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6.5: Biochemie der schwefelhaltigen Aminosäuren - Biologie

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S. cerevisiae benötigt zum Leben drei schwefelhaltige Aminosäuren. Neben Met
und Cys, die in zelluläre Proteine ​​eingebaut werden, benötigen Zellen auch S-Adenosylmethionin (AdoMet), das aktivierte Methylgruppen für viele Methylierungsreaktionen liefert. Die Konsensansicht der Synthese dieser drei Aminosäuren auf der vorherigen Seite wird jetzt durch biochemische und genetische Beweise aus vielen Laboratorien gut gestützt (überprüft in Thomas
& Surdin-Kerjan, 1992). In diesen Experimenten konstruierten die Forscher Plasmide mit Wildtyp GETROFFEN, CYS oder SAM Gene, die in mutierte Stämme umgewandelt wurden. (In dieser Klasse verwenden Sie die Plasmidkomplementation, um die Identifizierung Ihrer Stämme und Plasmide zu bestätigen.)

Die meisten Gene, mit denen wir in diesem Semester arbeiten werden, kodieren für Enzyme, die eine Umwandlung eines schwefelhaltigen Moleküls in ein zweites schwefelhaltiges Molekül katalysieren. Sonstiges GETROFFEN Gene kodieren für Enzyme, die nicht direkt an der Synthese von Schwefelaminosäuren beteiligt sind, aber die Synthese eines Cofaktors oder eines Methyldonors katalysieren, der für die Synthese von Schwefelaminosäuren benötigt wird. In der folgenden kurzen Beschreibung verfolgen wir den Fortschritt eines Schwefelatoms von anorganischem Sulfat bis zu seiner Umwandlung in Met, Cys oder AdoMet.

Die Sulfatassimilation beinhaltet die Schwefelaktivierung und die Reduktion zu Sulfid

Die frühen Schritte des Weges, der die Reaktionen umfasst, die an der Umwandlung von Sulfat in Sulfid beteiligt sind, umfassen den Sulfatassimilationsweg. Sulfationen sind die Quelle des meisten Schwefels in biologischen Molekülen, aber es wird beträchtliche Stoffwechselenergie benötigt, um Sulfat aus seiner Oxidationsstufe +6 zu aktivieren und es in Sulfid umzuwandeln, das eine Oxidationsstufe von -2 hat. Die für die Sulfatassimilation verantwortlichen Enzyme sind in Mikroorganismen und Pflanzen weit verbreitet. In S. cerevisiae, Sulfat wird zuerst durch ATP Sulfurylase oder Met3p aktiviert, um 5’-Adenylylsulfat (APS) zu bilden. APS wird dann von Met14p oder APS-Kinase phosphoryliert, wodurch 3’-Phospho-5’-Adenylylsulfat (PAPS) gebildet wird. PAPS ist ein interessantes Molekül, da es ein aktiviertes Schwefelatom enthält, das für eine Vielzahl von Schwefelübertragungsreaktionen verwendet werden kann. Bei Säugetieren wird PAPS für eine Vielzahl von Sulfatierungsreaktionen im Golgi verwendet, wobei die Akzeptoren Lipide, Proteine ​​und eine Vielzahl kleiner Moleküle umfassen. (Interessanterweise ist die APS-Kinase das einzige Hefeenzym, das an der Sulfatassimilation mit Homologen bei Säugetieren beteiligt ist.)

Die letzten beiden Schritte der Sulfatassimilation sind NADPH-abhängige Reduktionsreaktionen. Die PAPS-Reduktase oder Met16p katalysiert die erste Reaktion, bei der dem Schwefelatom zwei Elektronen hinzugefügt werden. Die abschließende 6-Elektronen-Reduktion wird durch Sulfitreduktase katalysiert. Sulfitreduktase ist ein komplexes Metalloenzym mit zwei Met5p- und zwei Met10p-Untereinheiten sowie mehreren prothetischen Gruppen, einschließlich Sirohäm, die am Elektronentransfer beteiligt sind. (Eine prothetische Gruppe ist ein Metallion oder ein organisches Molekül, das kovalent an ein Enzym gebunden und für seine Aktivität essentiell ist.) In Hefe wird Sirohäm in einer Reihe von Reaktionen synthetisiert, die durch Met1p und Met8p katalysiert werden. Die Sirohem-Synthese wird formal nicht als Teil des Sulfatassimilationsweges angesehen, aber ihre Funktion ist entscheidend für den Aufbau der funktionellen Sulfitreduktase.

Homocysteinsynthese und Transsulfuration

Im nächsten Schritt der Met- und Cys-Biosynthese wird Sulfid in die Aminosäure Homocystein (Hcy) eingebaut. Hcy sitzt am Verzweigungspunkt zwischen mehreren Pfaden in Hefe. Das Aminosäure-Rückgrat von Hcy leitet sich letztendlich von Asparaginsäure ab, die in . umgewandelt wurde
eine Reihe von Schritten zu Homoserin. (Hinweis: „Homo“-Aminosäuren haben im Vergleich zu den Namensgebern ohne Präfix ein zusätzliches Kohlenstoffatom in ihren Seitenketten.) Met2p aktiviert das Homoserin
in einer Acetylierungsreaktion, die Acetyl-CoA verwendet. Met17p, auch bekannt als entweder Homocystein-Synthase oder O-Acetyl-Homoserin-Sulfhydryase, katalysiert dann die Reaktion von O-Acetylhomoserin mit Sulfid, um Hcy zu bilden.

In Hefe dient Hcy als Vorläufer für entweder Cys oder Met. Der Weg, der Hcy und Cys verbindet, wird als Transsulfurierungsweg bezeichnet. Transsulfuration bietet S. cerevisiae mit ungewöhnlicher Flexibilität in Bezug auf Schwefelquellen. Vier verschiedene Genprodukte sind an der Umwandlung von Hcy in Cys und umgekehrt beteiligt, wobei Cystathionin (unten) als gemeinsames Zwischenprodukt verwendet wird. Str2p katalysiert die Cystathioninsynthese aus Cys und O-Acetylhomoserin, dem Produkt der durch Met2p katalysierten Reaktion. Auf dem entgegengesetzten Weg katalysiert Cys4p (auch bekannt als Str4p) die Cystatinsynthese aus Hcy und Ser. Die vier Gene im Schwefeltransferweg zeigen unterschiedliche Muster der evolutionären Konservierung. Zum Beispiel, E coli ist nicht in der Lage, Cys aus Met zu synthetisieren, während Säugetiere Met nicht aus Cys synthetisieren können.

Cystathionin ist das Zwischenprodukt für Transsulfurierungsreaktionen. Enzyme im Transsulfurierungsweg von S. cerevisiae werden durch die STR1-STR4 Gene. Str2pand Str1p (Cys3p) katalysieren die Synthese bzw. Hydrolyse des Cystathionins S-Cg Bindung. Str3p und Str4p (Cys4p) katalysieren die Synthese bzw. Hydrolyse des Cystathionins S-CB Bindung.

Methionin und AdoMet werden während des Methylzyklus gebildet

Hcy ist auch der Ausgangspunkt eines Zyklus, der Met und AdoMet produziert. Der Zyklus beginnt, wenn Met6p die Umwandlung von Hcy zu Met katalysiert, unter Verwendung eines ungewöhnlichen Methyldonors, Polyglutamyl-5-methyl-tetrahydrofolat (THF). Die MET13 und MET7 Gene kodieren die Enzyme, die die letzten beiden Schritte in der Synthese von Polyglutamyl-5-methyl-THF katalysieren, was ihre Unfähigkeit erklärt, met7 und met13 Zellen, um Methionin zu synthetisieren.

Wie zu erwarten, wird das meiste Methionin für die Proteinsynthese in Zellen verwendet, aber eine beträchtliche Menge wird von zwei nahezu identischen AdoMet-Synthasen, Sam1p und Sam2p, in den hochenergetischen Methyldonor AdoMet umgewandelt. S. cerevisiae ist in der Lage, große Mengen von AdoMet zu synthetisieren, das entweder für Transmethylierungsreaktionen verwendet oder in seiner Vakuole gespeichert wird. (Tatsächlich ist Hefe die Quelle für das meiste kommerziell hergestellte AdoMet.) Mehrere Hefe-Methyltranferasen katalysieren die Übertragung von Methylgruppen von AdoMet auf Hunderte verschiedener Substrate, darunter Nukleotidbasen und Zucker in DNA und RNA, verschiedene Aminosäureseitenketten in Proteine, Lipide, kleine Moleküle und mehr. Jede Transmethylierungsreaktion erzeugt ein Molekül S-Adenosylhomocystein (AdoHcy), das von Sah1p zu Adenosin und Hcy hydrolysiert wird, wodurch der Methylzyklus abgeschlossen wird.

Wir werden in dieser Klasse nicht die Enzyme untersuchen, die am Methylzyklus beteiligt sind, aber
Es ist wichtig, ihre Bedeutung für das Überleben von Zellen zu erkennen. Die Aminosäuresequenzen von Sam1p und Sam2p sind zu 93% identisch, was weit höher ist als bei anderen Proteinen, die durch Genduplikation entstanden sind S. cerevisiae. Diese Redundanz stellt einen Puffer gegen den Verlust einer der beiden Funktionen bereit. Zellen mit einer Mutation in einem der SAM1 oder SAM2 Gen können überleben, aber Zellen mit Mutationen in beiden Genen können nicht überleben. Ebenso die SAH1 Gen ist eines der wenigen essentiellen Gene in S. cerevisiae, wahrscheinlich weil der Aufbau von AdoHcy viele Methyltransferase-Reaktionen hemmen würde.

Mutationen stören biochemische Wege

Die getroffen Mutanten, die Sie analysieren, können eine der Reaktionen, die für die Synthese von Schwefelaminosäuren erforderlich sind, nicht katalysieren. In diesem Labor verwenden Sie selektive und differentielle Medien, um festzustellen, welche Gene in Ihren Stämmen inaktiviert wurden. Stellen Sie sich jede Mutation als das Löschen eines der Pfeile vor, die im Schwefelaminosäureweg gezeigt werden. Unsere selektiven Medien enthalten eine Vielzahl von Schwefelquellen. Je nach Position des getroffen Mutation in Bezug auf die Schwefelquelle, kann der Stamm die Schwefelaminosäuren synthetisieren oder nicht.

Sie werden auch das Differenzierungsmedium BiGGY-Agar verwenden, um Hefestämme zu unterscheiden
durch die Menge an Schwefelwasserstoff, die sie produzieren. Dies liegt daran, dass BiGGY Wismut enthält, das mit Sulfid reagiert, um einen bräunlichen bis schwarzen Niederschlag zu bilden. Es wird erwartet, dass alle Stämme auf BiGGY wachsen, da es Hefeextrakt enthält, der eine Methioninquelle ist. BiGGY enthält auch Sulfit anstelle von Sulfat als primäre Schwefelquelle. Lokalisieren Sie die Positionen Ihrer mutierten Gene im Signalweg relativ zu Sulfid und Sulfit. Mutationen in Genen stromaufwärts von Sulfid sollten hellere Kolonien erzeugen, da weniger Sulfid produziert wird. Von diesen sollten Mutationen, die eine Sulfitreduktion verhindern, die leichtesten Kolonien erzeugen. Mutationen in Genen stromabwärts von Sulfid sollten dunklere Kolonien erzeugen, da die Stämme Sulfid nicht metabolisieren können.

Wenn Sie Ihre Vorhersagen für dieses Experiment treffen, können Sie diese Analogie nützlich finden: Ein Stoffwechselweg ist nicht unähnlich einer Einbahnstraße (Aufgrund energetischer Überlegungen sind die meisten Stoffwechselwege unidirektional) Autobahn mit einer Reihe von Brücken, die Inseln verbinden. (Die Inseln haben unterschiedliche Energieniveaus.) Die Autos, die auf der Autobahn vorbeifahren, sind die Moleküle, die von einer Form in eine andere umgewandelt werden. Wenn ein Auto die nächste Insel auf dem Weg erreicht, ändert sich seine Farbe, weil es in ein anderes Molekül umgewandelt wurde. Die Brücken sind die Enzyme
im Weg. Sie erleichtern die Durchfahrt der Autos, weil sie die Reaktionen katalysieren, die ein Molekül in das nächste umwandeln. Tritt eine Mutation in einem Gen auf, das für ein bestimmtes Enzym kodiert, fällt diese bestimmte Brücke ab. Autos stapeln sich vor der kaputten Brücke, und auf Inseln hinter der kaputten Brücke würden nur sehr wenige Autos gefunden. In einigen Fällen kann es einen alternativen Weg oder einen Rettungsweg geben, aber dieser Weg ist normalerweise weniger effizient.


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