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Was ist der beste Weg, um zwei Proteine ​​in einer Säugerzelle zu exprimieren?

Was ist der beste Weg, um zwei Proteine ​​in einer Säugerzelle zu exprimieren?



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Ich habe zwei Proteine ​​und werde einen Vektor mit beiden Genen für eine stabile Transfektion vorbereiten. Jedes Protein wird seinen eigenen Promotor haben und ich werde den piggyBac-Vektor verwenden, um eine einzelne Kassette mit beiden Genen darin in die Chromosomen einzufügen. Meine Fragen sind:

  1. Wenn ich denselben Promotor (CMV, SV40 oder einen induzierbaren) für beide Gene verwende, wie würde sich dies auf die Expressionsniveaus auswirken? Ich habe in einigen Artikeln gelesen, dass eines der Gene möglicherweise niedriger exprimiert wird als das andere. Wenn Sie Erfahrungen aus erster Hand haben, bin ich Ihnen dankbar, wenn Sie diese teilen.
  2. Wenn ich für beide den gleichen Promotor verwende, aber weit weg (d. h. Enden der Kassette) platziere, würden die Expressionsspiegel erneut beeinflusst? Es klingt einfach genug, aber ich denke, die Leute hätten etwas veröffentlicht, wenn sie damit ein gutes Ergebnis erzielt hätten.
  3. Wenn ich für jedes Gen unterschiedliche Promotoren verwende (z. B. CMV für das eine und Tet-induzierbar für das andere), wie würde es funktionieren? Ich konnte kein Papier finden, das dies verwendet, und ich möchte mit diesem Ansatz fortfahren; daher bin ich für jede hilfe sehr dankbar, wenn sie erfahrungen haben.

Ich möchte kein IRES oder 2A-Peptid verwenden. Ich möchte dieses Experiment im Transkriptionsstadium kontrollieren können.


Sie können einen bidirektionalen Promoter verwenden. Das von Ihnen erwähnte Problem bezüglich Proteinen, die nicht in gleichem Maße exprimiert werden, tritt aufgrund der Konkurrenz um Polymerase auf. Aber es gibt gut optimierte Teile und auch kommerziell erhältliche Vektoren, die gut funktionieren.

Sie können Gene in einer seriellen Reihenfolge klonen. Es wird kein Problem sein. Lassen Sie einfach einen 100bp-Linker nach dem polyA-Signal des vorherigen Gens. Wenn Ihre Kassette zu groß wird, wird das Einlegen etwas schwierig. Deshalb verwenden die Leute IRES oder TA-Peptide usw.

Retroviral-basierte Einfügungen funktionieren recht anständig, aber Sie können die Variation der Kopienzahl zwischen verschiedenen Zellen nicht kontrollieren.

Sie können zwei verschiedene Promotoren verwenden. Die Dynamik hängt von der Promotorstärke und der Konzentration des Induktors ab.


Ich ging meine Fragen durch und stellte fest, dass dies immer noch unbeantwortet ist. Nun, ich habe jetzt die Antwort.

Ich entwarf das Konstrukt mit zwei separaten Promotoren (CMV für den einen und Tet-induzierbar für den anderen) und erzielte wirklich gute Ergebnisse. Ich hatte keine Schwierigkeiten, die Proteine ​​zu exprimieren. Ich war in der Lage, das Tet-induzierbare Protein sehr gut zu kontrollieren und erreichte mit CMV konstante Spiegel des anderen Proteins.

Lange Rede, kurzer Sinn: Sie können zwei Gene sicher unter zwei separate Promotoren stellen, damit stabile Zelllinien herstellen und gute Expressionsraten erzielen.


Was ist der beste Weg, um zwei Proteine ​​in einer Säugerzelle zu exprimieren? - Biologie

Was ist rekombinantes Protein? Proteine ​​sind eines der wichtigsten biologischen Moleküle für das Leben. Und diese Proteine ​​erfüllen innerhalb von Organismen eine Vielzahl von Funktionen, darunter die Katalyse von Stoffwechselreaktionen, die DNA-Replikation, die Reaktion auf Reize und den Transport von Molekülen von einem Ort zum anderen. Wenn wir jedoch die Struktur, Funktion, den Mechanismus, den Stoffwechselweg oder andere Fakten dieser Proteine ​​analysieren wollen, werden wir feststellen, dass die Mengen aus natürlichen Quellen nicht ausreichen. In diesem Fall müssen wir in unserem Labor Proteine ​​in hoher Menge und Reinheit in kurzer Zeit und zu geringen Kosten herstellen. Daher ist eine rekombinante Proteintechnologie erforderlich. Rekombinantes Protein ist eine manipulierte Form von Protein, die auf verschiedene Weise erzeugt wird, um große Mengen an Proteinen zu produzieren, Gensequenzen zu modifizieren und nützliche kommerzielle Produkte herzustellen. Rekombinantes Protein wird von rekombinanter DNA kodiert, die in ein System kloniert wurde, das die Expression des Gens und die Translation von mRNA unterstützt. Die rekombinante DNA, normalerweise die cDNA-Sequenz des Zielproteins, ist so konstruiert, dass sie unter der Kontrolle eines gut charakterisierten Promotors steht und das Zielprotein innerhalb der ausgewählten Wirtszelle exprimiert, um eine Proteinexpression auf hohem Niveau zu erreichen. Die Modifikation des Gens durch rekombinante DNA-Technologie kann zur Expression eines mutierten Proteins oder einer großen Proteinmenge führen.

Die Wahl eines geeigneten Proteinexpressionssystems ist der Schlüssel zum Erfolg der rekombinanten Proteinexpression. Mehrere Faktoren müssen berücksichtigt werden, einschließlich der Eigenschaften des Zielproteins, der beabsichtigten Anwendung, der Proteinausbeute und der Kosten. Darüber hinaus bestehen Herausforderungen für viele Proteinexpressionsprojekte, insbesondere für große Proteine, Membranproteine, Kernproteine ​​und Proteine ​​mit starken posttranslationalen Modifikationen.

Heutzutage gibt es mehrere Expressionssysteme zur Verwendung. Unterschiedliche Systeme haben unterschiedliche Funktionen und Anwendungen. Hier stellen wir vier Systeme vor, die in Forschung und Industrie gebräuchlich sind. Sie sind Bakterien-Expressionssystem, Hefe-Expressionssystem, Baculovirus-Expressionssystem und Säugetier-Expressionssystem.

Abb1. Vier Ausdruckssysteme

Das E. coli-Expressionssystem ist das primäre und ausgereifteste Expressionssystem. Das Hauptverfahren besteht darin, einen Vektor, der das Ziel-DNA-Fragment inseriert hat, in die Wirtszelle zu übertragen. Und dann die Proteinexpression durch IPTG induzieren.

Als früheste Entwicklung und das am weitesten verbreitete klassische Expressionssystem hat das E. coli-Expressionssystem die Vorteile eines klaren genetischen Hintergrunds, einer schnellen Züchtung, geringer Kosten, hoher Expression, einfacher Reinigung des Produkts, guter Stabilität, starker Anti-Verschmutzungsfähigkeit und breites Anwendungsspektrum. Das prokaryontische Expressionssystem weist jedoch viele Mängel auf: Nicht alle Proteine ​​sind löslich. Falsch gefaltete Proteine, die im Zytoplasma gebildet werden, können unlösliche Aggregate bilden, die als Einschlusskörperchen bezeichnet werden, was zu einer schwierigen Reinigung führt. Darüber hinaus ist die posttranslationale Modifikationsverarbeitung des prokaryotischen Expressionssystems unvollkommen und die biologische Aktivität des exprimierten Produkts ist gering.
Daher werden auch andere ausgeklügeltere Systeme entwickelt, wobei solche Systeme die Expression von Proteinen ermöglichen können, die zuvor in E. coli für unmöglich gehalten wurden, beispielsweise glykosylierte Proteine.

Abb2. Falsch gefaltete und Einschlusskörper

Das Hefe-Expressionssystem als ein neues exogenes Protein-Expressionssystem enthielt Vorteile sowohl des prokaryotischen als auch des eukaryotischen Expressionssystems. Im Bereich der Gentechnik findet es breite Anwendung. Die vollständige Gensequenz von Saccharomyces cerevisiae wurde 1996 sequenziert. Die Verwendung von S.cerevisiae in der Brau- und Brotindustrie ist seit Tausenden von Jahren bekannt und gilt als GRAS-Kreaturen (allgemein als sicher anerkannt), die keine Toxine produzieren und haben wurde auch von der FDA anerkannt. Somit benötigen die vom Hefesystem exprimierten Produktionen nicht viele Wirtssicherheitsexperimente.

Verglichen mit dem neuen Hefesystem ist das Expressionssystem von S. cerevisiae jedoch nicht für eine Kultur mit hoher Dichte geeignet, der ein starker und strenger Regulationspromotor fehlt. Und die Sekretionseffizienz ist gering. Insbesondere werden viele Zielproteine ​​mit einem Molekulargewicht von mehr als 30 kD fast nicht sezerniert.

Später haben die Menschen ein Expressionssystem für Spalthefe und Methanolhefe entwickelt. Unter diesen ist das Methanol-Hefe-Expressionssystem das am weitesten verbreitete Hefe-Expressionssystem. Heutzutage werden hauptsächlich die Methanolhefen H Polymorpha, Candida Bodini und Pichia Pastris verwendet. Pichia Pastoris ist das beliebteste Werkzeug. Der Großteil der Methanolhefe enthält das methanolische Hefe-Oxidase-Gen-1 (AOX1). Das exogene Gen wurde unter der Wirkung des Promotors (PAOX1) exprimiert. PAOX1 ist ein starker Promotor, der Glucose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet. Die Expression des AOX1-Gens in Methanolhefe wurde normalerweise gehemmt. Und PAOX1 konnte aktiviert werden, als Methanol die einzige Kohlenstoffquelle war. Daher konnte die Expression des AOX1-Gens unter der Kontrolle des Gens erhöht werden. Die Verwendung von Methanolhefe zur Expression der exogenen Proteinproduktion beträgt oft bis zu Gramm. Verglichen mit S. cerevisiae ist seine Translation näher an Säugerzellen und unterliegt keiner Hyperglykosylierung.

Das Insekten-Expressionssystem ist ein weit verbreitetes eukaryotisches Expressionssystem, das die Fähigkeit besitzt, Fremdproteine ​​ähnlich wie höhere Eukaryoten zu translatieren und zu modifizieren. Die Expression von exogenem Protein im Insektenzellsystem durch rekombinantes Baculovirus ist eine populärere Expressionsmethode. Der Proteingehalt beträgt bis zu 1

500mg / L. Aber es wird durch viele Faktoren wie Kulturmedium, Sauerstoffversorgung und logarithmisches Wachstum usw. eingeschränkt und beeinflusst.

Baculovirus ist die größte Gruppe bekannter Insektenviren und ist das früheste, am besten untersuchte und anwendbare Insektenvirus. Das Baculovirus-Genom ist ein einzelnes geschlossenes zirkuläres doppelsträngiges DNA-Molekül mit einer Größe von 80-160 kb. Sein Genom kann in Insektenkernen repliziert und transkribiert werden. Die DNA-Replikation wird in der Rinde des Baculovirus zusammengebaut, das eine große Flexibilität aufweist und große Fragmente von Fremd-DNA-Insert aufnehmen könnte. Es ist der ideale Träger für die Expression großer DNA-Fragmente.

Zu den Hauptvorteilen des Baculovirus-Systems gehören:

  1. Rekombinantes Protein hat eine vollständige biologische Funktion, wie z. B. eine korrekte Proteinfaltung und eine Disulfidbindung
  2. Änderung nach der Übersetzung
  3. Hohe Expressionsrate, bis zu 50% der Gesamtproteinmenge
  4. Nimmt großes Insert-Protein auf
  5. Gleichzeitig mehrere Gene exprimieren.

Der Hauptnachteil besteht darin, dass die exogene Proteinexpression unter der Kontrolle des sehr späten viralen Promotors steht, wo die Zellen aufgrund einer Virusinfektion zu sterben beginnen.
Insektenexpressionssystem wird normalerweise für die Produktion von Membranproteinen verwendet, obwohl die Glykosylierungen von denen abweichen können, die in Vertebraten gefunden werden. Im Allgemeinen ist es sicherer in der Anwendung als das Säugervirus, da es ein begrenztes Wirtsspektrum hat und Wirbeltiere nicht ohne Modifikationen infiziert.

Rekombinante Proteine, die in Säugerzellen exprimiert werden, verwenden üblicherweise Plasmidtransfektion und virale Vektorinfektion. Eine stabile Zelllinie mit Plasmidtransfektion dauert mehrere Wochen oder sogar Monate, während der Virusvektor Zellen innerhalb weniger Tage schnell infizieren kann.

Abhängig von den zeitlichen und räumlichen Unterschieden in der Proteinexpression kann das Expressionssystem in transiente, stabile und induzierte Expressionssysteme unterteilt werden. Ein transientes Expressionssystem bezieht sich darauf, dass Wirtszellkulturen ohne Selektionsdruck und exogener Vektor während der Zellteilung allmählich verloren gehen. Die Expressionsdauer des Zielproteins ist kurz. Der Vorteil des transienten Expressionssystems ist die einfache und kurze Versuchsdauer. Stabiles Expressionssystem bedeutet, dass die Träger-DNA repliziert und lange Zeit stabil in der Wirtszelle exprimiert wird. Aufgrund der Notwendigkeit ausgewählter Widerstands- und Druckstufen ist eine stabile Expression relativ zeitaufwendig und mühsam. Induktions-Expressionssystem bezieht sich darauf, dass das Zielgen zu exprimieren beginnt, wenn es durch fremde kleine Moleküle induziert wird. Die Verwendung von heterologen Promotoren, Enhancern und amplifizierbaren genetischen Markern kann die Proteinproduktion erhöhen.
Das Säuger-Expressionssystem hat einen einzigartigen Vorteil bei Proteininitiationssignalen, Prozessierung, Sekretion, Glykosylierung und ist zum Exprimieren intakter Makromoleküle geeignet.

Abb3.Stabile Zelllinienentwicklung

Das von Säugerzellen produzierte Fremdprotein, das dem nativen Protein näher ist, hat viel mehr Aktivität als Proteine, die durch prokaryontische Expressionssysteme oder andere eukaryontische Expressionssysteme, wie Hefe- und Insektenzellen, produziert werden. Der Nachteil der Technik ist kompliziert, hoher Bedarf, geringe Ausbeute und manchmal existieren virale Infektionen.

Für all diese Expressionssysteme gibt es vor allem Vor- und Nachteile. Der Vorteil des E. coli- und Hefe-Expressionssystems ist ein hohes Expressionsniveau und niedrige Kosten. Aber ihre Modifikationssysteme unterscheiden sich von Insektenzellen und Säugerzellen. Protein, das von Säugerzellen produziert wird, ist dem nativen Protein ähnlich. Der Nachteil ist jedoch ein niedriges Expressionsniveau und eine komplizierte Operation. Die biologische Aktivität und Immunogenität der rekombinanten Proteine, die von verschiedenen Expressionssystemen produziert werden, sind manchmal aufgrund der umgeleiteten posttranslationalen Prozessierung unterschiedlich. Daher müssen wir bei der Auswahl des Expressionssystems eine Vielzahl von Faktoren berücksichtigen, z. B. ob das Zielprotein toxisch ist, ob das Protein biologische Aktivität benötigt, ob die Glykosylierung für das Protein und Kosteneffizienz erforderlich ist, Reinigung, Sicherheit und so weiter. Unterstützt durch erfahrenes experimentelles Wissen und unter Berücksichtigung all dieser Faktoren wird unser Fachwissen die geeignete Entscheidung und Auswahl treffen.

Tabelle 1. Vergleichen Sie einfach zwischen Expressionssystemen

Bakterielles Expressionssystem Hefe-Expressionssystem Insekten-Expressionssystem Säugetier-Expressionssystem
Geschwindigkeit ★★★★ ★★★ ★★
Ertrag ★★★ ★★★★ ★★
PTM
(relativ zum Menschen)
★★ ★★★ ★★★★
Kosten ★★★★ ★★★ ★★
Anwendung Prokaryotisches Protein, einfaches eukaryotisches Protein Intrazelluläres/sekretiertes Protein, Disulfid-gebundenes Protein, glykosyliertes Protein Membranprotein, Großes Protein,
Virale Impfstoffe, Signalproteine, Zytokine, Kinasen
Komplexes eukaryotisches Protein, Protein braucht genaues PTM

Wir bieten alle Dienstleistungen für Proteinexpressionssysteme in unserem Unternehmen an. Wenn Sie Fragen zur Wahl des rekombinanten Proteins und des Expressionssystems haben, können Sie uns gerne für weitere Informationen kontaktieren!


Normale Lebensdauer und Zelllinienableitung

Während der frühen Entwicklungsstadien durchlaufen tierische Zellen eine ausgedehnte Proliferation und Differenzierung, während sie sich zu verschiedenen Geweben und Organen entwickeln. Bei einem Erwachsenen ruht die überwiegende Mehrheit der Zellen, obwohl sie metabolisch aktiv sind und ihre physiologischen Aufgaben erfüllen, wie beispielsweise die Filtration in den Nieren oder die Synthese und chemische Umwandlung in der Leber, die meisten teilen sich jedoch nicht aktiv. Die meisten normalen adulten Zellen teilen sich nur als Reaktion auf Stimuli, um alte oder beschädigte Zellen wieder aufzufüllen. Nur Zellen in bestimmten Geweben, wie Haut- oder Darmepithelzellen, teilen sich regelmäßig.

Der Körper hat über 200 verschiedene Arten von Zellen, von denen viele nicht ausgeschnitten und in Kultur gezüchtet werden können. Zellen, die einer Kultur besser zugänglich sind, umfassen Fibroblasten und bestimmte Epithelzellen. Ein erster Schritt bei der Zellisolierung ist die Explantation eines Gewebes in einer physikalischen und chemischen Umgebung, die für diese Zellen geeignet ist, um zu überleben und sich zu vermehren.

Eine permissive Umgebung für das Zellwachstum erfordert eine komplexe Mischung von Nährstoffen, darunter Zucker, Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und Wachstumsfaktoren wie Insulin. Mit Ausnahme bestimmter Zelltypen im Blut sind aus Geweben gewonnene Zellen verankerungsabhängig, d. h. sie wachsen nicht als frei schwebende Einzelzellen. Daher benötigen Zellen nach der Freisetzung aus der Gewebeumgebung eine Oberfläche, an der sie sich anheften können, da sie andernfalls nicht überleben und sich teilen können.

Nach der Anheftung wachsen und expandieren Zellen auf leeren Oberflächen, bis die gesamte Oberfläche mit einer Schicht von einer Zelle Dicke bedeckt ist (d.h., eine Monoschicht). An diesem Punkt hören sie auf, sich zu teilen und erreichen einen Zustand, der als Kontakthemmung bezeichnet wird. Als nächstes wird ein Enzym wie Trypsin verwendet, um die Proteine ​​​​abzubauen, die die Zellen an die Oberfläche „kleben“, wodurch die Zellen in Lösung gebracht werden. Nach dem Ablösen können die Zellen in ein Kulturgefäß mit größerer Oberfläche überführt werden, um das Wachstum wieder aufzunehmen.

Dieser Zyklus von Anheftung, Zellexpansion und Ablösung kann viele Male wiederholt werden, wobei jeder Zyklus aus mehreren Zellteilungen besteht. Die meisten normalen Zellen haben jedoch eine interne Uhr, die ihre eigenen Verdopplungen zählt. Die Zellteilung stoppt, sobald das sogenannte Hayflick-Limit erreicht ist (3, 4). Die meisten aus Geweben gewonnenen Zellen können sich bis zu 40–60 Mal teilen, bevor sie aufhören zu proliferieren (seneszent werden) und ein anormales Aussehen aufweisen. Nichtsdestotrotz ist die Zahl der Verdoppelungen, die diese Zellen in Kultur aufrechterhalten können, für Anwendungen in der Impfstoffproduktion ausreichend.

Die von diesen Zellen gezeigte Seneszenz und Kontakthemmung sind Kennzeichen von Zellen aus normalem Gewebe. Bestimmte aus Krebszellen isolierte Zellen sind jedoch unsterblich und können die Kontakthemmung überwinden. Vor mehr als einem halben Jahrhundert gelang es Wissenschaftlern, Zellen zu isolieren, die die Seneszenz überlebten (5, 6). Diese Zellen teilten sich weiter, nachdem alle anderen gestorben waren. Interessanterweise gehorchten einige der überlebenden Zellen im Gegensatz zu Krebszellen immer noch der Kontakthemmung und sahen morphologisch normal aus.

Diese unsterblichen Zellen, die die Hayflick-Grenze umgehen und sich weiter teilen, werden Zelllinien genannt und sind in Kultur im Gegensatz zu Zellstämmen, die aus normalem Gewebe isoliert wurden, unsterblich. Zellstämme und Zelllinien unterscheiden sich in einem weiteren wichtigen Punkt: Alle Zellen in Zellstämmen haben normale Chromosomen mit zwei Sätzen pro Zelle, während Zellen aus Zelllinien typischerweise nicht zwei Chromosomensätze haben, auch wenn sie morphologisch normal sind.

Viele Zelllinien induzieren die Tumorbildung, wenn sie Mäusen mit geschwächtem Immunsystem injiziert werden. Da sie jedoch für immer kultiviert werden können, können Zelllinien gentechnisch verändert werden, um ein Produkt in praktisch unbegrenzter Menge herzustellen. Aus diesem Grund verwenden alle in Säugerzellen produzierten therapeutischen Proteine ​​Zelllinien.


Transiente Transfektionsmethoden

Liposomen sind synthetische Analoga der Phospholipid-Doppelschicht, dem Baustein der Zellmembran. Diese Transfektionsverbindungen teilen eine Reihe von Eigenschaften mit ihren natürlichen Gegenstücken, einschließlich der Anwesenheit von hydrophoben und hydrophilen Regionen jedes Moleküls, die die Bildung von kugelförmigen Liposomen unter wässrigen Bedingungen ermöglichen. In Gegenwart von freier DNA oder RNA verkapseln Liposomen die Nukleinsäuren, um ein effizientes Abgabesystem zu schaffen. Die Ladung, Zusammensetzung und Struktur des Liposoms definiert die Affinität des Komplexes zur Zellmembran. Unter bestimmten Bedingungen ist der Liposom-Nukleinsäure-Komplex in der Lage, mit der Zellmembran zu interagieren, um durch Endozytose in die Zelle einzudringen und anschließend die Nukleinsäuren in das Zytoplasma freizusetzen. Es gibt mehrere Faktoren, die die erfolgreiche Abgabe von Nukleinsäuren durch Liposomen in Säugerzellen bestimmen, einschließlich Partikelgröße, Lipidformulierung, Ladungsverhältnis und das Verfahren der Liposomenherstellung.

Alternativen zu Liposomen umfassen nicht-liposomale Lipide und Polymere, die mit Nukleinsäure Komplexe bilden können, um Mizellen zu bilden, oder winzige einkapselnde Tröpfchen. Die Transfektion wird normalerweise unter wässrigen Bedingungen durchgeführt, wodurch der lipophile Teil der amphiphilen Verbindung oder der Teil des Tröpfchens, der eine Affinität zu Fettsäuren wie die Zellmembran zeigt, die Mizellenkapsel bilden kann, die die exogenen Nukleinsäuren umhüllt .

Dendrimere sind hochverzweigte, kugelförmige Makromoleküle, die mit DNA in Wechselwirkung treten können, um kleine Komplexe zu bilden. Dendrimere sind in biologischen Flüssigkeiten stabil und nicht temperaturempfindlich. Diese Eigenschaften machen Dendrimere zu hocheffizienten Werkzeugen für die Transfektion von Gewebekulturen. Der Nachteil von Dendrimeren ist, dass sie nicht biologisch abbaubar sind und daher bei längerer Exposition für Zellen toxisch sein können.

Die Elektroporation ist eine hocheffiziente Technik zur Abgabe exogener Nukleinsäuren an Suspensionszellen und nicht-adhärente Primärzellen (wie Lymphozyten). Diese Technik verwendet Elektrizität, um transiente Poren (Elektroporen) in der Zellmembran zu erzeugen, um die Aufnahme geladener Nukleinsäuremoleküle (RNA oder DNA) in die Zielzellen zu ermöglichen.


Positive Selektion in Säugerzellen

Um eine stabile Transfektion zu erreichen, sollte ein selektiver Druck bestehen, um Zellen zu zwingen, die Plasmid-DNA in das Genom einzubauen. Für die Zwecke dieses Beitrags definieren wir positive Selektion als Mittel zum Aufnehmen positiver Merkmale (dh das Plasmid enthält eine Kassette, die Zellen resistent gegen ein Toxin macht), während negative Selektion das Aufnehmen eines negativen Merkmals ( dh das Plasmid enthält eine Kassette, die Zellen gegenüber einem Toxin empfindlich macht). In der folgenden Tabelle konzentrieren wir uns auf die positive Selektion, jedoch können negative Selektionstechniken in Verbindung mit der positiven Selektion verwendet werden, um sicherzustellen, dass Ihr Gen auf eine bestimmte Stelle im Genom ausgerichtet wird.

Die positive Selektion in Säugerzellen funktioniert ähnlich wie in Bakterien und eine Tabelle der am häufigsten verwendeten Selektionsmarker ist unten aufgeführt:

HeLa, NIH3T3, CHO, COS-1, 293HEK

*Nicht umfassend. ** Bei Eukaryoten. ***Die für die Selektion verwendete Konzentration ist typischerweise höher (doppelt) als die, die für die Erhaltung einer transfizierten Zelllinie verwendet wird.


Optimierung der Proteinexpression

Wie ein Zug, der aus einer bestimmten Abfolge von Waggons besteht, von der Lokomotive bis zur Kombüse, können Proteine ​​den Bahnhof erst „verlassen“, nachdem jedes ihrer Segmente, Aminosäuren, miteinander verbunden sind.

Tatsächlich ist das Pendeln von Waggons auf einem Bahnhof viel einfacher als die Prozesse, die die Proteinexpression ausmachen – Prozesse, die mit der Transkription beginnen, in der Übersetzung gipfeln und sogar in der posttranslationalen Modifikation ausgearbeitet werden. Es ist jedoch möglich, die Kontrolle über diese Prozesse zu übernehmen und wertvolle Fracht wie komplexe Biopharmazeutika zu befördern.

Mit dem Ziel, praktische Lösungen für die heutigen Herausforderungen zu bieten, konzentrierte sich der jüngste Bioprocessing Summit in einem Segment seines Konferenzprogramms auf Fortschritte bei der Proteinexpression. Dieses Segment umfasste neue Ansätze wie die Nutzung von RNA-Interferenz auf genomischer Ebene (RNAi), die Verbesserung des Glykoengineerings der allseits beliebten chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO)-Zellexpressionssysteme und die Harmonisierung der transienten und stabilen Expression, um die Wirkstoffentwicklung zu verbessern.

Präsentationen wurden auch Insektenzellen gewidmet. Wie andere Expressionssysteme können auch Insektenzellen zur Herstellung von Biotherapeutika verwendet werden, indem herstellungskompatible Prozesse sorgfältig optimiert werden. Schließlich berührten einige Präsentationen Outsourcing-Themen, wie die relativen Vorteile der Nutzung eines oder mehrerer Unternehmen für die zahlreichen Prozesse, die an der Proteinexpression beteiligt sind.

Multidisziplinärer Ansatz

Angesichts der unzähligen Herausforderungen, die eine effiziente Proteinexpression beeinträchtigen können, ist es manchmal sinnvoll, Spezialisten zu konsultieren. Zum Beispiel haben Outsourcing-Probleme viele Unternehmen dazu veranlasst, mit Ingenza zusammenzuarbeiten, die darauf abzielen, der bevorzugte Partner in der industriellen Biotechnologie und synthetischen Biologie zu sein.

„Es gibt viele unbekannte und bekannte Facetten einer effektiven Proteinexpression, die ein hohes Maß an Fachwissen erfordern, um gleichzeitig zu optimieren“, sagte Ian Fotheringham, Ph.D., Geschäftsführer von Ingenza. „Einige Labore verfügen über Kenntnisse in dem einen oder anderen Aspekt, aber oft ist es effizienter, mit jemandem zusammenzuarbeiten, der die vielfältigen Aspekte einer effektiven Proteinexpression anspricht. In dieser Hinsicht sind wir unverwechselbar.“

Dr. Fotheringham stellte fest, dass Outsourcing mittlerweile eine etablierte Option im Bereich der Proteinexpression ist: „Kunden wollen jemanden, der produziert, innovativ ist, Fehler behebt und kontinuierlich mit ihnen im Dialog steht, um ihre Erfolgschancen zu erhöhen. Wir sind aus gutem Grund ein multidisziplinäres Unternehmen.“

Als Beispiel beschrieb Dr. Fotheringham die Zusammenarbeit mit einem führenden US-amerikanischen Biopharmaunternehmen, dessen exprimiertes Zielprotein im rekombinanten Wirt verkürzt wurde. „Zuerst optimierten wir das Zielgen für die Expression in Escherichia coli mit einer Bibliothek von

50.000 Sequenzvarianten der kodierenden Region. Wir haben ein einfaches Petriplatten-Screening entwickelt, das schnell die besten Performer in voller Länge identifizierte.

„Angespornt von solchen Erfolgen haben wir in der Folge GMP-konforme Produktionsstämme für viele unserer Kundenziele bereitgestellt. An anderen Projekten wurden erfolgreich Dual-Kassetten-Vektoren (wie Target und Chaperon), alternative Wirte, neuartige Induktionsstrategien und gezielte Genomintegration zur Optimierung der Stabilität, Produktion und Reinigung rekombinanter Proteine ​​beteiligt.“

Ingenza arbeitet auch mit akademischen Einrichtungen und aufstrebenden Spin-outs zusammen, um innovative Forschung zu übersetzen. Dr. Fotheringham nannte als Beispiel Epidermicin, ein starkes antimikrobielles Mittel, das von einem Universitätspartner des Unternehmens entdeckt wurde. Epidermicin kann Methicillin-resistente bekämpfen Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion, war aber zunächst aufgrund der Wirtstoxizität nur in geringen Mengen exprimierbar.

„Wir nutzten unsere proprietäre inABLE ® kombinatorische Montageplattform, um spaltbare Fusionskonstrukte herzustellen und zu screenen, die in Kombination mit einer durch das Design-of-Experiment (DOE) getriebenen Fermentation eine Überproduktion von Epidermicin und seinen Derivaten ermöglichten“, erläutert Dr. Fotheringham. „Erfolg ist, dass ein Universitäts-Spin-off das Ergebnis verwerten kann.“

Das Unternehmen bewegt sich nun weiter in die GMP-Biologika-Arena mit Schlüsselkunden vor, indem es optimierte mikrobielle und Säugetier-Produktionssysteme und modulare Single-Use-Fermentationsansätze verwendet, um Arzneimittelsubstanzen für die klinische Bewertung und Herstellung bereitzustellen.


Ingenza verwendet einfache Petrischalen-Screenings, um die Zielgenexpression in Escherichia coli mithilfe einer Bibliothek von . zu optimieren

Harmonisierung von transientem und stabilem CHO-Ausdruck

Für diejenigen, die intern arbeiten, bleibt die Expression von Proteinprodukten in CHO-Zellen aus verschiedenen Gründen eine der beliebtesten Expressionsplattformen, sagte Yashas Rajendra, Ph.D., Forschungswissenschaftler Eli Lilly and Company. „CHO-Systeme“, erklärte er, „sind von Natur aus anpassungsfähig und einfach auf industrielle Bioreaktoren skalierbar“

Für die Frühphase der Wirkstoffforschung komplexer Biopharmazeutika verlassen sich Unternehmen jedoch häufig auf HEK293-Plattformen für die transiente Expression. „Dies kann das Risiko von Überraschungen erhöhen, wenn Moleküle weiterentwickelt und schließlich in CHO exprimiert werden“, warnte Dr. Rajendra. „Um dieses Risiko zu reduzieren, haben wir eine transiente CHO-Plattform entwickelt, die auf derselben Zelllinie, demselben Medienpaket und derselben DNA-Expressionskassette basiert, die für unsere stabile CHO-Plattform verwendet werden.“

Laut Dr. Rajendra kann die Harmonisierung transienter und stabiler Expressionsansätze eine bessere Vorhersagbarkeit der Proteinqualität und -expression beim Übergang der Moleküle von der Entdeckung zur Entwicklung und schließlich zur Herstellung ermöglichen. „Dieses transiente CHO-System kann schnell (innerhalb von sieben Tagen) hohe Titer erzeugen“, versicherte Dr. Rajendra. „Das System ist auf 10 Liter skalierbar.“

Die Gruppe von Dr. Rajendra führte eine weitere Modifikation ein: die Verwendung stabiler CHO-Pools (anstelle von Master-Wells oder Klonen), um Grammmengen an therapeutischem Protein zu erzeugen. „Es dauert 2–4 Wochen, um einen stabilen CHO-Pool zu erzeugen“, bemerkte Dr. Rajendra. „Im Gegensatz dazu dauert es in der Regel mehrere Monate, um klonale CHO-Zelllinien zu generieren. Daher ist die Geschwindigkeit ein großer Vorteil von stabilen Pools.

„Zusätzlich zu den Vorteilen gegenüber der transienten Expression gehören die Verwendung kleinerer Mengen an Plasmid-DNA für die Transfektion, die einfache volumetrische Skalierung und die Flexibilität, mehrere Produktionsläufe über einen längeren Zeitraum mit einer gefrorenen Zellbank durchzuführen. Wir haben kürzlich CHO-Pool-Titer im Bereich von 2 bis 7,6 g/L veröffentlicht.“

Dr. Rajendra wies darauf hin, dass derzeit stabile Pools aufgrund von Bedenken hinsichtlich klonaler Heterogenität, genetischer Stabilität und Expressionsstabilität sowie Produktqualitätskonsistenz hauptsächlich für die präklinische Materialerzeugung verwendet werden. In Zukunft kann sich die Verwendung stabiler Pools jedoch auf die Generierung von Toxikologie-Chargen und die ersten Humandosisstudien erstrecken.

„Obwohl dies einige Zeit dauern wird“, schloss Dr. Rajendra, „hoffe ich, dass wir angesichts der Fortschritte im Wirtszell-Engineering, Transposon-vermittelten Ansätzen und Analysewerkzeugen, die eine eingehende Bewertung der Produktqualität ermöglichen, sehen werden ein Wechsel vom „Klonalität“-Paradigma hin zu einem „Produktqualitätskonsistenz“-Paradigma.“

Glycoengineering in CHO

Obwohl sie weit verbreitet sind, stellen CHO-Expressionssysteme ähnliche Herausforderungen wie andere Säugerzellen. Insbesondere produzieren CHO-Zellen rekombinante Proteine, die in N-Glykanen vom komplexen Typ heterogen sind.

„Die Glykosylierung ist eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen von Proteinen“, sagt Andrew (Cheng-Yu) Chung, Forscher, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University (JHU). „Glykane auf Proteinen spielen eine Schlüsselrolle, insbesondere bei der Proteinfaltung. Somit haben sie einen signifikanten Einfluss auf die Proteinstabilität und die Protein-Protein-Interaktionen.“

Chung, der im Labor von Michael J. Betenbaugh, Ph.D., arbeitet, untersucht die Sialylierung von gentechnisch veränderten Proteinen. „Aufgrund der negativen Ladung, Größe und hydrophilen Eigenschaften der Sialinsäuregruppen ist die Sialylierung eine der sehr kritischen Modifikationen am Glykanterminus“, erklärte Chung. Diese Eigenschaften ermöglichten es der Sialinsäure, einen erheblichen Einfluss auf die Protein-Protein-Interaktionen zu haben. Darüber hinaus kann die Sialylierung die Wirksamkeit von Biotherapeutika beeinträchtigen.“

Chung und Kollegen untersuchten die Anwendung gentechnischer Strategien zur Modulation des Sialylierungsgehalts verschiedener potenzieller Biotherapeutika. „Ein gängiger Weg, die Glykanstruktur zu manipulieren, sind gentechnische Werkzeuge wie CRISPR/Cas9, um bestimmte Glykoenzyme zu knockin/knockout oder zu überexprimieren“, bemerkte er. „Zum Beispiel ist die Überexpression von Glykoenzymen, die am Sialylierungsweg beteiligt sind, eine Strategie zur Herstellung von Biologika mit erhöhtem Sialinsäuregehalt, der die Kreislaufretentionszeit (CRT) beeinflussen kann. Eine erhöhte CRT kann für die Patienten niedrigere Dosen bedeuten.“

Eine andere Strategie, um die Glykosylierung in CHO-Zellen einheitlicher und dem analogen Prozess in menschlichen Zellen ähnlich zu machen, besteht darin, dem Zellkulturmedium spezifische chemische Ergänzungen zuzusetzen.

Chungs Gruppe beschloss, beide Strategien – Gentechnik und Zusatzmedienergänzung – gleichzeitig auszuprobieren. „Die Gentechnik von CHO-Zellen kann verwendet werden, um Biologika mit verbesserter Sialylierung sowie höheren Proteintitern herzustellen“, sagte Chung. Dieser Ansatz, so Chung weiter, wurde mit der Verwendung chemischer Nahrungsergänzungsmittel kombiniert. Die spezifischen chemischen Analoga, die dem Futter zugesetzt werden, wurden von Kevin Yarema, Ph.D., einem assoziierten Professor für Biomedizintechnik an der JHU, entwickelt.

Insektenzellausdruck

Während die meisten rekombinanten Biotherapeutika in Säugerzellen produziert werden, werden andere in Insektenzellen produziert. Beispielsweise wurde eine Insektenzellplattform ausgewählt, um rekombinante Proteine ​​für Genocea Biosciences zu exprimieren.

„Unser therapeutischer Impfstoff (GEN-003) gegen Herpes genitalis besteht aus zwei rekombinanten Proteinen in Kombination mit einem Adjuvans“, sagte Rajiv Gangurde, Ph.D., stellvertretender Direktor der Proteinproduktion. „Beide Proteine ​​werden in Insektenzellen exprimiert.

„Die Wahl der Expressionsplattform wurde in erster Linie durch spezifische posttranslationale Modifikation(en) bestimmt, die für die Aktivität erforderlich sind, d. h. die Fähigkeit, eine geeignete immunogene Reaktion durch eines der Antigene hervorzurufen. Diese Modifikationen sind nicht nur spezifisch für die Wirtszellen, in denen das rekombinante Protein exprimiert wird, sondern werden auch vom Menschen gut vertragen, was einer der größten Vorteile der Verwendung von Insektenzellen ist.“

Genitalherpes ist eine schwere chronische Infektion, von der weltweit mehr als 400 Millionen Menschen und allein in den Vereinigten Staaten über 50 Millionen Menschen betroffen sind. Dr. Rajiv wies darauf hin, dass es seit Jahrzehnten keine wirkliche Innovation für die Patienten gegeben habe, nicht seit der Zulassung oraler antiviraler Mittel.

Prior to expressing the product in insect cells, Dr. Rajiv and colleagues needed to overcome some specific hurdles. “Early on, we faced several challenges in developing manufacturing-compatible processes,” he noted. “We have overcome those hurdles through extensive in-house process development work and choosing a contract manufacturing organization with insect cell production scale-up experience.

“One protein is expressed as a soluble, secreted protein, while the other is an intracellular, insoluble protein. This fundamental difference in expression makes it easier to express the proteins separately. Moreover, there are notable differences in the levels of expression hence, independent expression allows the required flexibility in downstream processing and drug product manufacture.”

The company, which is conducting its third clinical trial with GEN-003, expects to start Phase III in the second half of next year. Next, the company plans to file a Biologics License Application with the FDA in 2019. If the application is approved, the company will launch GEN-003 in 2020.

“We believe we have established GEN-003 as a highly attractive product that requires only a once-yearly injection offering similar efficacy to that of daily oral antiviral therapy,” asserts Dr. Rajiv. “Given that most patients choose not to take daily oral anti-viral pills and accounting for compliance challenges with daily therapy, we believe the real-world efficacy of GEN-003 from an annual injection could translate into significant patient benefits and a revenue opportunity in excess of $1 billion in the United States alone.”


Genocea Biosciences’ Rajiv Gurde, Ph.D., utilizes insect cells to separately express two key recombinant proteins for the company’s therapeutic vaccine, GEN-003, against genital herpes.

RNAi to Enhance Expression

Aside from its traditional use as a workhorse technique for basic research, RNAi also has applications for improving protein expression.

“RNAi has been often applied in the fields of medical and basic research, especially to understand disease mechanisms,” reports Joseph Shiloach, Ph.D., director of the Biotechnology Core Laboratory, Intramural Research at the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health. “We decided to use it for identifying genes that are currently not known to be involved in protein expression, yet whose knockdown could improve recombinant protein production in mammalian cells.”

Dr. Shiloach and colleagues performed a genome-scale, high-throughput RNAi screen using HEK293 cells expressing firefly luciferase. “The basic idea was to individually knock down approximately 22,000 genes one at a time and look for those that affected expression, but did not affect cell growth,” explained Dr. Shiloach. “We utilized three different siRNAs for each gene and performed the work collaborating with the National Center for Advanced Translational Science.”

Among the “hits” identified was the gene for ornithine decarboxylase antizyme 1. The protein product helps regulate intracellular polyamines that are needed for cell growth and proliferation. “We also performed a detailed investigation to confirm the findings,” continued Dr. Shiloach. “We are now assessing the long-term effects of knockdown, the mechanisms involved in metabolism, and feasibility of extending this approach to other mammalian cells.”

According to Dr. Shiloach, the take-home message from these studies is that genome-scale RNAi screens can identify key pathways and genes whose modulation may help improve the expression and production of recombinant proteins. “These studies are more a beginning than an ending,” he stated. “But we have established a different foundation for the targeted design of more efficient mammalian cell expression platforms.”

Boosting Expression

Expression levels of recombinant proteins (simple proteins as well as complex biologics) can be unpredictable in mammalian cells, and this causes major headaches for target discovery and scale-up manufacture, according to Tom Payne, Ph.D., head of cell engineering at Oxford Genetics. Scientists are familiar with finding that sometimes proteins express at unexpectedly low levels, even when under the control of strong promoters (e.g., CMV).

“To minimize protein-to-protein variability and maximize yield, we adopted a high-throughput approach to screen and optimize >5,000 recombinant promoters by random shuffling, >30 5’ UTRs in different configurations and >15 poly-A signals,” said Dr. Payne. “We also developed Kozak and stop codon libraries and screened >1,000 genes from diverse organisms encoding putative ancillary protein to generate expression plasmids that consistently produce high yields of diverse proteins in HEK-293 and CHO systems, termed SnapFast Pro.”

Validating the System

To validate this vector system, Dr. Payne and his team compared protein yields to an industry-standard protein-expression vector. To maximize the relevance of the dataset they algorithmically determined the frequency with which each gene in the human genome had been cited in publications (PubMed hits, 2000–2016), identifying those genes consistently increasing in hits, as an indication of importance in biomedical research.

“The top 150 genes were batch codon-optimized, FLAG-tagged, and sub-cloned into the expression vector or SnapFast Pro,” continued Dr. Payne. “Following transient transfection into either CHO-K1 or HEK-293 cells, lysates and/or supernatants (depending on whether the protein is secreted) were subjected to high-throughput automated western blot. For both secreted and nonsecreted proteins, SnapFast Pro gave consistently high-level protein expression, in many cases showing high expression where no protein could be detected with the reference expression vector.”


Oxford Genetics is a specialist synthetic biology company focused on providing DNA, protein, virus, and cell-line design and development solutions. Two of the firm’s scientists can be seen working on a custom cell-line development project looking to optimize expression of a client’s gene of interest.


Protein Purification Strategies

Proteins are biological macromolecules that maintain the structural and functional integrity of the cell, and many diseases are associated with protein malfunction. Protein purification is a fundamental step for analyzing individual proteins and protein complexes and identifying interactions with other proteins, DNA or RNA. A variety of protein purification strategies exist to address desired scale, throughput and downstream applications. The optimal approach often must be determined empirically.

Proteinreinigung

The best protein purification protocol depends not only on the protein being purified but also on many other factors such as the cell used to express the recombinant protein (e.g., prokaryotic versus eukaryotic cells). Escherichia coli remains the first choice of many researchers for producing recombinant proteins due to ease of use, rapid cell growth and low cost of culturing. Proteins expressed in E coli can be purified in relatively high quantities, but these proteins, especially eukaryotic proteins, may not exhibit proper protein activity or folding. Cultured mammalian cells might offer a better option for producing properly folded and functional mammalian proteins with appropriate post-translational modifications (Geisse et al. 1996). However, the low expression levels of recombinant proteins in cultured mammalian cells presents a challenge for their purification. As a result, attaining satisfactory yield and purity depends on highly selective and efficient capture of these proteins from the crude cell lysates.

To simplify purification, affinity purification tags can be fused to a recombinant protein of interest (Nilsson et al. 1997). Common fusion tags are polypeptides, small proteins or enzymes added to the N- or C-terminus of a recombinant protein. The biochemical features of different tags influence the stability, solubility and expression of proteins to which they are attached (Stevens et al. 2001). Using expression vectors that include a fusion tag facilitates recombinant protein purification.

Isolation of Protein Complexes

A major objective in proteomics is the elucidation of protein function and organization of the complex networks that are responsible for key cellular processes. Analysis of protein:protein interactions can provide valuable insight into the cell signaling cascades involved in these processes, and analysis of protein:nucleic acid interactions often reveals important information about biological processes such as mRNA regulation, chromosomal remodeling and transcription. For example, transcription factors play an important role in regulating transcription by binding to specific recognition sites on the chromosome, often at a gene’s promoter, and interacting with other proteins in the nucleus. This regulation is required for cell viability, differentiation and growth (Mankan et al. 2009 Gosh et al. 1998).

Analysis of protein:protein interactions often requires straightforward methods for immobilizing proteins on solid surfaces in proper orientations without disrupting protein structure or function. This immobilization must not interfere with the binding capacity and can be achieved through the use of affinity tags. Immobilization of proteins on chips is a popular approach to analyze protein:DNA and protein:protein interactions and identify components of protein complexes (Hall et al. 2004 Hall et al. 2007 Hudson and Snyder, 2006). Functional protein microarrays normally contain full-length functional proteins or protein domains bound to a solid surface. Fluorescently labeled DNA is used to probe the array and identify proteins that bind to the specific probe. Protein microarrays provide a method for high-throughput identification of protein:DNA interactions. Immobilized proteins also can be used in protein pull-down assays to isolate protein binding partners in vivo (mammalian cells) or in vitro. Other downstream applications such as mass spectrometry do not require protein immobilization to identify protein partners and individual components of protein complexes.


Inhalt

Commonly used protein production systems include those derived from bacteria, [2] yeast, [3] [4] baculovirus/insect, [5] mammalian cells, [6] [7] and more recently filamentous fungi such as Myceliophthora thermophila. [8] When biopharmaceuticals are produced with one of these systems, process-related impurities termed host cell proteins also arrive in the final product in trace amounts. [9]

Cell-based systems Edit

The oldest and most widely used expression systems are cell-based and may be defined as the "combination of an expression vector, its cloned DNA, and the host for the vector that provide a context to allow foreign gene function in a host cell, that is, produce proteins at a high level". [10] [11] Overexpression is an abnormally and excessively high level of gene expression which produces a pronounced gene-related phenotype. [12] [13]

There are many ways to introduce foreign DNA to a cell for expression, and many different host cells may be used for expression — each expression system has distinct advantages and liabilities. Expression systems are normally referred to by the host and the DNA source or the delivery mechanism for the genetic material. For example, common hosts are bacteria (such as E coli, B. subtilis), yeast (such as S.cerevisiae [4] ) or eukaryotic cell lines. Common DNA sources and delivery mechanisms are viruses (such as baculovirus, retrovirus, adenovirus), plasmids, artificial chromosomes and bacteriophage (such as lambda). The best expression system depends on the gene involved, for example the Saccharomyces cerevisiae is often preferred for proteins that require significant posttranslational modification. Insect or mammal cell lines are used when human-like splicing of mRNA is required. Nonetheless, bacterial expression has the advantage of easily producing large amounts of protein, which is required for X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance experiments for structure determination.

Because bacteria are prokaryotes, they are not equipped with the full enzymatic machinery to accomplish the required post-translational modifications or molecular folding. Hence, multi-domain eukaryotic proteins expressed in bacteria often are non-functional. Also, many proteins become insoluble as inclusion bodies that are difficult to recover without harsh denaturants and subsequent cumbersome protein-refolding.

To address these concerns, expressions systems using multiple eukaryotic cells were developed for applications requiring the proteins be conformed as in, or closer to eukaryotic organisms: cells of plants (i.e. tobacco), of insects or mammalians (i.e. bovines) are transfected with genes and cultured in suspension and even as tissues or whole organisms, to produce fully folded proteins. Säugetier in vivo expression systems have however low yield and other limitations (time-consuming, toxicity to host cells. ). To combine the high yield/productivity and scalable protein features of bacteria and yeast, and advanced epigenetic features of plants, insects and mammalians systems, other protein production systems are developed using unicellular eukaryotes (i.e. non-pathogenic 'Leishmania' cells).

Bacterial systems Edit

Escherichia coli Bearbeiten

E coli is one of the most widely used expression hosts, and DNA is normally introduced in a plasmid expression vector. The techniques for overexpression in E coli are well developed and work by increasing the number of copies of the gene or increasing the binding strength of the promoter region so assisting transcription.

For example, a DNA sequence for a protein of interest could be cloned or subcloned into a high copy-number plasmid containing the lac (often LacUV5) promoter, which is then transformed into the bacterium E coli. Addition of IPTG (a lactose analog) activates the lac promoter and causes the bacteria to express the protein of interest.

E coli strain BL21 and BL21(DE3) are two strains commonly used for protein production. As members of the B lineage, they lack lon und OmpT proteases, protecting the produced proteins from degradation. The DE3 prophage found in BL21(DE3) provides T7 RNA polymerase (driven by the LacUV5 promoter), allowing for vectors with the T7 promoter to be used instead. [14]

Corynebacterium Bearbeiten

Non-pathogenic species of the gram-positive Corynebacterium are used for the commercial production of various amino acids. Die C. glutamicum species is widely used for producing glutamate and lysine, [15] components of human food, animal feed and pharmaceutical products.

Expression of functionally active human epidermal growth factor has been done in C. glutamicum, [16] thus demonstrating a potential for industrial-scale production of human proteins. Expressed proteins can be targeted for secretion through either the general, secretory pathway (Sec) or the twin-arginine translocation pathway (Tat). [17]

Unlike gram-negative bacteria, the gram-positive Corynebacterium lack lipopolysaccharides that function as antigenic endotoxins in humans.

Pseudomonas fluorescens Bearbeiten

The non-pathogenic and gram-negative bacteria, Pseudomonas fluorescens, is used for high level production of recombinant proteins commonly for the development bio-therapeutics and vaccines. P. fluoreszenz is a metabolically versatile organism, allowing for high throughput screening and rapid development of complex proteins. P. fluoreszenz is most well known for its ability to rapid and successfully produce high titers of active, soluble protein. [18]

Eukaryotic systems Edit

Yeasts Edit

Expression systems using either S. cerevisiae oder Pichia pastoris allow stable and lasting production of proteins that are processed similarly to mammalian cells, at high yield, in chemically defined media of proteins.

Filamentous fungi Edit

Filamentous fungi, especially Aspergillus und Trichoderma, but also more recently Myceliophthora thermophila C1 [8] have been developed into expression platforms for screening and production of diverse industrial enzymes. The expression system C1 shows a low viscosity morphology in submerged culture, enabling the use of complex growth and production media.

Baculovirus-infected cells Edit

Baculovirus-infected insect cells [19] (Sf9, Sf21, High Five strains) or mammalian cells [20] (HeLa, HEK 293) allow production of glycosylated or membrane proteins that cannot be produced using fungal or bacterial systems. [19] It is useful for production of proteins in high quantity. Genes are not expressed continuously because infected host cells eventually lyse and die during each infection cycle. [21]

Non-lytic insect cell expression Edit

Non-lytic insect cell expression is an alternative to the lytic baculovirus expression system. In non-lytic expression, vectors are transiently or stably transfected into the chromosomal DNA of insect cells for subsequent gene expression. [22] [23] This is followed by selection and screening of recombinant clones. [24] The non-lytic system has been used to give higher protein yield and quicker expression of recombinant genes compared to baculovirus-infected cell expression. [23] Cell lines used for this system include: Sf9, Sf21 from Spodoptera frugiperda cells, Hi-5 from Trichoplusia ni cells, and Schneider 2 cells and Schneider 3 cells from Drosophila melanogaster Zellen. [22] [24] With this system, cells do not lyse and several cultivation modes can be used. [22] Additionally, protein production runs are reproducible. [22] [23] This system gives a homogeneous product. [23] A drawback of this system is the requirement of an additional screening step for selecting viable clones. [24]

Ausgrabungen Bearbeiten

Leishmania tarentolae (cannot infect mammals) expression systems allow stable and lasting production of proteins at high yield, in chemically defined media. Produced proteins exhibit fully eukaryotic post-translational modifications, including glycosylation and disulfide bond formation. [ Zitat benötigt ]

Mammalian systems Edit

The most common mammalian expression systems are Chinese Hamster ovary (CHO) and Human embryonic kidney (HEK) cells. [25] [26] [27]

    [26] myeloma lymphoblstoid (e.g. NS0 cell) [25]
  • Fully Human
    • Human embryonic kidney cells (HEK-293) [26]
    • Human embryonic retinal cells (Crucell's Per.C6) [26]
    • Human amniocyte cells (Glycotope and CEVEC)

    Cell-free systems Edit

    Cell-free production of proteins is performed in vitro using purified RNA polymerase, ribosomes, tRNA and ribonucleotides. These reagents may be produced by extraction from cells or from a cell-based expression system. Due to the low expression levels and high cost of cell-free systems, cell-based systems are more widely used. [28]


    Weitere Informationen

    Authors' contributions

    GC and VS designed the experiments. GC, VS and MG performed the experiments. AP developed the models and AP and DdB conducted simulations. AP, GC and DdB drafted the manuscript. DdB and MdB conceived and supervised the collaboration and overall strategy of the project and edited the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.

    Giulia Cuccato, Athanasios Polynikis contributed equally to this work.


    Customer Testimonial for our Protein Expression & Purification Services

    "GenScript provides fast, professional protein synthesis services at very reasonable prices. By making it cost-effective to outsource protein production, GenScript has made it possible for my lab to focus on our own area of expertise and get more research done. The detailed planning, updates, and reports that GenScript provides all of the quality control that one could ask for. I strongly recommend GenScript's protein production service."

    — Dr. Barry Bradford, Kansas State University, Department of Animal Sciences & Industry


    Schau das Video: Die Transkription - Proteinbiosynthese Teil 1 (August 2022).