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Warum sollten Sie Polymerasen in der PCR mischen?

Warum sollten Sie Polymerasen in der PCR mischen?



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Ich habe ein Handbuch für das Kit gelesen, in dem Sie DNA durch PCR amplifizieren müssen, bevor Sie sie im Kit analysieren. Das Handbuch schlägt vor, korrekturlesende und nicht korrekturlesende Polymerasen zu mischen:

Verwenden Sie für PCR-Produkte mit einer Länge von >2500 bp eine DNA-Polymerase-Mischung, die Taq-DNA-Polymerase enthält, ergänzt mit einer korrekturlesenden DNA-Polymerase

Wie würde dies die Verstärkung von Langprodukten verbessern? Es schlägt vor, nur eine Korrekturlese-Polymerase für Fragmente unter 2500 Basen zu verwenden. Verbessert die Zugabe einer nicht korrekturlesenden Polymerase die Geschwindigkeit? Ich habe TAQ und PFU Ultra, aber beide Anweisungen sagen, eine Verlängerungszeit von 1 Minute pro kb zu verwenden.


Die Taq-Polymerase ist ein ziemlich schnelles Enzym (die Syntheserate beträgt etwa 1 kb/min), aber der Nachteil besteht darin, dass sie keine 3'-5'-Exonuklease-Aktivität besitzt, die ein Korrekturlesen der neu synthetisierten DNA ermöglichen würde. Dies führt zur Einführung von Fehlern und die Wahrscheinlichkeit, diese zu bekommen, ist umso höher, je länger die DNA, die Sie synthetisieren möchten, ist.

Polymerasen, die Korrekturlesen können (die die Exonuklease-Aktivität aufweisen) wie Pfu haben eine viel geringere Fehlerrate, sind aber andererseits auch viel langsamer, typischerweise um 0,5 kb/min. Pfu ist auch teurer als die Taq-Polymerase. Siehe Tabelle 1 aus Referenz 1 unten:

Um die Vorteile beider Polymerasen zu kombinieren, verwenden Sie typischerweise eine Mischung aus Taq und Pfu. Dann erhalten Sie die hohe Prozessivität des Taq kombiniert mit der Korrekturlesekapazität des Pfu und erhalten gute DNA-Ausbeuten mit einer geringen Anzahl von Mutationen. Siehe auch Referenz 2 für Details zu diesem System.

Verweise:

  1. Fehlerratenvergleich während der Polymerase-Kettenreaktion durch DNA-Polymerase
  2. Effektive Amplifikation langer Targets aus klonierten Inserts und humaner genomischer DNA.

Wählen Sie die richtige DNA-Polymerase für die PCR

New England BioLabs verfügt über viele Polymerasen, die für die Verwendung in der PCR entwickelt wurden. Wie entscheiden Sie, welches Sie benötigen? Dies hängt in erster Linie von Ihrer Anwendung ab. Die erste Entscheidung, die Sie wahrscheinlich treffen werden, ist, ob Sie eine High-Fidelity-Verstärkung oder eine Standardverstärkung benötigen? Wenn Sie Ihr PCR-Produkt in nachfolgenden Experimenten wie Proteinexpression oder Sequenzierung verwenden möchten, möchten Sie den Einbau von Fehlern minimieren und sollten eine High-Fidelity-Polymerase wählen. Wenn Sie nur sehen müssen, ob Sie ein PCR-Produkt haben oder nicht, zum Beispiel wenn Sie bestätigen, dass Ihr Plasmid ein Insert hat, dann ist Standard- oder Kolonie-PCR geeignet.

Für eine High-Fidelity-Amplifikation empfehlen wir, mit der High-Fidelity-DNA-Polymerase Q5 zu beginnen, da sie die niedrigste verfügbare Fehlerrate aufweist und außerdem für eine wirklich robuste Leistung im gesamten ATGC-Spektrum optimiert wurde. Für die Standard-PCR oder die Kolonie-PCR empfehlen wir, mit der OneTaq DNA-Polymerase zu beginnen, die auch für eine hohe Leistung selbst bei schwierigen Templates wie GC-reich optimiert wurde.

Müssen Sie als Nächstes Ihre Reaktionen bei Raumtemperatur einstellen? Ist Spezifität eine Herausforderung? In diesem Fall ist eine Hot-Start-Version der Polymerase ideal.

Ihre nächste Entscheidung wird das Polymerase-Format sein. Für eine einfache Anwendung haben wir Mastermixe, die Enzym, Puffer und dNTPs enthalten, sowie Mastermix-Formate zum schnellen Laden, die auch Ladefarbstoff enthalten, damit Sie Ihre PCR direkt auf das Gel laden können. Und natürlich haben wir auch eigenständige Polymerasen.


Korrekturlesen der DNA-Polymerase

Die meisten DNA-Polymerasen besitzen eine 3´→5´-Korrektur-Exonukleasedomäne. Es ermöglicht dem Enzym, jedes Nukleotid während der DNA-Synthese zu überprüfen und fehlgepaarte Nukleotide in der 3´ bis 5´-Richtung auszuschneiden. Die Korrekturlesedomäne ermöglicht es einer Polymerase auch, ungepaarte 3´-überhängende Nukleotide zu entfernen, um stumpfe Enden zu erzeugen. Protokolle wie High-Fidelity-PCR, 3´-Überhangpolitur und High-Fidelity-Zweitstrangsynthese erfordern alle die Anwesenheit einer 3´→5´-Exonuklease.

Im Gegensatz dazu werden einige Anwendungen durch die Verwendung von Polymerasen ohne Korrekturleseaktivität verbessert. Zum Beispiel wird die Effizienz der DNA-Markierung durch das Fehlen eines Korrekturlesens verbessert, da es das Ausschneiden eingebauter Basen verhindert, wodurch weniger der modifizierten Base verwendet werden kann.

Modifizierte Baseneinbau-Assays, wie Multicolor-Analyse der Genexpression, Genkartierung und vor Ort Hybridisierungen, die DNA verwenden, die mit einem fluoreszierenden Nukleotid markiert wurde, um den Nachweis zu erleichtern, sind gut auf die Exonuklease-defizienten DNA-Polymerasen von NEB abgestimmt. Nicht-korrekturlesende Polymerasen sind auch unverzichtbar, wenn 5´-Überhänge nur mit ausgewählten dNTPs partiell ausgefüllt werden. Die Zugabe eines nicht-templatierten dNTP am 3´-Terminus von stumpfen Enden, eine Voraussetzung für die TA-Klonierung, wird auch durch nicht korrekturlesende Enzyme gefördert. Zusätzlich zu mehreren Wildtyp-Polymerasen in jeder dieser Kategorien bietet NEB genetisch veränderte Versionen mehrerer Korrekturlese-Polymerasen an, bei denen die Korrekturlese-Exonuklease-Aktivität abgeschwächt oder abgeschafft wurde.


Parameter, die die PCR . beeinflussen

Wesentliche Bestandteile von Polymerase-Kettenreaktionen:

    Eine thermostabile DNA-Polymerase zur Katalyse der matrizenabhängigen DNA-Synthese:

Abhängig von der Fähigkeit, Genauigkeit und Effizienz, große DNA-Produkte zu synthetisieren, steht heute eine große Auswahl an Enzymen zur Verfügung. Für Routine-PCRs bleibt Taq-Polymerase (0,5-2,5 Einheiten pro 25-50-ul-Standardreaktion) das Enzym der Wahl. Die spezifische Aktivität der meisten kommerziellen Zubereitungen von Taq ist

80.000 Einheiten/mg Protein. Da die Effizienz der Primerverlängerung mit Taq-Polymerase im Allgemeinen

0,7, wird das Enzym limitierend, wenn sich 1,4*1012 bis 7*1012 Moleküle des amplifizierten Produkts in der Reaktion angesammelt haben.

Da das Design des Oligonukleotidprimers der wichtigste Faktor ist, der die Effizienz und Spezifität der Amplifikationsreaktion beeinflusst, ist ein sorgfältiges Design der Primer erforderlich, um die gewünschten Produkte in hoher Ausbeute zu erhalten, die Amplifikation unerwünschter Sequenzen zu unterdrücken und die anschließende Manipulation der amplifizierten Produkt. Da die Primer den Erfolg oder Misserfolg von PCR-Protokollen so stark beeinflussen, ist es ironisch, dass die Richtlinien für ihr Design weitgehend qualitativ sind und mehr auf gesundem Menschenverstand als auf gut verstandenen thermodynamischen oder strukturellen Prinzipien basieren.

Design von Oligonukleotid-Primern für PCR

In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, mehrere Segmente der Ziel-DNA gleichzeitig zu amplifizieren. In diesen Fällen wird eine als "Multiplex-PCR" bezeichnete Amplifikationsreaktion verwendet, die mehr als ein Primerpaar im Reaktionsgemisch enthält. Standardreaktionen enthalten eine nicht begrenzende Menge an Primern, typischerweise 0,1–0,5 μM jedes Primers (6*1012 bis 3*1013 Moleküle). Diese Menge reicht für mindestens 30 Amplifikationszyklen eines 1-kb-DNA-Segments aus. Höhere Primerkonzentrationen begünstigen eine Fehlprimung, die zu einer unspezifischen Amplifikation führen kann.

Standard-PCRs enthalten äquimolare Mengen aller vier dNTPs. Für Taq-Polymerase in Reaktionen mit 1,5 mM MgCl2 empfohlene Konzentrationen von 200-250 μM jedes dNTP. In einer 50-ul-Reaktion sollten diese Mengen die Synthese von

6-6,5μg DNA, die auch für Multiplex-Reaktionen ausreichen sollte, bei denen acht oder mehr Primerpaare gleichzeitig verwendet werden. Hohe Konzentrationen von dNTPs (>4 mM) wirken hemmend, möglicherweise aufgrund der Sequestrierung von Mg2+. Eine zufriedenstellende Menge an amplifiziertem Produkt kann jedoch mit dNTP-Konzentrationen von nur 20 μM – 0,5-1,0 pM eines amplifizierten Fragments hergestellt werden

1kb lang. Um Probleme zu vermeiden, sollten dNTPs-Vorräte bei -20 °C in kleinen Aliquots gelagert werden, die nach dem zweiten Einfrieren oder Auftauen verworfen werden sollten. Bei längerer Lagerung bei -20 °C verdunsten kleine Mengen Wasser und gefrieren dann an den Wänden der Durchstechflasche. Um Konzentrationsänderungen zu minimieren, sollten Fläschchen mit dNTP-Lösungen nach dem Auftauen einige Sekunden in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert werden.

Alle thermostabilen DNA-Polymerasen benötigen für ihre Aktivität freie zweiwertige Kationen – normalerweise Mg2+. Einige Polymerasen funktionieren auch, wenn auch weniger effizient mit Puffern, die Mn2+ enthalten. Calciumionen sind ziemlich wirkungslos. Da dNTPs und Oligonukleotide Mg2+ binden, muss die molare Konzentration des Kations die molare Konzentration der Phosphatgruppen überschreiten, die von dNTPs und Primern beigesteuert werden. Es ist daher unmöglich, eine unter allen Umständen optionale Konzentration von Mg2+ zu empfehlen. Obwohl routinemäßig eine Konzentration von 1,5 mM Mg2+ verwendet wird, wurde berichtet, dass eine Erhöhung der Mg2+-Konzentration auf 4,5 mM oder 6 mM das unspezifische Priming in einigen Fällen verringert und in anderen erhöht. Die optimale Konzentration von Mg2+ muss daher für jede Kombination von Primern und Matrize empirisch bestimmt werden. Die Präparate der Template-DNA sollten keine signifikanten Mengen an Chelatbildnern (wie EDTA oder negativ geladene Ionen wie PO43-) enthalten, die Mg2+ sequestrieren können.

Tris-Cl, eingestellt auf einen pH zwischen 8,3 und 8,8 bei Raumtemperatur, ist in Standard-PCRs in einer Konzentration von 10 mM enthalten. Bei Inkubation bei 72 °C (Verlängerungsphase der PCR) sinkt der pH-Wert der Reaktionsmischung um mehr als eine volle Einheit, wodurch ein Puffer mit einem pH-Wert von entsteht

Standard-PCR-Puffer enthält 50 mM KCl und eignet sich gut für die Amplifikation von DNA-Segmenten mit einer Länge von > 500 bp. Erhöhung der KCl-Konzentration auf

70-100 mM verbessern oft die Ausbeute kürzerer DNA-Segmente.

Template-DNA, die Zielsequenzen enthält, kann der PCR in einzel- oder doppelsträngiger Form hinzugefügt werden. Geschlossene zirkuläre DNA-Matrizen werden etwas weniger effizient amplifiziert als lineare DNAs. Obwohl die Größe der Matrizen-DNA nicht kritisch ist, kann die Amplifikation von Sequenzen, die in DNA mit hohem Molekulargewicht (>10 kb) eingebettet sind, durch Verdauen der Matrize mit einem Restriktionsenzym, das nicht innerhalb der Zielsequenz spaltet, verbessert werden.

Im besten Fall benötigt die PCR nur eine einzige Kopie der Zielsequenz als Matrize. Typischer jedoch werden mehrere tausend Kopien der Ziel-DNA in die Reaktion eingeimpft. Im Fall von genomischer DNA von Säugetieren werden bis zu 1 μg DNA pro Reaktion verwendet, eine Menge, die

3*105 Kopien eines autosomalen Einzelkopie-Gens. Die typischen Mengen an Hefe-, Bakterien- und Plasmid-DNAs, die pro Reaktion verwendet werden, betragen 10 µg, 1 µg bzw. 1 pg.


Auswahl eines PCR-Master-Mix

Die Verwendung eines PCR-Mastermixes für Echtzeit-PCR-Experimente bietet eine schnellere Einrichtung mit weniger Pipettieren, weniger Kontamination, weniger Variabilität von Röhrchen zu Röhrchen und reproduzierbarere Ergebnisse.

Bio-Rad PCR-Mastermixe sind für verschiedene Anwendungen optimiert, beispielsweise für die Quantifizierung der Genexpression, Genotypisierung oder hochauflösende Schmelzanalyse. Bei der Auswahl des besten PCR-Mastermixes für Ihre Anwendung gibt es eine Reihe von Überlegungen, darunter:

  • Art der PCR &ndash Screening, Klonierung oder quantitativ
  • Größe des Amplikons
  • Vorlagenkomplexität und G-C-Inhalt, Sekundärstruktur usw.
  • Geschwindigkeit, Genauigkeit und Prozessivität der DNA-Polymerase
  • Inhibitortoleranz
  • Antikörper-vermittelte Hot-Start-Polymerase
  • Toleranz gegenüber Reaktionsparametern wie unterschiedlichen Primer-Tm Werte
  • Skalierbarkeit
  • Kosten pro Reaktion

DiyBio Thermocycler-Optionen

Diybio-Leute, die PCR-Reaktionen zu Hause durchführen möchten, haben einige Möglichkeiten. Wenn man bedenkt, dass Thermocycler eigentlich nur DNA-Proben über eine Reihe von Zyklen erhitzen und kühlen, hängt der Unterschied der Optionen vom Preis, der Größe und dem Automatisierungsgrad ab.

Hier sind einige der Optionen.

MiniPCR mini8

PocketPCR

BentoLab

Dort war auch OpenPCR, aber es sieht so aus, als ob das Projekt eingestellt und durch eine qPCR-Maschine ersetzt wurde, die bei etwa 5000 US-Dollar beginnt. Ich werde das überspringen, da dies für die meisten DIY-Biologen nicht im Bereich ist.

Für welchen Thermocycler habe ich mich letztendlich entschieden?

Ich habe alle Optionen abgewogen und bin in eine andere Richtung gegangen: einen gebrauchten Thermocycler bei eBay kaufen!

Der Kauf bei eBay ist von Natur aus riskant, aber machbar. Sie müssen unbedingt sicherstellen, dass in der Auflistung angegeben ist, dass das Gerät getestet wurde und funktioniert. Sie müssen unbedingt sicherstellen, dass er mit dem Wärmeblock (dem großen Metallstück, in dem die Rohre sitzen) geliefert wird. Andernfalls kann der Kauf eines neuen Blocks mehr kosten als die Maschine selbst.

Ich habe gehört, dass einige Leute Glück haben, defekte Einheiten zu reparieren, aber ich würde diesen Ansatz nicht empfehlen, wenn Sie Diybio noch nicht kennen, da Sie bereits mit den Dingen, die Sie tun und lernen müssen, überfordert sein werden.

Am Ende kaufte ich einen Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 für etwa 300 US-Dollar (150 US-Dollar für das Gerät + 150 US-Dollar für den Versand).

Diese Option war für mich die günstigste von allen oben genannten Optionen, trotz der hohen Versandkosten. Obwohl es nicht portabel ist und nicht über eine App gesteuert werden kann, funktioniert es. Es hat einen 96-Well-Heizblock, der mehr ist, als ich jemals für mein Heimlabor brauche. Es ermöglicht mir, meine PCR-Routinen einfach zu programmieren und zu speichern. Und überraschenderweise werden viele der Einweg- und Peripheriegeräte immer noch von ThermoFisher verkauft.

Draufsicht auf Thermocycler in Versandverpackung Ansicht des Thermocycler-Displays

Zusätzliche Komponenten, die für die Durchführung von PCR erforderlich sind

Ein Thermocycler ist nur ein Puzzleteil bei der DNA-Amplifikation. Es gibt andere Verfahren und erforderliche Werkzeuge + Reagenzien, die Sie benötigen, um eine PCR-Reaktion erfolgreich durchzuführen.

Meine Erfahrung liegt in der Extraktion und Amplifikation des ITS-Gens aus Pilzproben, aber für jedes Gen, das Sie amplifizieren möchten, gelten die gleichen allgemeinen Anforderungen:

  • DNA-Extraktion – Sie benötigen eine Probe, ein Protokoll zur Extraktion der DNA, Reagenzien zum Herausbrechen der DNA aus Ihren Kulturen’-Zellen, eine Zentrifuge und 1,5 ml oder 0,2 ml Eppendorf-Röhrchen.
  • Oligonukleotide (Primer) Primer sind kleine DNA-Stränge, die den Genen, die Sie amplifizieren möchten, ein Präfix und ein Suffix voranstellen. Sobald Sie Ihre DNA extrahiert haben, mischen Sie die Primer gemäß Ihrem Protokoll vor der Durchführung der PCR ein. Während der PCR heften sich die Primer an das interessierende Gen, wobei das nächste Reagens darunter arbeitet, um das interessierende Gen zu verdoppeln.
  • TAQ-Polymerase – Dieses Reagens wird mit den Primern hinzugefügt und es ist ein spezielles hitzebeständiges Enzym, das die Verdoppelung des/der interessierenden Gens/Gene zwischen jedem Denaturierungs-/Annealing-Zyklus erleichtert.
  • Puffer – Puffer besteht normalerweise nur aus Wasser und Tris-HCL pH 8,0 (manchmal mit EDTA), aber seine Aufgabe ist es, die extrahierte DNA auszugleichen und zu stabilisieren und/oder Primerverdünnungen zu erzeugen.

Nach der Durchführung der PCR kann Gelelektrophorese verwendet werden, um zu testen, ob Ihre PCR-Reaktion erfolgreich war oder nicht. Dies ist ein wichtiger Schritt, da er sicherstellt, dass Sie das richtige Gen amplifiziert haben, bevor Sie mit den kostspieligen nächsten Schritten wie der Sequenzierung fortfahren.

Abschließend möchte ich sagen, dass das Erlernen der PCR ein unglaublich nützliches und vielseitiges Werkzeug ist. Viele der Leute, mit denen ich gesprochen habe, denken über ihre Zeit nach, die sie mit dem Lernen und Ausführen von PCR-Reaktionen verbracht haben. Ohne die PCR wäre ein Großteil der modernen genetischen Arbeit nicht möglich. Also geh hin und lerne es! Es wird Ihre Zeit wert sein.


QPCR und RT-qPCR

Quantitative Endpunkt-PCR

PCR und RT-PCR werden im Allgemeinen in einem qualitativen Format verwendet, um biologische Proben zu bewerten. Eine Vielzahl von Anwendungen, wie die Bestimmung der Viruslast, die Messung von Reaktionen auf therapeutische Mittel und die Charakterisierung der Genexpression, würden jedoch durch die quantitative Bestimmung der Zielhäufigkeit verbessert. Theoretisch sollte dies angesichts der exponentiellen Natur der PCR leicht zu erreichen sein, da zwischen der Anzahl der Amplifikationszyklen und dem Logarithmus der Anzahl der Moleküle ein linearer Zusammenhang besteht. In der Praxis wird die Amplifikationseffizienz jedoch aufgrund von Verunreinigungen (Inhibitoren), kompetitiven Reaktionen, Substraterschöpfung, Polymerase-Inaktivierung und Target-Reannealing verringert. Mit zunehmender Zyklenzahl nimmt die Amplifikationseffizienz ab, was schließlich zu einem Plateaueffekt führt.

Normalerweise erfordert die quantitative PCR, dass Messungen vor der Plateauphase durchgeführt werden, damit die Beziehung zwischen der Anzahl der Zyklen und den Molekülen relativ linear ist. Dieser Punkt muss aufgrund der zahlreichen Faktoren, die die Amplifikationseffizienz beeinflussen können, für verschiedene Reaktionen empirisch bestimmt werden. Da die Messung vor dem Reaktionsplateau erfolgt, verwendet die quantitative PCR weniger Amplifikationszyklen als die grundlegende PCR. Dies kann zu Problemen bei der Erkennung des Endprodukts führen, da weniger Produkt zu erkennen ist.

Um die Amplifikationseffizienz zu überwachen, sind viele Anwendungen so konzipiert, dass sie einen internen Standard in die PCR einschließen. Ein solcher Ansatz umfasst ein zweites Primerpaar, das für ein &ldquohousekeeping&rdquo-Gen (d. h. ein Gen, das unter den verglichenen Proben konstante Expressionsniveaus aufweist) in der Reaktion spezifisch ist (Gaudette und Crain, 1991, Murphy). et al. 1990). Die Amplifikation von Housekeeping-Genen bestätigt, dass die Zielnukleinsäure und die Reaktionskomponenten von akzeptabler Qualität waren, berücksichtigt jedoch keine Unterschiede in der Amplifikationseffizienz aufgrund von Unterschieden in der Produktgröße oder der Primer-Annealing-Effizienz zwischen dem internen Standard und dem quantifizierten Ziel.

Das Konzept der kompetitiven PCR und Variation der quantitativen PCR ist eine Reaktion auf diese Einschränkung. Bei der kompetitiven PCR wird der Reaktion eine bekannte Menge einer Kontrollmatrize zugesetzt. Diese Matrize wird unter Verwendung des gleichen Primerpaars wie das experimentelle Zielmolekül amplifiziert, liefert jedoch ein unterscheidbares Produkt (z. B. unterschiedliche Größe, Restriktionsverdaumuster usw.). Die Mengen an Kontrolle und Testprodukt werden nach der Amplifikation verglichen. Während diese Ansätze die Qualität der Zielnukleinsäure, der Pufferkomponenten und der Primer-Annealing-Effizienz kontrollieren, haben sie ihre eigenen Grenzen (Siebert und Larrick, 1993 McCulloch et al. 1995), einschließlich der Tatsache, dass viele von der endgültigen Analyse durch Elektrophorese abhängig sind.

Es existieren zahlreiche Fluoreszenz- und Festphasen-Assays, um die Menge des in jeder Reaktion erzeugten Amplifikationsprodukts zu messen, aber sie können oft nicht die interessierende amplifizierte DNA von unspezifischen Amplifikationsprodukten unterscheiden. Einige dieser Analysen beruhen auf Blotting-Techniken, die aufgrund der Effizienz des Nukleinsäuretransfers eine weitere Variable einführen, während andere Assays entwickelt wurden, um die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese zu eliminieren und dennoch die erforderliche Spezifität bereitzustellen. Die Echtzeit-PCR, die die Möglichkeit bietet, die Ergebnisse jedes Amplifikationszyklus anzuzeigen, ist eine beliebte Methode, um die Notwendigkeit einer Analyse durch Elektrophorese zu überwinden.

Quantitative Real-Time-PCR

Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden oder Primern oder fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen zum Nachweis und zur Quantifizierung eines PCR-Produkts ermöglicht die Durchführung einer quantitativen PCR in Echtzeit. Speziell entwickelte Instrumente führen sowohl thermische Zyklen durch, um das Ziel zu amplifizieren, als auch Fluoreszenzdetektion, um die Ansammlung von PCR-Produkten zu überwachen. DNA-bindende Farbstoffe sind einfach anzuwenden, unterscheiden jedoch nicht zwischen spezifischen und unspezifischen PCR-Produkten und sind für Multiplex-Reaktionen nicht förderlich. Fluoreszierend markierte Nukleinsäuresonden haben den Vorteil, dass sie nur mit spezifischen PCR-Produkten reagieren, sie können jedoch teuer und schwierig zu entwerfen sein. Einige qPCR-Technologien verwenden fluoreszenzmarkierte PCR-Primer anstelle von Sonden.

Die Verwendung von fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen ist einer der einfachsten qPCR-Ansätze. Der Farbstoff wird einfach der Reaktion zugesetzt und die Fluoreszenz wird bei jedem PCR-Zyklus gemessen. Da die Fluoreszenz dieser Farbstoffe in Gegenwart von doppelsträngiger DNA dramatisch zunimmt, kann die DNA-Synthese als Zunahme des Fluoreszenzsignals verfolgt werden. Allerdings müssen oft Vorarbeiten geleistet werden, um sicherzustellen, dass die PCR-Bedingungen nur ein bestimmtes Produkt liefern. In nachfolgenden Reaktionen kann die spezifische Amplifikation durch eine Schmelzkurvenanalyse verifiziert werden. Thermische Schmelzkurven werden erzeugt, indem das gesamte Produkt bei einer niedrigeren Temperatur (ungefähr 60 °C) doppelsträngige DNA bilden kann und die Temperatur langsam auf denaturierende Werte (ungefähr 95 °C) erhöht wird. Die Produktlänge und -sequenz beeinflussen die Schmelztemperatur (Tm), daher wird die Schmelzkurve verwendet, um die Homogenität des Amplikons zu charakterisieren. Unspezifische Amplifikation kann durch breite Peaks in der Schmelzkurve oder Peaks mit unerwarteten Tm-Werten identifiziert werden. Durch die Unterscheidung spezifischer und unspezifischer Amplifikationsprodukte fügt die Schmelzkurve einen Aspekt der Qualitätskontrolle während des Routineeinsatzes hinzu. Die Erstellung von Schmelzkurven ist mit Assays, die auf der 5&prime&rarr3&prime-Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase beruhen, wie der Sonden-basierten TaqMan®-Technologie, nicht möglich.

Einige qPCR-Strategien verwenden komplementäre Nukleinsäuresonden, um das DNA-Ziel zu quantifizieren. Diese Sonden können auch verwendet werden, um Einzelnukleotidpolymorphismen (Lee et al. 1993 Bernhard et al. 1998). Es gibt mehrere allgemeine Kategorien von Echtzeit-PCR-Sonden, einschließlich Hydrolyse-, Haarnadel- und einfache Hybridisierungssonden. Diese Sonden enthalten eine komplementäre Sequenz, die es der Sonde ermöglicht, an das akkumulierende PCR-Produkt anzulagern, aber die Sonden können sich in der Anzahl und Position der fluoreszierenden Reporter unterscheiden.

Hydrolysesonden sind mit einem Fluor am 5&prime-Ende und einem Quencher am 3&prime-Ende markiert, und da die beiden Reporter in unmittelbarer Nähe sind, wird das Fluoreszenzsignal gelöscht. Während des Annealing-Schritts hybridisiert die Sonde an das PCR-Produkt, das in vorherigen Amplifikationszyklen erzeugt wurde. Das resultierende Sonde:Ziel-Hybrid ist ein Substrat für die 5&prime&rarr3&prime-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase, die die angelagerte Sonde abbaut und den Fluor freisetzt (Holland et al. 1991). Der Fluor wird von den Wirkungen des energieabsorbierenden Quenchers befreit und der Reaktionsfortschritt und die Akkumulation von PCR-Produkt wird durch die resultierende Zunahme der Fluoreszenz verfolgt. Bei diesem Ansatz müssen vor den Quantifizierungsexperimenten Vorversuche durchgeführt werden, um zu zeigen, dass das erzeugte Signal proportional zur Menge des gewünschten PCR-Produkts ist und dass keine unspezifische Amplifikation auftritt.

Haarnadelsonden, auch als Molecular Beacons bekannt, enthalten invertierte Wiederholungen, die durch eine zur Ziel-DNA komplementäre Sequenz getrennt sind. Die Wiederholungen annealen, um eine Haarnadelstruktur zu bilden, bei der das Fluor am 5&prime-Ende und ein Quencher am 3&prime-Ende nahe beieinander liegen, was zu einem geringen Fluoreszenzsignal führt. Die Haarnadelsonde ist so konstruiert, dass die Sonde bevorzugt an die Ziel-DNA bindet, anstatt die Haarnadelstruktur beizubehalten. Während die Reaktion fortschreitet, hybridisieren zunehmende Mengen der Sonde mit dem sich ansammelnden PCR-Produkt, und als Ergebnis werden der Fluor und der Quencher physikalisch getrennt. Der Fluor wird nicht mehr gelöscht und die Fluoreszenz nimmt zu. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass Haarnadelsonden weniger wahrscheinlich fehlpassen als Hydrolysesonden (Tyagi et al. 1998). Es müssen jedoch Vorversuche durchgeführt werden, um zu zeigen, dass das Signal spezifisch für das gewünschte PCR-Produkt ist und keine unspezifische Amplifikation stattfindet.

Die Verwendung einfacher Hybridisierungssonden umfasst zwei markierte Sonden oder alternativ eine markierte Sonde und einen markierten PCR-Primer. Beim ersten Ansatz wird die vom Fluor an einer Sonde emittierte Energie von einem Fluor an der zweiten Sonde absorbiert, die in der Nähe hybridisiert. Beim zweiten Ansatz wird die emittierte Energie von einem zweiten Fluor absorbiert, das als Teil des Primers in das PCR-Produkt eingebaut wird. Beide dieser Ansätze führen zu einer erhöhten Fluoreszenz des Energieakzeptors und einer verringerten Fluoreszenz des Energiedonors. Die Verwendung von Hybridisierungssonden kann noch weiter vereinfacht werden, so dass nur eine markierte Sonde benötigt wird. Bei diesem Ansatz wird das Löschen des Fluors durch Desoxyguanosin verwendet, um eine Änderung der Fluoreszenz herbeizuführen (Crockett und Wittwer, 2001, Kurata et al. 2001). Die markierte Sonde annealt, so dass sich der Fluor in unmittelbarer Nähe zu den G-Resten innerhalb der Zielsequenz befindet, und wenn die Sonden-Annealing zunimmt, nimmt die Fluoreszenz aufgrund des Desoxyguanosin-Quenchings ab. Bei diesem Ansatz ist die Position der Sonde begrenzt, da die Sonde hybridisieren muss, so dass der Fluoreszenzfarbstoff sehr nahe einem G-Rest ist. Der Vorteil einfacher Hybridisierungssonden besteht darin, dass sie durch die Verwendung unterschiedlich gefärbter Fluors und Sonden mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen leichter gemultiplext werden können als Hydrolyse- und Haarnadelsonden (Übersicht in Wittwer et al. 2001).

Einige qPCR-Strategien verwenden komplementäre Nukleinsäuresonden, um das DNA-Ziel zu quantifizieren. Diese Sonden können auch verwendet werden, um Einzelnukleotidpolymorphismen (Lee et al . 1993 Bernhard et al . 1998). Es gibt mehrere allgemeine Kategorien von Echtzeit-PCR-Sonden, einschließlich Hydrolyse-, Haarnadel- und einfache Hybridisierungssonden. Diese Sonden enthalten eine komplementäre Sequenz, die es der Sonde ermöglicht, an das akkumulierende PCR-Produkt anzulagern, aber die Sonden können sich in der Anzahl und Position der fluoreszierenden Reporter unterscheiden.

QPCR-Produkte und -Ressourcen

GoTaq® qPCR- und RT-qPCR-Kits sind für farbstoffbasierte oder sondenbasierte Echtzeit-PCR-Ansätze erhältlich. GoTaq qPCR-Systeme enthalten BRYT Green Dye, das eine maximale Amplifikationseffizienz und eine höhere Fluoreszenz als SYBR Green bietet.

GoTaq®-Sondensysteme sind gebrauchsfertige Master-Mixe, die den Reaktionsaufbau für die auf Hydrolysesonden basierende Detektion vereinfachen.


In-vitro-Mutagenese

PCR-Mutagenese zirkulärer DNA

PCR-Mutagenese kann auch verwendet werden, um das gesamte Plasmid zu amplifizieren, das das interessierende Gen enthält. Eine einfache Methode, die als „invertierte“ oder „Gegen“-PCR bezeichnet wird, verwendet Back-to-Back-Primer (Abbildung 2B). Das PCR-Produkt ist ein lineares Plasmid voller Länge, das dann vor der Transformation phosphoryliert und ligiert wird. Dieses Verfahren kann leicht verwendet werden, um Deletionsmutanten herzustellen, indem eine Lücke zwischen den Primern erzeugt wird. Varianten dieser Methode umfassen die „rekombinante Zirkel“-PCR (Abbildung 2C) und die „Rekombinations“-PCR, die beide auf der Rekombination linearer Plasmide beruhen. Bei diesen Techniken werden zwei inverse PCRs mit Primern mit Lücken an unterschiedlichen Stellen durchgeführt. Diese beiden mutierten Plasmide werden dann rekombiniert in vitro durch Mischen und Annealing (rekombinante Kreis-PCR) oder in vivo (Rekombinations-PCR). Die Lücken werden dann durch die bakterielle DNA-Reparaturmaschinerie repariert.


Vorteil HD Polymerase Mix

Der Advantage HD Polymerase Mix bietet maximale Genauigkeit und verlängerte PCR-Produktlänge und ist daher besonders nützlich für Anwendungen, die eine hohe Genauigkeit erfordern, wie z. B. cDNA-Klonierung, ortsgerichtete Mutagenese und Mutationsgenotypisierung (d. h. SNP-Analyse).

Der Advantage HD Polymerase Mix besteht aus einer neuartigen DNA-Polymerase mit einem Hot-Start-Antikörper und wird mit einem Röhrchen mit 5X Puffer (mit Mg 2+ ) geliefert.

Der Advantage HD Polymerase Mix bietet maximale Genauigkeit und verlängerte PCR-Produktlänge und ist daher besonders nützlich für Anwendungen, die eine hohe Genauigkeit erfordern, wie z. B. cDNA-Klonierung, ortsgerichtete Mutagenese und Mutationsgenotypisierung (d. h. SNP-Analyse).

Der Advantage HD Polymerase Mix besteht aus einer neuartigen DNA-Polymerase mit einem Hot-Start-Antikörper und wird mit einem Röhrchen mit 5X Puffer (mit Mg 2+ ) geliefert.

Advantage HD Polymerase Mix bietet aufgrund der 3' &rarr 5' Exonuklease-Aktivität eine hervorragende Genauigkeit, was zu einer extrem niedrigen Fehlerrate führt. Es funktioniert auch extrem gut auf GC-reichen und anderen komplexeren Templates. Der Advantage HD Polymerase Mix amplifiziert Ziele von bis zu 8,5 kb aus humaner genomischer DNA, 10 kb aus E coli genomische DNA und 22 kb von Lambda-DNA. Die Amplifikationseffizienz von Advantage HD Polymerase Mix ist höher als die von Wildtyp Taq Polymerase.


PrimeSTAR Max DNA-Polymerase – schnelle und High-Fidelity-PCR

PrimeSTAR Max DNA Polymerase hat die höchste Wiedergabetreue und schnellste Verlängerungsrate aller Takara Bio Enzyme. Die Formulierung basiert auf Takaras einzigartiger High-Fidelity PrimeSTAR HS DNA Polymerase in Kombination mit einem Elongationsfaktor für effizientes Priming und Extension, wodurch die für Annealing- und Extensionsschritte erforderliche Zeit stark reduziert wird. Dadurch kann PrimeSTAR Max DNA Polymerase für eine außergewöhnlich schnelle PCR verwendet werden. Es ist als 2X-Premix formuliert, der optimierte Puffer und dNTPs enthält, was eine schnelle Vorbereitung von Reaktionen für Anwendungen mit hohem Durchsatz ermöglicht.

PrimeSTAR Max DNA Polymerase hat die höchste Wiedergabetreue und schnellste Verlängerungsrate aller Takara Bio Enzyme. Die Formulierung basiert auf Takaras einzigartiger High-Fidelity PrimeSTAR HS DNA Polymerase in Kombination mit einem Elongationsfaktor für effizientes Priming und Extension, wodurch die für Annealing- und Extensionsschritte erforderliche Zeit stark reduziert wird. Dadurch kann PrimeSTAR Max DNA Polymerase für eine außergewöhnlich schnelle PCR verwendet werden. Es ist als 2X-Premix formuliert, der optimierte Puffer und dNTPs enthält, was eine schnelle Vorbereitung von Reaktionen für Anwendungen mit hohem Durchsatz ermöglicht.

Darüber hinaus eignet sich die PrimeSTAR Max DNA Polymerase durch die Standardisierung der Verlängerungsschrittzeit für Reaktionen mit überschüssigen Nukleinsäuren, die aufgrund unspezifischer Bindung normalerweise schwer zu amplifizieren wären. Die überlegene Prozessivität der PrimeSTAR Max DNA Polymerase verhindert die Hemmung durch überschüssige Nukleinsäuren, was zu einer viel höheren Erfolgsrate für die PCR bei minimalem Optimierungsbedarf führt. Die antikörpervermittelte Hot-Start-Funktion bietet eine verbesserte Spezifität, indem sie falsche Initiationsereignisse während des Reaktionsaufbaus verhindert.


Schau das Video: Primer Dimers. How Primer Dimers Are Formed. Primer Dimer Formation (August 2022).