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Hitzeschock vs Elektroporation

Hitzeschock vs Elektroporation



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Ich habe E. coli mittels Hitzeschock transformiert, um Oligonukleotide (ca. 50 nt) einzufügen; jedoch hat keines meiner Experimente bisher positive Ergebnisse geliefert. Ich beginne, die Effizienz der chemischen Transformation in Frage zu stellen, insbesondere bei kurzen DNA-Fragmenten. Gibt es einen so bemerkenswerten Unterschied zwischen chemischer und elektrischer Transformation?

BEARBEITEN: Ich überprüfe die CRISPR-Array-Erweiterung, also haben meine Oligos eine Protospacer-Länge und -Struktur. Ich verwende BL21(DE3)-Zellen, die ein IPTG-induzierbares T7 haben, das ich zuerst mit einem Cas1-Cas2-Plasmid transformiere. Dann induziere ich die Zellen, um diese Proteine ​​zu exprimieren, mache sie kompetent und transformiere dann noch einmal, aber mit den Oligos und einem eGFP-Plasmid (für eine Art Selektion). Um nach positiven Ergebnissen zu suchen, amplifiziere ich die Leader-Repeat-Verbindung des CRISPR-Arrays und vergleiche seine Länge (über Elektrophorese) mit einem üblichen Array, das keine Integranden hat.


Wie erkennt man eine potenziell positive Transfektion? Kurze Fragmente können angemessene teräre Strukturen aufweisen, die dazu führen, dass sie sich anders verhalten, als Sie es erwarten würden. Außerdem wird nicht-zirkuläre DNA und RNA in den meisten Zellen viel schneller abgebaut, wenn die richtigen Kopf- oder Schwanzsignale fehlen.

Zu Ihrer Frage: Die gepulste Elektroporation mit gut vorbereiteten Bakterien (Zustand, Puffer,…) ist in der Regel 5-100x effizienter als chemisch kompetente Bakterien.


Verdünnen Sie die Ligationsreaktion für die Elektroporation - (18. Juni 2008)

Ich mache so oft die Elektroporation für BL21 E.coli durch 1 ul direkte Ligation, aber im Elektroporator kommt immer Flash, daher ist es wichtig, die Ligationsreaktion zu verdünnen und wie man sie am besten verdünnt.

Ja, verdünne es mit ddH20 10 Mal und verwenden Sie 1ul.

Die Elektroporation ist eine sehr effiziente Methode (im Vergleich zum Hitzeschock), sodass die Verwendung einer verdünnten Ligationsreaktion kein Problem darstellt. Tatsächlich erhöht es meiner Erfahrung nach die Effizienz.

Ja, verdünne es mit ddH20 10 Mal und verwenden Sie 1ul.

Die Elektroporation ist eine sehr effiziente Methode (im Vergleich zum Hitzeschock), sodass die Verwendung einer verdünnten Ligationsreaktion kein Problem darstellt. Tatsächlich erhöht es meiner Erfahrung nach die Effizienz.

danke für deine idee heute habe ich die umformung mit verdünnter mischung und ohne flash gemacht und morgen werde ich die nr. der Kolonie danke

Ja, verdünne es mit ddH20 10 Mal und verwenden Sie 1ul.

Die Elektroporation ist eine sehr effiziente Methode (im Vergleich zum Hitzeschock), sodass die Verwendung einer verdünnten Ligationsreaktion kein Problem darstellt. Tatsächlich erhöht es meiner Erfahrung nach die Effizienz.

danke für deine idee heute habe ich die umformung mit verdünnter mischung und ohne flash gemacht und morgen werde ich die nr. der Kolonie danke

daer cellcounter
bin nicht glücklich, denn selbst in der Kontrollplatte keine Kolonie, was kann ich tun?

Ein Vorschlag. Schweben Sie ein kleines Milipore-Filterpapier auf dd-Wasser in einer Petrischale ... und geben Sie einfach 5-10 ul Ihrer Ligationsmischung für eine Stunde oder so darauf. Danach die Ligationsmischung mit einer Pipette entnehmen. und geh zur Transformation. Das Prinzip, wie Sie vielleicht schon erraten haben, ist die "Mikro"-Dialyse zum Entsalzen ... hoffentlich funktioniert es. Lass es mich wissen..

1. Es gibt mehrere andere Dinge, die schief gehen können, also müssen Sie auch andere Aspekte beheben. Beginnend mit dem Bakterienstamm, Medien, Antibiotika, Elektroporator, Küvetten, Inkubationszeiten usw. Da Sie bereits eine Kontrollplasmid-Elektroporation durchführen, können Sie ohne Fehlerbehebung beim Klonen (Ligation usw.) jede Eventualität.

Es ist eine sehr schlechte Idee, BL21-Stämme direkt mit einem Ligationsprodukt zu transformieren. Sie sparen Zeit und Ärger, indem Sie zuerst in DH5a, DH10B oder einen anderen Klonierungsstamm transformieren, ein Miniprep durchführen und das BL21 mit der Plasmid-DNA transformieren. BL21 hat eine sehr schlechte Transformationseffizienz.


Biologische Auswirkungen von Stromschlag und Hitzedenaturierung und Oxidation von Molekülen, Membranen und Zellfunktionen

Es ist bekannt, dass die direkte Exposition von Zellen in Suspension zu intensiven elektrischen Impulsen Schäden an Zellmembranen und supramolekularen Organisationen von Zellen und Denaturierung von Makromolekülen verursacht, ähnlich wie bei Verletzungen und Rissen bei Patienten mit Elektrotrauma. Somit wurde das System als Labormodell zur Untersuchung der biochemischen Grundlagen der elektrischen Verletzung verwendet. Ein intensiver elektrischer Impuls kann zwei Haupteffekte auf Zellen haben – einen durch das Feld oder das elektrische Potenzial und den anderen durch Strom oder die elektrische Energie. Das feldinduzierte Transmembranpotential kann elektrokonformative Veränderungen von Ionenkanälen und Ionenpumpen und, wenn das Potential die Spannungsfestigkeit der Zellmembran (ca Elektroporationen von Membranproteinen und Lipiddoppelschichten. Diese Ereignisse führen zum Durchgang von elektrischem Strom durch die membranporierten Zellen und zur Erwärmung der Zellmembranen und des zytoplasmatischen Inhalts. Die anschließende Denaturierung von Zellmembranen und zytoplasmatischen Makromolekülen führt zu vielen komplexen biochemischen Reaktionen, einschließlich der Oxidation von Proteinen und Lipiden. Die kombinierten Effekte können die Zellen irreparabel lahmlegen. Diese Mitteilung konzentriert sich auf die thermischen Auswirkungen von Stromschlägen. Nach einem kurzen Überblick über den aktuellen Wissensstand zur thermischen Denaturierung von löslichen Enzymen und Muskelproteinen werden in diesem Beitrag Experimente zur thermischen Denaturierung zellulärer Komponenten und Funktionen wie Nukleosomen, der Elektronentransportkette und synthetischer ATP-Enzyme der mitochondriale innere Membranen. Die Daten zeigen, dass selbst bei moderaten Temperaturen zwischen 40 °C und 45 °C eine Lipidperoxidation und der anschließende Verlust der Energieübertragungsfähigkeit der Zellen auftreten können. Allerdings kann die Lipidperoxidation mit reduzierenden Reagenzien wie Mercaptoethanol, Dithiothreitol, und Ascorbinsäure. Eine Reaktivierung von denaturierten zellulären Proteinen und Funktionen kann ebenfalls möglich sein und eine Strategie dafür wird diskutiert.


Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit der Hitzeschockmethode

Die Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mittels der Hitzeschockmethode ist eine grundlegende Technik der Molekularbiologie. Es besteht darin, ein fremdes Plasmid oder Ligationsprodukt in Bakterien zu inserieren. Dieses Videoprotokoll beschreibt die traditionelle Transformationsmethode mit kommerziell erhältlichen chemisch kompetenten Bakterien von Genlantis. Nach einer kurzen Inkubation in Eis wird eine Mischung aus chemisch kompetenten Bakterien und DNA für 45 Sekunden bei 42 °C (Hitzeschock) und dann wieder in Eis gelegt. SOC-Medium wird zugegeben und die transformierten Zellen werden bei 37 °C für 30 Minuten unter Rühren inkubiert. Um sicherzustellen, dass Kolonien unabhängig von der Transformationseffizienz isoliert werden, werden zwei Mengen transformierter Bakterien ausplattiert. Dieses traditionelle Protokoll kann erfolgreich verwendet werden, um die meisten kommerziell erhältlichen kompetenten Bakterien zu transformieren. Die Turbozellen von Genlantis können auch in einem neuartigen 3-Minuten-Transformationsprotokoll verwendet werden, das in der Bedienungsanleitung beschrieben ist.


Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit der Hitzeschockmethode

Die Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mittels der Hitzeschockmethode ist eine grundlegende Technik der Molekularbiologie. Es besteht darin, ein fremdes Plasmid oder Ligationsprodukt in Bakterien zu inserieren. Dieses Videoprotokoll beschreibt die traditionelle Transformationsmethode mit kommerziell erhältlichen chemisch kompetenten Bakterien von Genlantis. Nach einer kurzen Inkubation in Eis wird eine Mischung aus chemisch kompetenten Bakterien und DNA für 45 Sekunden bei 42ଌ gehalten (Hitzeschock) und dann wieder in Eis gelegt. SOC-Medium wird zugegeben und die transformierten Zellen werden 30 min bei 37 °C unter Rühren inkubiert. Um sicherzustellen, dass Kolonien unabhängig von der Transformationseffizienz isoliert werden, werden zwei Mengen transformierter Bakterien ausplattiert. Dieses traditionelle Protokoll kann erfolgreich verwendet werden, um die meisten kommerziell erhältlichen kompetenten Bakterien zu transformieren. Die Turbozellen von Genlantis können auch in einem neuartigen 3-Minuten-Transformationsprotokoll verwendet werden, das in der Bedienungsanleitung beschrieben ist.


Methoden des Gentransfers: 6 Methoden

Dieser Artikel beleuchtet die sechs Methoden des Gentransfers. Die sechs Methoden sind: (1) Transformation (2) Konjugation (3) Elektroporation (4) Liposom-vermittelter Gentransfer (5) Transduktion und (6) Direkter DNA-Transfer.

Methode # 1. Transformation:

Transformation ist das Verfahren zur Einführung fremder DNA in Bakterienzellen (z. B. E. coli). Die Aufnahme von Plasmid-DNA durch E.coli erfolgt in eiskaltem CaCl2 (0–5°C) und einem anschließenden Hitzeschock (37–45°C für etwa 90 Sekunden). Bei dieser Technik ist die Transformationshäufigkeit, die sich auf den Anteil der Zellpopulation bezieht, der übertragen werden kann, einigermaßen gut, z. ungefähr eine Zelle für 1000 (10 –3) Zellen.

Transformationseffizienz:

Er bezieht sich auf die Anzahl der Transformanten pro Mikrogramm hinzugefügter DNA. Für E. coli, Transformation durch Plasmid, beträgt die Transformationseffizienz etwa 10 7 bis 10 8 Zellen pro Mikrogramm intakter Plasmid-DNA. Die Bakterienzellen, die DNA aufnehmen können, gelten als kompetent. Die Kompetenz kann durch Veränderung der Wachstumsbedingungen gesteigert werden.

Der Mechanismus des Transformationsprozesses ist nicht vollständig verstanden. Es wird angenommen, dass das CaCI2 beeinflusst die Zellwand, bricht an lokalisierten Bereichen und ist auch für die Bindung von DNA an die Zelloberfläche verantwortlich. Ein kurzer Hitzeschock (d. h. der plötzliche Temperaturanstieg von 5 °C auf 40 °C) stimuliert die DNA-Aufnahme. Im Allgemeinen sind große DNAs bei der Transformation weniger effizient.

Andere chemische Transformationsmethoden:

Calciumphosphat (anstelle von CaCl2) wird für den Transfer von DNA in kultivierte Zellen bevorzugt. Manchmal kann Calciumphosphat zu Ausfällungen und Toxizität für die Zellen führen. Einige Arbeiter verwenden Diethylaminoethyldextran (DEAE-Dextran) für den DNA-Transfer.

Methode # 2. Konjugation:

Konjugation ist ein natürlicher mikrobieller Rekombinationsprozess. Bei der Konjugation kommen zwei lebende Bakterien (ein Spender und ein Empfänger) zusammen, verbinden sich durch zytoplasmatische Brücken und übertragen einzelsträngige DNA (von Spender zu Empfänger). Innerhalb der Empfängerzelle kann sich die neue DNA in das Chromosom integrieren (eher selten) oder frei bleiben (wie es bei Plasmiden der Fall ist).

Eine Konjugation kann zwischen den Zellen verschiedener Bakteriengattungen (z. B. Salmonella- und Shigella-Zellen) auftreten. Dies steht im Gegensatz zur Transformation, die zwischen den Zellen einer Bakteriengattung stattfindet. Somit ist durch Konjugation der Transfer von Genen von zwei verschiedenen und nicht verwandten Bakterien möglich.

Das natürliche Phänomen der Konjugation wird für den Gentransfer ausgenutzt. Dies wird erreicht, indem DNA mit Plasmid-Insert von einer Zelle in eine andere übertragen wird. Im Allgemeinen fehlen den Plasmiden konjugative Funktionen und sie sind daher als solche nicht in der Lage, DNA auf die Empfängerzellen zu übertragen. Einige Plasmide mit konjugativen Eigenschaften können jedoch hergestellt und verwendet werden.

Methode # 3. Elektroporation:

Die Elektroporation basiert auf dem Prinzip, dass elektrische Hochspannungspulse die Zellplasmamembranen zum Verschmelzen bringen können. Somit ist die Elektroporation eine Technik, die eine durch ein elektrisches Feld vermittelte Membranpermeabilisierung beinhaltet. Elektroschocks können auch die zelluläre Aufnahme von exogener DNA (vermutlich über die durch elektrische Impulse gebildeten Poren) aus der Suspensionslösung induzieren.

Die Elektroporation ist eine einfache und schnelle Technik zum Einbringen von Genen in die Zellen verschiedener Organismen (Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere).

Die grundlegende Technik der Elektroporation zum Transfer von Genen in Säugerzellen ist in Abb. 6.11 dargestellt. Die Zellen werden in eine DNA enthaltende Lösung gegeben und Elektroschocks ausgesetzt, um Löcher in den Membranen zu verursachen. Die fremden DNA-Fragmente dringen durch die Löcher in das Zytoplasma und dann in den Zellkern ein.

Elektroporation ist ein effektiver Weg, um E. coli-Zellen zu transformieren, die Plasmide mit Insert-DNAs enthalten, die länger als 100 kb sind. Die Transformationseffizienz beträgt etwa 10 9 Transformanten pro Mikrogramm DNA für kleine Plasmide (etwa 3 kb) und etwa 10 6 für große Plasmide (etwa 130 kb).

Methode # 4. Liposom-vermittelter Gentransfer:

Liposomen sind kreisförmige Lipidmoleküle, die ein wässriges Inneres haben, das Nukleinsäuren tragen kann. Es wurden mehrere Techniken entwickelt, um DNA in Liposomen einzukapseln. Der Liposomen-vermittelte Gentransfer, die sogenannte Lipofektion, ist in Abb. 6.12 dargestellt.

Bei der Behandlung von DNA-Fragmenten mit Liposomen werden die DNA-Stücke in Liposomen eingekapselt. Diese Liposomen können an Zellmembranen haften und mit ihnen fusionieren, um DNA-Fragmente zu übertragen. So gelangt die DNA in die Zelle und dann in den Zellkern. Die positiv geladenen Liposomen komplexieren sehr effizient mit DNA, binden an Zellen und übertragen DNA schnell.

Die Lipofektion ist eine sehr effiziente Technik und wird für den Transfer von Genen in Bakterien-, Tier- und Pflanzenzellen verwendet. T

Methode # 5. Transduktion:

Manchmal kann die fremde DNA in tierische Viren verpackt werden. Diese Viren können die Zellen auf natürliche Weise infizieren und die DNA in die Wirtszellen einbringen. Der Transfer von DNA durch diesen Ansatz wird als Transduktion bezeichnet.

Methode # 6. Direkter DNA-Transfer:

Es ist möglich, die DNA direkt in den Zellkern zu übertragen. Mikroinjektion und Partikelbombardierung sind die beiden gebräuchlichen Techniken für diesen Zweck.

Für die kultivierten Zellen wird im Allgemeinen ein DNA-Transfer durch Mikroinjektion verwendet. Diese Technik ist auch nützlich, um DNA in große Zellen wie Eizellen, Eier und die Zellen früher Embryonen einzuführen. Der Begriff Transfektion wird für den Transfer von DNA in eukaryontische Zellen durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel verwendet.


Hitzeschock vs. Elektroporation - Biologie

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ELEKTROPORATION VON EMBRYOGENEN PROTOPLASTEN VON SÜßORANGE (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) UND REGENERATION VON TRANSFORMIERTEN PFLANZEN

RANDALL P. NIEDZ, 1,2 W. L. McKENDREE, 1 R. G. SHATTERS Jr. 1

1 Agricultural Research Service, US Horticultural Research Laboratory, 2001 South Rock Road, Ft. Pierce, FL 34945-3030
2 Autor, an den die Korrespondenz gerichtet werden soll: [email protected]

Enthält PDF & HTML, falls verfügbar

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Es ist nicht im Einzelverkauf erhältlich.

Die Elektroporationsbedingungen wurden für die Transfektion von Protoplasten optimiert, die aus einer embryogenen Zelllinie der Süßorange [Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Hameln]. Elektrische Feldstärke (375–450 V cm −1 ), Vektor-DNA-Konzentration (100 μg ml −1 ), Träger-DNA-Konzentration (100 μg ml −1 ), Elektroporationspuffer (pH 8) und Hitzeschock von Protoplasten vor der Elektroporation (5 min bei 45°C) wurden optimiert. Es wurde der Plasmidvektor pBI221 verwendet, der die β-Glucuronidase (GUS) kodierende Sequenz unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors enthielt, und die GUS-Aktivität wurde 24 h nach der Elektroporation gemessen. Alle Variablen beeinflussten die Transfektionseffizienz signifikant und wenn optimale Bedingungen für jede kombiniert wurden, betrug die GUS-Aktivität 7714 pmol 4-Methylumbelliferon (ME) mg –1 (Protein) min –1 . Protoplasten wurden dann in Gegenwart der grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Expressionsvektoren pARS101 oder pARS108 elektroporiert. Grün fluoreszierende Embryonen wurden ausgewählt, Pflanzen regeneriert und die Integration des Transgens wurde durch Southern-Blot-Analyse bestätigt. Beide Plasmide wurden unter Verwendung von EGFP konstruiert, einer GFP-Variante, die 35 mal heller als wtGFP ist, einen einzelnen rotverschobenen Anregungspeak aufweist und für die Verwendung von humanem Codon optimiert wurde. pARS101 wurde konstruiert, indem EGFP unter die Kontrolle eines 35S-35S-Promotors gestellt wurde, der 33 bp der untranslatierten Leadersequenz des Alfalfa-Mosaikvirus enthielt. pARS108 wurde ähnlich konstruiert, außer dass Sequenzen für den Transport und die Retention von EGFP im Lumen des endoplasmatischen Retikulums hinzugefügt wurden.

RANDALL P. NIEDZ , WL McKENDREE und RG SHATTERS Jr. "ELECTROPORATION OF EMBRYOGENIC PROTOPLASTS OF SWEET ORANGE (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) UND REGENERATION OF TRANSFORMED PLANTS", In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 39(6) 586-594, (1. November 2003). https://doi.org/10.1079/IVP2003463

Eingegangen: 4. Februar 2003 Angenommen: 1. Mai 2003 Veröffentlicht: 1. November 2003

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Essay: Gentransfertechniken – Vor- und Nachteile

Gentransfer ist eine Technik, um funktionelle Gene (die normalerweise kloniert werden) stabil und effizient in die Zielzellen einzuführen. Der genetische Transfer ist der Mechanismus, durch den DNA von einem Spender auf einen Empfänger übertragen wird. Sobald sich die Spender-DNA im Empfänger befindet, kann es zu einem Crossing-Over kommen. Das Ergebnis ist eine rekombinante Zelle, deren Genom sich entweder vom Spender oder vom Empfänger unterscheidet. Nach dem Transfer muss ein Rekombinationsereignis stattfinden, damit die Veränderung im Genom vererbbar ist (an die nächste Generation weitergegeben wird). Die Gene sind die Baupläne, die notwendig sind, um alle Proteine ​​​​in unserem Körper zu erzeugen, die schließlich alle biologischen Funktionen erfüllen. Daher wird, wenn ein Gen effizient in eine Zielzelle des Wirts eingeführt wird, das Protein produziert, das von diesem Gen kodiert wird.
Gentransfertechnologien wurden ursprünglich als Forschungsinstrument zur Untersuchung der Genexpression und ihrer Funktion entwickelt. Für den Gentransfer werden verschiedene Techniken und natürlich vorkommende Verfahren eingesetzt.
Es stehen Techniken zur Einführung von DNA in viele verschiedene Zelltypen in Kultur zur Verfügung, entweder um die Genfunktion und -regulation zu untersuchen oder um große Mengen an rekombinantem Protein zu produzieren.
Zellkulturen wurden daher im kommerziellen Maßstab verwendet, um Produkte wie Antikörper, Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine und virale Hüllproteine ​​für die Immunisierung zu synthetisieren Zellen lebender Tiere, um Krankheiten zu behandeln. Das außergewöhnliche Potenzial veränderter DNA-Moleküle besteht darin, neue Lebensformen hervorzubringen, die für das Überleben besser geeignet sind. Eine Änderung der Basensequenz der DNA führt zu einer Änderung des Proteins, das den Krankheitszustand verursacht, der durch Manipulation des Gens korrigiert werden kann. Der Genmanipulation bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Parkinson-Krankheit, lysosomalen Erkrankungen, okulärer Gentherapie und Osteoarthritis wurde viel Aufmerksamkeit geschenkt.
Überblick über Gentransferstrategien:
Der Gentransfer kann im Wesentlichen über drei Wege erreicht werden. Am einfachsten ist der direkte DNA-Transfer, das physikalische Einbringen fremder DNA direkt in die Zelle. Bei kultivierten Zellen kann dies beispielsweise durch Mikroinjektion erfolgen, während bei Zellen in vivo der direkte Transfer oft durch Beschuss mit winzigen DNA-beschichteten Metallpartikeln erreicht wird. Der zweite Weg wird als Transfektion bezeichnet und umfasst eine Reihe von Techniken, einige chemische und einige physikalische, die verwendet werden können, um Zellen dazu zu bringen, DNA aus ihrer Umgebung aufzunehmen. Die dritte besteht darin, die DNA in ein
Tiervirus, da Viren Mechanismen entwickelt haben, um Zellen auf natürliche Weise zu infizieren und ihre eigene Nukleinsäure einzuführen. Der Transfer fremder DNA in eine Zelle auf diesem Weg wird als Transduktion bezeichnet.
Die Wahl der Methoden des DNA-Transfers hängt von den Zielzellen ab, in denen die Transformation durchgeführt wird. Es hängt auch von den Zielen der Genmanipulation ab. Die Transfektion kann entweder stabil oder vorübergehend sein. Obwohl die Wahl des DNA-Transferverfahrens sehr wichtig ist, sind die anderen wichtigen Schritte die Auswahl des Gens, die Isolierung des Gens, die Herstellung rekombinanter DNA und die Auswahl der transformierten Zellen. Ebenso wichtig ist die Regeneration des Organismus mit neuen Eigenschaften. Die Abgabe von Genen in vitro kann durch Behandeln der Zellen mit Viren wie Retrovirus oder Adenovirus, Calciumphosphat, Liposomen, Partikelbombardierung, Injektion von nackter Feinnadel-DNA, Elektroporation oder einer beliebigen Kombination dieser Verfahren erfolgen. Dies sind die leistungsstarken Werkzeuge für die Forschung und haben Anwendungsmöglichkeiten in der Gentherapie.
BEI DER AUSWAHL EINER GENVERABREICHUNGSMETHODE ZU BERÜCKSICHTIGENDE FAKTOREN
Der Fortschritt neuer Technologien hat die Genabgabe sowohl effizienter als auch verwirrender gemacht angesichts der beeindruckenden Palette von Reagenzien und Methoden, die jetzt verfügbar sind. Die Bestimmung des besten Genlieferansatzes für ein bestimmtes Experiment erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung einer Reihe verschiedener Faktoren, wie unten angegeben.
1. Zellulärer Kontext oder Umgebung – Der Kontext oder die Umgebung der Zellen (d. h. in vivo vs. in
vitro vs. ex vivo), an die Nukleinsäuren abgegeben werden, ist der erste zu berücksichtigende Faktor, wenn
Entscheidung über eine Gentransfermethode. Die Hindernisse und Herausforderungen bei der Lieferung an in
vitro-Zellkulturen unterscheiden sich stark von denen von in-vivo- oder ex-vivo-Zellen und erfordern
verschiedene Werkzeuge und Techniken, um sie zu überwinden. Zum Beispiel das Targeting von Nukleinsäuren auf
bestimmte Zellen, während andere Zellen vermieden werden, ist normalerweise ein Hauptanliegen für den In-vivo-Gentransfer
Anwendungen, manchmal ein Problem für Ex-vivo-Anwendungen, aber normalerweise kein Problem für In-vitro
Anwendungen.
Ein weiteres wichtiges Thema, das bei der Planung von In-vivo- (aber nicht In-vitro-) Genen berücksichtigt werden muss
Delivery-Studien ist die Immunogenität des Gentransfersystems. Dies ist besonders wichtig, wenn man die Verwendung bestimmter zuvor diskutierter viraler Vektoren in Betracht zieht, die stark immunogen sein können. Mit der Immunogenität verbunden ist auch die Frage der allgemeinen Sicherheit, sowohl für den Experimentator als auch für den Probanden jeder Studie, die eine Transfektion verwendet. Fast immer erfordert die Verwendung viraler Vektoren sehr umfangreiche Sicherheitsvorkehrungen als die Verwendung synthetischer Transfektionsverfahren.
2. Zell- oder Gewebetyp – Der Ursprung der Zellen oder des Gewebes, in die Nukleinsäuren aufgenommen werden
transferiert ist typischerweise der zweite Parameter, der bei der Auswahl einer Genlieferung berücksichtigt wird
Methode. Die Schwierigkeit der zellulären Nukleinsäureabgabe variiert aus verschiedenen Gründen
von Zelltyp zu Zelltyp. Aus diesem Grund ist es immer wichtig, die Literatur zu überprüfen, um
festzustellen, ob der interessierende Zelltyp zuvor für Gentransferexperimente verwendet wurde,
welche genauen Methoden verwendet wurden und welche Liefereffizienzen erreicht wurden, d. h. was
Prozentsätze der tatsächlich transfizierten oder transduzierten Zellen mit jedem Verfahren.
Bestimmte Zelltypen werden oft als „notorisch schwer zu transfizieren“ beschrieben.
Dazu gehören primäre Zellkulturen vieler Sorten. Erfolgreicher Gentransfer in solche Zellen
erfordert in der Regel viel Forschung, bevor eine bestimmte Genliefermethode ausgewählt wird.
3. Liefereffizienz – Für die meisten Anwendungen Transfektion oder Transduktion von so vielen Zellen wie möglich
möglich wird bevorzugt, insbesondere wenn es notwendig ist, das Vorhandensein von seltenen Transgenen nachzuweisen
Produkte. Daher ist es wichtig, den Grad der Liefereffizienz zu bestimmen, der für eine gegebene
Anwendung, bevor Sie sich für eine bestimmte Gentransfermethode entscheiden. In den meisten Fällen wird festgestellt, dass
virale Vektoren bieten die höchsten Abgabeeffizienzen. Für einige häufig verwendete und leicht transfizierte Zelllinien entsprechen kationische Lipide in ihrer Gentransfereffizienz fast viralen Vektoren und bieten gleichzeitig sicherere und viel schnellere Verfahren.
4. Stabile vs. transiente Genlieferung – Gentransferverfahren werden häufig kategorisiert
, ob das zugeführte Gen vom Chromosom der Wirtszelle getrennt bleibt oder in das Chromosom der Wirtszelle integriert ist. Im ersten Fall, der als transiente Genabgabe bekannt ist, verschwindet die Expression des Transgens typischerweise nach einer bestimmten Zeit – normalerweise innerhalb von
mehrere Tage –, weil der Expressionsvektor entweder abgebaut oder aus der Wirtszelle ausgestoßen wird.
Im zweiten Fall, der als stabiler Gentransport bekannt ist, ist die Expression des übertragenen Gens
verlängert oder stabil, da der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle integriert ist. Offensichtlich,
unterschiedliche Anwendungen erfordern unterschiedliche Zeiträume der Transgenexpression. Also ein vorsichtiges
Vergleich zwischen verschiedenen Gen-Delivery-Methoden ermöglicht eine geeignete Wahl für
Erzeugen des gewünschten transienten oder stabilen Ausdrucks.
Im Fall von viralen Vektoren, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Virus für stabile oder transiente . geeignet ist
Bei der Transduktion geht es einfach darum, die allgemeinen Eigenschaften des Vektors zu lernen. Im Falle
des chemischen oder physikalisch/mechanischen Gentransfers, um festzustellen, ob eine bestimmte Methode
geeignet für vorübergehende vs. stabile Lieferung kann so einfach sein wie das Lesen von Verkaufsliteratur aus dem
Hersteller oder die Überprüfung der primären Forschungsliteratur.
5. Art des gelieferten Moleküls – Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Auswahl einer Genlieferung
Methode ist, welche Art von Nukleinsäure oder einem anderen Molekül transfiziert oder transduziert wird. Zum
Ein Reagens, das Plasmide effizient liefert, kann beispielsweise DNA nicht effizient abgeben
Oligonukleotide. Es ist häufig am einfachsten, einfach die Literatur durchzusehen, um zu erfahren, welche Methoden erfolgreich verwendet wurden, und sich mit anderen Forschern in Verbindung zu setzen, die Erfahrung mit der Bereitstellung des interessierenden Moleküls haben.
6. Zytotoxizität – Ein weiteres Problem, das bei der Auswahl zwischen verschiedenen Genen häufig auftaucht
Abgabemethoden ist die Zytotoxizität der verschiedenen Methoden und Reagenzien. Einige Methoden, wie z
B. Elektroporation und Genkanonen, können für Zellen extrem aggressiv sein und oft zum Tod führen
einer Mehrzahl von Zellen. Außerdem kann das DEAE-Dextran bei einigen Zelltypen ziemlich hart sein, insbesondere
wenn ein DMSO- oder Glycerin-Schockschritt als Teil des Verfahrens verwendet wird. Bei einigen Anwendungen,
wenn eine kleine Anzahl von Transfektanten von einem widerspenstigen Zelltyp benötigt wird, ist dies
kein Problem. In den meisten Anwendungen ist jedoch ein hoher Prozentsatz des Zelltods einfach
inakzeptabel. Die Vielzahl der verfügbaren kationischen Lipide und Polymerreagenzien hat unterschiedliche
Toxizitätsgrade bei verschiedenen Zelltypen und deren Konzentrationen während der Transfektion können
nach Bedarf optimiert, um den Zelltod zu minimieren.
7. Suspension vs. adhärente Zellen – Die am häufigsten transfizierten Zellen wachsen – und sind
transfiziert –, während es an einer Art von Träger befestigt ist, unabhängig davon, ob dieser Träger das Gewebe ist von
von denen sie abgeleitet sind, eine inerte Membran oder ein inertes Gerüst oder die Oberfläche einer Gewebekultur
Teller. Seltener sind Zellen, die wachsen, während sie in einem Medium suspendiert sind, wie z
Blut und andere Körperflüssigkeiten. Suspensionszellen sind im Allgemeinen schwieriger zu transfizieren
Daher kann es notwendig sein, sich auf härtere Methoden zur Genübertragung zu verlassen, wie z
Elektroporation, Genkanonen, Mikroinjektion oder virale Vektoren für akzeptable Transfektionsniveaus.
Einige kationische Lipide können auch Suspensionszellen effektiv transfizieren und sollten ausprobiert werden, wenn
aufgrund ihrer Einfachheit und Wirtschaftlichkeit möglich.
8. Expertise – Der Schwierigkeitsgrad bei der Durchführung der verschiedenen Transfektionstechniken kann
variieren stark, und daher ist das Fachwissen und die Erfahrung des Forschers in der Regel ein
wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Zum Beispiel sind Verfahren wie Mikroinjektions- und virale Transfektionsverfahren ausnahmslos komplexer als kationische Lipide und Polymerreagenzien. Auch von den chemischen Verfahren kann die Calciumphosphat-Copräzipitation aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber geringfügigen Änderungen der experimentellen Bedingungen ziemlich schwierig sein.
9. Zeit – Ein weiterer wichtiger zu berücksichtigender Faktor ist die Zeit, die für die Genabgabe benötigt wird. Viral
Methoden sind zwar sehr effizient, können aber recht zeitaufwendig sein und dauern in der Regel zwischen zwei Wochen und einem Monat. Chemische und physikalisch/mechanische Verfahren hingegen sind in der Regel innerhalb weniger Tage durchführbar, liefern jedoch häufig geringere Transfektionseffizienzen. Daher ist es nicht ungewöhnlich, dass die Vorteile schnellerer Ergebnisse und weniger Arbeitsaufwand gegen den Vorteil einer höheren Effizienz abgewogen werden müssen.
10 Kosten – Schließlich können die Kosten ein wichtiger Faktor bei der Entscheidung für die beste Genübertragung sein
Methode für eine bestimmte Anwendung. Die teuersten Methoden sind in der Regel die
physikalische/mechanische Methoden, wie Elektroporation und Genkanonen, aufgrund der spezialisierten
Ausrüstung, die sie benötigen. Die Übertragung von viralen Genen ist vielleicht die zweitteuerste Methode, da sie die Vektorreagenzien, viel Zeit und Arbeit erfordert, um langwierige Vektorpräparationsverfahren durchzuführen, sowie die ordnungsgemäße Entsorgung viraler Abfallmaterialien.
Die drittteuersten Genabgabeverfahren verwenden Polymere und kationische Lipide, die keine spezielle Ausrüstung oder langwierige Schritte zur Herstellung von viralen Vektoren erfordern. Solche Reagenzien kosten typischerweise Hunderte von Dollar, abhängig von der Anzahl der durchzuführenden Transfektionen. Schließlich verwenden die am wenigsten teuren Verfahren Calciumphosphat, das ein billiges und reichlich vorhandenes Mineral ist, und nackte DNA, die offensichtlich keine Transfektionsreagenzkosten erfordert, aber sehr ineffizient sein kann.
GENTRANSFER-TECHNIKEN
TRANSFORMATION
Transformation ist der natürlich vorkommende Prozess des Gentransfers, der die Absorption des genetischen Materials durch eine Zelle durch die Zellmembran beinhaltet, was die Fusion der fremden DNA mit der nativen DNA bewirkt, was zur genetischen Expression der erhaltenen DNA führt. Die Transformation beinhaltet die Aufnahme von “naked” DNA (DNA, die nicht in Strukturen wie Chromosomen eingebaut ist) durch kompetente Bakterienzellen. Zellen sind nur in einem bestimmten Stadium ihres Lebenszyklus, offenbar vor Abschluss der Zellwandsynthese, kompetent (in der Lage, DNA aufzunehmen).
Transformation ist normalerweise eine natürliche Methode des Gentransfers, aber als Ergebnis des technologischen Fortschritts entstand die künstliche oder induzierte Transformation. Daher gibt es zwei Arten, die als natürliche Transformation und künstliche oder induzierte Transformation bezeichnet werden. Bei der natürlichen Transformation bindet sich die Fremd-DNA an den DNA-Rezeptor der Wirtszelle und gelangt mit Hilfe der Protein-DNA-Translokase in die Wirtszelle. Die Anwesenheit von Nukleasen schränkt den Eintritt von zwei DNA-Strängen ein, zerstört einen einzelnen Strang und ermöglicht so nur einem Strang, in die Wirtszelle einzudringen. Jede DNA, die nicht in das Chromosom integriert ist, wird abgebaut. Diese einzelsträngige DNA vermischt sich erfolgreich mit dem genetischen Material des Wirts.
Die künstliche oder induzierte Transformationsmethode wird unter Laborbedingungen durchgeführt, die entweder ein chemisch vermittelter Gentransfer oder eine Elektroporation ist. Geningenieure sind in der Lage, Kompetenz zu induzieren, indem sie Zellen in bestimmte Lösungen geben, die typischerweise Calciumsalze enthalten. An der Eintrittsstelle zerschneiden Endonukleasen die DNA in Fragmente von 7.000-10.000 Nukleotiden, und die doppelsträngige DNA trennt sich in Einzelstränge. Die einzelsträngige DNA kann im Inneren der Zelle mit dem Chromosom des Wirts rekombinieren. Diese Rekombination ersetzt das Gen im Wirt durch eine Variante des –, wenn auch homologen – Gens.
Nachteile:
DNA aus einer eng verwandten Gattung kann erworben werden, aber im Allgemeinen wird DNA nicht zwischen entfernt verwandten Mikroben ausgetauscht.
Nicht alle Bakterien können kompetent werden.
KONJUGATION
Konjugation ist ein Mittel des Gentransfers bei vielen Bakterienarten. Der Zell-zu-Zell-Kontakt durch ein spezielles Anhängsel, das als F-Pilus (oder Sexpilus) bekannt ist, ermöglicht die Übertragung einer Kopie eines F-Plasmids (Fruchtbarkeitsplasmid) auf eine Zelle, die das Plasmid nicht enthält. In seltenen Fällen kann ein F-Plasmid in das Chromosom seines bakteriellen Wirts integriert werden, wodurch eine sogenannte Hfr-Zelle (Hochfrequenz der Rekombination) entsteht. Eine solche Zelle kann auch die Synthese eines Sexpilus steuern. Wenn sich das Chromosom der Hfr-Zelle repliziert, kann es beginnen, den Pilus zu durchqueren, so dass Plasmid und chromosomale DNA auf die Empfängerzelle übertragen werden. Diese DNA kann mit der ihres neuen Wirts rekombinieren, wodurch neue Genvarianten eingeführt werden. Plasmide, die Gene für Virulenzfaktoren und Antibiotikaresistenz codieren, werden durch Bakterienpopulationen und zwischen mehreren Bakterienarten durch Konjugation weitergegeben.
Im Labor kann Konjugation verwendet werden, um gestörte Gene auf ein selbstübertragbares Plasmid zu übertragen, um einen mutierten Stamm zu entwickeln. Ein interessierendes Gen aus einem E. coli-Empfangsstamm wird in einen selbstübertragbaren Vektor kloniert und in einem Spenderstamm zur genetischen Manipulation gehalten. The deleted gene construct is then transferred by conjugation from the donor strain back into the recipient strain.
TRANSDUCTION
Transduction is another method for transferring genes from one bacterium to another the transfer is mediated by bacteriophages. A bacteriophage infection starts when the virus injects its DNA into a bacterial cell. The bacteriophage DNA may then direct the synthesis of new viral components assembled in the bacterium. Bacteriophage DNA is replicated and then packaged within the phage particles. Early in the infective cycle the phage encodes an enzyme that degrades the DNA of the host cell. Some of these fragments of bacterial DNA are packaged within the bacteriophage particles, taking the place of phage DNA. As the number of phages increases it breaks open (lyse) the cell. When released from the infected cell, a phage that contains bacterial genes can continue to infect a new bacterial cell, transferring the bacterial genes.
Sometimes genes transferred in this manner become integrated into the genome of their new bacterial host by homologous recombination. Such transduced bacteria are not lysed because they do not contain adequate phage DNA for viral synthesis and these phages can enter an alternate life cycle called lysogeny. In this cycle, all the virus’s DNA becomes integrated into the genome of the host bacterium. The integrated phage, called a prophage, can confer new properties to the bacterium.
Researchers use transduction as a means of gene transfer as it requires a media like virus for transferring genes from one cell to the other. Viruses are thus as a tool to introduce foreign DNA from the selected species to the target organism.
There are two types of transduction called as generalized transduction in which any of the bacterial gene is transferred via the bacteriophage to the other bacteria and specialized transduction involves transfer of limited or selected set of genes.
Viral vectors for gene transfer:
The use of viruses as vectors for transduction, i.e. the introduction of genes into animal cells by exploiting the natural ability of the virus particle, within which the transgene is packaged, to adsorb to the surface of the cell and gain entry is being employed . Due to the efficiency with which viruses can deliver their nucleic acid into cells and the high levels of replication
and gene expression it is possible to achieve, viruses have been used as vectors not only for gene expression in cultured cells but also for gene transfer to living animals. Four classes of viral vector have been developed for use in human gene therapy and have reached phase 1 clinical trials. These are the retrovirus, adenovirus, herpesvirus and adenoassociated virus (AAV) vectors . Before introducing the individual vector systems,we discuss some general properties of viral transduction vectors. Transgenes may be incorporated into
viral vectors either by addition to the whole genome or by replacing one or more viral genes. This is generally achieved either by ligation (many viruses have been modified to incorporate unique restriction sites) or homologous recombination.
For many applications, it is favourable to use vectors from which all viral coding sequences have been deleted.These amplicons (also described as ‘gutless vectors’) contain just the cis-acting elements required for packaging and genome replication. The advantage of such vectors is their high capacity for foreign DNA and the fact that, since no viral gene products are made, the vector has no intrinsic cytotoxic effects. The choice of vector depends on the particular properties of the virus and the intended host, whether transient or stable expression is required and how much DNA needs to be packaged. For example, icosahedral viruses such as adenoviruses and retroviruses package their genomes into preformed capsids, whose volume defines the maximum amount of foreign DNA that can be accommodated. Conversely, rod-shaped viruses such as the baculoviruses form the capsid around the genome, so there are no such size constraints. There is no ideal virus for gene transfer ‘ each has its own advantages and disadvantages. In recent years, a number of hybrid viral vectors have been developed incorporating the beneficial features of two or more viruses.
Vorteile:
1) viral vectors that especially efficient at transducing the intended cell type but not other cell types.
2) retroviruses are particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
Limitations:
1) cannot deliver genes to terminally differentiated cells
2) viral vectors may be highly immunogenic
TRANSFECTION BY CHEMICAL METHODS
One of the methods of gene transfer where the genetic material is deliberately introduced into the animal cell in view of studying various functions of proteins and the gene is transfection. This mode of gene transfer involves creation of pores on the cell membrane enabling the cell to receive the foreign genetic material. When transformation is carried out in eukaryotic cells it is termed as transfection.
1) Calcium phosphate mediated DNA transfer
The process involves a mixture of isolated DNA (10-100ug) with solution of
calcium chloride and potassium phosphate. . When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface .Cells are then incubated with precipitated DNA either in solution or in tissue culture dish. A fraction of cells will take up the calcium phosphate DNA precipitate by a process not entirely understood but thought to be endocytosis.
Transfection efficiencies using calcium phosphate can be quite low, in the range of 1-2 % . Es kann
be increased if very high purity DNA is used and the precipitate allowed to form slowly.
Einschränkungen
1. Frequency is very low.
2. Integrated genes undergo substantial modification.
3. Many cells do not like having the solid precipitate adhering to them
and the surface of their culture vessel.
4. Integration with host cell chromosome is random.
5, Due to above limitations transfection applied to somatic gene therapy
ist begrenzt.
Anwendungen:
This technique is used for introducing DNA into mammalian cells. This process has been a preferred method of identifying many oncogenes.
2)DNA transfer by DAE-Dextran method:
DNA can be transferred with the help of DAE Dextran also. DAE-Dextran may be used in the
transfection medium in which DNA is present. This is a polycationic, high molecular weight substance and is convenient for transient assays. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis.
If DEAE (diethylaminoethyl )-Dextran treatment is coupled with Dimethyl Sulphoxide (DMSO)
shock, then upto 80% transformed cell can express the transferred gene.
Vorteile:
The advantage of this method is that, it is cheap, simple and can be used for transient cells
which cannot survive even short exposure of calcium phosphate.
The major advantages of the technique are its relative simplicity and speed, limited expense, and remarkably reproducible interexperimental and intraexperimental transfection efficiency.
Limitations:
Disadvantages include inhibition of cell growth and induction of heterogeneous morphological changes in cells.
Furthermore, the concentration of serum in the culture medium must be transiently reduced during the transfection.
It does not appear to be efficient for the production of stable transfectants.
For cells that grow in suspension, electroporation or lipofection is usually preferred, although DEAE-dextran-mediated transfection can be used.
Transfer of DNA by polycation-DMSO:
As calcium phosphate method of DNA transfer is reproducible and efficient but there is narrow range of optimum conditions. DNA transfer by
Another polycationic chemical,the detergent Polybrene is carried out to increase the adsorption of DNA to the cell surface followed by a brief treatment with 25-30% DMSO to increase membrane permeability and enhance uptake of DNA. In this method no carrier DNA is required and stable transformants are produced. This method works with mouse fibroblast and chick embryo.
LIPOSOME MEDIATED GENE TRANSFER
Liposomes are spheres of lipids which can be used to transport molecules into the cells. These are artificial vesicles that can act as delivery agents for exogenous materials including transgenes. They are considered as spheres of lipid bilayers surrounding the molecule to be transported and promote transport after fusing with the cell membrane.
Liposomes for use as gene transfer vehicles are prepared by adding an appropriate mix of bilayer constituents to an aqueous solution of DNA molecules. In this aqueous environment, phospholipid hydrophilic heads associate with water while hydrophobic tails self-associate to exclude water from within the lipid bilayer. This self-organizing process creates discrete spheres of continuous lipid bilayer membrane enveloping a small quantity of DNA solution. The liposomes are then ready to be added to target cells. Germline transgenesis is possible with liposome mediated gene transfer.Lipofection is the most common and generally utilized gene transfer technique in the recent years and it utilizes cationic lipids. The combined DNA and cationic lipids act instantaneously to form structures called as lipoplexes that are more complex in structure than the simple liposomes. Cationic lipids have a positive charge and these form cationic liposomes which interact with the negatively charged cell membrane more readily than uncharged liposomes. This leads to a fusion between cationic liposome and the cell surface resulting in quick entry by endocytosis and the delivery of the DNA directly across the plasma membrane. Cationic liposomes can be produced from a number of cationic lipids that are commercially available and sold as an in vitro-transfecting agent, termed lipofectin.
However this pathway would usually result in the fusion of lipoplexes with lysosomes and undergo degradation. This problem is overcome by utilizing the neutral helper lipids, which are generally included along with the cationic lipid. This allows entrapped DNA to escape the endosomes, reach the nucleus and get access to the cell’s transcriptional machinery.The endosomal structure is destroyed by increasing the osmotic pressure created by the lipids’ buffering action within the endosomes and by the fusion of the lipid with the endosomal membrane. The ability of a lipid to destroy endosomes is one of the main characteristics of a transfection reagent.
Vorteile
1. Simplicity.
2. Long term stability.
3. Low toxicity.
4. Protection of nucleic acid from degradation.
5. particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
6. cationic lipids effectively transfect suspension cells.
Limitations:
1) Cannot deliver genes to terminally differentiated cells
ELECTROPORATION
A rapid and simple technique for introducing genes into a wide variety of microbial, plant and animal cells, including E. coli, is electroporation. Electroporation uses electrical pulse to produce transient pores in the plasma membrane thereby allowing macromolecules into the cells. These pores are known as electropores which allow the molecules, ions and water to pass from one side of the membrane to another. The electropores reseal spontaneously and the cell can recover. The pores can be recovered only if a suitable electric pulse is applied .The formation of electropores depends upon the cells that are used and the amplitude and duration of the electric pulse that is applied to them. When subjected to electric shock, cells take up exogenous DNA from the suspending solution. Once inside the cell, the DNA is integrated and the foreign gene will express. A proportion of these cells become stably transformed and can be selected if a suitable marker gene is carried on the transforming DNA. The most critical parameters are the intensity and duration of the electric pulse, and these must be determined empirically for different cell types. Electric currents can lead to dramatic heating of the cells that can results in cell death. Heating effects are minimized by using relatively high amplitude, a short duration pulse or by using two very short duration pulses. However, once optimal electroporation parameters have been established, the method is simple to carry out and highly reproducible.
Many different factors affect the efficiency of electroporation, including temperature,
various electric-field parameters (voltage, resistance and capacitance), topological form of the DNA,
and various host-cell factors (genetic background, growth conditions) and post-pulse treatment.
General applications of electroporation.
1. Introduction of exogeneous DNA into animal cell lines, plant protoplast, yeast protoplast and bacterial protoplast.
2. Electroporation can be used to increase efficiency of transformation or transfection of bacterial cells.
3. Wheat, rice, maize, tobacco have been stably transformed with frequency upto 1% by this method.
4. Genes encoding selectable marker may be used to introduce genes using electroporation.
5. To study the transient expression of molecular constructs.
6. Electroporation of early embryo may result in the production of transgenic animals.
7. Hepatocytes, epidermal cells, haematopoietic stem cells, fibroblast, mouse T and B lymphocytes can be transformed by this technique.
8. Naked DNA may be used for gene therapy by applying electroporation device on animal cells.
Advantages of electroporation.
1. Method is fast.
2. Less costly.
3. Applied for a number of cell types.
4. Simultaneously a large number of cell can be treated.
5. High percentage of stable transformants can be produced.
DRAWBACKs
1)Limited effective range of

1 cm between the electrodes.
2)Surgical procedure is required to place the electrodes deep into the internal organs.
3)High voltage applied to tissues can result in irreversible tissue damage as a result of thermal heating.
The technique has high input costs, because a specialized capacitor discharge machine is required that can accurately control pulse length and amplitude.
4) Larger numbers of cells may be required than for other methods because, in many cases, the most efficient electroporation occurs when there is up to 50% cell death.
ULTRASONICATION
Sonication is the act of applying sound energy to agitate particles in a sample. Ultrasonic frequencies (>20 kHz) are usually used, leading to the process also being known as ultrasonication . Sonoporation, or cellular sonication, is the use of these ultrasonic frequencies for modifying the permeability of the cell plasma membrane. This technique is usually used in molecular biology and non-viral gene therapy in order to allow uptake of large molecules such as DNA into the cell, in a cell disruption process called transfection or transformation. Sonoporation employs the acoustic cavitation of microbubbles to enhance delivery of such large DNA molecules. Although the early results could achieve only 10- to 30-fold increases in transfection efficiency in vitro, technical refinements have lead to enhancements of up to several thousand fold in vitro ,sufficient to encourage ultrasonication mediated gene transfer in vivo.
Vorteile:
1) It is non-invasive and well tolerated,
2)extraordinary safety record over a wide range of frequency and intensity
3)high levels of public acceptability and understanding.
there are highly sophisticated, flexible, cost-effective and readily available diagnostic and therapeutic systems that can achieve site-specific transfer of ultrasound energy almost anywhere in the body, except perhaps the lung.
4) The bioactivity of this technique is similar to, and in some cases found superior to, electroporation.
5) in vivo is relatively nontoxic.
Limitations:
1)Extended exposure to low-frequency (<MHz) ultrasound has been demonstrated to result in complete cellular death (rupturing) as well as microvascular hemorrhage and disruption of tissue structure, thus cellular viability must also be accounted for when employing this technique.
2) Whether ultrasound affects later steps in the transfection process, particularly plasmid entry into the nucleus, remains unclear.
Anwendungen:
Sonoporation is under active study for the introduction of foreign genes in tissue culture cells, especially mammalian cells. Sonoporation is also being studied for use in targetedGene therapy in vivo, in a medical treatment scenario whereby a patient is given modified DNA, and an ultrasonic transducer might target this modified DNA into specific regions of the patient’s body.
MICROINJECTION
In microinjection DNA can be introduced into cells or protoplast with the help of very fine needles or
glass micropipettes having the diameter of 0.5 to 10 micrometer. The DNA may be directly delivered into the nucleus or in the cytoplasm. Some of the DNA injected may be taken up by the nucleus. The desired gene in the form of plasmid or alone is injected directly into the plant protoplast.
Injection into the nucleus is more efficient than that into the cytoplasm. Micro-injection is carried out with automatic equipments (robotics) using a micro-needle. Computerized control of holding pipette, needle, microscope stage and video technology has improved the efficiency of this technique.
Advantages of microinjection.
1. Frequency of stable integration of DNA is far better as compare to other methods.
2. Method is effective in transforming primary cells as well as cells in established cultures.
3. The DNA injected in this process is subjected to less extensive modifications.
4. Mere precise integration of recombinant gene in limited copy number can be obtained.
Einschränkungen
1. Costly.
2. Skilled personal required.
3.Has not been successful for many plant cells .
4. Embryonic cells preferred for manipulation.
5. Knowledge of mating timing, oocyte recovery is essential.
6. Method is useful for protoplasts and not for the walled cells.
7. Process causes random integration.
8. Rearrangement or deletion of host DNA adjacent to site of integration are common.
9. The technique is laborious, technically difficult, and limited to the number of cells actually injected.
Applications of microinjection.
1. Process is applicable for plant cell as well as animal cell but more common for animal cells.
2. Technique is ideally useful for producing transgenic animal quickly.
3. Procedure is important for gene transfer to embryonic cells.
4. Applied to inject DNA into plant nuclei.
5. Method has been successfully used with cells and protoplast of
tobacco, alfalfa etc.
Fig: microinjection in mouse egg.
BIOLISTICS
(MICROPROJECTILE/GENE GUN)
Biolistics or particle bombardment is a physical method that uses accelerated microprojectiles to
deliver DNA or other molecules into intact tissues and cells. Biolistics transformation is relatively new and novel method amongst the physical methods for artificial transfer of exogenous DNA. The nucleic acid is delivered through membrane penetration at a high velocity, usually connected to microprojectiles like microscopic particles of tungsten or gold coated into cells using an electrostatic pulse, air pressure, or gunpowder percussion. As the particles pass through the cell, the DNA becomes free to integrate into the plant-cell genome.
The gene gun is a device that literally fires DNA into target cells . The DNA to be transformed
into the cells is coated onto microscopic beads made of either gold or tungsten. Beads are carefully
coated with DNA. The coated beads are then attached to the end of the plastic bullet and loaded into
the firing chamber of the gene gun. An explosive force fires the bullet down the barrel of the gun
towards the target cells that lie just beyond the end of the barrel. When the bullet reaches the end of
the barrel it is caught and stopped, but the DNA coated beads continue on toward the target cells.
Some of the beads pass through the cell wall into the cytoplasm of the target cells. Here the bead and
the DNA dissociate and the cells become transformed. Once inside the target cells, the DNA is
solubilised and may be expressed.
Applications
1. Biolistics technique has been used successfully to transform soyabean,
cotton, spruce, sugarcane, papaya, corn, sunflower, rice, maize, wheat,
tobacco etc.
2. Genomes of subcellular organelles have been accessible to genetic
manipulation by biolistic method.
3. Mitochondria of plants and chloroplast of chlamydomonas have been
transformed.
4. Method can be applied to filamentous fungi and yeast (mitochondria).
5. The particle gun has also been used with pollen, early stage
embryoids, meristems somatic embryos, plant cells, root section, seeds and pollen.
6. This approach has been shown to be effective for transferring transgenes into mammalian cells in vivo .
Vorteile
1. Requirement of protoplast can be avoided. Unlike electroporation and microinjection, this technique does not require protoplasts or even single-cell isolations and is applicable to even intact plant tissue
2. Walled intact cells can be penetrated.
3. Manipulation of genome of subcellular organelles can be achieved.
4. This is also a highly mechanized or robotic mediated technique in which the
speed of the micro-projectile particles is controlled by foolproof mechanisms
5) It is also gaining in use as a method for transferring DNA construct into whole animals.
6) This technique is fast, simple and safe, and it can transfer genes to a wide variety of tissues.
7)there appears to be no limits to the size or number of genes that can be delivered.
Einschränkungen
1. Integration is random.
2. Requirement of equipments.
3.It can be a challenge to obtain a sufficient number of cells modified by this method to see a biologically significant effect.
MICROLASER
A new technique is presented to incorporate exogeneous gene materials (DNA) into cells with a microbeam irradiation from an uv pulsed laser. A frequency-multiplied Laser, 355 m wavelength, 5 ns pulse duration, punches a self-healing hole of submicrometer aperture in cell membrane under selected irradiation conditions. At the site of the beam impact, due probably to local temperature changes, the cell membrane modifies its permeability. As a consequence of the hit, circular areas, whose radius may be apparently regulated by changing the irradiation time and/or the radiation intensity (energy), appear on the wall, last for a short time and fade spontaneously . It takes a fraction of a second for the aperture to close, long enough to allow the foreign DNA, contained in the medium, to slip into the cell.
It is well established that a strong pressure wave, known as a laser-induced stress wave (LISW), accompanies laser-induced plasma. We have extended their method to deliver macromolecules, such as genes. Plasmid DNA (circular DNA residing in bacterial cytoplasm) is used as a vector of the gene of interest. We inject the plasmid into target tissue, on which a laser target is placed, and subject the target to irradiation with a high-intensity, nanosecond laser pulse to induce plasma and hence an LISW. By placing optically transparent material on the target, the plasma is confined, resulting in an increase in the LISW’s impulse. Interaction of tissue cells with the LISW allows plasmid to enter the cytoplasm
Vorteile
1) it only takes advantage of the presence of phenol-red, a normal cell medium component, with no need of addition of extraneous substances
(2) it is a very mild treatment virtually suitable for any cell type and
(3) it allows transfection of selected cells even in the presence of cells of different type (providing that they are morphologically distinguishable).
4) . it is rapidly replacing virus mediated techniques as they have serious side effects caused by immune response and limited targeting characteristics rendering them inappropriate for clinical application
5) The method offers a clear advantage over existing methods: increases the success rate of DNA transfection as well as the efficiency of cell modification by orders of magnitude.
6) . It enables minimally invasive tissue interaction.
FAZIT
Thus there are a number of ways by which the genes can be introduced into the cells. With the advent of molecular tools and technologies it is now comparatively easy to introduce gene into cells without losing its integrity and biological activity. Moreover the recent development in molecular biology has made the transfer of gene with great accuracy to the target cell. The transfer of gene through different gene transfer technologies has cured a number of diseases. Research is on progress to cure those diseases which cannot be cured by using drugs. Moreover the treatment of diseases by gene transfer provides better result for a prolong period of time. It is the need of hour to discover new and cheap method of gene transfer technologies so to make the treatment of the diseases a little easier and affordable. Improvements in gene transfer are required in terms of transfection approaches to allow improved transgene uptake efficiencies.
REFERENCES
1)Society of Applied Sciences.
Gene Transfer Technologies and their Applications: K.H.KHAN
Medical Biotechnology Division, School of Biosciences and Technology,
VIT University, Vellore-632014, Tamil Nadu, India.
2)Principles of gene manipulation: R.W.Old ,S.B. Primrose and R.M.Twymann ‘ sixth edition,chapter 10 and 11.
3) BIOTECHNOLOGY 2020-From the Transparent Cell to
the Custom-Designed Process–Prof. Gerhard Kreysa Dr.-Ing. E.h. Dr.h.c. & Dr. R??diger Marquardt
4) INTRODUCTION TOBIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING
-A.J. NAIR, PH.D.
5)From genes to genomes- concepts and applications of DNA technology–Jeremy W Dale, Malcom von Schantz
6) http://www.nature.com
7)www.learner.org

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Heat shock vs electroporation - Biology

Article Summary:

Definition:-
Elektroporation ist das Verfahren der Biotechnologie, bei dem der elektrische Strom durch die lebende Oberfläche, beispielsweise eine Zelle oder ein Molekül, geleitet wird. Dadurch entstehen Poren in der Oberfläche der lebenden Struktur und biologisches Material kann diese leicht passieren. Dieses Verfahren wird üblicherweise verwendet, um die Viren oder Plasmide in Form von Vektoren oder Plasmiden durch Poren in der Zellmembran in die Zelle einzubringen.

Was ist Elektroporation:-
Die Technik der Elektroporation wird hauptsächlich im Bereich der Molekularbiologie verwendet. Wenn diese Technik auf eine beliebige Zelle angewendet wird, indem elektrischer Strom von einer externen Quelle verwendet wird, wird die Zellmembran durchlässiger, sodass Fremdkörper in sie eindringen können. Wenn die Wissenschaftler eine molekulare Sonde, ein kleines DNA-Stück oder irgendein Medikament einführen müssen, das die Funktion der Zelle verändern kann, wenden sie diese Technik an.

Es ist nicht einfach, Poren in die Zellmembran zu bringen, bis sie einem geeigneten elektrischen Feld ausgesetzt wird, das es der Plasmamembran ermöglichen kann, ihre dielektrische Stärke zu überschreiten. Wenn das gesamte Experiment gut kontrolliert wird, können sich die Poren der Plasmamembran nach einiger Zeit wieder verschließen, aber während dieser Zeit können die Moleküle oder Fremdkörper in das Zytoplasma der Zelle eindringen. Es ist schädlich für die Zelle, wenn sie über einen längeren Zeitraum dem elektrischen Strom ausgesetzt ist. Es führt zum Zelltod oder zur Apoptose.

Das Verfahren der Elektroporation wird hauptsächlich für die Transformation von Bakterien, Pflanzenprotoplasten und Hefen verwendet. Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan und seinen Derivaten. Es hat von Natur aus Poren in seiner Zellwand. Wenn die Plasmide also in die Bakterienzelle eindringen müssen, wird zu diesem Zweck eine kleine Menge elektrischen Stroms verwendet, nur um das Plasmid in die Bakterienzelle eindringen zu lassen. Der gesamte Prozess sollte gut kontrolliert werden, damit beobachtet werden kann, dass sich die Bakterienzellen in neue Tochterzellen teilen können, die die Plasmide enthalten. Dieses Verfahren ist effektiver als die chemische Elektroporation. Dieses Verfahren kann auch für die Gewebekulturzellen verwendet werden, um die Fremdgene hauptsächlich in die Säugerzellen einzubringen.

Wie funktioniert der Prozess der Elektroporation?
Zur Durchführung des Elektroporationsprozesses werden spezielle Arten von Geräten verwendet, die als Elektroporatoren bezeichnet werden. Dieses Gerät wird durch die Lösung der Zelle geleitet, die normalerweise Bakterien enthält, aber auch andere Rufarten können zu diesem Zweck verwendet werden. Die Zelllösung wird in die Glas- oder Kunststoffküvette gegeben. Eine Glas- oder Kunststoffküvette ist ein kleines rundes Röhrchen, das speziell dafür entwickelt wurde, die Proben für spektroskopische Experimente aufzubewahren. Es enthält zwei Aluminiumelektroden, eine auf jeder Seite. Wenn die Bakterienzelle bei der Elektroporation verwendet wird, muss die verwendete Suspension 50 Mikroliter betragen. Plasmide werden vor Beginn des Prozesses in die Suspension eingebracht und die gesamte Suspension in die Glasküvette eingebracht. Die Spannung wird in den Elektroporatoren auf 240 Volt eingestellt und die Küvette wird in den Elektroporator eingesetzt. Vor der Inkubation wird 1 Milliliter Flüssigmedium in die Küvette gegeben und dann die Inkubation gestartet. Nach einer Stunde Inkubation wird die gesamte Lösung auf das Agarosegel gegeben. Wenn die Plasmidlösung rein ist, besteht die Möglichkeit, bessere Ergebnisse des Experiments zu erzielen, da sonst Bakterienzellen aufgrund der Überexplosion absterben und der Prozess möglicherweise erneut gestartet wird.

Anwendungen:-
Elektroporationsverfahren Elektroporation ist im medizinischen Bereich anwendbar, um Krebs und Herzkrankheiten zu behandeln, indem neue Gene in die Krebszelle eingefügt werden. Einige andere Krankheiten können auch mit Hilfe der Elektroporation geheilt werden, bei denen eine Gewebeentfernung erforderlich ist.

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Prinzip

Transformation process allows a bacterium to take up genes from its surrounding environment that is transformation involves the direct uptakes of fragments of DNA by a recipient cell and the acquisition of new genetic characteristics. There are two major parameters involved in efficiently transforming a bacterial organism. The first is the method used to induce competence for transformation. The second major parameter is the genetic constitution of the host strain of the organism being transformed. Competent cells are capable of uptaking DNA from their environment and expressing DNA as functional proteins. If a bacterium is said to be competent, it has to maintain a physiological state in which it can take up the donor DNA. Calcium chloride treatment is one of the best methods for the preparation of competent cells. Competence results from alterations in the cell wall that makes it permeable to large DNA molecules. This is a naturally occurring process and through this bacteria can transfer advantageous characteristics, such as antibiotic resistance. Bacteria can take DNA from the environment in the form of plasmid. Most of them are double stranded circular DNA molecules and many can exist at very high copy numbers within a single bacterial cell. Many naturally occurring plasmids carry an antibiotic resistant gene referred to as a marker.

In the process of transformation, the competent cells are incubated with DNA in ice. Then it is placed in a water bath at 42ºC and further plunging them in ice. This process will take up the DNA into the bacterial cell. Then it is plated in an agar plate containing appropriate antibiotic. The presence of an antibiotic marker on the plasmid allows for rapid screening of successful transformants. Blue &ndashwhite selection (Alpha complementation) can be used to determine which plasmids carry an inserted fragment of DNA and which do not. These plasmids contain an additional gene (lac Z) that encodes for a portion of the enzyme &beta &ndash galactosidase. When it transformed into an appropriate host, one containing the gene for the remaining portion of &beta &ndashgalactosidase, the intact enzyme can be produced and these bacteria form blue colonies in the presence of X &ndash gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) and a gratuitous inducer called IPTG (Isopropyl &beta-D- Thiogalactopyronoside). These plasmids contains a number of cloning sites within the lac Z gene, and any insertion of foreign DNA into this region results in the loss of the ability to form active &beta &ndashgalactosidase. Therefore colonies that carry the plasmid with the insert, ie, Transformants will remain white and the colonies without the foreign DNA (Non-Transformants) will remain Blue. We can also calculate the efficiency of transformation by using the concentration of DNA and number of transformed colonies.