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Welche Chemikalien töten P1-Phage, aber nicht E. coli?

Welche Chemikalien töten P1-Phage, aber nicht E. coli?



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ich arbeite mit E coli und P1-Phage. Ich frage mich, ob es ein chemisches Mittel gibt, das P1 tötet oder deaktiviert, aber es verlässt E coli unberührt? Es reicht nicht aus, nur eine Infektion zu verhindern. Es muss den Phage zerstören.


Neues Material tötet E. coli-Bakterien in 30 Sekunden ab

Forscher in Singapur haben ein neues Material entwickelt, das die E coli Bakterien innerhalb von 30 Sekunden.

Jeden Tag sind wir Millionen schädlicher Bakterien ausgesetzt, die Infektionskrankheiten verursachen können, wie z E coli Bakterien. Forscher des Institute of Bioengineering and Nanotechnology (IBN) der Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapur, haben nun ein neues Material entwickelt, das die E coli Bakterien innerhalb von 30 Sekunden. Dieses Ergebnis wurde in der Peer-Review-Zeitschrift veröffentlicht, Klein.

„Die weltweite Bedrohung durch arzneimittelresistente Bakterien hat zu einem dringenden Bedarf an neuen Materialien geführt, die schädliche Bakterien abtöten und deren Wachstum verhindern können. Unser neues antimikrobielles Material könnte in Verbraucher- und Körperpflegeprodukten verwendet werden, um gute persönliche Hygienepraktiken zu unterstützen und Ausbreitung von Infektionskrankheiten zu verhindern", sagte die geschäftsführende Direktorin von IBN, Professor Jackie Y. Ying.

Triclosan, ein häufiger Inhaltsstoff, der in vielen Produkten wie Zahnpasten, Seifen und Reinigungsmitteln enthalten ist, um bakterielle Infektionen zu reduzieren oder zu verhindern, wird mit der Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika und schädlichen Auswirkungen auf die Gesundheit in Verbindung gebracht. Die Europäische Union hat die Verwendung von Triclosan in Kosmetika eingeschränkt[1], und die US-amerikanische Food and Drug Administration führt eine laufende Überprüfung dieses Inhaltsstoffs durch [2].

Angetrieben von der Notwendigkeit, eine geeignetere Alternative zu finden, synthetisierten IBN-Gruppenleiter Dr. Yugen Zhang und sein Team eine chemische Verbindung, die aus Molekülen besteht, die in einer Kette miteinander verbunden sind. Dieses Material, das als Imidazolium-Oligomere bezeichnet wird, kann 99,7 % der E coli Bakterien innerhalb von 30 Sekunden, unterstützt durch seine kettenartige Struktur, die hilft, die Zellmembran zu durchdringen und die Bakterien zu zerstören. Im Gegensatz dazu töten Antibiotika nur die Bakterien ab, ohne die Zellmembran zu zerstören. Wenn die Zellstruktur intakt bleibt, können neue antibiotikaresistente Bakterien wachsen.

„Unser einzigartiges Material kann Bakterien schnell abtöten und die Entwicklung antibiotikaresistenter Bakterien hemmen. Computerchemische Studien unterstützten unsere experimentellen Ergebnisse, dass die kettenartige Verbindung wirkt, indem sie die Zellmembran angreift. Dieses Material ist auch sicher in der Anwendung, da es eine positive Ladung, die auf die negativ geladenen Bakterien abzielt, ohne rote Blutkörperchen zu zerstören", sagte Dr. Zhang.

Die Imidazolium-Oligomere liegen in Form eines weißen, wasserlöslichen Pulvers vor. Die Forscher fanden auch heraus, dass es, sobald es in Alkohol gelöst wurde, spontan Gele bildete. Dieses Material könnte in alkoholische Sprays eingearbeitet werden, die zur Sterilisation in Krankenhäusern oder zu Hause verwendet werden.

E coli ist eine Bakterienart, die im Darm von Mensch und Tier vorkommt, und einige Stämme können schwere Durchfälle, Bauchschmerzen und Fieber verursachen. Eine solche Infektion ist ansteckend und kann durch kontaminiertes Essen oder Wasser oder durch Kontakt mit Menschen oder Tieren verbreitet werden. Gute Hygienepraktiken und der richtige Umgang mit Lebensmitteln können verhindern


Bakteriophagen-Vektoren für E.Coli | Genetik

Die Klonierung einzelner Gene erfolgt normalerweise am besten unter Verwendung von Plasmiden, da das Insert selten größer als etwa 2 kb ist. Für die Klonierung größerer DNA-Stücke (z. B. während der Genbank-Konstruktion) sind diese Plasmide jedoch nicht geeignet, da größere Inserts die Plasmidgröße erhöhen, was die Transformation ineffizient macht. Große DNA-Moleküle können durch virale Partikel (Bakteriophagen) in die Bakterienzelle des Wirts injiziert werden. Häufig verwendete Bakteriophagen sind M13-, f1-, fd- und Lambda-(λ)-Phagen.

(i) Phagen Lambda (λ) als Vektor:

Ein häufig verwendeter Vektor ist der des Lambda (λ)-Phagen. Als Klonierungsvektor kann der Bakteriophage verwendet werden, der E. coli-Zellen infiziert. Die DNA des λ-Phagen ist 48,5 kb lang. An seinen Enden befinden sich die cos (kohäsiven) Stellen, die aus 12 bp kohäsiven Enden bestehen. Die cos-Enden ermöglichen die Zirkularisierung der DNA in der Wirtszelle.

Für die Klonierung großer DNA-Fragmente bis etwa 20 kb wird ein Großteil der nicht essentiellen Lambda-DNA entfernt und durch das Insert (gewünscht oder ta) ersetzt. Die rekombinante DNA wird dann in vitro in virale Partikel verpackt, und diese werden infiziert Bakterienzellen (E. coli), die auf Agar ausplattiert wurden.

In den Bakterienzellen angekommen, wird die rekombinante virale DNA repliziert. Alle Gene, die für ein normales lytisches Wachstum benötigt werden, sind noch in der DNA vorhanden, und so findet die Vermehrung des Virus durch Zyklen der Zelllyse und Infektion der umgebenden Zellen statt. Es führt zu Plaques von lysierten Bakterienzellen auf einem Hintergrund oder Rasen von Bakterienzellen. Aus den Viren in diesen Plaques kann geklonte DNA gewonnen werden.

Es gibt die folgenden zwei Arten von Lambda-Vektor-Phagen, die sich in der Größe der DNA unterscheiden, die sie akzeptieren:

(a) Lambda-Ersetzungsvektoren und

(b) Lambda-Insertionsvektoren.

(a) Lambda-Ersatzvektoren:

Lambda-Ersatzvektoren enthalten eine Restriktionsstelle für die Phagenvermehrung in einem geeigneten bakteriellen Wirt. Der verbleibende Teil des Lambda-Genoms wird entfernt und durch fremde DNA ersetzt. Die Ligation wird in einem Verhältnis von Armen zu Ziel-DNA durchgeführt, das die Bildung sehr langer Konkatemere begünstigt. Die Konkatemere sind Kopien mit mehreren Längen mit mehreren Replikationskomplexen und -gabeln. In jedem der Konkatemere sind Vektor- und Zielmoleküle eingestreut.

Aus dem Phagen wurden eine Reihe sogenannter Ersatzvektoren entwickelt, Beispiele sind EMBL4, EMBL3, λ DASH usw. Bei den meisten Ersatzvektoren enthält die interne Region, die durch das Target ersetzt wird, ein Gen, das den Phagen unlebendig macht (tot). ) in einem geeigneten E. coli-Wirt Vektormolekül, das Ziel-DNA enthält, kann durch Infektion des Wirts selektiert werden. Rekombinante Phagen, bei denen die interne Region durch Ziel-DNA ersetzt ist, sind lebensfähig und werden meistens zum Klonen von eukaryontischen DNA-Fragmenten verwendet.

(b) Lambda-Einfügungsvektoren:

Beim Klonieren in einen Insertionsvektor wird die Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym gespalten, das sie nur einmal schneidet, und das Ziel wird in diese Stelle eingefügt. Es wird keine Phagen-DNA entfernt, daher kann viel kleinere Ziel-DNA eingefügt werden.

Im üblicherweise verwendeten Vektor-Phagen λgt 10 befindet sich die Eco II-Klonierungsstelle in einem Gen, das für die Phagenreplikation in bestimmten Wirtsstämmen schädlich ist. Dies ermöglicht die Selektion gegen nicht-rekombinante Phagen.

(ii) Filamentöse Phagen als Klonierungsvektor:

Es umfasst die Ff-Klasse von filamentösen Phagen, einschließlich der Stämme f1, fd und M13, die E. coli-Zellen infizieren. Diese Ff-Virionen sind lang und dünn und enthalten eine geschlossene Schleife einzelsträngiger DNA. Da die Phagen leicht Inserts fremder DNA akzeptieren und einen Strang dieser DNA in einer leicht isolierten Form liefern, sind Vektoren auf der Basis von Ff-Phagen zur Standardwahl der Biotechnologie geworden.

A. M13 Bakteriophage:

Der M13 ist ein filamentöser Bakteriophage von E. coli. Es ist 870 nm lang und 6 nm breit. Es hat eine Proteinhülle (das Kapsid), die aus drei Arten von Kapsomeren besteht. Dieser filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen infiziert die Bakterienzelle, indem er an einen Pilius adsorbiert und durch diesen eindringt. M13-Phagen infizieren nur F + - oder Hfr-Zellen, nicht F –-Zellen.

Die M 13 Phagenpartikel enthalten eine 6,7 kb große zirkuläre einzelsträngige DNA. Nach Infektion eines sensitiven E. coli-Wirts wird der komplementäre Strang synthetisiert und die DNA als Doppelstandard-Kreis, der replikativen Form (RF), mit etwa 100 Kopien pro Zelle repliziert.

Weitere M13-Phagen lysieren die Wirtszellen nicht (um Nachkommen-Phagen und bakterielle DNA aus den aufgebrochenen bakteriellen Wirtszellen freizusetzen) wie Lambda-Phagen während des lytischen Zyklus. Stattdessen werden die Nachkommen M13-Viren/Phagen durch die Schichten der Plasmamembran und Zellwand extrudiert, ohne das Zellwachstum wesentlich zu stören.

Infizierte Bakterienzellen wachsen weiter und extrudieren Tausende von Nachkommen-Viruspartikeln (d. h. bis zu 1000 pro Zellgeneration), die jeweils ein einzelsträngiges Genom enthalten, in das Medium. Da die Viruspartikel im Vergleich zu den Wirtsbakterien sehr klein sind, können die Wirtszellen durch langsame Zentrifugation entfernt werden.

Die Viruspartikel können dann durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation aus der überstehenden Suspension gewonnen werden und ihre einzelsträngigen DNA-Moleküle können durch einzelne Phenol-Chloroform-Extraktionen isoliert werden. Der DNA-Strang des Virus ist immer verpackt und wird als “+” oder Plus-Strang bezeichnet (sein Komplement ist der “-” oder Minus-Strang).

Der verpackte „+“-Strang der Phase hat den gleichen „Sinn“ wie die mRNA, d. h. Nukleotidtripletts des +-DNA-Strangs des M13-Phagen entsprechen den mRNA-Codons, jedoch mit T anstelle von U.

Das Verpacken von Einzelsträngen von Phagen-DNA in Nachkommen-Phagen stellt eine saubere biologische Reinigung von Einzelstrang-DNA bereit. Wichtig ist, dass diese Aussage für ein fremdes Gen, das in das virale Chromosom kloniert wurde, genauso wie für die Phagengene selbst gilt. Diese Eigenschaft der M13-Phase wurde für ihre Verwendung als Vektor ausgenutzt.

Schließlich wird der Phagen M13 nicht als primärer Vektor verwendet, um neue DNA-Ziele zu klonieren, sondern Fragmente werden normalerweise unter Verwendung von Standardplasmidverfahren in M13RF subkloniert, wenn die einzelsträngige Form eines Fragments erforderlich ist.

1. Genetische Organisation des Wildtyp-M13-Bakteriophagen:

Das DNA-Molekül des M13-Phagen ist einzelsträngig und zirkulär. Es ist 6407 Basen lang und hat 10 dicht gepackte Gene. Alle diese Gene sind für die Replikation der Phagen essentiell. Es gibt ein Segment einer 507 Basen langen intergenischen Sequenz (IS), das den Replikationsursprung (OR) enthält.

Die IS enthaltende Region des viralen Genoms wird zum Klonen manipuliert, ohne den Replikationsursprung zu unterbrechen. Daher hat der wilde M13-Phagen eine begrenzte Verwendung in Genklonierungsexperimenten. Die Größe des Phagenpartikels wird durch die Größe der Phagen-DNA bestimmt. Bis zu sechsmal die normale Länge von M13-Phagen-DNA kann verpackt werden.

2. Konstruktion von M13-basierten Vektoren:

In der M13-Phagen-DNA ist die intergene Sequenz die einzige Region, die für die Genklonierung manipuliert werden kann. Da diese Region nur zwei Restriktionsschnittstellen (Asa I und Ava II) aufweist, ist der Wildtyp-Phagen kein effizienter Vektor. Die intergenische Sequenz kann jedoch modifiziert werden, um zusätzliche Restriktionsstellen einzuführen.

Im Folgenden werden einige solcher Vektoren diskutiert:

M13mp1 und M13mp2:

Das Gen lac Z wird in die intergene Wildtyp-Sequenz eingeführt, um die M13 mpl-Phagen zu erhalten. Dieser Schritt erzeugt blaue Plaques auf X-gal-Agarplatten. Das lac Z-Gen besitzt keine Restriktionsstelle. Es hat jedoch eine Hexanukleotidsequenz, GGATTC in der Nähe des Starts. Wenn der zweite G-Rest durch einen A-Rest ersetzt wird, wird diese Sequenz eine Eco R1-Stelle, d. h. GAATTC. Diese Art der Umwandlung erfolgt durch in vitro-Mutagenese.

Jetzt heißt dieser Phage M13 mp2. Das lac Z’-Gen hat jetzt eine leicht veränderte Basensequenz. Aufgrund dieser Änderung weist das β-Galactosidase-Enzym, das durch das lacZ-Gen kodiert wird, die Aminosäure Asparagin anstelle von Asparaginsäure (Aminosäure) an der fünften Position auf. Eine solche Veränderung (aufgrund einer Mutation) beeinflusst die Aktivität des β-Galactosidase-Enzyms nicht. Dies kann mit X-Gal-Agar getestet werden, bei dem die Plaque eine blaue Farbe ergibt.

Das Gen lac Z von E. coli kodiert für das N-terminale a-Peptid des Enzyms (3-Galactosidase, das für die Hydrolyse von Lactose in Galactose und Glucose verantwortlich ist.

Der M13 mp2 ist der einfachste Klonierungsvektor, der vom M13-Phagen abgeleitet ist. In die einzigartige Eco RI-Stelle von M13 mp2 kann jede Fremd-DNA mit Eco RI-Klebeenden eingefügt werden. Diese Insertion inaktiviert das lac Z-Gen und wird als Insertionsinaktivierung bezeichnet. Solche rekombinanten Phagen produzieren auf X-gal-Agar keine blauen Plaques, stattdessen produzieren sie klare Plaques.

Der M13 mp7 ist ein Derivat von MB mp2. Wenn ein Polylinker in die EcoRI-Stelle des lacZ’-Gens eingefügt wird, wird M13 mp7 zu M13 mp7. Der Polylinker ist so konzipiert, dass er das lac Z’-Gen nicht inaktiviert.

Wenn der Vektorphage M13 mit Eco RI, Bam HI, Sal I oder Pst I geschnitten wird, wird der gesamte Polylinker oder ein Teil davon ausgeschnitten und bilden klebrige Enden. Fremd-DNA mit den entsprechenden klebrigen Enden wird inseriert, um rekombinantes M13 mp7 herzustellen. Somit ist M13 mp7 ein komplexerer Vektor mit vier möglichen Insertionsstellen.

Die Insertion von Fremd-DNA neigt dazu, das lac-Z-Gen zu inaktivieren und die Produktion des Galactosidase-Enzyms wird verhindert. Dies wird durch die Bildung klarer Plaques auf X-gal-Agar durch die rekombinante Phagen-DNA gezeigt.

3. M13-Plasmid-Hybridvektoren:

Die Hybridvektoren enthalten Komponenten sowohl von Plasmiden als auch von Phagenchromosomen. Diese Vektoren replizieren in E. coli als normale doppelsträngige Plasmide, bis ein Helferphage bereitgestellt wird. Nach Zugabe des “helper”-Phagen wechseln sie in den Phagen-Replikationsmodus (d. h. Rolling-Circle-Replikation), wie er für Phagen ф×l- beobachtet wird, und verpacken DNA-Einzelstränge in Phagenpartikel.

Der Helferphage ist eine Mutante, die ihre eigene DNA ineffizient repliziert, aber virale Replikationsenzyme und Strukturproteine ​​für die Produktion von Plasmid-DNA-Molekülen bereitstellt, die in Phagenhüllen verpackt sind.

(b) pUC 118 und pUC 119 Klonierungsvektoren:

Die Phagen-Plasmid-“hybrid”-Vektoren pUC118 und pUC119 sind ein Paar von Vektoren, die im Wesentlichen identisch sind, außer dass die Regionen, in die Fremd-DNAs eingefügt werden, in entgegengesetzter Ausrichtung vorliegen (dh von Ende zu Ende relativ zum Rest gedreht) der Gene des Vektors.

Wenn also in beiden Vektoren eine Fremd-DNA in eine spezifische Restriktionsstelle eingefügt wird, verpackt ein Vektor den komplementären Strang des Gens. Daher können beide Stränge des Gens isoliert, sequenziert, einer ortsspezifischen Mutagenese unterzogen werden und so weiter.

Die Vektoren wurden als pUC für Plasmid, University of California (wo die ersten pUC-Vektoren in der Serie von J. Messing und J. Vieira 1987 konstruiert wurden) und 118, 119 bezeichnet, um von früheren Mitgliedern (dh niedrigeren Nummern) der Serie zu unterscheiden .

Die Vektoren pUC 118 und pUC 119 unterscheiden sich von früheren Vektoren in der pUC-Reihe durch die Hinzufügung eines Replikationsursprungs vom Phagen M13. Dadurch können pUC118 und pUC119 entweder (1) als Doppelstandard-Plasmid in Abwesenheit von „Helfer“-Phagen oder (2) als einzelsträngige DNA, die in M13-Phagenhüllen verpackt und in Gegenwart von . aus der Zelle extrudiert wird, replizieren “Helfer”-Phagen (meistens ein M13-Derivat namens K07).

In Abwesenheit von “Helfer”-Phagen wird die Replikation durch den Plasmid-Replikationsursprung kontrolliert. Die pUC-Vektoren wurden von einem frühen Plasmidklonierungsvektor namens pBR322 durch eine Reihe direkter Modifikationen abgeleitet.

Der pUC-Vektor wie PBR322 enthält einen Replikationsursprung, der anfänglich in Plasmid Col E1 vorhanden ist. In Gegenwart von Helfer-Phagen wird die Replikation von pUC118 und pUC119 durch den M13-Phagen-Replikationsursprung gesteuert, der den Plasmiden hinzugefügt wurde.

Einige wichtige Merkmale der Klonierungsvektoren pUC11S und pUC119 sind die folgenden:

1. Sie liegen als kleine, supercoiled, kovalent geschlossene zirkuläre DNA vor. Aufgrund dieser Eigenschaft lassen sie sich leicht in ‘ vitro isolieren und manipulieren.

2. Sie tragen das amp”-Gen als selektierbaren Marker. Somit wachsen nur Bakterien, die ein Plasmid beherbergen, auf Medium, das das Antibiotikum Amplicillin enthält.

3. Sie tragen eine hohe Kopienzahl, bis zu 5000 Kopien pro Bakterium. Somit würde es große Ausbeuten an DNA aus kleinen Zellkulturen geben.

4. Sie tragen eine Polyklonierungsregion, die eine Vielzahl von Restriktionsenzymschnittstellen aufweist. Somit können viele verschiedene Typen von Restriktionsfragmenten ohne Modifikation eingefügt werden.

5. Die Polyklonierungsregion unterbricht die kodierende Region des 5′ Endes des E. coli lac Z-Gens. Somit können Kolonien, die Plasmide mit fremden DNA-Inserts beherbergen, durch einen einfachen Farbtest von denen unterschieden werden, die Plasmide ohne Insertion tragen.

6. Das lac Z-Gen steht unter der Kontrolle des lac-Promotors. Somit können im Leseraster eingefügte Gene (Codons im richtigen Leseraster) exprimiert werden, um β-Galactosidase-Fremdprotein-Fusionsprodukte herzustellen.

7. Sie tragen einen Plasmid-Replikationsursprung. Somit produziert die Replikation der Vektor-DNA eine große Anzahl doppelsträngiger Plasmid-DNAs in Abwesenheit von „Helfer”-Phagen.

8. Sie tragen einen Phagen-M13-Replikationsursprung. So findet die Produktion von einzelsträngiger DNA und die Verpackung dieser DNA in Phagenhüllen in Gegenwart von "Helfer"-Phagen statt.

9. Die Polyklonierungsregionen liegen in pUC118 und pUC119 in entgegengesetzten Orientierungen vor. Wenn pUC118 also einen Strang eines klonierten Gens verpackt, verpackt pUC119 den Komplementstrang.

Verschiedene Mitglieder der pUC-Vektorserie enthalten verschiedene, aber verwandte Sätze von Restriktionsenzymschnittstellen. Die Polyklonierungsregionen von pUC118 und pUC119 enthalten 10 geclusterte Restriktionsenzymschnittstellen. Einige dieser Stellen sind Substrate für zwei oder mehr verschiedene Restriktionsenzyme.

Der Nutzen von pUC wird durch einen einfachen Farbtest stark erhöht, der es ermöglicht, Zellen, die Plasmide mit Fremd-DNA-Inserts beherbergen, von solchen zu unterscheiden, die Plasmid ohne Insertion beherbergen. Grundlage dieses Farbindikatortests ist die funktionelle Inaktivierung des im Vektor vorhandenen 5'-Segments des lac Z-Gens durch die Insertion von Fremd-DNA in die Polyklonierungsregion.

Das Klonfahrzeug pEMBL8:

Das Klonierungsvehikel pEMBL8 wird konstruiert, indem ein 1300 bp-Fragment des Genoms des M13-Phagen in das pUC8-Plasmid transformiert wird. Dieses Stück des M13-Genoms weist die Signalsequenz auf, die von den Enzymen erkannt wird, die die dsM13-DNA in ein ssDNA-Molekül umwandeln. So werden auch die pEMBL 8-Moleküle in einzelsträngige DNA-Moleküle umgewandelt und diese als infektiöse Phagenpartikel freigesetzt.

Bei Verwendung des pEMBL 8-Vektors sollten die E. coli-Zellen auch mit einem intakten M13-Partikel infiziert werden. Dieser fungiert als Helferphage, indem er die notwendigen Enzyme und Phagenhüllproteine ​​bereitstellt. Da pEMBL 8 von pUC8 abgeleitet ist, hat es den Polylinker am notwendigen lac Z’-Gen.

Somit hat dieser Plasmidvektor die folgenden Vorteile von pUC8-Plasmiden und denen der M13-Phagen:

1. Fremd-DNA-Fragmente mit zwei unterschiedlichen klebrigen Enden können an der multiplen Klonierungsstelle des lac Z’-Gens eingefügt werden.

2. Das rekombinante pEMBL 8-Genom kann in das Kapsid des M13-Phagen verpackt werden.

3. Die Phagenpartikel, die das rekombinante pEMBL 8-Genom enthalten, sind hinsichtlich ihrer Fähigkeit, E. coli-Zellen zu infizieren und dann das Fremdgen zu exprimieren, genauso effizient wie die Wildtyp-M13-Phagen.

4. Das rekombinante pEMBL 8-Genom kann leicht unter Verwendung des X-gal enthaltenden Mediums gescreent werden.


Schwanengesang für Antibiotika? Können Phagentherapie und Gen-Editierung die Lücke schließen?

Es ist Zeit, sich der Musik zu stellen: Das goldene Zeitalter der Antibiotika ist vorbei.

Die Menschen befinden sich in einem endlosen Krieg gegen Bakterien – sie können uns sogar töten – und seit Jahrzehnten sind Antibiotika unsere einzige wirkliche Waffe gegen sie. Sie haben im 20. Jahrhundert die Medizin revolutioniert und zusammen mit Impfungen zur nahezu Ausrottung vieler Krankheiten in den Industrieländern geführt.

Aber trotz ihres erstaunlichen Erfolgs und sie hatten einen wundersamen Lauf, arzneimittelresistente Superbugs wie MRSA, CRE und VRE gewinnen langsam. Jedes Jahr sterben mehr und mehr Menschen an arzneimittelresistenten Infektionen, je näher wir uns den Tagen vor Penicillin nähern. Ihre Wirksamkeit und leichte Zugänglichkeit führten insbesondere in der Nutztierhaltung zu einer Übernutzung und führten dazu, dass Bakterien Resistenzen entwickelten. Dies führte letztes Jahr dazu, dass die Weltgesundheitsorganisation antimikrobielle Resistenzen als “ernste Bedrohung einstufte, [die] keine Vorhersage für die Zukunft mehr ist, sondern gerade jetzt in jeder Region der Welt passiert und das Potenzial hat, jeden zu treffen, von jedes Alter, in jedem Land”

An dieser Umkehrung gibt es viele Schuldzuweisungen: Ärzte, die Antibiotika gegen Erkältungen verschreiben, Patienten, die Medikamente gegen die Grippe fordern, Regierungen, die die Entwicklung neuer Antibiotika deanreizen, und Pharmaunternehmen, die für unrentabel halten.

Unabhängig davon, wer dafür verantwortlich gemacht werden könnte, diese aktuelle Situation musste eintreten, unser zufälliges Verhalten beschleunigte einfach die Ankunft dieses Tages. Immer wenn das Ziel darin besteht, einen lebenden Organismus abzutöten, ist Resistenz unvermeidlich. So funktioniert die Natur: natürliche Selektion. In diesem Fall tötet ein Antibiotikum alle anfälligen Bakterien ab, aber einige wenige, die aufgrund zufälliger Mutationen gegen das Medikament resistent sind, überleben und gedeihen schließlich. Kurz davor, ein Problem zu beseitigen, rauscht es noch schlimmer zurück, als es angefangen hat.

So reagiert das ganze Leben auf Stressoren. Wir passen uns an. Es zeigt sich auch in der Pflanzenwelt. Schauen Sie sich die Firestorm-Debatte über herbizidresistente Unkräuter in der Landwirtschaft an. Unabhängig davon, ob ein Landwirt biologisch zugelassene Herbizide, konventionell gezüchtete (z. Es ist das Gesetz der Natur. Ja, wir können Herbizide ändern oder neue herstellen, aber der Prozess beginnt dann von vorne. Das gilt auch für Antibiotika. Selbst wenn wir also eine neue Klasse von Antibiotika entwickeln, werden irgendwann Resistenzen folgen, egal wie verantwortungsvoll wir damit umgehen.

Vor diesem Hintergrund ist es klar, dass Begriffe wie „Superbugs“ und „Superweeds“ irreführend sind, da diese Organismen in keiner Weise besonders sind, sie tun einfach genau das, was die Natur von ihnen beabsichtigt.

Die Herausforderung für Antibiotika besteht darin, dass Bakterien in der Lage zu sein scheinen, schneller Resistenzen zu entwickeln als jeder andere Organismus. Die Konjugation (bakterielles Geschlecht) ermöglicht es Bakterien, Resistenzgene nicht nur mit Mitgliedern ihrer Spezies, sondern über Spezies und sogar über Bakterienarten hinweg (d. h. grampositiv bis gramnegativ) zu teilen. Dies wird als horizontaler Gentransfer bezeichnet und ermöglicht es, vorteilhafte Merkmale unter den Mitgliedern der aktuellen Generation statt in zukünftigen Generationen zu verbreiten. Darüber hinaus deuten einige Beweise darauf hin, dass Bakterien auch spüren können, wenn ihr Rücken an der Wand ist, und ihr Genom schneller mutieren, um einen ihrer Nachkommen in einem letzten verzweifelten Versuch, genug zu mutieren, um eine Resistenz gegen das Antibiotikum zu entwickeln.

Aber abgesehen von Darwin liegt es in unserem Interesse, über das Zeitalter der Antibiotika hinauszugehen. Die Verwendung von Antibiotika zur Behandlung einer Infektion ist wie die Verwendung eines Vorschlaghammers, um einen Nagel einzuschlagen. Sicher, der Nagel wird eingeschlagen, aber es wird auch ein großes Loch in deiner Wand geben. Selbst das engste Antibiotika-Spektrum beeinflusst unsere normale Flora auf eine Weise, die weitreichende Folgen für unsere Physiologie haben kann.

Phagentherapie

Was wir in unserem Kampf gegen Mikroben brauchen, sind biozide Wirkstoffe, die wirksam sind, aber auch mehr Speziesspezifität aufweisen. Eine in Arbeit befindliche Strategie besteht darin, sich an den natürlichen Feind der Bakterien, das Virus, zu wenden. Mit anderen Worten der Feind meines Feindes ist mein Freund.

Viren infizieren nicht nur den Menschen, tatsächlich hat jede Spezies auf dem Planeten zahlreiche Virusarten, die sie infizieren können. Wenn ein Virus ein Bakterium infiziert, haben Wissenschaftler einen speziellen Namen dafür: Bakteriophage oder einfach nur Phagen. In Bakterien, wie auch beim Menschen, funktionieren Viren, indem sie sich Zugang zum Inneren einer Zelle verschaffen und die Zellmaschinerie des Wirts (d. h. Enzyme, Ribosomen usw.) manipulieren, um mehr Kopien des Virus herzustellen. An einem bestimmten Punkt führt die Anzahl der Kopien eines Virus dazu, dass die Zelle platzt und manchmal Tausende neuer Kopien des Virus freisetzt, die dann eine andere Zelle infizieren können und der Vorgang wiederholt sich.

Diesen Prozess zu korrumpieren, um den menschlichen Bedürfnissen im Kampf gegen Antibiotika gerecht zu werden, ist tatsächlich seit den frühen Tagen des Kalten Krieges im Gange. Während die USA in Antibiotika investierten, entwickelten die Sowjets die sogenannte Phagentherapie. Tatsächlich wird die Phagentherapie in Ländern wie Georgien, Russland und Polen heute noch häufig zur Behandlung von Infektionen eingesetzt.

Einer der Hauptvorteile der Phagentherapie gegenüber herkömmlichen Antibiotika ist die Spezifität eines Phagen für seinen Wirt. Größtenteils ein Phagen, der einen E coli wird keinen anderen Bakterientyp wie einen Kommensale infizieren können Staphylokokken. Es gibt sogar Hinweise darauf, dass Phagen stammspezifisch sind, was bedeutet, dass wir Phagen entwickeln können, die pathogene Stämme von unterschiedlich infizieren können E coli (d.h. E coli O157:H7) beim Verlassen des gesunden Kommensalen E coli Belastungen allein.

Ein weiterer Vorteil der Phagentherapie ist, dass sie sich selbst wieder auffüllt. Ein einzelner Phagen, der eine Zelle infiziert, produziert Tausende neuer Kopien seiner selbst, die weitere Bakterien abtöten können. Es gibt jedoch einige Hinweise auf den Mechanismus, bei dem Viren Zellen durch Aufplatzen abtöten, was einen Nachteil der Behandlung darstellt, da sie bakterielle Toxine freisetzen, die zu Sepsis führen können, einem potenziell tödlichen Zustand, bei dem das Immunsystem auf absterbende Bakterien überreagiert.

Doch Forscher arbeiten bereits an einer Lösung für dieses Problem. Am MIT haben sie „Phagemide“ entwickelt: manipulierte Phagen, die statt eines ganzen Genoms Plasmide tragen. Plasmide sind kurze zirkuläre DNA-Stücke, die einige Gene tragen, die oft für Virulenzfaktoren und/oder Antibiotikaresistenzfaktoren kodieren. Wenn Bakterien einer Konjugation unterzogen werden, teilen sie sich dies im Allgemeinen, um Resistenzgene weiterzugeben. In einem Phagemid ist das Plasmid mit Genen kodiert, die die Bakterien abtöten, ohne dass die Zelle lysiert wird. Keine Lyse bedeutet, dass diese internen Giftstoffe nicht in den Körper abgegeben werden. Diese Wissenschaftler haben bereits großen Erfolg bei der Behandlung von Peritonitis bei Mäusen.

Die Genbearbeitung mit CRISPR-Cas9 (clustered repeating interspaced short palindromic repeats) könnte zur Bekämpfung von Bakterien eingesetzt werden. Wenn Bakterien eine Infektion durch einen Phagen erfolgreich abwehren, speichern sie einen kurzen Teil des Virus-Genoms im Genom. Die Bakterien exprimieren diese Sequenzen als kurze RNA-Sequenzen, die zu Teilen des Genoms des Phagen komplementär sind. Wenn die Bakterien mit demselben Phagen erneut infiziert werden, bindet die RNA-Sequenz komplementär zu diesem Teil des Phagengenoms. Innerhalb der Zelle sind diese RNA-Sequenzen mit einem DNA-Schneidprotein namens Cas9 verbunden, das das Phagengenom spaltet und es unwirksam macht.

Der Trick bei CRISPR-Cas9 besteht darin, dass die RNA-Sequenz komplementär zu allem gemacht werden kann, einschließlich bakterieller Resistenzgene. Zum Beispiel hat eine Gruppe der Universität Tel Aviv ein CRISPR-Cas9-System entwickelt, das auf das Beta-Lactamase-Gen abzielt. Dieses Gen produziert ein Enzym, das eine Vielzahl von Antibiotika inaktiviert, darunter Penicilline, Cephamycine und Carbapeneme. Andere Gruppen haben ausgezeichnete Erfolge bei der Ausrichtung auf die Gene erzielt, die sich verwandeln Staphylococcus aureus in MRSA.

Die CRISPR-Sequenz und das Cas9-Protein werden über einen manipulierten Phagen an Bakterien abgegeben, und die Technik ist erfolgreich, um sowohl auf chromosomale Gene als auch auf Plasmide abzuzielen. Derzeit ist ein Großteil der Forschung zu dieser Technik darauf ausgerichtet, Bakterien für gängige Antibiotika zu sensibilisieren, aber es ist nicht ausgeschlossen, dass CRISPR-Cas9 so konstruiert werden könnte, dass es auf essentielle bakterielle Gene abzielt, wodurch die Technik bakterizid wird.

Der Einsatz von Phagen, Phagemiden und CRISPR-Cas9 stellt für uns einen ausgeklügelteren und gezielteren Weg dar, Infektionen durch Bakterien zu behandeln. Dies sollte jedoch in keiner Weise als Wunderwaffe betrachtet werden, die uns mit Antibiotika in Schwierigkeiten gebracht hat. Widerstand gegen diese Techniken wird auftreten. Es ist unvermeidlich, dass sich diese Organismen anpassen.

Bei einigen Arten wurde bereits eine Resistenz gegen CRISPR-Cas9 in Phagen dokumentiert, daher ist es möglich, dass auch Bakterien eine Resistenz gegen CRISPR-Cas9 entwickeln. Bakterien werden auch CRISPR-Cas9-Systeme entwickeln, um ein Gedächtnis der manipulierten Phagen zu schaffen, die wir in der Phagentherapie verwenden werden. Dies sind jedoch keine Gründe, diese Technologie aufzugeben. Diese sollten als Blaupause dafür dienen, worauf wir vorbereitet sein sollten, wenn der Tag kommt, an dem Resistenzen gegen unsere anfänglichen Phagentherapieoptionen beobachtet werden. Im Wesentlichen haben wir jetzt die Schlachtpläne des Feindes dafür, wie er auf unsere neueste Verteidigung reagieren wird. Wir müssen diese Informationen verwenden, damit unsere Gegenangriffe in den Startlöchern warten.


Wirtsspezifität der von . produzierten DNA Escherichia coli : I. Wirtskontrollierte Modifikation des Bakteriophagen λ*

Lambda-Bakteriophagen-Partikel tragen eine „Wirtsspezifität“, die durch die Bakterienstämme bestimmt wird, auf denen sie produziert wurden. Bei Infektion eines anderen bakteriellen Wirts (1) kann die Phagen-DNA auf der Grundlage dieser Spezifität entweder akzeptiert oder abgelehnt werden, (2) wenn sie akzeptiert wird, vermehrt sich der Phagen und es werden Phagen-Nachkommen produziert. Jene Nachkommen, auf die das DNA-Molekül des parentalen Phagen übertragen wird, entweder in konservierter oder halbkonservierter Form, erhalten auch die Spezifität des parentalen Phagen-Wirts. Alle Nachkommen, die nur neu synthetisierte DNA enthalten, erhalten nur die Spezifität des neuen bakteriellen Wirts. Daraus wird geschlossen, dass die Wirtsspezifität von der Bakteriophagen-DNA getragen wird.

Der Phage P1, der in einer Bakterienzelle entweder als Prophagen oder vegetativer Phagen vorliegt, verleiht λ DNA, die sich in derselben Zelle vermehrt, eine Wirtsspezifität, die über die vom Wirt selbst bestimmte hinausgeht. Eine solche P1-induzierte Spezifität kann replizierenden und nicht-replizierenden . gleich gut aufgeprägt werden λ DNA.

Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds für wissenschaftliche Forschung unterstützt.


Schwanengesang für Antibiotika? Können Phagentherapie und Gen-Editierung die Lücke schließen?

Es ist Zeit, sich der Musik zu stellen: Das goldene Zeitalter der Antibiotika ist vorbei.

Die Menschen befinden sich in einem endlosen Krieg gegen Bakterien – sie können uns sogar töten – und seit Jahrzehnten sind Antibiotika unsere einzige wirkliche Waffe gegen sie. Sie haben im 20. Jahrhundert die Medizin revolutioniert und zusammen mit Impfungen zur nahezu Ausrottung vieler Krankheiten in den Industrieländern geführt.

Aber trotz ihres erstaunlichen Erfolgs und sie hatten einen wundersamen Lauf, arzneimittelresistente Superbugs wie MRSA, CRE und VRE gewinnen langsam. Jedes Jahr sterben mehr und mehr Menschen an arzneimittelresistenten Infektionen, je näher wir uns den Tagen vor Penicillin nähern. Ihre Wirksamkeit und leichte Zugänglichkeit führten insbesondere in der Nutztierhaltung zu einer Übernutzung und führten dazu, dass Bakterien Resistenzen entwickelten. Dies führte letztes Jahr dazu, dass die Weltgesundheitsorganisation antimikrobielle Resistenzen als “ernste Bedrohung einstufte, [die] keine Vorhersage für die Zukunft mehr ist, sondern gerade jetzt in jeder Region der Welt passiert und das Potenzial hat, jeden zu treffen, von jedes Alter, in jedem Land”

An dieser Umkehrung gibt es viele Schuldzuweisungen: Ärzte, die Antibiotika gegen Erkältungen verschreiben, Patienten, die Medikamente gegen die Grippe fordern, Regierungen, die die Entwicklung neuer Antibiotika deanreizen, und Pharmaunternehmen, die für unrentabel halten.

Unabhängig davon, wer dafür verantwortlich gemacht werden könnte, diese aktuelle Situation musste eintreten, unser zufälliges Verhalten beschleunigte einfach die Ankunft dieses Tages. Immer wenn das Ziel darin besteht, einen lebenden Organismus abzutöten, ist Resistenz unvermeidlich. So funktioniert die Natur: natürliche Selektion. In this case an antibiotic kills off all susceptible bacteria, but a hardy few resistant to the drug because of random mutations survive, and eventually thrive. On the verge of wiping out a problem, it roars back even worse than how it started.

This is how all life responds to stressors. We adapt. It shows up in the plant world as well. Look at the firestorm debate over herbicide resistant weeds in agriculture. Whether a farmer uses organic approved herbicides, conventionally bred ones (such as conventionally bred sunflower crops) or crops genetically engineered to resist glyphosate, mutant weeds survive and adapt and supersedes develop. It’s the law of nature. Yes, we can change up herbicides or create new ones, but the process then begins again. That’s true about antibiotics as well. So even if we create a new class of antibiotics, resistance will eventually follow, no matter how responsible we are with using it.

In this light, it’s clear that terms like “superbugs” and “superweeds” are misnomers because these organisms aren’t special in any way, they are simply doing exactly what nature intends them to do.

What compounds the challenge for antibiotics is that bacteria appear to be able to evolve resistance faster than any other type of organism. Conjugation (bacterial sex) allows bacteria to share resistance genes with not only members of their species, but across species and even across bacterial type (i.e. gram positive to gram negative). This is called horizontal gene transfer and allows advantageous traits to be spread among members of the current generation, instead of in future generations. Furthermore, some evidence suggests that bacteria can also sense when their back is against the wall and mutate their genome at faster rates in a last ditch effort for one of their descendants to mutate enough to develop resistance to the antibiotic.

But Darwin aside, it’s in our best interest to move beyond the era of antibiotics. Using antibiotics to treat an infection is like using a sledge hammer to pound in a nail. Sure the nail will get pounded in but there’s also going to be a large hole in your wall. Even the most narrow spectrum of antibiotics drastically affect our normal flora in ways that can have far reaching consequences on our physiology.

Phage therapy

What we need in our war against microbes are biocidal agents that are effective but also have more species specificity. One strategy in the works involves turning to the natural enemy of the bacteria, the virus for help. Mit anderen Worten the enemy of my enemy is my friend.

Viruses don’t just infect humans, in fact every species on the planet has numerous species of virus that can infect them. When a virus infects a bacteria, scientists have a special name for them: bacteriophage, or just phage. In bacteria, as they do in humans, viruses work by gaining access to the interior of a cell and manipulating the host’s cell machinery (i.e. enzymes, ribosomes etc) into making more copies of the virus. At a certain point, the number of copies of a virus induces the cell to burst releasing sometimes thousands of new copies of the virus, which can then go on to infect another cell and the process repeats.

Corrupting this process to fit human needs in the fight against antibiotics has actually been going on since the early days of the cold war. While the U.S. was investing in antibiotics, the Soviets were developing what is now called phage therapy. In fact in places like the country of Georgia, Russia and Poland phage therapy is still widely used today to treat infections.

One of the major benefits of phage therapy over traditional antibiotics is the specificity a phage has for its host. For the most part, a phage that infects an E coli will not be able to infect another bacteria type, like a commensal Staphylokokken. There is even some evidence that phages are strain specific meaning we can develop phages that can differentially infect pathogenic strains of E coli (d.h. E coli O157:H7) while leaving the healthy commensal E coli strains alone.

Another advantage of phage therapy is that it is self-repleting. A single phage infecting a cell will produce thousands of new copies of itself that can go on to kill more bacteria. However, some point to the mechanism in which viruses kill cell, by bursting it open, presents a drawback to the treatment as it will release bacterial toxins which can lead to sepsis, a potentially deadly condition in which the immune system overreacts to dieing bacteria.

But researchers are already working up a solution to this problem. At MIT, they have developed “phagemids”: engineered phages that carry plasmids instead of a whole genome. Plasmids are short piece of circular DNA that carry a couple of genes which often code for virulence factors and/or for antibiotic resistance factors. When bacteria undergo conjugation this is generally what they share to pass around resistance genes. In a phagemid, the plasmid is encoded with genes that kill the bacteria without the cell being lysed. No lysis means those internal toxins aren’t released into the body. These scientists have already had a high degree of success treating mice for peritonitis.

Gene editing using CRISPR-Cas9 (clustered repeating interspaced short palindromic repeats) could be used to fighting bacteria. If bacteria successfully fights off infection from a phage, they save a short portion of the viruses genome in the genome. The bacteria expresses these sequences as short RNA sequences that are complementary to parts of the phage’s genome. If the bacteria becomes reinfected with the same phage, the RNA sequence binds complementary to that portion of the phages genome. Inside the cell, these RNA sequences are associated with a DNA cutting protein called Cas9, which cleave the phage genome, rendering it ineffective.

The trick with CRISPR-Cas9 is that RNA sequence can be made to be complementary to anything including bacterial resistance genes. For example, a group at Tel Aviv University has created a CRISPR-Cas9 system to target the Beta lactamase gene. This gene produces an enzyme that inactivates a wide variety of antibiotics including penicillins, cephamycins, and carbapenems. Other groups have seen excellent success targeting the genes that turn Staphylococcus aureus into MRSA.

The CRISPR sequence and the Cas9 protein will be delivered to bacteria via an engineered phage and the technique is successful at targeting both chromosomal genes and plasmid based ones. Currently, much of the research on this technique has been to re-sensitize bacteria to common antibiotics, but it is not out of the realm of possibility that CRISPR-Cas9 could be engineered to target essential bacterial genes, thus making the technique bactericidal.

The use of phages, phagemids and CRISPR-Cas9 present to us a more sophisticated and targeted way to treat infections from bacteria. However, in no way should this be thought of as a magic bullet that’s the kind of thinking that got us into trouble with antibiotics. Resistance to these techniques will happen. It is inevitable that these organisms will adapt.

Resistance to CRISPR-Cas9 in phages has already been documented in some species, so it is possible bacteria could evolve resistance to them too. Bacteria will also develop CRISPR-Cas9 systems to create a memory of the engineered phages we will use in phage therapy. But these are not reasons to abandon this technology. These should serve as a blueprint for what we should be prepared for when the day comes that resistance to our initial phage therapy options is observed. In essence, we now have the enemy’s battle plans for how they will react to our newest defense. We need to use that information to have our counter attacks waiting in the wings.


What is BAC in biology?

A bacterial artificial chromosome (BAC) is an engineered DNA molecule used to clone DNA sequences in bacterial cells (for example, E. coli). BACs are often used in connection with DNA sequencing. Segments of an organism's DNA, ranging from 100,000 to about 300,000 base pairs, can be inserted into BACs.

Likewise, how do you get bac? Making a BAC library To machen a genomic Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library you first verfügen über to isolate the cells containing the DNA you want to store. For animal and human BAC libraries the DNA normally comes from white blood cells. These isolated cells are then mixed with hot agarose, a jelly-like substance.

YAC stands for yeast artificial chromosome and BAC stands for bacterial artificial chromosomes. These are the vectors which are basically tools to insert the gene of interest in the host cell. The major difference between these two vectors is that of the insert size of the gene of interest.

Yeast artificial chromosomes (YACs) are genetically engineered chromosomes derived from the DNA of the yeast, Saccharomyces cerevisiae, which is then ligated into a bacterial plasmid. The primary components of a YAC are the ARS, centromere, and telomeres from S. cerevisiae.


Notiz: It will be a very helpful if you have access to a lab with pipets, petri dishes, cotton swabs, and other common supplies. Talk to your teachers at school to obtain access.

  • Coliphage culture and titer determination study kit available from Ward's Science Anmerkungen: 1) This kit has enough supplies to go through the procedure einer Zeit. Purchase additional materials for repeat trials, which will help ensure your results are accurate and repeatable. This is an advanced procedure, so the details of how to repeat the procedure are not supplied. 2) This kit contains the strain E coli B which is nicht a human pathogen and is safe to use in a classroom laboratory. Standard bacterial safety, detailed below, should still be followed.
    • Culture of E coli B
    • Culture of T4r phage
    • Tryptic soy agar (125 mL)
    • 2-mL tubes of soft agar (6)
    • 9-mL dilution tubes (12)
    • 1- x 0.01-mL sterile pipets (12)
    • Sterile petri dishes (6)
    • Sterile swab
    • Pipet bulb
    • Tryptic soy agar
    • Soft soy agar
    • Tryptic soy broth
    • Petrischalen

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    'Deadman' and 'Passcode' microbial kill switches for bacterial containment

    Biocontainment systems that couple environmental sensing with circuit-based control of cell viability could be used to prevent escape of genetically modified microbes into the environment. Here we present two engineered safeguard systems known as the 'Deadman' and 'Passcode' kill switches. The Deadman kill switch uses unbalanced reciprocal transcriptional repression to couple a specific input signal with cell survival. The Passcode kill switch uses a similar two-layered transcription design and incorporates hybrid LacI-GalR family transcription factors to provide diverse and complex environmental inputs to control circuit function. These synthetic gene circuits efficiently kill Escherichia coli and can be readily reprogrammed to change their environmental inputs, regulatory architecture and killing mechanism.


    Influenza and Coronavirus Demise Could Lie with Phage Nanoparticles

    Given the current global viral pandemic, it wouldn’t be difficult for most to think of viruses in only a negative context. However, over the past several years, a slew of researchers and data has come to light on the benefits of using phage viruses as therapeutic options. Now, a team of investigators led by scientists at the Leibniz-Forschungsinstitut for Molecular Pharmacology (FMP) and Humboldt University (HU) has found a new use for phage in the fight against seasonal influenza and avian flu. The researchers developed a chemically modified phage capsid that “stifles” influenza viruses. Perfectly fitting binding sites cause influenza viruses to be enveloped by the phage capsids in such a way that it is practically impossible for them to infect lung cells any longer. This phenomenon has been proven in preclinical trials using human lung tissue and is being used for the immediate investigation of coronavirus infections.

    Findings from the new study were published recently in Nature Nanotechnology through an article entitled “Phage capsid nanoparticles with defined ligand arrangement block influenza virus entry.”

    Current antiviral drugs are only partially effective because they attack viruses like influenza and coronavirus after lung cells have been infected. It would be desirable—and much more effective—to prevent infection in the first place. This is exactly what the new approach from the current study promises. The phage capsid, developed by a multidisciplinary team of researchers, envelops flu viruses so perfectly that they can no longer infect cells.

    “Preclinical trials show that we are able to render harmless both seasonal influenza viruses and avian flu viruses with our chemically modified phage shell,” explained senior study investigator Christian Hackenberger PhD, head of the department chemical biology at FMP and a professor for chemical biology at HU. “It is a major success that offers entirely new perspectives for the development of innovative antiviral drugs.”

    The new inhibitor makes use of a feature that all influenza viruses have: There are trivalent receptors on the surface of the virus, referred to as hemagglutinin protein, that attaches to sugar molecules (sialic acids) on the cell surface of lung tissue. In the case of infection, viruses hook into their victim—in this case, lung cells—like a hook-and-loop fastener. The core principle is that these interactions occur due to multiple bonds, rather than single bonds.

    It was the surface structure of flu viruses that inspired the researchers to ask the following initial question more than six years ago: Would it not be possible to develop an inhibitor that binds to trivalent receptors with a perfect fit, simulating the surface of lung tissue cells? The answer to the question lies with Q-beta phage, which has the ideal surface properties and is excellently suited to equip it with ligands—sugar molecules—as “bait.” An empty phage shell does the job perfectly.

    “We present a multivalent binder that is based on a spatially defined arrangement of ligands for the viral spike protein haemagglutinin of the influenza A virus,” the authors wrote. “Complementary experimental and theoretical approaches demonstrate that bacteriophage capsids, which carry host cell haemagglutinin ligands in an arrangement matching the geometry of binding sites of the spike protein, can bind to viruses in a defined multivalent mode. These capsids cover the entire virus envelope, thus preventing its binding to the host cell as visualized by cryo-electron tomography. As a consequence, virus infection can be inhibited in vitro, ex vivo, und in vivo.”

    Lead study investigator Daniel Lauster, PhD, a former graduate student in the Group of Molecular Biophysics (HU) and now a postdoc at Freie Universität Berlin added that “Our multivalent scaffold molecule is not infectious, and comprises 180 identical proteins that are spaced out exactly as the trivalent receptors of the hemagglutinin on the surface of the virus. It, therefore, has the ideal starting conditions to deceive the influenza virus—or, to be more precise, to attach to it with a perfect spatial fit. In other words, we use a phage virus to disable the influenza virus!”

    To enable the Q-beta scaffold to fulfill the desired function, it must first be chemically modified. Produced from E coli bacteria, the researchers used synthetic chemistry to attach sugar molecules to the defined positions of the virus shell.

    Several studies using animal models and cell cultures have proven that the suitably modified spherical structure possesses considerable bond strength and inhibiting potential. The study also enabled the research team to examine the antiviral potential of phage capsids against many current influenza virus strains, and even against avian flu viruses. Its therapeutic potential has even been proven on human lung tissue: when tissue infected with flu viruses was treated with the phage capsid, the influenza viruses were practically no longer able to reproduce.

    Additionally, high-resolution cryo-electron microscopy and cryo-electron microscopy show directly and, above all, spatially, that the inhibitor completely encapsulates the virus. Moreover, mathematical-physical models were used to simulate the interaction between influenza viruses and the phage capsid on the computer.

    “Our computer-assisted calculations show that the rationally designed inhibitor does indeed attach to the hemagglutinin, and completely envelops the influenza virus,” confirmed study co-author Susanne Liese, PhD, professor at Freie Universität Berlin. “It was therefore also possible to describe and explain the high bond strength mathematically.”

    These findings must now be followed up by more preclinical studies. It is not yet known, for example, whether the phage capsid provokes an immune response in mammals. Ideally, this response could even enhance the effect of the inhibitor. However, it could also be the case that an immune response reduces the efficacy of phage capsids in the case of repeated-dose exposure, or that flu viruses develop resistances. And, of course, it has yet to be proven that the inhibitor is also effective in human

    “Our rationally developed, three-dimensional, multivalent inhibitor points to a new direction in the development of structurally adaptable influenza virus binders. This is the first achievement of its kind in multivalency research,” Hackenberger concluded.


    What chemicals will kill P1 Phage but not E. coli? - Biologie

    A major thrust of vector development has been to create vectors that will handle larger foreign DNA inserts, aiming to reduce the number of recombinants it is necessary to look at in order to identify a specific DNA sequence.

    Cosmid vectors were among the first large insert cloning vehicles developed.

    The vector replicates as a plasmid
    (it contains a ColE1 origin of replication),
    uses Amp r for positive selection and
    employs lambda phage packaging to select for recombinant plasmids carrying foreign DNA inserts 45 KB in size.

    Ligation of cosmid vector and foreign DNA fragments (SauIIIA partial digest fragments 45 kb in size) is similar to ligation into a lambda substitution vector.
    The desired ligation product is a concatemer of
    45 kb foreign DNA fragment and 5 kb cosmid vector sequences.

    This concatemer is then packaged into viral particles (remember packaging is cos site to cos site) and these are used to infect E. coli where the cosmid vector replicates using the ColE1 orignin of replication. Phage packaging serves only to select for recombinant molecules and to transfer these long DNA molecues (50 kb total) into the bacterial host (50 kb fragments transform very inefficiently while phage infection is very efficient).

    Recently, the need for prokaryotic vectors capable of replicating very large foreign DNA fragments
    (> 1 MB in size) has produced a couple of additional prokaryotic vector systems.
    One is based on another bacteriophage called P1.
    P1 phage can carry in excess of 100 KB of foreign DNA but do not seem to have found wide acceptance.

    A few years ago, a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) vector was developed allowing foreign DNA fragements over 1 MB to be propagated in E. coli.
    These BAC vectors replicate as low copy number plasmids (to minimize the demands on the host replication system) but how do we get such large DNA fragments into E. coli?

    Standard methods for transforming E coli rely on the chemical preparation of the E coli to put them in a 'transformation competent' state.
    This typically involves incubating the bacteria in the presence of divalent cations (particularly Ca +2 ) at low temperature (4 o C) which puts the cell membrane into a 'semi-crystaline state. Addition of DNA to these 'competent cells' allow the DNA to bind to the semi-crystaline membrane. Heat shocking the cells (42 o C) remobilizes the membrane and allows the DNA to cross the membrane. This transit across the membrane is sensitive to DNA length - small plasmids cross the membrane rapidly while larger molecules are unable to cross.

    Getting very large molecules across the cell membrane relies on an alternative mechanism called electroporation. This involves mixing DNA with E coli cells and then exposing the mixture to a high-voltage pulse. The high voltage induces massive membrane rearrangements and the coincident uptake of DNA which is independant of size. BACs have been an important tool for the human genome sequencing project.

    Numerous vector systems have been developed for use in eukaryotic systems.
    The most common of these are often called 'shuttle vectors' as they replicate in both prokaryotic and eukaryotic hosts. In general, DNA manipulations and characterizations are done in prokaryotic systems, and then the manipulated DNA is reintroduced to eukaryotic systems for functional analysis.

    Yeast Vectors
    Shuttle vectors were first developed for transfering DNA fragments between E coli and S cerevisiae. These vectors contain an antibiotic resistance gene for positive selection in E coli, and E coli origin of replication (ColE1 ori), and a polylinker in the lacZ alpha-complementing fragment for insertional inactivation by the foreign DNA insert. In addition, the vector contains a yeast specific origin of replication (derived from the naturally occuring yeast plasmid called the 2 um circle - 2um ori)
    and amino-acid or N-base biosynthsis enzymes for positive selection in yeast (HIS, LEU and ADE genes)

    Mammalian Vectors
    Shuttle vectors have also been developed for use in mammalian tissue culture.
    Like the yeast shuttle vectors, mammalian shuttle vectors require sequeces enabling them to replicate in mammalian tissue culture. These eukaryotic origins of replication are typically derived from well characterized mammalian viruses - most commonly SV-40 (SV-40 ori and Large T antigen system) or Epstein-Barr virus (mononucleosis). Both systems allow the vector to replicate within the host cell as a plasmid without integrating into the genome. In addition to the origin of replication, these shuttle vectors also carry antibiotic resistance genes which function in eukaryotic cells (ie neomycin (G418) resistance, hygromycin resistance, methotrexate resistance etc).

    Finally, artificial chromosome vectors have been developed for use in yeast (YACs) and are being developed for use in mammalian cells (MACs).
    These eukaryotic vectors contain telomeric sequences (eukaryotic chromsomes are linear not circular molecules) and centromeres to ensure appropriate segregation of the artificial chromosomes as well as selectable markers. Such vector systems may gain in importance as we move towards manipulating the eukaryotic genome.


    Schau das Video: M13 PHAGE VECTORS English u0026 Malayalam (August 2022).