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Pektinase-Enzym-Assay

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Ich arbeite an einem Pektinase-Enzym-Assay. Ich inkubierte 900 ul Substrat für 10 Minuten im Wasserbad, gefolgt von der Zugabe von 2 ml DNSA-Reagens, dann wurden 100 ul Enzymextrakt hinzugefügt, schließlich las ich die Absorption bei 540 OD ab. Allerdings sind die Werte hoch. Wie kann ich hohe Enzymleerwerte im Pektinase-Assay beheben?


Ihr Rohling ist also alles andere als das Enzym? Das heißt, Substrat und DNSA mit 100 µL Wasser? Wenn ja, messen Sie als Negativkontrollen nur Substrat und DNSA allein. Wenn einer von ihnen auch stark Licht absorbiert, kann er kontaminiert sein und eine neue Durchstechflasche sollte bestellt werden. Wenn beide stark absorbieren, kann es am verwendeten Wasser oder am Spektralfotometer liegen.

Alternativ können Sie versuchen, einen Zeitverlauf zu messen. Wenn die Extinktion des Leerwerts im Laufe der Zeit zunimmt, liegt eine Kontamination vor, und eine Nachbestellung von Reagenzien kann Ihnen helfen. Wenn die Absorption konstant bleibt, liegt keine Enzymkontamination vor, dh der Schuldige ist verdorbenes Wasser, fehlerhafte Spezifikationen oder sogar ein falsches Protokoll. (Das heißt, Neuanordnen oder Wiederholen hilft nicht.)


Pektinase-Enzymkomplex-Produktion durch Aspergillus spp. in der Festphasenvergärung: Eine vergleichende Studie

Eine vergleichende Bewertung von drei Aspergillus Spezies nach ihrer Pektinase-Produktion in der Festphasen-Fermentation durchgeführt. Die Festphasenfermentation bietet mehrere potenzielle Vorteile für die Enzymproduktion durch Pilzstämme. Die Nutzung landwirtschaftlicher Nebenprodukte als kostengünstige Substrate für die mikrobielle Enzymproduktion führte zu einem wirtschaftlichen und vielversprechenden Verfahren. Die pektinolytischen Enzymaktivitäten von zwei Aspergillus sojae Stämme wurden mit einem bekannten Hersteller verglichen, Aspergillus niger IMI 91881 und zu A. soja ATCC 20235, die neu klassifiziert wurde als Aspergillus oryzae. Die Auswertung der Polymethylgalacturonase- und Polygalacturonase-Aktivität wurde ebenso durchgeführt wie die Exo- vs. Endo-Enzymaktivität im rohen Pektinase-Enzymkomplex der genannten Stämme. Darüber hinaus wurde ein Plattendiffusionstest angewendet, um das Vorhandensein und die Wirkung von Proteasen in den Rohextrakten zu bestimmen. A. soja ATCC 20235 mit der höchsten Polymethylgalacturonase-Aktivität und der höchsten Polygalacturonase-Aktivität sowohl der Exo- als auch der Endoenzymaktivität ist ein vielversprechender Kandidat für die industrielle Pektinase-Produktion, eine Gruppe von Enzymen mit hohem kommerziellem Wert, in Festphasen-Fermentationsprozessen. Neben den enzymatischen Assays wird ein Proteinprofil jedes Stamms durch SDS-PAGE-Elektrophorese erstellt und zusätzlich wurden speziesspezifische Zymogramme für pektinolytische Enzyme beobachtet, die die Unterschiede im Proteinmuster der A. soja Stämme zu den neu klassifizierten A. oryzae.

Höhepunkte

► Screening von verschiedenen Aspergillus Spezies für die Pektinase-Enzymproduktion. ► Festkörperfermentation von Aspergillus spp. ► Vergleich der Enzymaktivitäten der verschiedenen Spezies.


Wirksamkeit von Aspergillus fumigatus R6-Pektinase bei der enzymatischen Rötung von Kenaf

Enzymröste kann eine praktikable Alternative zur Wasserrötung sein, die derzeit verwendet wird, um Fasern aus Kenaf zu extrahieren. Die Vorteile der Enzymröste sind die höhere Umweltfreundlichkeit, die kürzere Röstezeit und die besser kontrollierbare Faserqualität. Das Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit von Pektinase zu bestimmen, die aus lokal isolierten Aspergillus fumigatusR6 beim Kenafrösten. A. fumigatus Die R6-Pektinase trennte die Fasern effektiv von den Nicht-Faserkomponenten. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Oberfläche von Pektinase-behandelten Kenaf-Bastfasern glatter und feiner zu sein schien. Der Rötungsgrad nahm mit der Inkubationszeit zu. Eine Röstzeit von 32 h lieferte gute Kenaf-Bastfasern mit hoher Zugfestigkeit (459 MPa). Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zugeigenschaften von Kenaf-Bastfasern gefunden, die mit . behandelt wurden A. fumigatus R6-Pektinase enthaltendes Kulturfiltrat und andere Quellen des kommerziellen Pektinase-Enzyms. Daraus wurde geschlossen, dass A. fumigatus R6-Pektinase war in der Lage, Kenaf effektiv zu rösten.

Schlüsselwörter: Kenaf Enzyme Retting Pektinase Hohe Zugfestigkeit

Kontaktinformationen: a: Department of Microbiology, b: Department of Bioprocess Technology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia c: Institute of Tropical Forestry and Forest Products, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia *Korrespondierende Autorin: [email protected]

EINLEITUNG

Kenaf (Hibiskus-Cannabinus L.), ein Mitglied der Hibiskusfamilie, ist eine der vielseitigsten Bastfasern Westafrikas. Kenaf wird zur Verwendung als Tierfutter, Tauwerk und Papierprodukte angebaut (Dempsey 1975 Warnock et al. 2002). Naturfasern treten als Ersatz für Carbon- und Glasfasern in der Automobilindustrie und in Baumaterialien sowie in der Orthopädie und Prothetikindustrie auf (Fowler et al. 2006 Baltina et al. 2012 Ich et al. 2012). Kenaf-Fasern sind nachhaltig und umweltfreundlich, da sie biologisch abbaubar und erneuerbar sind. Darüber hinaus ermöglicht das schnelle Wachstum von Kenaf zwei Erntezeiten pro Jahr, was die Produktionserträge erhöht und es kostengünstiger macht (Song und Obendorf 2007 Tahir et al. 2011).

Kenaf-Fasern werden durch Rösten gewonnen, einem biochemischen Prozess, bei dem Biopolymere wie Pektin, Hemicellulosen und andere schleimige Substanzen in der Kutikula und der Epidermis gespalten werden. Diese Stoffe halten die benachbarten Faserbündel zusammen, so dass die Entfernung von nichtfaserigen Stoffen die Faserbündel freilegt. Schließlich können Fasern hergestellt werden (Van Sumere 1992 Othman et al. 2014). Nichtzellulosehaltige Stoffe wirken sich negativ auf die Fasereigenschaften aus, was sich insbesondere in der Textilindustrie auf den nachgelagerten Prozess auswirkt (Othman et al. 2014). Daher ist die Entfernung von nichtzellulosehaltigen Materialien notwendig, um hochwertige Kenaf-Bastfasern zu erhalten.

Wasserrösten ist eine der traditionellen Methoden zur Herstellung hochwertiger Fasern, die größten Nachteile dieser Methode sind jedoch die Wasserverschmutzung und ein starker Geruch, der während des Röstprozesses entsteht (Van Sumere 1992 Akin et al. 2007). Ein anderes Röstverfahren, die Tauröste, führt zu Fasern von inkonsistenter Qualität, da dieses Verfahren geografisch begrenzt und wetterabhängig ist, was die Röstbedingungen unkontrollierbar macht (Van Sumere 1992). Es wurden daher Anstrengungen unternommen, alternative Röstverfahren zu finden, wobei der Schwerpunkt auf der enzymatischen Röste lag.

Die Enzymtechnologie gewinnt weltweite Anerkennung, weil sie umweltfreundlich ist und eine spezifische und fokussierte Leistung hat (Bledzki et al. 2010 Hanana et al. 2015). Auch die Enzymrötung ist besser kontrollierbar und die Abwasserproduktion kann reduziert werden (Kozlowski et al. 2006). Der biologische Abbau von Pektin erfolgt durch die synergistische Wirkung verschiedener extrazellulärer Enzyme, die in diesem Prozess verwendet werden (Brühlmann et al. 1994). Polygalacturonase und Pektinlyase, zwei Arten von Pektinase, sind die wichtigsten Enzyme, die am Rötungsprozess beteiligt sind (Othman et al. 2014). Es können hochfeste Fasern mit gleichbleibender Qualität und unterschiedlicher Feinheit hergestellt werden überEnzymrötung mit Pektinase. Diese hochwertigen Fasern können in neuartigen Harzen verwendet oder für landwirtschaftliche Rohstoffverbunde aus Naturfasern (Foulk et al. 2011 Bernava et al. 2015). Van Sumere (1992) schlug vor, dass die Anwesenheit von Hemicellulasen und Cellulasen erforderlich ist, um die Pektinase zu unterstützen, um gute Rötungsergebnisse zu erzielen. Die Wirksamkeit von Pektinase bei der Enzymrötung variiert mit der Art der Pektinase und der Quelle des Mikroorganismus (Henriksson® et al. 1999).

Obwohl in der Enzym-Retting-Forschung Erfolge erzielt wurden, die zu einem halbindustriellen Versuch führten, wurde kein kommerzielles System entwickelt (Tian et al. 2013). Heutzutage sind viele kommerzielle Enzympräparate für die Fasermodifizierung verfügbar, aber die Haupthürden sind eine mäßige bis geringe Haltbarkeit, hohe Kosten, geringe Aktivität und geringe Erneuerbarkeit (Bera et al. 2014). Parameter wie Faserfestigkeit, Weichheit und Zähigkeit hängen weitgehend von der Qualität der Enzymbehandlung ab.

Enzymröste scheint eine vielversprechende Methode zur Herstellung hochwertiger Fasern unter leicht kontrollierbaren Bedingungen zu sein. Die meisten Studien haben sich bisher auf das Rösten von Naturfasern wie Flachs und Ramie (Foulk et al. 2011 Bera et al. 2014 Bernava et al. 2015) mit kommerziellen Enzymen. Die Abhängigkeit von kommerziellen Enzymen kann jedoch die Produktionskosten für Kenaf-Fasern erhöhen. Ziel dieser Studie ist es daher, die Wirksamkeit der lokal isolierten A. fumigatusR6, das eine hohe Ausbeute an Pektinaseenzymen beim Kenafrösten produziert. Diese Arbeit kann als Grundlage für zukünftige Arbeiten in diesem Bereich dienen.

EXPERIMENTAL

Die in dieser Arbeit verwendeten Kenaf-Pflanzen wurden vom National Board of Kenaf and Tobacco, Malaysia, bezogen. Die Kenaf Sorte V36 wurde in Rompin, Pahang angebaut. Das Erntealter betrug 4 Monate. Kenaf-Stängel wurde maschinell geerntet und zur Verarbeitung ins Labor gebracht. Entkernter Kenaf-Bast wurde in 10-cm-Stücke von der Mitte des Stiels geschnitten, gefolgt von einem Eintauchen in Leitungswasser bei 30 °C für 4 Stunden, um Pigmentierung zu entfernen, und für 24 Stunden vor dem Rösten luftgetrocknet.

Die in dieser Studie verwendeten kommerziellen Enzyme waren Produkte von Sigma-Aldrich (USA). Das Kulturfiltrat mit Pektinase-Aktivität von Bazillus subtilis ADI1 wurde von der Abteilung für Mikrobiologie der Fakultät für Biotechnologie und Biomolekulare Wissenschaften der Universiti Putra Malaysia bereitgestellt. Alle Enzyme wurden in 0,2 M Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5 hergestellt.

Kultivierung und Ernte von Aspergillus fumigatus R6 Pektinase

A. fumigatus Das in dieser Studie verwendete R6 wurde aus dem Kenaf-Wasserrötungsbecken (Institute of Tropical Forestry and Forest Products, Malaysia) isoliert. Frühere Studien haben gezeigt, dass A. fumigatus R6 produzierte ein hohes Pektinase-Enzym und könnte daher möglicherweise im Kenaf-Retting-Prozess verwendet werden. Sporensuspension von A. fumigatus R6 wurde hergestellt, indem eine Schleife voller Sporen in 0,01% Tween 80®-Lösung suspendiert und als Inokulum verwendet wurde. Das Inokulum wurde auf mit einer Minerallösung ergänzte Reiskleie beimpft und 129 h bei 33 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 5, zu der Kultur zugegeben. Pektinase wurde durch Zentrifugation bei 10.000 . geerntet × g, 4 °C für 15 min unter Verwendung einer Avanti® J-25I-Zentrifuge (Beckman Coulter, USA). Der klare Überstand wurde während der gesamten Studie als Rohenzym verwendet. Eine Lösung von 0,05% Natriumazid (NaN3) wurde dem Überstand zugesetzt, um ein mikrobielles Wachstum zu verhindern.

Um die Polygalacturonase-Aktivität zu bestimmen, wurde geeignet verdünntes Rohenzym mit 1% Polygalacturonsäure in 0,2 M Natriumacetat-Puffer, pH 5, 10 min bei 40°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 µl 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS) beendet und 15 min gekocht. Dann wurden 4,4 ml destilliertes Wasser zugegeben und bei einer Wellenlänge von 530 nm gemessen (Kashyap et al. 2000). Die Konzentration des freigesetzten reduzierenden Zuckers wurde mit Galacturonsäure als Standard bestimmt. Eine Einheit Enzymaktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist, um ein µmol des Produkts unter Standardbedingungen herzustellen.

Die Pektin-Lyase-Aktivität wurde spektrometrisch nach der Methode von Nedjma . bestimmt et al. (2001). Eine Einheit wurde als Änderungen der 0,01-Absorption bei einer Wellenlänge von 550 nm unter Standardtestbedingungen definiert.

Carboxymethylcellulase (CMCase) und Xylanase-Aktivitäten wurden durch Abschätzen der Freisetzung von reduzierendem Zucker unter Verwendung der 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)-Methode (Miller 1959) bestimmt, wobei 1 % Carboxymethylcellulose bzw. Xylan als Substrat in der Reaktionsmischung verwendet wurden .

Kenaf-Bast wurde mit entsprechend verdünntem Pektinase-Enzym (A. fumigatus R6), in eine Polyethylenbox gegeben und 40 h bei 30 °C inkubiert. Die Proben wurden in 8-Stunden-Intervallen gesammelt und unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Kenaf-Bast wurde nach dem Trocknen gereinigt und gekämmt. Die Qualität und Morphologie der gerösteten Fasern wurden bewertet.

Morphologische Charakterisierung der gerösteten Kenaffasern

Kenaf-Bast wurde auf eine Streichholzgröße von 2 cm × 0,5 cm × 0,5 cm geschnitten und in destilliertem Wasser erhitzt, um Sauerstoff zu entfernen. Die Stäbchen wurden nach der Methode von Franklin (1945) in einer Lösung aus Eisessig und Wasserstoffperoxid getränkt. Nachdem die Stäbchen farblos geworden waren, wurden sie mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um Chemikalien zu entfernen. Kenaf-Baststäbchen wurden in neue Teströhrchen überführt, in destilliertem Wasser geschüttelt und mit Safranin gefärbt. Die Fasern wurden dann unter einem Mikroskop betrachtet.

Der Helligkeits- und Yellowness-Index wurde gemäß ASTM E313 (2015) gemessen. Alle Messungen wurden unter den Bedingungen der CIE-Normlichtart D65 (durchschnittliches Tageslicht) und 10° Beobachtungswinkel durchgeführt. Die Oberflächentopographie von Kenaf-Fasern wurde qualitativ untersucht, um die Wirksamkeit von A. fumigatus R6-Pektinase beim Kenaf-Retting unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (JOEL, Japan).

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR)-Analyse

Zur Bewertung der chemischen Zusammensetzung der behandelten Kenaf-Bastfasern wurde ein FT-IR-Spektrophotometer (Perkin Elmer, USA) verwendet. Die Spektren wurden im Frequenzbereich von 4000 bis 280 cm -1 aufgenommen.

Die Zugeigenschaften wurden mit einer Universal Testing Machine (Instron®, USA) bestimmt. Tests wurden gemäß ASTM International D3379 (1975) durchgeführt. Dreißig Proben wurden getestet, um die durchschnittliche Einzelfaserfestigkeit zu bestimmen. Die Tests wurden in einer Standard-Laboratmosphäre von 25 °C und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Die Traversengeschwindigkeit in dieser Studie betrug 3 mm/min, und die Messlänge wurde konstant auf 10 mm gemessen.

Alle statistischen Tests wurden durch eine Varianzanalyse (einfache ANOVA) und einen Post-hoc-Türkei-Test mit einem Wahrscheinlichkeitsniveau unter 5 % (P < 0,05) durchgeführt.


Was ist eine Pektinase? (Mit Bildern)

Pektinase ist eine Gruppe von Enzymen, die einen zentralen Teil der Pflanzenzellwände abbauen. Enzyme sind Proteine, die die Reaktionsgeschwindigkeit beschleunigen. Diese Enzyme sind ein allgegenwärtiger Bestandteil der Fruchtsaft- und Weinindustrie. Auch bekannt als pektische Enzyme, werden sie dem Viehfutter zugesetzt, damit die Tiere ihr Futter besser verdauen können. Sie werden auch als Nahrungsergänzungsmittel für den Menschen verkauft, um die Verdauung zu unterstützen.

Verschiedene Arten von Pektinenzymen unterscheiden sich darin, wie sie Pektin abbauen, ein langes Polysaccharid von Zuckern, das ein Gel bildet. Pektin bildet das Zentrum der pflanzlichen Zellwand. Darin sind andere Moleküle wie Zellulose eingebettet. Wenn Pektin durch Pektinase abgebaut wird, werden die Zellwände schwächer. Während der Fruchtreife hilft beispielsweise das Enzym Polygalacturonase bestimmten Früchten wie Tomaten, weich und essbar zu werden.

In anderen Fällen produzieren Pilze und Bakterien diese Enzyme, um Zellwände als Teil ihres Eindringens in Pflanzengewebe aufzubrechen. Dieser Abbau kann zu einem vollständigen Abbau des Gewebes führen, beispielsweise wenn eine Kartoffel Weichfäule bekommt. Pektinenzyme helfen auch bei der Zersetzung von Pflanzenstreu und werden bei der Abwasserbehandlung verwendet. Genetisch veränderte Pilze sind eine wichtige Quelle dieser Enzyme für die Industrie.

Kommerziell wird Pektinase dem Viehfutter zugesetzt, um den Tieren zu helfen, ihre Nahrung besser zu verdauen. Dies verbessert die Gesundheit ihres Verdauungssystems und hilft ihnen, Nährstoffe besser zu verdauen. Es ermöglicht ihnen auch, nicht zu stark verarbeitete Lebensmittel zu füttern, die weniger kosten. Nahrungsergänzungsmittel mit Enzymen, die Pflanzenmaterialien abbauen, werden ebenfalls verkauft, um die menschliche Verdauung zu unterstützen, obwohl solche Nahrungsergänzungsmittel nicht von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) reguliert werden, sodass ihre Wirksamkeit unklar ist.

Die Lebensmittel- und Weinindustrie verwendet diese Enzyme häufig in Kombination mit Amylase, das Stärke abbaut, um Lösungen zu klären. Dies gilt insbesondere für Apfelsaft, der aufgrund von Pflanzenstoffen, die nach der Herstellung darin verbleiben, oft trüb ist. Die Behandlung mit Pektinenzymen baut das Pektin ab und hilft, einen klaren Saft zu produzieren. Bei der Herstellung von Säften auf Beerenbasis kann eine solche Behandlung auch die Beibehaltung von Aroma und Farbe verbessern. Ein ähnlicher Ansatz wird mit Wein verfolgt, der Pektin enthält.

Pektinase wird auch verwendet, wenn Früchte zu Fruchtfleisch verarbeitet und dann extrahiert werden, um ihren Saft zu entfernen, da festgestellt wurde, dass sie die Ausbeute verbessert. Andere Anwendungen für Pektinenzyme in der Lebensmittelindustrie sind das Weichmachen von Fruchtschalen, um das Schälen zu erleichtern, und das Fermentieren von Kaffee und Tee. Diese Enzyme werden zusammen mit anderen zellwandabbauenden Enzymen auch bei der Isolierung von Pflanzenfasern wie Baumwolle verwendet und reduzieren den Bedarf an giftigen Chemikalien in solchen Prozessen.


  • NCBE, 2006. "In a Jam and Out of Juice", National Centre for Biotechnology Education, University of Reading, UK [Zugriff am 7. Juli 2006] http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/ INAJAM/PDF/JAM03.pdf.
  • Wikipedia-Mitwirkende, 2006a. "Zellwand", Wikipedia, Die freie Enzyklopädie. [Zugriff am 7. Juli 2006] http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cell_wall&oldid=61797174.
  • Wikipedia-Mitwirkende, 2006b. "Enzym", Wikipedia, Die freie Enzyklopädie. [Zugriff am 7. Juli 2006] http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Enzyme&oldid=62644117.
  • Wikipedia-Mitwirkende, 2006c. "Pektin", Wikipedia, Die freie Enzyklopädie. [Zugriff am 7. Juli 2006] http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pectin&oldid=61390030.

Diese Artikel können bei der Carolina Biological Supply Company, einem von Science Buddies anerkannten Lieferanten, erworben werden:

  • 100-ml-Becher (2). Alternativ können Sie auch saubere Gläser verwenden.
  • Pektinase. Möglicherweise können Sie es auch vor Ort in einem Geschäft mit Heimwerkerbedarf finden.
  • Bewässerungspipetten (2). Alternativ können 1-ml-Spritzen oder -Pipetten verwendet werden.
  • Thermometer
  • Trichter (2)
  • 100 mL Messzylinder (2)

Sie müssen auch diese Gegenstände sammeln:

  • Äpfel (2)
  • Lineal, metrisch
  • Scharfes Messer zum Schneiden von Äpfeln
  • Waage zum Abwiegen von Apfelstücken, z. B. die digitale Taschenwaage Fast Weigh MS-500-BLK, 500 x 0,1 G, erhältlich bei Amazon.com
  • Destilliertes Wasser
  • Abdeckband und Permanentmarker oder Haftnotizen und ein Stift
  • Einweg-Plastiklöffel zum Rühren (2)
  • Plastikfolie
  • Das Wasserbad kann so einfach sein wie eine Styroporbox oder eine isolierte Truhe, die groß genug ist, um die Becher aufzunehmen
  • Timer oder Uhr
  • Optional: Holzlöffel
  • Kaffeefilter aus Papier (2)
  • Labornotizbuch

Haftungsausschluss: Science Buddies nimmt an Partnerprogrammen mit Home Science Tools, Amazon.com, Carolina Biological und Jameco Electronics teil. Erlöse aus den Partnerprogrammen helfen dabei. + Mehr Science Buddies, eine öffentliche Wohltätigkeitsorganisation gemäß 501(c)(3), und halten Sie unsere Ressourcen für alle frei. Unsere oberste Priorität ist das Lernen der Schüler. Wenn Sie Kommentare (positiv oder negativ) zu Käufen haben, die Sie aufgrund von Empfehlungen auf unserer Website für wissenschaftliche Projekte getätigt haben, teilen Sie uns dies bitte mit. Schreiben Sie uns an [email protected]
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Einfluss der Pektinase-Konzentration auf das Volumen von Apfelsaft

In der heutigen Gesellschaft wird ein Enzym namens Pektinase häufig von Apfelsaftfabriken verwendet, um den Prozess der Apfelsaftproduktion zu beschleunigen. Um zu testen, ob Pektinase tatsächlich bei der Saftproduktion wirksam ist, führte ich eine Untersuchung durch, indem ich die Apfelsaftausbeute beobachtete, wenn die Konzentration der Pektinase geändert wurde. Heute möchte ich die Ergebnisse dieses Experiments mit Ihnen teilen.

Um einige Hintergrundinformationen zu liefern, bezieht sich ein Enzym auf einen biologischen Katalysator, der chemische Reaktionen in Organismen beschleunigt. Pektinase, zu der Pektolyase, Pektozyme und Polygalacturonase gehören, ist die Gruppe der Pektin- & 8211-Abbauenzyme. Pektin reduziert die Aktivierungsenergie, die benötigt wird, um ein Pektinmolekül zu spalten, das die Zellwand aufbricht und folglich die Zeit für die Extraktion von Fruchtsäften verkürzt. Es wird häufig in der kommerziellen Produktion verwendet, beispielsweise bei der Gewinnung von Wein aus dem Fruchtfleisch.

Die Pektinase-Aktivität wird wie jede andere enzymatische Aktivität von der Temperatur und dem pH-Wert beeinflusst. Der optimale pH-Wert liegt bei 4,5 bis 5,5 und die optimale Temperatur bei 45˚C bis 55˚C. Pektinase wird auch durch die Anwesenheit von Mikroorganismen und Konzentrationen des Enzyms und des Substrats beeinflusst.

Diagramm des Apfelsaft-Extraktionsprozesses

Während des Experiments änderte ich die Konzentration der Pektinase von 10 % auf 0 % (destilliertes Wasser) und maß das Volumen des mit einem Messzylinder extrahierten Apfelsafts. Ich fügte zuerst 10 ml Pektinase-Lösung in 30 g Apfelmus hinzu und stellte die Mischung in das Wasserbad, das auf 40 Grad Celsius eingestellt war. Nach 20 Minuten habe ich die Becher aus dem Wasserbad genommen und den Saft gefiltert. Ich notierte die Saftmengen und beobachtete die Farbe des Apfelsafts, um quantitative und qualitative Daten zu erfassen.

Die Ergebnisse zeigten eine positive Korrelation zwischen der Pektinase-Konzentration und der extrahierten Apfelsaftmenge. Während das Volumen des aus einer Pektinase-Konzentration von 0,0 % extrahierten Apfelsafts von 0,0 ml auf 3,5 ml anstieg, stieg das Volumen des aus einer Pektinase-Konzentration von 10,0 % extrahierten Apfelsaftvolumens von 0,0 ml auf 7,9 ml. Allerdings waren die Fehlerbalken in meinem Experiment außergewöhnlich groß, fast alle Fehlerbalken überlappten sich. Sie resultierten wahrscheinlich aus kleinsten Messteilungen von Werkzeugen oder einer begrenzten Anzahl von Versuchen.

In der Anwendung auf das wirkliche Leben kann die Apfelsaftindustrie die Ergebnisse dieser Untersuchung nutzen, um die Verwendung von Pektinase zu verteidigen. Obwohl die Ergebnisse eine positive Korrelation zwischen der Apfelsaftmenge und der Pektinasekonzentration zeigten, waren die Fehlerbalken signifikant groß, was die Aussagekraft der Daten einschränkte. Daraus kann geschlossen werden, dass das Argument, dass eine Erhöhung der Pektinase-Konzentration zu einer höheren Ausbeute an Apfelsaft führt, schwach und unbegründet ist.


Pflanzen-Erreger-Interaktion Teil I: Enzyme in der Pflanzenpathologie

Die meisten Pilz- und Bakterienparasiten produzieren viele Enzyme, die das Pflanzenmaterial in vivo abbauen. Enzyme, die an der Pathogenese oder Virulenz (Prozess der Krankheitsauslösung) beteiligt sind, umfassen sowohl konstitutive als auch induzierbare Enzyme.

(1). Konstitutiv Enzyme sind die Enzyme, die ständig in den Zellen vorhanden sind.
(2). Induzierbare Enzyme sind solche Enzyme, die nur dann produziert werden, wenn sie von den Zellen als Reaktion auf bestimmte innere oder äußere Reize benötigt werden.

Wichtige Enzymklassen, die an der Pathogenese beteiligt sind, sind:

(1). Cutinasen
(2). Pektinasen
(3). Cellulasen
(4). Hemicellulasen
(5). Ligninasen
(6). Lipasen
(7). Proteinasen

Die Pflanzenoberfläche ist zum Schutz und zur Verhinderung von Wasserverlust mit einer dicken oder dünnen Kutikulaschicht beschichtet. Die Kutikulaschicht über der Pflanzenepidermis wird normalerweise imprägniert und mit Wachs bedeckt. Cuticula besteht hauptsächlich aus Cutin, einem Strukturpolymer aus Estern von Hydroxy- und Hydroxyepoxy-Fettsäuren. Cutinasen sind eine Gruppe von Enzymen, die Pflanzenkutikula hydrolysieren. Biochemisch gehört das Cutinase-Enzym zur Familie der Serinhydrolase. Von vielen pflanzenpathogenen Pilzen und wenigen Bakterien ist bekannt, dass sie während der Pathogenese das Cutinase-Enzym produzieren. Cutinase-Enzyme brechen die Nagelhaut auf und setzen Monomere und Oligomere frei. Diese Monomere dringen in die Zelle ein und lösen die weitere Expression von Cutinase-Genen aus. Das Cutinase-Enzym ist für die direkte Penetration der Cuticula des Wirts durch pathogene Pilze sehr wichtig. Die höchsten Konzentrationen der Cutinase sind am Penetrationspunkt von Hyphen und am Infektionszapfen des Appressoriums vorhanden.

(2). Pektinasen:

Pektinsubstanzen sind die Bestandteile der Mittellamelle und dienen als interzelluläres Zementierungsmaterial zwischen Pflanzenzellen. Pektinsubstanz macht auch einen großen Teil der primären Zellwand aus. In der primären Zellwand bildet Pektin ein amorphes Gel, das den Raum zwischen den Zellulose-Mikrofibrillen ausfüllt. Pflanzenpektin ist ein Polysaccharid, das aus einer Vielzahl von Galakturonsäureresten besteht. Für den erfolgreichen Eintritt von Krankheitserregern in die Wirtszellen ist der Abbau der Zellwandbestandteile sehr wichtig. Viele pathogene Pilze können während des Infektionsprozesses das Enzym Pektinase produzieren. Der Pektinabbau durch das Enzym Pektinase führt zur Verflüssigung der Pektinsubstanzen und zum Aufwachen der Zellwand, was zur Gewebemazeration führt. Pektinasen sind das Hauptenzym, das an der Weichfäule von Geweben durch Pilze beteiligt ist. Die weiche Fäulnis und Verflüssigung von Geweben erleichtert das schnelle Eindringen und die Etablierung von Krankheitserregern.

Es ist bekannt, dass zwei Klassen von Pektinasen an der Pflanzenpathogenese beteiligt sind.

(1). Pektinesterasen (PE) oder Pektinmethylesterasen (PME): entfernt kleine Äste der Pektinkette

(2). Polygalakturonasen (PG) oder Pektische Glykosidasen: spaltet die Pektinkette in kürzere Ketten von einem oder wenigen Galakturonsäuremolekülen.

Galacturanan-Monomere, die durch den Pektinabbau produziert werden, gelangen in die Zellen und lösen beim Erreger eine vermehrte Pektinase-Produktion aus. Diese vom Erreger aufgenommenen Monomereinheiten dienen als Induktor für die Massenproduktion von Pektinase in der Zelle.

(3). Cellulasen:

Im Gegensatz zu tierischen Zellen sind die Pflanzenzellen durch eine Zellulosezellwand geschützt. Um den Eintritt in die Wirtszelle zu etablieren, sollte der Erreger die um die Zelle herum vorhandene dicke Zellulose-Zellwand durchbrechen. Die Fähigkeit, Cellulase-Enzym zu produzieren, ist ein Hauptmerkmal von Pflanzenpathogenen bakteriellen und pilzlichen Ursprungs. Cellulasen sind eine Enzymklasse, die Pflanzenzellulose, den Hauptbestandteil der Zellwand, abbaut. Verschiedene Klassen-Cellulasen sind:

(1). Cellulase-C1: greifen native Cellulose an und spalten Vernetzungen zwischen Ketten

(2). Cellulase-C2: greifen auch native Cellulose an und spalten sie in kürzere Ketten

(3). Cellulase-Cx: Enzyme greifen kürzere Zelluloseketten an und hydrolysieren zu Disaccharideinheiten, die Cellobiose genannt wird

(4). β-Glucosidase: Cellobiose spalten und Glukoseeinheiten freisetzen.

(4). Hemicellulase:

Hemicellulose ist ein komplexes Gemisch aus Plysaccharid, das zusammen mit Cellulose vorliegt und einen Hauptbestandteil der primären Zellwand, der mittleren Lamelle und der sekundären Zellwand von Pflanzen bildet. Hemicellulasen sind die Enzyme, die von vielen Pflanzenpathogenen zum Abbau von Hemicellulosebestandteilen in der Zellwand produziert werden. Mehrere Arten von Hemicellulasen werden von vielen pflanzenpathogenen Pilzen produziert. Die Variation der Hemicellulase, die von den pathogenen Pilzen produziert wird, ist auf die Variation der aus dem Polymer freigesetzten Monomereinheiten zurückzuführen. Hauptkategorien von Hemicellulasen, die an der Pathogenese beteiligt sind, sind (1). Xylanase, (2). Galactanase, (3). Glucanase, (4). Arabinase und (5). Mannase.

(5). Ligninase:

Lignin ist ein komplexes organisches Polymer, das in der sekundären Zellwand vorhanden ist. Lignin ist ein komplexes Polymer und die wichtigste Struktureinheit ist ein Phenylpropanoid mit einem oder mehreren seiner Kohlenstoffe mit -OH, -O-CH3 oder = O Gruppen. Lignin gilt als der widerstandsfähigste Bestandteil der Pflanzen. Ligninase sind Enzyme, die das Lignin der sekundären Zellwand abbauen. Nur sehr kleine Gruppen von Mikroorganismen sind in der Lage, Lignin abzubauen. Die meisten Pilzarten gehören zu den Basidiomyceten der Klasse Hymenomyceten sind in der Lage, Ligninase-Enzym zu produzieren und Lignin abzubauen.

Liginase-produzierende Pilze verursachen ein charakteristisches Symptom namens Braunfäule. Die Ligninase-Aktivität ist die Ursache für den Holzverfall durch Pilzinfektionen. Obwohl Pilze Lignin abbauen können, können sie das Lignin nicht als Nahrungsquelle nutzen. Abgesehen von Basidiomycetes-Pilzen ist auch von wenigen Weißfäulepilzen bekannt, dass sie Ligninase produzieren. Diese Pilzgruppe kann Lignin als Nahrungsquelle nutzen.

Lipasen sind die Enzyme, die die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran hydrolysieren. Von einigen bakteriellen und pilzlichen Pathogenen ist bekannt, dass sie Lipaseenzyme produzieren.

(7). Proteinasen

Um die Pathogenese zu etablieren, müssen die Erreger viele Proteine ​​des Wirts abbauen. Diese Proteine ​​umfassen nicht nur die Strukturproteine ​​der Plasmamembran des Wirts, sondern umfassen auch viele Enzyme des Wirts, wie Nukleasen, Wirtsproteinasen usw. Fast alle pathogenen Pilze und Bakterien können viele Proteinasen produzieren.

Dies sind die wichtigsten Enzyme, die an der Pathogenese beteiligt sind. Die meisten dieser Enzymproduktionen im Parasiten werden durch kleine Moleküle vom Wirt ausgelöst. Diese kleinen Moleküle, die als Induktoren oder Auslöser bezeichnet werden, dringen in die Parasitenzelle ein und interagieren spezifisch mit einigen Zielproteinen wie Transkriptionsfaktoren. Die aktivierten Transkriptionsfaktoren induzieren dann die Massenproduktion des betreffenden Enzyms. Die koordinierten Aktivitäten aller oben genannten Enzyme sind für die erfolgreiche Induktionsinfektion in Pflanzen notwendig.


Extraktion, Reinigung und industrielle Anwendungen von Pektinase: Ein Rückblick

Pektin ist ein Hetero-Polysaccharid-Molekül mit 1,4-verknüpfter α-D-Galakturonsäure als Hauptbestandteil. Das Pektinase-Enzym ist für das Aufbrechen der glyosidischen Bindungen von Galakturonsäureresten in Pektinsubstanzen verantwortlich. Zur Herstellung des Pektinase-Enzyms werden üblicherweise sowohl die Submers- als auch die Festphasen-Fermentation (SSF) verwendet. Meist ist die Produktion von Enzymen in SSF besser. Es gibt bestimmte unterschiedliche Techniken wie Filtration, Dialyse, Ammoniumsalzfällung, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und SDS-PAGE, die zur Reinigung des Pektinaseenzyms verwendet werden können. Pektinase spielt eine wichtige Rolle in industriellen Prozessen wie der Fruchtsaftgewinnung, der Entschleimung von Pflanzenfasern, der Abwasserbehandlung, der Ölgewinnung, der Kaffee- und Teefermentation, der Papier- und Zellstoffindustrie.

Schlüsselwörter: Biomolekül-Polysaccharid-Enzymologie-Fermentation

Einführung

Die Verwendung lebender Organismen in industriellen Prozessen zur Entwicklung verschiedener Produkte wird aufgrund des geringeren Energieverbrauchs unerlässlich. Mikroorganismen sind für die Gesellschaft von Vorteil, da sie für die Herstellung wichtiger Produkte wie Enzyme, Antibiotika, Impfstoffe, Käse, Brot und viele andere verantwortlich sind [1]. Aus Mikroben extrahierte Enzyme werden aufgrund ihrer umweltfreundlichen Natur in der Industrie verwendet. Mikrobielle Enzyme ersetzen den Einsatz von Chemikalien sowohl in technischen als auch in industriellen Prozessen, was die Verschmutzungsrate senkt. Ein solches Enzym ist Pektinase, die in verschiedenen Industrien verwendet werden kann und aus verschiedenen Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen hergestellt werden kann [2]. Die durch pektinolytische Enzyme katalysierten Verbindungen tragen den Gattungsnamen Pektinsubstanzen (Abbildung 1). Diese sind sauer und negativ geladen [3].

Abbildung 1:Einstufung von Pektinsubstanzen [3].


Es gibt vier Arten von Pektinsubstanzen, die von der American Chemical Society klassifiziert wurden [4]:

A. Pektinsäure: Es ist das Polymer des Galacturonan, das eine Löslichkeitseigenschaft hat und die Methoxylgruppen sind vernachlässigbar. Pektat ist das saure oder normale Salz der Pektinsäure [5].

B. Protopektin: Diese pektische Substanz ist in Wasser unlöslich. Intakte Pflanzengewebe enthalten Protopektin. Aufgrund eingeschränkter Hydrolyse produziert Protopektin Pektinsäure oder Pektin [6].

C. Pektinsäuren: Die Kette von Polygalacturon ist Pektinsäure mit methylierten Einheiten von Galacturonat. Normale und saure Salze der Pektinsäure werden Pektinate genannt [5].

D. Pektin: Pektin ist allgemein als Polymethylgalacturonat bekannt. In Pektin sind Galacturonat-Einheiten Carboxylgruppen, von denen bis zu 75 % durch Veresterung mit Methanol verknüpft sind. Durch die Bindung an Cellulose in der Zellwand verleiht es der Zellwand Steifigkeit [3].

Früchte sind eine wichtige Pektinquelle und die hohe Viskosität von Fruchtsäften ist auf das mechanische Zerkleinern von pektinreichen Früchten zurückzuführen. Die mechanische Saftgewinnung ist schwierig [7]. Pektinase ersetzt zusammen mit einigen anderen Enzymen den mechanischen Extraktionsprozess und klären den aus pektinhaltigen Früchten gewonnenen Saft (Tabellen 1). Pectinase enzyme is responsible for the breakage of glycosidic bonds of galaturonic acid’s residues present in pectic substances [8]. Pectinase is a complex of enzymes enzyme also known as pectic enzyme complex which includes pectozyme, pectolyase and polygalacturonase involved in pectin breakdown. Polygalacturonase is commercially used pectinase. The pectinolytic enzyme has been divided into three major groups that are Protopectinase, Esterase, and Depolymerase [6].

Tables 1:Pectic content of different fruits.


Proto-pectinases act by degrading the insoluble protopectin and produce in soluble proteins. Esterases remove methoxy ester D-galaturonic acids by the deesterification of pectin while α-(1- 4)-glycosidic bonds present in D-galaturonic acid, is subjected to hydrolytic cleavage by deploymerases [3]. For the production of pectinolytic enzymes, both submerged and solid-state fermentation can be employed. The use of stirred tank bioreactors is preferred in the submerged process because it has the upside of controlled aeration and agitation rate which facilitates in the maximum transfer of Oxygen [9]. Conditions for culture medium are provided such that they are in accordance with the natural habitat of filamentous fungi. It gives the added benefit of maximum production because the fungi acclimatize to the culture conditions, thus escalating its efficiency. Moreover, these processes provide an uplift in the economy of the countries which are rich in deposits of biomass and agricultural waste [10].

Production and Extraction of Pectinase Enzyme

Submerged fermentation

Submerged fermentation and SSF, both can be employed to produce pectinase. The process which uses liquid broth to culture organisms is called submerged fermentation (Tables 2). The prerequisites for submerged fermentation are continuous agitation, provision of large amount of water. A colossal amount of effluents is released in this process [11-15]. After production of enzyme, it is easily extracted by using Whatman filter-paper 4. Biomass stays on the filter paper and liquid as supernatant passes through it [16]. The broth is centrifuged for measuring activity of pectinase [17].

Tables 2:Comparison of different media used for submerged fermentation.


Solid state fermentation

The process in which growth is proceeded on a solid surface or particles, in the absence or partial presence of water is termed as solid-state fermentation [18,19]. For extraction of enzyme after fermentation, the particular amount of specific buffer and water added into the fermented flask and allowed to mix well by using mechanical stirring. Filtration and centrifugation was done after mixing and centrifugation was carried out for obtaining the clear extract of enzyme [20]. Different fungal strains are metabolically different and grow differently in different media (Tables 3). Some fungal strains are not able to produce enzyme under solid state fermentation but become active when submerged conditions were provided [21,22].

Microbial sources

Tables 3:Comparison of different media used for SSF.


Aspergillus niger, Aspergillus. awamori, Penicillium restrictum, Trichoderma viride, Mucor piriformis and Yarrowia lipolytica are the filamentous fungi employed in both submerged as well as solid state fermentation for production of various industrially important products such as citric acid, ethanol etc. [23,24]. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium expansum, are the types of fungi which are considered as safe (GRAS) by United States Food and Drugs Administration (USFDA) and are put to use in food industry. Some bacteria (Bacillus licheniformis, Aeromonas cavi, Lactobacillus, etc), yeasts like Saccharomyces, Candida and Actinomycetes like Streptomycetes are also used. Amongst these, the filamentous fungi are most commonly employed [11].

Importance of solid state fermentation over submerged fermentation

Solid state fermentation is opted in place of submerged fermentation because it has more advantages [10] as the one is that it uses substrates which are considered as waste but actually contains nutrients. These substrates are important for long term use in fermentation because of their slow utilization rate [25]. Solid state fermentation gives more products after extraction as compared to submerged fermentation [22]. As in the example Penicillium citrinum produced more percentage yield of pectinase in solid as compared to submerged fermentation and is shown below (Tables 4) [26].

Tables 4:Comparison of units obtained from solid state and submerged fermentation.


Reinigung

The enzyme, pectinase may have extracted from different sources by using fermentation techniques. It is necessary to purify it for further processing. The purification steps are following [17]:

Filtration

If enzyme and the spore’s bodies are required to separate, then filtration is the best technique. In this filtration is done using Filter paper and centrifugation is carried out for 15 minutes at a rpm of 10,000. The resulting enzyme extract is used for pectinase activity assay [17].

Ethanolfällung

For ethanol precipitation, crude enzyme must be dialyzed and the resultant supernatant has been mixed with chilled ethanol. Up to 3 volumes of ethanol were used and the mixture was placed undisrupted at a temperature of 4 °C overnight [27]. Centrifugation of resultant precipitate after overnight incubation was carried out at same temperature at 9,000×g. Time for centrifugation was 30 minutes. 10mL Sodium citrate buffer with a pH of 6.5 was used for dissolving the precipitate [28].

Ammonium sulfate precipitation

Supernatant was used as an enzyme source obtained by the centrifugation of cultural medium. The enzyme precipitated by the addition of 60 percent ammonium sulfate [27]. Incubate it for overnight at a temperature of 40 °C after that centrifugation was done for twenty minutes at a rpm of 5000. Dissolved the resultant pellet in appropriate buffer such as T.E. buffer (pH 7.0) [6].

Dialysis

Activation of dialysis membrane is mainly achieved by sodium bi carbonate, and by boiling in hot water. This membrane contains dialysis tubing and after the activation of membrane the partially purified sample was added in to it and sealed it [28]. The salt impurities from protein extract was allowed to remove by suspending the tube in water and then incubated overnight [17].

Ionenaustauschchromatographie

This chromatography technique helps mainly in the removal of proteins either bound or unbound [27]. Sephadex G 150 is used for packing the glass column. After packing, the sample have been loaded into column. Tris HCl was used for protein elution in this method, having a pH 7.5. The volume collected after void volume were fractions of 1.5ml and their absorbance were taken. Those fractions having positive results for pectinase activity were saved by pooling out and concentrated them for further processing [23].

Gel filtration chromatography: The sample which was properly dialyzed, loaded in a column which is Sephadex G-250. 0.2M solution of phosphate buffer having a pH of 7.5 was used for column equilibration. The same buffer was used for protein elution. The flow rate was 0.1ml/min and with this rate the which were collected were ten. Factions having pectinase activity were separated out for further analysis [7].

SDS- Page

SDS PAGE was used for purity checking. Molecular weight was determined by running the marker and purified enzyme. Coomassie brilliant blue is used for staining the gel band for clear visualized [29].

Different purification techniques having different conditions become suitables for one but not for other proteins [30]. The slight change in pH above or below the optimum value change the activity of enzyme which could be a reason for variation in percentage yield of same proteins using different purification strategies.

Anwendung

One of the enzymes, that are the reason of unprecedented success of the textile and fruit industries, is pectinase [1]. Pectinases have a variety of applications in the industrial sector. This particular enzyme is used in the extraction of fruit juices such as apples, grape wine, strawberries, grapes, raspberries etc [31]. Pectin have a vital role in the turbidity and viscosity of fruits. For the purpose of clarifying fruit juices, a mixture of amylases and pectinases is used. The time of filtration is decreased upto 50% [32]. Pectinases are applied for the treatment of waste water coming from different industries [33]. Textile processing and bioscouring of cotton also finds a role of pectinase in their process. Pectinases combined with lipases, amylases, cellulases and hemicelluloses, is being used in place of caustic soda which is toxic in nature [34]. Pectinase is also used in paper making. It has the ability to depolymerize pectin. Pectin has a higher cationic demand which is lowered by the implementation of pectinase and the filtrate from peroxidase [35]. Besides all these, fermentation of tea and coffee [36], oil extraction and [37], and animal feed production also requires pectinase [34].

Abschluss

Pectinases are of humongous importance as they can be employed in a variety of industrial processes which ultimately leads to an escalation in the quality and yield of the product. A great deal of work done on pectinases involves its screening, isolation, production, purification, characterization and application in the arena of fruit juice production and clarification. Apart from fruit industry, other industries also enjoy the perks of pectinases according to some reports. In the coming times, protein engineering and the technique of site directed mutagenesis should be applied to search for the molecular aspects of pectinases which can increase its robustness regarding the pH and temperature kinetics. The main focus of research on pectinase should be its regulatory mechanism of secretion at a molecular level in the future. This will also aid in the understanding of how different pectinolytic enzymes act on pectin substances.

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Ergebnisse

Plackett-Burman design screening of the main components affecting cell biomass and pectinase production by A. niger

Fractional factorial design was applied to find out the most significant medium components affecting pectinase production by A. niger. Table 1 shows different investigated medium components and their low (− 1) and high (+ 1) levels. The performed experiments (36 runs, Table 3) revealed that the highest pectinase activity of 87.73–88.85 U/mL was obtained from runs 2, 27 and 29, which were conducted using medium containing (g/L): pectin, 30.0 (NH4)2SO4, 3.3 K2HPO4, 0.50 MgSO4.5H2O, 0.50. Moreover, the coefficients of determination (R 2 ) for both cell biomass and pectinase activity were 86.94 and 85.31%, respectively, indicating that this design had a good model fitting.

However, based on the analysis of variance (ANOVA) for pectinase activity (Table 4, Fig. 1), it can be concluded that the first investigated medium components i.e. pectin, (NH4)2SO4 und K2HPO4, were the most significant factors affecting pectinase production. This can be seen based on the obtained model F-value and the lower P-value (P- < 0.05). Accordingly, magnesium sulphate was excluded from the second step of optimization, since its effect on pectinase production was insignificant (P- = 0.23).

Pareto chart for the effect of the four factors on total enzyme production

Statistical medium optimization using Box-Behnken design

The BB experimental design was further applied to optimize the concentrations of pectin, (NH4)2SO4 und K2HPO4 in the culture medium according to the three levels (low, − 1 middle, 0 and high + 1) studied and shown in Table 2. The obtained results (Table 5) clearly showed that highest pectinase activity was obtained upon using the middle levels of all tested three components (Runs 8, 10, 21, 22, 24 and 25), where the maximal pectinase activity obtained ranged from 84.88 to 101.06 U/mL.

The present results show that the applied model exhibited significant P-values for the effects of the investigated factors on pectinase production (Table 6). Thus, this model was considered highly significant. From the obtained ANOVA results for the regression model in Table 6, we can deduce the following polynomial:

Response surface plots (Fig. 2a-c) represent correlations between the experimental factors (pectin, (NH4)2SO4 und K2HPO4) and the response of pectinase production. Figure 2a shows the relative effects between (NH4)2SO4 concentration (1.0–6.0 g/L) and pectin concentration (10–50 g/L) while keeping K2HPO4 concentration constant at 1.25 g/L. Pectinase production increased with increasing pectin concentration to reach its maximal production at 32.22 g/L of pectin, while (NH4)2SO4 was less effective on pectinase production. Figure 2b shows the relative effects between K2HPO4 concentration (0.5–2.0 g/L) and pectin concentration (10–50 g/L), while keeping (NH4)2SO4 concentration constant at 3.5 g/L. Results showed that highest pectinase production will be obtained at the most optimum pectin concentration (32.22 g/L), while 1.36 g/L K2HPO4 was suitable for producing maximal pectinase production. On the other hand, the combined surface plot for (NH4)2SO4 und K2HPO4 (Fig. 2c), where pectin concentration was fixed at 30 g/L, shows that increasing both components gradually increased pectinase production up to its maximal, and that further increase resulted in decreased pectinase production. The final optimum concentration for both components were 1.36 and 4.33 g/L for K2HPO4, and (NH4)2SO4, bzw. Furthermore, from the model results compared to our experimental runs, it can be seen that the maximal obtained experimental pectinase production (90 U/mL) was in good agreement with the model predicted production (92.48 U/mL) with a desirability of 0.915. It can be generally seen, that the evaluated components are significant for pectinase production. Carbon and nitrogen sources are basic components of fermentation medium, where they are used for cellular growth and metabolic machinery, which is finally reflected on the production of pectinase.

Contour plots of pecinase production by A. niger showing the interactions between pectin, (NH4)2SO4 und K2HPO4

Growth kinetics of A. niger cultivated in un-optimized and optimized medium

This part of the work was designed to compare the kinetics of cell growth and pectinase production on both un-optimized and statistically optimized media in shake flasks (Fig. 3). Cells grew exponentially in both cultures for the first 36 h with a similar growth rate (0.054 g/L/h), after which, cell dry weight remained more or less constant till the end of fermentation. Maximal cell growth recorded comparable values by the end of both cultivations (2.26 and 2.29 g/L for un-optimized and optimized media, respectively). Moreover, during the early exponential phase (0–24 h), the pH dropped from 5.5 to 3.8 and 4.1 in un-optimized and optimized media, respectively, and remained approximately constant for the remaining cultivation time. On the other hand, pectinase production was significantly improved upon using optimized medium, where pectinase was produced at a production rate of about 2.12 U/mL/h and recorded a maximal production of 76.35 U/mL after 36 h. In contrast, in the un-optimized medium, the maximal pectinase achieved was 27.2 U/mL at 60 h, which was about 35.6% of the maximal pectinase produced in the optimized medium. Similarly, the production rate in the un-optimized was only 26.9% (0.57 U/mL/h) of the production rate in the optimized medium. Concerning production yield (JaP/X) results showed that the maximal yield obtained in optimized medium (38,270.7 U/g cells) was almost 3-folds of the maximal yield obtained in un-optimized medium (12,895.4 U/g cells).

Cell growth, pectinase production, yield coefficient, and pH changes in the shake flask cultures using un-optimized and optimized media

Batch cultivation in the bioreactor under controlled and uncontrolled pH

The optimized production conditions were transferred from shake-flask level to bioreactor level to gain insights about process performance in semi-industrial scale bioreactor. Cultivations were run in a 16-L stirred tank bioreactor at an aeration rate of 1 v/v/min, under uncontrolled pH. This cultivation was compared with cultivation conducted at controlled pH conditions at 5.5 by the continuous addition of H2SO4/NaOH using a computerized pH control system (Fig. 4). Results showed that the pH in the uncontrolled cultivation dropped from 5.5 to about 3.6 after 18 h, and remained more or less constant until the end of the cultivation. It can also be noticed that cells grew exponentially without a lag phase, in both cultivations. Maximal cell growth reached 2.38 and 3.28 g/L for uncontrolled and controlled pH, respectively. Additionally, the average cell growth rates were similar (0.02 and 0.028 g/L/h, for uncontrolled and controlled cultivations, respectively). Concerning pectinase production, results showed that the enzyme was exponentially produced until 84 h with production rates of 0.94 and 0.86 U/mL/h in pH-uncontrolled and -controlled cultivations, respectively. The maximal pectinase produced in pH-controlled cultivation (109.63 U/mL) was higher by about 10% from the maximal pectinase produced in pH-uncontrolled cultivation (99.55 U/mL). This increase in enzyme production can be attributed to the increase in cell biomass rather than the increase in cell productivity, since the maximal recorded production yields (JaP/X) were comparable in both cultivations (46,282.7 and 43,760.3 U/g cell for controlled and uncontrolled pH cultures, respectively). Additionally, both produced maximal pectinase concentrations were higher by about 30.4 (uncontrolled pH) and 43.6% (controlled pH) than the maximal pectinase produced in optimized shake flask cultivation (76.35 U/mL).

Cell growth, volumetric and specific pectinase production, and change in pH during batch cultivation of A. niger in a 16-L bioreactor under uncontrolled and controlled pH conditions

Fed-batch cultivation in the bioreactor with constant sucrose feeding

Based on the previous data obtained from batch cultivations, fed-batch cultivation was conducted under controlled pH conditions in 16-L stirred tank bioreactor (Fig. 5). The cultivation was started as a normal batch mode for the first 60 h, where the cell growth and pectinase production kinetics were similar to the previous experiments, reaching maximal cell growth and pectinase production of 2.8 g/L and 120 U/mL, respectively. At 60 h, and before entering the stationary growth phase, sucrose was added at a constant feeding rate of 2.0 g/L/h. Accordingly, cells continued to grow exponentially with the same growth rate (0.028 g/L/h) and reached a maximal of 6.58 g/L after 120 h. Concomitantly, the volumetric pectinase production increased with an average production rate of 7.33 U/mL/h and reached a maximal of 450 U/mL at 108 h (about 4-folds higher than the corresponding batch culture). Afterwards, pectinase production remained approximately constant for the rest of cultivation. The highest production yield coefficient (JaP/X) obtained in the fed-batch cultivation recorded 75,762 U/g cells, which was almost 63.7% higher than the highest production yield obtained in pH-controlled batch cultivation (46,282.7 U/g cells).

Cell growth, volumetric and specific pectinase production, and change in pH during fed-batch cultivation of A. niger in a 16-L bioreactor

Finally, Table 7 summarizes different steps applied for the development of the production bioprocess for pectinase enzyme. There were significant increases in both volumetric and specific enzyme production through medium optimization, bioreactor cultivation, and switching to fed-batch mode. The statistical media optimization enhanced the pectinase activity up to 76.35 U/mL, compared with only 26.85 U/mL in the un-optimized medium in shake flasks. Moreover, cells cultivated in the bioreactor under controlled pH conditions yielded the highest volumetric pectinase production of 109.63 U/mL. Pectinase production was maximized using sucrose feeding. The highest enzyme production was 450 U/mL after 108 h, which represented about 16-folds increase in volumetric production, compared with the initial un-optimized culture medium and conditions.


Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels

A thermophilic fungal strain producing both pectinase and polygalacturonase was isolated after primary screening of 120 different isolates. The fungus was identified as Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Using solid-state cultivation, the optimum levels of variables for pectinase and polygalacturonase (PG) production were determined. Maximal levels of enzyme activities were achieved upon growing the culture in a medium containing wheat bran, sucrose, yeast extract and (NH4)2SO4 after 2-3 days of incubation at a temperature of 50ºC. Highest enzyme activities of 1116 Ug-1 for pectinase and 1270 Ug-1 for polygalacturonase were obtained at pH 4.0 and 5.0, respectively.

thermophilic fungi pectinase polygalacturonase

Através da tiragem de 120 cepas de fungos, isolou-se uma cepa capaz de produzir tanto pectinase quanto poligalacturonase. A cepa foi identificada como Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Empregando cultivo em estado sólido, determinou-se os níveis ótimos das variáveis para a produção de pectinase e de poligalacturonase. Os níveis máximos de atividade enzimática foram obtidos quando a cultura era realizada em meio contendo farelo de trigo, sacarose, extrato de levedura e (NH4)2SO4 por 2-3 dias a uma temperatura de 50ºC. A atividade máxima de pectinase (1116 Ug-1) e de poligalacturonase (1270 Ug-1) foi obtida em pH 4,0 e 5,0, respectivamente.

fungos termofílicos pectinase poligalacturonase

Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels

Produção de pectinases e poligalacturonase por Aspergillus fumigatus termofílico isolado de cascas de laranja em decomposição

Urmila Phutela Vikram Dhuna Shobhna Sandhu B.S. Chadha * * Corresponding Author. Mailing address: Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar, Punjab, 143005, India. Tel.: (+91183) 225-8802 Extn. 3317, Fax: (+91183) 225-8820. E-mail: [email protected]

Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar, Punjab, India

A thermophilic fungal strain producing both pectinase and polygalacturonase was isolated after primary screening of 120 different isolates. The fungus was identified as Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Using solid-state cultivation, the optimum levels of variables for pectinase and polygalacturonase (PG) production were determined. Maximal levels of enzyme activities were achieved upon growing the culture in a medium containing wheat bran, sucrose, yeast extract and (NH4)2SO4 after 2-3 days of incubation at a temperature of 50ºC. Highest enzyme activities of 1116 Ug -1 for pectinase and 1270 Ug -1 for polygalacturonase were obtained at pH 4.0 and 5.0, respectively.

Schlüsselwörter: thermophilic fungi, Aspergillus fumigatus, pectinase, polygalacturonase

Através da tiragem de 120 cepas de fungos, isolou-se uma cepa capaz de produzir tanto pectinase quanto poligalacturonase. A cepa foi identificada como Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Empregando cultivo em estado sólido, determinou-se os níveis ótimos das variáveis para a produção de pectinase e de poligalacturonase. Os níveis máximos de atividade enzimática foram obtidos quando a cultura era realizada em meio contendo farelo de trigo, sacarose, extrato de levedura e (NH4)2SO4 por 2-3 dias a uma temperatura de 50ºC. A atividade máxima de pectinase (1116 Ug -1 ) e de poligalacturonase (1270 Ug -1 ) foi obtida em pH 4,0 e 5,0, respectivamente.

Palavras-chave: fungos termofílicos, Aspergillus fumigatus, pectinase, poligalacturonase

Pectinolytic enzymes catalyzing the degradation of pectic substances are of great industrial importance (28). The pectinases are required for extraction and clarification of fruit juices and wines, extraction of oils, flavors and pigments from plant materials, preparation of cellulose fibers for linen, jute and hemp manufacture (8), coffee and tea fermentations (29) and novel applications in the production of oligogalacturonides as functional food components (13). Fungal polygalacturonases used in industrial processes for juice clarification are mainly obtained from mesophilic aspergilli and penicillia (3) and the range of enzyme sources is being extended through new recombinant and non-recombinant fungal strains. Thermophilic fungi are potential sources of various industrially important thermostable enzymes, such as lipases, xylanases, proteases, amylases and pectinases. These enzymes have numerous applications in the detergent, starch, food, paper and pharmaceutical industries (17).

Higher cost of the production is perhaps the major constraint in commercialization of new sources of enzymes. Though, using high yielding strains, optimal fermentation conditions and efficient enzyme recovery procedures can reduce the cost. In addition, technical constraint includes supply of cheap and pure raw materials and difficulties in achieving high operational stabilities, particularly to temperature and pH. Therefore, the understanding of various physiological and genetic aspects of pectinase is required for producing thermostable and acid stable strains of pectinolytic fungi.

Literature highlighting the optimization, biochemical characterization, genetics and strain improvement studies of pectinases from mesophilic fungi (7,11,18,19) is available. However, the studies on pectinases from thermophilic fungi are lacking. Considering the biotechnological importance of thermophilic fungi in the enzyme industry, the present paper reports the isolation of pectin degrading thermophilic fungi from various sources, their screening and process evaluation.

MATERIALS AND METHODS

Isolation of thermophilic fungi

Thermophilic fungi were isolated from different soil samples, compost and decomposed matter collected from the vegetable, fruit markets and composting soils of Amritsar, Jalandhar, Ludhiana, and Gurdaspur cities of Punjab (India). Isolation medium of following composition, gL -1 (pectin, 10.0 sucrose, 10.0 tryptone, 3.0 yeast extract, 2.0 KCl, 0.5 MgSO4. 7H2O, 0.5 MnSO4.5H2O, 0.01 (NH4)2SO4, 2.0) supplemented with mineral salt solution of composition g/100 mL (CuSO4.5H2O, 0.04 FeSO4, 0.08 Na2MoO4, 0.08 ZnSO4, 0.8 Na2B4Ö7, 0.004, MnSO4, 0.008), 1 mL distilled water to make 1L solution pH 5.5-6.0 was used (27). To the above medium, ampicillin (100 mg/mL) was added to restrict bacterial growth. The inoculated plates were incubated at 50ºC for 5-7 days. The cultures were further purified by sub culturing on YPSS (Yeast soluble starch agar) medium having composition, gL -1 (starch, 15 yeast extract, 0.4 K2HPO4, 0.23 KH2Bestellung4, 0.2 MgSO4.7H2O, 0.05 citric acid, 0.052 pH 5.5-6.0).

Screening of thermophilic fungal isolates for pectinolytic activity

Preliminary screening of isolates for pectinase production was carried out by disc plate method of Acuna-Arguelles et al. (2). The size of clearance zone formed around the colonies using 1% cetrimide solution corresponds to the enzymatic activity of a particular culture. The potency index of each isolate was calculated as the ratio of zone diameter to colony diameter. The cultures showing high potency index were further screened by semiquantitative plate assay method (22,23). The cultures were individually plated on YPSS medium (9) containing pectin in place of starch and incubated at 50ºC. A 6 mm colony from the growing edge of the colony was transferred to 2mL citrate buffer (0.1M pH 4.0), incubated for 1 h at 50ºC under shaking conditions. The resultant extract was assayed for pectinase activity. The released sugars were estimated using DNS. On the basis of plate assay, eight cultures were selected for further studies and were compared along with three standard cultures for pectinase production by solid state culturing. The solid-state cultivation was carried out using basal medium of following composition (1), given as gL -1 : (pectin, 10 urea, 3.0 sucrose, 31.4 (NH4)2SO4, 12.6 KH2Bestellung4, 6.5 FeSO4, 0.29 sugarcane bagasse, 231.0 pH, 5.0-5.5. The final moisture was adjusted to 70%. The flasks were inoculated with spore suspension (1 mL) containing (10 6 spores mL -1 ) and incubated at 50ºC for 2-3 days. The crude enzyme was extracted by adding 100mL of citrate buffer (0.05M pH 5.5) to each flask followed by filtration and centrifugation at 14400 g. The resultant extract was used for enzyme assay.

The isolate TF3, identified as Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163 by Microbial Type Culture Collection (MTCC), Chandigarh, India, was taken up for further studies.

The production of the pectinase was followed for 5 days the contents of the flasks were harvested at regular intervals (24h) by adding 100ml citrate buffer (50 mM, pH 5.0) followed by centrifugation. The resultant clear extract was assayed for pectinase and PG activities.

Effect of physico-chemical parameters

The effect of natural substrates like different complex carbon source (malt sprouts, wheat bran, rice bran and pectin from pomegranate, lemon, banana, orange and mussami) and purified commercial carbon sources (glucose, sucrose, galactose, trehalose, carboxymethyl cellulose and starch), nitrogen sources urea and (NH4)2SO4 (U+N), yeast extract and (NH4)2SO4 (Y+N), peptone and (NH4)2SO4 (P+N), soybean meal and (NH4)2SO4 (So+N), malt sprouts and (NH4)2SO4 (M+N), yeast extract and NaNO3 (Y+S), peptone and NaNO3 (P+S), urea and NaNO3 (U+S), incubation temperature between 30 and 80ºC and effect of pH on pectinase and PG production were studied.

The pectinase and PG activities were determined using pectin and polygalactouronic acid as substrates (20). The reaction mixture (1mL) containing equal amounts of substrate (1%) prepared in citrate buffer (0.05 M pH4.4) and suitably diluted enzyme was incubated at 50ºC for 30 minutes in water bath. After incubation 3 mL DNS solution was added to stop the reaction and tubes were kept in boiling water for 10 minutes. On cooling, the developed colour was read at 575 nm using UV-visible spectrophotometer (Shimadzu-Mini 1240). The amount of released reducing sugar was quantified using galactouronic acid as standard. The enzyme activity was calculated as the amount of enzyme required to release one micromole equivalent of galactouronic acid per minute under assay condition. The activities expressed as units/g of substrate. The protein in the supernatant was measured by the method of Lowry et al. (16)

Effect of pH and temperature on enzyme activities

The enzyme extract was pre-incubated at different temperatures ranging from 30-80ºC for different time intervals and then assayed for pectinase and PG activity. The effect of pH on pectinase and PG activities were studied between pH 3.0 - 9.0 using citrate/phosphate (pH 3.0-7.2) and Tris-HCl (pH 7.2-9.0) buffers (50 mM). All the experiments were conducted in triplicate and the results show the mean values of the activities.

Screening of isolates

Thermophilic fungal strains isolated from various sources and sites of different cities of Punjab, were purified and their cultural and morphological characteristics were examined (9). Fungal cultures were further screened by disc plate method and the potency index was calculated. Fifteen cultures had a potency index above 3.5, thirty-five cultures had potency index between 3.0-3.5, and forty-three isolates had a potency index of 2.0-3.0. These isolates were categorized as high, moderate and low pectinase producers, respectively.


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