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3: Verdünnungstechniken und Pipettieren - Biologie

3: Verdünnungstechniken und Pipettieren - Biologie


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Lernziele

  • Machen Sie sich mit dem Umgang mit der Pipette vertraut.
  • Identifizieren Sie verschiedene Möglichkeiten zum Verdünnen.
  • Erfahren Sie, wie Sie ein Verdünnungsproblem lösen.

Verdünnungen werden während des Semesters im Mikrobiologielabor für verschiedene Zwecke mehrmals verwendet. Daher ist es wichtig, dass jeder versteht, wie es geht verwenden die Pipette, wie es geht lesen die Pipette genau und wie bestimmt man, welche Verdünnung hergestellt wurde. Es ist gängige Praxis, die Keimzahl sowohl für flüssige als auch für feste Proben zu bestimmen – Suspensionen von E coli in Nährbrühe bis hin zu Bodenproben und Hamburgerfleisch. Das folgende Protokoll ist ein schrittweises Verfahren zur Bearbeitung von Verdünnungsproblemen und enthält am Ende einige Übungsaufgaben. Der Zweck kann die Bestimmung von Bakterien-, Pilz- oder Viruszahlen sein (allgemein als koloniebildende Einheiten bezeichnet, KBE, für Bakterien- oder Pilzzählungen oder Plaque-bildende Einheiten, PFUs, für Viruszählungen).

VERWENDUNG DER PIPETTE

Abb. 1 Abb. 2 Abb. 3

  • Vergewissern Sie sich, dass Sie wissen, wie die Linien auf den verschiedenen Pipettengrößen zu lesen sind. Denken Sie daran, dass die Ablesung am unteren Rand des Meniskus erfolgt. (Der Messwert auf der Pipette im Bild beträgt 8,1 ml. Siehe Abb. 1)
  • Verwenden Sie die Pipette mit dem kleinsten Volumen für das zu pipettierende Volumen
  • Stecken Sie das Ende der Pipette gerade in die Öffnung der pi-Pumpe (grüne pi-Pumpe für 5 und 10ml, blaue pi-Pumpe für 1m. 2 und Abb. 3l).
  • Legen Sie die Pipettenspitze in die Lösung; Drehen Sie das Pi-Pumpenrad, damit die Flüssigkeit aufsteigt.
  • Bewegen Sie das Rad langsam, bis Sie die erforderliche Menge korrekt abgeben.

Notiz

Bei dieser kleinen Übung ist keine aseptische Technik erforderlich, aber Genauigkeit ist wichtig. Sie beginnen mit einem methylenblau gefärbten Wasser und verdünnen es auf verschiedene Weise. Bei richtiger Ausführung hat das letzte Röhrchen jedes der 3 Verdünnungssets den GENAUEN Blauton. Ist dies nicht der Fall, haben Sie die Proben ungenau verdünnt --- entweder ungenau pipettiert oder Wasser ungenau in die Röhrchen gegeben.

BENÖTIGTE MATERIALIEN

  • Flasche blaues Wasser
  • unsterile Pipetten - 1, 5 und 10 ml
  • 6 unsterile Reagenzgläser
  • blaue und grüne pi-pumpen

DER ABLAUF

Abb. 4

  1. Sie benötigen eine Flasche blauen Farbstoff.
  2. Bereiten Sie die folgenden Verdünnungsleerwerte mit Leitungswasser mit einer 10-ml-Pipette und der grünen Pi-Pumpe vor: 4,5 ml, 9 ml, 9,5 ml, 4 ml, 3 ml, 12 ml.
  3. Stellen Sie 3 Sätze Verdünnungsröhrchen her, wie in Abb. 4 gezeigt. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens.
  • Verdünnungsset 1: Geben Sie 0,5 ml blaues Wasser in die 4,5 ml Wasser, dann 1 ml von Röhrchen 1 in das nächste Röhrchen mit 9 ml Wasser.
  • Verdünnungsset 2: Übertragen Sie 1 ml blaues Wasser in die 4 ml Wasser, dann 0,5 ml von Röhrchen 1 in das nächste Röhrchen mit 9,5 ml.
  • Verdünnung 3 . einstellen: Übertragen Sie 1 ml blaues Wasser in die 3 ml Wasser, dann 0,5 ml von Röhrchen 1 in das nächste Röhrchen mit 12 ml.

4. Interpretation Ihrer Verdünnungsröhrchen--

  • Notieren Sie die Verdünnungswerte Ihrer Röhrchen unten.
  • Vergleichen Sie die letzten Röhrchen jedes Sets miteinander, um sicherzustellen, dass sie den gleichen Blauton haben.

Definition

Verdünnungsfaktor = Probenmenge/( Probenmenge + Menge im Röhrchen)

Gesamtverdünnungsfaktor = vorherige Verdünnung des Röhrchens X Verdünnung des nächsten Behälters

Beispiel: Verdünnungsset 1

0,5 ml zu 4,5 ml hinzugefügt = 0,5/5 = 5/50 = 1/10 für das 1. Röhrchen

1ml zu 9ml hinzugefügt = 1/10 (2. Röhrchen) x vorherige Verdünnung von 1/10 (1. Röhrchen) = Gesamtverdünnung von 1/100

VERDÜNNUNGSSET 1: Die Gesamtverdünnung von Röhrchen 1 beträgt 1/10 und für Röhrchen 2 1/100.
VERDÜNNUNGSSET 2: Die Gesamtverdünnung von Röhrchen 1 beträgt ________ und für Röhrchen 2 __________.
VERDÜNNUNGSSET 3: Die Gesamtverdünnung von Röhrchen 1 beträgt ________ und für Röhrchen 2 __________.

Das letzte Röhrchen jedes der 3 Sets sollte die GLEICHE Gesamtverdünnung aufweisen.

FRAGEN

  1. Was ist der Meniskus?
  2. Wenn Sie 0,1 ml einer Probe in einen 99,9 ml-Blindwert mit Kochsalzlösung überführen, wie lautet die Verdünnung?
  3. Wie viel Flüssigkeit ist IN der Pipette rechts (Abb. 5)?
  4. Geben Sie für die Verdünnungsröhrchen mit farbigem Wasser die folgenden Werte ein

SET 1 GESAMTVERDÜNNUNG

Rohr 1 1/10

Röhre 2 1/100

SET 2 GESAMTVERDÜNNUNG

Rohr 1 _______

Rohr 2 _______


SET 3 GESAMTVERDÜNNUNG

Rohr 1 _______ Abb. 5

Rohr 2 _______


Strategien zur Minimierung der Variabilität und des Bias im Zusammenhang mit dem manuellen Pipettieren in Ligandenbindungsassays, um die Datenqualität der therapeutischen Quantifizierung von Proteinen sicherzustellen

Bioanalytische Labors benötigen genaues und präzises Pipettieren, um reproduzierbare und genaue Ergebnisse für zuverlässige Daten zu gewährleisten. Zwei Bereiche, in denen Pipettierunterschiede zwischen Analytikern zu einer schlechten Reproduzierbarkeit führen, sind Langzeitstabilitätstests und Probenverdünnung. Der Zweck dieses Dokuments besteht darin, die Probleme beim manuellen Pipettieren zu veranschaulichen, eine Automatisierungsstrategie zur Minderung der mit dem manuellen Pipettieren verbundenen Risiken zu beschreiben und Empfehlungen für eine Kontrollstrategie zu geben, die Proben, die Verdünnungen erfordern, ordnungsgemäß überwacht. Wir haben Unterschiede zwischen verschiedenen manuellen Pipettiertechniken von Analytikern innerhalb eines Labors festgestellt. Um die Variabilität beim Pipettieren zu reduzieren, wurde auf dem Hamilton Microlab Star (HMS) ein flexibles modulares Liquid-Handling-Skript erstellt, um die Probenverdünnung, Vorbehandlung und Plattenbeladung durchzuführen. Das Skript kann mit variablen Verdünnungsfaktoren umgehen. Zusätzlich wurden zwei Verdünnungskontrollen hergestellt und bei Konzentrationen von hohen und mittleren Qualitätskontrollen (QC) getestet. Dieselben Verdünnungskontrollen wurden sowohl in die Validierung vor der Studie als auch in die QCs während der Studie aufgenommen, um die Verdünnungsverarbeitung und die Assay-Leistung zu überwachen. Die Variabilität des manuellen Pipettierens bei 11 Analytikern war mit zunehmender Verdünnung negativer verzerrt. Das Vorwärts- und Rückwärtspipettieren, das unterschiedliche Volumina lieferte, trugen zur Diskordanz bei. Der Verdünnungsfehler beim manuellen Pipettieren wurde mit dem Liquid Handler eliminiert. Der Gesamtfehler der Verdünnungskontrollen betrug weniger als 20 %. Die Erfolgsquote im Studium lag bei 100 %. Die Anwendung von Liquid Handlern minimiert die Variabilität und Verzerrung aufgrund von Unterschieden beim manuellen Pipettieren zwischen den Analytikern. Die Einarbeitung von Verdünnungs-QCs dient einem doppelten Zweck, um den Verdünnungsprozess der Proben sowie die Leistung des Bindungsassays zu überwachen.


Protokoll

1. Bereiten Sie einen sterilen Arbeitsplatz vor

Bevor Sie Sterilisationsverfahren in Ihrem Arbeitsbereich beginnen, waschen Sie Ihre Hände gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser.

Achten Sie darauf, Ihre Hände jedes Mal erneut zu waschen, wenn Sie vermuten, dass Sie eine Kontamination durch Ihre experimentellen Manipulationen haben.

Entfernen Sie alle Materialien, die Ihren Arbeitsbereich auf dem Labortisch überladen. Nehmen Sie ein vorbefeuchtetes Desinfektionstuch aus dem Kanister und wischen Sie den gesamten Bereich ab. Desinfektionsmittel verdunsten lassen - nicht trockenwischen!

Verwenden Sie Desinfektionsmittel wie Alkohol (Isopropanol oder 70 % Ethanol) oder phenolische Verbindungen (o-Phenylphenol).

Verhindern Aerosolisierung, oder die Bildung eines feinen Nebels, der Bakterienzellen enthält, und die Verbreitung mikrobieller Verunreinigungen vermeiden Sie die Abgabe von Desinfektionsmittel aus einer Quetschflasche.

Die Austrocknung von Mikroorganismen ist eine der effektivsten Methoden zur Dekontamination von Oberflächen.

Auch wenn jemand den Labortisch kürzlich benutzt hat und die Tischplatte mit Desinfektionsmittel abgewischt wurde, beginnen Sie Ihre Laborzeit IMMER mit dem Abwischen des Tisches.

Nachdem das Desinfektionsmittel vollständig getrocknet ist, zünden Sie den Bunsenbrenner mit einem Zünder an. Stellen Sie die Flamme so ein, dass in der Mitte der Flamme ein blauer Kegel zu sehen ist. Die Flamme produziert jetzt ein Aufwind, oder Luftkonvektionsströmungen, bei denen warme Luft nach oben und weg von der Flamme aufsteigt (Abbildung 1). Mit steigender Hitze werden Mikroorganismen und Staubpartikel nach oben und aus dem unmittelbaren Arbeitsbereich gedrängt. In diesem vom Bunsenbrenner geschaffenen Bereich, der als a . bezeichnet wird, arbeiten Sie stets langsam, sorgfältig und bewusst steriles Feld. Lassen Sie den Bunsenbrenner während des gesamten Vorgangs eingeschaltet.

Die Spitze des blauen Kegels ist der heißeste Teil der Flamme.

Achten Sie darauf, den Aufwind nicht durch schnelle Bewegungen zu stören, die die Luftströmungen um den Labortisch herum dramatisch verändern. Durch die Erzeugung eines Aufwinds mit dem Bunsenbrenner wird die Möglichkeit minimiert, dass Mikroorganismen und Staub auf den Tisch oder in offene Flaschen, Röhrchen oder Kolben im Arbeitsbereich fallen.

Ordnen Sie alle für das Verfahren benötigten Materialien auf dem Labortisch in der Nähe des sterilen Feldes an. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien richtig gekennzeichnet sind.

Die Lieferungen können serologische Pipetten und Mikropipetten, sterile Kulturröhrchen, sterile Kolben, Medienflaschen mit Brühe, sterile Mikrozentrifugenröhrchen, Mikropipettenspitzen, Gestelle für Röhrchen, Bakterienzellkulturen und Phagenvorräte umfassen.

Flüssige Medien sollten in einem Autoklaven bei 121 °C für mindestens 15 Minuten in der Flüssigeinstellung sterilisiert werden. Größere Medienvolumina (> 1L) erfordern längere Autoklavierzeiten. Laborbedarf sollte in einem Autoklaven bei 121 °C für mindestens 30 Minuten auf Schwerkraft (trocken) sterilisiert werden.

Im Allgemeinen können sterile Lösungen bis zu 5 Monate bei 4 °C gelagert werden. Beachten Sie, dass die Lagerzeit für Lösungen mit instabilen Komponenten wie Antibiotika erheblich verkürzt wird - beachten Sie immer die Empfehlungen des Herstellers.

2. Übertragung von Flüssigkeiten mit serologischen Pipetten

Serologische Pipetten gibt es in vielen Größen und Optionen: Kunststoff oder Glas, Einweg- oder Mehrwegpipetten, mit oder ohne Stecker. Diese sind kalibriert, um Volumina von 0,1 ml bis 25 ml zu liefern.

Übliche Größen für serologische Pipetten sind 5 ml, 10 ml und 25 ml und sollten für aseptische Flüssigkeitstransfers von 0,1 ml oder mehr verwendet werden (Panel A von Figur 2). Es gibt auch größere serologische Pipetten, die Volumina bis zu 100 ml abgeben können, jedoch liegt der Schwerpunkt dieses Protokolls auf den gebräuchlicheren, kleineren Pipetten.

Für Mikrobiologie- und Gewebekulturexperimente werden vorsterilisierte Pipetten mit Wattestopfen benötigt. Der Stopfen sollte nicht von der Pipettenoberseite entfernt werden, da er als Barriere gegen das Überfüllen der Pipette dient.

Unterschiedliche Anwendungen erfordern serologische Pipetten aus Kunststoff im Vergleich zu Glas. Für organische Lösungsmittel wird Glas benötigt. Beide können bei der Durchführung von BSL-1-Experimenten auf dem Labortisch verwendet werden. Bei Arbeiten in einer Biosicherheitswerkbank mit BSL-2-Organismen, bei denen kein Bunsenbrenner verwendet werden kann, darf nur Kunststoff verwendet werden. Es wird auch empfohlen, Kunststoff für Anwendungen zu verwenden, bei denen geschmolzener Agar übertragen wird.

Es gibt zwei Arten von serologischen Pipetten: TC ("zu enthalten") oder TD ("zu liefern"). TC-Pipetten geben das gesamte Volumen einschließlich der Spitze ab und müssen "ausgeblasen" oder gespült werden, um das angegebene Volumen zu erhalten. TD-Pipetten sind so kalibriert, dass ein winziges Stückchen in der Spitze verbleibt, das nicht wird geliefert. Überprüfen Sie unbedingt das Etikett auf dem Pipettenkörper oben, um festzustellen, um welchen Typ es sich handelt (Figur 3). Am häufigsten werden TD-Pipetten verwendet, die oben mit Doppelringen gekennzeichnet sind.

Nehmen Sie eine sterile serologische Kunststoffpipette (auch volumetrische Transferpipette genannt) und entfernen Sie vorsichtig die Papierhülse am Ende mit dem Wattebausch, indem Sie sie wie eine Bananenschale abziehen - entfernen Sie nicht die gesamte Hülse, um die Spitze des die Pipette, die mit der zu übertragenden Flüssigkeit in Kontakt kommt. Berühren Sie mit den Händen nur die Spitze der Pipette (über den Teilstrichen).

Niemals mit einer gebrauchten Pipette in eine sterile Lösung gehen, auch wenn sorgfältig darauf geachtet wurde, dass sie steril bleibt.

Serologische Glaspipetten werden normalerweise in Metallkanistern aufbewahrt (Tafel B von Figur 2). Lösen Sie die Oberseite des Kanisters, entfernen Sie dann vorsichtig die Kappe und brennen Sie die offenen Enden von Kappe und Kanister ab. Legen Sie die Kappe mit der Seite nach unten auf die desinfizierte Bank. Nehmen Sie eine Pipette aus dem Kanister, indem Sie sie waagerecht halten und vorsichtig schütteln, sodass die Spitzen einer oder zweier Pipetten etwa 2,5 cm herausragen und leicht ergriffen werden können. Legen Sie den Kanister auf die Seite und entnehmen Sie eine Pipette, aber achten Sie darauf, die anderen Pipetten im Behälter nicht zu berühren. Berühren Sie die untere Spitze der Pipette nicht mit den Händen und vermeiden Sie den Kontakt der Spitze mit anderen unsterilen Oberflächen.

Bringen Sie eine Pipettierhilfe wie einen Kolben, eine Pumpe oder eine Pistole am oberen Ende der serologischen Pipette an. Entfernen Sie die Papierhülle von der Plastikpipette. Halten Sie die Pipettierhilfe in der rechten Hand.

Wenn Sie eine Glaspipette verwenden, führen Sie das untere Drittel der Pipette für 1-3 Sekunden durch den blauen Kegel in der Bunsenbrennerflamme. Drehen Sie die Pipette um 180°, während sie durch die Flamme geht. Kunststoffpipetten und -röhrchen können nicht beflammt werden.

Wenn Sie Linkshänder sind, halten Sie die Pipettierhilfe in der linken Hand und führen Sie anschließende Manipulationen an Kulturflaschen und Röhrchen mit der rechten Hand durch.

Bei Kunststoffpipetten kommt es beim Herausziehen der letzten Zentimeter der Pipette aus der Hülse zu Kontaminationen, da die sterile Spitze mit dem von Ihren Händen berührten Teil der Hülse in Kontakt kommt.

Entfernen Sie den Verschluss der Flasche mit sterilen Medien. Legen Sie die Kappe nicht auf den Labortisch, sondern halten Sie sie zwischen Ringfinger und Handfläche der rechten Hand, während Sie die Pipettierhilfe mit Daumen, Zeige- und Mittelfinger derselben Hand manipulieren (Figur 4). Halten Sie die Flasche in einem Winkel von 45° und führen Sie den Flaschenrand durch die Flamme des Bunsenbrenners, um ein steriles Feld um die offene Flasche herum zu erzeugen.

Obwohl dies am besten vermieden wird, legen Sie die Kappe, wenn Sie sie absetzen müssen, mit der Vorderseite nach unten auf eine desinfizierte Oberfläche. Wenn eine Kappe nach oben zeigt, besteht eine größere Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch Bewegungen von Gegenständen oder Händen, wodurch Luftströmungen entstehen, die Mikroorganismen und Staubpartikel auf die Innenseite der Kappe absinken lassen.

Der Zweck des Abflammens besteht nicht darin, die Öffnung der Flasche zu sterilisieren, sondern sie zu erwärmen und Luftkonvektionsströme nach oben und von der Öffnung weg zu erzeugen (d. h. Aufwind). Die warme, aufsteigende Luft verhindert das Eindringen von Staubpartikeln und anderen Verunreinigungen in die Flasche.

Halten Sie den Sterilbehälter so kurz wie möglich geöffnet. Es ist wichtig, die Eintrittspunkte von luftgetragenen Mikroorganismen während des gesamten Verfahrens auf ein Minimum zu beschränken.

Vermeiden Sie Husten, Niesen, Sprechen und andere unbeabsichtigte Bewegungen, während sterile Behälter geöffnet sind.

Führen Sie niemals Hände und Finger über ein steriles Feld (d. h. offene Flaschen oder Flaschen, das Innere von Röhrchen und Flaschenverschlüssen), nachdem sie durch die Flamme des Bunsenbrenners geführt wurden.

Arbeiten Sie beim Öffnen von sterilen Röhrchen oder Flaschen immer mit offener Flamme. Lassen Sie nie mehr als ein Röhrchen, eine Flasche oder eine Flasche gleichzeitig auf der Werkbank geöffnet. Das Abflammen sollte unmittelbar nach dem Öffnen und kurz vor dem Verschließen von Röhrchen, Flaschen und Flaschen erfolgen.

Stecken Sie die Spitze der serologischen Pipette in die Flasche mit dem sterilen Medium, dann aspirieren, oder entnehmen Sie die Probe aseptisch aus der Flasche. Verwenden Sie die Pipettierhilfe, um den Probenfluss in die Pipette zu kontrollieren. Lesen Sie das in die Pipette aufgezogene Volumen genau ab, indem Sie den Meniskus, der sich oben auf der Flüssigkeitssäule gebildet hat, auf die Teilstriche auf der kalibrierten Pipette ausrichten (Abbildung 5).

PIPETTE NICHT MUND! Verwenden Sie immer eine Pipettierhilfe (Pumpe, Kolben oder Pistole).

Achten Sie bei der Bestimmung des angesaugten Volumens auf die Zahlenfolge. Die Zahlen können von oben nach oben oder umgekehrt oder oft in beide Richtungen gedruckt werden.

Halten Sie die Pipette beim Ablesen des Volumens immer senkrecht, senkrecht zum Boden und betrachten Sie den Flüssigkeitsmeniskus genau auf Augenhöhe.

Serologische Pipetten sind nur so genau wie das kleinste markierte Inkrement, das typischerweise 0,1 ml für 5-ml- und 10-ml-Pipetten und 0,2 ml für 25-ml-Pipetten beträgt. Wenn eine höhere Präzision erforderlich ist, kann eine serologische Pipette in Kombination mit einer Mikropipette verwendet werden.

Führen Sie den Flaschenrand erneut durch die Flamme des Bunsenbrenners und setzen Sie dann den Verschluss wieder auf die Flasche. Stellen Sie die Medienflasche beiseite.

Verbrennen Sie sich nicht so schnell mit dem Bunsenbrenner, um die Flasche zu verschließen.

Halten Sie ein Reagenzglas oder eine Flasche in der linken Hand. Entfernen und halten Sie die Kappe wie in Schritt 4 oben beschrieben. Schaffen Sie ein steriles Feld, indem Sie den Rand des Röhrchens oder der Flasche im Bunsenbrenner abflammen.

Dispensieren Sie das Medium in der Pipette in das Röhrchen oder den Kolben. Kontrollieren Sie den Probenfluss, damit sie nicht aus dem Röhrchen oder Kolben herausspritzt.

Volumina können so gemessen werden, dass das gesamte Volumen abgegeben wird und die Pipette vollständig entleert wird, oder ein bestimmtes Volumen wird durch eine Punkt-zu-Punkt-Abgabe (eine Volumenmarkierung zur anderen) erreicht.

Führen Sie den Rand des Röhrchens oder der Flasche noch einmal durch die Flamme des Bunsenbrenners und setzen Sie dann die Kappe wieder auf. Stellen Sie das Röhrchen oder die Flasche beiseite. Entfernen Sie die Pipettierhilfe und entsorgen Sie die Pipette in den entsprechenden Abfallbehälter.

Serologische Pipetten aus Kunststoff sind Einwegartikel, während serologische Pipetten aus Glas sterilisiert und wiederverwendet werden können. Für eine ordnungsgemäße Entsorgung müssen Kunststoffpipetten in einen dafür vorgesehenen Behälter für spitze Gegenstände (starre Box mit Kunststoff-Entsorgungsbeutel) gelegt werden, während Glaspipetten zunächst in einen Behälter mit 10 % Bleichmittellösung eingetaucht werden sollten, um die Innen- und Außenflächen zu desinfizieren. Anschließend sollten die Glaspipetten gründlich mit Laborreiniger gewaschen, mit destilliertem Wasser gespült und im Autoklaven sterilisiert werden.

Dieselben Schritte sollten beim Beimpfen von Medien mit einer Bakterienkultur oder einem Phagenstamm oder bei der Durchführung von Reihenverdünnungen befolgt werden.

3. Übertragen von Flüssigkeiten mit Mikropipetten

Mit Mikropipetten (auch als Pipetman Panel A of . bezeichnet) können Minutenvolumina präzise gemessen und abgegeben werden Abbildung 6). Diese Instrumente sind in verschiedenen Größen mit jeweils einem bestimmten Lautstärkebereich erhältlich: P2 für 0,2-2 μl , P10 für 1-10 μl, P20 für 2-20 μl, P200 für 20-200 μl und P1000 für 200-1000 μl.

Behandeln Sie Mikropipetten mit Sorgfalt, da es sich um Präzisionsinstrumente handelt. Lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt auf dem Labortisch liegen, wo sie abgestoßen und beschädigt werden können. Pipetten nicht mit ätzenden Chemikalien in Berührung bringen.

Verwenden Sie für Volumina über 1000 μl eine serologische Pipette.

Obwohl im sterilen Feld des Bunsenbrenners gearbeitet wird, dürfen Mikropipetten, Röhrchen und Kunststoffspitzen nicht entflammt werden. Die Röhrchen und Spitzen sollten vorsterilisiert werden. Die Mikropipetten können vor der Verwendung mit einem vorbefeuchteten Desinfektionstuch abgewischt werden.

Durch Drehen des Einstellknopfes kann ein numerischer Volumeter eingestellt werden, der das abgegebene Volumen anzeigt. Stell die Lautstärke ein Vor Fahren Sie mit Schritt 3 fort.

DREHEN SIE DEN EINSTELLKNOPF NIEMALS ÜBER DEN VORGESEHENEN BEREICH!

Um eine maximale Genauigkeit beim Verringern der Volumeneinstellung an der Mikropipette zu erzielen, drehen Sie das Rändelrad langsam nach unten und achten Sie darauf, dass Sie die Teilungsmarke nicht überschreiten.

Um maximale Genauigkeit beim Erhöhen der Volumeneinstellung an der Mikropipette zu erzielen, drehen Sie das Rändelrad nach oben und passieren Sie die gewünschte Teilungsmarke um 1/3 einer Umdrehung. Drehen Sie dann langsam das Rändelrad herunter, um die gewünschte Lautstärke zu erreichen, und achten Sie darauf, dass Sie die Teilungsmarke nicht überschreiten.

Das Volumeter zeigt drei Zahlen an. Je nach Mikropipette werden die Zahlen unterschiedlich interpretiert. Beachten Sie, dass jede Mikropipette nur so genau ist wie die kleinste Teilungsmarke.P2: Für Volumina zwischen 0,2-2,0 μl. Die obere Zahl bezeichnet das Volumen in Mikrolitern. Die zweite Zahl steht für Zehntel Mikroliter (0,1 μl) und die dritte Zahl für Hundertstel Mikroliter (0,01 μl). Jeder Teilstrich entspricht einem Inkrement von zwei Tausendstel (0,002 μl) eines Mikroliters.P10: Für Volumina zwischen 1,0-10,0 μl. Die oberste Zahl ist für Dutzende von Mikrolitern, diese ist normalerweise auf „0“ eingestellt und sollte nur auf „1“ eingestellt werden, während die anderen beiden Zahlen auf „0“ gesetzt werden, wenn 10,0 μl abgegeben wird. Die mittlere Zahl bezeichnet das Volumen in Mikrolitern. Die dritte Zahl gibt Zehntel eines Mikroliters an (0,1 μl). Jeder Teilstrich entspricht einem Inkrement von zwei Hundertstel (0,02 μl) eines Mikroliters.P20: Für Volumina zwischen 2,0-20,0 μl. Die oberste Zahl in Schwarz steht für Dutzende von Mikrolitern. Diese sollte nur auf „2“ eingestellt werden, während die anderen beiden Zahlen auf „0“ gesetzt werden, wenn 20,0 μl abgegeben werden. Die zweite Zahl in Schwarz bezeichnet das Volumen in Mikrolitern. Die dritte rote Zahl gibt Zehntel eines Mikroliters an (0,1 μl). Jeder Teilstrich entspricht einem Inkrement von zwei Hundertstel (0,02 μl) eines Mikroliters.P200: Für Volumina zwischen 20,0-200 μl. Die oberste Zahl ist für Hunderte von Mikrolitern, diese sollte nur auf „2“ eingestellt werden, während die anderen beiden Zahlen auf „0“ gesetzt werden, wenn 200 μl abgegeben werden. Die mittlere Zahl gibt das abgegebene Volumen in Dutzenden von Mikrolitern an und die dritte Zahl bezeichnet das Volumen in Mikrolitern. Jeder Teilstrich entspricht einem Inkrement von zwei Zehntel (0,2 μl) eines Mikroliters.P1000: Für Volumina zwischen 200-1000 μl. Die oberste Zahl ist für Tausende von Mikrolitern, diese ist normalerweise auf „0“ eingestellt und sollte nur auf „1“ gesetzt werden, während die anderen beiden Zahlen auf „0“ gesetzt werden, wenn 1000 μl abgegeben werden. Die mittlere Zahl steht für Hunderte von Mikrolitern. Die untere Zahl steht für Dutzende von Mikrolitern. Jeder Teilstrich entspricht einem Inkrement von zwei (2 μl) Mikrolitern.

Leistungsprüfung: Diese Instrumente sollten jährlich kalibriert werden, um sicherzustellen, dass Genauigkeit und Präzision innerhalb von ± 5 % der Spezifikationen bleiben. Verwenden Sie eine Analysenwaage, um Wasser zu messen, und stellen Sie sicher, dass die Mindest- und Höchsteinstellungen dem vorgesehenen Volumen entsprechen. Verwenden Sie beispielsweise einen P1000, um 200 μl Wasser in eine Wiegeschale auf der Waage zu übertragen. Da Wasser eine Dichte von 1 hat, entspricht 1 ml Wasser 1 Gramm (g). Somit sollten 200 μl (0,2 ml) Wasser 0,2 g entsprechen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Spitze nicht ausläuft und das gewünschte Volumen bis zur Abgabe mit dem Kolbensystem aufrechterhalten kann.

Mikropipetten müssen immer mit Einwegspitzen aus Kunststoff verwendet werden. Stecken Sie eine Spitze fest auf das Ende des Zylinders der Mikropipette. Nach unten drücken und leicht drehen, um eine luftdichte Versiegelung zu gewährleisten.

Die Spitzen werden normalerweise in Plastikboxen verpackt, die durch Autoklavieren sterilisiert werden können. Öffnen Sie die Spitzenbox, um eine Spitze zu entnehmen, und schließen Sie dann die Spitzenbox, um den Kontakt mit Verunreinigungen in der Luft zu minimieren.

Einige Spitzen haben Filter ähnlich den Wattestopfen serologischer Pipetten. Diese Spitzen sind oft teurer als normale Spitzen und werden daher für spezielle Anwendungen verwendet. Wenn Sie beispielsweise flüchtige Chemikalien wie Chloroform oder radioaktive Flüssigkeiten wie 32 P-markierte DNA messen, hilft die Verwendung von Filterspitzen, eine Kontamination des Zylinders der Mikropipette zu verhindern.

Halten Sie die Mikropipette senkrecht.

Wenn Sie die Mikropipette aufrecht halten, wird verhindert, dass Flüssigkeiten hineinlaufen und den Zylinder der Mikropipette verunreinigen.

Die Mikropipette hat drei Positionen: (1) Ruheposition, (2) Erster Stopp und (3) Zweiter Stopp (Abbildung 6, Tafel B). Das Instrument verfügt über ein Zwei-Stopp-Kolbensystem. Der erste Halt hat zwei Funktionen. Die erste besteht darin, beim Loslassen des Kolbens vom ersten Anschlag in die Ruheposition das gewünschte Flüssigkeitsvolumen in die Spitze zu ziehen. Die zweite Funktion besteht darin, den Großteil der Flüssigkeit aus der Spitze abzugeben, wenn der Kolben aus der Ruheposition bis zum ersten Anschlag gedrückt wird. Ein weiteres Herunterdrücken des Kolbens bis zum zweiten Anschlag gibt die Flüssigkeit ab, die in der Spitze verbleibt. Drücken Sie den Druckknopf am Kolben aus der Ruheposition bis zum ersten Anschlag. Luft, die dem Volumen der Einstellung entspricht, wird verdrängt.

Tauchen Sie die Spitze in die Flüssigkeit ein, während Sie den Druckknopf bis zum ersten Anschlag gedrückt halten.

Berühren Sie mit der Mikropipette selbst nicht die Seiten von Flaschen, Röhrchen und Kolben, da sonst die Innenflächen dieser Gefäße kontaminiert werden. Nur die Spitzen sind steril.

Lassen Sie den Druckknopf langsam los, um die Flüssigkeit in die Spitze zu saugen. Stoppen Sie, sobald sich der Druckknopf wieder in der Ruheposition befindet. Warten Sie einen Moment, damit Flüssigkeit in die Spitze gezogen werden kann.

Das Flüssigkeitsvolumen in der Spitze entspricht dem Volumen der Einstellung der Mikropipette.

Viskose Flüssigkeiten wie solche, die Glycerin enthalten, benötigen mehr Zeit, um in die Spitze einzutreten.

Nehmen Sie die Spitze aus der Flüssigkeit und überprüfen Sie die Spitze visuell, um sicherzustellen, dass die aufgesaugte Flüssigkeit das erwartete Niveau in der Spitze erreicht hat und sich keine Luftblasen in der Spitze befinden.

Wenn nötig, stoßen Sie die Flüssigkeit aus und ziehen Sie die Spitzen manuell auf der Mikropipette fest. Ziehen Sie die Flüssigkeit auf und überprüfen Sie erneut.

Platzieren Sie die Spitze in einem Winkel (10 ° bis 45 °) gegen die Wand des die Flüssigkeit aufnehmenden Röhrchens. Um die Flüssigkeit auszustoßen, drücken Sie den Druckknopf am Kolben langsam bis zum ersten Anschlag. Warten Sie einen Moment und drücken Sie dann den Druckknopf bis zum zweiten Anschlag, um eventuelle Restflüssigkeit in der Spitze zu entfernen.

Ein zu schnelles Drücken des Kolbens kann dazu führen, dass die ausgestoßene Flüssigkeit spritzt oder unerwünschte Blasen im Röhrchen entstehen.

Vor dem Loslassen des Kolbens in die Ruheposition die Spitze aus der Flüssigkeit nehmen.

Entsorgen Sie die Spitzen in den dafür vorgesehenen Abfallbehälter für scharfe Gegenstände, indem Sie die Auswurftaste an der Mikropipette drücken.

4. Aufräumen des Arbeitsplatzes

Wenn ein Experiment beendet ist, das eine aseptische Technik erfordert, schalten Sie den Bunsenbrenner aus und räumen Sie alle Vorräte und Reagenzien weg. Wischen Sie die Außenflächen von Laborgeräten (Flaschen, Mikropipetten, Pipettenspitzenboxen) mit einem vorbefeuchteten Desinfektionstuch ab, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen an den Lagerort gelangen.

Kontaminierte Glaswaren und gefährliche Abfallstoffe in den entsprechenden Entsorgungsbehälter geben. Laborabfälle umfassen Laborbedarf wie Handschuhe, Pipetten, Spitzen und Röhrchen. Bei der Durchführung von Experimenten mit nicht-pathogenen Organismen (BSL-1) fallen nicht infektiöse gefährliche Abfälle an, bei der Verwendung von pathogenen Organismen (BSL-2 oder höher) infektiöse gefährliche Abfälle. Infektiöser Abfall muss vor der Entsorgung autoklaviert oder desinfiziert werden. Befolgen Sie die im BMBL (5. Aufl.) beschriebenen Laborsicherheitsrichtlinien sowie die von der OSHA und den institutionellen Abteilungen für Umwelt, Gesundheit und Sicherheit bereitgestellten.

Wischen Sie den gesamten Arbeitsbereich auf dem Labortisch mit einem vorbefeuchteten Desinfektionstuch aus dem Kanister ab und lassen Sie das Desinfektionsmittel erneut verdunsten.

Vor Verlassen des Labors Hände gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser waschen.

5. Repräsentative Ergebnisse

Ein Anwendungsbeispiel für die Verwendung serologischer Pipetten zum Transfer von Flüssigkeiten ist in gezeigt Abbildung 7. Diese Pipetten werden häufig im mikrobiologischen Labor verwendet, um Medien für die Beimpfung mit Bakterienkulturen vorzubereiten. Sterile Flaschen werden beispielsweise zuerst mit einem bestimmten Volumen an Kulturbrühe, in diesem Fall Luria Broth (LB), dann mit einer kleinen Anzahl von Zellen (wie z E coli) werden den Medien hinzugefügt. Mit einer serologischen Pipette muss zunächst die Brühe aseptisch aus der Medienflasche in den Kolben überführt werden. In diesem Fall wurden 25 ml LB unter Verwendung einer 25 ml serologischen Pipette in einen sterilen 125 ml-Kolben gegeben. Als nächstes muss die Brühe mit . beimpft werden E coli Zellen. Hier wurden 10 μl Zellen aseptisch mit einer P20-Mikropipette aus einer zuvor wachsenden Kulturflasche auf die 25 ml frischen LB übertragen. Der Kolben wird für eine bestimmte Zeit in einer Wachstumskammer inkubiert, damit sich die Zellen replizieren können (in diesem Beispiel die E coli Zellen wurden über Nacht bei 37 °C auf einer Schüttelplattform inkubiert). Das Ergebnis ist eine trübe Bakterienzellkultur, die für nachfolgende Experimente verwendet werden kann.

Serologische Pipetten können auch verwendet werden, um Medien, die ursprünglich in einer Flasche geliefert wurden, in Teströhrchen oder zwischen Teströhrchen zu transferieren, wie dies bei Verdünnungen einer Bakterienkultur der Fall ist. Wenn bei diesen Arten von Medienmanipulationen keine aseptische Technik beibehalten wird, werden die Kulturen kontaminiert, und nachfolgende Experimente mit diesen Kulturen werden verzögert, da frische, nicht kontaminierte Kulturen hergestellt werden müssen. Fehler treten auf, weil während des gesamten Verfahrens kein steriles Feld aufrechterhalten wird. Sie können beispielsweise vergessen, den Labortisch zu desinfizieren oder den Rand einer Kulturflasche oder eines Kulturröhrchens abzuflammen. Sie können die Pipettenspitze berühren oder den Verschluss einer Flasche oder eines Reagenzglases auf den Tisch legen, anstatt sie in der Hand zu halten. Das richtige Verfahren ist entscheidend, um die Kontamination von Medien und Kulturen auf ein Minimum zu reduzieren. Abbildung 8A liefert ein Beispiel für eine reine versus kontaminierte Kultur von E coli in einem Röhrchen mit 5 ml LB. Das linke Feld zeigt eine Kultur mit einer einheitlichen feinen Trübung, die typisch für eine reine E coli Kultur. Im Gegensatz dazu zeigt das rechte Bild eine kontaminierte Kultur, deren Wachstumseigenschaften von denen abweichen, die für diesen Bakterienstamm erwartet werden.

Bei der Handhabung serologischer Pipetten können technische Fehler auftreten, die zur Übertragung falscher Medienvolumina zwischen den Teströhrchen führen. Sie können beispielsweise das Volumen auf der Pipette falsch ablesen (d. h. Ober- und Unterkante des Meniskus) oder Sie können das Medium vollständig aus einer TD-Pipette ausstoßen, die so konzipiert wurde, dass ein winziges Stückchen in der Spitze verbleibt, das nicht abgegeben werden kann. Bei einer Punkt-zu-Punkt-Förderung von Medien können Sie die falschen Kalibriermarken verwenden und das falsche Volumen dosieren. Abbildung 8B zeigt ein Beispiel für Teströhrchen mit korrekten vs. falschen Medienvolumina. Das Röhrchen links enthält 3,5 ml LB, gemessen mit einer 5-ml-serologischen Pipette. Der Student führte eine Punkt-zu-Punkt-Verabreichung der Medien durch, bei der LB bis zur 5,0-ml-Teilungsmarke aufgezogen und bis zur 1,5-ml-Marke dispensiert wurde. Das rechte Röhrchen enthält 2,5 ml LB, gemessen mit einer Pipette der gleichen Größe, weil der Student, der die Punkt-zu-Punkt-Zufuhr des Mediums durchgeführt hat, es falsch von der 5,0-ml-Marke bis zur 2,5-ml-Marke dosiert hat. Dieser Fehler führt zu einer Bakterienkultur mit einer höheren Konzentration als geplant, was dazu führt, dass nachfolgende Verdünnungen falsch sind. Diese Fehlerausbreitung kann zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen, das mit den richtigen Zellkonzentrationen wiederholt werden müsste.

Ein Anwendungsbeispiel für die Verwendung von Mikropipetten zum Transfer von Flüssigkeiten ist in gezeigt Abbildung 9. Diese Pipetten werden für eine Vielzahl von Experimenten in der Molekularbiologie und Mikrobiologie verwendet, einschließlich der Vorbereitung von Proben für die PCR und Gelelektrophorese oder das Beimpfen von sterilen Medien oder Puffern mit kleinen Volumina (weniger als 1,0 ml) von Bakterienzellen oder Phagenpartikeln. In dem bereitgestellten Beispiel überführte der Schüler 12,5 µl TE-Puffer in ein 1,8-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (linkes Röhrchen in Tafel A beachten Sie, dass dem Puffer Farbstoff zugesetzt wurde, um die Visualisierung der Flüssigkeit in den klaren Mikrozentrifugenröhrchen zu erleichtern). Bei diesem Verfahren musste der Schüler zuerst die richtige Mikropipette auswählen, in diesem Fall eine P20, und dann den Volumeter auf das richtige Volumen einstellen (Tafel B). Es wurde eine Spitze verwendet, die am Ende einen Wattebausch enthält, um zu verhindern, dass mögliche Verunreinigungen, die aus dem Zylinder der Mikropipette ausgestoßen werden könnten, die Pufferprobe in der Spitze erreichen. Diese Vorsichtsmaßnahme ist nicht erforderlich, wenn beim Ansaugen von Flüssigkeiten in die Spitzen vorsichtig vorgegangen wird und der Kolben langsam heruntergedrückt wird, damit die Flüssigkeit nicht in den Pipettenzylinder spritzt. Es können technische Fehler auftreten, die zur Übertragung falscher Volumina führen. Sie können beispielsweise die falsche Mikropipette für den Job auswählen oder den Volumeter an der richtigen Mikropipette auf ein falsches Volumen einstellen. Bevor Sie die Spitze in den Puffer eintauchen, können Sie den Kolben über den ersten Anschlag schieben, wodurch beim Loslassen des Kolbens ein Überschuss an Puffer in die Spitze gezogen wird. Alternativ tauchen Sie die Spitze möglicherweise nicht weit genug in den Puffer ein, sodass Luft in die Spitze anstelle des Puffers gesaugt wird. Wenn Sie Puffer in das Mikrozentrifugenröhrchen dosieren, vergessen Sie möglicherweise, den Kolben bis zum zweiten Anschlag zu drücken, wodurch weniger als das gewünschte Volumen aus der Spitze abgegeben wird. Das rechte Rohr in Paneel A von Abbildung 9 zeigt ein Mikrozentrifugenröhrchen mit dem falschen Puffervolumen im Verhältnis zum Röhrchen auf der linken Seite. Anstatt 12,5 μl Puffer abzugeben, gab der Schüler 125 μl ab. In diesem Fall wurde, obwohl die Zahlen auf dem Volumeter identisch eingestellt sind, die falsche Mikropipette für die Aufgabe ausgewählt (der Student verwendete eine P200 anstelle eines P20-Panels B), was zur Abgabe eines wesentlich größeren Puffervolumens führte. Wenn diese Lösung verwendet wurde, um eine Mischung von Reagenzien für eine Anwendung wie die PCR herzustellen, ändert dieser Fehler die Endkonzentration aller Reagenzien, die später in dasselbe Röhrchen gegeben werden. Folglich ist es unwahrscheinlich, dass das Experiment erfolgreich sein wird, da molekularbiologische Verfahren wie die PCR erfordern, dass alle Komponenten in bestimmten Konzentrationen vorliegen, damit die Reaktion richtig funktioniert.

Da es nicht immer möglich ist sicherzustellen, dass Mikropipetten (insbesondere das Innere des Zylinders) steril sind, können Stammlösungen kontaminiert werden, sodass selbst Fehlersuche bei der Durchführung von Experimenten fehlschlagen. Bei Verwendung von Mikropipetten zum Transferieren steriler Lösungen wird dringend empfohlen, Aliquots der Stammlösungen (Medien, Puffer, Wasser) unter aseptischer Technik mit serologischen Pipetten herzustellen. Es ist üblich, Arbeitsstammlösungen in sterilen konischen Röhrchen von 15 ml oder 50 ml aufzubewahren. Diese sind beim Betrieb einer Mikropipette oft einfacher zu handhaben und können bei Kontamination während des Volumentransfers durch ein frisches Aliquot der Stammlösung ersetzt werden.

Abbildung 1. Steriles Feld durch Aufwind der Bunsenbrennerflamme. Um die Kontamination steriler Lösungen und Kulturen zu minimieren, ist es wichtig, dass alle Manipulationen im sterilen Bereich durchgeführt werden. Die Ränder von Kulturröhrchen und -kolben aus Glas sollten durch die Spitze des blauen Kegels, den heißesten Teil der Flamme, geführt werden. Kunststoffröhrchen und -spitzen können nicht abgeflammt werden – diese sollten vor der Verwendung mit alternativen Methoden vorsterilisiert werden.

Figur 2. Serologische Pipetten zum aseptischen Transfer von Flüssigkeiten. (A) Von links nach rechts sind Zeichnungen von 25 ml-, 10 ml- und 5 ml-Pipetten gezeigt. (B) Serologische Pipetten können aus Kunststoff oder Glas sein. Plastikpipetten sind Einwegartikel (einmaliger Gebrauch) und werden normalerweise einzeln in Papier- und Plastikhüllen verpackt, in denen alle Innenflächen steril sind (linke Seite). Glaspipetten können mehrmals verwendet werden, vorausgesetzt, sie werden zwischen den Anwendungen gereinigt und sterilisiert. Diese werden normalerweise in Metallkanistern aufbewahrt (rechte Seite).

Figur 3. Es gibt zwei Arten von serologischen Pipetten: TC ("zu enthalten") oder TD ("zu liefern"). Abgebildet ist das erläuternde Etikett einer TD 5-ml-Pipette.

Figur 4. Aseptische Technik. Beim Aufsaugen von Flüssigkeiten aus einer Flasche, einem Kolben oder einem Röhrchen mit Kappen niemals die Kappe auf den Tisch legen. Halten Sie stattdessen die Kappe in derselben Hand wie die Pipettierhilfe, während Sie das Gefäß mit der Flüssigkeit mit der anderen Hand wie abgebildet manipulieren.

Abbildung 5. Meniskusbildung beim Aufziehen von Flüssigkeit in eine serologische Pipette. Das Volumen entspricht der Teilungsmarke auf der Pipette, an der der Meniskusboden ausgerichtet ist. In diesem Beispiel fluchtet der Meniskus mit der 2,5-ml-Teilungsmarke.

Abbildung 6. Einkanal-Mikropipette. (A) Gezeigt ist eine Probenmikropipette mit einer Kunststoffspitze, die an der Unterseite des Zylinderspitzenhalters befestigt ist. Angezeigt sind die Positionen des Volumeters, des Rändelrads zum Ändern der Volumeter-Einstellung, des Zylinderspitzenhalters, des Spitzenabwurfknopfes und des Druckknopfes für den Kolben. (B) Zwei-Stopp-Kolbensystem auf einer Mikropipette.

Abbildung 7. Verwenden serologischer Pipetten, um Medien in sterile 125-ml-Kolben zu überführen. Der linke Kolben enthält nur 25 ml Medium (LB), während der rechte Kolben eine Kultur von E coli resultierend aus der Inokulation von LB mit Zellen und anschließender Inkubation über Nacht bei 37 °C. Beachten Sie, dass das Medium in der Flasche auf der rechten Seite aufgrund des Zellwachstums trüb ist.

Abbildung 8. Mit serologischen Pipetten Medien in sterile Reagenzgläser überführen. (A) Das linke Röhrchen enthält 5 ml eines reinen E coli Kultur, während das rechte Röhrchen 5 ml einer kontaminierten Bakterienzellkultur enthält. Beachten Sie die Unterschiede in den Wachstumseigenschaften zwischen den beiden Kulturen. Obwohl beide trüb sind, wurde die rechte Kultur mit einem Pilz oder anderen luftgetragenen Mikroorganismen kontaminiert, was der Kultur eine andere Farbe und Konsistenz verleiht als erwartet für E coli Zellen. (B) Das linke Kulturröhrchen enthält 3,5 ml LB, während das rechte Röhrchen nur 2,5 ml LB enthält. Dieser Volumenunterschied resultierte aus einem Fehler, der bei der Durchführung einer Punkt-zu-Punkt-Zufuhr von Medien zu den Röhrchen gemacht wurde.

Abbildung 9. Verwenden von Mikropipetten, um Puffer in sterile Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. (A) Das linke Mikrozentrifugenröhrchen enthält nur 12,5 μl TE-Puffer, während das rechte Röhrchen 125 μl enthält. Beachten Sie, dass dem Puffer ein Farbstoff hinzugefügt wurde, um die Visualisierung der Flüssigkeit in den klaren Mikrozentrifugenröhrchen zu erleichtern. (B) Der linke Volumeter stammt von einer P20-Mikropipette, während der rechte Volumeter von einer P200-Mikropipette stammt. Ein häufiger Fehler ist die Auswahl der falschen Mikropipette. Obwohl die Nummern beim Volumeter P20 und P200 identisch eingestellt sind, führt die Auswahl der falschen Mikropipette zur Übertragung falscher Volumina.

Abbildung 10. Laminar-Flow-Haube zur Verhinderung der Kontamination von Lösungen und Kulturen. Abgebildet ist eine Biosicherheitswerkbank, die für die Arbeit mit BSL-2-Organismen zugelassen ist.


Methoden

Trainingstipps sind selbstgemachte Sätze markierter Pipettenspitzen, die den Auszubildenden beim Erlernen der Verwendung von Mikropipetten anleiten. In unserem Labor pipettieren wir am häufigsten zwischen 0,5 μl und 1000 μl, daher habe ich drei Sätze Trainingsspitzen entwickelt, die entweder mit der P1000-, P200/20- oder P10-Pipette verwendet werden. Um Trainingstipps herzustellen, pipettieren Sie eine Menge Wasser in die Pipettenspitze und markieren Sie den Meniskus mit einem schwarzen Marker. Markieren Sie jede Spitze nur bei einem einzigen Volumen. Es ist wichtig, dass die Linien auf den Trainingsspitzen möglichst parallel zur Basis der Spitze verlaufen. Das Wickeln des Klebebands leicht oberhalb und unterhalb des Meniskus, das Einfärben des freigelegten Bereichs und das Entfernen des Klebebands können sauberere Linien erzeugen, verlängern jedoch die Zeit, um jede Spitze herzustellen. Auf den P1000 Spitzen sind 1000 µl bis 200 µl in 50 µl Intervallen markiert. Bei P200/20-Spitzen werden 200 µl bis 20 µl in Abständen von 10 µl markiert. Darüber hinaus sind die P200/20-Spitzen auch mit 15, 10, 7,5, 5, 2 und 1 μl gekennzeichnet (Abbildung 1A).

(EIN) P200/20 Trainingsspitze, 200 µl–2 µl Spitzen. (B) Beispiele für Etiketten von Trainingsspitzen und wie sich 50-μl-Volumenunterschiede auf P1000-Spitzen registrieren.

(EIN) P200/20 Trainingsspitze, 200 µl–2 µl Spitzen. (B) Beispiele für Etiketten von Trainingsspitzen und wie sich 50-μl-Volumenunterschiede auf P1000-Spitzen registrieren.

Für P10-Spitzen wurden zwischen 10 µl und 1 µl in 1 µl-Intervallen markiert. Je nach Trainingssituation können mehr oder weniger Tipps angebracht sein. Auf einer Seite und der Oberseite jeder Spitze habe ich angegeben, welches Volumen die Markierung bezeichnet (Abbildung 1B). Die schwarzen Markierungslinien auf den Trainingstipps sind leichter zu erkennen als die klaren Abstufungen auf den Standardtipps. Darüber hinaus bieten die meisten Standardspitzen nur eine oder zwei Abstufungen, was die Fähigkeit der Schüler einschränkt, ihre Genauigkeit zu überprüfen. Die Trainingsspitzen sind in feineren Abstufungen und an einer einzigen Stelle markiert, so dass die Schüler deutlich sehen können, wie weit die Flüssigkeit für das angegebene Volumen die Spitze hinaufkommen sollte. Ein Schlüssel oben auf jeder Pipettenspitzenbox zeigt die Spitze an, die sich in jeder Vertiefung befindet (Abbildung 2). Der Schlüssel hilft den Schülern, das passende Trinkgeld schnell zu finden, und erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Schüler das Trinkgeld wieder in den Slot zurückgeben, aus dem es stammt. Dies trägt dazu bei, die Trinkgeldreihenfolge beizubehalten, wenn mehrere Schüler eine Box verwenden.

Beispiel für einen Schlüssel oben auf der Box mit Trainingstipps.

Beispiel für einen Schlüssel oben auf der Box mit Trainingstipps.

Wenn der Trainierende genau pipettiert, steigt die Flüssigkeit bis zur Markierung an der Seite der Spitze, aber nicht darüber hinaus. Mit den Trainingstipps können die Schüler sofort sehen, ob sie die richtige Flüssigkeitsmenge in die Pipette aufziehen. Wenn die Schüler beim Drücken des Pipettenkolbens über den ersten Anschlag hinausdrücken oder die Flüssigkeit nicht langsam in die Spitze eintreten lassen, wird die Flüssigkeit nicht bis zur markierten Linie gezogen und/oder es bilden sich Blasen. Die markierten Linien lenken die Aufmerksamkeit der Schüler auf die Pipettenspitze, und es ist wahrscheinlicher, dass sie Blasen bemerken und ihre Technik anpassen. Wenn die Schüler außerdem die falsche Pipette verwenden – zum Beispiel P200, um 5 μl zu pipettieren – wird die Flüssigkeit die Markierung nicht erreichen. Schulungstipps erfordern keine Waage, damit die Schüler feststellen können, ob sie genau pipettiert haben. Eine Waage wird jedoch für die Pipettenkalibrierung benötigt und kann bei der Beurteilung der Fortschritte der Schüler hilfreich sein. Die Markierungsstrategie ist auf jede Pipettenspitzenmarke anwendbar und dauert ungefähr ein bis zwei Stunden pro Satz. Es wird nicht für jeden Schüler einer Klasse ein ganzes Set benötigt und da Trainingstipps nicht für Experimente verwendet werden sollten und nur ein Trainingswerkzeug sind, können sie mit H . mehrfach wiederverwendet werden20. Daher ist der Zeitaufwand für die Erstellung von Trainingstipps nicht schwer. Um den Prozess der Erstellung von Trainingstipps weiter zu rationalisieren, könnte man sich auf Pipettenspitzen konzentrieren, die üblicherweise in einem Kurs oder einer bestimmten Übung verwendet werden. Die einzigen Materialien, die für die Herstellung von Trainingstipps benötigt werden, sind Pipettenspitzen, ein feiner schwarzer Marker und H20, daher sind die Kosten minimal.

In unserem Labor haben wir festgestellt, dass das Üben mit Trainingstipps den Schülern hilft, eine gute Pipettiertechnik zu erlernen und ihre Aufmerksamkeit auf die Flüssigkeitsmenge zu richten, die in die Pipette aufgesaugt wird. Wir haben festgestellt, dass das Pipettieren von farbiger Flüssigkeit in Abhängigkeit von der Farbe der Spitze und dem zu pipettierenden Flüssigkeitsvolumen einen noch dramatischeren visuellen Maßstab liefern kann, um zu sehen, ob sie richtig pipettieren. Wichtig ist, dass die Trainingstipps den Schülern schnell zeigen, wenn sie nicht richtig pipettieren, und haben so dazu geführt, dass die Schüler viel früher Hilfe suchen. Die Implementierung dieser Trainingsmethode hat dazu geführt, dass sich die Schüler stärker auf das Erlernen des Pipettierens konzentrieren. Obwohl sich die Ausbildungszeit nicht erhöht hat, haben sich die Fähigkeiten der Schüler verbessert.

Die meisten Schüler sind mit μl-Volumen nicht vertraut, bevor sie mit Mikropipetten arbeiten. Trainingstipps bieten visuelle Benchmarks für den Unterschied zwischen Volumina, die selbst für das geschulte Auge sehr ähnlich erscheinen (Abbildung 1A und B). Solche kleinen Volumenunterschiede können dramatische Auswirkungen auf den Versuchserfolg und die Reproduzierbarkeit haben. Bei Flüssigkeitsmengen, die mit mehreren Spitzentypen genau pipettiert werden können, können die Schüler sehen, wie hoch die Flüssigkeit in jeder Spitze steigen sollte. Zum Beispiel sieht das Pipettieren von 5 μl anders aus und fühlt sich anders an, wenn Sie einen P10 im Gegensatz zu einem P20 verwenden (Abbildung 3A). Trainingstipps ermöglichen es den Schülern zu sehen, wie ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen unter diesen unterschiedlichen Umständen aussehen sollte.


Ein Problem mit Basiskonzentrationen und seriellen Verdünnungsberechnungen - (Januar/06/2014 )

Ich habe vor kurzem ein Praktikum in einem Labor gemacht und finde mich mit grundlegenden mathematischen Problemen verloren! Es ist mir ziemlich peinlich, das zu fragen, aber ich muss diese Grundlagen in meiner Tasche haben.

1. Für die PCR benötige ich eine Konzentration von 0,3 µM an Primern. Wir halten unseren Lagerbestand bei 10uM. Wie viel pipettiere ich?

2. Reihenverdünnungen, wenn die Menge zum Pipettieren zu gering ist, z. 0,056ul

OK - das sind mehr Hausaufgaben für Sie, daher gebe ich Ihnen die Antworten nicht vollständig - Sie müssen selbst nachdenken.

Welches Volumen würden Sie für eine PCR (für 1 Röhrchen) erwarten? - Welches Volumen würden Sie also für die Primer pipettieren (ml? l? ul? nl?)? 

µM sind Mikromol pro Liter, wie viele pmol Primer werden in jeder Reaktion enthalten?  Und welches Volumen würde das ergeben?

Serielle Verdünnungen - Sie können eine 1:10-Verdünnung oder ein beliebiges anderes Vielfaches vornehmen, um ein pipettierbares Volumen (0,5 ul und mehr) zu erreichen.  1:10 und 1:2 sind am einfachsten, da sie irgendwie intuitiv sind (Multiplizieren mit 10 bzw. 2)

Für Verdünnungen ist die beste zu verwendende Gleichung Vi x Ci = Vf x Cf, wobei V und C Volumen und Konzentration sind und i und f Anfangs- bzw. Endwerte sind.

bob1 sagte am Mon Jan 6 19:49:05 2014:

OK - das sind mehr Hausaufgaben für Sie, daher gebe ich Ihnen die Antworten nicht vollständig - Sie müssen selbst nachdenken.

 

Welches Volumen würden Sie für eine PCR (für 1 Röhrchen) erwarten? - Welches Volumen würden Sie also für die Primer pipettieren (ml? l? ul? nl?)? 

 

µM sind Mikromol pro Liter, wie viele pmol Primer werden in jeder Reaktion enthalten?  Und welches Volumen würde das ergeben?

 

Serielle Verdünnungen - Sie können eine 1:10-Verdünnung oder ein beliebiges anderes Vielfaches durchführen, um ein pipettierbares Volumen (0,5 ul und mehr) zu erreichen.  1:10 und 1:2 sind am einfachsten, da sie irgendwie intuitiv sind (Multiplizieren mit 10 bzw. 2)

 

Für Verdünnungen ist die beste zu verwendende Gleichung Vi x Ci = Vf x Cf, wobei V und C Volumen und Konzentration sind und i und f Anfangs- bzw. Endwerte sind.

Das Volumen für die PCR wird in Mikrolitern angegeben. Wir werden 25 ul Gesamtreaktion verwenden. 

0,3 uM = 0,3 Picomol/ul. Bedeutet dies, dass ich aus meinem Vorrat von 10 uM beim Pipettieren von 1 ul 0,3 Pico-Mol für mein Reaktionsröhrchen bekomme? 

Normalerweise verwende ich civ1 = c2v2 in Berechnungen, aber hier ist kein vf angegeben (da ich das Experiment entwerfe und nur weiß, dass es unter 2 ul liegen sollte)

Für die serielle Verdünnung. Wenn ich mit 10 multipliziere, kann ich eine pipettierbare Menge erreichen. Von 0,056/1, multipliziert mit 10, erhalte ich eine Verdünnung von 0,56/10. Ich kann dies pipettieren, indem ich 0,56 ul in 10 (-0,56) ul hinzufüge. Füge ich davon 1 ul zu meinem letzten Röhrchen hinzu? 

Tut mir leid, wenn es überall ist, ich bin verwirrt über dieses Thema.

Vg12th sagte am Montag, 6. Januar, 22:03:02:

Das Volumen für die PCR wird in Mikrolitern angegeben. Wir werden 25 ul Gesamtreaktion verwenden. 

0,3 uM = 0,3 Picomol/ul. Bedeutet dies, dass ich aus meinem Vorrat von 10 uM beim Pipettieren von 1 ul 0,3 Pico-Mol für mein Reaktionsröhrchen bekomme? 

Normalerweise verwende ich civ1 = c2v2 in Berechnungen, aber hier ist kein vf angegeben (da ich das Experiment entwerfe und nur weiß, dass es unter 2 ul liegen sollte)

 

Für die serielle Verdünnung. Wenn ich mit 10 multipliziere, kann ich eine pipettierbare Menge erreichen. Aus 0,056/1, multipliziert mit 10, erhalte ich eine Verdünnung von 0,56/10. Ich kann dies pipettieren, indem ich 0,56 ul in 10 (-0,56) ul hinzufüge. Füge ich davon 1 ul zu meinem letzten Röhrchen hinzu? 

 

Tut mir leid, wenn es überall ist, ich bin verwirrt über dieses Thema.

Richtig - 1 ul ergibt 0,3 pmol - dies sollte es Ihnen ermöglichen, das richtige Volumen zu erhalten.  Wenn Sie kein Vf haben, aber die gewünschte Gesamtmenge kennen, verwenden Sie V=n/ C  wobei n der gewünschte Betrag ist.

Für eine Verdünnung von 1:10 bedeutet, dass Sie 1 Volumen Probe nehmen und auf 10 Volumen Verdünnungsmittel auffüllen (zB 1 ul Probe + 9 ul Verdünnungsmittel = 10 ul insgesamt) oder ein beliebiges Vielfaches davon.  Sie würden dann 0,56 ul nehmen dies (0,056 x 10).

1 ul 10 uM ergibt 10 pmol

Oh, ja, tut mir leid, habe gerade das erste bisschen über 0,3 µM gelesen.   Wie Mdfenko sagt.


3: Verdünnungstechniken und Pipettieren - Biologie

Dieser Abschnitt ist kein Rezept für Ihr Experiment. Es erklärt einiges Prinzipien für die Gestaltung von Verdünnungen, die optimale Ergebnisse liefern. Sobald Sie diese Prinzipien verstanden haben, können Sie die Verdünnungen, die Sie für jeden speziellen Fall benötigen, besser entwerfen.

Bei experimentellen Arbeiten müssen Sie häufig eine Reihe von Konzentrationen abdecken, sodass Sie eine Reihe verschiedener Verdünnungen herstellen müssen. Zum Beispiel müssen Sie solche Verdünnungen des Standard-IgG durchführen, um die Standardkurve im ELISA zu erstellen, und dann wieder für die unbekannten Proben im ELISA.

    Die Verdünnungen sind unnötig kompliziert zu machen. Sie müssen für jeden eine andere Berechnung durchführen und unterschiedliche Volumina messen. Es dauert lange, und es ist zu leicht, einen Fehler zu machen.

Verdünnungsreihen sind viel einfacher zu machen und sie den Bereich gleichmäßig abdecken.

Wenn Sie mehrere Zehnerfaktoren (mehrere "Größenordnungen") mit einer Reihe von Verdünnungen abdecken müssen, ist es normalerweise am sinnvollsten, die Verdünnungen (relative Konzentrationen) auf a . aufzutragen Logarithmische Darstellung. Dadurch wird vermieden, dass die meisten Punkte an einem Ende gebündelt werden und nur der letzte Punkt weit unten auf der Skala liegt.

Bevor Sie serielle Verdünnungen vornehmen, müssen Sie grobe Schätzungen der Konzentrationen in Ihren Unbekannten, und Ihre Unsicherheit in diesen Schätzungen. Wenn beispielsweise A280 sagt, dass Sie 7,0 mg Gesamtprotein/ml haben und Sie denken, dass das Protein zwischen 10 % und 100 % rein sein könnte, dann muss Ihr Assay in der Lage sein, alles zwischen 0,7 und 7 mg/ml zu sehen. Das bedeutet, dass Sie einen zehnfachen Verdünnungsbereich abdecken müssen, oder vielleicht ein bisschen mehr, um sicher zu gehen.

Wenn die Halbwertszeit Ihres Assays bei etwa 0,5 mg/ml liegt, beträgt Ihre minimale Verdünnungsfalte (700 mg/ml)/(0,5 mg/ml) = 1.400. Ihr Maximum ist (7000 mg/ml)/(0,5 mg/ml) = 14.000. Um sicher zu gehen, möchten Sie vielleicht 1.000 bis 20.000 abdecken.

    Was sind die niedrigste und höchste Konzentrationen (oder Verdünnungen) Sie müssen testen, um sicher zu sein, die Halbwertsgrenze zu finden? Diese bestimmen den Bereich der Verdünnungsreihe.

Angenommen, Sie entscheiden sich dafür sechs Tests ausreichen (vielleicht jeweils in vierfacher Ausfertigung). Nun, beginnend mit 1/1.000, benötigen Sie fünf gleiche Verdünnungsschritte (was Ihnen sechs Gesamtverdünnungen ergibt, wobei das anfängliche 1/1.000 gezählt wird), die in einer 20-fach höheren Verdünnung (ergeben von 1/20.000) enden. Du kannst Entscheide dich für eine gute Schrittgröße einfach durch Versuch und Irrtum. Würde 2-fach funktionieren? 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Ja, das deckt das 32-fache ab, mehr als das 20-fache, das wir brauchen. (Die genaue Antwort ist die 5. Wurzel von 20, die Ihnen Ihr Taschenrechner mitteilt, ist das 1,82-fache pro Schritt. Es ist viel einfacher, mit 2-fachen Verdünnungen zu gehen und ungefähr das gleiche Ergebnis zu erzielen.)

Sie müssen also zunächst eine Verdünnung von 1/1.000 vornehmen. Dann müssen Sie das 2-fache pro Schritt in fünf Schritten seriell verdünnen. Sie können 1/1.000 herstellen, indem Sie 1 Mikroliter Probe zu 0,999 ml Verdünnungsmittel hinzufügen. Warum ist das eine schlechte Wahl? Weil Sie mit gewöhnlichen Pipetten 1 Mikroliter (oder sogar 10 Mikroliter) nicht genau messen können. Machen Sie also drei serielle 1/10-Verdünnungen (0,1 ml [100 Mikroliter] in 0,9 ml): 1/10 x 1/10 x 1/10 = 1/1.000.


VERDÜNNUNGSBESCHICHTUNG

Dieses Verfahren wird verwendet, um die Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen in einer festen Menge einer Flüssigkeit zu bestimmen. Es kann auch relativ leicht modifiziert werden, um Ergebnisse mit festen Substanzen zu erhalten, z.B. mazerierte Lebensmittel.

Hintergrund

Die serielle Verdünnung beinhaltet das wiederholte Mischen bekannter Mengen der Quellkultur mit (sterilisierter) Flüssigkeit. 1 ml Zugabe zu 9 ml ergibt eine 10-fache Verdünnung 1 ml Zugabe zu 99 ml ergibt eine 100-fache Verdünnung.

Wenn feste Mengen dieser Verdünnungsreihe mit einem geeigneten Agar gemischt und inkubiert werden, werden unterschiedliche Kolonienzahlen erhalten.

Durch Rückarbeiten von einer leicht zählbaren Platte und Verwendung des entsprechenden Verdünnungsfaktors kann die Anzahl der Mikroorganismen in der ursprünglichen Quellkultur berechnet werden.

Verfahren

Für diese Übung können Hefesuspensionen, ("frische" oder "abgestandene") Milch oder Wasser verwendet werden.

Röhrchen und (leere) Petrischalen wie in der Abbildung unten gezeigt auslegen und beschriften.

Jedes Mitglied des Teams kann abwechselnd die unten aufgeführten wiederholten Abschnitte ausführen und andere nach Bedarf auffordern.

Flammen und lösen Sie die Deckel der Röhrchen 0 und 1.

Übertragen Sie mit einer sterilen Pipette ASEPTISCHE HANDHABUNG 1 ml Flüssigkeit von Röhrchen 0 auf Platte 0 und mit DER GLEICHEN PIPETTE 1 ml Flüssigkeit aus der Quellkultur (Röhrchen 0) in Röhrchen 1.

Dann: ENTSORGEN SIE DIE PIPETTE.

Den Rand des Röhrchens 1 abflammen. Den Inhalt verschließen und vorsichtig mischen.

Wiederholen Sie den Vorgang mit dem nächsten Röhrchen und der nächsten Platte:

Flamme und löse die Deckel der Röhrchen 1 und 2.

Übertragen Sie 1 ml Flüssigkeit aus Röhrchen 1 auf Platte -1 und auch in Röhrchen 2.

ENTSORGEN SIE DIESE PIPETTE. Flammen Sie den Rand von Röhrchen 2 ab. Verschließen und mischen Sie den Inhalt vorsichtig.

Wiederholen Sie die gleichen Schritte 5 oder 6 Mal und bewegen Sie sich entlang der Kette, wie im folgenden Flussdiagramm gezeigt.

Am Ende dieses Prozesses:

Nehmen Sie eine Flasche sterilisierten Agars aus dem 45 °C warmen Wasserbad, wo er knapp über der Einstellungstemperatur gehalten wurde. Trocknen Sie die Außenseite der Flasche und flammen Sie den oberen und den Halsbereich ab.

Dann ARBEITEN SIE SCHNELL UND ASEPTISCH:

Öffnen Sie jeden Petrischalendeckel nur leicht und gießen Sie Nähragar in die bereits in der Petrischale befindliche Verdünnungsflüssigkeit, bis er etwa zwei Drittel der Fläche bedeckt - dies ist jedoch nicht kritisch.

Mischen Sie den Agar mit der Verdünnungsflüssigkeit durch leichtes Schwenken, flammen Sie dann die Flaschenöffnung ab und fahren Sie fort, um eine weitere Petrischale zu gießen. Wenn die Flasche leer ist, waschen Sie sie mit heißem Wasser aus.

Lassen Sie das Geschirr ungestört FLACH AUF DER BANK fest werden – mindestens 10 Minuten. Überprüfen Sie die Beschriftung.

Versiegeln und drehen Sie die Petrischalen um und stellen Sie sie bei einer geeigneten Temperatur in den Inkubator.

Ergebnisse

Nach angemessener Zeit:

Untersuchen Sie jede Petrischale OHNE SIE ZU ÖFFNEN und suchen Sie nach einzelnen Kolonien.

Einige werden mehr Kolonien haben, als Sie zählen können. Manche haben vielleicht keine.

Mehrere Zwischenstufen werden zählbar sein. ZÄHLEN UND ZEICHNEN Sie diese zusammen mit den entsprechenden Verdünnungsfaktoren in eine Tabelle ein.

Gibt es ein allgemeines Muster oder eine mathematische Beziehung zwischen ihnen?

Von diesem Verfahren wird manchmal gesagt, dass es eher die Zahl der "koloniebildenden Einheiten" als die einfache Zahl lebensfähiger Organismen angibt. Was ist der Unterschied?


Spike-and-Recovery-Experimente

Bei Spike-and-Recovery-Experimenten besteht das primäre Ziel darin, festzustellen, ob die Analyterkennung durch einen Unterschied zwischen dem Assay-Verdünnungsmittel/Puffer, der zur Erstellung der Standardkurve eines Endbenutzers verwendet wird, und der Probenmatrix beeinflusst wird. Die Probenmatrix kann eine reine (unverdünnte) biologische Probe oder eine biologische Probe sein, die in Assay-Verdünnungsmittel verdünnt ist. Dies wird erreicht durch Zugabe einer bekannten Menge des rekombinanten Proteinstandards (Spike) in die natürliche Testprobenmatrix und Beobachten seiner Reaktion (Wiederfindung) relativ zur Zugabe derselben bekannten Menge zum Assay-Verdünnungsmittel. Die Reaktion (die resultierende Konzentration) wird aus der Standardkurve und der OD interpoliert, die sich aufgrund der Zugabe einer bekannten Menge an rekombinantem Proteinstandard ergab. Nach dem Ausführen der beiden Antwortsätze und der Berechnung der Konzentration anhand der Standardkurve kann ein Endbenutzer die prozentuale Wiederfindung berechnen, um die prozentuale Abweichung des beobachteten gespikten Probenwerts vom beobachteten nicht gespikten Probenwert relativ zur tatsächlich bekannten Menge zu ermitteln und die Kompatibilität zu bestimmen des Assay-Verdünnungsmittels und der Probenmatrix. Ein Endbenutzer möchte eine identische Reaktion für eine bestimmte Menge an interessierendem Analyt sowohl in der Probenmatrix als auch im Assay-Verdünnungsmittel/Puffer erzielen. Mit anderen Worten, bei vollständig kompatiblen Probenmatrizes sollte eine Wiederfindung von 100 % erreicht werden, da die für den Spike beobachtete Wiederfindung identisch mit der Wiederfindung ist, die sowohl im Assay-Verdünnungsmittel als auch in der Probenmatrix erhalten wurde. Die prozentuale Wiederfindung kann bis zu 20 % abweichen. Wenn der wiedergefundene Wert erheblich von der erwarteten Menge abweicht (aufgrund von Dotierung mit einer bekannten Menge), kann diese Abweichung von der 100%igen Wiederfindung auf den Grad der Inkompatibilität/Diskrepanz des Assay-Verdünnungsmittels zur Probenmatrix hindeuten. In diesem Fall müssen Anpassungen vorgenommen werden die Abweichung minimieren. Bei sehr schlechten Probenrückgewinnungen kann diese Anpassung die Verwendung eines anderen Assay-Verdünnungsmittels empfehlen, dessen Zusammensetzung der endgültigen Probenmatrix besser entspricht.


Regulatoren und Effektoren kleiner GTPas

Yan Feng, . Angela Wandinger-Ness, in Methoden der Enzymologie, 2001

Erzeugung stabiler Zelllinien.

Der endozytische Membrantransport wurde in der BHK-Zelllinie gut charakterisiert und wurde daher für die Erzeugung stabiler Zelllinien ausgewählt, die bedingt Rab7 exprimieren. 6 Das ursprünglich von Gossen und Bujard 7 beschriebene Tetracyclin-induzierbare System 7 wurde wegen seiner strengen regulatorischen Kontrolle verwendet, mit nicht nachweisbarer Expression unter nicht-induzierenden Bedingungen (3 μg/ml Tetracyclin).

Zunächst wurde eine parentale Zelllinie erzeugt, die den chimären Tetracyclin-regulierten Transkriptionstransaktivator tTA durch Standard-Calciumphosphat-vermittelte Transfektion von subkonfluenten BHK21-Zellen mit pUHD 15-1 (6 μg pro 6-cm-Schale) exprimierte. Nach der Transfektion wurde den Zellen erlaubt, sich 24 Stunden lang zu erholen, bevor sie bei 1:2,6 passagiert und in G-MEM mit 800 &mgr;g/ml Geneticin transferiert wurden. Lebensfähige Klone wurden unter Verwendung von Klonierungsringen isoliert, in Geneticin enthaltendem Medium und konditioniertem Medium aus subkonfluenten BHK-Zellen expandiert und auf ihre Fähigkeit getestet, die Expression von Luciferase unter der Kontrolle eines Tetracyclin-empfindlichen Operators (unter Verwendung von pUHC 13–37) zu induzieren. Klonieren mit limitierender Verdünnung wurde verwendet, um eine BHK-tTA-Zelllinie zu subklonieren, die einen 10-fachen Anstieg der Luciferase nach Transfektion und Wachstum in Abwesenheit von Tetracyclin und <2% der maximalen Luciferase-Aktivität bei Kultivierung in Gegenwart von Tetracyclin aufwies. Das Erhalten einer streng regulierten Elternzelllinie ist ein kritischer erster Schritt zur erfolgreichen Isolierung nachfolgender Zelllinien, bei denen die Expression des interessierenden Gens streng kontrolliert wird. Eine Reihe anderer Zelltypen, die tTA exprimieren und als Elternlinien nützlich sind, sind jetzt im Handel von Clontech erhältlich.

Um stabile Linien zu isolieren, die rekombinante Rab7-Proteine ​​exprimieren, wurden subkonfluente BHK-tTA-Zellen einer Calciumphosphat-vermittelten Transfektion mit 10 µg pUHD 10-3-Rab7 pro 6-cm-Schale und 1 µg des pMiwhph-Plasmids, das das Hygromycin-Resistenzgen trägt, unterzogen. 24 Zellen durften sich 24 Stunden nach der Transfektion in G-MEM erholen, das 400 µg/ml Geneticin und 3 µg/ml Tetracyclin enthielt, vor einer 1:2,6-Aufteilung und der Zugabe von 400 µg/ml Hygromycin B (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla , CA). Einzelne BHK-tTA/R7-Klone wurden isoliert und durch Immunoblot-Analyse und Immunfluoreszenz-Färbung auf Tetracyclin-regulierte Überexpression von Rab7 untersucht. Jene Klone mit Spiegeln der rekombinanten Rab7-Proteinexpression unterhalb des Nachweises in Gegenwart von Tetracyclin wurden zweimal durch limitierende Verdünnung subkloniert. Diese stabilen BHK-tTA/R7-Zelllinien wurden routinemäßig in normalem G-MEM (5% FCS, 2,6 mg/ml Tryptosephosphat-Brühe, Glutamin und Penicillin/Streptomycin), ergänzt mit 200 µg/ml Hygromycin B, 3 µg/ml ., gehalten Tetracyclin und 400 µg/ml Geneticin. Unter diesen Bedingungen konnte keine rekombinante Rab7-Proteinexpression nachgewiesen werden. G-MEM, das die selektiven Mittel enthält, wird nach Bedarf aus Einmal-Aliquoten gefrorener Stammlösungen aufgrund der instabilen Natur von Tetracyclin in wässriger Lösung hergestellt. Für einige Anwendungen kann es aufgrund seiner höheren Stabilität und Wirksamkeit bei niedrigeren Dosierungen (20 ng/ml) vorteilhaft sein, Tetracyclin durch Doxycyclin zu ersetzen.


Verdünnung von Lösungen Techniken und Berechnungen (Verdünnungsgleichung: c1V1=c2V2)

C1V1 = c2V2

C1 = Konzentration der Stammlösung (vor der Verdünnung) in mol L -1
V1 = Volumen der vor der Verdünnung vorhandenen Stammlösung in L
C2 = Konzentration der neuen verdünnten Lösung (nach Zugabe von mehr Lösungsmittel) in mol L -1
V2 = Gesamtvolumen der neuen verdünnten Lösung in L
Hinweis: V2 > V1 und C2 < c1

findenBerechnung
Konzentration der verdünnten Lösung bestimmenC2 = C1V1 &V teilen2
Volumen der verdünnten Lösung bestimmenV2 = C1V1 &dividiere c2
Konzentration der Stammlösung vor der Verdünnung bestimmenC1 = C2V2 &V teilen1
Volumen der verwendeten Stammlösung bestimmen (vor Verdünnung)V1 = C2V2 &dividiere c1
C1V1 = c2V2

C1 = Konzentration der Stammlösung (vor Verdünnung) in mol L -1
V1 = Pipettenvolumen zum Überführen der Stammlösung in L
C2 = Konzentration der neuen verdünnten Lösung (nach Zugabe von Wasser) in mol L -1
V2 = Volumen des zur Herstellung der verdünnten Lösung verwendeten Messkolbens in L

findenBerechnung
Konzentration der verdünnten Lösung bestimmenC2 = C1V1 &V teilen2
Volumen der verdünnten Lösung bestimmenV2 = C1V1 &dividiere c2
Konzentration der Stammlösung bestimmenC1 = C2V2 &V teilen1
Bestimmen Sie das Volumen der verwendeten PipetteV1 = C2V2 &dividiere c1

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Verdünnungstechnik

Eine Lösung kann durch Zugabe von Lösungsmittel zu einem bestimmten Volumen der Stammlösung verdünnt werden.

Um eine Lösung zu verdünnen, benötigen wir:

Schritt Beschreibung Berechnung
1 Die zu verdünnende Lösung befindet sich in einem Gefäß wie einem Messkolben. Diese Lösung wird als Stammlösung bezeichnet.
Um eine Kontamination dieser Stammlösung zu vermeiden, geben Sie eine kleine Menge davon in einen sauberen, trockenen Erlenmeyerkolben, schwenken Sie diese und entsorgen Sie diese Lösung entsprechend.
Verwenden Sie zum Spülen des Kolbens KEIN Wasser oder ein anderes Lösungsmittel, da die Zugabe von mehr Lösungsmittel die Lösung verdünnen würde und wir die Konzentration dieser Lösung nicht mehr kennen würden.
Gießen Sie einen Teil Ihrer Stammlösung in den gespülten Erlenmeyerkolben.
Verschließen Sie den Erlenmeyerkolben, wenn Sie ihn nicht verwenden, um eine Kontamination aus der Atmosphäre zu vermeiden.
Beschriften Sie es mit dem Datum und der Formel der Lösung und ihrer Konzentration, zum Beispiel [NaCl(aq)] = 0.10 mol L -1
Notieren Sie die Konzentration dieser unverdünnten Stammlösung als c1 in mol L -1
C1 = [unverdünnte Lösung] mol L -1

2 Sie benötigen eine saubere, trockene Pipette mit bekanntem Volumen.
Dies wird auf die Pipette gedruckt, zum Beispiel 10,00 ml, 25,00 ml usw.
Mit dem Pipettenfüller (Birne) eine kleine Menge Stammlösung aus dem Erlenmeyerkolben aufziehen, die Pipette aus der Lösung nehmen, die Lösung in der Pipette zum Spülen schwenken und diese Lösung dann entsprechend entsorgen.
Verwenden Sie zum Spülen der Pipette KEIN Wasser oder ein anderes Lösungsmittel, da Sie die Lösung verdünnen würden und wir die Konzentration dieser Lösung nicht mehr kennen würden.
Legen Sie die gespülte Pipette in die Stammlösung im Erlenmeyerkolben und ziehen Sie die Lösung auf, bis der auf der Pipette markierte Füllstand überschritten ist.
Entfernen Sie die Pipette aus der Stammlösung.
Die Pipette wurde innerhalb der Grenzen eines Becherglases aufgehängt.
Lassen Sie die Lösung tropfenweise aus der Pipette entweichen, bis der Meniskusboden (in Augenhöhe betrachtet) gerade auf der auf der Pipette markierten Höhe liegt.
Sie müssen das Volumen dieser unverdünnten Stammlösung in der Pipette aufzeichnen.
Es ist eine gute Idee, dieses Volumen in Milliliter (ml) in ein Volumen in Liter (L) umzurechnen, wenn Ihre Konzentration mol L -1 (Molarität) beträgt:
Volumen in L = Volumen in ml & 1000 . dividieren
Notieren Sie das Volumen dieser Pipette als V1, zum Beispiel V(NaCl)1 = 10,00 ml = 10,00/1000 = 0,0100 l
V1 = [Volumen der unverdünnten Lösung in der Pipette] L V1 = V(unverdünnte Lösung) L

3 Positionieren Sie die Pipette so, dass die Pipettenspitze schräg auf den Innenhals des sauberen Messkolbens trifft.
Lassen Sie die Lösung in der Pipette entweichen und laufen Sie über den Hals des Messkolbens in den Kolbenkörper.
Pipetten sind normalerweise so konstruiert, dass sie ein bekanntes Volumen abgeben. Das bedeutet, dass der kleine Lösungstropfen, der in der Pipettenspitze verbleibt, dort sein soll, also versuchen Sie nicht, ihn auszublasen.
Wir haben nun ein bekanntes Volumen der unverdünnten Stammlösung mit bekannter Konzentration in diesem Messkolben.
Berechnen Sie die Mole des gelösten Stoffes n(gelöster Stoff), die in diesem Messkolben enthalten sind.
Mol des gelösten Stoffes (Mol) = Konzentration der Lösung (Mol L -1 ) & mal das Volumen der von der Pipette abgegebenen Lösung (L)
n(gelöst) = c1 &mal V1
Notieren Sie die Mole des gelösten Stoffes, n(gelöster Stoff) in Mol. n(gelöst) = c1 &mal V1 mol 4 Setzen Sie einen Glastrichter in den Hals des Messkolbens.
As you pour your solvent, for example water, into the funnel, leave a small air gap between the stem of the funnel and the neck of the volumetric flask so that the solvent flows freely.
When the solvent reaches the base of the neck of the volumetric flask, stop pouring and allow any solvent remaining in the funnel to flow through.
Slowly, and carefully, add more solvent until the bottom of the meniscus is about 1 cm from the level marked on the neck of the volumetric flask when viewed at eye level.
Use a clean pasteur pipette that has been rinsed with the solvent to add more solvent drop-by-drop to the volumetric flask until the bottom of the meniscus sits exactly on the level marked on the neck of the flask when viewed at eye level.
Stopper the volumetric flask.
Record the volume of the diluted solution in this volumetric flask as V2 in mL
Convert the volume in millilitres to a volume in litres dividing by 1000.
Record this volume as V2 L. V2 = [dilute solution] L

The Dilution Equation (dilution formula, or, dilution expression)

undiluted solution &rarr pipette &rarr volumetric flask &rarr add solvent &rarr dilute solution
c(undiluted solution) mol L -1 V(pipette) in mL
V(pipette) in mL ÷ 1000 = V(pipette) L
n(solute) = c(undiluted solution) × V(pipette in L) mol V(dilute solution) in mL
V(dilute solution in mL) ÷ 1000 = V(dilute solution in L)
c(dilue solution) = n(solute) ÷ V(dilute solution in L)
C1
in mol L -1
V1
in L
n(solute) = c1 × V1
in mol
V2
in L
C2 = n(solute) ÷ V2
in mol L -1
or c2 = (c1 × V1) ÷ V2
in mol L -1

So we now have an equation (expression or formula) to calculate the concentration of a solution after it has been diluted:

C1 = concentration of undiluted solution in mol L -1
V1 = volume of stock solution added to the volumetric flask = volume of pipette used in L
C2 = concentration of the dilute solution in mol L -1
V2 = volume of volumetric flask holding the dilute solution in L

If we rearrange this equation (expression or formula) by multiplying both sides of the equation by V2 we get:

which simply means that the moles of solute transferred by pipette and placed in the volumetric flask (n1) equals the moles of solute present in the volumetric flask after more solvent was added during the dilution (n2).

moles solute transferred by pipette to volumetric flask=moles solute in volumetric flask after solvent added (dilute solution)
C1V1=C2V2
n1=n2

This equation (formula or expression) is very useful because we can rearrange it find:


Schau das Video: How to use a Micropipette (Juni 2022).


Bemerkungen:

  1. Kazram

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  2. Turg

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  3. Elrod

    Herzlichen Glückwunsch, Sie haben gerade eine brillante Idee besucht

  4. Andor

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  5. Vosho

    Du hast nicht recht. Lass uns diskutieren. Senden Sie mir eine E -Mail an PM, wir werden reden.

  6. Sparke

    Ich denke, Sie werden den Fehler zulassen. Schreiben Sie mir in PM, wir werden diskutieren.



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