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Wie unterschiedlich sind gewebespezifische Fibroblasten voneinander?

Wie unterschiedlich sind gewebespezifische Fibroblasten voneinander?



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Ich plane, in unserem Labor ein neues System einzusetzen, in dem ich Krebszellen aus verschiedenen Geweben mit Fibroblasten kokultiviere. Ich habe die Möglichkeit, primäre Fibroblasten aus der Haut zu erhalten. Mir wurde gesagt, dass die normalen Fibroblasten im ganzen Körper sehr ähnlich sind. Ist das wirklich wahr? Ich gehe davon aus, dass Fibroblasten zum Beispiel gewebespezifische Faktoren absondern. Die Frage ist, wie schnell passen sie sich einer neuen Umgebung an? Wenn ich zum Beispiel diese aus der Haut stammenden Fibroblasten nehme und sie mit Brustkrebszellen co-kultiviere, wie lange wird es dann dauern, bis die Fibroblasten, falls vorhanden, eher wie aus der Brust stammende Fibroblasten werden?


Mir wurde gesagt, dass die normalen Fibroblasten im ganzen Körper sehr ähnlich sind. Ist das wirklich wahr?

Nein.

Starke Beweise deuten darauf hin, dass Fibroblasten in verschiedenen Körperteilen intrinsisch unterschiedlich sind und es sogar in einer einzigen Region Unterschiede zwischen ihnen geben kann [3].

Sie haben morphologische Ähnlichkeiten, wirken aber unterschiedlich (zumindest in Kulturen):

Die Untersuchung von Haut- und Lungenfibroblasten, die von denselben menschlichen Föten stammten, ergab signifikante in vitro-Unterschiede. Fötale Lungenkulturen wiesen im Vergleich zu fötalen Hautkulturen schnellere Zellreplikationsraten, einen größeren [$^3H$]Thymidin-Einbau in die DNA, höhere Zellzahlen bei Konfluenz, kleinere Zellvolumina, verringerte zelluläre RNA- und Proteingehalte und eine längere In-vitro-Lebensdauer auf. Außerdem reagierten diese Zellkulturen unterschiedlich auf die Zugabe von Hydrocortison zu Kulturmedien [1].

Sie passen sich kaum an ein anderes Serum an (in vitro) [2]. Sie haben jedoch ein hohes Unterscheidungsvermögen (in vivo):

[…] Fibroblasten scheinen auch die vielseitigsten Bindegewebszellen zu sein und zeigen eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich in andere Mitglieder der Familie zu differenzieren. [… ] „reife“ Fibroblasten mit geringerer Transformationsfähigkeit können beispielsweise Seite an Seite mit „unreifen“ Fibroblasten (oft als Mesenchymzellen bezeichnet) existieren, die sich zu einer Vielzahl von reifen Zelltypen entwickeln können [3].


Verweise:

  1. E. L. Schneider, Y. Mitsui, K.S. Au, S. Stuart Shorr. Gewebespezifische Unterschiede in kultivierten humanen diploiden Fibroblasten. Experimentelle Zellforschung. Band 108, Ausgabe 1, August 1977, Seiten 1-6. DOI 10.1016/S0014-4827(77)80002-5
  2. Zamansky, GLENB. et al. "Anpassung von humanen diploiden Fibroblasten in vitro an Serum aus verschiedenen Quellen." Zeitschrift für Zellwissenschaft 61.1 (1983): 289-297.
  3. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molekularbiologie der Zelle. 4. Auflage. New York: Girlandenwissenschaft; 2002. Fibroblasten und ihre Transformationen: Die Familie der Bindegewebszellen. Verfügbar unter: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26889/

Abstrakt

Hintergrund

Fibroblasten sind die wichtigsten Stromazellen, die in ganzen Organen vorkommen und in vielen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Obwohl die funktionelle Diversität von Fibroblasten geschätzt wurde, wurde keine umfassende Analyse von Fibroblasten aus dem ganzen Körper durchgeführt und ihre Transkriptionsdiversität wurde nicht ausreichend erforscht. Das Ziel dieser Studie war es, die transkriptionelle Diversität menschlicher Fibroblasten im gesamten Körper aufzuklären.

Methoden

Eine globale Genexpressionsanalyse wurde an 63 menschlichen primären Fibroblasten aus 13 Organen durchgeführt. Davon wurden 32 Fibroblasten aus gastrointestinalen Organen (gastrointestinale Fibroblasten: GIFs) von einem Paar von 2 anatomischen Stellen gewonnen: der submukösen Schicht (submuköse Fibroblasten: SMFs) und der subperitonealen Schicht (subperitoneale Fibroblasten: SPFs). Mit Hilfe der hierarchischen Clustering-Analyse haben wir identifizierbare Untergruppen von Fibroblasten aufgeklärt und den transkriptionellen Charakter jeder Untergruppe analysiert.

Ergebnisse

Beim unüberwachten Clustering wurden 2 Hauptcluster beobachtet, die GIFs und Nicht-GIFs trennen. Organisch und anatomisch ortsabhängige Cluster innerhalb von GIFs wurden ebenfalls beobachtet. Die Signaturgene, die GIFs von Nicht-GIFs, SMFs von SPFs und die Fibroblasten eines Organs von einem anderen Organ unterschieden, bestanden aus Genen, die mit Transkriptionsregulation, Signalliganden und extrazellulärem Matrix-Remodeling assoziiert sind.

Schlussfolgerungen

GIFs sind charakteristische Fibroblasten mit spezifischen Genexpressionen aus der Transkriptionsregulation, Signalliganden und verwandten Genen der extrazellulären Matrixremodellierung. Darüber hinaus wurde auch die anatomische orts- und organabhängige Diversität von GIFs entdeckt. Diese Eigenschaften von GIFs tragen zu ihrer spezifischen physiologischen Funktion und homöostatischen Aufrechterhaltung bei und schaffen eine funktionelle Vielfalt des Magen-Darm-Trakts.

Zitat: Higuchi Y, Kojima M, Ishii G, Aoyagi K, Sasaki H, Ochiai A (2015) Gastrointestinale Fibroblasten haben spezialisierte, vielfältige Transkriptionsphänotypen: Eine umfassende Genexpressionsanalyse menschlicher Fibroblasten. PLoS ONE 10(6): e0129241. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0129241

Wissenschaftlicher Redakteur: Mathias Chamaillard, INSERM, FRANKREICH

Empfangen: 19. Januar 2015 Akzeptiert: 6. Mai 2015 Veröffentlicht: 5. Juni 2015

Urheberrechte ©: © 2015 Higuchi et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten, erwartet für rohe Microarray-Daten, befinden sich in der Veröffentlichung und in den Dateien mit den Hintergrundinformationen. Die Zugangsnummer der Microarray-Daten ist GSE63626, die unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63626 verfügbar ist.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde unterstützt durch: Forschungsstipendien für Gesundheits- und Arbeitswissenschaften, Stipendiennummer 26270601 (Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt, [http://www.mhlw.go.jp/: MK]) und ein Stipendium für ein 3. 10-Jahres-Strategy for Cancer Control Grant Nummer 23-A-3 (Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt, [http://www.mhlw.go.jp/: AO]). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


Hintergrund

Fibroblasten wurden lange Zeit als relativ einfache Strukturzellen angesehen, die zur extrazellulären Matrix (ECM) im Bindegewebe beitragen und für die Gewebereparatur während der Wundheilung verantwortlich sind. In den letzten Jahren wurde jedoch erkannt, dass diese Zellen auch in anderen Prozessen eine wichtige Rolle spielen und auf alle Arten von Zellen in ihrer Umgebung einen maßgeblichen Einfluss ausüben können. Es scheint nun offensichtlich, dass Fibroblasten entscheidende Akteure bei Entzündungsprozessen sind, indem sie die Aktivitäten von Leukozyten modulieren, indem sie spezifische Signalmoleküle an Entzündungsherden absondern [1]. Wichtig ist, dass Fibroblasten für die Beendigung von Immunantworten oder alternativ für den Wechsel von einer akuten zu einer chronischen Entzündung verantwortlich sind [2, 3]. Bei einer akuten Entzündung werden Immunzellen im geschädigten Gewebe rekrutiert und vermehrt. Unter normalen physiologischen Bedingungen verhindern Kontrollmechanismen eine Überstimulation dieser Zellen. Dabei spielen Fibroblasten eine wichtige Rolle, indem sie immunregulatorische Signale freisetzen, die die Entfernung abgestorbener oder überzähliger Immunzellen fördern. Chronische Entzündungen können auftreten, wenn diese Clearance-Mechanismen versagen. Dies kann passieren, wenn Fibroblasten entweder apoptotische Prozesse hemmen, indem sie Überlebenszytokine produzieren, oder die Immunzellen durch die Freisetzung spezifischer Chemokine zurückhalten [2]. Chronische Entzündungsprozesse sind auch an Krankheiten wie Fibrose und Krebs beteiligt. Regulatorische Effekte von Fibroblasten auf die Entstehung und Progression von Fibrose und Krebs wurden nachgewiesen [4–8]. Dabei spielt die Reorganisation der ECM durch Fibroblasten eine wichtige Rolle. Bei Tumoren scheinen zudem Interaktionen zwischen Fibroblasten und Tumorzellen für das Tumorwachstum und die Tumorprogression essentiell zu sein. Diese Interaktionen werden durch lösliche Signalfaktoren wie Wachstumsfaktoren, Zytokine, Chemokine und Lipidprodukte oder durch direkte Kommunikation der Zellen durch Integrine vermittelt [9] ECM-abbauende Enzyme wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die von Fibroblasten produziert werden, tragen zu die Degradation und Remodellierung der Tumorumgebung, wodurch die Tumorprogression, einschließlich Angiogenese, Invasivität und Metastasierung, unterstützt wird [10].

Heute scheint klar, dass Fibroblasten nicht nur an strukturellen Problemen beteiligt sind, sondern auch wichtige Akteure in pathophysiologischen Prozessen sind. Viele Fragen bleiben jedoch unbeantwortet. Daher ist die Charakterisierung verschiedener Fibroblasten-Subtypen, einschließlich ihrer Expressionsprofile sowohl in inaktivierten als auch in aktivierten und krankheitsbezogenen Zellzuständen, noch nicht eindeutig bewertet. Bislang wurden keine selektiven Marker etabliert und Zellen mit spindelförmiger Morphologie, die in-vitro auf Kunststoff haften und darüber hinaus nicht-lymphoide, nicht-endotheliale und nicht-epitheliale Phänotypen aufweisen, werden im Allgemeinen als Fibroblasten angesehen [1]. Daher wurden einige Versuche unternommen, diese Zellen besser zu charakterisieren [4, 11, 12]. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werfen jedoch neue Fragen auf. Tatsächlich scheint es, dass mehr verschiedene Subtypen von Fibroblasten existieren als erwartet [13]. Einige Forscher behaupten sogar, neue Zelltypen zu definieren und weisen darauf hin, dass Fibroblasten aus verschiedenen anatomischen Stellen Unterschiede aufweisen, die mit denen vergleichbar sind, die zwischen verschiedenen Leukozyten-Linien beobachtet werden [14]. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass mehrere Subtypen an einem einzigen Standort kolokalisiert sind. Außerdem kann die Herkunft von Fibroblasten an einer bestimmten Stelle nicht genau bestimmt werden. Sie können aus dem primären Mesenchym oder alternativ aus BM-abgeleiteten Vorläuferzellen oder aus der lokalen epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) stammen [6, 15]. Kenntnisse über spezifische Markermoleküle, die zwischen Fibroblasten unterschiedlicher anatomischer Lokalisationen sowie zwischen Fibroblasten in unterschiedlichen funktionellen oder krankheitsbezogenen Zuständen unterscheiden könnten, würden massiv zum Verständnis pathophysiologischer Mechanismen beitragen. Darüber hinaus hängt die Sterblichkeit bei Krebs oft mit Fernmetastasen zusammen, die eher als späte Schritte der Krankheitsprogression auftreten. Krebsfrühmarker werden daher dringend benötigt, um zeitnahe Behandlungen zu ermöglichen, bevor sich aggressive Krebsformen entwickeln können. Solche frühen Krankheitsmarker könnten in der veränderten stromalen Mikroumgebung des Tumors gefunden werden, deren Hauptverursacher Fibroblasten sind. Von besonderer Bedeutung wäre in diesem Zusammenhang die Charakterisierung exakter Phänotypen von normalen sowie von aktivierten und krankheitsbedingten Fibroblasten. Da verschiedene Funktionalitäten von der Synthese oder Hochregulierung spezifischer Proteine ​​begleitet werden, können sie durch Expressions- oder Proteom-Profiling-Experimente aufgedeckt werden.

Das Ziel dieser Studie war es, zur proteomischen Charakterisierung von Fibroblasten aus verschiedenen anatomischen Standorten und in verschiedenen funktionellen und krankheitsbezogenen Zellzuständen beizutragen. Proteomprofile von normalen menschlichen Lungenfibroblasten wurden erstellt und mit denen verglichen, die zuvor von primären Haut- und BM-Fibroblasten erhalten wurden. Ziel war es, für diese Zellen charakteristische Proteomsignaturen zu erarbeiten. Darüber hinaus wurden dieselben Zellen mit IL-1β entzündlich behandelt, um funktionsspezifische Proteomveränderungen herauszufinden. Schließlich wollten wir in einem letzten Schritt die Funktionszustände tumorassoziierter Fibroblasten aus analogen Geweben bestimmen. Einerseits wurde das Proteomprofil von Lungenkrebs-assoziierten Fibroblasten analysiert. Andererseits wurden bereits veröffentlichte proteomische Daten aus der Analyse von Melanom-verwandten Fibroblasten verwendet, die somit krebsassoziierte Hautfibroblasten repräsentieren, sowie Fibroblasten von Patienten mit multiplem Myelom, einem Plasmazelltumor des BM [16, 17]. Darüber hinaus wurden Ergebnisse unserer bisherigen Untersuchungen zu HCC-assoziierten Fibroblasten [18] für vergleichende Analysen in die vorliegende Studie einbezogen. Ziel war es, die Frage zu beantworten, ob tumorassoziierte Fibroblasten einen entzündlich aktivierten Zellzustand aufweisen und ob Fibroblasten, die mit verschiedenen Krebsarten in Zusammenhang stehen, Ähnlichkeiten in ihren Proteomprofilen aufweisen können.


Resultate und Diskussionen

Ein Gewebetyp

Die Gene MRPL19, PSMC4, SF3A1, PUM1, ACTB und GAPD wurden durch quantitative Echtzeit-RT-PCR analysiert. Die Anzahl der Startkopien für die sechs Kandidaten für die Haushaltsführung wurde in 80 primären Brusttumorproben gemessen. Die Daten stehen als Zusatzdatendatei 1 mit der Online-Version dieses Artikels zur Verfügung. Diagramme der rohen und log-skalierten Expressionsniveaus (alle Logarithmen in diesem Papier sind Logarithmen der natürlichen Basis (e)) sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Brusttumorproben sind nach dem Mittelwert der log-Expressionsniveaus aller Gene geordnet . Aus dem Diagramm ist ersichtlich, dass für die Rohdaten die Variabilität der Messungen innerhalb der Stichprobe mit dem Mittelwert zunimmt, während die Variabilität für alle Proben mit der Log-Transformation ungefähr gleich bleibt. Darüber hinaus erlaubt uns die Log-Transformation, Faltenänderungen der Expressionsniveaus auf additive Weise zu modellieren.

Relative Expressionsniveaus, die durch quantitative Echtzeit-RT-PCR bestimmt wurden, werden für 6 Haushältergene in 80 Brusttumoren gezeigt. Der obere Bereich zeigt die Rohdaten und der untere Bereich zeigt eine Log-Skala der Daten an.

Um die besten Haushälterinnen für die Normalisierung von Daten über einen einzelnen Gewebetyp auszuwählen, testeten wir drei Variationen eines Modells (Modell 1, a-c) mit quantitativen Echtzeit-RT-PCR-Daten, die aus primären Brustproben generiert wurden (Details siehe Materialien und Methoden).

Modell 1a

Wir modellieren den Ausdruck ja ijvon Genen J in Probe ich von

Protokoll ja ij= μ + T ich+ g J+ ε ij, wo ε ij

wo μ ist der Gesamtmittelwert (log-) Ausdruck, T ichist der unterschied der ichGewebeprobe aus dem Gesamtdurchschnitt und g Jist der unterschied der JGen aus dem Gesamtdurchschnitt. Das Hauptmerkmal dieses Modells, das es von einem traditionellen ANOVA-Modell unterscheidet, besteht darin, dass es heteroskedastischen Fehlern ermöglicht, unterschiedliche Variabilität in den Genen zu berücksichtigen [17]. Die Variabilität um die genspezifische mittlere log-Expression μ + T ich+ g Jwird durch die Fehlerstandardabweichung quantifiziert σ J. Um eine Überanpassung der Daten zu vermeiden, wurde das Bayessche Informationskriterium (BIC) verwendet [18]. Modell 1a hatte den besten BIC-Wert und wurde aus einer Reihe konkurrierender Modelle ausgewählt, die eine Methode mit gleichen Fehlervarianzen (Modell 1b in Materialien und Methoden) und eine komplexere Methode mit korrelierten Fehlern (Modell 1c in Materialien und Methoden) umfassten.

Unter Verwendung von Modell 1a wurden Standardabweichungen bestimmt, um die besten Kontrollgene für Brustkrebs auszuwählen. Tabelle 1 zeigt, dass MRPL19 weist die geringste Variabilität bei den Brustkrebsproben auf und wäre die beste Wahl für eine einzige Haushälterin-Kontrolle. Obwohl sich einige der Konfidenzintervalle überschneiden, ist ein direkter Vergleich zwischen den aus dem Microarray ausgewählten Genen (MRPL19, PSMC4, PUM1, SF3A1) zu den klassischen Haushälterinnen (GAPD und ACTB) zeigt einen signifikanten Unterschied (P = 0.0014).

Da die biologische Funktion vieler Gene noch unbekannt ist, ist es schwierig vorherzusagen, wie sich unterschiedliche experimentelle Bedingungen auf die Expression mutmaßlicher Haushältergene auswirken. Daher ist es ein sichererer Ansatz, eine durchschnittliche Expression mehrerer Gene zu verwenden, die eine geringe Varianz zwischen den Bedingungen aufweisen. Auf Basis des gewählten Modells kann die Schätzung der Varianz des Log-Durchschnitts der Expression mehrerer Gene berechnet werden (Details siehe Materialien und Methoden). Tabelle 2 zeigt die Standardabweichungen des logarithmischen Mittelwerts des besten Gensatzes für jede mögliche Satzgröße (d. h. 1-6). Diese Standardabweichungswerte sind ungefähr gleich dem Variationskoeffizienten in der ursprünglichen Skala. Aus den Schätzungen ergibt sich das Vier-Gen-Set von PSMC4, MRPL19, PUM1 und SF3A1 bietet die geringste Gesamtvariabilität bei der Auswahl einer Kombination von Genen. Dieses Vier-Gen-Set unterscheidet sich jedoch kaum von der Drei-Gen-Kombination von MRPL19, PUM1 und PSMC4, was wiederum weitaus besser ist als die beste Kombination aus zwei Genen. Aus Wirtschaftlichkeit und weil SF3A1 hatte eine relativ hohe individuelle Variabilität im Vergleich zu anderen in der Menge, unsere Wahl für die normalisierende Menge ist das geometrische Mittel der Ausdrücke von MRPL19, PUM1 und PSMC4.

Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie wichtig es ist, eine unvoreingenommene und genomweite Suche nach Haushälterinnen durchzuführen, anstatt sich auf traditionelle Haushältergene zu verlassen. Wir verwendeten Microarray-Daten, um Gene mit geringer Variabilität in der Expression in Brusttumoren und Zelllinien auszuwählen. Da die quantitativen Unterschiede zwischen den Microarray- und RT-PCR-Plattformen relativ sind, sollten Gene mit geringer Variabilität in der Expression über Tumoren hinweg durch Microarray auch eine geringe Variabilität in der Expression durch RT-PCR aufweisen. Obwohl die quantitativen Daten von Microarray im Vergleich zur RT-PCR tendenziell einen geringeren Dynamikbereich aufweisen, liegt dies hauptsächlich am Informationsverlust von Genen, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Unser Microarray-Datensatz wurde gefiltert, um Gene mit Signalen in der Nähe von Hintergrundrauschen zu entfernen.

Das Ergebnis ist sehr ähnlich mit Vandesompele et al.'S m Wertmethode, mit nur den Positionen von PUM1 und PSMC4 Änderung des Stabilitätsrangs. Es ist zu beachten, dass die M-value-Methode ordnet nicht die beiden besten Gene (MRPL19 und PSMC4). Ihr bester Gensatz-Selektionsansatz würde vorschlagen, den (log-skaligen) Durchschnitt dieser beiden besten Gene als Kontrolle zu verwenden. Eine solche Konkordanz ist angesichts der engen Verwandtschaft zwischen den m Wert und unser Modell unter Verwendung der Variabilität des Durchschnitts mehrerer Gene (siehe Materialien und Methoden für Details). Ein Vorteil unseres Ansatzes ist die Möglichkeit, die Variabilität einzelner Gene mit dem Durchschnitt mehrerer Gene zu vergleichen.

Mehrere Gewebearten

Gen(e) mit minimaler Variation in der Expression über verschiedene Zelltypen hinweg dienen als gute „universelle“ Haushälter. Eine universelle Kontrolle kann ein einzelnes Gen oder eine Kombination von Genen sein. Während erstere sowohl eine geringe Variabilität innerhalb eines gegebenen Gewebetyps als auch konsistente basale Expressionsniveaus über Gewebetypen hinweg aufweisen sollte, kann letzteres einen Gensatz mit individuell unterschiedlichen, aber komplementären basalen Expressionsniveaus über Gewebetypen hinweg umfassen.

Um unsere Modelle zur Auswahl universeller Haushälterinnen zu testen, haben wir veröffentlichte Daten von Vandesompele verwendet et al. [13]. Sie maßen das Expressionsniveau von 10 Genen in Neuroblastomzelllinien (NB), kultivierten normalen Fibroblasten (FIB), normalen Leukozyten (LEU) und Zellen aus normalem Knochenmark (BM). Darüber hinaus wurden auch normale Gewebe aus gepoolten Organen (Brust, Gehirn, fötales Gehirn, Herz, Niere, Uterus, Lunge, Luftröhre und Dünndarm) profiliert. Ein Diagramm dieser Haushälterinnen in den verschiedenen Geweben ist in Abbildung 2 gezeigt. Es ist bemerkenswert, dass ein Gen innerhalb eines bestimmten Gewebetyps eine stabile Expression aufweisen kann, aber die Rangposition im Vergleich zu anderen Haushälterinnen über Gewebe hinweg ändern kann. Zum Beispiel, GAPD hat im Vergleich zu anderen Haushältern eine relativ hohe Expression in Fibroblasten, aber eine niedrige Expression in Leukozyten. Daher, GAPD kann innerhalb bestimmter Gewebetypen eine gute Einzelhaushälterin sein, ist jedoch möglicherweise keine optimale universelle Haushälterin, es sei denn, sie wird innerhalb eines komplementären Gensatzes verwendet.

Datensatz von Vandesompele et al. [13] in logarithmischer Skala, die Expressionsniveaus von 10 mutmaßlichen Haushältergenen nach Probe und Gewebetyp zeigt. Zu den analysierten Gewebetypen gehörten normales Knochenmark (BM), kultivierte normale Fibroblasten (FIB), normale Leukozyten (LEU), Neuroblastom-Zelllinien (NB) und gepooltes normales Gewebe aus Brust, Gehirn, fötalem Gehirn, Herz, Niere, Uterus, Lunge , Luftröhre und Dünndarm (POOL).

Modell 2

Um die Leistung von Haushälterinnen innerhalb und zwischen verschiedenen Geweben zu vergleichen, haben wir ein Modell 2 erstellt (siehe Materialien und Methoden für weitere Details), das die Expression von Genen modelliert J in dem ichGewebeartprobe k von

Protokoll ja i(k)j= μ + C k+ T ich k)+ g J+ (CG) kj+ ε i(k)j, wo ε i(k)j

wo μ bezeichnet den Gesamtmittelwert (log-) Ausdruck, C kist der unterschied der kGewebetyp aus dem Gesamtdurchschnitt, Tich(k) ist die spezifische Wirkung der ichGewebeartprobe k, g Jist der unterschied der JGen aus dem Gesamtdurchschnitt und (CG) kjist die gewebetypspezifische Wirkung von Gen J. Die Variabilität in der Berechnung kommt aus zwei Quellen: dem spezifischen Gen (σ J) und der Gewebetyp (ς k). Die Schätzungen dieser Parameter sind in Tabelle 3 angegeben. Das einzelne Gen mit der geringsten Gesamtvariabilität innerhalb jedes Gewebetyps ist GAPD, dicht gefolgt von UBC (Ubiquitin C), HPRT1 (Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1) und YWHAZ (Tyrosin-3-Monooxygenase/Tryptophan-5-Monooxygenase-Aktivierungsprotein, Zeta-Polypeptid). Dieses Ergebnis korreliert eng mit Vandesompele et al.'s Ansatz. Das heißt, die Top-5-Gene haben genau die gleiche Reihenfolge, wenn wir die Gene innerhalb jedes Gewebetyps nach ihrer m-Wert. Hier weisen wir dem ungeordneten besten Paar einen Rang von 1,5 zu und mitteln dann die Ränge, um eine Gesamtordnung der Gene zu erhalten.

Das Risiko der Normalisierung von Daten auf ein Housekeeper-Gen mit variablem Gesamtexpressionsniveau in verschiedenen Geweben kann mathematisch als Bias-Fehler dargestellt werden. Eine Haushälterin, die einen geringen Bias für ein bestimmtes Gewebe aufweist, weist ein Expressionsniveau auf, das in der Nähe seiner durchschnittlichen Expression über Gewebe liegt. In unserem zweiten Modell ist der Begriff (CG) kjrepräsentiert diesen gewebetypspezifischen Bias. Das Maß der Variabilität um einen beabsichtigten Wert, wenn ein Bias vorhanden ist, wird als mittlerer quadratischer Fehler (MSE) bezeichnet: MSE = Bias 2 + Varianz. Um einen Satz von Genen für die Normalisierung über die verschiedenen Gewebetypen zu finden, verwenden wir daher ein Minimax-MSE-Kriterium: Minimierung des größten MSE der Kombination. Tabelle 4 enthält eine Liste für den besten Gensatz jeder Größe zusammen mit dem Minimax-MSE-Wert. Obwohl GAPD hat eine relativ geringe Gesamtvariabilität innerhalb jedes Gewebetyps, seine basale Expression ändert sich zwischen den Gewebetypen, was ihn zu einer schlechten Wahl für eine einzige universelle Kontrolle macht. Die Daten zeigen, dass RPL13A (ribosomales Protein L13a) ist die beste universelle Haushälterin, aber es ist klar, dass kein einzelnes Gen für eine universelle Haushälterin optimal ist. Tatsächlich liefert die Auswahl aller Kandidaten den kleinsten MSE, was nicht verwunderlich ist, da die Menge aller 10 Gene per Definition unverzerrt ist. Für die Routineanwendung ist es sinnvoll, die Anzahl der Kontrollgene zu begrenzen, da die Kosten für die Untersuchung zusätzlicher Gene die erhaltene zusätzliche Präzision ausgleichen müssen. Vor diesem Hintergrund ist es aufschlussreich zu beachten, dass die dreigliedrige Menge von HPRT1, RPL13A und UBC ist eine ausgezeichnete Wahl, weil es eine Prioritätsrangfolge beibehält, selbst wenn die Auswahl offen für die Einbeziehung von vier- oder fünfelementigen Sätzen ist. Die von uns mittels RT-PCR an Brusttumorproben getesteten Haushältergene wurden nicht in anderen Gewebetypen getestet und konnten daher nicht als universelle Kontrollen bewertet werden. Dennoch ist es wahrscheinlich, dass unsere Ergebnisse im Brustgewebe auch bei anderen Gewebetypen Bestand haben, da unsere Gene ursprünglich aus Microarray-Daten ausgewählt wurden, die 17 verschiedene und unterschiedliche Zelllinien sowie primäre Brusttumore umfassten [19].

Abbildung 3 zeigt den MSE jedes Gens, aufgeschlüsselt in die Squared-Bias- und Varianz-Komponenten. Die Richtung jedes Balkens zeigt das Vorzeichen des Bias. Es ist offensichtlich, dass der große Bias die großen Werte von MSE dominiert. Die Verwendung des (log-) Durchschnittes mehrerer Gene neigt dazu, die Varianz aufgrund des Effekts der Bias-Reduktion zu reduzieren, bei dem sich entgegengesetzte Bias aufheben. Zum Beispiel beide ACTB und TBP (TATA-Box-Bindungsprotein) weisen in den gepoolten normalen Proben einen großen Bias auf, jedoch in entgegengesetzte Richtungen. Der mittlere quadratische Fehler des (log-) Mittels von ACTB und TBP in diesen Stichproben beträgt nur 0,35, was viel niedriger ist als ihre individuellen MSEs über 6.

Mittlerer quadratischer Fehler (MSE) jedes Gens nach Gewebetyp. Das Vorzeichen wird durch die Richtung des Bias bestimmt. Der MSE wird in die beitragenden Komponenten des quadrierten Bias (Bias 2) und der Varianz (Sigma 2) zerlegt. Datensatz von Vandesompele et al. [13]. Die analysierten Gewebetypen umfassten normales Knochenmark (BM), kultivierte normale Fibroblasten (FIB), normale Leukozyten (LEU), Neuroblastom-Zelllinien (NB) und gepooltes normales Gewebe aus Brust, Gehirn, fötalem Gehirn, Herz, Niere, Uterus, Lunge , Luftröhre und Dünndarm (POOL).

Zusammenfassend haben wir die Leistung von putativen Haushälterinnen modelliert, um ihre Anpassungsgüte zu testen, die als Normalisierungskontrollen für die relative Insertquantifizierung dient. Ein großer Vorteil eines Modellansatzes besteht darin, dass die Terme in einen soliden statistischen Rahmen gestellt werden und nicht Ad hoc, wodurch der Algorithmus auf eine Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Bedingungen verallgemeinert werden kann. Die Gene und Algorithmen, die wir für die Normalisierung ausgewählt haben, sollten einen breiten Nutzen für Diagnostik und Forschung haben.


Diskussion

Daten aus ehrwürdigen Isozymstudien zeigen, dass eine Dosiskompensation bei XX-Weibchen durch die Inaktivierung eines X-Chromosoms bei Beuteltieren und Euthern erreicht wird. Im Gegensatz zur zufälligen X-Inaktivierung bei Menschen und Mäusen erwies sich XCI jedoch bei allen Beuteltierarten als väterlicherseits und an allen getesteten Loci. Die Beobachtung, dass einige Gene auf dem väterlichen X in einigen Känguru-Geweben ganz oder teilweise auf Proteinebene exprimiert werden, führte zu dem Schluss, dass Beuteltier-XCI unvollständig und gewebespezifisch ist (Übersicht in [19]). Es ist schwierig, diese Ergebnisse auf das gesamte X-Chromosom oder andere Beuteltiere zu verallgemeinern, da die Ergebnisse auf nur drei Genen basieren, die in nur einer oder wenigen Beuteltierarten polymorph waren (ohne unser Modellkänguru, das Tammar-Wallaby).

Die Verfügbarkeit einer robusten physikalischen Karte des Tammar-X-Chromosoms [31] und der Tammar-DNA-Sequenz (Tammar-Genomprojekt, in Vorbereitung) ermöglichte es uns, eine Aktivitätskarte des gesamten X-Chromosoms in Fibroblasten des Tammar-Wallaby zu erstellen die Allgemeingültigkeit der alten Daten zu testen und noch offene Fragen der Kontrolle von Beuteltier-XCI auf molekularer Ebene zu untersuchen. Wir verwendeten qPCR, um das Expressionsniveau mehrerer X-borne Loci in männlichen und weiblichen Fibroblasten zu vergleichen, und stellten fest, dass das Verhältnis weiblich:männlich für verschiedene Gene unterschiedlich war, aber dass die meisten Gene bei Frauen stärker exprimiert wurden als bei Männern .

Unsere überraschendsten Ergebnisse wurden unter Verwendung von RNA-FISH gemacht, um die Inaktivierung auf individueller Zellbasis zu quantifizieren. Diese Methode lieferte einzigartige Informationen in einer Spezies, bei der nur wenige Polymorphismen in X-übertragenen Genen identifiziert wurden. Der RNA-FISH war an allen Loci äußerst effizient und konnte die Expression von 94 bis 99% der Loci in männlichen Zellen nachweisen.

Beuteltier XCI wird auf Transkriptionsebene reguliert

Untersuchungen zur Inaktivierung auf Proteinebene ließen die Frage offen, ob XCI bei Beuteltieren auf Transkriptionsebene vorlag, wie es bei Euthern der Fall ist [32]. Die vorliegende Studie zeigt, dass die XCI-Kontrolle auch bei Beuteltieren auf Transkriptionsebene ausgeübt wird, denn RNA-FISH zeigte, dass die meisten weiblichen Zellkerne nur ein einziges Signal zeigten, das für 1X-aktive Zellen typisch ist. Dieses Ergebnis wird durch die Abwesenheit von RNA-Polymerase von dem inaktiven X-Chromosom bestätigt (Chaumeil J, Waters PD, Koina E, Gilbert C, Robinson TJ & Graves JAM, eingereicht).

Die Expression von einem X-Chromosom wird koordiniert gesteuert

Die Co-Lokation von Signalen benachbarter Gene in weiblichen Fibroblasten-RNA-FISH-Experimenten führte zu dem Schluss, dass Gene koordinativ vom gleichen aktiven X-Chromosom transkribiert werden. Wir haben zum Beispiel festgestellt, dass STAG2 und PSMD10 wurden in allen Kernen co-exprimiert, die eine einzelne aktive Expression für jeden Locus zeigten, was zeigt, dass Gene, die nahe beieinander auf demselben X liegen, koordiniert exprimiert werden. Paarweise Vergleiche unter Verwendung verschiedener Kombinationen anderer Gene zeigten, dass alle getesteten Gene auf demselben aktiven X-Chromosom, Xa, aktiv waren. Wir haben keine Möglichkeit, den elterlichen Ursprung dieses aktiven Chromosoms zu bestimmen, aber alle bisherigen Untersuchungen an Zellpopulationen haben gezeigt, dass das mütterliche Allel immer exprimiert wird und das inaktive Allel immer vom väterlichen X stammt. Wir schließen daher, dass alle Allele auf das mütterliche X wird in allen Zellen exprimiert.

Der Ausdruck von Xi ist unvollständig und ortsspezifisch

Wir verwendeten RNA-FISH, um die Expression von Loci zu untersuchen, die entlang des Tammar-Wallaby-X-Chromosoms verteilt sind. Wir fanden heraus, dass alle Gene der Inaktivierung bis zu einem gewissen Grad entgingen. Jeder Locus weist eine unterschiedliche Fluchthäufigkeit auf, die zwischen den Tieren konsistent ist, was bedeutet, dass die Flucht lokusspezifisch ist. Dieses partielle, ortsspezifische Entweichen bestätigte den vorläufigen Hinweis aus qPCR-Daten, dass das Verhältnis von weiblich zu männlich des X-Gen-Transkripts von vollständiger Dosiskompensation bis zu vollständigem Entweichen variierte. Dies erweitert die Erkenntnisse aus Isozymstudien, die väterliche PGK1 und G6PD werden teilweise in Känguru-Fibroblasten exprimiert [28, 33].

Flucht vor dem Beuteltier XCI ist stochastisch

Frühe Studien zur partiellen Inaktivierung auf Proteinebene [34] beinhalteten den Nachweis, dass Einzelzellklone das gleiche väterliche Expressionsniveau wie die gesamte Population beibehielten. Dies wurde so interpretiert, dass eine partielle Expression einer gleichförmigen Herunterregulierung der Expression des väterlichen Allels in allen Zellen gleichkam. Unsere qRT-PCR der weiblichen:männlichen Expressionsverhältnisse zeigte auch unterschiedliche Grade von Transkriptions-Silencing in weiblichen Zellen. Jedoch kann keine Technik, die auf Zellpopulationen angewendet wird, zwischen einer partiellen Expression aufgrund einer Herunterregulierung der Transkription vom Xi in jeder Zelle oder von unterschiedlichen Häufigkeiten von Zellen mit 1X-aktiver und 2X-aktiver Expression unterscheiden.

Unsere Fähigkeit, die Transkription auf der Ebene eines einzelnen Kerns unter Verwendung von RNA-FISH nachzuweisen, ermöglichte es uns daher zu entdecken, dass die Kontrolle nicht wie erwartet durch die Herunterregulierung des väterlichen Allels in allen Zellen ausgeübt wird. Vielmehr wird das Gesamtniveau der Transkription durch die Frequenz der Kerne reguliert, in denen das Allel auf dem inaktiven X exprimiert wird. Die Regulation scheint ein stochastischer (probabilistischer) Prozess zu sein, da verschiedene Gene eine charakteristische Häufigkeit von 2X-aktiven und 1X-aktiven Kernen in einer Population von Fibroblasten desselben Weibchens aufweisen.

Eine alternative Interpretation ist, dass die Kontrolle der X-Inaktivierung durch eine Herunterregulierung der Transkription vom Xi in jeder Zelle ausgeübt wird, aber dieses niedrige Transkriptionsniveau wird von RNA-FISH nicht nachgewiesen. Wir halten dies jedoch für unwahrscheinlich, da RNA-FISH die Transkription in fast 100% der Loci in männlichen Zellen nachweist und DNA-FISH zwei Loci in fast allen weiblichen Zellen nachweist. Tatsächlich ist RNA-FISH empfindlicher als DNA-FISH, bei dem einzelne Moleküle in Interphase-Kernen nachgewiesen werden können.

Darüber hinaus fanden wir, dass Gene, die auf dem Xi nahe beieinander liegen, normalerweise mit unterschiedlichen Frequenzen und in den Anteilen exprimiert werden, die für ein unabhängiges Entkommen der Inaktivierung erwartet werden. Dies impliziert, dass die Transkriptionswahrscheinlichkeiten verschiedener Loci auf dem inaktiven X unabhängig reguliert werden.

Wir schlagen daher vor, dass die Regulierung des Entweichens von XCI bei Beuteltieren eher auf die Kontrolle der Expressionswahrscheinlichkeit eines Locus auf Xi als auf das Ausmaß der Expression aus dem Locus hinausläuft. Somit steht die Expression von Genen auf dem inaktiven Beuteltier X unter einer zuvor nicht vermuteten Art der epigenetischen Kontrolle, die möglicherweise ortsspezifische regulatorische Faktoren beinhaltet, die lokale oder regionale Veränderungen in der Chromatinorganisation verursachen, die die Wahrscheinlichkeit bestimmen, dass ein Gen auf dem väterlichen X transkribiert wird.

Diese stochastische Regulation von Beuteltier-XCI scheint sich ziemlich von der Kontrolle von XCI bei Maus und Mensch zu unterscheiden. Obwohl die molekularen Aspekte von XCI in den letzten 50 Jahren detailliert untersucht wurden, wurden jedoch keine vergleichbaren RNA-FISH-Daten für XCI bei Euthern veröffentlicht, und es bleibt möglich, dass das Entweichen von Genen auf dem menschlichen inaktiven X stochastisch ist. Es wäre sehr aufschlussreich, die Zellverteilung von 1X- und 2X-aktiven Kernen für Gene zu untersuchen, die der Inaktivierung auf dem menschlichen X teilweise entgehen.

Die Inaktivierung des Beuteltiers X zeigt keine Polarität von einem Inaktivierungszentrum

Wir erstellten eine Aktivitätskarte des inaktiven (vermutlich väterlichen) Tammar-Wallaby X, um festzustellen, ob es eine Polarität in der Häufigkeit der Expression gab. Wir beobachteten keine Korrelation zwischen der Genposition und der Häufigkeit, mit der das Allel auf dem Xi exprimiert wurde. Somit gibt es keinen Hinweis auf die Polarität, von der angenommen wurde [19], dass sie ein Inaktivierungszentrum aufzeigt, von dem die Kontrolle des gesamten X-Chromosoms ausgehen könnte. Gene, die weitgehend inaktiv sind, wurden nicht geclustert, ebensowenig Gene, die der Inaktivierung weitgehend entgangen sind.

Darüber hinaus fanden wir keine Korrelation zwischen Y-Expression und Dosiskompensation der X-Paraloge. Die höchste Fluchthäufigkeit wurde bei beobachtet ATRX (60%) und der niedrigste für RBMX (7%), beide Gene mit Y-Paralogen, die nicht in Fibroblasten exprimiert werden

RNA-FISH hat den Vorteil, dass es Informationen über einzelne Zellen liefert, jedoch nicht quantitativ ist und die Signalintensität nicht mit dem Expressionsniveau korreliert. Unabhängige Studien zu Y-bürtigen Genen von Beuteltieren mittels qPCR zeigen, dass Y-Paraloge entweder eine testisspezifische Expression aufweisen oder viel schwächer exprimiert werden als ihre X-Partner [35, 36] (Murtagh VJ, Sankovic N, Delbridge ML, Kuroki Y, Boore JL , Toyoda A, Jordan KS, Pask AJ, Renfree MB, Fujiyama A, Graves JAM & Waters PD, eingereicht).

Diese unterschiedlichen Expressionsprofile von X- und Y-getragenen Paralogen, zusammen mit geringer XY-Sequenzkonservierung (Murtagh VJ, Sankovic N, Delbridge ML, Kuroki Y, Boore JL, Toyoda A, Jordan KS, Pask AJ, Renfree MB, Fujiyama A, Graves JAM & Waters PD, eingereicht) legt nahe, dass Y-Gene im Vergleich zu ihren X-Partnern entweder eine andere oder eine verminderte Funktion haben. Daher ist es unwahrscheinlich, dass das Entkommen dieser Gene aus XCI das Ergebnis einer Komplementierung durch einen aktiven Y-Locus ist.

Tatsächlich ist das einzige Merkmal, das Beuteltier-X-Gene mit einer hohen Häufigkeit der Flucht vor der X-Inaktivierung vereint, dass ihre menschlichen Orthologe zusammen auf Xq22 lokalisiert sind. Vielleicht spiegelt dies ihre ursprüngliche Anordnung auf einem angestammten Therian X vor 145 Millionen Jahren wider, an einer Position, an der die Y-Degradation später auftrat und XCI daher weniger vollständig ist.

Somit wird Beuteltier-XCI auf eine ganz andere Weise kontrolliert als die von Mensch und Maus-X. Bei Eutherianern ist XCI ein Ganzes-X-Phänomen, bei dem Aktivitätsdomänen koordiniert von einem Inaktivierungszentrum kontrolliert werden, das die XIST Gen. Die unabhängige Kontrolle der Expression von Loci auf dem inaktiven X ist konsistent mit der Abwesenheit von an XIST Gen aus dem Beuteltier X [23, 24, 37].

Toleranz gegenüber Dosierungsunterschieden

XCI wird weithin als ein lebenswichtiger Mechanismus angesehen, der eine angemessene Dosiskompensation zwischen XY-Männchen und XX-Weibchen gewährleistet, und die ersten Ergebnisse älterer Studien zu XCI bei Menschen und Mäusen zeigten, dass Gene auf dem Xi mit seltenen Ausnahmen vollständig inaktiv waren. Diese strikte Einhaltung der Dosisäquivalenz stimmt mit Beobachtungen der katastrophalen Auswirkungen von Monosomien eines Autosoms oder einer autosomalen Region bei menschlichen Patienten überein. Es mag daher überraschend erscheinen, dass die Dosiskompensation für viele X-borne Loci bei Beutelfibroblasten unvollständig ist oder fehlt.

Heute wissen wir jedoch, dass viele Gene auf dem menschlichen X-Chromosom der Inaktivierung entgehen [38], insbesondere auf dem kurzen Arm, der eine relativ neue Ergänzung zu den X- und Y-Chromosomen war [39–41]. Sogar auf der Maus X, die einen Zustand nahezu vollständiger Inaktivierung darzustellen scheint, werden einige Gene von der Xi exprimiert.Die ersten Gene auf dem menschlichen X, die sich als 2X-aktiv erwiesen, waren diejenigen, die Partner auf dem Y-Chromosom behielten [42], was darauf hindeutet, dass ihre Y-Partner aktiv sind (oder bis vor kurzem waren) und die Funktion der X-Gene ergänzen. die daher keine Dosiskompensation benötigen. Tatsächlich entkommen einige der Gene, die wir mit Paralogen auf dem Y-Chromosom untersucht haben, XCI auf dem Beuteltier X (ATRX, UBA1) jedoch zumindest einige Y-Paraloge (z. B. EIN VERSUCH) sind testisspezifisch und ergänzen sich nicht. Darüber hinaus können andere Beuteltier-X-Gene mit einem Y-Partner, wie z RBMX, PHF6X und HUWE1X, entgehen nicht der Inaktivierung.

Vielleicht ist die Dosiskompensation also nicht so entscheidend für Entwicklung und Funktion, wie wir angenommen hatten. Diese Schlussfolgerung wird durch die jüngsten Beweise gestützt, dass das Z-Chromosom des Vogels nur teilweise kompensiert ist, die 934 Gene auf dem Z zeigen eine Reihe von Dosisbeziehungen zwischen Männchen und Weibchen zwischen 1,0 und 2,0 [4, 43] und der Nachweis, dass die fünf X Chromosomen des Schnabeltiers (verwandt mit Vogel Z und zusammen mehr als 12% des Genoms ausmachen) scheinen diese Eigenschaft zu teilen.

Möglicherweise reagieren Gene, die eine vollständige Kompensation erfordern, besonders empfindlich auf Dosiseffekte, da sich Änderungen ihrer Dosis über zahlreiche nachgeschaltete Gennetzwerke ausbreiten. Dosierungsunterschiede bei einigen Genen können für die Entwicklung sexueller Unterschiede entscheidend sein, wie dies bei den der Fall ist DMRT1 Gen bei Vögeln [44]. Im Gegensatz dazu können nicht kompensierte Gene an der intrazellulären Haushaltsführung und an katalytischen Aktivitäten teilnehmen, die auf vielen anderen Ebenen reguliert werden, sodass ihre Funktion weniger empfindlich auf die Gendosis reagiert. Solche ubiquitär exprimierten Gene sind in der Liste der Beuteltiergene, die einer Inaktivierung weitgehend entgehen, überrepräsentiert.

Wir schlagen hier vor, dass während der Geschlechtschromosomendifferenzierung der allmähliche Verlust von Genen aus dem Proto-Y-Chromosom, die für die Inaktivierung des väterlichen Allels der homologen X-getragenen Gene ausgewählt wurden, die besonders empfindlich auf Dosisunterschiede in dem einen oder anderen Gewebe reagierten. Dies führte zu einer stückweisen Inaktivierung, die gewebespezifisch war, wie sie bei Beuteltier-XCI beobachtet wird. Wir vermuten, dass die kooperative Natur der Chromatinveränderungen, die rekrutiert wurden, um diesen Locus bei Eutheriern zum Schweigen zu bringen, unkritische Loci in der Nähe beinhaltete. Diese Ausbreitung der Inaktivierung von dosissensitiven Loci ist bei der Maus fast vollständig, hat jedoch viele Lücken im menschlichen X hinterlassen, insbesondere auf dem kürzlich rekrutierten kurzen Arm.

Evolution der X-Chromosom-Inaktivierung

Der grundlegende Unterschied zwischen Beuteltier- und Eutherie-XCI führte uns dazu, nach Ähnlichkeiten mit der Dosiskompensation bei entfernter verwandten Säugetieren und Nicht-Säuger-Wirbeltieren zu suchen. Tatsächlich ist die stochastische Inaktivierung, die wir bei Beuteltieren beobachtet haben, ähnlich der, die wir kürzlich für Gene auf den fünf X-Chromosomen des Schnabeltiers beschrieben haben. X-spezifische Gene werden von einem oder beiden Allelen in verschiedenen Fibroblasten derselben Frau exprimiert, und die Häufigkeit von 1X-aktiven und 2X-aktiven Kernen ist ein konsistentes Merkmal jedes Gens und liegt zwischen 20 % und 53 % der 2X-aktiven Kerne [7]. Es ist jedoch schwer, eine evolutionäre Verbindung zwischen Monotrem und Beuteltier-Dosiskompensation zu unterstellen, da die X-Chromosomen des Schnabeltiers keine Homologie mit denen von Beuteltieren und Eutheriern aufweisen, sondern eine beträchtliche Homologie mit dem Z-Chromosom von Vögeln haben [10]. Es ist bekannt, dass die Dosiskompensation beim Huhn unvollständig ist und von einem ZZ-Männchen:ZW-Frauen-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 für verschiedene Gene reicht [4]. Begrenzte RNA-FISH wurde für fünf Gene berichtet [5], aber die geringe Nachweiseffizienz macht es schwierig zu beurteilen, ob Unterschiede in der Expression eine Herunterregulierung in jeder Zelle oder eine stochastische Kontrolle der Expression darstellen.

Vielleicht behält das Beuteltier-XCI also Merkmale eines alten Silencing-Mechanismus bei, der allen Chromosomen gemeinsam ist. Die stochastische Natur der Beuteltier- und Monotrem-X-Chromosomenexpression erinnert an die monoallelische Expression vieler autosomaler Loci, einschließlich olfaktorischer Rezeptoren und Immungene wie Immunglobuline, T-Zell-Rezeptoren und natürliche Killer-Zell-Rezeptoren [45]. Es ist verlockend zu spekulieren, dass dies einen uralten Mechanismus zur Kontrolle der Genexpression offenbart, der sich bei Monotremen und Therianern unabhängig voneinander zu einem X-Chromosom-Kompensationssystem entwickeln sollte [46].

Eine stochastische Grundlage für die transkriptionelle Aktivierung kann als eine Abfolge von Ereignissen angesehen werden, die ein zufälliges Element, wie die Bindung eines Transkriptionsfaktors, mit einem selektiven Schritt, wie der Zellbindung, kombiniert. Ein in tetraploiden Zellen der Maus identifizierter „wahrscheinlichkeitsfördernder Faktor“ ermöglicht es beispielsweise jedem X-Chromosom, unabhängig die Wahrscheinlichkeit der Auslösung von XCI zu bestimmen [47]. Die Wahrscheinlichkeit der Inaktivierung des einen oder anderen X-Chromosoms in der Maus kann durch Mutationen in einem Locus in der Nähe von . verändert werden XIST [48]. Die Inaktivierung eines einzelnen X wird durch einen vom XCI-Zentrum gesteuerten Rückkopplungsmechanismus blockiert, der die Inaktivierung des aktiven X unterdrückt [49]. Die stochastische allelische Expression von Genen führt zu einem vielfältigen Repertoire von Zellen und schafft Diversität, so dass, obwohl die individuellen Zellexpressionsprofile selbst innerhalb eines Klons variieren, das Nettoergebnis für eine Zellpopulation ein stabiles Ergebnis sein wird.

Hat sich ein väterliches, stochastisches und unvollständiges Inaktivierungssystem der Vorfahren, das immer noch durch Beuteltiere repräsentiert wird, zur hyperstabilen chromosomweiten Inaktivierung eutherischer Säugetiere entwickelt? Die Ähnlichkeiten von Beuteltier-XCI mit der ersten XCI-Welle im extraembryonalen Gewebe von Nagetieren und Rindern (das ebenfalls väterlicherseits, unvollständig und unabhängig von der Methylierung ist) legen nahe, dass dies das Inaktivierungssystem in einem alten therianischen Säugetier darstellt, das Änderungen unterzogen wurde, um es zu rendern vollständiger und stabiler bei Eutherianern. Es wird sehr interessant sein zu entdecken, ob XCI in embryonalen Membranen von Mäusen, wie Beuteltier-XCI, lokusspezifisch und stochastisch ist.

Wie hat sich XCI zu einem Ganzchromosomensystem entwickelt? Die Entwicklung der XIST Gen früh in der eutherischen Abstammungslinie, vielleicht durch Insertion einer repetitiven Sequenz [24] und Pseudogenisierung eines alten Tetrapoden-Gens[37], brachte benachbarte Inaktivierungsdomänen unter chromosomale Kontrolle. Bindung mit XIST RNA ermöglichte die Bindung modifizierter Histone und machte die DNA-Methylierung wahrscheinlicher, was zu einer Stabilisierung der Inaktivierung führte. Vielleicht ist die stochastische Expression auch die Grundlage der zufälligen Inaktivierung im Embryo eutherischer Säugetiere.


Mesenchymale Stromazellen und gewebespezifische Vorläuferzellen: ihre Rolle bei der Gewebehomöostase

Multipotente mesenchymale Stroma-/Stammzellen (MSCs) befinden sich in vielen menschlichen Organen und umfassen eine heterogene Population von Zellen mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Diese Zellen können aus verschiedenen Geweben isoliert werden, und ihre Morphologie, ihr Immunphänotyp und ihr Differenzierungspotential hängen von ihrem Ursprungsgewebe ab. Jedes Organ enthält eine spezifische Population von Stromazellen, die den Regenerationsprozess des Gewebes aufrechterhalten, in dem sie sich befinden, aber einige von ihnen haben eine viel breitere Plastizität und differenzieren sich in mehrere Zelllinien. Aus erwachsenen menschlichen Geweben isolierte MSCs sind ideale Kandidaten für die Geweberegeneration und das Tissue Engineering. MSCs tragen jedoch nicht nur zur strukturellen Gewebereparatur bei, sondern besitzen auch starke immunmodulatorische und entzündungshemmende Eigenschaften und können die Gewebereparatur durch Modulation der lokalen Umgebung beeinflussen. Dieser Artikel bietet einen Überblick über den aktuellen Stand der Biologie von geweberesidenten mesenchymalen Stroma- und Vorläuferzellen (aus Knochenmark, Leber, Skelettmuskel, Haut, Herz und Lunge) im Zusammenhang mit Geweberegeneration und Gewebehomöostase.

1. Einleitung

Viele menschliche Organe und Gewebe, einschließlich Haut, Leber, Muskel, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Fettgewebe, Plazenta, Knochenmark (BM) und peripheres Blut sowie andere enthalten eine undifferenzierte Population geweberesidenter Zellen, die die Gewebereparatur erleichtern und Geweberemodellierung im Laufe des Lebens. Diese Zellen zeichnen sich durch spezifische Eigenschaften aus: Selbsterneuerungskapazität, die Fähigkeit, nachkommende Vorläuferzellen hervorzubringen, Multipotenz und die Fähigkeit, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, die für bestimmte Gewebe spezifisch sind. Geweberesidente Stromazellen sind normalerweise in einer spezifischen lokalen Gewebemikroumgebung lokalisiert, die einen bestimmten Zelltyp oder ihre Vorläufer für die Differenzierung und Reifung aufrechterhalten und kontrollieren.

Allerdings nimmt die Stromazellfunktion vieler Organe mit zunehmendem Alter ab, was zu einem verminderten Regenerationspotential aller Organe führt [1]. In der Literatur werden verschiedene Typen von geweberesidenten mesenchymalen Stromazellen (MSCs) beschrieben, es ist jedoch nicht klar, ob diese Zellen nur für die Geweberegeneration, aus der sie stammen, spezifisch sind oder ob sie aufgrund ihrer Heterogenität in verschiedene Zelltypen differenzieren können . Aus verschiedenen Geweben isolierte MSCs teilen eine Reihe von nicht-hämatopoetischen Zellmarkern, einschließlich CD29-, CD44-, CD73-, CD90-, CD105- und MHC-Klasse-I-Antigenen. Nichtimmunogene Eigenschaften von MSC werden durch das Fehlen von MHC-Klasse-II-Antigenen und das Fehlen der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80 und CD86 ermöglicht. Diese Eigenschaften machen MSCs zu vielversprechenden Kandidaten für neue therapeutische Strategien in der Transplantation und regenerativen Medizin.

Zellen mit MSC-Eigenschaften wurden aus verschiedenen Organen und Geweben des menschlichen Körpers isoliert, einschließlich BM, Fettgewebe, Haut, Muskeln, Sehnen, Knochen, Gehirn, Leber, Nieren, Lunge, Milz, Pankreasthymus, Synovialmembran und Nabelschnur [2 ]. Intensive Studien zu MSCs werden jedoch seit Jahren durchgeführt, um die Lage und Rolle nativer MSCs in ihrer eigenen Gewebeumgebung zu untersuchen in vivo sind nicht vollständig erklärt, hauptsächlich wegen des Fehlens spezifischer Marker, die ihre genaue Erkennung ermöglichen [3]. In sich selbst erneuernden Organen befinden sich Stromazellen in spezifischen Nischen, die die Mikroumgebung bilden, in der gewebespezifische Vorläuferzellen in einem Ruhezustand gehalten werden. Nach der Abgabe des Aktivierungssignals proliferieren Vorläuferzellen und wandern zu den Verletzungsstellen, wo sie sich differenzieren und den reifen Phänotyp erwerben [4]. Die Nischenhomöostase von gewebespezifischen Vorläuferzellen wird durch die Teilung von Vorläuferzellen reguliert, die die Menge an primitiven und gebundenen Zellen im Gewebe aufrechterhalten [5].

MSC, die aus verschiedenen Gewebeorten stammten, zeigten viele gemeinsame Merkmale, jedoch unterscheiden einige Marker das Differenzierungspotential dieser Zellen. Dieser Review stellt die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen MSCs vor, die aus verschiedenen Gewebetypen stammen, basierend auf ihren Oberflächenmarkern und ihrem regenerativen Potenzial in Organen, in denen sie sich befinden, und ihrer multipotenzialen Fähigkeit, sich in andere Abstammungslinien zu differenzieren.

2. Mesenchymale Stammzelle des Knochenmarks

Bis heute sind MSCs aus adultem Knochenmarkstroma die am besten charakterisierten aus dem Mesoderm stammenden Stromazellen mit multipotenter Differenzierungskapazität. Der Begriff MSC wurde 1991 von Caplan als eine Art adulter Stammzellen mit natürlichem Potenzial zur Differenzierung in verschiedene mesenchymale Zelltypen einschließlich Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten und andere eingeführt [6]. Historisch wurden MSCs erstmals von Friedenstein aus dem Knochenmark als fibroblastische Vorläufer mit unbekannter anatomischer Lage in der KM-Umgebung isoliert [7]. Diese Zellen waren durch plastische Adhäsionskapazität mit fibroblastenähnlicher Morphologie, ausgedehnte Proliferationsfähigkeit und klonale Expansion gekennzeichnet, wie durch den koloniebildenden Einheitsfibroblasten-Assay (CFU-F) bestätigt wurde. Darüber hinaus führte die heterotope Transplantation von BM-Zellen in verschiedene immunprivilegierte Orte, einschließlich der Nierenkapsel, zu einer ektopen Knochenbildung, was darauf hindeutet, dass osteogene Vorläufer in der BM-Umgebung vorhanden sind.

Seitdem wurde umfangreiche Forschung an MSCs mit Ursprung im Knochenmark durchgeführt, um die Biologie und Oberflächenepitope von MSCs zu charakterisieren. MSCs sind heterogene Populationen und exprimieren eine Vielzahl von Oberflächenepitopen, einschließlich Integrinrezeptoren (CD29, CD49α), Zelladhäsionsmoleküle (CD44, CD54, CD58, CD62L, CD105, CD106, CD146 und CD166), Enzyme (CD39, CD73), Wachstumsfaktorrezeptoren (CD140b, CD271, CD340 und CD349), Zwischenfilamente (Nestin, Vimentin, Desmin und Neurofilament) und embryonalen Antigenen (SSEA-1), aber keines dieser Moleküle ist spezifisch für von KM abgeleitete MSCs (Tabelle 1) [2, 8]. Die Isolierung von MSCs basierend auf STRO-1 [9], dem Antinervenwachstumsfaktor-Rezeptor CD271 [10, 11] oder der Expression des Zelladhäsionsmoleküls CD146 [12, 13] dokumentierte ihre Heterogenität und klonogene Kapazität dieser Zellen. Weitere Studien dokumentierten jedoch, dass MSCs, die auf der Basis von CD271- und CD146-Oberflächenmarkern isoliert wurden, zwei verschiedene Populationen von MSCs mit BM-Ursprung darstellen und diese Subtypen während der Entwicklung und des Alterns unterschiedliche Funktionen haben können [14].

Heterogenität von MSCs, unterschiedliche Isolierungsverfahren nativer Stromazellen und unterschiedliche Kulturbedingungen waren ein Grund, vom Mesencymal and Tissue Stem Cell Committee der International Society for Cellular Therapy Minimalkriterien zu definieren, die humane mesenchymale Stammzellen als (i) plastische adhärente Zellen charakterisieren , (ii) mit Expression der Oberflächenmarker CD73, CD90 und CD105 und fehlender Expression der hämatopoetischen Marker CD34–, CD45–, CD14–, CD79α− und HLA-DR−, und (iii) das Differenzierungspotential mehrerer Abstammungslinien in Osteoblasten, Adipozyten und Chondroblasten [15]. Wenn die obigen Kriterien nicht erfüllt sind, sollte der Begriff „mesenchymale Stammzellen“ für adhärente Knochenmarkszellen oder andere MSC-ähnliche Zellen anderer Herkunft verwendet werden.

Umfangreiche Forschung, die den MSC-Phänotyp und die Biologie beschreibt, wurde an humanem KM-abgeleitetem MSC . durchgeführt in vitro, aber es gibt immer noch ein paar Hinweise auf ihren Phänotyp in ihrem natürlichen in vivo Umgebung. Jüngste Studien an trabekulären Knochenbiopsien dokumentierten das Vorhandensein von Zellen mit einem Muster der MSC-Antigenexpression mit unterschiedlicher Morphologie und mikroanatomischer Lokalisation [8]. Nichtretikuläre Stromazellen einschließlich runder Stromazellen und Knochenauskleidungszellen exprimieren CD73-, CD140b- und CD271-Antigene. Runde Stromazellen exprimieren zusätzlich CD10, während sich Knochenauskleidungszellen durch die Expression von neuralen Gangliosiden (GD2) auszeichnen. Retikuläre Stromazellen wie fibroblastische retikuläre Zellen und adipöse Stromazellen (ASC) überlappen CD10- und CD146-Antigene und unterscheiden sich durch das Vorhandensein von GD2 (auf fibroblastischen retikulären Zellen) und CD73 (auf ASC) [8]. In vielen Studien wird die Topographie von MSCs in der BM-Umgebung als die Zelle eingeführt, die die äußeren Oberflächen von Blutgefäßen und perivaskulären Zellen auskleidet und diese Zellen CD146-Antigen exprimieren [8, 16, 17]. MSCs sortiert nach STRO-1+CD146+-Phänotyp exprimiertem Glattmuskel-Aktin-Alpha (αSMA), die auch für Perizyten spezifisch ist [18]. Tormin-Studien ergaben, dass die CD146+/CD271+-BM-Zellfraktion sowohl sinusoidale perivaskuläre Zellen als auch Zellen umfasst, die sich in der BM-Umgebung befinden, während knochenauskleidendes MSC CD271 allein exprimierte [19]. Alle diese Beobachtungen legten nahe, dass MSCs, die in der Markhöhle, im Endosteum und im BM-Stroma vorkommen, unterschiedliche Fraktionen von MSCs darstellen, die zur Entwicklung unterschiedlicher Vorläufer in der natürlichen BM-Mikroumgebung beitragen.

In der BM-Umgebung sind MSCs an der Gewebehomöostase beteiligt, indem sie zur Bildung von hämatopoetischem Stroma und zur Produktion regulatorischer Moleküle beitragen, einschließlich Stammzellfaktor (SCF) und Chemokin CXCL12, Faktoren, die für die Nischenregulierung und Aufrechterhaltung der hämatopoetischen Stammzellen (HSC) notwendig sind. Die Herunterregulierung der CXCL12-Expression in retikulären Zellen und Osteoblasten führt zur Mobilisierung von HSC in die Peripherie und zum Verlust von B-Zell-Vorläufern, während die Deletion von Cxcl12 aus Stromazellen in der perivaskulären Region hat einen Einfluss auf die langfristige Repopulationsaktivität von HSC und gemeinsame lymphoide Vorläufer [20]. Die perivaskuläre HSC-Nische ist jedoch komplexer und wird von anderen Zelltypen unterstützt, darunter Gefäß-Endothelzellen, sympathische Nerven, nicht-myelinisierende Schwann-Zellen, Makrophagen und Osteoblasten, die in Zusammenarbeit mit perivaskulären MSC für die Selbsterneuerung, Proliferation und den Transport von . verantwortlich sind HSC, wodurch der Pool von HSC erhalten bleibt [20]. Daher bestätigte das Niveau der CXCL12-Expression auf MSC, das aus verschiedenen HSC-Nischen stammte, die MSC-Diversität im BM-Kompartiment und ihren Einfluss auf die Aktivität von HSC und lymphoiden Vorläufern.

Jüngste Studien dokumentierten, dass Stromazellen aus verschiedenen Geweben (außer BM) stammten und signifikante Unterschiede in ihrer Differenzierung und ihrem molekularen Phänotyp zeigten, und diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Stromazellen aus anderen Quellen möglicherweise nicht in der Lage sind, Stromazellen aus dem Knochenmark zu ersetzen [21].

3. Die Vorläuferzellen der Leber

Das Regenerationspotential der Leber wird durch residente Hepatozyten und Cholangiozyten erreicht, wenn eine mäßige Leberschädigung auftritt. Die Selbsterneuerungskapazität der Hepatozyten ist jedoch eingeschränkt, wenn eine massive Leberschädigung oder eine partielle Hepatektomie erfolgt. Unter diesen bestimmten Bedingungen können Stroma-/Vorläuferzellen der Leber beim Menschen [22, 23] und ovale Zellen bei Nagetieren [24, 25], die nach ihrem morphologischen Aussehen als kleine Zellen mit ovalen Kernen benannt sind, an der Leberregeneration teilnehmen. Humane hepatische Vorläuferzellen sind bipotente Vorläufer von Hepatoblasten und Cholangioblasten und befinden sich an Duktusplatten in der fetalen Leber und in Hering-Kanälen in der Nähe der Portaltriaden von Azini in adulten Lebern [23]. Sie exprimieren den spezifischen Marker EpCAM (Epithelzelladhäsionsmolekül), was ihre Immunselektion ermöglicht (Tabelle 1). EpCAM-positive Zellen charakterisieren eine hohe klonogene Aktivität für über 150 Populationsverdopplungen. Darüber hinaus ermöglichte die Pluripotenz von EpCAM-positiven Zellen und die Fähigkeit zur Differenzierung in biliäre Vorläufer und Hepatoblasten die Selbsterneuerungsfähigkeit dieser Zellen. Mit Ausnahme von EpCAM exprimieren hepatische Vorläuferzellen CD29-, CD133- und NCAM (CD56)-Moleküle, und sie sind negativ für hämatopoetische Marker (CD34, CD45, CD38 und CD14), für Endothelzellmarker (VEGFR, vWF und CD31) und für mesenchymale Marker, die von den Autoren als CD146, Desmin und . definiert wurden α- glattes Muskel-Aktin. Jedoch, Ex-vivo Die klonogene Expansion von EpCAM-positiven Zellen zeigte das Vorhandensein von mesenchymalen „Begleitzellen“, die die Kolonien durchdringen und überall dort gefunden wurden. Die mesenchymalen „Begleitzellen“ repräsentieren zwei unterschiedliche Populationen: Angioblasten, die für VEGFR, vWF, CD31 und CD117 positiv sind (c-kit) und hepatische Sternzellen, die CD146+, Desmin und exprimierten α- glattes Muskel-Aktin. Eine zusätzliche rigorose Immunselektion für EpCAM+-Zellen bewies, dass die parakrine Signalübertragung von mesenchymalen „Begleitzellen“ für das Überleben von EpCAM+-Zellen essentiell ist [23]. Vermutlich tragen unter den mesenchymalen „Begleitzellen“ Perizyten (CD146+, CD90+ und CD140b+), die normalerweise um periportale Blutgefäße in der menschlichen fetalen und adulten Leber lokalisiert sind, zum klonogenen Potenzial von EpCAM-Zellen bei [26]. Studien am Nagetiermodell ergaben, dass EpCAM auf ovalen Zellen und auf Cholangiozyten exprimiert wird, während das TROP2-assoziierte Protein, ein Mitglied der EpCAM-Familie, ausschließlich in ovalen Zellen exprimiert wird, was darauf hindeutet, dass TROP2 ein wertvoller Marker für die Eigenschaften ovaler Zellen ist. Die TROP2-Expression, die in ovalen Zellen in verletzter Leber hochreguliert wird, erhöht die Möglichkeit, die intrazelluläre Signalgebung von EpCAM zu modulieren und/oder zu verstärken, um die Proliferation und Migration von ovalen Zellen in das Leberparenchym zu unterstützen [27].

Ovale Zellen, die in der Leber eines Erwachsenen als fakultative Vorläuferzellen erkannt werden und sich normalerweise im Portalbereich der Leber befinden, sind proliferativ ruhend. Nach schwerer Leberschädigung werden ovale Zellen aktiviert und wandern in das Leberparenchym ein und differenzieren sich in Hepatozyten und Cholangiozyten.Der Ursprung ovaler Zellen ist jedoch umstritten, und Studien dokumentierten, dass ovale Zellen aus dem Knochenmark stammen [28]. Bei schwerer Leberschädigung regulieren Hepatozyten die Expression von SDF-1 . hochα, ein potenter Chemoattraktant für hämatopoetische Zellen CXCR4+. Ovale Zellen exprimieren CXCR4, den einzigen Rezeptor für SDF-1α. Interaktion von SDF-1α/CXCR4 ist wichtig, um die Aktivierung ovaler Zellen zu initiieren, wenn die Hepatozytenproliferation beeinträchtigt ist, und um Stammzellnischen durch die Kontrolle der Vorläuferzellmigration durch mögliche Rekrutierung einer zweiten Welle von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark auf der verletzten Seite der Leber aufrechtzuerhalten [ 25, 29].

Die hepatische Sternzelle repräsentiert den Anteil der leberresidenten Zellen mit sternförmiger Morphologie, die sich zwischen den sinusoidalen Endothelzellen der Leber und den Hepatozyten befinden. Perisinusoidale Sternzellen repräsentieren MSC der Leber und regulieren wesentliche physiologische und pathologische Prozesse der Leber. Unter normalen Bedingungen sind Sternzellen ruhend und haben eine niedrige Proliferationsrate, aber nach einer Leberschädigung aktivieren diese Zellen nach und nach und ändern ihren ruhenden Phänotyp in einen aktiven myofibroblastenähnlichen Phänotyp. Myofibroblasten-ähnlicher Phänotyp ist gekennzeichnet durch die Expression von α- glattes Muskelaktin (α-SMA) und Desmin-Zwischenfilamenten. Darüber hinaus exprimieren aktivierte Sternzellen neuronale Marker, einschließlich glial fibrillary acidic protein (GFAP), Nestin und N-CAM. Diese Beobachtungen weisen auf eine Möglichkeit eines neuralen Ursprungs von Lebersternzellen hin. Diese Zellen exprimieren auch CD271, bekannt als p75NTRF (Nervenwachstumsfaktor-Rezeptorfamilie), das ein Marker für mesenchymale Stromazellen ist und für deren positive Isolierung verwendet wird. Der zelluläre Phänotyp von primären hepatischen Sternzellen hängt jedoch von ihrem fetalen oder adulten Leberursprung ab und ist hochdynamisch, zeitabhängig und abhängig von den Kulturbedingungen. In einem frühen Stadium exprimierten fötale CD271-positive Zellen in Kultur nicht α-SMA und CD90, aber nach längerer Kultivierung zeigen diese kultivierten CD271-Zellen eine starke Expression dieser Marker. Im Gegensatz dazu exprimierten frisch isolierte CD271-Zellen aus adulter Leber alle Marker von Sternzellen [30]. Beide Typen von CD271-Zellen exprimierten jedoch den für MSCs charakteristischen Phänotyp, einschließlich CD73 und CD105, und waren negativ für die hämatopoetischen Marker CD34 und CD45. Unsere eigenen Studien an geweberesidenten Stromazellen dokumentierten die Gewebeverteilung von Zellen mit Selbsterneuerungskapazität in der Leber, die CD73, CD90 und c-kit exprimieren, und diese Zellen sind im periportalen Bereich der Leber lokalisiert, wie in Abbildung 1 dargestellt [31].

Somit ist die Regenerationsfähigkeit der menschlichen Leber nicht mit einem Typ von Lebervorläuferzellen mit Regenerationspotential verbunden. Vielmehr ist die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Arten von Stammzellen der Leber notwendig, um die Integrität und Homöostase der Leberzellen aufrechtzuerhalten.

4. Mesenchymale Vorläuferzelle des Skelettmuskels

Die Skelettmuskulatur enthält, ähnlich wie die meisten postnatalen Gewebe, einen natürlich vorkommenden Pool von residenten adulten Vorläuferzellen, die das Regenerationspotential der Skelettmuskulatur aufrechterhalten. Die Hauptvorläuferzellen, die für die Muskelregeneration verantwortlich sind, sind Satellitenzellen, eine ruhende bipotente gewebespezifische Zellpopulation, die sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma befindet [32]. Die Aktivierung von Satellitenzellen wird durch Muskelverletzungen ausgelöst und wird durch proximale Signale aus Muskelnische, Mikrovaskulatur und Entzündungszellen [33] sowie systemischen Faktoren [34] gesteuert. Aktivierte Satellitenzellen fungieren als Stroma-/Vorläuferzellen, die zur Reparatur beschädigter Myofasern beitragen, oder sie sind in der Lage, nach Zellteilung und Fusion miteinander oder mit den vorhandenen Myozyten neue Myofasern zu erzeugen. Darüber hinaus haben Satellitenzellen die Fähigkeit, einen Reservepool von geweberesidenten Vorläuferzellen in der Skelettmuskulatur über die Selbsterneuerungskapazität aufzufüllen [35]. Ruhende Satellitenzellen exprimieren CD34-, CD56- und Myf5-Oberflächenantigene und den gepaarten Box-Transkriptionsfaktor Pax7, jedoch nahm die Expression von CD34+ während der Differenzierung in Myoblasten ab [36]. Eigene Studien belegten, dass die MSC-Marker CD73 und CD90 auf einzelnen Stammzellen der untersuchten Skelettmuskulatur exprimiert wurden und in den spezifischen Gewebekompartimenten zwischen Basallamina und Sarkolemma der Myofasern des Muskels lokalisiert waren [31]. Darüber hinaus exprimieren Skelettmuskel-Vorläuferzellen, jedoch keine Vorläuferzellen, die in Haut, Leber oder Herz vorhanden sind, ausschließlich den Transkriptionsfaktor Pax7 (Abbildung 1).

Der Pool von Satellitenzellen ist während des Lebens relativ stabil, kann sich jedoch in bestimmten Muskelgruppen unterscheiden. Es wurde vermutet, dass Satellitenzellen aus zwei verschiedenen Populationen bestehen, von denen eine für die Muskelregeneration verantwortlich ist, deren Anzahl jedoch mit zunehmendem Alter abnimmt, und die zweite, die als Reaktion auf eine schwere Muskelverletzung aktiviert wird und das ganze Leben lang konstant bleibt [1, 37 ].

Neben Satellitenzellen spielt eine Vielzahl von geweberesidenten Vorläufern, die in der Skelettmuskulatur existieren, eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase [32]. Das myogene Potenzial von Nichtsatelliten-Vorläuferzellen wurde in einer Zellpopulation identifiziert, die im Muskelinterstitium des Neugeborenen residiert [38]. Diese Zellen weisen ein Potenzial für mehrere Abstammungslinien auf und gehören zu mesenchymalen Vorläufer-/Stromazellen (MSCs), wie durch ein breites Spektrum an Genexpressionen bestätigt wird, die MSC gemeinsam haben [39]. Diese Muskelvorläuferzellen sind durch die Expression von CD34, dem Stressmediator PW1, charakterisiert, aber sie sind negativ für Pax7 (PW1+/Pax7– interstitielle Zellen, PICs). Studien haben gezeigt, dass diese Zellen wie dokumentiert zur Bildung neuer Myofasern und zur Bildung von Satellitenzellen beitragen in vitro bei Kokultur mit Myoblasten oder in vivo wenn sie in eine regenerierende Muskelumgebung transplantiert werden. Allerdings sind PW1+/Pax7−-Populationen negativ für Endothelmarker, wie durch CD31-Negativfärbung nachgewiesen wurde [38].

Eine weitere muskelresidente Population von Nichtsatelliten-Vorläuferzellen sind bipotente fibro/adipogene Vorläuferzellen (FAPs), die im Muskelinterstitium lokalisiert und benachbart zu muskelassoziierten Blutgefäßen sind. Diese Zellen sind phänotypisch CD31-/CD45- und exprimieren stark PDGFα und Vimentin, Marker, die mit mesenchymalen Vorläufern assoziiert sind [40]. Die Mehrheit der FABs (über 90%) hat eine adipogene Kapazität. Diese Zellen unterscheiden sich jedoch von PICs, da sie kein direktes myogenes Potenzial zeigen. Mesenchymale FAPs-Vorläufer, aber keine PW1+-Zellen, tragen durch die Sekretion von parakrinen Faktoren von IL-6, IGF-1 und Wnt1 zur Muskelregeneration bei, was die Myoblasten bis zur terminalen Differenzierung deutlich steigerte [41, 42].

Das myogene Potenzial wurde auch bei endothelähnlichen mesodermalen Vorläuferzellen mit perizytischen Merkmalen bestätigt [43]. Perizyten, die sich in der Basalmembran von Gefäßen im menschlichen Skelettmuskel befinden, stellen myogene Vorläufer dar, die sich von Satellitenzellen unterscheiden. Muskelresidente Perizyten sind negativ für myogene Marker, einschließlich Myf5, MyoD und MyoG. Sie werden durch alkalische Phosphatase-Expression (AP) identifiziert und exprimieren Neuroglia-2-Proteoglykan (NG-2), Thrombozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) und Glattmuskel-Aktin alpha (αSMA). Perizyten aus dem Muskel stimuliert in vitro sind zur myogenen Differenzierung fähig. In vivo Studien zur Muskeldystrophie bei Mäusen dokumentierten, dass Perizyten, die in scid-mdx-Mäuse transplantiert wurden, den Wirtsmuskel kolonisieren und Muskelfasern erzeugen, die menschliches Dystrophin exprimieren [43]. Nachfolgende Studien zeigten, dass ein Teil der Perizyten in der frühen postnatalen Phase mit Myofasern fusionieren und zur Myogenese beitragen kann.

Muskelresidente mesenchymale Stroma-/Vorläuferzellen bilden eine heterogene Zellpopulation mit unterschiedlicher Differenzierungsfähigkeit und spielen eine wichtige Rolle bei der Gewebehomöostase. Die meisten von ihnen, wie Satellitenzellen, PICs und Perizyten, haben eine direkte myogene Differenzierungskapazität in vivo, während die mesenchymalen Vorläufer FAB/MSC die Myogenese durch die Sekretion von parakrinen Wachstumsfaktoren effektiv unterstützen. Somit ist ein effektives regeneratives Potenzial von geschädigtem Skelettmuskel mit kollaborativen Interaktionen zwischen mehreren heterogenen Muskelvorläuferzelltypen, die im Gewebe leben, verbunden.

5. Die von der Haut abgeleiteten multipotenten Stromazellen

Das Vorhandensein von Zellen mit regenerativem Potenzial in der Haut kann der Aufrechterhaltung der Hauthomöostase und der Reaktion auf Schäden zugeschrieben werden. Die Haut besteht aus Epidermis- und Dermisschichten, die einem ständigen Regenerationsprozess unterliegen und eine Reihe von Zellen enthalten, die aus Mesoderm und Ektoderm stammen [44, 45]. Die Selbsterneuerungskapazität der Epidermis und der Haarfollikel hängt von Vorläuferzellen ab, die in der Epidermis, den dermalen Papillen und der Ausbuchtung vorhanden sind. Das Vorhandensein von Vorläufer-ähnlichen Zellen oder MSCs in der Haut wurde durch die Identifizierung mehrerer Arten von erwachsenen Hautstromazellen oder Vorläuferzellen, die in beiden Hautschichten lokalisiert sind, einschließlich dermaler Stromazellen und epidermaler Stromazellen, bestätigt [20, 45, 46]. Darüber hinaus tragen von der Haut abgeleitete Vorläufer, die in mehreren anderen Hautstrukturen wie Haarfollikeln, Blutgefäßen, sensorischen Rezeptoren und Nervenenden lokalisiert sind, zum Regenerationsprozess und zur Aufrechterhaltung der Hautintegrität bei. Isolierte endogene, von der Haut abgeleitete Vorläufer haben die Fähigkeit, sich für viele Passagen mit unspezialisiertem Phänotyp zu vermehren, aber unter bestimmten Bedingungen sind sie in der Lage, sich in bestimmte Zelltypen einschließlich einer neuroektodermalen und mesodermalen Abstammungslinie zu differenzieren. In der Haut sind auch verschiedene Arten von MSC vorhanden, und ihre biologischen Eigenschaften sind in Zellkulturen unterschiedlich. Adhärente MSCs aus der Haut wachsen in Gegenwart von Serum, exprimieren spezifische Marker für die mesenchymalen Stammzelllinien CD73, CD90 und CD105, sind negativ für hämatopoetische Merker, einschließlich CD34, CD45, CD14, CD31 und HLA-DR, und sind negativ für Nestin und positiv für Fibronektin, Vimentin und Kollagen Typ I. Im Gegensatz dazu bilden aus der Haut stammende Vorläufer in Kultur ohne Serum schwebende Kugeln und exprimieren Nestin, der Marker, der sie von plastisch anhaftenden Zellen unterscheidet [20, 45, 47]. Darüber hinaus stellen serumfreie expandierte Floating-Kugeln von der Haut abgeleitete Vorläufer mit begrenztem mesodermalem, aber höherem neurogenen Differenzierungspotential dar, vergleichbar mit Neuralleisten-Stammzellen [45].

Die Diversität von humanen MSC mit Ursprung in der Dermis wurde auch in Studien an mesenchymalen Vorläuferzellen bestätigt, die aus Vorhautproben isoliert wurden [48]. Vor Ort Eine an Hautproben durchgeführte Analyse ergab, dass die MSC-Marker CD73, CD90 und CD105 sowie CD271 und SSEA-4 auf verschiedenen dermalen Zelltypen einschließlich Endothelzellen (CD31+, CD34+) und Leukozyten (CD45+) exprimiert werden. Es wurden jedoch auch CD73-, CD90- und CD105-positive Zellen identifiziert, denen Endothel- und Leukozytenmarker fehlten, und diese Zellen wurden als potenzielle mesenchymale Vorläuferzellen charakterisiert. Isolierte dermale mesenchymale Vorläufer exprimierten Oberflächenmarker ähnlich denen aus Knochenmark stammender MSC. Dermale Stromazellen stellen eine sehr heterogene Population dar, und außer mesenchymalen Vorläufern sind innerhalb der dermalen plastikadhärenten Population differenzierte Fibroblasten vorhanden. Die Immunselektion von MSC basierend auf CD271+ und SSEA-4 Markern aus adhärenten dermalen Zellen bestätigte ihre mesenchymale Differenzierungskapazität und unterschied so dermale MSC von differenzierten Fibroblasten. Allerdings zeigte die CD271+-Zellpopulation eine höhere adipogene, osteogene und chondrogene Differenzierungskapazität im Vergleich zu SSEA+-Zellen, die eine Zellpopulation mesenchymalen Ursprungs mit einem auf die Adipogenese beschränkten Differenzierungspotenzial darstellen [48].

In der Haut des menschlichen Oberschenkels identifizierten wir Marker, die mit dem Phänotyp gewebespezifischer Stromazellen assoziiert sind, lokalisiert in der Basalschicht der Epidermis und im Epithel der Adnexstruktur der Haut (c-kit, CD90). CD73-positive Zellen waren eher im perivaskulären Bereich vorhanden (Abbildung 1). Diese Beobachtungen bewiesen erneut die Diversität von geweberesidenten Stromazellen, die mit ihrer spezifischen Nische assoziiert sind.

Somit stellt die Haut, insbesondere die Vorhaut und die Haut, die während der ästhetischen Chirurgie entfernt wurde, ein ausgewähltes biologisches Abfallmaterial dar und kann als alternative Quelle für vorläuferähnliche Zellen für diese MSCs des Knochenmarks dienen, die für Studien zur Gewebereparatur verwendet werden können und zellbasierte Therapie in der regenerativen Medizin.

6. Herzstammzellen

Das menschliche Herz enthält eine Population primitiver Zellen mit selbsterneuernden, klonogenen und multipotenten Eigenschaften, und diese Zellen sind in der Lage, sich in Kardiomyozyten und Herzkranzgefäße zu differenzieren. Residente kardiale Vorläuferzellen stellen eine heterogene Population dar, die nach ihren biologischen Eigenschaften und Oberflächenmarkern für Nebenpopulation (SP), c-kit+ (CD117+), Stammzellantigen-1 (Sca-1+), Insel 1+, SSEA-1+ . klassifiziert ist , und „Kardiosphären“ [49]. Im menschlichen Myokard sind kardiale Vorläuferzellen innerhalb der kardialen Nischen lokalisiert, die aus Myozyten und Fibroblasten bestehen, die die Stützzellen darstellen und die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Ruhe und Aktivierung von kardialen Stammzellen ermöglichen [5]. In unseren Studien zur Gewebeverteilung von Stroma-/Vorläuferzellen wurden kardiale Vorläuferzellen mit dem Phänotyp CD73+, CD90+ und c-kit+ identifiziert, die mit Myozyten und Fibroblasten in den Herznischen verbunden sind (Abbildung 1) [31].

Die kardialen Vorläuferzellen der Nebenpopulation sind heterogen und stellen verschiedene Subpopulationen dar, die durch die Expression von VE-Cadherin, CD31, CD34 und Sca-1 identifiziert wurden, und bestehen aus vaskulären Endothelzellen, glatten Muskelzellen und mesenchymalen Vorläufern, einschließlich kardiomyogener Vorläufer. Bei Nagetieren wurden SP-Herzvorläuferzellen als Sca-1+, c-kit+, CD34+, CD31– und CD45– Zellen beschrieben, die den kardialen spezifischen Transkriptionsfaktor exprimieren. Nach der Isolation und in vitro Kultur, erwarben SP-Herzvorläuferzellen einen Kardiomyozyten-Phänotyp, der durch die Expression von sarkomerischen Proteinen, Troponin und dokumentiert wurde α- Herzaktinin [49, 50]. Auf in vitro Stimulation zeigten diese Zellen eine multipotente Fähigkeit, nicht nur in Kardiomyozyten, sondern auch in typische von Neuralleisten abgeleitete Linien, einschließlich Neuronen, Glia und glatter Muskulatur, zu differenzieren [51]. In vivo Studien am Rattenmodell dokumentierten die Fähigkeit von SP-Herzvorläuferzellen, geschädigtes Myokard zu beherbergen und nach intravenöser Infusion in Kardiomyozyten und Endothelzellen zu differenzieren [52].

C-kit ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor für den Stammzellfaktor, der hauptsächlich auf hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark beschrieben wird [53]. Von Beltrami et al. [54]. Nachfolgende Studien bestätigten das Potenzial von c-kit-positiven kardialen Vorläuferzellen zur Verringerung der Infarktgröße und zur Verbesserung der Herzfunktion nach Myokardinfarkt [55]. Isolation und in vitro Die Expansion von c-kit-positiven Zellen aus Herzgewebe zeigte ein Differenzierungspotential zu Kardiomyozyten, wie durch die Expression von Kardiomyozyten-Markern bestätigt wurde, einschließlich α- kardiales Actinin, kardiales Myosin, Desmin und Connexin [54, 55]. Wie von Tallini et al. berichtet, wirken c-kit-positive Zellen jedoch bis in die neonatale Phase als kardiale Vorläuferzellen, im adulten Myokard sind sie jedoch eher für die Neoangiogenese verantwortlich [56]. Aus humanen Herzbiopsien isolierte C-kit+CD45–-Zellen koexprimieren die endothelialen Vorläuferzellmarker CD31, CD34, CXCR4 und FLK-1, was auf eine weitere Differenzierung in Endothelzellen hinweist [57]. Jüngste Beobachtungen führten zu der Theorie, dass c-kit-positive Zellen zwei Populationen darstellen, wobei die Zellen mit hohem c-kit+-Gehalt als kardiale Vorläufer und die niedrige c-kit+-Population als MSC fungieren könnten [58]. Die Pluripotenz von c-kit-positiven Zellen wurde durch die Differenzierungsfähigkeit in Adipozyten und Skelettmuskelmyozyten bestätigt.

Hypoxie begünstigt die Ruhe der kardialen Vorläuferzellen, während Normoxie für ihre Aktivierung notwendig ist und das Gleichgewicht zwischen hypoxischen und normoxischen Herzvorläuferzellen in jungen Herzen vorhanden sein kann, während Defekte in der Gewebeoxygenierung, die im alten Myokard auftreten, die homöostatische Kontrolle stören können. Jüngste Studien berichteten, dass im seneszenten Myokard eine erhöhte Anzahl ruhender c-kit-positiver kardialer Vorläuferzellen mit intakten Telomeren vorhanden ist, die nicht in den Zellzyklus zurückkehren können, während die Myozytenreparatur durch Teilung kardialer Vorläuferzellen mit verkürzten Telomeren kontrolliert wird. Diese Beobachtung legt nahe, dass ein Pool funktionell kompetenter kardialer Vorläuferzellen, eingebettet in hypoxischen Nischen im seneszenten Myokard, die Myozytenregeneration nach Aktivierung durch den Stammzellfaktor fördern kann [59].

Sca-1-positive Zellen innerhalb des Myokards repräsentieren eine heterogene Subpopulation von Herzvorläuferzellen basierend auf der unterschiedlichen Untergruppe von coexprimierten Stammmarkern. Kardiale Vorläuferzellen, die Sca-1+CD31+ exprimieren und denen die Blutzelllinienmarker c-kit, FLT-1, CD45 und CD34-negativ fehlen, wurden im adulten Mausmyokard identifiziert [60]. Diese Zellen können sich mit der Expression von strukturellen Herzgenen zu Kardiomyozyten differenzieren. Sca-1-positive Zellen, die mit Oxytocin stimuliert wurden, das c-kit, CD45 und CD34 exprimierte, erzeugten schlagende Kardiomyozyten, während Sca-1+CD45–-Zellen unter den gleichen Bedingungen eine multipotente Differenzierungskapazität in osteogene und adipogene Linien zeigten [61].

Insel-1-positive Zellen gelten als echte Kardiomyozyten-Vorläufer, die während der Embryogenese auftreten und zum rechten Ventrikel und Ausflusstrakt beitragen, obwohl unklar ist, ob diese Zellen im adulten Myokard existieren [62]. Im Myokard sind kardiale Vorläuferzellen vorhanden, die stadienspezifisches embryonales Antigen-1 (SSEA-1) exprimieren. Diese Zellen stellen eine Population eines unreifen Pools embryonaler Vorläufer dar, die sich im Neugeborenenstadium der Herzentwicklung in Myokard- und Endokardzellen differenzieren. Es wurde vorgeschlagen, dass kardiale Stammzellen aus SSEA-1+ zu engagierteren kardialen Vorläuferzellen führen können, die c-kit und Sca-1 exprimieren [63].

Residente Herzvorläuferzellen sind innerhalb des Myokards in Nischen, die sich vorzugsweise in den Vorhöfen und Apex und im Ventrikel befinden, reichlich vorhanden und bewahren effektiv die Integrität des Gewebes unter physiologischen Bedingungen. Die Anzahl der residenten Herzvorläuferzellen könnte jedoch nicht ausreichen, um verletztes Gewebe nach einem ausgedehnten Myokardinfarkt wieder zu besiedeln. Dies kann darauf hindeuten, dass die inhärente Fähigkeit des Myokards, geschädigte Myozyten nach einem Myokardinfarkt zu regenerieren, unzureichend ist. Dies kann durch die Wirkung schädlicher Faktoren erklärt werden, wie (i) mangelnde Sauerstoffzufuhr im Infarktbereich, was nicht nur zur Nekrose der Kardiomyozyten, sondern auch zum Tod von residenten Vorläuferzellen innerhalb der Infarktstelle führt, (ii) und residenten kardialen Vorläufern Zellen, die sich akut an der Infarktgrenze ansammeln und nicht vom lebensfähigen Gewebe zur verletzten Stelle wandern können, weil ihre Translokation in das geschädigte Myokard behindert ist. Dies ist nicht nur mit einer anatomischen Barriere (Narbenbildung) verbunden, sondern auch mit einer begrenzten Produktion von Wachstumsfaktoren (Hepatozyten-Wachstumsfaktor, Insulin-Wachstumsfaktor und Stroma-Wachstumsfaktor), die die Rekrutierung von Herzvorläuferzellen an den Ort der Verletzung erleichtern, und mit entzündliches Milieu des verletzten Myokards, das sich negativ auf die Lebensfähigkeit und Differenzierung der kardialen Vorläuferzellen auswirken kann [64, 65].

Somit können autologe residente kardiale Vorläuferzellen, die aus dem adulten Myokard isoliert werden, deutliche Vorteile gegenüber anderen adulten Stammzellen für die Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen bieten, da sie gewebespezifisch und den kardiovaskulären Abstammungslinien vorbestimmt sind.

7. Die Lungenstromal- und Vorläuferzellen

Die Lunge ist ein sich bedingt erneuerndes Organ, und der Umsatz von Atemwegsepithelzellen beträgt im Steady State weniger als 1% pro Tag um täglich etwa 10 9 hämatopoetische Zellen zu erzeugen. Nach schweren Verletzungen steigt jedoch das Selbsterneuerungspotenzial der stromalen und epithelialen Vorläuferzellen der Lunge schnell an und das kompensatorische Wachstum multipotenter Zellen gewährleistet eine ordnungsgemäße Regeneration der Lunge [66]. Innerhalb der Lunge gibt es viele verschiedene Epithelzelltypen, die in mehreren verschiedenen regionalen Mikroumgebungen entlang des Lungentrakts verteilt sind. Viele Studien an Mausmodellen und eine kleinere Anzahl von Literaturberichten über die menschliche Lunge beschreiben mutmaßliche Populationen von adulten endogenen Atemwegs- und alveolären epithelialen Vorläuferzellen, jedoch ist die Charakterisierung und Einordnung dieser Zellen in eine Hierarchie noch umstritten [67].

Die Organisation endogener stromaler und epithelialer Vorläuferzellen in der adulten Lunge ist spezifisch für ihre regionale Verteilung und Funktion entlang der proximal-distalen Achse des Atemwegsbaums. Der proximale Teil des Atemwegs umfasst die knorpelige Trachea, die von säulenförmigen pseudostratifizierten Epithelzellen mit submukösen Drüsen ausgekleidet ist und umfasst basale, sekretorische, zilienartige und neuroendokrine Zellen. Basalzellen stellen Vorläufer-/Stromazellen des bronchiolären Epithels dar und sind durch die Expression des Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors (NGFR), p63, Cytokeratin-5, Cytokeratin-14 und Aquaporin 3 gekennzeichnet. Nach Isolierung und Ex-vivo Kultur bildeten sie klonale Strukturen, die für Flimmer- und Klumpenzellen (bekannt als Clara-Zellen) positiv sind [68, 69]. Eine Population von Basalzellen kann aus der bronchiolären Nische in geschädigtes Alveolarepithel wandern und sich vermehren, um die Alveolarregion zu reparieren [69].

Der distale Teil des Atemwegs ist mit säulenförmigen Epithelzellen ausgekleidet und umfasst verschiedene Zellpopulationen, darunter Clubzellen, Flimmerzellen, Becherzellen und neuroendokrine Zellen [66]. Während der epithelialen Homöostase können sich Klumpenzellen selbst erneuern und Flimmerzellen erzeugen, während Flimmerzellen keine Fähigkeit zur Selbstregeneration besitzen [70, 71]. Innerhalb der Klumpenzellen, die sich entlang der distalen Achse des Atemwegsbaums befinden, ist eine eindeutige Population von Zellen vorhanden, die als variante Klumpenzellen bekannt sind, und sie befinden sich an der bronchoalveolären Gangverbindung. Die Variante Klumpenzellen mit Selbsterneuerungspotential und Differenzierungskapazität zu Klumpenzellen sind in der Lage, bronchioläre Epithelzellen nach Naphthalinverletzung zu reparieren [71]. Eine weitere Population von Stroma- und Vorläuferzellen der distalen Atemwege ist eine seltene Population von Zellen, die als bronchioalveoläre Stamm-/Vorläuferzellen bezeichnet werden [66]. Bronchioalveoläre Vorläuferzellen sind positiv für den Stammzellmarker Sca-1, positiv für EpCAM und negativ für hämatopoetische (CD34, CD45) und Endothelzellmarker (CD31) [72]. In vitro Studien belegten, dass bronchioalveoläre Vorläuferzellen in der Lage sind, sich in bronchioläre und alveoläre Kolonien zu differenzieren und sich selbst erneuern. Darüber hinaus nimmt ihre Zahl nach bronchiolären Verletzungen zu, was auf ihre Rolle bei der Geweberegeneration hindeutet [73].

Der terminale Teil der Lunge besteht aus Alveolen mit spezifischen alveolären Vorläuferzellen, die sich in Surfactant-produzierende alveoläre Typ-II-Zellen und gasaustauschende alveoläre Typ-I-Zellen differenzieren [71]. Eine Population von alveolären Vorläuferzellen, die den Lamininrezeptor exprimieren α6β4 Integrin, befindet sich im Alveolarepithel und kann im experimentellen Modell nach Parenchymverletzung zur Regeneration von Atemwegen und Alveolargewebe beitragen [74].

Residente mesenchymale Stromazellen der Lunge sind ein Schlüsselelement epithelialer Vorläufernischen entlang der proximal-distalen Achse des Atemwegsbaums [71, 72, 75]. Die mesenchymalen Stromazellen der Lunge sezernieren FGF 10, einen kritischen Faktor, der für die Steuerung der Differenzierung in der sich entwickelnden Lunge notwendig ist [71]. Darüber hinaus wurde dokumentiert, dass mesenchymale Lungenstromazellen, EpCAM-negativ und Sca-1-positiv, die mit Lungenepithel-Vorläuferzellen (EpCAM-positiv) kokultiviert wurden, deren Proliferation und Differenzierung unterstützen und Kolonien bilden, die Atemwegs-, Alveolar- oder gemischte Lungenepithelzelllinien umfassen [75].

Regionale Stroma- und Vorläuferzellen wie submuköse Drüsen-/Drüsen-Vorläuferzellen, Basalzellen, Variant-Club-Zellen, bronchioalveoläre Stamm-/Vorläuferzellen und alveoläre Vorläuferzellen, die sich in verschiedenen Nischen des Respirationstraktes befinden, sind für die Aufrechterhaltung spezifischer Epithelzelllinien verantwortlich Integrität in der spezifischen Region der Atemwege. Verschiedene Populationen von geweberesidenten Stroma- und Vorläuferzellen sind an der regionenspezifischen Homöostase und Gewebereparatur nach Lungenverletzungen beteiligt. Somit ist die Homöostase der Lunge ein hoch koordinierter Prozess der Proliferation und Differenzierung von Lungenstroma- und Vorläuferzellen und erfordert ein Gleichgewicht zwischen Immunregulation und Förderung der Geweberegeneration.

8. Zusammenfassung

Multipotente MSCs befinden sich in spezifischen Gewebenischen, die aus Zellen bestehen, die eine spezifische Mikroumgebung für geweberesidente Vorläuferzellen schaffen und ihnen die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase erleichtern. Nischenzellen liefern Signale, die das Gleichgewicht der Selbsterneuerung und der Differenzierungskapazität der in ihnen befindlichen Stamm-/Vorläuferzellen regulieren und kontrollieren. Die Nische kontrolliert auch die Teilung und Aktivität von Stamm-/Vorläuferzellen, um die Krebsbildung zu erhalten. Das Gleichgewicht zwischen Ruhe und Aktivität von Vorläuferzellen ist ein Kennzeichen einer funktionellen Nische und wird durch interne (z. B. DNA-Schäden) und externe Signale reguliert, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen führen.

MSC kann leicht aus verschiedenen Gewebequellen isoliert, in der Kultur vermehrt und unter geeigneten Bedingungen entsprechend differenziert werden. Abhängig von ihrem Ursprungsgewebe sind MSCs prädisponiert, um die Art von Gewebezellen hervorzubringen, aus denen sie stammen. Somit sind MSCs aus adulten menschlichen Geweben ideale Kandidaten für die Geweberegeneration und das Tissue Engineering. MSCs tragen jedoch nicht nur zur strukturellen Gewebereparatur bei, sondern besitzen auch starke immunmodulatorische und entzündungshemmende Wirkungen und können durch direkte Zell-Zell-Interaktion oder Sekretion verschiedener bioaktiver Faktoren einen Einfluss auf die lokale Gewebereparatur durch Modulation der lokalen Umgebung haben .

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Wissen

Diese Arbeit wird durch das National Science Center Grant N N407 121940 unterstützt.

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Copyright © 2016 Aleksandra Klimczak und Urszula Kozlowska. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


Bindegewebslabor

Im Gegensatz zu Epithelien ist Bindegewebe dünn von Zellen besiedelt und enthält eine ausgedehnte extrazelluläre Matrix aus Proteinfasern, Glykoproteinen und Proteoglykanen. Die Funktion dieses Gewebetyps besteht darin, andere Gewebe strukturell und mechanisch zu unterstützen und den Austausch von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen dem Kreislauf und anderen Geweben zu vermitteln. Diese Gewebe haben zwei Hauptkomponenten, eine extrazelluläre Matrix und eine Vielzahl von Stützzellen. Diese beiden Komponenten stehen im Mittelpunkt dieses Labs.

Am häufigsten werden die verschiedenen Bindegewebstypen durch ihren Gehalt an drei unterschiedlichen Typen extrazellulärer Fasern spezifiziert: kollagene Fasern, elastische Fasern und retikuläre Fasern.

Kollagenfasern

Kollagenfasern bestehen aus Kollagen vom Typ I, II oder III und sind in allen Arten von Bindegewebe vorhanden. Kollagenes Bindegewebe wird in zwei Typen unterteilt, basierend auf dem Verhältnis von Kollagenfasern zu Grundsubstanz. Grundsubstanz ist ein wässriges Gel aus Glykoproteinen und Proteoglykanen, das den Raum zwischen zellulären und fibrillären Elementen des Bindegewebes einnimmt.

  • Loses (areolares Bindegewebe) ist die häufigste Form von kollagenem Bindegewebe. Es tritt in kleinen, länglichen Bündeln auf, die durch Bereiche getrennt sind, die Grundsubstanz enthalten.
  • Dichtes Bindegewebe ist mit wenig Grundsubstanz an kollagenen Fasern angereichert. Liegen die dicht gepackten Faserbündel in einer Richtung, so spricht man von regelmäßig, wenn sie in mehrere Richtungen orientiert sind, spricht man von unregelmäßig. Ein Beispiel für regelmäßig dichtes Bindegewebe sind Sehnen, ein Beispiel für unregelmäßig dichtes Bindegewebe ist das der Dermis.

Retikuläre Fasern

Retikuläre Fasern bestehen aus Kollagen Typ III. Im Gegensatz zu den dicken und groben kollagenen Fasern bilden die retikulären Fasern ein dünnes retikuläres Netzwerk. Solche Netzwerke sind in verschiedenen Geweben weit verbreitet und bilden tragende Gerüste in der Leber, lymphoiden Organen, kapillaren Endothelen und Muskelfasern.

Elastische Fasern

Elastische Fasern enthalten das Protein Elastin, das mit dem Protein Fibrillin kopolymerisiert. Diese Fasern sind oft in Lamellenschichten organisiert, wie in den Wänden von Arterien. Dichtes, regelmäßiges, elastisches Gewebe zeichnet die Bänder aus. Elastische Fasern sind dehnbar, weil sie normalerweise desorganisiert sind – das Strecken dieser Fasern lässt sie eine organisierte Struktur annehmen.

Zellen des Bindegewebes

Fibroblast

Fibroblasten sind mit Abstand der häufigste native Zelltyp des Bindegewebes. Der Fibroblast synthetisiert das Kollagen und die Grundsubstanz der extrazellulären Matrix. Diese Zellen produzieren eine große Menge an Protein, die sie absondern, um die Bindegewebsschicht aufzubauen. Einige Fibroblasten haben eine kontraktile Funktion, die als Myofibroblasten bezeichnet werden.

Makrophage

Der Makrophage ist das Bindegewebe, das für das retikuloendotheliale oder mononukleäre Phagozytensystem repräsentativ ist. Dieses System besteht aus einer Reihe von gewebespezifischen, beweglichen, phagozytischen Zellen, die von Monozyten abstammen - dazu gehören die Kupffer-Zellen der Leber, die Alveolarmakrophagen der Lunge, die Mikroglia des Zentralnervensystems und die retikulären Zellen des Milz. Sie werden jedem von ihnen später im Kurs begegnen, stellen Sie sicher, dass Sie alle von Monozyten abstammen und dass der Makrophage die Bindegewebsversion ist. Makrophagen sind von Fibroblasten nicht zu unterscheiden, können aber erkannt werden, wenn sie große Mengen sichtbarer Tracersubstanzen wie Farbstoffe oder Kohlenstoffpartikel internalisieren. Makrophagen phagozytieren Fremdmaterial in der Bindegewebsschicht und spielen auch als Antigen-präsentierende Zellen eine wichtige Rolle, eine Funktion, über die Sie in Immunbiologie mehr erfahren.

Mastzelle

Mastzellen sind granulierte Zellen, die typischerweise im Bindegewebe vorkommen. Diese Zellen vermitteln Immunantworten auf Fremdpartikel. Insbesondere setzen sie als Reaktion auf die Antigenerkennung große Mengen an Histamin und Enzymen frei. Dieser Degranulationsprozess schützt vor dem Eindringen von Fremdorganismen in den Körper, ist aber auch die Ursache vieler allergischer Reaktionen.

Weiße Fettzelle

Weiße Fettzellen oder Adipozyten sind auf die Speicherung von Triglyceriden spezialisiert und kommen einzeln oder in kleinen Gruppen verstreut im lockeren Bindegewebe vor. Sie treten besonders häufig entlang kleinerer Blutgefäße auf. Wenn sich Fettzellen in einer solchen Menge angesammelt haben, dass sie zelluläre und faserige Elemente verdrängen oder ersetzen, wird die Ansammlung als Fettgewebe bezeichnet. Diese Zellen können bis zu 100 Mikrometer groß werden und enthalten in der Regel einmal zentral gelegene Lipidvakuolen - das Zytoplasma bildet einen kreisförmigen Ring um diese Vakuole, und der Zellkern wird komprimiert und zur Seite verschoben. Die Funktion von weißem Fett besteht darin, als Energiequelle und Wärmeisolator zu dienen.

Braune Fettzelle

Braune Fettzellen sind hochspezialisiert auf die Temperaturregulation. Diese Zellen sind bei Neugeborenen und überwinternden Säugetieren reichlich vorhanden, bei Erwachsenen jedoch selten. Sie besitzen zahlreiche, kleinere Lipidtröpfchen und eine Vielzahl von Mitochondrien, deren Cytochrome die braune Farbe des Gewebes verleihen. Die Elektronentransportkette dieser Mitochondrien wird durch ein Entkopplungsprotein unterbrochen, was die Dissipation des mitochondrialen Wasserstoffionengradienten ohne ATP-Produktion bewirkt. Dadurch entsteht Wärme.

Knorpel

Knorpel ist eine spezialisierte Form des Bindegewebes, die von differenzierten fibroblastenähnlichen Zellen, den Chondrozyten, produziert wird. Es zeichnet sich durch eine prominente extrazelluläre Matrix aus, die aus verschiedenen Anteilen von Bindegewebsfasern besteht, die in eine gelartige Matrix eingebettet sind. Chondrozyten befinden sich innerhalb von Lücken in der Matrix, die sie um sich herum aufgebaut haben. Einzelne Lücken können mehrere Zellen enthalten, die von einem gemeinsamen Vorläufer stammen. Durch die sekretorische Aktivität der Chondrozyten werden Lakunen voneinander getrennt. Drei Arten von Knorpel werden nach der Häufigkeit bestimmter Fasern und den Eigenschaften ihrer Matrix klassifiziert.

Hyaliner Knorpel

Hyaliner Knorpel hat eine Matrix aus Kollagen Typ II und Chondromucoprotein, einem Copolymer der Chondroitinsulfate A und C mit Protein. Seine hohe Konzentration an negativ geladenen Sulfatgruppen lässt es unter H&E stark basophil erscheinen. Dieser Knorpel befindet sich in der Nase, in den Trachealringen und dort, wo die Rippen mit dem Brustbein verbunden sind.

Faserknorpel

Faserknorpel zeichnet sich durch seinen hohen Gehalt und die geordnete Anordnung von Typ-I-Kollagenfasern aus. Es befindet sich typischerweise in Regionen, in denen Sehnen an Knochen, den Bandscheiben und der Schambeinfuge befestigt sind.

Elastischer Knorpel

Elastischer Knorpel zeichnet sich durch das Vorhandensein zahlreicher elastischer Fasern aus und ist ziemlich zellulär. Es besteht aus Kollagen Typ II und befindet sich in der Ohrmuschel und in der Epiglottis.


Bindegewebe

Der menschliche Körper besteht aus nur vier grundlegenden Gewebearten: Nerven-, Muskel-, Epithel- und Bindegewebe. Bindegewebe ist der am häufigsten vorkommende, am weitesten verbreitete und vielfältigste Typ. Es umfasst faseriges Gewebe, Fett, Knorpel, Knochen, Knochenmark und Blut. Wie der Name schon sagt, bindet Bindegewebe oft andere Organe zusammen, hält Organe an Ort und Stelle, polstert sie und füllt den Raum.

Bindegewebe unterscheidet sich von den anderen Typen dadurch, dass das extrazelluläre Material (Matrix) in der Regel mehr Platz einnimmt als die Zellen und die Zellen relativ weit voneinander entfernt sind. Fett ist eine Ausnahme, da es Zellen in engem Kontakt miteinander hat, aber mit großen, nicht lebenden, intrazelluläres Lipid Tröpfchen enthält Fett viel mehr nicht lebendes Material als lebendes Material.

Die Matrix des Bindegewebes besteht typischerweise aus Fasern und einer strukturlosen Grundsubstanz. Die am häufigsten vorkommende Faser im Bindegewebe ist ein zähes Protein Kollagen genannt. Sehnen, Bänder und das weiße faserige Gewebe (Faszien), das in einigen Fleischstücken zu sehen ist, bestehen fast ausschließlich aus Kollagen, ebenso wie Leder, das aus der Bindegewebsschicht (Dermis) von Tierhäuten besteht. Kollagen stärkt auch Knochen und Knorpel. Elastisch und retikulär Fasern sind weniger häufige Bindegewebsproteine ​​mit einer begrenzteren Verteilung.

Die Grundsubstanz kann flüssig sein, wie im Blut gallertartig, wie in Areolar Gewebe gummiartig wie bei Knorpel oder verkalkt und steinig wie bei Knochen. Es besteht hauptsächlich aus Wasser und kleinen gelösten Ionen und organisch Moleküle, aber die gallertartige bis gummiartige Konsistenz einiger Gewebe resultiert aus enormen Protein-Kohlenhydrat-Komplexen in der Grundsubstanz. Die harte Knochenkonsistenz resultiert hauptsächlich aus Calciumphosphatsalzen in der Grundsubstanz.

Einige der Zellen des Bindegewebes sind Fibroblasten (die Kollagenfasern produzieren und der einzige Zelltyp in Sehnen und Bändern sind) Adipozyten (Fettzellen) Leukozyten (weiße Blutkörperchen, auch außerhalb der

Art und Eigenschaften des Bindegewebes Funktionen Standorte
Areoläres (loses) Bindegewebe. Lose Anordnung von zufälligen Fasern mit einer Vielzahl von Zelltypen Nährt und polstert Epithelien, bietet eine Arena für die Immunabwehr gegen Infektionen, bindet Organe zusammen, ermöglicht den Durchgang von Nerven und Blutgefäßen durch andere Gewebe Unter allen Epithelien äußere Hüllen von Blutgefäßen, Nerven, Speiseröhre und anderen Organen Faszie zwischen Muskeln, Pleura und Perikardsäcken
Fettgewebe (Fett). Große fettgefüllte Adipozyten und spärliche extrazelluläre Matrix. Speichert Energie, speichert Körperwärme, polstert und schützt viele Organe, füllt den Raum, formt den Körper Unter der Haut um Nieren, Herz und Augen Brust-Bauchmembranen (Mesenterien)
Dichtes unregelmäßiges Bindegewebe. Dicht beabstandete, zufällig angeordnete Fasern und Fibroblasten. Zähigkeit schützt Organe vor Verletzungen bietet Schutzkapseln um viele Organe Dermis der Hautkapseln um Leber, Milz und andere Organe faserige Hülle um die Knochen
Dichtes regelmäßiges Bindegewebe. Dicht beabstandete, parallele Kollagenfasern und Fibroblasten. Bindet Knochen zusammen und befestigt Muskeln an Knochen, überträgt die Kraft von Muskel zu Knochen Sehnen und Bänder
Knorpel (Knorpel). Weit auseinander liegende Zellen in kleinen Hohlräumen (Lücken) gummiartige Matrix. Erleichtert Gelenkbewegungen widersteht Kompression an den Gelenken hält die Atemwege offen formt das Außenohr bewegt die Stimmbänder Vorläufer des fetalen Skeletts Wachstumszone der Kinderknochen Äußeres Ohr, Kehlkopf, Ringe um die Luftröhre, Gelenkflächen und Wachstumszonen von Knochen, zwischen Rippen und Brustbein, Bandscheiben
Knochen (knöchernes Gewebe). Weit auseinander liegende Zellen in Lakunen, ein Großteil der Matrix in konzentrischen zwiebelartigen Schichten harter mineralisierter Matrix. Unterstützt den Körper physisch, sorgt für Bewegung, umschließt und schützt weiche Organe, speichert und gibt Kalzium und Phosphor ab   Skelett
Blut. Erythrozyten, Leukozyten und Blutplättchen in Transportiert Nährstoffe, Gase, Abfälle, Hormone, Zirkuliert im Herz-Kreislauf-System

Blutkreislauf im faserigen Bindegewebe) Makrophagen (große phagozytische Zellen, die von bestimmten Leukozyten abstammen) Erythrozyten (rote Blutkörperchen, die nur im Blut und Knochenmark vorkommen) Chondrozyten (Knorpelzellen) und Osteozyten (Knochenzellen).

Die obige Tabelle listet repräsentative Orte und Funktionen der wichtigsten Arten von Bindegewebe auf. Weitere Details zum Bindegewebe finden Sie in Lehrbüchern von Histologie und menschliche Anatomie.


NEUE EIGENSCHAFTEN

Statistik der neu aufgenommenen TSS-Daten

In dieses Update haben wir insgesamt 330 533 354 neue 36-bp-Single-End-Read-TSS-Tags aufgenommen. Diese Tags wurden aus einer Reihe von Oligp-gekappten Bibliotheken gesammelt, die aus acht Arten von menschlichem Normalgewebe (Gehirn, Niere, Herz, fötales Gehirn, fötale Niere, fötales Herz, fötaler Thymus und fötale Leber) und sechs kultivierten Zelllinien (Darmkrebs) DLD1, B-Lymphozyten Ramos, Bronchialepithelzellen BEAS2B, embryonale Niere HEK293, Brustadenokarzinom MCF7 und fetales Lungen-TIG3 beim Menschen) und Fibroblasten-NIH3T3-Zellen bei Mäusen für Details zur Herkunft der Zellen siehe http://dbtss.hgc.jp /cgi-bin/cell_type.cgi. Wir konstruierten die 5'-End-Bibliotheken unter Verwendung von sechs Zelltypen, die unter verschiedenen Bedingungen, wie Hypoxie oder Normoxie, und mit oder ohne IL4-Behandlung kultiviert wurden. Insgesamt umfasst das aktuelle DBTSS 31 verschiedene Zelltypen oder Kulturbedingungen, die jeweils ∼ 10 Millionen TSS-Tags enthalten (Tabelle 1). Zugangsnummern für jeden Datensatz sind in http://dbtss.hgc.jp/cgi-bin/accession.cgi angegeben. Details der experimentellen Verfahren sind auch in http://dbtss.hgc.jp/docs/protocol_solexa.html beschrieben.

Die TSS-Tags in jedem Datensatz wurden in 500 bp-Bins geclustert, um Transkriptionsstartcluster (TSCs) zu trennen, von denen jeder unabhängige Promotoren darstellen kann [siehe auch Ref. (3) für weitere Einzelheiten]. 5′-Ende-Cluster wurden weiter aufgespalten, je nachdem, ob sie in der Nähe eines RefSeq-Gens kartiert wurden (von –50 Kb stromaufwärts vom 5′-Ende eines RefSeq-Transkripts bis zum 3′-Ende davon) oder weiter als 50 Kb entfernt, in dem, was wir eine intergenische Region nennen. Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, gab es im Durchschnitt ∼ 100 000 RefSeq-Transkriptionsstartcluster und 40 000 intergene pro Zelle und pro Kulturbedingung. Trotz der im Allgemeinen großen Anzahl von 5′-Ende-Clustern, die mit früheren Beobachtungen von uns (3) und anderen (5) übereinstimmten, bestanden die meisten Cluster aus einem oder zwei TSSs. Die TSCs mit signifikanten Expressionsniveaus, die für weitere biologische funktionelle Charakterisierungen priorisiert werden können, waren relativ selten. Die Anzahl der TSCs mit Expressionsniveaus von > 5 ppm (Teile pro Million Tags beachten Sie, dass 1 ppm 1 Kopie pro Zelle entspricht, vorausgesetzt, jede Zelle enthält 1 Million mRNA-Kopien) ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Detaillierte Statistiken zu jedem TSS-Seq-Sub- Datensätze werden in http://dbtss.hgc.jp/cgi-bin/cell_type.c angezeigt. Alle Daten können auf unserer Downloadseite (ftp://ftp.hgc.jp/pub/hgc/db/dbtss/dbtss_ver7/) heruntergeladen werden.

Statistik der neuen TSS-Seq-Daten

Platte A
Beispielname Zelltyp Zustand Zeitverlauf Tag-Anzahl
DLD1 (Hypoxie mit nicht-markierter RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 723 359
DLD1 (Hypoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 727 105
DLD1 (Normoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 7 410 902
DLD1 (Hypoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 8 737 554
DLD1 (Normoxie mit nicht zielgerichteter RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 644 835
DLD1 (Normoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 353 702
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 22 954 017
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B-Elternteil IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 166 848
Beas2B-Elternteil IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siRNA− IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siRNA+ IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 5 879 777
Beas2B stat6 siRNA+ IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenokarzinom der Brust 1% O2 24 Stunden 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenokarzinom der Brust 21% O2 24 Stunden 13 609 932
WIG-O2 1% Fötale Lunge 1% O2 24 Stunden 8 848 737
WIG-O2 21% Fötale Lunge 21% O2 24 Stunden 9 235 808
293 O2 1% Embryonale Niere 1% O2 24 Stunden 10 590 128
293 O2 21% Embryonale Niere 21% O2 24 Stunden 8 162 101
Fötales Herz Normales fetales Gewebe 10 182 282
Fetale Niere Normales fetales Gewebe 8 424 482
Fetale Leber Normales fetales Gewebe 4 741 889
Fötaler Thymus Normales fetales Gewebe 7 122 556
Fötales Gehirn Normales fetales Gewebe 11 285 710
Gehirn Normales Gewebe für Erwachsene 11 561 960
Herz Normales Gewebe für Erwachsene 9 378 901
Niere Normales Gewebe für Erwachsene 11 196 359
Maus 3T3 Fibroblast 20 246 303
Gesamt 330 533 354
Panel: B
Durchschnittliche 5′-Endcluster pro Zelle Durchschnittliche Anzahl von TSCs > 5 ppm pro Zelle Anzahl der vertretenen Gene (Abdeckung gegenüber den gesamten RefSeq-Genen)
RefSeq-Region 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Intergene Region 40 537 1083 ND
Platte A
Beispielname Zelltyp Zustand Zeitverlauf Tag-Anzahl
DLD1 (Hypoxie mit nicht-markierter RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 723 359
DLD1 (Hypoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 727 105
DLD1 (Normoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 7 410 902
DLD1 (Hypoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 8 737 554
DLD1 (Normoxie mit nicht zielgerichteter RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 644 835
DLD1 (Normoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 353 702
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 22 954 017
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B-Elternteil IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 166 848
Beas2B-Elternteil IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siRNA− IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siRNA+ IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 5 879 777
Beas2B stat6 siRNA+ IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenokarzinom der Brust 1% O2 24 Stunden 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenokarzinom der Brust 21% O2 24 Stunden 13 609 932
WIG-O2 1% Fötale Lunge 1% O2 24 Stunden 8 848 737
WIG O2 21% Fötale Lunge 21% O2 24 Stunden 9 235 808
293 O2 1% Embryonale Niere 1% O2 24 Stunden 10 590 128
293 O2 21% Embryonale Niere 21% O2 24 Stunden 8 162 101
Fötales Herz Normales fetales Gewebe 10 182 282
Fetale Niere Normales fetales Gewebe 8 424 482
Fetale Leber Normales fetales Gewebe 4 741 889
Fötaler Thymus Normales fetales Gewebe 7 122 556
Fötales Gehirn Normales fetales Gewebe 11 285 710
Gehirn Normales Gewebe für Erwachsene 11 561 960
Herz Normales Gewebe für Erwachsene 9 378 901
Niere Normales Gewebe für Erwachsene 11 196 359
Maus 3T3 Fibroblast 20 246 303
Gesamt 330 533 354
Panel: B
Durchschnittliche 5′-Endcluster pro Zelle Durchschnittliche Anzahl von TSCs > 5 ppm pro Zelle Anzahl der vertretenen Gene (Abdeckung gegenüber den gesamten RefSeq-Genen)
RefSeq-Region 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Intergene Region 40 537 1083 ND

Statistik der neuen TSS-Seq-Daten

Platte A
Beispielname Zelltyp Zustand Zeitverlauf Tag-Anzahl
DLD1 (Hypoxie mit nicht-markierter RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 723 359
DLD1 (Hypoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 727 105
DLD1 (Normoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 7 410 902
DLD1 (Hypoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 8 737 554
DLD1 (Normoxie mit nicht zielgerichteter RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 644 835
DLD1 (Normoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 353 702
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 22 954 017
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B-Elternteil IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 166 848
Beas2B-Elternteil IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siRNA− IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siRNA+ IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 5 879 777
Beas2B stat6 siRNA+ IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenokarzinom der Brust 1% O2 24 Stunden 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenokarzinom der Brust 21% O2 24 Stunden 13 609 932
WIG-O2 1% Fötale Lunge 1% O2 24 Stunden 8 848 737
WIG O2 21% Fötale Lunge 21% O2 24 Stunden 9 235 808
293 O2 1% Embryonale Niere 1% O2 24 Stunden 10 590 128
293 O2 21% Embryonale Niere 21% O2 24 Stunden 8 162 101
Fötales Herz Normales fetales Gewebe 10 182 282
Fetale Niere Normales fetales Gewebe 8 424 482
Fetale Leber Normales fetales Gewebe 4 741 889
Fötaler Thymus Normales fetales Gewebe 7 122 556
Fötales Gehirn Normales fetales Gewebe 11 285 710
Gehirn Normales Gewebe für Erwachsene 11 561 960
Herz Normales Gewebe für Erwachsene 9 378 901
Niere Normales Gewebe für Erwachsene 11 196 359
Maus 3T3 Fibroblast 20 246 303
Gesamt 330 533 354
Panel: B
Durchschnittliche 5′-Endcluster pro Zelle Durchschnittliche Anzahl von TSCs > 5 ppm pro Zelle Anzahl der vertretenen Gene (Abdeckung gegenüber den gesamten RefSeq-Genen)
RefSeq-Region 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Intergene Region 40 537 1083 ND
Platte A
Beispielname Zelltyp Zustand Zeitverlauf Tag-Anzahl
DLD1 (Hypoxie mit nicht-markierter RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 723 359
DLD1 (Hypoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 7 727 105
DLD1 (Normoxie mit HIF1A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 7 410 902
DLD1 (Hypoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 1% O2 24 Stunden 8 737 554
DLD1 (Normoxie mit nicht zielgerichteter RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 644 835
DLD1 (Normoxie mit HIF2A-RNAi) Fibroblast 21% O2 24 Stunden 8 353 702
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 22 954 017
Beas2B überexprimiert STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B-Elternteil IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 166 848
Beas2B-Elternteil IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siRNA− IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siRNA+ IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 5 879 777
Beas2B stat6 siRNA+ IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4+ Bcell IL4 4 Stunden 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenokarzinom der Brust 1% O2 24 Stunden 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenokarzinom der Brust 21% O2 24 Stunden 13 609 932
WIG-O2 1% Fötale Lunge 1% O2 24 Stunden 8 848 737
WIG O2 21% Fötale Lunge 21% O2 24 Stunden 9 235 808
293 O2 1% Embryonale Niere 1% O2 24 Stunden 10 590 128
293 O2 21% Embryonale Niere 21% O2 24 Stunden 8 162 101
Fötales Herz Normales fetales Gewebe 10 182 282
Fetale Niere Normales fetales Gewebe 8 424 482
Fetale Leber Normales fetales Gewebe 4 741 889
Fötaler Thymus Normales fetales Gewebe 7 122 556
Fötales Gehirn Normales fetales Gewebe 11 285 710
Gehirn Normales Gewebe für Erwachsene 11 561 960
Herz Normales Gewebe für Erwachsene 9 378 901
Niere Normales Gewebe für Erwachsene 11 196 359
Maus 3T3 Fibroblast 20 246 303
Gesamt 330 533 354
Panel: B
Durchschnittliche 5′-Endcluster pro Zelle Durchschnittliche Anzahl von TSCs > 5 ppm pro Zelle Anzahl der vertretenen Gene (Abdeckung gegenüber den gesamten RefSeq-Genen)
RefSeq-Region 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Intergene Region 40 537 1083 ND

TSS-Dynamik-Viewer

Da die erweiterten DBTSS-Daten Hunderte Millionen von TSS-Daten enthalten, die von Dutzenden verschiedener Zelltypen unter verschiedenen Kulturbedingungen gesammelt wurden, ist es wichtig, die TSS-Daten darzustellen, um den Interessen der Benutzer gerecht zu werden. Andernfalls wird die Datenbank zu einer verwirrenden Zusammenstellung massiver TSS-Daten. Zuerst haben wir die Cluster mit sehr niedrigen Expressionsniveaus maskiert (<5 ppm bei der Standardeinstellung, obwohl es eine Option gibt, alle TSSs anzuzeigen), da sie möglicherweise aus intrinsischem Transkriptionsrauschen der Zellen ( 10) oder anderen experimentellen Fehlern stammen . Zweitens haben wir die TSCs in eine Reihe von TSS-Seq-Daten kategorisiert, damit Benutzer die unterschiedliche Verwendung der TSSs in verschiedenen Zelltypen oder Kulturbedingungen empirisch verstehen können. Für die grafische Darstellung haben wir eine Reihe neuer Schnittstellen entwickelt, wie in den Abbildungen 1 und 2 gezeigt. Die TSSs, die einem bestimmten Gen von Interesse für den Benutzer (Abbildung 1B) entsprechen, können abgerufen und ihre unterschiedliche Verwendung unter verschiedenen zellulären Umständen dargestellt werden. 1D veranschaulicht den gewebespezifischen alternativen Promotor. Im Zinkfingerprotein 622-Gen (NM_033414) wurde der zweite stromaufwärts gelegene alternative Promotor (moosgrün) selektiv im fetalen Herzen verwendet, während ein anderer alternativer Promotor (hellgrün) in den anderen Geweben einschließlich des erwachsenen Gewebes verwendet wird. Außerdem können Benutzer mithilfe unserer neuen Suchseite, wie in Abbildung 1C gezeigt, nach Promotoren suchen, die signifikante Expressionsänderungen als Reaktion auf bestimmte Umweltänderungen zeigen.

Schnittstellen des neu implementierten ‚TSS Tag Viewer‘. TSS-Sequenz-Tag-Informationen können von der obersten Seite abgerufen werden (EIN) indem Sie einem der Links folgen. Die jedem Link entsprechenden Betrachter sind in den angegebenen Figuren dargestellt. (B) Im Formular „Datenbanksuche“ können Benutzer direkt die 5′-End-Tags eines Gens oder eines Zelltyps angeben, die sie anzeigen möchten. (C) Im Formular „TSS-Tag-Suche“ können Benutzer nach TSS-Tags suchen, indem sie Zelltypen, Falteninduktion und/oder Tag-Zahlen angeben. Sie können auch auswählen, welche Kategorie von Tags berücksichtigt werden soll (z. B. ob Tags verschiedener alternativer Promotoren getrennt gezählt werden sollen oder nicht). (D) Ein Beispiel für entwicklungsstadienspezifische alternative Promotoren. Im Zinkfingerprotein 622-Gen (NM_033414) wird der in Moosgrün (zweite Tafel) angezeigte Promotor selektiv im fetalen Herzen verwendet. Die oberen und unteren Felder repräsentieren die TSS-Tag-Verwendungen in adultem bzw. fötalem Gewebe. Die Höhe der vertikalen Balken repräsentiert die Anzahl der TSS-Seq-Tags, die sich in den entsprechenden genomischen Regionen befinden. Verschiedene alternative Promotoren werden durch unterschiedliche Farben dargestellt. Jede horizontale Linie stellt die experimentelle Bedingung dar, aus der TSS-Tags abgeleitet wurden. Legenden für die Gewebe und die Summe der TSS-Tag-Zählungen werden am rechten Rand angezeigt. (E) Beispiel für den Fall, in dem eine alternative Promotor-spezifische Induktion als Reaktion auf die IL-4-Stimulation in Ramos-Zellen beobachtet wurde. In dem hypothetischen Protein LOC746-Gen (NM_014206) wird der in rot angezeigte alternative Promotor (erste Tafel) selektiv induziert, während der andere alternative, blau angezeigte Promotor (zweite Tafel) unverändert blieb. Die angezeigten TSS-Regionen sind in den unteren unteren Feldern auf das Nukleotidniveau vergrößert.

Schnittstellen des neu implementierten ‚TSS Tag Viewer‘. TSS-Sequenz-Tag-Informationen können von der obersten Seite abgerufen werden (EIN) indem Sie einem der Links folgen. Die jedem Link entsprechenden Betrachter sind in den angegebenen Figuren dargestellt. (B) Im Formular „Datenbanksuche“ können Benutzer direkt die 5′-End-Tags eines Gens oder eines Zelltyps angeben, die sie anzeigen möchten. (C) Im Formular „TSS-Tag-Suche“ können Benutzer nach TSS-Tags suchen, indem sie Zelltypen, Falteninduktion und/oder Tag-Zahlen angeben. Sie können auch auswählen, welche Kategorie von Tags berücksichtigt werden soll (z. B. ob Tags verschiedener alternativer Promotoren getrennt gezählt werden sollen oder nicht). (D) Ein Beispiel für entwicklungsstadienspezifische alternative Promotoren. Im Zinkfingerprotein 622-Gen (NM_033414) wird der in Moosgrün (zweite Tafel) angezeigte Promotor selektiv im fetalen Herzen verwendet. Die oberen und unteren Felder repräsentieren die TSS-Tag-Verwendungen in adultem bzw. fötalem Gewebe. Die Höhe der vertikalen Balken repräsentiert die Anzahl der TSS-Seq-Tags, die sich in den entsprechenden genomischen Regionen befinden. Verschiedene alternative Promotoren werden durch unterschiedliche Farben dargestellt. Jede horizontale Linie stellt die experimentelle Bedingung dar, aus der TSS-Tags abgeleitet wurden. Legenden für die Gewebe und die Summe der TSS-Tag-Zählungen werden am rechten Rand angezeigt. (E) Beispiel für den Fall, in dem eine alternative Promotor-spezifische Induktion als Reaktion auf die IL-4-Stimulation in Ramos-Zellen beobachtet wurde. In dem hypothetischen Protein LOC746-Gen (NM_014206) wird der in rot angezeigte alternative Promotor (erste Tafel) selektiv induziert, während der andere alternative, blau angezeigte Promotor (zweite Tafel) unverändert blieb. Die angezeigten TSS-Regionen sind in den unteren unteren Feldern auf das Nukleotidniveau vergrößert.

Schnittstelle des aktualisierten „ncRNA-Viewers“ und „Comparative Genomic Viewer“. (EIN) Beispiel für die TSS-Tags, die aus den umgebenden Regionen berichteter kleiner RNAs identifiziert wurden. Das Ergebnis der Suche nach einer kleinen ncRNA, miR9-2, wird angezeigt. Vollständige cDNA (AK091356), die in derselben Region identifiziert wurde, wird ebenfalls durch orange Kästchen dargestellt. (B) Evolutionäre Konservierung der alternativen Promotoren der Proteinkinase C zeta (PRKCZ)-Gene (NM_002744). Verschiedene alternative Promoter sind durch unterschiedliche Farben gekennzeichnet. Obere und untere Felder repräsentieren die TSS-Informationen bei Menschen bzw. Mäusen. Entsprechende genomische Sequenzen wurden gemäß den Informationen des UCSC Genome Browser ausgerichtet.

Schnittstelle des aktualisierten „ncRNA-Viewers“ und „Comparative Genomic Viewer“. (EIN) Beispiel für die TSS-Tags, die aus den umgebenden Regionen berichteter kleiner RNAs identifiziert wurden. Das Ergebnis der Suche nach einer kleinen ncRNA, miR9-2, wird angezeigt. Vollständige cDNA (AK091356), die in derselben Region identifiziert wurde, wird ebenfalls durch orange Kästchen dargestellt. (B) Evolutionäre Konservierung der alternativen Promotoren der Proteinkinase C zeta (PRKCZ)-Gene (NM_002744). Verschiedene alternative Promoter sind durch unterschiedliche Farben gekennzeichnet. Obere und untere Felder repräsentieren die TSS-Informationen bei Menschen bzw. Mäusen. Entsprechende genomische Sequenzen wurden gemäß den Informationen des UCSC Genome Browser ausgerichtet.

Auch können Anwender beispielsweise nach allen alternativen Promotoren mit mehr als 5-facher Induktion nach IL-4-Stimulation in Ramos-Zellen und mit Expressionslevel >5 ppm suchen. Abbildung 1E zeigt das Ergebnis einer solchen Suche. Im hypothetischen Protein LOC746 Gen (NM_014206) wurde der zweite alternative Promotor (rot) selektiv induziert, während das Expressionsniveau des anderen nachgeschalteten alternativen Promotors (blau) unverändert blieb. Es sollte beachtet werden, dass die Expressionsanalyse unter Verwendung von Microarrays oder RT-PCR solche promotorspezifischen Expressionsänderungen je nach den Positionen der entworfenen DNA-Sonden oder PCR-Primer übersehen könnte.Nach unserem besten Wissen gibt es keine Datenbank, die die unterschiedliche Verwendung jedes der Promotoren unter verschiedenen experimentellen Bedingungen quantitativ darstellt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass solch unterschiedliche Transkriptionsregulationen eine molekulare Grundlage bilden, um ein komplexes funktionelles Netzwerk menschlicher Gene durch eine begrenzte Anzahl von Gesamtgenen zu erzeugen (7–9). Außerdem ist eine genaue Identifizierung der mit jedem alternativen Promotor assoziierten Veränderungen der Genexpression wesentlich, um akkumulierende ChIP-Seq-Daten zu interpretieren (11), um beispielsweise die Transkriptionsinduktion der proximalen Bindung eines bestimmten Transkriptionsfaktors zuzuschreiben. Das aktualisierte DBTSS wird die vielseitigen Anforderungen der Analyse des transkriptionalen Netzwerks menschlicher Gene in der Ära der Sequenzierung der nächsten Generation erfüllen.

TSS-Informationen für nicht-kodierende RNAs

Die im gesamten menschlichen Genom unvoreingenommen gesammelten TSS-Informationen sind auch nützlich, um bisher nicht identifizierte Transkripte zu identifizieren und zu charakterisieren. Insbesondere die neue Version von DBTSS kann eine einzigartige und wichtige Ressource für die Identifizierung von primären Transkripten von miRNAs und anderen nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) sein, die sich in intergenischen Regionen befinden (12). Obwohl Hunderte von mutmaßlichen ncRNAs identifiziert und ihre biologische Charakterisierung vorgenommen wurden, gab es nur wenige Fälle, in denen die TSSs der primären Transkripte der ncRNAs identifiziert und ihre Promotorstrukturen aufgeklärt wurden. Das neue DBTSS enthält Informationen der miRBase-Datenbank ( 13) und NR-Transkript-Informationen der RefSeq-Datenbank ( 14), und TSSs innerhalb eines beliebigen definierten Abstands von den ncRNAs können abgerufen werden. Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde ein möglicher TSS eines primären Transkripts einer miRBase miRNA miR9-2 (miRBase http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_entry.pl?acc=MI0000467) gefunden in 6-Kb-Upstream-Regionen von miR9-2. Darüber hinaus legten unsere cDNA-Sequenzdaten auch nahe, dass diese miRNA in der 3'-Endregion eines mutmaßlichen nicht-kodierenden Transkripts, AK091356, existiert.

Aktualisierter Viewer für vergleichende Genomik

Obwohl DBTSS jetzt eine beispiellose Datenmenge enthält, hatten wir Bedenken, dass viele Promotoren und ncRNAs Produkte von „Transkriptionsrauschen“ sein könnten, die im menschlichen Genom auftreten könnten, und daher keine biologische Relevanz haben. Um dieses Problem auszuräumen, haben wir unseren vergleichenden genomischen Viewer aktualisiert, damit die Benutzer die evolutionäre Konservierung der umgebenden genomischen Sequenzen und der TSS-Tag-Informationen im Vergleich zu anderen Säugetieren untersuchen können. 2B veranschaulicht den Fall im Proteinkinase C zeta (PRKCZ)-Gen (NM_002744). Dieses Gen enthält mindestens drei alternative Promotoren, die blau, rot und grün hervorgehoben sind. Der am weitesten stromaufwärts gelegene und der dritte Promotor (blau und grün) werden in der fetalen Niere und im Herzen verwendet, während der zweite Promotor (rot) selektiv im fötalen Gehirn verwendet wird. Die genomische Sequenz der ersten beiden Promotoren (blau und rot) ist zwischen Mensch und Maus gut konserviert und entsprechende TSS-Tags wurden in beiden Spezies beobachtet. Im Gegensatz dazu ist die den dritten Promotor (grün) umgebende genomische Sequenz nicht konserviert, und dieser Promotor scheint in der Maus nicht verwendet zu werden. Um komplexe Transkriptionsregulationen dieses Gens abzugrenzen, ist es wichtig, die unterschiedliche Verwendung und das unterschiedliche Niveau der evolutionären Konservierung jedes der hier dargestellten Promotoren zu berücksichtigen.

In ähnlicher Weise haben wir die evolutionäre Konservierung der intergenen TSCs von >5 ppm untersucht und festgestellt, dass mindestens die Hälfte zwischen Mensch und Maus nicht konserviert ist (detaillierte Analyse wird an anderer Stelle veröffentlicht). Es ist noch nicht klar, ob diese intergenen Cluster von Transkriptionsstarts Protein-kodierenden oder nicht-kodierenden RNAs entsprechen, die humanspezifische biologische Funktionen erfüllen oder nicht. Die Informationen in der Vergleichsanzeige sollten jedoch nützliche Hinweise geben, um die Ziele zu priorisieren und zukünftige Experimente mit dem Ziel weiterer Funktionsstudien zu entwerfen.


Ergebnisse

Genetische Auswirkungen auf Genexpression und DNA-Methylierung

Wir haben zuvor über die Entdeckung von . berichtet cis Assoziationen zwischen genetischer Variation und Genexpression (exprimierte Quantitative Trait Loci eQTLs) und zwischen genetischer Variation und DNA-Methylierung (Methylierungs-QTLs mQTLs) in primären Fibroblasten, EBV-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs) und primären T-Zellen von Neugeborenen, die gezeigt in Tabelle 1[37]. Hier haben wir den Replikationsgrad der LCL-eQTLs mit den LCL-eQTLs bewertet, die in einer leistungsstärkeren RNA-seq-Studie mit älteren Zelllinien von erwachsenen Personen berichtet wurden [5]. Daraus ergibt sich eine Replikation von ca. 70 % bezogen auf den Anteil der True Positive aus einer P-Wert-Verteilung [38] und einem Effektstärkenvergleich (S1 Abb.). In dieser Studie haben wir auch die Lage der zuvor entdeckten eQTLs und mQTLs analysiert. Wie in früheren Microarray-Studien beobachtet, häufen sich hochsignifikante eQTLs nahe dem TSS [39]. Wenn eQTL-Gene danach klassifiziert werden, ob sie in einem, zwei oder drei Zelltypen als signifikant bezeichnet werden, beobachten wir, dass eQTLs, die in allen Zelltypen signifikant sind, tendenziell weniger weit vom TSS entfernt sind als eQTLs, die in zwei Zelltypen signifikant sind , und diese sind weniger weit entfernt als diejenigen, die nur in einem Zelltyp signifikant sind (S2 Abb.). Das gleiche Muster wird für die LCL-eQTLs beobachtet, die in einem unabhängigen Datensatz repliziert wurden, sowie für eine ähnliche Analyse, die besser mit dem Fluch des Gewinners umgeht (S2C-D Abb.). Dies repliziert die in früheren Studien beobachteten Muster [6, 22], und obwohl einige eQTLs aufgrund des Fluchs des Gewinners falsch klassifiziert werden können, könnte dieses Muster die Bedeutung entfernter regulatorischer Elemente wie Enhancer bei der gewebespezifischen Regulation widerspiegeln. Darüber hinaus finden wir auch einen großen Anteil von eQTLs sehr nahe an der Transkriptionsendstelle (TES S3 Abb.), ähnlich wie in früheren Beobachtungen [4, 40]. Auch in Bestätigung früherer Studien mit Arrays mit niedrigerer Auflösung [20] sind hochsignifikante mQTLs in der Nähe der abgefragten CpG-Stelle überrepräsentiert (P < 1.3E-14 S4 Abb.). Bei allen Zelltypen beobachten wir, dass die besten eQTLs pro Gen signifikant an DNase-I-überempfindlichen Stellen, Exons und CpG-Inseln angereichert sind (Abb. 1A siehe auch S5 Abb.). Auch in allen Zelltypen sind mQTLs signifikant an Enhancern und Isolatoren angereichert und an letzten Exons und Introns abgereichert (Abb. 1B siehe auch S6 Abb.). Bei mehreren dieser QTLs handelt es sich um SNPs, von denen berichtet wurde, dass sie mit verschiedenen Krankheiten und Merkmalen in Zusammenhang stehen, gemäß der Literatur zu genomweiten Assoziationsstudien [41] (GWAS) – 8, 3 und 4 eQTLs und 32, 51 und 74 mQTLs, in Fibroblasten , LCLs bzw. T-Zellen – obwohl diese Anreicherung nicht signifikant ist und nicht unbedingt einen kausalen Zusammenhang zwischen diesen eQTLs oder mQTLs und der Krankheit impliziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass genetische Varianten, die die Genexpression und das DNA-Methylierungsniveau beeinflussen, häufig mit funktionellen genomischen Elementen überlappen. Dies weist auch darauf hin, dass die DNA-Sequenzvariation den Methylierungsgrad stark beeinflusst. Die genetischen Varianten, die die DNA-Methylierung beeinflussen, befinden sich überwiegend in entfernten regulatorischen Regionen, wie hier gezeigt, oder in Nicht-CpG-Inselpromotoren, wie zuvor gezeigt [37], und nicht innerhalb von Genen. Diese Ergebnisse sind mit den Beobachtungen der unterschiedlichen Methylierung in Geweben kompatibel, die überwiegend entfernt von Transkriptionsstartstellen lokalisiert sind [31] und um interindividuelle Methylierungsvariationen im Zusammenhang mit genetischer Variation angereichert sind [37].