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Methoden zur mikrobiellen Identifizierung im Boden

Methoden zur mikrobiellen Identifizierung im Boden



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Ich versuche, eine Untersuchung des Lebens in einer Bodenprobe durchzuführen. Ich möchte wissen, welche Arten von Bakterien, Pilzen und anderen Organismen darin enthalten sind. Ich habe gehört, dass die ITS-Sequenzierung und die 16S-rRNA-Sequenzierung beide Möglichkeiten sind, dies zu tun, aber ich weiß nicht genug über diese Techniken, um zu verstehen, welche (wenn überhaupt) ich verwenden sollte oder wie Sie die resultierende Sequenzdatei interpretieren, die von geliefert wird das Labor. Werden diese Techniken tun, was ich will? Wie wähle ich das eine aus? Und wie interpretiere ich die Ergebnisse?


16S- und ITS-Techniken versuchen, Organismen in Ihren Proben zu identifizieren, indem sie kurze „Barcode“-Sequenzen aus der DNA jedes Organismus amplifizieren und diese kurzen Sequenzen verwenden, um zu versuchen, den Organismus zu identifizieren, von dem sie stammen.

16S kann nützlich sein, um Prokaryoten (Bakterien) zumindest auf Gattungsebene zu unterscheiden. Es wird jedoch nicht immer genügend Informationen liefern, um die genaue Art zu bestimmen. ITS kann besonders nützlich sein, um zwischen einigen Eukaryoten (Pflanzen, Pilze usw.) zu unterscheiden, sogar bis auf Artenebene. Wenn Sie sich sowohl für Bakterien als auch für Pilze interessieren, müssen Sie beide Analysen an Ihren Proben durchführen.

Ein anderer Ansatz ist die Schrotflinten-Metagenomik, bei der Sie, anstatt nur die 16S- oder ITS-Region zu amplifizieren, jede mögliche DNA aus der Probe extrahieren und sequenzieren und dann versuchen, jede gelesene Sequenz einer Spezies/Gattung durch Abgleich mit einer Referenz zuzuordnen Sammlung (zB MEGAN-Pipeline) oder durch kmer-Analyse (zB Kraken).

Es gibt einige verpackte Ansätze für den Umgang mit 16S. Qiime2 ist beliebt und erfordert wahrscheinlich einiges an Arbeit in Python, um es zum Laufen zu bringen. Es gibt ein R-Paket-Mikrobiom, aber ich habe keine Erfahrung damit. Mothur ist ein langjähriges eigenständiges Paket, das relativ einfach zu bedienen ist, und MG-RAST ist eine webbasierte Version, die auch relativ einfach ist.

Die ITS-Analyse ist als Pipeline weniger ausgereift, aber ich bin sicher, dass Sie einige in der Literatur finden können, wenn Sie nach Studien anderer Leute über Bodenmikrobiome suchen.

Dieser Überblick über Techniken und Ansätze kann hilfreich sein, wenn Sie mehr über die gesamten Genome/Metagenomics-Ansätze erfahren möchten: http://ccb.jhu.edu/people/salzberg/docs/Breitwieser-etal-2017-Metagenomics-review- Nachdruck.pdf


16S ist immer noch eine der beliebtesten Methoden zur Identifizierung von Organismen. Die Technik ist sehr gut stabil und funktioniert gut. Es hat jedoch einige Einschränkungen, zum Beispiel gibt es eine signifikante Varianz der Kopienzahl dieser Gene in der Spezies. Was die Quantifizierung nicht sehr zuverlässig macht.

Um zu entscheiden, mit welchen Tools Sie Ihre Ergebnisse besser analysieren können, können Sie sich das CAMI-Challenge-Papier ansehen. Mehrere Tools für verschiedene Teile der Analyse werden in den Labors verglichen. Die beliebtesten Tools sind nicht immer die besten für Ihre Analyse.


Bodenmikrobiologie (Prüfungsfragen und -antworten)| Mikrobiologie

Antwort: (1) Assoziation von Pilzen und Algen in Flechten.

(2) Protozoen, die als Wirt für einzellige Algen dienen, die im Zytoplasma von Protozoen leben. Die Einzeller geben Raum und Schutz, während die Algen dem Wirt zusätzliche Nährstoffe liefern.

F.3. Was ist Kommensalismus?

Antwort: Beim Kommensalismus profitiert ein Organismus von der Beziehung, ohne den anderen zu beeinflussen, z. B. können einige Bakterien Polymere wie Zellulose in einfachere Glucosekomponenten abbauen, die von den benachbarten Fängern leicht verwertet werden.

F.4. Was ist Co-Metabolismus?

Antwort: Einige Organismen können die resistenten Chemikalien wie Pestizide nicht abbauen, aber sie können dies tun, wenn sie eine primäre Energiequelle wie Glukose erhalten.

F.5. Warum wird Boden als “biologisches Feuer” betrachtet.

Antwort: Das von einem Baum abgeworfene Blatt wird leicht vom Boden verzehrt, indem er seine organische Substanz in Kohlenstoff, Stickstoff und andere chemische Verbindungen umwandelt.

F.6. Wie hoch ist der Anteil an organischer Substanz im Boden?

Antwort: Sie beträgt 2-10% in landwirtschaftlich genutzten Böden und bis zu 95% in Torfmoorböden.

Antwort: Das dunkel gefärbte Material im Boden, das aus teilweise zersetzten organischen Stoffen besteht, wird Humus genannt.

F.8. Warum haben Bodengase generell einen hohen Anteil an Kohlendioxid und einen geringen Anteil an Sauerstoff?

Antwort: Durch die Atmung von Bodenorganismen.

F.9. Wo kommen Bodengase vor?

Antwort: Bodengase befinden sich in Poren und Zwischenräumen zwischen Bodenpartikeln oder werden im darin enthaltenen Wasser gelöst.

F.10. Nennen Sie die Tiere, die in fruchtbarem Boden vorkommen.

Antwort: Sie reichen von Nematoden (kleine Würmer) bis hin zu großen Formen wie Insekten, Tausendfüßler, Tausendfüßler, Spinnen, Nacktschnecken, Schnecken, Regenwürmer, Mäuse, Maulwürfe, Gophers (grabende Nagetiere) und Reptilien.

F.11. In welcher Tiefe einer Gartenerde kommt die maximale Anzahl an Mikroorganismen pro Gramm vor?

Antwort: In einer Tiefe von 3-8 cm.

Antwort: Das von den Actinomyceten produzierte gasförmige Material, das dem Boden den charakteristischen muffigen Geruch verleiht, wird Geosmin genannt.

Antwort: Die Gesamtmasse lebender Organismen in einem bestimmten Volumen ist Biomasse. Die Biomasse von Actinomyceten ist ungefähr gleich der Biomasse aller im Boden vorhandenen Bakterien.

F.14. Die Zahl der Protozoen steigt oder sinkt tendenziell mit den Bakterienpopulationen. Wieso den?

Antwort: Wegen der räuberischen Gewohnheit vieler von ihnen.

F.15. Nennen Sie die häufigsten mikrobiellen Krankheitserreger des Bodens.

Antwort: Die endosporenbildenden Bakterien sind übliche Überlebende im Boden, z. B. Bacillus anthracis, der Milzbranderreger bei Tieren, Clostridium tetani, das Tetanus verursacht, Clostridium botulinum, die Erreger des Botulismus und Clostridium perfringens, die Erreger von Gasbrand.

F.16. Nennen Sie das Bodenbakterium, das ein Krankheitserreger von Insekten ist.

Antwort: Bacillus thuringiensis.

F.17. Welche Elemente sind von biogeochemischen Kreisläufen abhängig?

Antwort: Dies sind Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor.

F.18. Woher kommt der anorganische Kohlenstoff, der bei der Synthese organischer Verbindungen verwendet wird.

Antwort: Von CO2.

F.19. Was ist Treibhauseffekt?

Antwort: Es ist die Zunahme von Kohlendioxid in der Atmosphäre aufgrund des übermäßigen Verbrauchs fossiler Brennstoffe, die allgemein zur Erwärmung der Erde führt.

F.20. Wie verhält sich Ammoniak, das beim Abbau von Proteinen im Boden freigesetzt wird?

Antwort: In trockenem Boden tritt das Ammoniak aus, während es in feuchtem Boden löslich wird.

Die so gebildeten Ammoniumionen werden von Bakterien und Pflanzen zur Synthese von Aminosäuren verwendet.

F.21. Was ist Nitrifikation? Nennen Sie die beiden Bakterienarten, die mit der Nitrifikation verbunden sind.

Antwort: Der Vorgang der Oxidation von Ammoniumionen zu Nitrat wird als Nitrifikation bezeichnet. Die im Boden lebenden autotrophen nitrifizierenden Bakterien sind Nitrosomonas und Nitrobacter. Die Nitrifikation erfolgt in den folgenden zwei Schritten:

F.22. Was ist Denitrifikation? Nennen Sie die Bakterienart, die sie verursacht.

Antwort: Der Abbau von Nitraten zu Luftstickstoff ist Denitrifikation, z.B.

Häufige denitrifizierende Bakterien sind Pseudomonas. Einige andere Gattungen umfassen Paracoccus, Thiobacillus und Bacillus.

F.23. Nennen Sie die nicht-symbiotischen stickstofffixierenden Bakterien.

Antwort: Sie sind Azotobacter und einige Cyanobakterien. Die anderen Arten sind Clostridum, Klebsiella, Enterobacter (anaerob) und Rhodospirillum und Chlorobium (aerob photoautotroph).

F.24. Was ist Rhizopher?

Antwort: Die Region, in der Boden und Wurzeln vor allem im Grünland Kontakt haben. Diese Region ist reich an mikrobiellen Populationen.

F.25. Nennen Sie die symbiotischen Stickstofffixierer.

Antwort: Rhizobium und Bradyrhizobium, die Knötchen in den Wurzeln von Hülsenfrüchten bilden.

F.26. Nennen Sie ein Beispiel für die Stickstoffökonomie in einem Wald mit Algen und Pilzen.

Antwort: Flechte.

F.27. Nennen Sie drei Symbionten von Cyanobakterien.

Antwort: (1) Anthoceros ein Moosen

(2) Azolla ein kleiner Schwimmfarn und

F.28. Geben Sie ein Beispiel für ein symbiotisches stickstofffixierendes Wurzelknötchen, das von einem Aktinomyceten-Mitglied gebildet wird.

Antwort: Franken.

F.29. Geben Sie Schritte bei der Bildung von Wurzelknötchen an.

Antwort: (1) Anheftung von Rhizobium am Wurzelhaar.

(2) Bildung eines Infektionsfadens, durch den Bakterien eindringen.

(3) Die Bakterienzellen verwandeln sich in pleomorphe Bakterizide und die gepackten Wurzelzellen nehmen an Größe zu.

(4) Die vergrößerten Wurzelzellen bilden ein Knötchen.

F.30. Was ist Widerspenstigkeit? Gib ein Beispiel?

Antwort: Es ist widerstandsfähig gegen Abbau, z. B. DDT als widerspenstiges Mittel.

F.31. Was ist eine der Hauptursachen für die Ausrottung von Adlern und anderen Raubvögeln, die vor zwei Jahrzehnten in den Ebenen Nordindiens eine Fülle von Nahrung genossen.

Antwort: Ansammlung von DDT aus kontaminierten Lebensmitteln, die zu einer Beeinträchtigung ihres Fortpflanzungssystems führt.


Mikrobielle Funktion (enzymatische Aktivität)

Die fluorimetrischen und kolorimetrischen Plattenlesegeräte zur Messung von sichtbarer Farbe oder Fluoreszenz
(Foto von Dr. S. Grayston)

Die enzymatische Aktivität wurde durch die Mikroplattentechnik bestimmt, bei der die enzymatische Aktivität getestet wird, indem Bodenproben einem Testsubstrat ausgesetzt werden. Wann ist es? Enzyme reagieren mit dem Testsubstrat, es ändert entweder seine Farbe (farbmetrisch) oder leuchtet fluoreszierend. Bei dieser Technik wurde eine fluoreszierende Verbindung verwendet, um hydrolytische Aktivität (wie Phosphatase) nachzuweisen. Eine oxidative enzymatische Aktivität (wie Phenoloxidase) wurde kolorimetrisch bestimmt.

Dr. Alice Chang mit Gaschromatographie (GC) zur Identifizierung von PLFA
(Foto von Dr. S. Grayston)

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Bodenbiologische Tests


Die Abbildung zeigt ein DGGE-Gel, wobei jede Spur eine andere Bodenprobe darstellt.
Innerhalb jeder Spur repräsentieren die Banden mutmaßliche Bakterienarten aus der Bodenprobe
wodurch ein "Gemeinschafts-Fingerabdruck" von diesem Boden erzeugt wird.

Für Informationen zu DJPR wenden Sie sich bitte an:

&Kopie Bundesstaat Victoria (Landwirtschaft Victoria) 1996 - .

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Diskussion

Der mikrobielle Stoffwechsel ist ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung des Ausmaßes und der Dauer des Abbaus und der Konzentrationen von phenolischen Allelochemikalien in Böden. In dieser Studie haben wir Mikroben isoliert, die Phenole aus Böden aller drei Pflanzenarten, Bambus, Kiefer und Reis, effektiv abbauen können, was darauf hindeutet, dass alle diese Pflanzenböden das Potenzial haben, Phenolverbindungen durch Mikroben abzubauen. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass die Inokulation von Bodenmikroben in Kulturlösungen und Bambuserden effektiv abgebaut wurde P-Cumarsäure und verwandte Phenole. Diese Mikroben können zur Zersetzung und Gewinnung von Böden verwendet werden, die mit einem hohen Gehalt an Phenolen kontaminiert sind. Im Vergleich zu unseren frühen Berichten ( Li et al. 2007 ) über die chemische Oxidation von phenolischen Allelochemikalien in Bambusböden, in denen P-Kumarsäure in Bambuserde wurde zu 32 oder 37% abgebaut, wenn sie mit 0,1 oder 1% H . behandelt wurde2Ö2 des Fenton-Reagenzes zeigten mikrobielle Behandlungen 70–80 % Zersetzung von P-Kumarsäure (Abb. 1c). Der mikrobielle Abbau benötigt jedoch einen viel längeren Zeitraum (30 Tage).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Bodenbedingungen wichtige Faktoren für das Wachstum und den Stoffwechsel von Mikroben sowie für den mikrobiellen Abbau von Bodenphenolen sind. Das Wachstum und die Funktionen aller vier Isolate aus Böden hängen weitgehend von den mittleren pH-Werten, Temperaturen und Metallionen ab. Zum Beispiel die beiden Stämme von Ps. putida 4CD1 und 4CD3 konnten bei pH 4,0 und 3,0 Bedingungen nicht wachsen (Abb. 4a), die in den meisten angesäuerten Böden in unserer Gegend üblich sind R. glutinis 4CD4 konnte bei Temperaturen über 30°C nicht gut wachsen (Abb. 4b), während alle drei Stämme von Pseudomonas in mit Co 2+ kontaminierten Böden nicht wachsen konnten (Abb. 5). Dies kann die Ansammlung hoher Phenolkonzentrationen in den Bambusböden erklären, aus denen Ps. Nitroreducens 4CD2 und R. glutinis 4CD4 wurden isoliert. Das häufige Problem der Bodenversauerung in unserer Region hat möglicherweise das Wachstum von Ps. Nitroreducens 4CD2, und die lange Zeit hoher Temperaturen von mehr als 35 °C könnten das Wachstum von R. glutinis 4CD4.

Diese Ergebnisse zeigten, dass sich die Impfung von Mikroben unter Laborbedingungen oder unter kontrollierten Bedingungen (bei 30 °C und einem anfänglichen pH-Wert von 6,0) effektiv zersetzen kann P-Cumarsäure in Kulturlösungen (Abb. 1a,b) und Bambuserden (Abb. 1c) und kehren ihre Hemmung der Samenkeimung und des Sämlingswachstums um (Abb. 2 und 3). Um das mikrobielle Wachstum und den Abbau von Phenolen in Böden zu verbessern, scheint die Änderung der Bodenbedingungen wie pH-Wert und toxische Metallionen wichtiger zu sein als die Inokulation von Mikroben in Böden.

Der Abbau toxischer Schadstoffe durch Bodenmikroben wurde ausführlich untersucht, wie der Abbau von 2,4-Dichlorphenol ( Chen et al. 1999 ), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ( Michel et al. 1995), 2,4,6-Trichlorphenol ( Godoy et al. 1999), 2,4,6-Trinitrotoluol (Esteve-Núñez et al. 2001), Atrazin (Radosevich und Tuovinen 2004), Benzoxazolinon und Benzoxazinon (Fomsgaard et al. 2004 ), Dichlor-diphenyl-trichlorethan (DDT, Aislabie et al. 1997), Naphthalin (Tuleva et al. 2005), Phenanthren (Tao et al. 2007), Polyhydroxyalkanoate (Jendrossek und Handrick 2002) und andere Verbindungen (Healy und Young 1979 Song et al. 2000 Manickam et al. 2008). Die drei Bakterienarten identifiziert als Ps. putida, Ps. Nitroreducens und R. glutinis sind häufig vorkommende Mikroben in der Umwelt und haben sich als wirksam bei der Zersetzung und Umwandlung giftiger organischer Verbindungen erwiesen ( Hinteregger et al. 1992 Delneri et al. 1995 Heinaru et al. 2000 Gonzalez et al. 2001 Kilowatt et al. 2003 Margesin et al. 2004 Qualifikationen 2005 Sampaio et al. 2007 et al. 2007). Der Abbau von phenolischen Allelochemikalien in Böden durch die Mikroben wurde jedoch nicht umfassend untersucht. Die drei Mikroben wurden zuerst aus den Böden von Bambus, Kiefer und Reis isoliert und erwiesen sich als wirksam beim Abbau von phenolischen Allelochemikalien in den Böden. Zeng und Mallik (2006) wiesen darauf hin, dass Ektomykorrhiza-Arten die Arteninteraktionen in höheren Pflanzen kontrollieren können, indem sie die Chemie der Rhizosphäre ändern. Unsere Ergebnisse zeigten, dass mehr Bodenmikroben diese Funktion haben.

Mikrobielle Verwertung von Zimtsäurederivaten (z.B. P-Cumar- und Ferulasäure) beinhaltet mehrstufige Umwandlungen und führt zur Produktion anderer phenolischer Verbindungen, wie z P-Hydroxybenzaldehyd, P-Hydroxybenzoesäure und Catechol oder Vanillin, Vanillinsäure und Protocatechusäure, vor der Spaltung des aromatischen Rings und der weiteren Oxidation in Komponenten des Tricarbonsäurezyklus (Venturi et al. 1998 Priefert et al. 2001). Bei vielen Mikroben- und Pflanzenarten wird dieser Prozess durch Cumarat-CoA-Ligase oder Feruloyl-CoA-Synthetase initiiert, die mehrere Phenole als Substrate verwendet, wie z P-Cumar-, Ferula- und Kaffeesäure. Der vollständige Satz von Genen, die für die Umwandlung von Cumar- oder Ferulasäuren zur Spaltung des aromatischen Rings verantwortlich sind, wurde identifiziert aus Pseudomonas sp. Stamm HR199 (Priefert et al. 2001). Dies erklärt, dass die Pseudomonas sp. wir isoliert von Böden nutzen können P-Cumarsäure, Ferulasäure, P-Hydroxybenzoesäure und P-Hydroxybenzaldehyd. Das zeigen auch unsere Ergebnisse R. glutinis kann die vier phenolischen Verbindungen als einzige Kohlenstoffquelle nutzen, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich ähnliche Stoffwechselprozesse für den Abbau von phenolischen Verbindungen hat.

Zusammenfassend sind vier Mikrobenstämme mit hoher Effizienz bei der Nutzung P-Kumarsäure wurden zuerst aus den Wachstumserden von Bambus isoliert (B. chungii), Kiefer (Pi. massonian) und Reis (O. sativa) unter Verwendung eines anorganischen Siebmediums mit P-Cumarsäure als einzige Kohlenstoffquelle. Sie wurden identifiziert und bezeichnet als Ps. putida 4CD1, Ps. Nitroreducens 4CD2, Ps. putida 4CD3 und R. glutinis 4CD4, durch morphologische, biochemische und ribosomale rDNA-Sequenzanalyse. Die vier Stämme können effektiv wachsen und sich zersetzen P-Cumarsäure in anorganischen oder LB-Lösungen mit 1 g l −1 P-Cumarsäure als alleinige oder Co-Kohlenstoffquelle. Sie können auch Ferulasäure effektiv abbauen, P-Hydroxybenzoesäure und P-Hydroxybenzaldehyd. Behandlungen mit den vier Mikroben können sich effektiv zersetzen P-Cumarsäure und kehren ihre Hemmung der Samenkeimung und des Keimlingswachstums von Pflanzen in Kulturlösungen und Pflanzenerden unter Laborbedingungen um. Das Wachstum der Mikroben hängt jedoch stark von den Kultur-pH-Werten, Temperaturen und Metallionen ab. Die Ergebnisse zeigten, dass hohe Phenolgehalte in Pflanzenkulturlösungen und Bambuserden durch die Anwendung von Mikroben unter günstigen Bedingungen effektiv abgebaut werden können. Die Modifikation der Wachstumsumgebung für Mikroben ist jedoch in Böden wichtig, die sauer oder mit Metallionen kontaminiert sind.


4. Diskussion

Um Unterschiede in den mikrobiellen Gemeinschaften in diesem Bodentyp zu beurteilen, wurden eine Reihe von Maßnahmen verwendet. Die Größe der gesamten mikrobiellen Population war ähnlich, aber es gab Hinweise auf Unterschiede in der Gemeinschaftsstruktur. Diese strukturellen Unterschiede wurden durch die mit Biolog™ erhaltenen Substratnutzungsprofile, durch die Anzahl der Gruppen kultivierbarer Mikroben, die durch Plattenzählung und selektive Beschichtung gemessen wurden, sowie durch die direkte Extraktion von Fettsäuren aus den Böden gezeigt. Bei Proben, die an Standorten mit hohem Schlammeintrag entnommen werden, ist zu erwarten, dass sich nicht nur die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften, sondern auch die Populationsgröße und die Gesamtbiomasse verändern [ 29]. In den mit Schlamm behandelten Böden T1, T2 und T3 stiegen die Schwermetallkonzentrationen mit DOC an und deuteten auf eine höhere Abwasserbelastung von T3 hin, das mit Abstand den höchsten Gehalt an organischer Substanz und damit an Metall aufwies. Die mikroskopischen Gesamtzahlen und die Zahl der kultivierbaren heterotrophen Bakterien waren in T3 signifikant höher, aber der Anteil fluoreszierender Pseudomonaden war niedriger, was auf einen Unterschied in der Gemeinschaftsstruktur hindeutet (Tabelle 2). Dies kann auf die Langzeitbehandlungen zurückzuführen sein oder auch nicht, da wir nicht ausschließen können, dass die Populationen vor Beginn der Schlammzugabe unterschiedlich waren. Indikatororganismus für den akuten Toxizitäts-Bioassay war ebenfalls eine Pseudomonade, die in allen schlammbehandelten Böden eine Reduktion der Biolumineszenz im Vergleich zu den Grünlandböden zeigte ( Tabelle 2).

Bååth und Arnebrant [ 7] fanden keine Wirkung der Kalkapplikation auf die direkte Keimzahl in Böden, beobachteten jedoch mit steigendem pH-Wert eine Zunahme des Verhältnisses von Bakterien, die auf Agarplatten wuchsen, zur Gesamtkeimzahl. So konnte der Vergleich der Schlamm- und Grünlandböden in unserer Studie durch Kalkung sowie durch erhöhte organische Kohlenstoff-, Metall- und Phosphate im Schlamm sowie andere Faktoren beeinflusst werden. Smitet al. [ 30] zeigten keine Unterschiede zur direkten Zählung, fanden jedoch eine geringere Diversität von Isolaten in Böden, die mit 750 kg ha −1 zugesetztem Cu kontaminiert waren, im Vergleich zu nicht kontaminierten Grünlandböden.

Die gesamten extrahierten FAMEs zeigen einen ähnlichen Trend wie die Keimzahlen (Tabelle 2), mit höheren Werten in den mit Schlamm behandelten Parzellen. Die für FAMEs verwendete Methode extrahiert auch Fettsäuren aus nicht-mikrobiellen Quellen und toten Zellen, aber in diesem Fall scheinen die FAMEs die lebende bakterielle Biomasse widerzuspiegeln. In Böden, die etwa doppelt so viel Kohlenstoff enthielten und eine maximale Konzentration von Zn und Cu von 1230 bzw. 473 mg kg −1 enthielten (Tabelle 1), haben wir, gemessen durch FAMEs, nur geringe Auswirkungen auf die mikrobielle Gemeinschaft gezeigt. Die Unterschiede können auf die Wirkung der Kalkung zurückgeführt werden. Frostegård et al. [ 31] zeigten, dass das Kalken und der daraus resultierende pH-Anstieg die PLFA-Zusammensetzung im Boden verändert. Ein Großteil dieser Veränderung wurde einer größeren Verfügbarkeit von Kohlenstoff zugeschrieben [ 32]. Studien, in denen durch PFLAs gemessene Veränderungen auf Metalle im Boden zurückgeführt wurden, wurden in Böden mit viel höheren Metallkonzentrationen gezeigt [ 4, 11, 33].

Die aus der Analyse von Biolog™ abgeleiteten Shannons- und Gini-Diversitätsindizes zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den Böden (Tabelle 2). However, closer examination of the patterns of carbon substrate utilisation showed that microbial activities in the soil extracts were not identical and so the similarity between the indices is due to retention of the overall community structure, while changes may have occurred in the frequencies of individual species. It was important to consider not just the responses of the soil extracts to individual substrates at any one time, but also to compare growth curves. This highlights the importance of examining information carefully before assuming that an index is providing a true picture of the information.

There has long been an interest in the relationship between community diversity and the stability of communities responding to perturbations, such as toxic challenges. This interest has been sharpened recently by the work of Tilman [ 9] on plant communities confirming that biodiversity stabilises community and ecosystem processes, but not population processes (i.e. individual populations are less stable). In our study, the response of bacterial communities to sewage sludge in soils was considered, investigating the taxonomic (FAMEs) and catabolic (Biolog™) diversity alongside the total and viable bacterial numbers. Our results indicate that diversity was relatively stable, while individual species and functions underwent limited fluctuations, such as the decline in fluorescent pseudomonads and different carbon substrate utilisation patterns. The addition of sewage sludge with its associated land-management practices may have influenced the numbers of micro-organisms, and their catabolic and taxonomic profiles, but it is difficult to identify the most relevant comparisons to make when undertaking this type of field monitoring. There were no unlimed sludged sites available, and the grassland sites chosen had completely different management. A controlled long-term experiment would need to be set up to look at changes due specifically to the treatments. Nevertheless, it is interesting that the two grassland sites did not show great differences when compared with the sludged sites. However, the considerable spatial variability at the site, in terms of soil C and metals, means that the samples cannot be viewed strictly as with and without sludge. Variability in some soil properties ( Table 1) was as great within the treated arable and untreated grassland areas as it was between them.

This work highlights the need for integrated approaches when looking at microbial population structures in any soils, whether they are under different management or perturbed in some way. A number of different techniques, both biological and chemical, are needed when monitoring soils for impacts of land management practices on microbial communities. Our comparison of similar soil types with different managements showed no great impact on the microbial populations by all the techniques tested. However, it also indicated that there were differences in specific microbial parameters and populations and that it is necessary to use a number of different techniques including acute assays and measures of community diversity and function. The results do indicate that fluorescent pseudomonads are particularly sensitive indicators of soil perturbations that affect microbial communities.


8.3: Introduction to Bacterial Identification using Genotypic methods

Throughout this semester, we have learned about many methods to characterize and identify bacteria. These methods include characterizing cell shape (cellular morphology), identifying Gram status or specialized cellular features through staining, growth requirements (oxygen, pH, temperature, etc), appearance of colonies (colony morphology), and through biochemical reactions (enterotubes, selective and/or differential media types, etc.). All of these are primarily Phenotypic methods of analysis and characterization, that is, the results are a product of the Ausdruck of their genes.

Cellular morphology: cell shape--through microscopy

Staining characteristics: Gram status, cell structures such as flagella, endospores---microscopy

Growth characteristics: culturing requirements such as oxygen, osmotic pressure, temperature, colony morphology----culturing techniques

Genotypic methods

The last method used for the identification of bacteria is Genetic analysis through the use of nucleic acid probes or other molecular techniques.

The application of molecular techniques for detecting and identifying pathogens is widely used. In particular, in surveillance studies these methods provide reliable epidemiological data for tracing the source of human infections, such as a foodborne illness outbreak. A wide range of molecular techniques (including pulsed field gel electrophoresis, multilocus sequence typing, random amplified polymorphism deoxyribonucleic acid, repetitive extragenic palindromic, deoxyribonucleic acid sequencing, multiplex polymerase chain reaction and many more) have been used for detecting, speciating, typing, classifying and/or characterizing pathogens of great significance to humans.

The advent of the &ldquomolecular biology age&rdquo has provided a plethora of tools and techniques for the detection, identification, characterization, and typing of bacteria for a range of clinical and research purposes. Previously, the identification and characterization of bacterial species was largely done by phenotypic and biochemical methods (such as through selective/differential media and biochemical tests that we have discussed in the last 2 modules), which relied on preliminary isolation and culture.

While these methods continue to hold place in certain settings, molecular-based techniques have provided unprecedented insights into bacterial identification and typing. To name a few examples, genotypic methods have enabled the identification of a large diversity of previously unknown taxa, the characterization of uncultivable bacteria, and facilitated metagenomics studies on large and diverse bacterial communities. Both clinical and research setting have provided in depth insights into bacterial virulence, pathogenesis, antibiotic resistance, and epidemiological typing, as well as identification of novel, emerging, and re-emerging species. In addition, the widespread use and availability of molecular tools for bacterial genotyping has resulted in high throughput analysis, more sensitive and discriminatory results, and rapid turn-around-times, which are only likely to get better with automated tools and data analysis pipelines.

Most molecular methods for bacterial identification are based on some variation of DNA analysis, either amplification or sequencing based. These methods range from relatively simple DNA amplification-based approaches (PCR, real-time PCR, RAPD-PCR) towards more complex methods based on restriction fragment analysis, targeted gene and whole-genome sequencing, and mass spectrometry. In addition to this, approaches based on unique protein signatures such as matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and similar variations have also been explored.

Polymerase Chain Reaction

Many of these molecular techniques utilize the polymerase chain reaction or PCR. A technique you have probably heard of in other classes. Polymerase chain reaction (PCR) enables researchers to produce millions of copies of a specific DNA sequence in approximately two hours. This automated process bypasses the need to use bacteria for amplifying DNA. During the course of a bacterial infection, the rapid identification of the causative agent(s) is necessary for the determination of effective treatment options, thus molecular methods such as PCR is a popular option due to its speed. You may already know that for detection of the SARS-CoV2 virus, RT-PCR is widely used.

PCR allows DNA amplification so that specific segments of DNA can be copied numerous times, and then separated and analyzed by gel electrophoresis. The presence of a specific fragment of amplified DNA can be used to either identify an organisms or a particular characteristic such as antibiotic resistance. We often use the 16S rRNA gene for bacterial identification purposes because it is present in all bacteria, it is highly conserved sequences (large regions of nucleotide similarity) which are interspersed with variable regions that are genus- or species-specific. Bacteria can be identified by nucleotide sequence analysis of the 16S rRNA PCR product and comparing it to a database with known sequences.


Abbildung 1: Schematic PCR primers binding to the 16S rRNA gene for amplification from a bacterial chromosome.

In a PCR reaction, the is a series of steps that occur. Usually the dsDNA is denatured to ssDNA. At 55-58degC, a pair of synthesized oligonucleotide primers anneal to the ssDNA that flank the sequence of interest. At 72degC, a thermostable DNA polymerase will replicate the ssDNA to dsDNA sequences. The cycle repeats itself 20-40x to amplify the DNA.

Figure 2: PCR reaction. Image by Erica Suchman, Colorado State University, Ft. Collins, CO.


Beyond denitrification: The role of microbial diversity in controlling nitrous oxide reduction and soil nitrous oxide emissions

Center for Environmental Biotechnology, Department of Microbiology, Department of Civil and Environmental Engineering, Department of Biosystems Engineering and Soil Science, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA

Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA

School of Civil and Environmental Engineering and School of Biological Sciences, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Departments of Plant Biology and Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Wendy H. Yang, Mailing Address: 286 Morrill Hall, 505 South Goodwin Ave, Urbana, IL 61801, USA.

State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Changshu National Agro-Ecosystem Observation and Research Station, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing, China

Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Global Change and Photosynthesis Research Unit, United States Department of Agriculture – Agricultural Research Station,, Urbana, IL, USA

Program in Ecology, Evolution, and Conservation Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Center for Environmental Biotechnology, Department of Microbiology, Department of Civil and Environmental Engineering, Department of Biosystems Engineering and Soil Science, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA

Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA

School of Civil and Environmental Engineering and School of Biological Sciences, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Departments of Plant Biology and Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

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Abstrakt

Many biotic and abiotic processes contribute to nitrous oxide (N2O) production in the biosphere, but N2O consumption in the environment has heretofore been attributed primarily to canonical denitrifying microorganisms. Die nosZ genes encoding the N2O reductase enzyme, NosZ, responsible for N2O reduction to dinitrogen are now known to include two distinct groups: the well-studied Clade I which denitrifiers typically possess, and the novel Clade II possessed by diverse groups of microorganisms, most of which are non-denitrifiers. Clade II N2O reducers could play an important, previously unrecognized role in controlling N2O emissions for several reasons, including: (1) the consumption of N2O produced by processes other than denitrification, (2) hypothesized non-respiratory functions of NosZ as an electron sink or for N2O detoxification, (3) possible differing enzyme kinetics of Clade II NosZ compared to Clade I NosZ, and (4) greater nosZ gene abundance for Clade II compared to Clade I in soils of many ecosystems. Despite the potential ecological significance of Clade II NosZ, a census of 800 peer-reviewed original research articles discussing nosZ and published from 2013 to 2019 showed that the percentage of articles evaluating or mentioning Clade II nosZ increased from 5% in 2013 to only 22% in 2019. The census revealed that the slowly spreading awareness of Clade II nosZ may result in part from disciplinary silos, with the percentage of nosZ articles mentioning Clade II nosZ ranging from 0% in Agriculture and Agronomy journals to 32% in Multidisciplinary Sciences journals. In addition, inconsistent nomenclature for Clade I nosZ and Clade II nosZ, with 17 different terminologies used in the literature, may have created confusion about the two distinct groups of N2O reducers. We provide recommendations to accelerate advances in understanding the role of the diversity of N2O reducers in regulating soil N2O emissions.


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Keywords: antibiotic production, antimicrobial activity, Streptomyces sp., chromone antibiotics, non-polyenes

Citation: Singh V, Haque S, Singh H, Verma J, Vibha K, Singh R, Jawed A and Tripathi CKM (2016) Isolation, Screening, and Identification of Novel Isolates of Actinomycetes from India for Antimicrobial Applications. Vorderseite. Microbiol. 7:1921. doi: 10.3389/fmicb.2016.01921

Received: 09 July 2016 Accepted: 15 November 2016
Published: 06 December 2016.

Vijai Kumar Gupta, National University of Ireland, Ireland

Alok Kumar Pandey, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, India
Praveen Chandra Verma, Council of Scientific and Industrial Research-National Botanical Research Institute, India

Copyright © 2016 Singh, Haque, Singh, Verma, Vibha, Singh, Jawed and Tripathi. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (CC BY) verbreitet wird. Die Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung in anderen Foren ist unter Nennung der Originalautoren oder Lizenzgeber und unter Angabe der Originalpublikation in dieser Zeitschrift gemäß anerkannter wissenschaftlicher Praxis gestattet. Es ist keine Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung gestattet, die nicht diesen Bedingungen entspricht.


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