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17: Gram-Färbung - Biologie

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Ziele

  • Werden Sie geübt darin, die Grammfärbung konsequent und genau durchzuführen.
  • Unterscheiden Sie zwischen verschiedenen Formen, Größen, Anordnungen und Grammreaktionen von Bakterien.

Die Gramfärbung, ursprünglich 1884 von Christian Gram entwickelt, ist das wohl wichtigste Verfahren der gesamten Mikrobiologie. Gram verwendete tatsächlich Farbstoffe für menschliche Zellen und stellte fest, dass Bakterien vorzugsweise einige Farbstoffe binden. Die Gram-Färbung ist eine differentielle Färbung, im Gegensatz zur einfachen Färbung, die 1 Farbstoff verwendet. Durch die Verwendung von 2 Farbstoffen ist dieses Verfahren a Differential verfärben, werden Bakterien während des Verfahrens entweder violett/blau oder rosa.

Vor dem Färben muss das Präparat wie zuvor bei der einfachen Färbetechnik auf den Objektträgern montiert und fixiert werden. Aufgrund der 2 bei dem Verfahren verwendeten Farbstoffe – Kristallviolett und Safrinin – sowie des Entfärbers Aceton-Alkohol werden Bakterien aufgrund ihrer Gramm-Reaktivität in 2 Gruppen eingeteilt. Gram-positive Bakterien behalten das Kristallviolett auch während des Entfärbeschritts: Gram-negative Bakterien behalten das Kristallviolett nicht, werden entfärbt und nehmen dann den Safrininfarbstoff auf. Sowohl Gram + als auch – binden an das Kristallviolett: Der Schlüsselschritt zu ihrer Differenzierung ist die Entfärbung.

Sehen Sie sich das beiliegende Diagramm des Färbeverfahrens und seiner Auswirkungen auf die Bakterienfarbe an. Während des Kristallviolett-Jod-Schritts werden die gebundenen Moleküle innerhalb des Peptidoglykans der Gram + Zellwand und innerhalb der Membran fest gehalten. Der Aceton-Alkohol bewirkt tatsächlich, dass die Peptidoglycan-Moleküle (in einem Gitterwerk angeordnet) schrumpfen, wodurch das Kristallviolettiod noch fester gehalten wird. In der Gramm-Zelle wird die äußere Lipopolysaccharidschicht der Wand durch die Entfärbungsmittel aufgelöst, und da die Peptidoglycanschicht bei dieser Bakteriengruppe so dünn ist, wird das Kristallviolett aus der Wand ausgewaschen.

Obwohl bei dieser Färbung eine Standardroutine und festgelegte Reagenzien verwendet werden, muss jede Person eine bestimmte Methode finden, die für sie am besten geeignet ist. Die vielen Variablen, die diese Färbung beeinflussen können, sind das Alter der Kultur, die Menge des verwendeten Entfärbungsmittels, der Zeitpunkt der Entfärbung, die Art des Organismus (säurefeste Bakterien und Sporen färben nicht gut), die Dicke des Ausstrichs und die allgemeine Pflege des Färbers.

Die häufigsten Gründe für falsche Gramm-Reaktionen?

  • Einige Bakterienarten neigen zu Gramm-Variablen und zeigen beide Farben, obwohl am häufigsten Gramm +.
  • Überentfärbung des Abstrichs, zu lange Zeit.
  • Mit alten Kulturen (vorzugsweise sollten die Kulturen 18-48 Stunden alt sein).

Notiz

  • Achten Sie darauf, dass Ihr Abstrich nicht zu dick ist: Andernfalls können die Farbstoffe entweder nicht eindringen oder die Zellen werden nicht ausreichend entfärbt.
  • Stellen Sie sicher, dass Sie den Entfärbungsschritt richtig planen.
  • Den Ausstrich gleichmäßig mit Entfärbungsmittel überfluten.

BENÖTIGTE MATERIALIEN

  • Gramnegative Kontrolle: E coli Kultur
  • Grampositive Kontrolle: Bacillus subtilus Kultur
  • vorbereitete, gekaufte Objektträger von verschiedenen gramgefärbten Bakterien
  • Farbstoffe
  • Färben Fleck Wanne
  • Drahtauflage für Wanne
  • saubere Objektträger
  • Immersionsöl
  • Löschpapier

DAS VERFAHREN: individuell gemacht

  1. Wir haben Kulturen von E coli und Bazillus für Sie Gramm-Färbung. Dadurch erhalten Sie Gramm + und Gramm - Kontrollen, mit denen Sie Ihr Verfahren überprüfen können. Sie können 2 Objektträger verwenden, 1 für jedes Bakterium, oder Sie können einen Objektträger in zwei Hälften teilen und jedes Bakterium auf dem geteilten Objektträger ausstreichen. Es gibt auch vorbereitete, gram-gefärbte Objektträger von Bakterien verschiedener Formen und Größen von Bakterien, die man sich ansehen kann.
  2. Machen Sie den Bakterienabstrich aus Brühe, Schräge oder Platte.
    • Wenn aus einer Brühe genommen, verwenden Sie 1-2 Schleifen der Brühelösung.
    • Bei Entnahme aus einem festen Agarmedium (Platte oder Schrägagar) das Inokulum in einem Tropfen Wasser auf dem Objektträger aufhängen und gut mischen.
    • Verteilen Sie die Suspension auf dem Objektträger so, dass sie eine Fläche von mindestens der Größe eines Nickels bedeckt, vorzugsweise ein Viertel.
    • Sie könnten darüber nachdenken, den Abstrichbereich mit einer umlaufenden Wachsstiftmarkierung zu markieren, damit Sie den Abstrich unter dem Mikroskop leicht finden können.
    • Legen Sie ein Stück Klebeband auf die Seite des Abstrichs, damit Sie wissen, in welche Richtung OBEN ist.
  3. Lassen Sie den Objektträger vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie mit dem Verfahren fortfahren.
  4. Fixieren Sie den Objektträger heiß, indem Sie den Objektträger mit den Fingern an einem Ende festhalten und ihn einige Male schnell über der Flamme hin und her bewegen.
  5. Führen Sie das Färbeverfahren wie unten beschrieben durch.

Das STAIN-Verfahren

  • Legen Sie den Objektträger auf die Drahtgitterauflage auf der Färbewanne.
  • Den Ausstrich mit Kristallvioletttropfen überfluten und 1 Minute einwirken lassen. GUT mit Wasser waschen.
  • Den Abstrich mit Tropfen Gram's Jod überfluten und 1 Minute einwirken lassen. GUT mit Wasser waschen.
  • Aceton-Alkohol schnell auf den Objektträger fluten und innerhalb von 5-10 Sekunden abwaschen (ab Beginn der Zugabe von Entfärber). GUT mit Wasser waschen.
  • Den Abstrich mit Safrinintropfen überfluten und 1 Minute einwirken lassen. GUT mit Wasser waschen.
  • Mit saugfähigem Papier trocken tupfen, bevor es zur Betrachtung auf den Mikroskoptisch gelegt wird.
  1. Konzentrieren Sie sich auf den Abstrich mit einer Linse mit geringer Leistung, die bei einer 100-fachen Ölimmersion endet. Stellen Sie sicher, dass sich ein Tropfen Öl auf dem Objektträger befindet, bevor Sie Ihr 100X-Objektiv in Position drehen.
  2. Interpretieren Sie die Ergebnisse mit dem folgenden Protokoll.

Interpretation

  • Gram-positive Bakterien sind blau/violett/violett
  • Gram-negative Bakterien werden hellrosa
  1. Identifizieren Sie die verschiedenen Formen und Anordnungen von Bakterien.
  2. REINIGEN SIE IHRE DIAs mit dem Slide-Reiniger an den Waschbecken.
  3. Schauen Sie sich die vorbereiteten Objektträger verschiedener Bakterien an. Sie werden verschiedene Formen und Anordnungen sehen. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in die Tabletts auf der Bank zurück.

Verschiedene Bakterien-Objektträger

FRAGEN

  1. Kritik an Ihrer Gram-Färbungstechnik:
    • Sind die Zellen gut auf dem Objektträger verteilt?
    • Sind die Zellen einheitlich gefärbt und stimmt die Gram-Reaktion?
    • Ist die Anordnung des Bakteriums über die verschiedenen Sichtfelder hinweg konsistent?
  2. Was sind die Grammreaktion, Form und Anordnung von Bazillus?
  3. Was sind die Grammreaktion, Form und Anordnung von E coli?
  4. Welche Farbe ist E coli wenn Gramm gefärbt? Benennen Sie den Farbstoff, der ihm diese Farbe verleiht.
  5. An welche Zellstruktur binden die 2 Farbstoffe?
  6. Nennen Sie mindestens 3 Unterschiede zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien.
  7. Wäre es sinnvoll, eine Gram-Färbung an einer Mischkultur durchzuführen? Wieso den?
  8. Wenn Ihnen eine Gram-Färbung wertvolle Informationen über die Eigenschaften des Bakteriums liefert, was wäre dann der Vorteil einer einfachen Färbung?

Experiment zur Durchführung einer Gram-Färbung von Bakterien (mit Abbildung)

Die wichtigste Differenzfärbung in der Mikrobiologie ist die Gram-Färbung.

Es ist nach Dr. Christian Gram benannt, der Bakterien aufgrund der Unterschiede in der Zusammensetzung ihrer Zellwand in zwei Gruppen unterteilt hat:

(1) Gram-positive Bakterien:

Nach der Färbung eines Bakteriums mit Kristallviolett, wenn seine Zellwand der Entfärbung durch Waschen mit einem Entfärbungsmittel (Ethanol oder Aceton) widersteht, handelt es sich um ein grampositives Bakterium. Beispiele: Bacillus, Staphylococcus.

(2) Gram-negative Bakterien:

Nach der Färbung eines Bakteriums mit Kristallviolett, wenn seine Zellwand durch Waschen mit einem Entfärbungsmittel (Ethanol oder Aceton) entfärbt werden kann, handelt es sich um ein gramnegatives Bakterium. Beispiele: Escherichia, Salmonellen, Vibrio.

Die Unterscheidung von Bakterien in grampositive und gramnegative Gruppen liefert den wichtigsten Anhaltspunkt, um bei der Identifizierung unbekannter Bakterien in die richtige Richtung vorzugehen. Es ist auch nützlich für die einfache Unterscheidung von Bakterien in grampositive und gramnegative Gruppen. Es gibt auch eine Vorstellung von der Form und Anordnung der Bakterienzellen.

Prinzip:

Bei der Gram-Färbung werden die Bakterienzellen zunächst mit einer Primärfärbung, Kristallviolett, gefärbt, die in die Zellen eindringt und sie lila-blau färbt. Dann werden die Zellen mit einem Beizmittel, Grammjod, behandelt, das in die Zellen eindringt und an den Primärfarbstoff bindet und einen unlöslichen Farbstoff-Beizmittel-Komplex (Kristallviolett-Jod-Komplex) bildet, wodurch das Entweichen des Farbstoffs erschwert wird.

Anschließend werden die Zellen mit einem Entfärbungsmittel wie Ethanol oder Aceton behandelt. Es wirkt als Lipidlösungsmittel und als proteinentziehendes Mittel. In grampositiven Zellen wirkt das Entfärbungsmittel zunächst als Lipidlösungsmittel, das die geringe Menge an Lipid in der Zellwand herauslöst und dabei winzige Poren bildet. Anschließend entwässert es die Zellwandproteine ​​(Peptide), die die Poren verschließen.

Nun ist der Beizmittelkomplex durch das Entfärbemittel schwer zu entfernen und die Zellen behalten die violett-blaue Farbe der Primärfärbung. Bei Gegenfärbung mit einer rosa-roten Färbung, Safranin, kann es nicht in die Zellen eindringen, da die Poren geschlossen sind.

Die Zellen behalten schließlich die violett-blaue Farbe der Primärfärbung. Andererseits enthält die gramnegative Zellwand viel Lipid (LPS), das durch das Entfärbungsmittel herausgelöst wird, wodurch sich große Poren bilden. Diese Poren schließen sich bei Dehydratisierung von Zellwandproteinen nicht merklich.

Deshalb entweicht der Beiz-Beiz-Komplex beim Waschen mit dem Entfärbemittel durch die Poren und die Zellen erscheinen farblos. Bei einer Gegenfärbung mit Safranin dringt es durch die Poren in die Zellen ein und schließlich nehmen die Zellen die rosa-rote Farbe der Gegenfärbung an.

Benötigte Materialien:

Objektträger, Schlinge, Primärfärbung (Kristallviolett), Beizmittel (Grammjod), Entfärbungsmittel (95% Ethanol), Gegenfärbung (Safranin), Nährlösung/Schräg-/Plattenkultur von Bakterien, Mikroskop, Immersionsöl.

Verfahren:

1. Ein Objektträger wird ordnungsgemäß unter Leitungswasser gereinigt, sodass kein Wasser als Tropfen auf seiner Oberfläche zurückbleibt (Abbildung 5.11).

2. Das anhaftende Wasser wird mit Saugpapier abgewischt und der Objektträger luftgetrocknet.

3. Ein Bakterienausstrich wird in der Mitte des Objektträgers nach zwei Methoden wie folgt hergestellt.

(a) Wenn ein auf Agarplatten oder Schrägagar gewachsenes Bakterium beobachtet werden soll, wird ein Tropfen Wasser in die Mitte des Objektträgers gegeben und eine Bakterienschleife von der Platte oder Schrägagar wird mit einer über Flamme sterilisierten Schleife darauf übertragen . Dann wird durch langsame Drehung der Schlinge im Tropfen eine Bakteriensuspension hergestellt und verteilt, bis ein Abstrich erhalten wird.

(b) Wenn ein in flüssiger Brühe gewachsenes Bakterium beobachtet werden soll, wird ein Tropfen der Bakteriensuspension durch eine flammensterilisierte Schlaufe direkt in die Mitte des Objektträgers gegeben und durch Ausstreichen ein Ausstrich angefertigt.

5. Der Ausstrich wird durch Erhitzen fixiert. Das Erhitzen führt zur Koagulation der zellulären Proteine, wodurch die Zellen an der Oberfläche des Objektträgers kleben und während der Färbung nicht weggespült werden Oberfläche nach oben zeigend, damit sich der Ausstrich nicht erwärmt.

6. Der Objektträger wird auf einem Färbetablett aufbewahrt und 1 Minute mit der Primärfarbe Kristallviolett geflutet.

7. Überschüssige Flecken werden unter leicht fließendem Leitungswasser so vom Ausstrich abgewaschen, dass kein Wasser direkt auf den Ausstrich fällt.

8. Der Ausstrich wird 1 Minute lang mit dem Beizmittel Gramm Jod geflutet.

9. Überschüssige Beize wird unter leicht fließendem Leitungswasser so vom Ausstrich abgewaschen, dass kein Wasser direkt auf den Ausstrich fällt.

10. Der Ausstrich wird 5 Sekunden lang mit dem Entfärbungsmittel, 95% Ethanol, geflutet, wobei darauf zu achten ist, dass der Ausstrich nicht zu stark entfärbt wird.

11. Das Ethanol wird unter leicht fließendem Leitungswasser schnell vom Ausstrich abgewaschen, um eine Überfärbung zu vermeiden. Es wird darauf geachtet, dass kein Wasser direkt auf den Abstrich fällt.

12. Der Ausstrich wird 1 Minute mit der Gegenfärbung Safranin geflutet.

13. Überschüssige Gegenflecken werden unter leicht fließendem Leitungswasser so vom Ausstrich abgewaschen, dass kein Wasser direkt auf den Ausstrich fällt.

14. Der Objektträger wird mit saugfähigem Papier trockengetupft.

15. Der Objektträger wird auf den Objekttisch des Mikroskops geklemmt und der Ausstrich unter schwachen Objektiven und hohen Trockenobjektiven beobachtet.

16. Ein Tropfen Immersionsöl wird auf den Ausstrich gegeben.

17. Der Ausstrich wird unter einem Ölimmersionsobjektiv beobachtet.

Beobachtungen (unter Öl-Immersions-Objektiv):

1. Farbe der Zellen:

Violett-Blau: Gram-positive Bakterien

Rosa-Rot: Gram-negative Bakterien

3. Anordnung der Bakterien:

In Ketten (Streptokokken/Streptobazillen)

Traubenähnliche Trauben (Staphylococcus)

Quaderförmig (Sarkinae oder Oktett)

Zeichnen Sie durch Augenschätzung das Feld unter dem Ölimmersionsobjektiv.

Grammvariable Reaktion:

In einigen Fällen erscheinen die grampositiven Zellen als gramnegative Zellen. Dies wird als gramvariable Reaktion bezeichnet.

Die Gründe sind wie folgt:

(a) Es kann zu einer Überentfärbung kommen, wodurch auch die grampositiven Zellen ihre violette Farbe verlieren.

(b) Es kann zu einer Überfixierung kommen, wodurch die grampositiven Zellen ihre Fähigkeit verlieren, der Entfärbung zu widerstehen

(c) Wenn alte Bakterienkulturen verwendet werden, können sich die Bestandteile der Zellwand mit dem Alter der Zellen verändern, was eine Entfärbung ermöglicht.


Mikrobiologie Kapitel 17 Testbank

A. Nachweis viraler Nukleinsäure unter Verwendung spezifischer Sonden.

Dem Patienten entnommene C.-Zellen werden auf Anzeichen einer Virusinfektion untersucht.

A. serielles Verdünnen einer Serumprobe.

B. Bestimmen der niedrigsten Serumverdünnung, die eine sichtbare Reaktion hervorruft.

C. Bestimmung der höchsten Verdünnung des Antigens, die eine sichtbare Reaktion hervorruft.

A. Sie verlassen sich auf die Bildung von sichtbaren Klumpen zum Nachweis.

B. sie umfassen den VDRL-Test auf Syphilis.

C. werden sie oft in Agargelen durchgeführt.

D. Sie können in einem Reagenzglas durchgeführt werden, indem vorsichtig Antiserum über Antigenlösung gegeben wird.

A. Zuerst werden Antigen und Antikörper reagieren gelassen.

B. Gereinigte Komplementproteine ​​werden in das Antigen-Antikörper-Röhrchen gegeben.

C. Rote Blutkörperchen von Schafen werden dem Antigen-Antikörper-Komplement-Gemisch zugesetzt.

A. Ouchterlony Doppeldiffusion.

A. Ouchterlony Doppeldiffusion

A. Ouchterlony Doppeldiffusion

A. Ouchterlony Doppeldiffusion.

A. Sie können verwendet werden, um Antikörper in Immunfluoreszenztests zu markieren.

B. Sie emittieren sichtbares Licht als Reaktion auf ultraviolette Strahlung.

C. Sie werden im Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

D. Sie werden verwendet, um Krankheitserreger der Chlamydiose, der Legionärskrankheit und anderer zu identifizieren.


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Wie man Gram-Färbung

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Die Gram-Färbung ist ein schnelles Verfahren, um nach Bakterien in Gewebeproben zu suchen und Bakterien anhand der chemischen und physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände als grampositiv oder gramnegativ zu charakterisieren. [1] X Forschungsquelle Bergey, David H. John G. Holt Noel R. Krieg Peter H.A. Sneath (1994). Bergeys Handbuch der determinativen Bakteriologie (9. Aufl.). Lippincott Williams und Wilkins. Die Gram-Färbung sollte fast immer als erster Schritt bei der Diagnose einer Bakterieninfektion durchgeführt werden.

Die Gram-Färbung ist nach dem dänischen Wissenschaftler Hans Christian Gram (1853 – 1938) benannt, der die Technik 1882 entwickelt und 1884 veröffentlicht hat, um zwischen zwei Bakterienarten mit ähnlichen klinischen Symptomen zu unterscheiden: Streptococcus pneumoniae (auch bekannt als Pneumokokken) und Klebsiella pneumoniae Bakterien. [2] X Forschungsquelle Gram, HC (1884). "Über die isolierte DNA der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten". Fortschritte der Medizin 2: 185–9.


BIOLOGIE DER MYKOBAKTERIUM-TUBERKULOSE

Mykobakterien Bereichsgruppe von Bakterien, die einen einzigartigen Zellwandtyp besitzen, der aus Mykolsäure besteht. Mykolsäures sind stark hydrophobe Moleküle, die eine Lipidhülle um Mykobakterien bilden. Mykolsäure beeinflusst die Permeabilitätseigenschaften an der Zelloberflächengrenzfläche von Mykobakterien und sie tragen auch zur Pathogenität und/oder Virulenz dieser Bakterien bei. Typische Beispiele für Bakterien der Gruppe Mykobakterien sind Mycobacterium tuberculosis – welches der Erreger der Tuberkulose beim Menschen ist. Mycobacterium tuberculosis ist ein schlanker, unbeweglicher, nicht sporenbildender, grampositiver, obligat aerobe und säurebeständiger Bazillus (Stäbchen) mit einer wachsartigen Zellwand. Es findet sich in der Gattung Mykobakterium und Familie Mykobakterien. Abgesehen von M. tuberculosis, M. bovis (Rinder-/Tiererreger), M. avium und M. leprae (Erreger der Lepra/Morbus Hansen) sind die anderen wichtigen Arten der Gattung Mykobakterium die bei Menschen, Tieren und Vögeln Krankheiten verursachen. Andere nicht tuberkulöse Mykobakterien sind Mitglieder der normalen menschlichen Mikroflora und derjenigen, die in Wasseroberflächen vorkommen. Diese Mykobakterien sind nicht ansteckend und werden im Allgemeinen als atypisch Mykobakterien.

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Der Verzehr von nicht pasteurisierter (Roh-)Milch und enger Kontakt mit infizierten Rindern kann zu M. bovis Infektion beim Menschen. Die Zellwand aller Bakterien im Mykobakterium Gattung ist anders und sehr einzigartig, weil ihre Zellwand aus hohen Konzentrationen von Lipiden besteht, die langkettige Fettsäuren enthalten, die als . bekannt sind Mykolsäure (was die Zelloberfläche des Bakteriums hydrophob macht). Die Mykolsäure ist für jede Bakterienart in der Mykobakterium Gattung und macht etwa 60 % der gesamten Zellwandmasse des Organismus aus. M. tuberkulose hat eine Peptidoglycan enthaltende Zellwand, die der anderer grampositiver Bakterien ähnelt, außer dass ihr Peptidoglycan N-Glycolylmuraminsäure anstelle von N-Acetylmuraminsäure enthält – was typisch für alle grampositiven Bakterien ist. Der Mykolsäure-(Fett-)Säure-Gehalt der Zellwand von Mykobakterium Spezies macht sie resistent gegen Austrocknung und andere Chemikalien wie Antibiotika und Natriumhydroxid (NaOH), die normalerweise andere Bakterien im Sputum vor der Kultivierung im Labor abtöten oder hemmen. Allerdings Arten von Mykobakterium sind empfindlich gegenüber ultravioletten (UV) Strahlen.

M. tuberkulose und andere verwandte Arten der Gattung Mykobakterium heißen meistens säurefeste Bazillen (AFB) weil sie eine Tendenz von . zeigen Säurebeständigkeit beim Färben. Der Grund für ihre Säurebeständigkeit wird auf den hohen Mykolsäure-(Fett-)Säure-Gehalt ihrer Zellwand zurückgeführt, der es schwierig macht, sie leicht anzufärben, aber einmal angefärbt, Mykobakterium Arten widerstehen einer Entfärbung durch Alkohol oder Säure – ein Phänomen, das bei ihrer Erkennung und Differenzierung von anderen nicht-mykolischen Bakterien im Labor hilft. M. tuberkulose ist ein durch die Luft übertragener Krankheitserreger, der für eine Infektion verantwortlich ist, die als . bekannt ist Tuberkulose (TB) beim Menschen und ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Der Erreger der TB wurde erstmals 1882 von Robert Koch (dem Vater der Medizinischen Mikrobiologie) nach umfangreichen Recherchen isoliert und beschrieben. Tuberkulose (TB) ist eine chronische infektiöse Atemwegserkrankung, die sowohl bei Mensch als auch bei Tieren auftritt. TB ist nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) weltweit für über 2 Millionen Todesfälle verantwortlich. TB-Infektionen werden meist durch das Einatmen von Hustentropfen oder Aerosolen verursacht, die Tuberkelbazillen (d. h. lebensfähige Zellen von M. tuberkulose) von infizierten Personen freigesetzt. Die menschliche Lunge ist das Hauptreservoir von M. tuberkulose, und die Übertragung erfolgt am schnellsten über Atemtröpfchen und Tröpfchenkerne in Aerosolen oder Staubpartikel in TB-Endemiegebieten.

Tuberkelbazillen und Atemtröpfchen einer infizierten Person können die Abwehrmechanismen der oberen Atemwege (Nasenlöcher) umgehen und sich in den Alveolen der Lunge des anfälligen Individuums oder der anfälligen Bevölkerung festsetzen. Enger Kontakt und Kommunikation mit infizierten Personen können auch durch die Freisetzung von Aerosolen oder Tröpfchen, die infektiöse Tuberkelbazillen enthalten, zu einer Infektion führen. M. tuberkulose betrifft eine Vielzahl von Organen im Körper, einschließlich Lunge, Nieren, Wirbelsäule, Hirnhäute, Gehirn, Magen-Darm-Trakt und Blutgefäße. Ältere Menschen, medizinisches Personal in Kontakt mit Risikogruppen, Menschen mit geschwächtem oder geschwächtem Immunsystem, Obdachlose, Gefängnisinsassen, alkoholarme Männer, intravenöse (IV) Drogenkonsumenten, unterernährte Personen, Flüchtlinge und Überbelegung sind einige der prädisponierenden Faktoren und Personen mit einem Risiko, an Tuberkulose zu erkranken. Afrika südlich der Sahara, einige Teile Asiens, der Westpazifik und Lateinamerika haben eine der höchsten Inzidenzen von TB-Infektionen weltweit. TB ist eine wichtige Volkskrankheit, die aufgrund ihrer Sterblichkeits- und Morbiditätsrate von globaler Bedeutung ist. Die Krankheit tritt in einigen Gebieten wieder auf, und einige sind resistent M. tuberkulose Es gibt jetzt Stämme, die es schwierig machen, die Infektion zu behandeln und zu behandeln. TB ist die häufigste opportunistische Infektion bei Menschen mit HIV/AIDS (PLWHA) und sogar bei anderen immungeschwächten Personen.

PATHOGENESE VON MYKOBAKTERIUM-TUBERKULOSE INFEKTION

M. tuberkulose ist ein durch die Luft übertragener Krankheitserreger, und daher führt der Hauptweg der Übertragung oder der Erwerb der Krankheit über die oberen Atemwege / Atemwege (Abbildung 1). Eine Infektion mit dem Tuberkelbazillus, M. tuberkulose, wird normalerweise nach Inhalation von mikroskopisch kleinen Partikeln (bekannt als Tuberkelbazillen) in Aerosolen oder Tröpfchen eingeleitet, die von einem aktive Lungentuberkulose. Die Inkubationszeit der Krankheit nach der Infektion beträgt in der Regel 4-12 Wochen. Eine Exposition gegenüber M. tuberkulose kann zu einer Infektion führen, die meisten Infektionen führen jedoch nicht zu einer TB-Erkrankung, abhängig vom Immunzustand der betroffenen Person oder Bevölkerung. Menschen mit einer aktiven pulmonalen TB-Erkrankung stoßen beim Niesen, Husten, Auswurf/Spucken oder Sprechen eine Vielzahl von infektiösen mikroskopisch kleinen Tuberkelbazillen in die Atmosphäre aus. Da die infektiöse Dosis von TB sehr gering ist (ca. 5-10 Bakterien), kann das Einatmen von nur 10 Bakterienpartikeln in Aerosolen, Tröpfchen oder Staubpartikeln eine Infektion verursachen oder auslösen.

Abbildung 1: Das menschliche Atmungssystem mit Eintrittspforte und möglichen Stellen von M. tuberkulose Infektion im Körper. Foto mit freundlicher Genehmigung: https://pie1million.weebly.com/respiratory-system.html

Angrenzende Lymphknoten werden ebenfalls durch das pathogene Bakterium infiziert, und auch um diese Stellen herum bilden sich kleine entzündliche Läsionen. In der Lunge umgeben alveoläre Makrophagen das pathogene Bakterium durch den Prozess der Phagozytose, was zu einer Überempfindlichkeitsreaktion führt, die sich bildet Tuberkel (kleine und harte Knötchen, die für die TB-Krankheit charakteristisch sind). Dies ist bekannt als Primärinfektion, und in diesem Szenario ist das Immunsystem des Wirts in der Lage, den Tuberkelbazillus innerhalb des Lungensystems einzudämmen und einzudämmen – und so seine Ausbreitung zu verhindern und zu einem Krankheitszustand zu führen. In diesem Stadium ist die TB-Infektion begrenzt und die gebildeten Läsionen heilen selbst, obwohl möglicherweise nicht alle Tuberkelbazillen zerstört werden. Menschen mit geschwächtem Immunsystem erleiden eine aktive Lungeninfektion, die zur Zerstörung der Lunge und zur Ausbreitung des Erregers auf andere Körperteile mit Todesfolge führt. Die meisten Fälle von primären TB-Infektionen werden jedoch normalerweise vom Immunsystem des Wirts gut gehandhabt und die Mykobakterium vermehrt sich intrazellulär (aber unter der Aufsicht von Makrophagen) ohne nennenswerten Schaden an den Wirtszellen.

In Sekundärinfektion (das kann eine aktive pulmonale oder extrapulmonale Infektion sein), m. Tuberkulose in der Lunge wird nach mehreren Monaten oder Jahren aufgrund von Unterernährung, Immunschwäche oder schlechtem Gesundheitszustand des Individuums reaktiviert. Sekundäre (postprimäre) Infektionen können auch auftreten, wenn Primärinfektionen nicht effektiv heilen, und dies tritt normalerweise bei etwa 10 % der primären TB-Fälle auf. Tuberkelbazillen, die die primären Läsions- oder Infektionsprozesse überlebt haben, sind hauptsächlich dafür verantwortlich, postprimäre (Reaktivierungs-) TB-Typen auszulösen. Der weitere Verlauf der TB-Erkrankung (d. h. von der Primär- zur Sekundärinfektion) hängt vom Ergebnis der Begegnung zwischen der spezifischen zellvermittelten Immunität (CMI) des Wirts und den Tuberkelbazillen selbst ab. CMI ist bei einigen TB-infizierten Personen normalerweise schützend und lebenslang. In einigen anderen Fällen werden die Tuberkelbazillen oder -Partikel jedoch später in ihrem Leben durch die Mechanismen des CMI aus ihrer Eindämmung in die Atemwege des Wirts verdrängt, und dies geschieht, wenn die T-Zell-Immunantwort des Individuums signifikant reduziert ist. In diesem Stadium vermehrt sich der Erreger sporadisch im Körper des Wirts, breitet sich in den lebenswichtigen Körper aus und die TB-Krankheitssymptome beginnen auszustrahlen oder zu erscheinen.

Zu den klinischen Anzeichen und Symptomen von TB (dh bei Sekundärinfektion), die nur bei pulmonaler TB oder extrapulmonaler TB (dh wenn die Krankheit aktiv wird) auftritt und anderen Lungen-/Atemwegserkrankungen ähneln kann, gehören Appetitlosigkeit, Brustschmerzen, anhaltender und produktiver Husten mit Blut, Fieber, unerklärlicher Gewichtsverlust, schlechtes Wachstum bei Kindern und Müdigkeit. Zu den verbreiteten Formen der TB, die von einer Sekundärinfektion ausgehen, gehören (1) Militär-TB (die durch Verbreitung des Erregers über das Blut Milz, Lymphdrüsen und Leber betreffen), (2) Tuberkulose-Meningitis (die das Gehirn und die Hirnhäute betreffen), (3) Nieren- und Urogenitaltuberkulose (die den Magen-Darm-Trakt und die Niere betreffen) und(4) Knochen und Gelenktuberkulose (die das Rückenmark oder die Wirbel betreffen).

UNTERSCHIEDE ZWISCHEN EINER TB-INFEKTION UND EINER TB-KRANKHEIT

Bemerkenswert ist, dass eine Infektion mit M. tuberkulose bedeutet nicht unbedingt, dass jemand eine TB-Krankheit hat. Die Exposition gegenüber Aerosolen, Staubpartikeln und Atemtröpfchen (z. B. Sputa, Niesen und Husten eines infektiösen TB-Patienten) mit ausreichender Menge oder Dosierung von Tuberkelbazillen ist die erste Grundlage für den Erwerb von M. tuberkulose. Ob die Exposition, die zu einer Infektion geführt hat, folglich zu einer TB-Erkrankung führt, hängt von so vielen Faktoren ab, darunter: der Stamm des infizierenden Erregers, der Zustand der Immunität des Wirts und der Gesundheitszustand des Wirts unter anderem. TB-Infektion und TB-Krankheit sind zwei unterschiedliche Phänomene. Während erstere (d. h. TB-Infektion) weist keine klinischen Symptome auf, ist nicht infektiös, weist ein normales Röntgen-Thorax-Ergebnis auf und weist einen negativen Sputum-Abstrich und einen negativen Kulturtest auf (d. h. TB-Krankheit) zeigt klinische Symptome (Husten, Fieber und Gewichtsverlust), ist infektiös, eine Röntgenaufnahme des Brustkorbs zeigt Läsionen und die Ergebnisse des Sputumabstrichs und der Kulturtests sind positiv. In beiden Fällen einer TB-Infektion und einer TB-Erkrankung wird das Bakterium M. tuberkulose ist immer vorhanden und die Hauttestergebnisse (Tuberkulin) sind bei diesen Personen immer positiv. Menschen mit einer TB-Infektion sind jedoch nicht ansteckend (d. h. sie können die Infektion nicht auf andere Personen übertragen), aber Menschen mit einer TB-Erkrankung können den Erreger leicht übertragen (d. h. M. tuberkulose) von TB an empfängliche, nicht infizierte Personen in der menschlichen Bevölkerung. Menschen mit einer TB-Infektion haben M. tuberkulose in ihrem Körper, aber das Immunsystem dieser Personen hat einen Immunsystemmechanismus entwickelt, der den Erreger eindämmt und unter Kontrolle hält. TB bleibt bei den meisten Menschen, die mit infiziert sind, lebenslang ruhend M. tuberkulose Dies ist jedoch bei einer Person mit TB-Erkrankung nicht der Fall, da eine solche Person eine aktive Infektion hat. Eine TB-Übertragung kann nur von Menschen mit aktiver TB-Erkrankung und nicht von latenter oder ruhender TB erfolgen. Daher sind Exposition, latente TB-Infektion und TB-Erkrankung oft die drei (3) Hauptwege, um die Stadien der Tuberkulose klinisch zu beschreiben.

LABORDIAGNOSE VON M. TUBERKULOSE INFEKTION

Die primäre Probe für die Labordiagnostik einer potenziellen TB-Erkrankung ist Sputum, das in einem auslaufsicheren Probenbehälter mit Schraubverschluss gesammelt wird. Der Grund für die Verwendung eines auslaufsicheren Probenbehälters mit Schraubverschluss beim Sammeln von Sputum anstelle der üblichen Schnappverschlussbehälter besteht darin, die Ausbreitung der Krankheit oder des Erregers durch Aerosole zu minimieren, die nicht verschraubte, nicht auslaufsichere Probe Container initiieren können. Blut, Kehlkopfabstriche, bronchoskopische Proben, Pleura- und Peritonealflüssigkeiten, Magenspülung und Liquor können auch von infizierten Patienten entnommen und auf andere TB-Typen analysiert werden. Kultivierung und mikroskopische Techniken sind in der Regel die beiden Hauptmethoden zum Nachweis von M. tuberkulose aus Auswurf. Mantoux (Tuberkulin)-Hauttest, DNA-Sonden-Testkits für TB, PCR und Röntgenthorax sind weitere diagnostische Instrumente oder Maßnahmen zur klinischen Diagnose der Krankheit. Die Isolierung des säurefesten Bakteriums in Kultur und eine positive mikroskopische Färbetechnik sind jedoch oft die beiden zuverlässigsten Methoden zum Nachweis des Erregers.

Obwohl M. tuberkulose ein Gram-positives Bakterium ist, färbt die Gram-Färbungstechnik das Pathogen aufgrund des sehr hohen Lipidgehalts (d. h. Mykolsäure) in seiner Zellwand nicht ohne weiteres an. Ziehl-Neelsen-, Kinyoun- und Fluoreszenz-Färbungen sind die wichtigsten Färbungen bzw. Färbetechniken, die im Labor zur Identifizierung von M. tuberkulose und die anderen verwandten Arten der Gattung Mykobakterium. Die selektive Isolierung von M. tuberkulose aus Sputum und anderen klinischen Proben wird durch den hohen Fettsäuregehalt seiner Zellwand ermöglicht. Sputumabstriche sind zu erkennen M. tuberkulose, und bei der Färbung mit der Ziehl-Neelsen-Färbung färbt sich das Bakterium rot (wie in Figur 2) aufgrund des Mykol-(Fett-)Säure-Gehalts der Zellwand des Organismus. Die Färbung mit Fluorochrom-Färbungen (z. B. Rhodamin und Auramin) zeigt oder zeigt eine gelb-orange Fluoreszenz unter dem Mikroskop. Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von M. tuberkulose wird angezeigt in Figur 3.

Figur 2. Mikroskopie von Mykobakterium Tuberkulose Ziehl-Neelsen-Färbung mit Karbolfuchsin. Das TB-Bakterium ist rot dargestellt. Bei der Ziehl-Neelsen-Färbung wird eine Mischung aus Karbolfuchsin (einem basischen Farbstoff) und Phenol verwendet. Durch langsames Erhitzen des Ausstrichs auf dem Objektträger wird der Farbstoff direkt in die Zellwand der Tuberkelbazillen getrieben. Die Objektträger werden normalerweise für etwa 2-3 Minuten bis zum Dampfpunkt erhitzt. Das Phenol fördert die Penetration des Farbstoffs Karbolfuchsin in die Mykolsäure-Zellwand von M. tuberkuloseund säurefester Bazillus (AFB). Der Objektträger wird in destilliertem Wasser gewaschen und mit Säure-Alkohol entfärbt und erneut gewaschen und schließlich mit einer als Methylenblau bekannten Gegenfärbung gefärbt. Nicht-AFB-Bakterien nehmen die Farbe der Gegenfärbung auf, während M. tuberkulose wenn vorhanden erscheint unter dem Mikroskop rot. Foto mit freundlicher Genehmigung: https://www.microbiologyclass.com Figur 3. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von M. tuberkulose Bakterien. Foto mit freundlicher Genehmigung: https://www.microbiologyclass.com

Kultivierung von Sputumproben zum Nachweis von M. tuberkulose wird aufgrund der infektiösen Natur von TB-Proben normalerweise in Referenztuberkuloselabors durchgeführt. Die Kultur von TB-Proben erfolgt mit selektiven Nährmedien wie dem Löwenstein-Jensen (Middlebrook) Nährmedium (Figur 4). M. tuberkulose sollten zu Identifizierungszwecken und zum Testen der antimikrobiellen Empfindlichkeit kultiviert werden. Selektive Kulturmedien wie das Löwenstein-Jensen-Medium (Figur 4) wird zur Isolierung des Bakteriums verwendet. Da die Tuberkelbakterien langsam wachsen, werden Kulturmedien normalerweise wochenlang und bei einem Temperaturbereich von 35-37 °C inkubiert. Zusammenfassend erfordert die Diagnose von Tuberkulose den mikroskopischen Nachweis von säurefesten Bazillen (AFB) im Sputum von infizierten Patienten durch die Ziehl-Neelsen-Färbung oder andere zuverlässige Färbetechniken, wie bereits erwähnt. Then this must be followed by culturing in a selective media for the isolation and identification of the pathogen and consequently to determine their susceptibility profiles.

Figure 4: Kolonien von M. tuberculosis bacteria growing on Löwenstein-Jensen (Middlebrook) culture medium. Löwenstein-Jensen agar is an egg-substrate medium and M. tuberculosis bacteria produces rough, yellowish cauliflower-like colonies on the medium after several weeks of incubation. Photo courtesy: https://www.microbiologyclass.com

IMMUNITY TO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS INFECTION

If the tubercle bacilli do not kill its human host, there is a great tendency of the individual to develop a certain level of defense against the pathogen. Innate immunity against M. tuberculosis infection is very high in humans but this form of protection varies and depends on the genetic makeup of the individual. The host’s immune system mechanisms help to localize the Mycobacteria, and thus impede their growth and spread in the body. First exposure to M. tuberculosis also develops some appreciable levels of protection in the host’s body due to CMI. CMIactually develops when competent T cells recognize tubercle antigen complexes on the surface of macrophages containing M. tuberkulose.

Both cells of the CMI (i.e., CD8+ and CD4+) are involved in protecting the individual from tubercle bacilli infection, but acquired immunity in TB infection is incomplete or shortened. Damage to the lung of individuals infected with M. tuberculosis could be prevented if alveolar macrophages respond and appear early enough in the infection process. These alveolar macrophages join to form cells that combine with the CMI to produce a granulomatous reaction that walls off the growing tubercle lesion. Tubercle bacilli only survive in this lesion during the period of dormancy (i.e., primary infection), and may become reactivated when the host’s CMI is diminished following other health problems such as HIV or immunosuppressive drugs which repress the immune system of the individual. Humoural immunity does not eliminate a TB infection, rather it is the CMI that confers defense and eventually leads to recovery and protection of the affected host from a possible re-infection with a new strain of M. tuberculosis in der Zukunft.

TREATMENT OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS INFECTION

The successful treatment of TB disease is usually undertaken using multiple drugs to which the tubercle bacilli are susceptible to, and this is important due to the possibility of the mycobacteriain developing resistance to a single anti-tuberculosis drug. Thus, single drug regimens are often ruled out when considering therapy for a TB disease patient. Isoniazid (INH) and rifampin are the two drugs of choice used as first-line TB drugs for the treatment and management of a TB disease. Other first-line TB drugs are ethambutol, pyrazinamide and streptomycin (an injectable TB drug). Die second-line TB drugs include kanamycin (injectable), ofloxacin, capreomycin (injectable), amikacin (injectable), ethionamide, ciprofloxacin and cycloserine. Initial TB therapy is usually started with about three to four TB drugs that include the 2 first-line drugs (e.g., INH and rifampin) especially when susceptibility studies are still underway. But when susceptibility results become available, a two-drug therapy is given to the patient except in cases when resistance is anticipated, then the drugs can increase to three or four.

The course of drug therapy for TB disease usually spans a period of 9 months in which INH and rifampin are administered concomitantly on a daily basis for about 2 months. TB therapy normally takes a longer period to complete because the pathogen is a slow growing organism, and thus longer time is required to kill them. The use of two drugs in TB treatment helps to prevent the emergence of tubercle bacilli resistant to each of the drug. Second-line TB drugs are used and included in TB therapy when there is toxicity or resistance associated with any of the first-line drugs. Treatment with multiple anti-TB drugs helps to eradicate the tubercle bacilli and prevent the emergence of resistant strains or spread of the infection to non-TB individuals. In most cases, a direct observed therapy (DOT) in which the patients visit the health center or clinic to take their medication is usually used in TB treatment. DOT is anti-tuberculosis program where TB patients are regularly monitored to ensure that they take the full course of their medication so that resistance does not develop following irregular medication. DOT helps to protect the public health. But when patients fail to comply with their TB regimen, the infection becomes reactivated and the individual becomes infectious again.

Widerstand von M. tuberculosis to TB drug treatment is now a global health problem, and it usually develops in places where anti-TB programmes are poorly funded. Patient’s non-compliance to their drugs and use of ineffective or counterfeit drugs also contribute to the development of resistance. Blind treatment which is usually resorted to in most instances before a proper susceptibility test result is obtained also adds up to the development of drug resistant M. tuberculosis. M. tuberculosis strains that are multidrug-resistant (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) now exist and these resistant strains of Mycobacterium have added to the dilemma associated with the global containment and eradication of the TB disease. Multidrug-resistant TB (MDR-TB) sind M. tuberculosis strains that are resistant to at least one of the two best first-line TB treatment drugs (e.g., isoniazid and rifampin) while extensively drug-resistant TB (XDR-TB) are M. tuberculosis strains that are resistant to the two best first-line TB treatment drugs (e.g., isoniazid and rifampin), plus any fluoroquinolone and at least one of the three injectable second-line TB drugs (e.g., amikacin, kanamycin, or capreomycin). Streptomycin is also an injectable second-line TB drug. In some parts of the world such as the United States of America and Europe, TB disease has been contained to some extent and cases of new incidence of the disease are rare. Thus, infectious rates of the disease in these regions are very low. However, TB disease still contributes to the global bacterial disease morbidity and mortality rate especially in the developing countries where cases of new incidence of the disease are still being reported.

PREVENTION AND CONTROL OF M. TUBERCULOSIS INFECTION

The prevention and control of TB is critical to the global public health. Individuals that present with a positive tuberculin skin test but no active TB are considered to have a dormant type of TB, thus such individuals should be placed under intensive TB therapy using INH so that the infection does not progress to a disease state at a later time. The development of novel anti-TB drugs, availability of proper diagnostic tools for prompt/early TB detection and adequate susceptibility tests are fundamental to the containment of this man-killer disease known as TB. People living in high risk regions should be vaccinated with the Bacilli Calmette-Guerin (BCG) vaccine. It should also be administered to infants and children so as to protect them from the infection. BCG is a live attenuated bovine vaccine derived from M. bovis and the name “BCG” was from the two French scientists (Calmette and Guerin) that developed the vaccine in the early 1920’s. Individuals who receive the BCG vaccine develop a positive mantoux skin test because the components of the vaccine induce a DTH in the recipients.

BCG vaccine is contraindicated in HIV-infected individuals, and the vaccine should not be used in such cases. The chain of transmitting M. tuberculosis can be broken by isolating active pulmonary TB disease patients from the general population and starting effective anti-tuberculous therapy on them. Travelers should avoid close contact with known TB patients. TB disease patients under treatment for TB should not travel until the treating physician has documented by laboratory examination of sputum and other diagnostic or culture protocol, that they are not infectious and are therefore of no risk to others in terms of passing on the tubercle bacilli to susceptible individuals they might be coming in contact with. Potentially contaminated air is treated with UV rays to avoid contamination.

OTHER SPECIES OF MYCOBACTERIUM

  • Mycobacterium leprae is the causative agent of leprosy.
  • Mycobacterium africanum is found in humans and monkeys.
  • Mycobacterium kansasii is found in water and cattle.
  • Mycobacteriumulceransis found in humans and in the environment.
  • MycobacteriumaviumKomplexis found in birds, fowl, soil, water, cattle, swine, and in the environment.
  • Mycobacteriumbovisis found in cattle and humans.
  • Mycobacteriumgenavenseis found in pet birds.
  • Mycobacteriummalmoenseis found in the environment.
  • Mycobacteriummarinumis found in fish and water.
  • Mycobacteriumsimiaeis found in monkeys and water.
  • Mycobacteriumxenopiis found in water and birds.
  • Mycobacteriumgastriis found in gastric washings.
  • Mycobacteriumfortuitumis found in soil, water, marine life and animals.
  • Mycobacteriumchelonaeis found in soil, water, marine life and animals.
  • Mycobacteriumfallaxis found in soil and water.
  • Mycobacteriumgordonaeis found in water.
  • Mycobacteriumflavescensis found in soil and water.

Weiterlesen

Brooks G.F., Butel J.S and Morse S.A (2004). Medical Microbiology, 23 rd edition. McGraw Hill Publishers. VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA.

Gilligan P.H, Shapiro D.S and Miller M.B (2014). Cases in Medical Microbiology and Infectious Diseases. Third edition. American Society of Microbiology Press, USA.

Madigan M.T., Martinko J.M., Dunlap P.V and Clark D.P (2009). Brock Biology of Microorganisms, 12 th edition. Pearson Benjamin Cummings Inc, USA.

Mahon C. R, Lehman D.C and Manuselis G (2011). Textbook of Diagnostic Microbiology. Fourth edition. Saunders Publishers, USA.

Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H. Jorgensen, Marie Louise Landry, Michael A. Pfaller (2007). Manual of Clinical Microbiology, 9th ed.: American Society for Microbiology.

Wilson B. A, Salyers A.A, Whitt D.D and Winkler M.E (2011). Bacterial Pathogenesis: A molecular Approach. Third edition. American Society of Microbiology Press, USA.

Woods GL and Washington JA (1995). The Clinician and the Microbiology Laboratory. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds): Principles and Practice of Infectious Diseases. 4th ed. Churchill Livingstone, New York.


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