individuen zu erhalten. Wir haben die Expressionsniveaus von 12.578 Genen in primären Monozyten mit denen der DNA-Methylierung an CpGs in Verbindung gebracht, die sich innerhalb von 100 kb von ihrem TSS befinden, für insgesamt 513.536 CpG-Stellen. Assoziationen wurden als signifikant angesehen, wenn sie a . bestanden haben P Wertschwelle bestimmt mit 100 Permutationen (FDR = 5%, P < 5 × 10 –5 ) (siehe „Materialien und Methoden“).

Wir identifizierten 1666 CpGs, deren DNA-Methylierungsgrad mit der Genexpression (eQTMs) assoziiert war, für insgesamt 811 Gene (eQTM-Gene), die mit mindestens einem CpG in einer Populationsgruppe assoziiert waren (Zusatzdatei 5: Tabelle S3). Die mit eQTM-Genen assoziierten KEGG-Wege enthielten eine große Anzahl von immunbezogenen Signalwegen, die eine Verbindung zwischen DNA-Methylierung und Genexpression im Kontext der Immunität herstellten (Abb. 3a). Bei der Untersuchung der Populationsspezifität der 811 eQTMs (siehe „Materialien und Methoden“) fanden wir 93 signifikante populationsspezifische Effekte (43 AFB-spezifisch und 50 EUB-spezifisch). Die Mehrheit dieser Fälle (80 von 93) entsprach Genen, deren eQTMs ebenfalls unter genetischer Kontrolle standen, was wiederum auf das Auftreten von G × G- oder G × E-Interaktionen schließen lässt.

Korrelationen der DNA-Methylierung mit der Genexpression. ein Netzwerke von KEGG-Wegen von Genen, die in der eQTM-Kartierung nachgewiesen wurden. B Genomische Lokalisierung von eQTMs für positiv und negativ assoziierte CpG-Stellen (hell- bzw. dunkelgelb). Die Odds Ratio wurde gegen die allgemeine Verteilung der 552.141 CpGs aus unserem Datensatz berechnet. Die Verteilung von eQTMs nach der Richtung ihrer Wirkung auf die Genexpression wird gezeigt. C Anteile verschiedener Gruppen von CpG-Stellen in allen getesteten Zentren (linkes Feld) und unter den nachgewiesenen eQTMs (rechtes Feld)

Basierend auf aktuellen genomischen Annotationen waren eQTMs meist negativ mit der Genexpression korreliert (69,5% vs. 30,5%, siehe auch Lit. [23, 28, 65, 84, 85]). Negativ korrelierte Stellen waren in Enhancern stark angereichert (OR

2.6, P = 6,6 × 10 −59 ) (Abb. 3b), was ihre Hauptrolle bei der Transkriptionsregulation hervorhebt [86,87,88]. Darüber hinaus fanden wir einen leichten Überschuss an negativen Assoziationen in Promotoren (OR

1.2, P = 1,8 × 10 −2 ) und nahegelegenem TSS (TSS1500) (OR

1.4, P = 7,2 × 10 −13 ), wie erwartet nach dem kanonischen Modell. Umgekehrt wurden positive Assoziationen an Standorten in der Nähe von UTRs angereichert, insbesondere 3′-UTR (OR

1.8, P = 8,4 × 10 −5 ) [89], aber verarmt an Stellen in Promotoren (OR

0.6, P = 1,1 × 10 –4 ) (Abb. 3b). Darüber hinaus fanden wir, dass eQTMs in DMS stark angereichert waren (OR

11.8, P < 1,93 × 10 –216 ) und vor allem in meQTL-CpGs (OR

33.2, P < 1 × 10 –326) (Abb. 3c). Zusammengenommen weisen diese Beobachtungen darauf hin, dass DNA-Methylierungsvariationen, insbesondere an Stellen, die zwischen Populationen unterschiedlich methyliert sind (DMS), viel wahrscheinlicher unter genetischer Kontrolle stehen, wenn sie mit Genexpressionsunterschieden (eQTMs) verbunden sind, als zufällige CpG-Stellen.

Erforschung der zugrunde liegenden Kausalität zwischen regulatorischen Loci und Genexpression

Da die jeweilige Rolle genetischer und epigenetischer Faktoren bei der transkriptionellen Regulation nicht vollständig verstanden ist [56], kartierten wir als nächstes eQTLs (FDR = 5%, siehe „Materialien und Methoden“), um die Fälle zu identifizieren, in denen DNA-Methylierung, Genexpression und genetische Varianten zeigen signifikante Assoziationen zwischen allen Paaren (Zusatzdatei 1: Abbildung S11). Auf diese Weise erhielten wir 552 Trios, von denen jedes aus einem Gen, einem zu verschiedenen CpGs und einem zu verschiedenen SNPs (enthaltend 68,1% der in der eQTM-Kartierung nachgewiesenen Gene) besteht. Dies deutete auf potenzielle kausale Beziehungen zwischen diesen Variablen hin – eine latente, wenn auch herausfordernde Frage in der Epigenetik. Um die Kausalität zwischen regulatorischen Loci (d. h. eQTMs und eQTLs) und der Variation der Genexpression für diese spezifischen Trios abzuleiten, verwendeten wir zunächst ein elastisches Netzmodell, um zwei Zwischenvariablen zu erstellen, die (i) die genetische Variabilität der DNA-Methylierung für die Trios mit mehr als ein SNP und (ii) Genexpressionsvariabilität, die der DNA-Methylierung zuzuschreiben ist, für die Trios, die mehr als ein CpG präsentieren (siehe „Materialien und Methoden“).

Wir verwendeten einen Bayes-Ansatz [90], um potenzielle kausale Effekte einer vermittelnden Variablen zu bewerten m (DNA-Methylierung) über die Beziehung zwischen einer unabhängigen Variablen x (Genetik) und eine abhängige Variable Ja (Genexpression) [91]. Vergleicht man die Leistung dieser Methode mit der eines auf Teilkorrelationen basierenden Ansatzes, der simulierte Daten und verschiedene genomische Szenarien verwendet, fanden wir ähnliche Ergebnisse zwischen den beiden Ansätzen in Bezug auf Sensitivität und Spezifität (Abb. 4a, b Zusatzdatei 1: Abbildung S12 siehe „Materialien und Methoden“). Wir führten dann die Mediationsanalyse für jedes Trio durch, wobei wir die regulären Kovariaten (Alter und Ersatzvariablen), aber auch den vierten und zweiten PC der Genexpression bzw. DNA-Methylierung korrigierten. Die letztgenannten Kovariaten wurden hinzugefügt, da sie wahrscheinlich potenzielle Störfaktoren erfassen, die eine Korrelation zwischen DNA-Methylierung und -Expression induzieren, was die Annahme des kausalen Inferenzmodells verletzen würde (Zusatzdatei 1: Abbildung S13). Beachten Sie, dass eine umgekehrte Kausalität in unserem experimentellen Setting unwahrscheinlich war und daher in unseren Analysen nicht berücksichtigt wurde (Zusatzdatei 2: Ergänzende Anmerkung 2).

Rückschluss auf die kausalen Auswirkungen der DNA-Methylierung auf die Genregulation. ein Darstellung eines simulierten Szenarios mit den drei variierenden Parametern (α, β, und τ). B Vergleich der Mediationsanalyse (med) mit einem partiellen Korrelationsansatz (PartCor) unter Verwendung verschiedener simulierter Parameter für α (0.3–0.8), β (0,9–0,1) und τ (0,1–0,9). Beachten Sie, dass der simulierte Parameterbereich für β und τ wurde so angepasst, dass wir 75% der Varianz unerklärt hielten (zufälliger Rauschparameter γ = 0,25). Der Unterschied der Fläche unter der Kurve (AUC) zwischen den beiden Ansätzen wird mit unterschiedlichen Rot- und Blautönen dargestellt. Die Größe der Kreise ist proportional zur mittleren AUC der beiden Ansätze. Im oberen Teil der Abbildung sind zwei Beispiele für die ROC-Kurven dargestellt. C Anzahl vermittelter und nicht vermittelter eQTM-Gene für negative und positive Assoziationen zwischen DNA-Methylierung und Genexpression. Die Prozentsätze dieser beiden Kategorien sind ebenfalls angegeben. D Anteil der Varianz der Genexpression, erklärt durch DNA-Methylierung (hellgrau) und Genetik (dunkelgrau), in vermittelten und nicht vermittelten Fällen

Bei FDR = 5 % identifizierten wir 165 Gene, bei denen die genetische Kontrolle der Expressionsniveaus durch DNA-Methylierung vermittelt wurde (d. h. α × β war in mindestens einer Population signifikant von Null verschieden, Abb. 4a). Bemerkenswerterweise erfolgte in 66 dieser Fälle die Vermittlung durch CpG-Stellen, die in den Populationen unterschiedlich methyliert sind (DMS) (Zusatzdatei 6: Tabelle S4). Der Anteil der vermittelten Gene, deren Expression positiv und negativ mit der DNA-Methylierung korreliert war, war ähnlich und reichte von 26 bis 31 % (Fig. 4c). Erwartungsgemäß fanden wir heraus, dass bei den vermittelten Genen die DNA-Methylierung einen signifikant höheren Anteil der Varianz der Genexpression erklärt als die Genetik (Mittelwert R 2 = 23,4% versus 15,4% bzw. Wilcoxon P = 3,3 × 10 −11 ), im Gegensatz zu den 387 nicht vermittelten Fällen, in denen wir den gegenteiligen Trend beobachteten (Wilcoxon P = 7,8 × 10 –37 ) (Abb. 4d).

Wir fanden auch, dass CpG-Stellen, die die Genexpression vermitteln, bevorzugt in Enhancern (OR

2.5, P = 4,0 × 10 −21 ), was erneut die Hauptrolle dieser Regionen in epigenetischen Regulationsmechanismen unterstreicht [92,93,94]. Diese CpGs waren an Promotoren (OR

0.7, P = 1,4 × 10 −2 ), die ansonsten an nicht-vermittelnden CpGs angereichert waren (OR

1.3, P = 5,9 × 10 –3 ). Bemerkenswerterweise fielen 86,6% der vermittelnden CpGs direkt in eine TF-Bindungsstelle (TFBS), gegenüber den erwarteten 76,9% auf genomweiter Ebene (OR

1.9, Fishers genau P = 8,64 × 10 –7 ). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die DNA-Methylierung die Transkriptionsaktivität durch die Modulation der TF-Bindung aktiv regulieren könnte, eine Hypothese, die experimentelle Validierung erfordert.

Interessanterweise fanden wir unter den vermittelten Fällen Schlüsselgene der Immunantwort, wie z NLRP2, RAI14, NCF4, oder ICAM4, und Gene mit Funktionen im Zusammenhang mit der Transkriptionsaktivität, die Zinkfingerproteine ​​kodieren (zusätzliche Datei 6: Tabelle S4). Dies deutet auf eine umfassendere Rolle der DNA-Methylierung bei der Regulierung der Genexpression hin als die hier beschriebenen lokalen Assoziationen durch die Regulierung der DNA-bindenden Proteinaktivität.

Einfluss von Immunstörungen auf genetische und epigenetische Interaktionen

Schließlich versuchten wir zu verstehen, wie die DNA-Methylierungsvariation im Grundzustand die Transkriptionsreaktionen auf die Immunaktivierung beeinflusst. Wir verwendeten RNA-Sequenzierungsdaten, die von denselben Personen erhalten wurden, nachdem sie verschiedenen Stimuli ausgesetzt waren: LPS aktiviert TLR4 und Pam3CSK4 aktiviert TLR1/2, beide Wege erkennen bakterielle Komponenten, R848 aktiviert TLR7/8, erkennt hauptsächlich virale Nukleinsäuren und Influenza A Virus (IAV) [48]. Anschließend kartierten wir Response-QTMs (reQTMs) unter Verwendung von Faltungsänderungen in der Genexpression zwischen nicht stimulierten und stimulierten Zuständen für alle Gene, die in beiden Zuständen exprimiert wurden (siehe „Materialien und Methoden“).

Wir fanden 230 einzigartige Gene, deren Reaktion auf die Immunaktivierung in mindestens einer Bedingung mit DNA-Methylierung verbunden war. Die meisten Assoziationen waren kontextspezifisch, wobei nur 7 Gene in allen Bedingungen nachgewiesen wurden (Fig. 5a Zusätzliche Datei 5: Tabelle S3). Darüber hinaus wurde ein 2,5-facher Anstieg der Anzahl der reQTM-Gene beobachtet, die bei Aktivierung mit viralen Stimuli (R848 und IAV 197 einzigartige Gene) im Vergleich zu denen für bakterielle Liganden (LPS und Pam3CSK4 78 einzigartige Gene) nachgewiesen wurden (Abb. 5a). Zum Beispiel haben wir ein reQTM bei R848-Stimulation für nachgewiesen KARTE9 in EUB und CD1D nach einer IAV-Infektion in AFB spielen beide Gene bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Wirtsabwehr (Fig. 5b, c). Obwohl reQTMs und eQTMs eine ähnliche genomische Verteilung aufweisen (zusätzliche Datei 1: Abbildung S14), beobachteten wir eine wichtige Verschiebung hin zu positiven Assoziationen zwischen DNA-Methylierung und Transkriptionsreaktionen, insbesondere bei TLR-Liganden (Abb. 5d). Diese Verschiebung wurde hauptsächlich durch reQTMs erklärt, die die stärksten Assoziationen zwischen DNA-Methylierung und Genexpression im nicht stimulierten Zustand aufweisen (Zusatzdatei 1: Abbildung S15), was 109 Genen (47% der Gesamtmenge) entspricht. Dies steht im Gegensatz zu dem kanonischen Modell negativer Assoziationen, das hauptsächlich bei reQTMs beobachtet wurde und die stärksten Assoziationen im stimulierten Zustand zeigt, was 131 Genen (57% der Gesamtmenge) entspricht. Beachten Sie, dass 10 Gene mit reQTMs beider Gruppen assoziiert waren.

Auswirkungen der DNA-Methylierung auf die Transkriptionsreaktionen auf die Immunstimulation. ein Anzahl der Gene, die reQTMs unter einzelnen Bedingungen oder Kombinationen von Stimulationen beherbergen. B, C Beispiele für reQTMs, die in dieser Studie entdeckt wurden. Linien geben das angepasste lineare Regressionsmodell an und graue Schattierungen die 95 %-Konfidenzintervalle dieser Modelle. B Die Verteilung der Ausdruckswerte von CD1D bei nicht stimulierter (gelb) und nach IAV-Infektion (violett) als Funktion von aufgetragen β Werte, nur für AFB-Personen. C Die Verteilung der Ausdruckswerte von KARTE9 bei nicht-stimulierter (gelb) und bei R848-Stimulation (blau) als Funktion von aufgetragen β Werte, nur für EUB-Personen. D Anzahl der reQTM-Gene nach Bedingung und nach der Richtung ihrer Assoziation mit der DNA-Methylierung. e Anzahl vermittelter und nicht vermittelter reQTM-Gene pro Stimulationsbedingung. Die Prozentsätze dieser beiden Kategorien für jede Bedingung sind ebenfalls angegeben. F Anteil der Varianz der Genexpression, erklärt durch DNA-Methylierung, zwischen negativen (dunkle Farben) und positiven (hellen Farben) Assoziationen, in vermittelten Fällen

Um kausale Vermittlungseffekte der DNA-Methylierung im Kontext der Immunaktivierung zu untersuchen, haben wir Antwort-QTLs kartiert (siehe „Materialien und Methoden“). Unserer vorherigen Begründung folgend (Zusatzdatei 1: Abbildung S11) identifizierten wir 141 Trios (61,3% der 230 reQTM-Gene, Zusatzdatei 6: Tabelle S4). Bei FDR = 5% haben wir 40 Gene (28,4%) nachgewiesen, bei denen die genetische Kontrolle ihrer Transkriptionsantwort durch DNA-Methylierung vermittelt wurde (Fig. 5e). Obwohl nicht signifikant, fanden wir einen höheren Anteil an Mediation bei Genen, deren Reaktion positiv mit DNA-Methylierung assoziiert war, im Vergleich zu negativen Assoziationen, insbesondere bei viralen Herausforderungen (OR

2.0 Fishers genau P = 0,33) (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S16). Unter den vermittelten Genen in den viralen Zuständen war der Anteil der durch DNA-Methylierung erklärten Genexpressionsvarianz bei positiven Assoziationen höher als bei negativen Assoziationen, wiederum im Widerspruch zum nicht-stimulierten Zustand (Fig. 5f). Ganz allgemein veranschaulichen unsere Analysen den Wert der Kartierung von reQTMs und der Untersuchung der zugrunde liegenden Kausalitätsmuster, um Mechanismen aufzudecken, die Disparitäten in der Art und Weise erklären könnten, wie Individuen und Populationen auf die Immunaktivierung reagieren.


Teile der mysteriösen DNA, weit entfernt von „Junk“, spielen eine entscheidende Rolle

Zu den vielen Rätseln der Humanbiologie gehört, warum komplexe Krankheiten wie Diabetes, Bluthochdruck und psychiatrische Erkrankungen so schwer vorherzusagen und oft auch nur schwer zu behandeln sind. Ein ebenso verwirrendes Rätsel ist, warum ein Individuum eine Krankheit wie Krebs oder Depression bekommt, während ein eineiiger Zwilling vollkommen gesund bleibt.

Jetzt haben Wissenschaftler einen wichtigen Hinweis gefunden, um diese Rätsel zu lösen. Das menschliche Genom ist vollgepackt mit mindestens vier Millionen Genschaltern, die sich in DNA-Stücken befinden, die einst als „Schrott“ abgetan wurden, aber eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle des Verhaltens von Zellen, Organen und anderen Geweben spielen. Die Entdeckung, die als großer medizinischer und wissenschaftlicher Durchbruch gilt, hat enorme Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, da viele komplexe Krankheiten anscheinend durch winzige Veränderungen in Hunderten von Genschaltern verursacht werden.

Die Ergebnisse, die das Ergebnis eines riesigen Bundesprojekts sind, an dem 440 Wissenschaftler aus 32 Laboratorien weltweit beteiligt sind, werden sofort Anwendung finden, um zu verstehen, wie Veränderungen in den Nicht-Gen-Teilen der DNA zu menschlichen Krankheiten beitragen, die wiederum zu neuen führen können Drogen. Sie können auch helfen zu erklären, wie die Umwelt das Krankheitsrisiko beeinflussen kann. Bei eineiigen Zwillingen können kleine Veränderungen der Umweltbelastung die Gen-Umschaltung leicht verändern, so dass ein Zwilling erkrankt und der andere nicht.

Als Wissenschaftler sich mit dem „Müll“ befassten – Teilen der DNA, die keine eigentlichen Gene sind, die Anweisungen für Proteine ​​​​enthalten – entdeckten sie ein komplexes System, das Gene kontrolliert. Mindestens 80 Prozent dieser DNA sind aktiv und werden benötigt. Das Ergebnis der Arbeit ist eine kommentierte Roadmap eines Großteils dieser DNA, in der festgehalten wird, was sie tut und wie. Es umfasst das System von Schaltern, die wie Dimmer für Lichter steuern, welche Gene wann in einer Zelle verwendet werden und beispielsweise bestimmen, ob eine Zelle eine Leberzelle oder ein Neuron wird.

„Es ist Google Maps“, sagt Eric Lander, Präsident des Broad Institute, einem gemeinsamen Forschungsunternehmen von Harvard und dem Massachusetts Institute of Technology. Im Gegensatz dazu war der Vorgänger des Projekts, das Human Genome Project, das die gesamte Sequenz der menschlichen DNA bestimmt hatte, „wie ein Bild der Erde aus dem Weltraum zu bekommen“, sagte er. „Es sagt Ihnen nicht, wo die Straßen sind, es sagt Ihnen nicht, wie der Verkehr zu welcher Tageszeit ist, es sagt Ihnen nicht, wo die guten Restaurants sind, oder die Krankenhäuser, die Städte oder die Flüsse .“

Das neue Ergebnis "ist eine erstaunliche Ressource", sagte Dr. Lander, der nicht an der Forschung beteiligt war, die ihn hervorbrachte, aber einer der Leiter des Humangenomprojekts war. "Mein Kopf explodiert bei der Datenmenge."

Die Entdeckungen wurden am Mittwoch in sechs Artikeln in der Zeitschrift Nature und in 24 Artikeln in Genome Research and Genome Biology veröffentlicht. Darüber hinaus veröffentlicht das Journal of Biological Chemistry sechs Übersichtsartikel und Science einen weiteren Artikel.

Die menschliche DNA ist „viel aktiver, als wir erwartet hatten, und es passieren viel mehr Dinge, als wir erwartet hatten“, sagte Ewan Birney vom European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute, ein leitender Forscher des Projekts.

In einem der Nature-Papiere verbinden Forscher die Genschalter mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten – Multiple Sklerose, Lupus, rheumatoide Arthritis, Morbus Crohn, Zöliakie – und sogar mit Merkmalen wie der Körpergröße. In großen Studien der letzten zehn Jahre fanden Wissenschaftler heraus, dass geringfügige Veränderungen der menschlichen DNA-Sequenzen das Risiko erhöhen, dass eine Person diese Krankheiten bekommt. Aber diese Veränderungen waren im Schrott, jetzt oft als dunkle Materie bezeichnet – sie waren keine Veränderungen in den Genen – und ihre Bedeutung war nicht klar. Die neue Analyse zeigt, dass viele dieser Veränderungen Genschalter verändern und von großer Bedeutung sind.

„Die meisten Veränderungen, die die Krankheit beeinflussen, liegen nicht in den Genen selbst, sondern in den Schaltern“, sagte Michael Snyder, ein Forscher der Stanford University für das Projekt Encode für Encyclopedia of DNA Elements.

Und das, sagte Dr. Bradley Bernstein, ein Encode-Forscher am Massachusetts General Hospital, „ist eine wirklich große Sache“. Er fügte hinzu: "Ich glaube nicht, dass jemand vorhergesagt hat, dass dies der Fall sein würde."

Die Entdeckungen können auch aufdecken, welche genetischen Veränderungen bei Krebs wichtig sind und warum. Als sie begannen, die DNA-Sequenzen von Krebszellen zu bestimmen, stellten die Forscher fest, dass die meisten der Tausenden von DNA-Veränderungen in Krebszellen nicht in Genen stattfanden, sondern in der dunklen Materie. Die Herausforderung besteht darin, herauszufinden, welche dieser Veränderungen das Wachstum des Krebses antreiben.

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"Diese Arbeiten sind sehr bedeutsam", sagte Dr. Mark A. Rubin, ein Prostatakrebs-Genomforscher am Weill Cornell Medical College. Dr. Rubin, der nicht am Encode-Projekt beteiligt war, fügte hinzu: „Sie werden definitiv einen Einfluss auf unsere medizinische Krebsforschung haben.“

Bei Prostatakrebs etwa fand seine Gruppe Mutationen in wichtigen Genen, die von Medikamenten nicht ohne weiteres angegriffen werden. Aber Encode, indem es zeigt, welche Regionen der Dunklen Materie diese Gene kontrollieren, bietet eine andere Möglichkeit, sie anzugreifen: gezielt auf die kontrollierenden Schalter.

Dr. Rubin, der auch die Analogie zu Google Maps verwendet hat, erklärt: „Jetzt können Sie den Straßen folgen und den Verkehrsfluss sehen. Genauso werden wir diese Daten in der Krebsforschung nutzen.“ Encode bietet eine Roadmap mit Verkehrsmustern für alternative Wege, um Krebsgene zu bekämpfen, sagte er.

Dr. Bernstein sagte: „Dies ist eine Ressource, wie das menschliche Genom, die die Wissenschaft vorantreiben wird.“

Das System ist jedoch erstaunlich komplex und weist viele Redundanzen auf. Allein die Vorstellung von so vielen Schaltern sei fast unverständlich, sagte Dr. Bernstein.

Es gibt auch eine Art DNA-Verdrahtungssystem, das fast unvorstellbar kompliziert ist.

"Es ist, als würde man einen Kabelschrank öffnen und einen Haarball aus Drähten sehen", sagte Mark Gerstein, ein Encode-Forscher aus Yale. „Wir haben versucht, diesen Haarballen zu entwirren und interpretierbar zu machen.“

Es gibt noch eine andere Art von Haarballen: die komplexe dreidimensionale Struktur der DNA. Die menschliche DNA ist ein so langer Strang – etwa 3 Meter DNA, die in einen mikroskopisch kleinen Zellkern gesteckt wird –, dass sie nur passt, weil sie fest um sich selbst gewickelt und gewickelt ist. Als sie sich die dreidimensionale Struktur – den Haarballen – ansahen, entdeckten die Encode-Forscher, dass kleine Segmente der DNA aus dunkler Materie oft ziemlich nah an den Genen liegen, die sie kontrollieren. In der Vergangenheit schienen diese Kontrollregionen weit von den Genen entfernt zu sein, die sie beeinflussten, als sie nur die abgewickelte Länge der DNA analysierten.

Das Projekt begann 2003, als die Forscher zu schätzen begannen, wie wenig sie über die menschliche DNA wussten. In den letzten Jahren begannen einige, in 99 Prozent der menschlichen DNA Schalter zu finden, die keine Gene sind, aber sie konnten nicht vollständig charakterisieren oder erklären, was die überwiegende Mehrheit davon tat.

Der Gedanke vor Beginn des Projekts, sagte Thomas Gingeras, ein Encode-Forscher vom Cold Spring Harbor Laboratory, war, dass nur 5 bis 10 Prozent der DNA eines Menschen tatsächlich verwendet werden.

Die große Überraschung war nicht nur, dass fast die gesamte DNA verwendet wird, sondern auch, dass ein Großteil davon Genschalter sind. Vor Encode sagte Dr. John Stamatoyannopoulos, ein Wissenschaftler der University of Washington, der an dem Projekt beteiligt war: „Wenn Sie gesagt hätten, dass die Hälfte des Genoms und wahrscheinlich mehr Anweisungen zum Ein- und Ausschalten von Genen enthalten, hätten die Leute meiner Meinung nach nicht hat dir geglaubt."

Als das National Human Genome Research Institute, das zu den National Institutes of Health gehört, mit Encode begann, war es durch große Fortschritte in der DNA-Sequenzierung und der Computerbiologie denkbar, die dunkle Materie der menschlichen DNA zu verstehen. Trotzdem war die Analyse entmutigend – die Forscher generierten 15 Billionen Bytes an Rohdaten. Die Analyse der Daten erforderte das Äquivalent von mehr als 300 Jahren Computerzeit.

Allein die Organisation der Forscher und die Koordination der Arbeit war ein riesiges Unterfangen. Dr. Gerstein, einer der Projektleiter, hat ein Diagramm der Autoren mit ihren Verbindungen zueinander erstellt. Es sieht fast so kompliziert aus wie der Schaltplan für die menschlichen DNA-Schalter. Jetzt ist dieser Teil der Arbeit getan, und die Hunderte von Autoren haben ihre Papiere geschrieben.

"Es gibt buchstäblich eine Flotte von Papieren", sagte Dr. Gerstein. Aber, fügte er hinzu, es muss noch mehr Arbeit geleistet werden – es gibt immer noch Teile des Genoms, die noch nicht herausgefunden wurden.


Wie DNA funktioniert

Die DNA trägt alle Informationen für Ihre körperlichen Eigenschaften, die im Wesentlichen von Proteinen bestimmt werden. DNA enthält also die Anweisungen zur Herstellung eines Proteins. In der DNA wird jedes Protein von a . kodiert Gen (eine spezifische Sequenz von DNA-Nukleotiden, die angeben, wie ein einzelnes Protein hergestellt werden soll). Insbesondere die Reihenfolge der Nukleotide innerhalb eines Gens gibt die Reihenfolge und die Arten von Aminosäuren an, die zusammengefügt werden müssen, um ein Protein zu bilden.

Ein Protein besteht aus einer langen Kette von Chemikalien namens Aminosäuren Proteine ​​haben viele Funktionen:

  • Enzyme die chemische Reaktionen ausführen (wie Verdauungsenzyme)
  • Strukturproteine das sind Baustoffe (wie Kollagen und Nagelkeratin)
  • Transportproteine die Stoffe tragen (wie sauerstofftragendes Hämoglobin im Blut)
  • Kontraktionsproteine die eine Muskelkompression verursachen (wie Aktin und Myosin)
  • Speicherproteine die Substanzen festhalten (wie Albumin in Eiweiß und eisenspeicherndes Ferritin in Ihrer Milz)
  • Hormone - chemische Botenstoffe zwischen den Zellen (einschließlich Insulin, Östrogen, Testosteron, Cortisol usw.)
  • Schutzproteine - Antikörper des Immunsystems, Gerinnungsproteine ​​im Blut
  • Giftstoffe - giftige Substanzen (wie Bienen- und Schlangengift)

Die besondere Reihenfolge der Aminosäuren in der Kette unterscheidet ein Protein von einem anderen. Diese Sequenz ist in der DNA kodiert, wobei ein Gen für ein Protein kodiert.

Wie kodiert DNA die Informationen für ein Protein? Es gibt nur vier DNA-Basen, aber es gibt 20 Aminosäuren, die für Proteine ​​verwendet werden können. Gruppen von drei Nukleotiden bilden also ein Wort (codon), die angibt, welche der 20 Aminosäuren in das Protein eingehen (ein 3-Basen-Codon ergibt 64 mögliche Muster (4*4*4), was mehr als genug ist, um 20 Aminosäuren zu spezifizieren. Denn es gibt 64 mögliche Codons und nur 20 Aminosäuren, gibt es einige Wiederholungen im genetischen Code.Außerdem gibt die Reihenfolge der Codons im Gen die Reihenfolge der Aminosäuren im Protein an.Es kann zwischen 100 und 1.000 Codons (300 bis 2.000 Nukleotide) erfordern, um a . zu spezifizieren Jedes Gen hat auch Codons, um den Anfang (Startcodon) und Ende (Codon stoppen) des Gens.


Danksagung

Wir danken Shivani Nautiyal und S. Jarrett Wrenn für die kritische Lektüre des Manuskripts und die hilfreichen Diskussionen im Verlauf dieser Arbeit Elizabeth Zuo für die Oligonukleotidsynthese und Massenspektrometrieanalyse und Mai Nguyen für die Oligonukleotidsynthese. DRH ist Predoctoral Fellow des Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde durch einen Stanford Office of Technology Licensing Research Incentive Award (#127P304 an PBH) und einen Burroughs-Wellcome Fund New Investigator in the Pharmacological Sciences Award (#1001162 an PBH) finanziert.


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